Grazas por visitar Nature.com. A versión do navegador que estás a usar ten compatibilidade limitada con CSS. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que uses un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Mentres tanto, para garantir a compatibilidade continua, renderizaremos o sitio sen estilos nin JavaScript.
Necesítase un sistema in vitro fiable que poida reproducir con precisión o ambiente fisiolóxico do corazón para as probas de fármacos. A dispoñibilidade limitada de sistemas de cultivo de tecido cardíaco humano levou a interpretacións inexactas dos efectos dos fármacos cardíacos. Aquí, desenvolvemos un modelo de cultivo de tecido cardíaco (CTCM) que estimula electromecanicamente cortes de corazón e sofre un estiramento fisiolóxico durante as fases sistólica e diastólica do ciclo cardíaco. Despois de 12 días de cultivo, esta estratexia mellorou parcialmente a viabilidade das seccións do corazón, pero non preservou totalmente a súa integridade estrutural. Polo tanto, despois da selección de pequenas moléculas, descubrimos que a adición de 100 nM de triiodotironina (T3) e 1 μM de dexametasona (Dex) ao noso medio mantivo a microestrutura das seccións durante 12 días. En combinación co tratamento con T3/Dex, o sistema CTCM mantivo os perfís transcricionais, a viabilidade, a actividade metabólica e a integridade estrutural ao mesmo nivel que o tecido cardíaco fresco durante 12 días. Ademais, o estiramento excesivo do tecido cardíaco en cultivo induce a sinalización cardíaca hipertrófica, o que proporciona evidencias da capacidade da CTCM para imitar as condicións hipertróficas inducidas polo estiramento cardíaco. En conclusión, a CTCM pode modelar a fisioloxía e a fisiopatoloxía do corazón en cultivo durante longos períodos de tempo, o que permite unha detección fiable de fármacos.
Antes da investigación clínica, necesítanse sistemas in vitro fiables que poidan reproducir con precisión o ambiente fisiolóxico do corazón humano. Estes sistemas deberían imitar o estiramento mecánico alterado, a frecuencia cardíaca e as propiedades electrofisiolóxicas. Os modelos animais úsanse habitualmente como plataforma de cribado para a fisioloxía cardíaca, cunha fiabilidade limitada á hora de reflectir os efectos dos fármacos no corazón humano1,2. En definitiva, o Modelo Experimental de Cultivo de Tecidos Cardíacos Ideal (CTCM) é un modelo altamente sensible e específico para diversas intervencións terapéuticas e farmacolóxicas, que reproduce con precisión a fisioloxía e a fisiopatoloxía do corazón humano3. A ausencia dun sistema deste tipo limita o descubrimento de novos tratamentos para a insuficiencia cardíaca4,5 e levou á cardiotoxicidade dos fármacos como unha das principais razóns para saír do mercado6.
Durante a última década, retiráronse do uso clínico oito fármacos non cardiovasculares porque causan prolongación do intervalo QT, o que leva a arritmias ventriculares e morte súbita7. Polo tanto, existe unha necesidade crecente de estratexias de cribado preclínico fiables para avaliar a eficacia e a toxicidade cardiovasculares. O uso recente de cardiomiocitos derivados de células nai pluripotentes inducidas por humanos (hiPS-CM) no cribado de fármacos e nas probas de toxicidade proporciona unha solución parcial a este problema. Non obstante, a natureza inmatura dos hiPS-CM e a falta de complexidade multicelular do tecido cardíaco son as principais limitacións deste método. Estudos recentes demostraron que esta limitación pódese superar parcialmente utilizando hiPS-CM temperáns para formar hidroxeles de tecido cardíaco pouco despois do inicio das contraccións espontáneas e aumentando gradualmente a estimulación eléctrica co tempo. Non obstante, estes microtecidos hiPS-CM carecen das propiedades electrofisiolóxicas e contráctiles maduras do miocardio adulto. Ademais, o tecido cardíaco humano ten unha estrutura máis complexa, que consiste nunha mestura heteroxénea de diferentes tipos de células, incluíndo células endoteliais, neuronas e fibroblastos estromais, interconectados por conxuntos específicos de proteínas da matriz extracelular. Esta heteroxeneidade das poboacións non cardiomiocíticas11,12,13 no corazón de mamíferos adultos é un obstáculo importante para modelar o tecido cardíaco utilizando tipos de células individuais. Estas importantes limitacións salientan a importancia de desenvolver métodos para cultivar tecido miocárdico intacto en condicións fisiolóxicas e patolóxicas.
