Grazas por visitar Nature.com.A versión do navegador que estás a usar ten soporte CSS limitado.Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que utilices un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer).Mentres tanto, para garantir a asistencia continua, renderizaremos o sitio sen estilos e JavaScript.
Hai unha necesidade dun sistema in vitro fiable que poida reproducir con precisión o ambiente fisiolóxico do corazón para as probas de drogas.A limitada dispoñibilidade de sistemas de cultivo de tecidos cardíacos humanos levou a interpretacións inexactas dos efectos dos medicamentos cardíacos.Aquí, desenvolvemos un modelo de cultivo de tecido cardíaco (CTCM) que estimula electromecánicamente os cortes cardíacos e sofre estiramento fisiolóxico durante as fases sistólica e diastólica do ciclo cardíaco.Despois de 12 días de cultivo, este enfoque mellorou parcialmente a viabilidade das seccións cardíacas, pero non conservou totalmente a súa integridade estrutural.Polo tanto, despois do cribado de pequenas moléculas, descubrimos que a adición de 100 nM de triiodotironina (T3) e 1 μM de dexametasona (Dex) ao noso medio mantivo a microestrutura das seccións durante 12 días.En combinación co tratamento con T3/Dex, o sistema CTCM mantivo os perfís transcripcionais, a viabilidade, a actividade metabólica e a integridade estrutural ao mesmo nivel que o tecido cardíaco fresco durante 12 días.Ademais, o estiramento excesivo do tecido cardíaco en cultivo induce a sinalización cardíaca hipertrófica, proporcionando evidencia da capacidade do CTCM para imitar as condicións hipertróficas inducidas polo estiramento cardíaco.En conclusión, o CTCM pode modelar a fisioloxía e fisiopatoloxía do corazón en cultivo durante longos períodos de tempo, o que permite unha detección fiable de medicamentos.
Antes da investigación clínica, son necesarios sistemas in vitro fiables que poidan reproducir con precisión o ambiente fisiolóxico do corazón humano.Tales sistemas deberían imitar o estiramento mecánico alterado, a frecuencia cardíaca e as propiedades electrofisiolóxicas.Os modelos animais úsanse habitualmente como plataforma de cribado para a fisioloxía cardíaca cunha fiabilidade limitada para reflectir os efectos dos fármacos no corazón humano1,2.En definitiva, o Modelo Experimental de Cultivo de Tecido Cardíaco Ideal (CTCM) é un modelo altamente sensible e específico para diversas intervencións terapéuticas e farmacolóxicas, que reproduce con precisión a fisioloxía e fisiopatoloxía do corazón humano3.A ausencia deste sistema limita o descubrimento de novos tratamentos para a insuficiencia cardíaca4,5 e levou á cardiotoxicidade dos fármacos como un dos principais motivos para saír do mercado6.
Durante a última década, oito fármacos non cardiovasculares foron retirados do uso clínico porque provocan unha prolongación do intervalo QT que provoca arritmias ventriculares e morte súbita7.Así, hai unha necesidade crecente de estratexias de cribado preclínico fiables para avaliar a eficacia e a toxicidade cardiovascular.O uso recente de cardiomiocitos derivados de células nai pluripotentes inducidas por humanos (hiPS-CM) na detección de fármacos e nas probas de toxicidade proporciona unha solución parcial a este problema.Non obstante, a natureza inmadura dos hiPS-CM e a falta de complexidade multicelular do tecido cardíaco son as principais limitacións deste método.Estudos recentes demostraron que esta limitación pode superarse en parte mediante o uso de hiPS-CM precoz para formar hidroxeles de tecido cardíaco pouco despois do inicio das contraccións espontáneas e aumentando gradualmente a estimulación eléctrica co paso do tempo.Non obstante, estes microtecidos hiPS-CM carecen das propiedades electrofisiolóxicas e contráctiles maduras do miocardio adulto.Ademais, o tecido cardíaco humano ten unha estrutura máis complexa, que consiste nunha mestura heteroxénea de diferentes tipos celulares, incluíndo células endoteliais, neuronas e fibroblastos do estroma, interconectados por conxuntos específicos de proteínas da matriz extracelular.Esta heteroxeneidade de poboacións non cardiomiocitos11,12,13 no corazón de mamíferos adultos é unha barreira importante para modelar o tecido cardíaco utilizando tipos de células individuais.Estas limitacións principais enfatizan a importancia de desenvolver métodos para cultivar tecido miocárdico intacto en condicións fisiolóxicas e patolóxicas.
Seccións delgadas cultivadas (300 µm) do corazón humano demostraron ser un modelo prometedor de miocardio humano intacto.Este método proporciona acceso a un sistema multicelular 3D completo similar ao tecido do corazón humano.Non obstante, ata 2019, o uso de seccións cardíacas cultivadas estivo limitado pola curta supervivencia dos cultivos (24 h).Isto débese a unha serie de factores, incluíndo a falta de estiramento físico-mecánico, a interface aire-líquido e o uso de medios sinxelos que non soportan as necesidades do tecido cardíaco.En 2019, varios grupos de investigación demostraron que incorporar factores mecánicos aos sistemas de cultivo de tecidos cardíacos pode prolongar a vida do cultivo, mellorar a expresión cardíaca e imitar a patoloxía cardíaca.Dous estudos elegantes 17 e 18 mostran que a carga mecánica uniaxial ten un efecto positivo sobre o fenotipo cardíaco durante o cultivo.Non obstante, estes estudos non utilizaron a carga físico-mecánica tridimensional dinámica do ciclo cardíaco, xa que as seccións cardíacas estaban cargadas con forzas de tracción isométricas 17 ou cargas auxotónicas lineais 18 .Estes métodos de estiramento dos tecidos provocaron a supresión de moitos xenes cardíacos ou a sobreexpresión de xenes asociados con respostas de estiramento anormais.Notablemente, Pitoulis et al.19 desenvolveu un baño de cultivo de cortes cardíacos dinámicos para a reconstrución do ciclo cardíaco mediante a retroalimentación do transdutor de forza e as unidades de tensión.Aínda que este sistema permite un modelado máis preciso do ciclo cardíaco in vitro, a complexidade e o baixo rendemento do método limita a aplicación deste sistema.O noso laboratorio desenvolveu recentemente un sistema de cultivo simplificado mediante estimulación eléctrica e un medio optimizado para manter a viabilidade de seccións de tecido cardíaco porcino e humano ata 6 días20,21.
No manuscrito actual, describimos un modelo de cultivo de tecido cardíaco (CTCM) utilizando seccións do corazón porcino que incorpora sinais humorais para recapitular a fisioloxía cardíaca tridimensional e a distensión fisiopatolóxica durante o ciclo cardíaco.Este CTCM pode aumentar a precisión da predición preclínica de fármacos a un nivel nunca antes alcanzado proporcionando un sistema cardíaco rendible e de rendemento medio que imita a fisioloxía/patofisioloxía do corazón dos mamíferos para as probas preclínicas de fármacos.
Os sinais mecánicos hemodinámicos xogan un papel fundamental no mantemento da función dos cardiomiocitos in vitro 22,23,24.No manuscrito actual, desenvolvemos un CTCM (Figura 1a) que pode imitar o ambiente cardíaco adulto ao inducir a estimulación tanto eléctrica como mecánica a frecuencias fisiolóxicas (1,2 Hz, 72 latexos por minuto).Para evitar un estiramento excesivo do tecido durante a diástole, utilizouse un dispositivo de impresión 3D para aumentar o tamaño do tecido nun 25% (Fig. 1b).A estimulación eléctrica inducida polo sistema C-PACE foi cronometrada para comezar 100 ms antes da sístole mediante un sistema de adquisición de datos para reproducir completamente o ciclo cardíaco.O sistema de cultivo de tecidos usa un actuador pneumático programable (LB Engineering, Alemaña) para expandir cíclicamente unha membrana de silicona flexible para provocar a expansión dos cortes de corazón na cámara superior.O sistema conectouse a unha liña de aire externa mediante un transdutor de presión, o que permitiu axustar con precisión a presión (± 1 mmHg) e o tempo (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Coloque a sección de tecido ao anel de soporte de 7 mm, mostrado en azul, dentro da cámara de cultivo do dispositivo.A cámara de cultivo está separada da cámara de aire por unha fina membrana flexible de silicona.Coloque unha xunta entre cada cámara para evitar fugas.A tapa do dispositivo contén electrodos de grafito que proporcionan estimulación eléctrica.b Representación esquemática do dispositivo de tecido grande, anel guía e anel de apoio.As seccións de tecido (marrón) colócanse no dispositivo de gran tamaño co anel guía colocado na ranura do bordo exterior do dispositivo.Usando a guía, coloque coidadosamente o anel de soporte revestido de adhesivo acrílico tisular sobre a sección de tecido cardíaco.c Gráfico que mostra o tempo de estimulación eléctrica en función da presión da cámara de aire controlada por un actuador pneumático programable (PPD).Utilizouse un dispositivo de adquisición de datos para sincronizar a estimulación eléctrica mediante sensores de presión.Cando a presión na cámara de cultivo alcanza o limiar establecido, envíase un sinal de pulso ao C-PACE-EM para activar a estimulación eléctrica.d Imaxe de catro CTCM colocados nun andel da incubadora.Conéctanse catro dispositivos a un PPD mediante un circuíto pneumático e insírense sensores de presión na válvula hemostática para controlar a presión no circuíto pneumático.Cada dispositivo contén seis seccións de tecido.