As seccións finas (300 µm) cultivadas do corazón humano demostraron ser un modelo prometedor de miocardio humano intacto. Este método proporciona acceso a un sistema multicelular 3D completo similar ao tecido cardíaco humano. Non obstante, ata 2019, o uso de seccións de corazón cultivadas estaba limitado pola curta supervivencia do cultivo (24 h). Isto débese a unha serie de factores, incluíndo a falta de estiramento físico-mecánico, a interface aire-líquido e o uso de medios simples que non satisfacen as necesidades do tecido cardíaco. En 2019, varios grupos de investigación demostraron que a incorporación de factores mecánicos nos sistemas de cultivo de tecido cardíaco pode prolongar a vida útil do cultivo, mellorar a expresión cardíaca e imitar a patoloxía cardíaca. Dous estudos elegantes 17 e 18 mostran que a carga mecánica uniaxial ten un efecto positivo no fenotipo cardíaco durante o cultivo. Non obstante, estes estudos non utilizaron a carga físico-mecánica tridimensional dinámica do ciclo cardíaco, xa que as seccións de corazón cargáronse con forzas de tracción isométricas 17 ou carga auxotónica lineal 18. Estes métodos de estiramento de tecidos resultaron na supresión de moitos xenes cardíacos ou na sobreexpresión de xenes asociados con respostas de estiramento anormais. Cabe destacar que Pitoulis et al. 19 desenvolveron un baño de cultivo dinámico de cortes de corazón para a reconstrución do ciclo cardíaco mediante retroalimentación de transdutores de forza e accionamentos de tensión. Aínda que este sistema permite unha modelización in vitro do ciclo cardíaco máis precisa, a complexidade e o baixo rendemento do método limitan a aplicación deste sistema. O noso laboratorio desenvolveu recentemente un sistema de cultivo simplificado mediante estimulación eléctrica e un medio optimizado para manter a viabilidade de seccións de tecido cardíaco porcino e humano ata 6 días 20,21.
No presente manuscrito, describimos un modelo de cultivo de tecido cardíaco (CTCM) que emprega seccións do corazón porcino e que incorpora indicios humorais para recapitular a fisioloxía cardíaca tridimensional e a distensión fisiopatolóxica durante o ciclo cardíaco. Este CTCM pode aumentar a precisión da predición preclínica de fármacos a un nivel nunca antes acadado ao proporcionar un sistema cardíaco rendible e de rendemento medio que imita a fisioloxía/fisioloxía do corazón dos mamíferos para as probas preclínicas de fármacos.