Usando un único actuador pneumático, puidemos controlar 4 dispositivos CTCM, cada un dos cales podía albergar 6 seccións de tecido (Fig. 1d).No CTCM, a presión do aire na cámara de aire convértese en presión síncrona na cámara de fluído e induce a expansión fisiolóxica da porción cardíaca (figura 2a e película complementaria 1).Avaliación do estiramento do tecido a 80 mm Hg.Art.mostrou estiramento das seccións de tecido nun 25% (Fig. 2b).Demostrouse que este estiramento porcentual corresponde a unha lonxitude fisiolóxica do sarcómero de 2,2-2,3 µm para a contractilidade da sección cardíaca normal17,19,25.O movemento do tecido avaliouse mediante a configuración personalizada da cámara (Figura complementaria 1).A amplitude e velocidade do movemento do tecido (Fig. 2c, d) corresponderon ao estiramento durante o ciclo cardíaco e ao tempo durante a sístole e a diástole (Fig. 2b).O estiramento e a velocidade do tecido cardíaco durante a contracción e a relaxación mantivéronse constantes durante 12 días en cultivo (Fig. 2f).Para avaliar o efecto da estimulación eléctrica sobre a contractilidade durante o cultivo, desenvolvemos un método para determinar a deformidade activa mediante un algoritmo de sombreado (figuras complementarias 2a, b) e puidemos distinguir entre deformidades con e sen estimulación eléctrica.A mesma sección do corazón (Fig. 2f).Na rexión móbil do corte (R6-9), a tensión durante a estimulación eléctrica foi un 20% maior que en ausencia de estimulación eléctrica, o que indica a contribución da estimulación eléctrica á función contráctil.
Os rastros representativos da presión da cámara de aire, da presión da cámara de fluído e do movemento do tecido confirman que a presión da cámara cambia a presión da cámara de fluído, provocando un movemento correspondente da porción de tecido.b Trazos representativos do estiramento porcentual (azul) das seccións de tecido correspondentes ao estiramento porcentual (laranxa).c O movemento medido do corte cardíaco é consistente coa velocidade de movemento medida.(d) Traxectorias representativas do movemento cíclico (liña azul) e da velocidade (liña de puntos laranxa) nunha porción do corazón.e Cuantificación do tempo de ciclo (n = 19 cortes por grupo, de diferentes porcos), tempo de contracción (n = 19 cortes por grupo), tempo de relaxación (n = 19 cortes por grupo, de diferentes porcos), movemento do tecido (n = 25 ).cortes)/grupo de diferentes porcos), velocidade sistólica máxima (n = 24(D0), 25(D12) cortes/grupo de diferentes porcos) e taxa de relaxación máxima (n=24(D0), 25(D12) cortes/grupo de diferentes porcos).A proba t de Student de dúas colas non mostrou diferenzas significativas en ningún parámetro.f Rastros representativos de análise de cepas de seccións de tecido con estimulación eléctrica (vermello) e sen (azul), dez áreas rexionais de seccións de tecido da mesma sección.Os paneis inferiores mostran a cuantificación da diferenza porcentual de tensión en seccións de tecido con e sen estimulación eléctrica en dez áreas de diferentes seccións. (n = 8 franxas/grupo de diferentes porcos, realízase a proba t de Student de dúas colas; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 franxas/grupo de diferentes porcos, realízase a proba t de Student de dúas colas; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; *****p<0,1,**p<p<0,0,000). (n = 8 seccións/grupo de diferentes porcos, proba t de Student de dúas colas; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,01，*p < 0,0001， （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,01，*p < 0,0001， (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <p <0,01, *5). (n = 8 seccións/grupo, de diferentes porcos, proba t de Student de dúas colas; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).As barras de erro representan a media ± desviación estándar.
No noso anterior sistema de cultivo biomimético estático de cortes cardíacos [20, 21], mantivemos a viabilidade, función e integridade estrutural dos cortes cardíacos durante 6 días aplicando estimulación eléctrica e optimizando a composición do medio.Non obstante, despois de 10 días, estas cifras baixaron drasticamente.Referirémonos ás seccións cultivadas no noso sistema de cultivo biomimético estático anterior 20, 21 condicións de control (Ctrl) e usaremos o noso medio previamente optimizado como condicións de MC e cultivo baixo estimulación mecánica e eléctrica simultánea (CTCM).chamado .En primeiro lugar, determinamos que a estimulación mecánica sen estimulación eléctrica era insuficiente para manter a viabilidade do tecido durante 6 días (figuras complementarias 3a, b).Curiosamente, coa introdución da estimulación fisio-mecánica e eléctrica mediante STCM, a viabilidade das seccións cardíacas de 12 días mantívose a mesma que nas seccións de corazón fresco en condicións de MS, pero non en condicións de Ctrl, como mostra a análise MTT (Fig. 1).3a).Isto suxire que a estimulación mecánica e a simulación do ciclo cardíaco poden manter as seccións de tecido viables durante o dobre do tempo que se informa no noso sistema de cultivo estático anterior.Non obstante, a avaliación da integridade estrutural das seccións de tecido mediante a inmunomarcación da troponina T cardíaca e da conexina 43 mostrou que a expresión da conexina 43 foi significativamente maior nos tecidos MC o día 12 que nos controis o mesmo día.Non obstante, a expresión uniforme da conexina 43 e a formación do disco Z non se mantiveron completamente (Fig. 3b).Usamos un marco de intelixencia artificial (IA) para cuantificar a integridade estrutural do tecido26, unha canalización de aprendizaxe profunda baseada en imaxes baseada na tinción de troponina-T e conexina43 para cuantificar automaticamente a integridade estrutural e a fluorescencia das porcións de corazón en termos de forza de localización.Este método utiliza unha rede neuronal convolucional (CNN) e un marco de aprendizaxe profunda para cuantificar de forma fiable a integridade estrutural do tecido cardíaco dun xeito automatizado e imparcial, como se describe na referencia.26. O tecido MC mostrou unha semellanza estrutural mellorada co día 0 en comparación coas seccións de control estático.Ademais, a tinción tricromática de Masson revelou unha porcentaxe significativamente menor de fibrose en condicións de EM en comparación coas condicións de control o día 12 de cultivo (Fig. 3c).Aínda que o CTCM aumentou a viabilidade das seccións de tecido cardíaco no día 12 a un nivel similar ao do tecido cardíaco fresco, non mellorou significativamente a integridade estrutural das seccións cardíacas.