Os sinais mecánicos hemodinámicos desempeñan un papel fundamental no mantemento da función dos cardiomiocitos in vitro 22,23,24. No presente manuscrito, desenvolvemos un CTCM (Figura 1a) que pode imitar o ambiente cardíaco adulto ao inducir a estimulación tanto eléctrica como mecánica a frecuencias fisiolóxicas (1,2 Hz, 72 latexos por minuto). Para evitar o estiramento excesivo do tecido durante a diástole, utilizouse un dispositivo de impresión 3D para aumentar o tamaño do tecido nun 25 % (Fig. 1b). A estimulación eléctrica inducida polo sistema C-PACE temporizouse para comezar 100 ms antes da sístole utilizando un sistema de adquisición de datos para reproducir completamente o ciclo cardíaco. O sistema de cultivo de tecidos utiliza un actuador pneumático programable (LB Engineering, Alemaña) para expandir ciclicamente unha membrana de silicona flexible para provocar a expansión das porcións de corazón na cámara superior. O sistema conectouse a unha liña de aire externa a través dun transdutor de presión, o que permitiu axustar con precisión a presión (± 1 mmHg) e o tempo (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Fixe a sección de tecido ao anel de soporte de 7 mm, que se mostra en azul, dentro da cámara de cultivo do dispositivo. A cámara de cultivo está separada da cámara de aire por unha fina membrana de silicona flexible. Coloque unha xunta entre cada cámara para evitar fugas. A tapa do dispositivo contén eléctrodos de grafito que proporcionan estimulación eléctrica. b Representación esquemática do dispositivo de tecido grande, o anel guía e o anel de soporte. As seccións de tecido (marrón) colócanse no dispositivo de gran tamaño co anel guía colocado na ranura do bordo exterior do dispositivo. Usando a guía, coloque con coidado o anel de soporte revestido con adhesivo acrílico para tecidos sobre a sección de tecido cardíaco. c Gráfico que mostra o tempo de estimulación eléctrica en función da presión da cámara de aire controlada por un actuador pneumático programable (PPD). Utilizouse un dispositivo de adquisición de datos para sincronizar a estimulación eléctrica mediante sensores de presión. Cando a presión na cámara de cultivo alcanza o limiar establecido, envíase un sinal de pulso ao C-PACE-EM para activar a estimulación eléctrica. d Imaxe de catro CTCM colocados nunha estantería de incubadora. Catro dispositivos están conectados a un PPD a través dun circuíto pneumático e insírense sensores de presión na válvula hemostática para monitorizar a presión no circuíto pneumático. Cada dispositivo contén seis seccións de tecido.
Usando un único actuador pneumático, puidemos controlar 4 dispositivos CTCM, cada un dos cales podía conter 6 seccións de tecido (Fig. 1d). En CTCM, a presión do aire na cámara de aire convértese en presión síncrona na cámara de fluído e induce a expansión fisiolóxica da sección cardíaca (Figura 2a e Película Suplementaria 1). A avaliación do estiramento do tecido a 80 mm Hg. Art. mostrou un estiramento das seccións de tecido nun 25 % (Fig. 2b). Demostrouse que esta porcentaxe de estiramento corresponde a unha lonxitude fisiolóxica do sarcómero de 2,2–2,3 µm para a contractilidade normal da sección cardíaca17,19,25. O movemento do tecido avaliouse mediante a configuración personalizada da cámara (Figura Suplementaria 1). A amplitude e a velocidade do movemento do tecido (Fig. 2c, d) correspondían ao estiramento durante o ciclo cardíaco e ao tempo durante a sístole e a diástole (Fig. 2b). O estiramento e a velocidade do tecido cardíaco durante a contracción e a relaxación permaneceron constantes durante 12 días en cultivo (Fig. 2f). Para avaliar o efecto da estimulación eléctrica na contractilidade durante o cultivo, desenvolvemos un método para determinar a deformidade activa empregando un algoritmo de sombreado (Fig. suplementaria 2a,b) e puidemos distinguir entre deformidades con e sen estimulación eléctrica. A mesma sección do corazón (Fig. 2f). Na rexión móbil do corte (R6-9), a voltaxe durante a estimulación eléctrica foi un 20 % maior que en ausencia de estimulación eléctrica, o que indica a contribución da estimulación eléctrica á función contráctil.