un gráfico de barras mostra a cuantificación da viabilidade MTT de rebanadas de corazón fresco (D0) ou cultivo de rebanadas de corazón durante 12 días en cultivo estático (D12 Ctrl) ou en CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC/MC) realízase dun xeito diferente; 0,0001 en comparación con D0 e **p <0,01 en comparación con D12 Ctrl). un gráfico de barras mostra a cuantificación da viabilidade MTT de rebanadas de corazón fresco (D0) ou cultivo de rebanadas de corazón durante 12 días en cultivo estático (D12 Ctrl) ou en CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl MC, 12 (D12 Ctrl/grupo NOVA), realízase dun xeito diferente de # pilices/grupo NOVA. < 0,0001 en comparación con D0 e **p < 0,01 en comparación con D12 Ctrl).o histograma mostra a cuantificación da viabilidade de seccións de corazón fresco MTT (D0) ou cultivo de seccións de corazón durante 12 días en cultivo estático (control D12) ou CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (control D12).####p < 0,0001 para сравнению с D0 e **p < 0,01 para сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 en comparación con D0 e **p < 0,01 en comparación con D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl)养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 来自不同猪的0. 001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl)的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl ，**p。histograma que mostra a cuantificación da viabilidade MTT en seccións de corazón fresco (D0) ou seccións de corazón cultivadas durante 12 días en cultivo estático (control D12) ou CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (control D12)), 12 (D12 MC) seccións/grupo de diferentes probas ANOVA de porcos unidireccionais;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 en comparación con D0, **p < 0,01 en comparación con D12 Ctrl).b Troponina-T (verde), conexina 43 (vermello) e DAPI (azul) en seccións cardíacas recentemente illadas (D0) ou seccións cardíacas cultivadas en condicións estáticas (Ctrl) ou condicións CTCM (MC) durante 12 días) de imaxes de inmunofluorescencia representativas (escala en branco = 100 µm). Cuantificación da intelixencia artificial da integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) cortes/grupo cada un de diferentes porcos, realízase unha proba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparación con D0 e ****p < 0,001 C en comparación con D). Cuantificación da intelixencia artificial da integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) cortes/grupo cada un de diferentes porcos, realízase unha proba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparación con D0 e ****p < 0,001 C en comparación con D001). Noticias noutros idiomas срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравненей по сравненится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравненится однофакторный тест ANOVA; ию с D12 Ctrl). Cuantificación da integridade estrutural do tecido cardíaco mediante intelixencia artificial (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seccións/grupos de diferentes porcos, proba ANOVA unidireccional realizada; ####p < 0,0001 vs. con D0 e ****p < 0,0001 C en comparación con D).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rebanadas/grupo cada un de diferentes porcos, proba ANOVA unidireccional <1 䛔 盔. ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rebanadas/grupo cada un de diferentes porcos, proba ANOVA unidireccional 0 人####0 人工智; ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной тка7нl (D12), = (D12), (D12), MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. с D12 Ctrl). Intelixencia artificial para cuantificar a integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seccións/grupo cada un de diferentes porcos, proba ANOVA unidireccional; ####p<0,0001 vs .D0 Para comparación ****p < 0,0001 C en comparación con D). C imaxes representativas (esquerda) e cuantificación (dereita) para franxas cardíacas manchadas con mancha de tricromo de Masson (escala espida = 500 µm) (n = 10 franxas/grupo cada un de porco diferente, realízase unha proba ANOVA unidireccional; #### p <0,0001 en comparación con d0 e *** p <0,001 comparado a D12 ctrl). c Imaxes representativas (esquerda) e cuantificación (dereita) para rebanadas de corazón tinguidas con tinción tricromática de Masson (escala nua = 500 µm) (n = 10 rebanadas/grupo cada unha de diferentes porcos, realízase a proba ANOVA unidireccional; #### p < 0,0001 en comparación con C0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,1,0,0,0,0,0,1,0,0,0,0,1,0,0,1,0,1,0,1). c Репрезентативные изображения (слева) e количественная оценка (справа) срезов сердца сердца, окричественная оценка (справа) сителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свинтей покрытия, выпстоня выпстоной ANOVA; #### p < 0,0001 para сравнению с D0 e ***p < 0,001 para сравнению с D12 Ctrl). c Imaxes representativas (esquerda) e cuantificación (dereita) de seccións cardíacas tinguidas con tinción tricromática de Masson (escala sen recubrir = 500 µm) (n = 10 seccións/grupo de diferentes porcos, proba ANOVA unidireccional realizada; #### p < 0,0001 en comparación con D0 e *** 2 Ctr. c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺化（右）（裸尪（10µ=m （裸尺 010µ =切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比 与D0 相比，D***1 测试４，D４４４４４４，Dp 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 尺 度 尺 度度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向#0 单向#0 不#0 诏 Anova ．0 0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца сердца, окличественный анализ (справа) срезов сердца, окрынца сителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, просод свиньи, просод протова факторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению Crсl D12). c Imaxes representativas (esquerda) e cuantificación (dereita) de seccións cardíacas tinguidas con tinción tricrómica de Masson (en branco = 500 µm) (n = 10 seccións/grupo, cada unha delas dun porco diferente, probada mediante análise unidireccional da varianza ;### # p < 0,0001 en comparación con D0, ***0 p < 0.0001 comparado con D0.As barras de erro representan a media ± desviación estándar.
A hipótese de que ao engadir moléculas pequenas ao medio de cultivo poderíase mellorar a integridade dos cardiomiocitos e reducir o desenvolvemento da fibrose durante o cultivo CTCM.Polo tanto, analizamos pequenas moléculas usando os nosos cultivos de control estático20,21 debido ao pequeno número de factores de confusión.Para esta pantalla escolléronse dexametasona (Dex), triiodotironina (T3) e SB431542 (SB).Estas pequenas moléculas utilizáronse anteriormente en cultivos hiPSC-CM para inducir a maduración dos cardiomiocitos aumentando a lonxitude do sarcómero, os túbulos T e a velocidade de condución.Ademais, tanto Dex (un glucocorticoide) como SB son coñecidos por suprimir a inflamación29,30.Polo tanto, probamos se a inclusión dunha ou unha combinación destas pequenas moléculas melloraría a integridade estrutural das seccións cardíacas.Para o cribado inicial, seleccionouse a dose de cada composto en función das concentracións que se usan habitualmente nos modelos de cultivo celular (1 μM Dex27, 100 nM T327 e 2,5 μM SB31).Despois de 12 días de cultivo, a combinación de T3 e Dex deu lugar a unha integridade estrutural óptima dos cardiomiocitos e unha remodelación fibrosa mínima (Figuras complementarias 4 e 5).Ademais, o uso do dobre ou dobre destas concentracións de T3 e Dex produciu efectos nocivos en comparación coas concentracións normais (figuras complementarias 6a, b).
Despois da selección inicial, realizamos unha comparación cara a cabeza de 4 condicións de cultivo (Figura 4a): Ctrl: seccións cardíacas cultivadas no noso cultivo estático anteriormente descrito usando o noso medio optimizado;20.21 TD: T3 e Ctrl s Dex engadido o mércores;MC: seccións cardíacas cultivadas en CTCM utilizando o noso medio previamente optimizado;e MT: CTCM con T3 e Dex engadidos ao medio.Despois de 12 días de cultivo, a viabilidade dos tecidos de MS e MT mantívose igual que nos tecidos frescos avaliados mediante o ensaio MTT (Fig. 4b).Curiosamente, a adición de T3 e Dex aos cultivos transwell (TD) non deu lugar a unha mellora significativa na viabilidade en comparación coas condicións Ctrl, o que indica un papel importante da estimulación mecánica no mantemento da viabilidade das seccións cardíacas.
a Diagrama de deseño experimental que representa as catro condicións de cultivo utilizadas para avaliar os efectos da estimulación mecánica e da suplementación con T3/Dex en medio durante 12 días. b O gráfico de barras mostra a cuantificación da viabilidade 12 días despois do cultivo nas 4 condicións de cultivo (Ctrl, TD, MC e MT) en comparación con cortes de corazón fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC/grupo) dun xeito diferente. 0,0001, ###p <0,001 en comparación con D0 e **p <0,01 en comparación con D12 Ctrl). b O gráfico de barras mostra a cuantificación da viabilidade 12 días despois do cultivo nas 4 condicións de cultivo (Ctrl, TD, MC e MT) en comparación con cortes de corazón fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC/grupo) dun xeito diferente. 0,0001, ###p <0,001 en comparación con D0 e **p <0,01 en comparación con D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней послественную оценку жизнеспособности через 12 дней послественную ви4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (D0) (D0) (Dn1, Dn1, D18) 12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 со, ## 0,000p < 0,0, 000 p D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b O gráfico de barras mostra a cuantificación da viabilidade aos 12 días despois do cultivo nas 4 condicións de cultivo (control, TD, MC e MT) en comparación coas seccións de corazón fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) seccións/grupo de probas ANOVA, #-0 dun xeito diferente; 1, ###p <0,001 fronte a D0 e **p <0,01 en comparación con D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D150)D1、tD12、D12、和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.0001，#，#0.p 01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнения сравнения сравнения сравнения ца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, одно,##0сторо,##0нтой одно,##00 p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histograma que amosa as 4 condicións de cultivo (control, TD, MC e MT) en comparación con seccións de corazón fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), de diferentes porcos 12 (D12 MC) seccións/grupo, proba ANOVA unidireccional <; #.##0.<0 p. **p<0,01 vs control D12). c O gráfico de barras mostra a cuantificación do fluxo de glicosa 12 días despois do cultivo nas 4 condicións de cultivo (Ctrl, TD, MC e MT) en comparación con franxas de corazón fresco (D0) (n = 6 porcións/grupo de diferentes porcos, realízase a proba ANOVA unidireccional; ###p < 0,001, comparado con D0,0 e ***0p <0,001, comparado con D0,0,0,0,0,0,1,0,0,0,0,0,0,0,1). c O gráfico de barras mostra a cuantificación do fluxo de glicosa 12 días despois do cultivo nas 4 condicións de cultivo (Ctrl, TD, MC e MT) en comparación con franxas de corazón fresco (D0) (n = 6 porcións/grupo de diferentes porcos, realízase a proba ANOVA unidireccional; ###p < 0,001, comparado con D0,0 e ***0p <0,001, comparado con D0,0,0,0,0,0,1,0,0,0,0,0,0,0,1). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после кулхную оценку потока овиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 зруспы зами сердца (D0) свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению Cdr D0). c O histograma mostra a cuantificación do fluxo de glicosa 12 días despois do cultivo nas 4 condicións de cultivo (control, TD, MC e MT) en comparación con seccións de corazón fresco (D0) (n = 6 seccións/grupo de diferentes porcos, proba ANOVA unidireccional realizada; ###p <0,001 en comparación con D0 e ***p <Ctrl a D001). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 盌柯1＄囌柯1）糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 ， 与D0 ， ， 0*** l 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切 片 切片片 片 片后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， 定量 ， ， 啵 ， ， 啵 ， A试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней последи венную оценку 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (пра6в, пра сравнению) ных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сниро по снию с D0. c Histograma que mostra a cuantificación do fluxo de glicosa aos 12 días posteriores ao cultivo para as 4 condicións de cultivo (control, TD, MC e MT) en comparación coas seccións de corazón fresco (D0) (n = 6 seccións/grupo, de diferentes porcos, unilaterais.d Gráficos de análise de cepas de tecidos frescos (azul), día 12 MC (verde) e día 12 MT (vermello) en dez puntos de sección de tecidos rexionais (n = 4 cortes/grupo, proba ANOVA unidireccional; non houbo diferenza significativa entre os grupos).e Gráfico do volcán que mostra xenes expresados ​​de forma diferencial en seccións de corazón fresco (D0) en comparación coas seccións de corazón cultivadas en condicións estáticas (Ctrl) ou en condicións MT (MT) durante 10-12 días.f Mapa de calor de xenes de sarcómeros para seccións cardíacas cultivadas en cada unha das condicións de cultivo.As barras de erro representan a media ± desviación estándar.
A dependencia metabólica do cambio da oxidación dos ácidos graxos á glicólise é un selo distintivo da desdiferenciación dos cardiomiocitos.Os cardiomiocitos inmaduros usan principalmente glicosa para a produción de ATP e teñen mitocondrias hipoplásicas con poucas cristas5,32.As análises de utilización de glicosa mostraron que en condicións de MC e MT, a utilización de glicosa era similar á dos tecidos do día 0 (Figura 4c).Non obstante, as mostras Ctrl mostraron un aumento significativo na utilización de glicosa en comparación co tecido fresco.Isto indica que a combinación de CTCM e T3/Dex mellora a viabilidade do tecido e preserva o fenotipo metabólico das seccións cardíacas cultivadas de 12 días.Ademais, a análise de cepas mostrou que os niveis de cepa seguían sendo os mesmos que no tecido cardíaco fresco durante 12 días en condicións de MT e MS (Fig. 4d).
Para analizar o impacto global de CTCM e T3/Dex no panorama transcripcional global do tecido de corte cardíaco, realizamos RNAseq en cortes cardíacos das catro condicións de cultivo diferentes (datos suplementarios 1).Curiosamente, as seccións de MT mostraron unha gran semellanza transcripcional co tecido cardíaco fresco, con só 16 de 13.642 xenes expresados ​​diferencialmente.Non obstante, como mostramos anteriormente, as franxas Ctrl mostraban 1229 xenes expresados ​​de forma diferencial despois de 10-12 días de cultivo (Fig. 4e).Estes datos confirmáronse mediante qRT-PCR de xenes cardíacos e fibroblastos (figuras complementarias 7a-c).Curiosamente, as seccións Ctrl mostraron a regulación á baixa dos xenes cardíacos e do ciclo celular e a activación de programas de xenes inflamatorios.Estes datos suxiren que a desdiferenciación, que normalmente ocorre despois do cultivo a longo prazo, está completamente atenuada en condicións MT (figuras complementarias 8a, b).Un estudo coidadoso dos xenes do sarcómero mostrou que só en condicións MT se conservan os xenes que codifican o sarcómero (Fig. 4f) e a canle iónica (Figura complementaria 9), protexendoos da supresión en condicións Ctrl, TD e MC.Estes datos demostran que cunha combinación de estimulación mecánica e humoral (T3/Dex), o transcriptoma de corte cardíaco pode permanecer similar aos cortes de corazón fresco despois de 12 días en cultivo.
Estes achados transcricionais están apoiados polo feito de que a integridade estrutural dos cardiomiocitos nas seccións cardíacas consérvase mellor en condicións de MT durante 12 días, como mostra a conexina 43 intacta e localizada (Fig. 5a).Ademais, a fibrose nas seccións cardíacas en condicións MT reduciuse significativamente en comparación con Ctrl e similar ás seccións cardíacas frescas (Fig. 5b).Estes datos demostran que a combinación de estimulación mecánica e tratamento con T3/Dex preserva eficazmente a estrutura cardíaca en seccións cardíacas en cultivo.
a Imaxes de inmunofluorescencia representativas de troponina-T (verde), conexina 43 (vermello) e DAPI (azul) en seccións cardíacas recentemente illadas (D0) ou cultivadas durante 12 días nas catro condicións de cultivo de seccións cardíacas (barra de escala = 100 µm).). Cuantificación da intelixencia artificial da integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) cortes/grupo de diferentes porcos, realízase unha proba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparación con D0 e *p 1, < 0,0 p 0,0 0,0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 trl). Cuantificación da intelixencia artificial da integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) cortes/grupo de diferentes porcos, realízase a proba ANOVA unidireccional; #### p < 0,0001 en comparación con D0 e *p0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0* trl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного = интrl2 (Dr. 1) 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0 пен0 сра 0, 0 0 0 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). A cuantificación da integridade estrutural do tecido cardíaco mediante intelixencia artificial (n = 7 (D0 e D12 CTRL), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT)/grupo/grupo de diferentes porcos, proba ANOVA unida realizada; #### P <0,0001 comparado a D0 e*P <0,05 ou *** P <0,0001 comparado a D12 comparado a D0 e*p <0,05 ou *** P <0,0001 comparado a D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和/D12 和廿廿艺廿MT工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p 或****p < 0,00001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,00001 或对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc （1 （ d12 mc） 和 d12 ctrl）智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比， 0,05 相 0 0 0 0 0 0 0相比）.Cuantificación da integridade estrutural do tecido cardíaco mediante intelixencia artificial en diferentes porcos (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) seccións/grupo) cunha proba ANOVA unidireccional;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 en comparación con D0 e *p < 0,05 ou ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). b Imaxes representativas e cuantificación de rebanadas de corazón tinguidas con tinción tricromática de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) rebanadas/grupo de diferentes porcos, realízase unidireccional e compróbase a proba #ANOVA#0#0. < 0,001 ou ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). b Imaxes representativas e cuantificación de rebanadas de corazón tinguidas con tinción tricromática de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) rebanadas/grupo de diferentes porcos, realízase unidireccional e compróbase a proba #ANOVA#0#0. < 0,001 ou ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения e количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных трашенных траственная оценка срезов сердца а (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от раныно висони сторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению сl D12 Ct). b Imaxes representativas e cuantificación de seccións cardíacas tinguidas con tinción tricromática de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) seccións/grupo de diferentes porcos, realizadas ANOVA unidireccional <; #0.##0.0.0.0. ****p < 0,0001 fronte a D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）㼈D1010（D1010（D1010和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； 个析； 个 析； 个 析； 析； 缔 析； 01 伔 0. 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm（10 （ 10 （ （ 1 （ （ （ （ ） rl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 片 切片 爇片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析， 分析 分析 析 析 切 片 切片 切片/组，进行单因素方差分析 < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения e количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных трашенных тросо ая линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / грусоди / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусопы,#0#0; 01 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Imaxes representativas e cuantificación de seccións cardíacas tinguidas con tricrómico de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) seccións de diferentes porcos/grupo, un método ANOVA; ####p < 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 0,0001 en comparación con D12 Ctrl).As barras de erro representan a media ± desviación estándar.
Finalmente, a capacidade do CTCM para imitar a hipertrofia cardíaca foi avaliada aumentando o estiramento do tecido cardíaco.No CTCM, a presión máxima da cámara de aire aumentou de 80 mmHg a 80 mmHg.Art.(estiramento normal) ata 140 mmHg Art.(Fig. 6a).Isto corresponde a un aumento do 32% no estiramento (Fig. 6b), que anteriormente se mostraba como o estiramento porcentual correspondente necesario para as seccións cardíacas para acadar unha lonxitude do sarcómero similar á observada na hipertrofia.O estiramento e a velocidade do tecido cardíaco durante a contracción e a relaxación mantivéronse constantes durante seis días de cultivo (Fig. 6c).O tecido cardíaco das condicións de MT foi sometido a condicións de estiramento normal (MT (Normal)) ou de sobreestiramento (MT (OS)) durante seis días.Xa despois de catro días en cultivo, o biomarcador hipertrófico NT-ProBNP foi significativamente elevado no medio en condicións MT (OS) en comparación coas condicións MT (normais) (Fig. 7a).Ademais, despois de seis días de cultivo, o tamaño celular en MT (OS) (Fig. 7b) aumentou significativamente en comparación coas seccións de corazón MT (normal).Ademais, a translocación nuclear de NFATC4 aumentou significativamente nos tecidos sobreestirados (Fig. 7c).Estes resultados mostran o desenvolvemento progresivo da remodelación patolóxica despois da hiperdistensión e apoian o concepto de que o dispositivo CTCM pode usarse como plataforma para estudar a sinalización da hipertrofia cardíaca inducida por estiramento.