As trazas representativas das medicións da presión da cámara de aire, da presión da cámara de fluído e do movemento dos tecidos confirman que a presión da cámara cambia a presión da cámara de fluído, causando un movemento correspondente da porción de tecido. b Trazas representativas da porcentaxe de estiramento (azul) das seccións de tecido correspondentes á porcentaxe de estiramento (laranxa). c O movemento medido da porción cardíaca é consistente coa velocidade de movemento medida. (d) Traxectorias representativas do movemento cíclico (liña azul) e da velocidade (liña punteada laranxa) nunha porción do corazón. e Cuantificación do tempo de ciclo (n = 19 porcións por grupo, de diferentes porcos), tempo de contracción (n = 19 porcións por grupo), tempo de relaxación (n = 19 porcións por grupo, de diferentes porcos), movemento dos tecidos (n = 25 porcións/grupo de diferentes porcos), velocidade sistólica máxima (n = 24(D0), 25(D12) porcións/grupo de diferentes porcos) e taxa de relaxación máxima (n=24(D0), 25(D12) porcións/grupo de diferentes porcos). A proba t de Student bilateral non mostrou diferenzas significativas en ningún parámetro. Trazos representativos da análise de deformación de seccións de tecido con (vermello) e sen (azul) estimulación eléctrica, dez áreas rexionais de seccións de tecido da mesma sección. Os paneis inferiores mostran a cuantificación da diferenza porcentual na deformación en seccións de tecido con e sen estimulación eléctrica en dez áreas de diferentes seccións. (n = 8 cortes/grupo de diferentes porcos, realizouse a proba t de Student bilateral; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 cortes/grupo de diferentes porcos, realizouse a proba t de Student bilateral; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; *****p<0,1,**p
No noso sistema de cultivo de cortes de corazón biomimético estático anterior [20, 21], mantivemos a viabilidade, a función e a integridade estrutural dos cortes de corazón durante 6 días aplicando estimulación eléctrica e optimizando a composición do medio. Non obstante, despois de 10 días, estas cifras caeron drasticamente. Referirémonos ás seccións cultivadas no noso sistema de cultivo biomimético estático anterior 20, 21 condicións de control (Ctrl) e usaremos o noso medio previamente optimizado como condicións MC e cultivo baixo estimulación mecánica e eléctrica simultánea (CTCM), chamadas . En primeiro lugar, determinamos que a estimulación mecánica sen estimulación eléctrica era insuficiente para manter a viabilidade dos tecidos durante 6 días (Fig. suplementaria 3a, b). Curiosamente, coa introdución da estimulación fisiomecánica e eléctrica mediante STCM, a viabilidade das seccións de corazón de 12 días mantívose igual que nas seccións de corazón fresco en condicións de MS, pero non en condicións Ctrl, como demostra a análise MTT (Fig. 1). 3a). Isto suxire que a estimulación mecánica e a simulación do ciclo cardíaco poden manter as seccións de tecido viables durante o dobre de tempo que o informado no noso sistema de cultivo estático anterior. Non obstante, a avaliación da integridade estrutural das seccións de tecido mediante a inmunomarcaxe da troponina T cardíaca e a conexina 43 mostrou que a expresión da conexina 43 era significativamente maior nos tecidos MC o día 12 que nos controis o mesmo día. Non obstante, a expresión uniforme da conexina 43 e a formación do disco Z non se mantiveron completamente (Fig. 3b). Empregamos un marco de intelixencia artificial (IA) para cuantificar a integridade estrutural dos tecidos26, unha canle de aprendizaxe profunda baseada en imaxes baseada na tinguidura de troponina T e conexina43 para cuantificar automaticamente a integridade estrutural e a fluorescencia das seccións de corazón en termos de forza de localización. Este método emprega unha Rede Neuronal Convolucional (CNN) e un marco de aprendizaxe profunda para cuantificar de forma fiable a integridade estrutural do tecido cardíaco dun xeito automatizado e imparcial, como se describe na referencia.26. O tecido MC mostrou unha mellor similitude estrutural co día 0 en comparación coas seccións de control estático. Ademais, a tinguidura con tricromo de Masson revelou unha porcentaxe significativamente menor de fibrose en condicións de MS en comparación coas condicións de control o día 12 do cultivo (Fig. 3c). Aínda que a CTCM aumentou a viabilidade das seccións de tecido cardíaco no día 12 a un nivel similar ao do tecido cardíaco fresco, non mellorou significativamente a integridade estrutural das seccións cardíacas.