Os rastros representativos da presión da cámara de aire, da presión da cámara de fluído e do movemento do tecido confirman que a presión da cámara cambia a presión da cámara de fluído, provocando un movemento correspondente da porción de tecido.b Curvas representativas de porcentaxe de estiramento e taxa de estiramento para seccións de tecido normalmente estiradas (laranxa) e sobreestiradas (azul).c Gráfico de barras que amosa o tempo de ciclo (n = 19 cortes por grupo, de diferentes porcos), o tempo de contracción (n = 18-19 cortes por grupo, de diferentes porcos), o tempo de relaxación (n = 19 cortes por grupo, de diferentes porcos) ), a amplitude do movemento do tecido (n = 14 cortes/grupo), (peak = 14 cortes/grupo), velocidade de peak = 1 grupo, 4 velocidades/grupos diferentes. de diferentes porcos) e a taxa de relaxación máxima (n = 14 (D0), 15 (D6) ) seccións/grupos) de diferentes porcos), a proba t de Student de dúas colas non mostrou diferenzas significativas en ningún parámetro, o que indica que estes parámetros permaneceron constantes durante 6 días de cultivo con sobretensión.As barras de erro representan a media ± desviación estándar.
a Cuantificación gráfica de barras da concentración de NT-ProBNP en medios de cultivo a partir de rebanadas de corazón cultivadas en condicións de estiramento normal MT (Norm) ou sobreestiramento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4 MTOS) rebanadas/grupo de diferentes porcos, realízase ANOVA bidireccional < 0 normal.**1p. a Cuantificación gráfica de barras da concentración de NT-ProBNP en medios de cultivo a partir de rebanadas de corazón cultivadas en condicións de estiramento normal MT (Norm) ou sobreestiramento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4 MTOS) rebanadas/grupo de diferentes porcos, realízase ANOVA bidireccional < 0 ;Histograma cuantitativo da concentración de NT-ProBNP no medio de cultivo a partir de rodajas de corazón cultivadas en condicións de estiramento MT normal (norma) ou sobreestiramento (SO) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4).MTOS) cortes/grupo de diferentes porcos, realízase unha análise de varianza de dous factores;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 en comparación co estiramento normal). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓坡培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓坡閼坦4齄浓坡培养的心脏(D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；方差分析；来自不同猪的切片/练0,01). a Cuantificación da concentración de NT-ProBNP en cortes de corazón cultivados en condicións de estiramento normal MT (Norm) ou sobreestiramento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) de diferentes comparado co estiramento normal, p < 0,01).histograma Cuantificación das concentracións de NT-ProBNP en cortes de corazón cultivados en condicións de estiramento normal de MT (norma) ou sobreestiramento (SO) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) e D4 MTOS) cortes/grupo de diferentes porcos, análise bidireccional da varianza;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 en comparación co estiramento normal). b Imaxes representativas para cortes de corazón tinguidos con troponina-T e WGA (esquerda) e cuantificación do tamaño das células (dereita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) células/grupo de 10 cortes diferentes de diferentes porcos, realízase a proba t de Student de dúas colas; estiramento normal ****p < 0). b Imaxes representativas para cortes de corazón tinguidos con troponina-T e WGA (esquerda) e cuantificación do tamaño das células (dereita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) células/grupo de 10 cortes diferentes de diferentes porcos, realízase a proba t de Student de dúas colas; **** p < 10 en comparación co normal. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестова) пичнных тропонином-Т и АЗП (слестова) сердца ения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезных срезов от срезов от срезов от вория тся хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Imaxes representativas de seccións cardíacas tinguidas con troponina-T e AZP (esquerda) e cuantificación do tamaño celular (dereita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) células/grupo de 10 seccións diferentes de diferentes porcos, realizouse a proba t de Student de dúas colas; ****p < 0 en comparación coa norma 0). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表的代表的代表性30（ （（30（（30 ，来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生有尾学生切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生有尾学生 有尾学生t （D6 MTNorm ，****p < 0,0001). b Imaxes representativas de cortes de corazón tinguidos con calcareína-T e WGA (esquerda) e tamaño da célula (dereita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 de 10 cortes diferentes (D6 MTNorm)). ). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестнава ичнных) размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свируней пи, Курнеток критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Imaxes representativas de seccións cardíacas tinguidas con troponina-T e AZP (esquerda) e cuantificación do tamaño das células (dereita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) de 10 seccións diferentes de diferentes porcos) Células/grupo, criterio de dúas colas t de Student;****p < 0,0001 en comparación coa tensión normal). c Imaxes representativas para as franxas de corazón MTOS do día 0 e do día 6 inmunomarcadas para troponina-T e NFATC4 e cuantificación da translocación de NFATC4 aos núcleos de CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) cortes/grupo de diferentes porcos, realízase a proba t-p de Student de dúas colas.00; *). c Imaxes representativas para as franxas de corazón MTOS do día 0 e do día 6 inmunomarcadas para troponina-T e NFATC4 e cuantificación da translocación de NFATC4 aos núcleos de CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) cortes/grupo de diferentes porcos, * realízase a proba t-p de Student de dúas colas. c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 e 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропон и трозент 4 енная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу срезов/группу срезов/группу осви нырта озных клеток я двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Imaxes representativas para seccións cardíacas en MTOS 0 e 6 días, inmunomarcadas para troponina-T e NFATC4, e cuantificación da translocación de NFATC4 no núcleo de células cavernosas (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) cortes/grupo de diferentes porcos) realizáronse a dúas colas.*p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表怏囌标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表怏囌标记的第的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生双尾学生t 0,*锟t 0,5) c Imaxes representativas de cortes de corazón 第0天和第6天MTOS de calcanina-T e NFATC4 e NFATC4 de diferentes cantidades de núcleos de células NFATC4 易位至CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS,) 易位至CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS,)学生et 电影；*p <0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропрезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тромуномаркировки трозент 4 енная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два-статры свиней юдента; *p <0,05). c Imaxes representativas de cortes de corazón de MTOS no día 0 e 6 para a inmunomarcación de troponina-T e NFATC4 e cuantificación da translocación de NFATC4 no núcleo de CM de diferentes porcos (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) cortes/grupo, criterio t de dúas colas < 0,05 p.As barras de erro representan a media ± desviación estándar.
A investigación cardiovascular traslacional require modelos celulares que reproduzan con precisión o medio cardíaco.Neste estudo, desenvolveuse e caracterizouse un dispositivo CTCM que pode estimular seccións ultrafinas do corazón.O sistema CTCM inclúe estimulación electromecánica fisioloxicamente sincronizada e enriquecemento de fluídos T3 e Dex.Cando as seccións de corazón porcino foron expostas a estes factores, a súa viabilidade, integridade estrutural, actividade metabólica e expresión transcripcional seguían sendo as mesmas que no tecido cardíaco fresco despois de 12 días de cultivo.Ademais, o estiramento excesivo do tecido cardíaco pode causar hipertrofia do corazón causada pola hiperextensión.En xeral, estes resultados apoian o papel crítico das condicións de cultivo fisiolóxico no mantemento dun fenotipo cardíaco normal e proporcionan unha plataforma para a detección de fármacos.
Moitos factores contribúen a crear un ambiente óptimo para o funcionamento e a supervivencia dos cardiomiocitos.Os máis obvios destes factores están relacionados con (1) interaccións intercelulares, (2) estimulación electromecánica, (3) factores humorais e (4) substratos metabólicos.As interaccións fisiolóxicas célula a célula requiren complexas redes tridimensionais de múltiples tipos celulares apoiadas por unha matriz extracelular.Tales interaccións celulares complexas son difíciles de reconstruír in vitro co cultivo de tipos de células individuais, pero pódense conseguir facilmente utilizando a natureza organotípica das seccións cardíacas.
O estiramento mecánico e a estimulación eléctrica dos cardiomiocitos son fundamentais para manter o fenotipo cardíaco33,34,35.Aínda que a estimulación mecánica utilizouse amplamente para o acondicionamento e a maduración de hiPSC-CM, varios estudos elegantes intentaron recentemente a estimulación mecánica de cortes de corazón en cultivo mediante carga uniaxial.Estes estudos mostran que a carga mecánica uniaxial 2D ten un efecto positivo sobre o fenotipo do corazón durante o cultivo.Nestes estudos, as seccións do corazón foron cargadas con forzas de tracción isométricas17, carga auxotónica lineal18 ou o ciclo cardíaco foi recreado mediante realimentación do transdutor de forza e impulsos de tensión.Non obstante, estes métodos usan estiramento uniaxial do tecido sen optimización ambiental, o que orixina a supresión de moitos xenes cardíacos ou a sobreexpresión de xenes asociados con respostas anormais de estiramento.O CTCM descrito aquí proporciona un estímulo electromecánico 3D que imita o ciclo cardíaco natural en termos de tempo de ciclo e estiramento fisiolóxico (25% de estiramento, 40% de sístole, 60% de diástole e 72 latexos por minuto).Aínda que esta estimulación mecánica tridimensional por si soa non é suficiente para manter a integridade do tecido, é necesaria unha combinación de estimulación humoral e mecánica usando T3/Dex para manter adecuadamente a viabilidade, a función e a integridade do tecido.
Os factores humorais xogan un papel importante na modulación do fenotipo do corazón adulto.Isto destacou nos estudos HiPS-CM nos que se engadiron T3 e Dex aos medios de cultivo para acelerar a maduración celular.A T3 pode influír no transporte de aminoácidos, azucres e calcio a través das membranas celulares36.Ademais, a T3 promove a expresión de MHC-α e a regulación á baixa de MHC-β, promovendo a formación de miofibrillas de contracción rápida en cardiomiocitos maduros en comparación coas miofibrillas de contracción lenta na CM fetal.A deficiencia de T3 en pacientes hipotiroideos provoca a perda de bandas miofibrilares e unha taxa reducida de desenvolvemento do ton37.Dex actúa sobre os receptores de glucocorticoides e demostrouse que aumenta a contractilidade do miocardio en corazóns perfundidos illados;38 pénsase que esta mellora está relacionada co efecto sobre a entrada impulsada por depósitos de calcio (SOCE) 39,40.Ademais, Dex únese aos seus receptores, provocando unha resposta intracelular ampla que suprime a función inmune e a inflamación30.
Os nosos resultados indican que a estimulación física mecánica (MS) mellorou o rendemento global do cultivo en comparación co Ctrl, pero non logrou manter a viabilidade, a integridade estrutural e a expresión cardíaca durante 12 días en cultivo.En comparación con Ctrl, a adición de T3 e Dex aos cultivos CTCM (MT) mellorou a viabilidade e mantivo perfís de transcrición, integridade estrutural e actividade metabólica similares durante 12 días con tecido cardíaco fresco.Ademais, controlando o grao de estiramento do tecido, creouse un modelo de hipertrofia cardíaca inducida por hiperextensión mediante STCM, que ilustra a versatilidade do sistema STCM.Cómpre sinalar que aínda que a remodelación cardíaca e a fibrose adoitan implicar órganos intactos cuxas células circulantes poden proporcionar as citocinas adecuadas, así como a fagocitose e outros factores de remodelación, as seccións do corazón aínda poden imitar o proceso fibrótico en resposta ao estrés e ao trauma.en miofibroblastos.Isto avaliouse previamente neste modelo de corte cardíaco.Cómpre sinalar que os parámetros CTCM pódense modular cambiando a presión/amplitude eléctrica e a frecuencia para simular moitas condicións como taquicardia, bradicardia e soporte circulatorio mecánico (corazón descargado mecánico).Isto fai do sistema un rendemento medio para probas de drogas.A capacidade do CTCM para modelar a hipertrofia cardíaca inducida polo sobreesforzo abre o camiño para probar este sistema para unha terapia personalizada.En conclusión, o presente estudo demostra que o estiramento mecánico e a estimulación humoral son fundamentais para manter o cultivo de seccións de tecido cardíaco.
Aínda que os datos aquí presentados suxiren que CTCM é unha plataforma moi prometedora para modelar o miocardio intacto, este método de cultivo ten algunhas limitacións.A principal limitación do cultivo CTCM é que impón esforzos mecánicos dinámicos continuos nos cortes, o que impide a capacidade de controlar activamente as contraccións do corte cardíaco durante cada ciclo.Ademais, debido ao pequeno tamaño das seccións cardíacas (7 mm), a capacidade de avaliar a función sistólica fóra dos sistemas de cultivo mediante sensores de forza tradicionais é limitada.No manuscrito actual, superamos parcialmente esta limitación avaliando a tensión óptica como un indicador da función contráctil.Non obstante, esta limitación requirirá máis traballo e pode abordarse no futuro mediante a introdución de métodos para o seguimento óptico da función dos cortes de corazón en cultivo, como o mapeo óptico utilizando colorantes sensibles ao calcio e á tensión.Outra limitación do CTCM é que o modelo de traballo non manipula o estrés fisiolóxico (precarga e poscarga).No CTCM, a presión foi inducida en direccións opostas para reproducir un 25% de estiramento fisiolóxico na diástole (estiramento completo) e a sístole (longitude da contracción durante a estimulación eléctrica) en tecidos moi grandes.Esta limitación debería eliminarse en futuros deseños de CTCM mediante unha presión adecuada sobre o tecido cardíaco desde ambos os dous lados e aplicando as relacións exactas presión-volume que se producen nas cámaras do corazón.
A remodelación inducida polo exceso de estiramento informada neste manuscrito limítase a imitar sinais hipertróficos de hiperestiramento.Así, este modelo pode axudar no estudo da sinalización hipertrófica inducida por estiramento sen necesidade de factores humorais ou neuronais (que non existen neste sistema).Son necesarios máis estudos para aumentar a multiplicidade de CTCM, por exemplo, o co-cultivo con células inmunitarias, os factores humorais do plasma circulante e a inervación cando se co-cultivo con células neuronais mellorará as posibilidades de modelado de enfermidades con CTCM.
Neste estudo utilizáronse trece porcos.Todos os procedementos con animais realizáronse de acordo coas directrices institucionais e foron aprobados polo Comité Institucional de Uso e Coidado de Animais da Universidade de Louisville.Fixouse o arco aórtico e perfundiuse o corazón con 1 L de cardioplexia estéril (NaCl 110 mM, CaCl2 1,2 mM, KCl 16 mM, MgCl2 16 mM, NaHCO3 10 mM, heparina 5 U/mL, pH ata 7,4); os corazóns conserváronse en solución cardiopléxica xeada ata que foron transportados ao laboratorio sobre xeo que adoita ser <10 min. os corazóns conserváronse en solución cardiopléxica xeada ata que foron transportados ao laboratorio sobre xeo que adoita ser <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на, лчдон на é <10 min. os corazóns almacenáronse en solución cardiopléxica xeada ata o seu traslado ao laboratorio en xeo, o que normalmente leva menos de 10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычмно <10. Manter os corazóns en xeo a cardioplexia ata o seu traslado ao laboratorio en xeo, normalmente <10 min.
O dispositivo CTCM foi desenvolvido no software de deseño asistido por ordenador (CAD) SolidWorks.As cámaras de cultivo, divisores e cámaras de aire están feitas de plástico acrílico transparente CNC.O anel de respaldo de 7 mm de diámetro está feito de polietileno de alta densidade (HDPE) no centro e ten unha ranura de junta tórica para acomodar a junta tórica de silicona utilizada para selar o material debaixo.Unha fina membrana de sílice separa a cámara de cultivo da placa de separación.A membrana de silicona está cortada con láser a partir dunha folla de silicona de 0,02 polgadas de espesor e ten unha dureza de 35 A.As xuntas de silicona inferior e superior están cortadas con láser a partir de láminas de silicona de 1/16 "de espesor e teñen unha dureza de 50 A.Os parafusos de aceiro inoxidable 316L e as porcas ás utilízanse para fixar o bloque e crear un selado hermético.
Unha placa de circuíto impreso (PCB) dedicada está deseñada para integrarse co sistema C-PACE-EM.Os conectores da máquina suíza do PCB están conectados a electrodos de grafito mediante fíos de cobre bañados en prata e parafusos de bronce 0-60 atornillados nos electrodos.A placa de circuíto impreso colócase na tapa da impresora 3D.
O dispositivo CTCM está controlado por un actuador pneumático programable (PPD) que crea unha presión circulatoria controlada similar a un ciclo cardíaco.A medida que aumenta a presión dentro da cámara de aire, a membrana flexible de silicona se expande cara arriba, forzando o medio debaixo do lugar do tecido.A área do tecido estirarase entón por esta expulsión de líquido, imitando a expansión fisiolóxica do corazón durante a diástole.No pico da relaxación, a estimulación eléctrica foi aplicada a través de electrodos de grafito, que reduciu a presión na cámara de aire e provocou a contracción das seccións de tecido.No interior do tubo hai unha válvula hemostática cun sensor de presión para detectar a presión no sistema de aire.A presión detectada polo sensor de presión aplícase a un colector de datos conectado ao portátil.Isto permite un seguimento continuo da presión dentro da cámara de gas.Cando se alcanzou a presión máxima da cámara (estándar 80 mmHg, 140 mmHg OS), ordenouse ao dispositivo de adquisición de datos que enviara un sinal ao sistema C-PACE-EM para xerar un sinal de tensión bifásico durante 2 ms, configurado en 4 V.
Obtivéronse seccións de corazón e realizáronse as condicións de cultivo en 6 pozos do seguinte xeito: Transferencia dos corazóns collidos do recipiente de transferencia a unha bandexa que contiña cardioplexia fría (4 °C).Illouse o ventrículo esquerdo cunha lámina estéril e cortouse en anacos de 1-2 cm3.Estes bloques de tecido uníronse a soportes de tecido con adhesivo de tecido e colocáronse nun baño de tecido de microtomo vibrante que contiña solución de Tyrode e osixenáronse continuamente (3 g/L de 2,3-butanodiona monooxima (BDM), NaCl 140 mM (8,18 g), (0,18 g), (0,18 g de glicosa), (0,14 mM) ), HEPES 10 mM (2,38 g), MgCl2 1 mM (1 ml de solución 1 M), CaCl2 1,8 mM (solución 1 M de 1,8 ml), ata 1 L de ddH2O).O micrótomo vibrante foi configurado para cortar cortes de 300 µm de grosor a unha frecuencia de 80 Hz, unha amplitude de vibración horizontal de 2 mm e unha velocidade de avance de 0,03 mm/s.O baño de tecidos foi rodeado de xeo para manter a solución fresca e a temperatura mantívose a 4 °C.Transferir seccións de tecido do baño de microtomos a un baño de incubación que conteña solución de Tyrode osixenada continuamente sobre xeo ata que se obteñan seccións suficientes para unha placa de cultivo.Para os cultivos transwell, as seccións de tecido uníronse a soportes de poliuretano estériles de 6 mm de ancho e colocáronse en 6 ml de medio optimizado (medio 199, suplemento ITS 1x, FBS 10%, VEGF 5 ng/ml, alcalino FGF 10 ng/ml e antifúngico 2X).A estimulación eléctrica (10 V, frecuencia 1,2 Hz) aplicouse ás seccións de tecido a través do C-Pace.Para as condicións de TD, engadíronse T3 e Dex frescos a 100 nM e 1 μM en cada cambio de medio.O medio está saturado con osíxeno antes de substituílo 3 veces ao día.Cultiváronse seccións de tecido nunha incubadora a 37 °C e 5% CO2.
Para os cultivos CTCM, colocáronse seccións de tecido nunha impresora 3D feita a medida nunha placa de Petri que contén solución de Tyrode modificada.O dispositivo está deseñado para aumentar o tamaño da porción do corazón nun 25% da área do anel de soporte.Isto faise para que as seccións do corazón non se estiren despois de ser transferidas da solución de Tyrode ao medio e durante a diástole.Usando cola histoacrílica, fixáronse seccións de 300 µm de espesor nun anel de soporte de 7 mm de diámetro.Despois de unir as seccións de tecido ao anel de soporte, corte as seccións de tecido en exceso e coloque as seccións de tecido adheridas de novo ao baño de solución de Tyrode en xeo (4 °C) ata que se preparen suficientes seccións para un dispositivo.O tempo total de procesamento de todos os dispositivos non debe superar as 2 horas.Despois de que 6 seccións de tecido foron unidas aos seus aneis de soporte, montouse o dispositivo CTCM.A cámara de cultivo CTCM está pre-enchada con 21 ml de medio pre-osixenado.Transferir as seccións de tecido á cámara de cultivo e eliminar coidadosamente as burbullas de aire cunha pipeta.A sección de tecido é entón guiada no burato e presiona suavemente no seu lugar.Finalmente, coloque a tapa do electrodo no dispositivo e transfira o dispositivo á incubadora.A continuación, conecte o CTCM ao tubo de aire e ao sistema C-PACE-EM.O actuador pneumático ábrese e a válvula de aire abre o CTCM.O sistema C-PACE-EM configurouse para entregar 4 V a 1,2 Hz durante a estimulación bifásica durante 2 ms.O medio foi cambiado dúas veces ao día e os electrodos foron cambiados unha vez ao día para evitar a acumulación de grafito nos eléctrodos.Se é necesario, pódense eliminar seccións de tecido dos seus pozos de cultivo para expulsar as burbullas de aire que puidesen caer baixo elas.Para as condicións de tratamento con MT, engadiuse T3/Dex fresco con cada cambio de medio con 100 nM de T3 e 1 μM de Dex.Os dispositivos CTCM foron cultivados nunha incubadora a 37°C e 5% CO2.
Para obter traxectorias estiradas de cortes de corazón, desenvolveuse un sistema de cámara especial.Utilizouse unha cámara SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Xapón) cunha lente macro Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, CA).A visualización realizouse a temperatura ambiente despois de substituír o medio por medio fresco.A cámara sitúase nun ángulo de 51° e o vídeo grávase a 30 cadros por segundo.En primeiro lugar, utilizouse o software de código aberto (MUSCLEMOTION43) con Image-J para cuantificar o movemento dos cortes de corazón.A máscara creouse mediante MATLAB (MathWorks, Natick, MA, EE. UU.) para definir rexións de interese para latexar cortes de corazón para evitar ruído.As máscaras segmentadas manualmente aplícanse a todas as imaxes nunha secuencia de fotogramas e despois pásanse ao complemento MUSCLEMOTION.Muscle Motion utiliza a intensidade media dos píxeles en cada fotograma para cuantificar o seu movemento en relación co marco de referencia.Os datos rexistráronse, filtráronse e utilizáronse para cuantificar o tempo do ciclo e avaliar o estiramento do tecido durante o ciclo cardíaco.O vídeo gravado foi posprocesado mediante un filtro dixital de fase cero de primeira orde.Para cuantificar o estiramento do tecido (pico a pico), realizouse unha análise de pico a pico para distinguir entre picos e valles no sinal rexistrado.Ademais, a eliminación de tendencias realízase mediante un polinomio de 6ª orde para eliminar a deriva do sinal.O código do programa desenvolveuse en MATLAB para determinar o movemento global do tecido, o tempo de ciclo, o tempo de relaxación e o tempo de contracción (Código de programa complementario 44).
Para a análise da tensión, usando os mesmos vídeos creados para a avaliación do estiramento mecánico, primeiro trazamos dúas imaxes que representan picos de movemento (os puntos de movemento máis alto (superior) e máis baixo (inferior) segundo o software MUSCLEMOTION.A continuación, segmentamos as rexións do tecido e aplicamos unha forma de algoritmo de sombreado ao tecido segmentado (figura complementaria 2a).O tecido segmentado dividiuse entón en dez subsuperficies, e a tensión en cada superficie calculouse mediante a seguinte ecuación: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, onde Sup e Sdown son as distancias da forma das sombras superior e inferior do tecido, respectivamente (figura complementaria .2b).
As seccións cardíacas fixéronse en paraformaldehído ao 4% durante 48 horas.Os tecidos fixos deshidratáronse nun 10% e un 20% de sacarosa durante 1 h, despois nun 30% de sacarosa durante a noite.A continuación, as seccións foron incrustadas nun composto de temperatura de corte óptima (composto OCT) e conxeláronse gradualmente nun baño de isopentano/xeo seco.Almacene os bloques de incorporación de OCT a -80 °C ata a separación.Preparáronse as láminas como seccións cun espesor de 8 μm.
Para eliminar OCT das seccións cardíacas, quenta as láminas nun bloque de calefacción a 95 °C durante 5 min.Engadir 1 ml de PBS a cada portaobjetos e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente, despois impregnar as seccións configurando 0,1% de Triton-X en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente.Para evitar que os anticorpos inespecíficos se unan á mostra, engade 1 ml de solución de BSA ao 3% aos portas e incúbalo durante 1 hora a temperatura ambiente.A continuación, eliminouse o BSA e laváronse as láminas con PBS.Marca cada mostra cun lapis.Engadíronse anticorpos primarios (diluídos 1:200 nun 1% de BSA) (conexina 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) e troponina-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) ao longo de 90 minutos, despois engadíronse anticorpos secundarios contra 14%BSAdilución de rato (BSA200) (Thermo Scientific; #A16079), contra o coello Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) durante 90 minutos adicionais. e microscopio Keyence con aumento de 40x.
Utilizouse WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) a 5 μg/ml en PBS para a tinción con WGA e aplicouse a seccións fixas durante 30 minutos a temperatura ambiente.A continuación, laváronse as láminas con PBS e engadiuse negro de Sudán a cada lámina e incubáronse durante 30 minutos.A continuación, laváronse as láminas con PBS e engadiuse medio de incorporación vectashield.As diapositivas foron visualizadas nun microscopio Keyence cun aumento de 40x.
OCT foi eliminado das mostras como se describe anteriormente.Despois de eliminar o OCT, mergullo as láminas na solución de Bouin durante a noite.A continuación, as láminas enxágües con auga destilada durante 1 hora e despois colocáronse nunha solución de fucsina de ácido de aloe Bibrich durante 10 minutos.A continuación, laváronse as láminas con auga destilada e colocáronse nunha solución de 5% de fosfomolibdeno/5% de ácido fosfotúngstico durante 10 minutos.Sen aclarar, transfire as láminas directamente á solución de azul de anilina durante 15 minutos.A continuación, laváronse as láminas con auga destilada e colocáronse nunha solución de ácido acético ao 1% durante 2 minutos.As láminas secáronse en etanol 200 N e transfirieron a xileno.As diapositivas teñidas foron visualizadas mediante un microscopio Keyence cun obxectivo 10x.A porcentaxe de área de fibrose cuantificouse mediante o software Keyence Analyzer.
Ensaio de viabilidade celular CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), número de catálogo V13154, segundo o protocolo do fabricante con algunhas modificacións.En particular, utilizouse un punzón cirúrxico cun diámetro de 6 mm para garantir un tamaño uniforme do tecido durante a análise MTT.Os tecidos foron colocados individualmente nos pozos dunha placa de 12 pozos que contén substrato MTT segundo o protocolo do fabricante.As seccións incúbanse a 37° C durante 3 horas e o tecido vivo metaboliza o substrato MTT para formar un composto de formazán roxo.Substitúe a solución MTT con 1 ml de DMSO e incube a 37 °C durante 15 minutos para extraer formazán morado das seccións do corazón.As mostras diluíronse 1:10 en DMSO en placas de fondo transparentes de 96 pozos e a intensidade da cor púrpura medida a 570 nm usando un lector de placas Cytation (BioTek).As lecturas normalizáronse ao peso de cada porción do corazón.
Substituíuse o medio de corte de corazón por medio que conteña 1 μCi/ml [5-3H]-glicosa (Moravek Biochemicals, Brea, CA, EUA) para o ensaio de utilización de glicosa como se describiu anteriormente.Despois de 4 horas de incubación, engade 100 µl de medio a un tubo de microcentrífuga aberto que contén 100 µl de HCl 0,2 N.Despois colocouse o tubo nun tubo de centelleo que contiña 500 μl de dH2O para evaporar [3H]2O durante 72 horas a 37 °C.A continuación, retire o tubo de microcentrífuga do tubo de centelleo e engade 10 ml de fluído de centelleo.Os recontos de escintilación realizáronse mediante un analizador de centelleo líquido Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, EUA).Despois calculouse a utilización de glicosa tendo en conta a actividade específica da [5-3H]-glicosa, o equilibrio e o fondo incompletos, a dilución de [5-3H]-a glicosa non marcada e a eficiencia do contador de escintilación.Os datos están normalizados para a masa de seccións do corazón.
Despois da homoxeneización do tecido en Trizol, illouse o ARN das seccións cardíacas mediante o Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 segundo o protocolo do fabricante.A preparación, a secuenciación e a análise de datos da biblioteca de RNAsec realizáronse do seguinte xeito:
Utilizouse 1 μg de ARN por mostra como material de partida para a preparación da biblioteca de ARN.As bibliotecas de secuenciación foron xeradas mediante o NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit for Illumina (NEB, EUA) seguindo as recomendacións do fabricante e engadíronse códigos índice ás secuencias de atributos de cada mostra.Brevemente, o ARNm purificouse do ARN total usando perlas magnéticas unidas con oligonucleótidos poli-T.A fragmentación realízase utilizando catións divalentes a alta temperatura no tampón de reacción de síntese da primeira febra NEBNext (5X).O ADNc da primeira cadea sintetizouse usando cebadores hexámeros aleatorios e transcriptase inversa M-MuLV (RNase H-).A segunda cadea de ADNc sintetízase despois usando ADN polimerase I e RNase H. Os salientes restantes convértense en extremos romos mediante a actividade exonuclease/polimerase.Despois da adenilación do extremo 3′ do fragmento de ADN, únese a el un adaptador NEBNext cunha estrutura de bucle de horquilla para preparalo para a hibridación.Para a selección de fragmentos de ADNc de lonxitude preferida 150-200 pb.Os fragmentos da biblioteca purificáronse mediante o sistema AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, EUA).A continuación, utilizáronse 3 μl de enzima USER (NEB, EUA) con ADNc seleccionado por tamaño ligado cun adaptador durante 15 minutos a 37 °C e despois durante 5 minutos a 95 °C antes da PCR.A continuación realizouse a PCR usando ADN polimerase de alta fidelidade Phusion, cebadores universais de PCR e cebadores Index (X).Finalmente, purificáronse os produtos de PCR (sistema AMPure XP) e avaliouse a calidade da biblioteca nun sistema Agilent Bioanalyzer 2100.A biblioteca de ADNc foi entón secuenciada usando un secuenciador Novaseq.Os ficheiros de imaxe en bruto de Illumina convertéronse en lecturas en bruto mediante a chamada base CASAVA.Os datos en bruto gárdanse en ficheiros de formato FASTQ(fq) que conteñen secuencias de lectura e calidades base correspondentes.Seleccione HISAT2 para facer coincidir as lecturas de secuenciación filtradas co xenoma de referencia Sscrofa11.1.En xeral, HISAT2 admite xenomas de calquera tamaño, incluíndo xenomas superiores a 4.000 millóns de bases, e os valores predeterminados están establecidos para a maioría dos parámetros.As lecturas de empalme dos datos de ARN Seq pódense aliñar de forma eficiente usando HISAT2, o sistema máis rápido dispoñible actualmente, coa mesma ou mellor precisión que calquera outro método.
A abundancia de transcricións reflicte directamente o nivel de expresión xénica.Os niveis de expresión xénica avalíanse pola abundancia de transcritos (conto de secuenciación) asociados co xenoma ou os exóns.O número de lecturas é proporcional aos niveis de expresión xénica, a lonxitude do xene e a profundidade da secuenciación.Calculáronse os FPKM (fragmentos por mil pares de bases de transcrición secuenciados por millón de pares de bases) e determináronse os valores P de expresión diferencial mediante o paquete DESeq2.A continuación, calculamos a taxa de descubrimento falso (FDR) para cada valor P mediante o método Benjamini-Hochberg9 baseado na función R integrada "p.adjust".
O ARN illado de seccións cardíacas converteuse en cDNA a unha concentración de 200 ng/μl usando a mestura SuperScript IV Vilo Master de Thermo (Thermo, n.º de cat. 11756050).Realizouse a RT-PCR cuantitativa utilizando unha placa de reacción transparente de 384 pocillos de Applied Biosystems Endura Plate Microamp (Thermo, n.º de cat. 4483319) e un adhesivo óptico de microamperios (Thermo, n.o de cat. 4311971).A mestura de reacción consistiu en 5 µl de Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, número de cat. 4444557), 0,5 µl de Taqman Primer e 3,5 µl de H2O mesturados por pozo.Realizáronse ciclos estándar de qPCR e medironse os valores de CT utilizando un instrumento de PCR en tempo real Applied Biosystems Quantstudio 5 (módulo de 384 pocillos; produto # A28135).Os cebadores Taqman foron adquiridos de Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss068668_m1), (Ss06908795_m1), (Ss068680_m1), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) Normalizáronse os valores de mantemento de CTDH para todos os GCT.
A liberación no medio de NT-ProBNP avaliouse mediante o kit NT-ProBNP (porco) (núm. cat. MBS2086979, MyBioSource) segundo o protocolo do fabricante.Brevemente, engadíronse 250 µl de cada mostra e patrón por duplicado a cada pozo.Inmediatamente despois de engadir a mostra, engade 50 µl de reactivo de ensaio A a cada pozo.Axite suavemente a placa e sela con selante.Despois, os comprimidos incubáronse a 37 °C durante 1 hora.A continuación, aspire a solución e lave os pozos 4 veces con 350 µl de solución de lavado 1X, incubando a solución de lavado durante 1-2 minutos cada vez.A continuación, engade 100 µl de reactivo de ensaio B por pozo e selado con selante de placas.O comprimido foi axitado suavemente e incubado a 37 ° C durante 30 minutos.Aspire a solución e lave os pozos 5 veces con 350 µl de solución de lavado 1X.Engadir 90 µl de solución de substrato a cada pozo e selar a placa.Incubar a placa a 37 °C durante 10-20 minutos.Engadir 50 µl de solución de parada a cada pozo.A placa foi inmediatamente medida usando un lector de placas Cytation (BioTek) establecido a 450 nm.
Realizáronse análises de potencia para escoller os tamaños de grupos que proporcionarán >80% de potencia para detectar un cambio absoluto do 10% no parámetro cunha taxa de erro de tipo I do 5%. Realizáronse análises de potencia para escoller os tamaños de grupos que proporcionarán >80% de potencia para detectar un cambio absoluto do 10% no parámetro cunha taxa de erro de tipo I do 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощноя ти1 бора размеров групп солютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Realizouse unha análise de potencia para seleccionar tamaños de grupos que proporcionarían > 80 % de potencia para detectar un cambio absoluto do 10 % do parámetro cunha taxa de erro de tipo I do 5 %.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％的型和5％的玥检测参数中10进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％的型和5％的玥检测参数中10 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% моснощ 10% абсолютного изменения параметров e 5% частоты ошибок типа I. Realizouse unha análise de potencia para seleccionar un tamaño de grupo que proporcionase unha potencia superior ao 80% para detectar un cambio de parámetro absoluto do 10% e unha taxa de erro tipo I do 5%.Seleccionáronse aleatoriamente seccións de tecido antes do experimento.Todas as análises foron cegas e as mostras foron decodificadas só despois de que todos os datos foran analizados.Utilizouse o software GraphPad Prism (San Diego, CA) para realizar todas as análises estatísticas. Para todas as estatísticas, os valores p consideráronse significativos en valores <0,05. Para todas as estatísticas, os valores p consideráronse significativos en valores <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Para todas as estatísticas, os valores p consideráronse significativos en valores <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Para todas as estatísticas, os valores p consideráronse significativos en valores <0,05.Realizouse a proba t de Student de dúas colas sobre os datos con só dúas comparacións.Utilizouse ANOVA unidireccional ou bidireccional para determinar a significación entre múltiples grupos.Ao realizar probas post hoc, aplicouse a corrección de Tukey para contabilizar varias comparacións.Os datos de RNAsec teñen consideracións estatísticas especiais ao calcular FDR e p.adjust como se describe na sección Métodos.
Para obter máis información sobre o deseño do estudo, consulte o resumo do informe de investigación da natureza vinculado a este artigo.