Un gráfico de barras mostra a cuantificación da viabilidade MTT de cortes de corazón frescos (D0) ou cultivo de cortes de corazón durante 12 días, xa sexa en cultivo estático (D12 Ctrl) ou en CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) cortes/grupo de diferentes porcos, realizouse unha proba ANOVA dun sentido; ####p < 0,0001 en comparación con D0 e **p < 0,01 en comparación con D12 Ctrl). Un gráfico de barras mostra a cuantificación da viabilidade MTT de cortes de corazón frescos (D0) ou cultivo de cortes de corazón durante 12 días, xa sexa en cultivo estático (D12 Ctrl) ou en CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) cortes/grupo de diferentes porcos, realizouse unha proba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparación con D0 e **p < 0,01 en comparación con D12 Ctrl).O histograma mostra a cuantificación da viabilidade de seccións de corazón fresco MTT (D0) ou cultivo de seccións de corazón durante 12 días en cultivo estático (control D12) ou CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (control D12)). ), 12 (D12 MC) seccións/grupo de diferentes porcos, realízase unha proba ANOVA unidireccional;####p < 0,0001 para сравнению с D0 e **p < 0,01 para сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 en comparación con D0 e **p < 0,01 en comparación con D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组葌切片/组葌化ANOVA测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,000012 CtrlD12相比，**p。)histograma que mostra a cuantificación da viabilidade de MTT en seccións de corazón fresco (D0) ou seccións de corazón cultivadas durante 12 días en cultivo estático (control D12) ou CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (control D12)), 12 (D12 MC) seccións/grupo de diferentes porcos, proba ANOVA unidireccional;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 en comparación con D0, **p < 0,01 en comparación con D12 (Ctrl).b Troponina-T (verde), conexina 43 (vermello) e DAPI (azul) en seccións de corazón recentemente illadas (D0) ou seccións de corazón cultivadas en condicións estáticas (Ctrl) ou condicións CTCM (MC) durante 12 días) de imaxes de inmunofluorescencia representativas (escala en branco = 100 µm). Cuantificación por intelixencia artificial da integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) cortes/grupo cada un de porco diferente, realizouse unha proba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparación con D0 e ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). Cuantificación por intelixencia artificial da integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) cortes/grupo cada un de diferentes porcos, realizouse unha proba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparación con D0 e ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). Noticias noutros idiomas (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA ####p < 0,0001 по сни сра в сне срав 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Cuantificación da integridade estrutural do tecido cardíaco mediante intelixencia artificial (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seccións/grupos de diferentes porcos, realizouse unha proba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 fronte a D0 e ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rebanadas/grupo cada un de diferentes porcos, proba ANOVA unidireccional <1#0.相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rebanadas/grupo cada un de diferentes porcos, proba ANOVA unidireccional <0####0p0;与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной тка7нl (D12), = (D12) (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001 vs. сравнению с D12 Ctrl). Intelixencia artificial para cuantificar a integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seccións/grupo cada un de porcos diferentes, proba ANOVA unidireccional; ####p<0,0001 fronte a ,D0 Para comparación ****p < 0,0001 comparado con D12 Ctrl). c Imaxes representativas (esquerda) e cuantificación (dereita) para cortes de corazón tinguidos con tinguidura tricrómica de Masson (escala nuda = 500 µm) (n = 10 cortes/grupo cada un de porco diferente, realízase unha proba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparación con D0 e ***p < 0,001 en comparación con D12 Ctrl). c Imaxes representativas (esquerda) e cuantificación (dereita) para cortes de corazón tinguidos con tinguidura tricrómica de Masson (escala nua = 500 µm) (n = 10 cortes/grupo cada un de porcos diferentes, realízase unha proba ANOVA unidireccional; #### p < 0,0001 en comparación con D0 e ***p < 0,001 en comparación con D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, ошенташаш трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от ра,знынх разниным выполняется односторонний тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по; сравнению с D12 Ctrl). c Imaxes representativas (esquerda) e cuantificación (dereita) de seccións de corazón tinguidas con tinguidura tricroma de Masson (escala sen revestimento = 500 µm) (n = 10 seccións/grupo de diferentes porcos, proba ANOVA unidireccional realizada; #### p < 0,0001 en comparación con D0 e ***p < 0,001 en comparación con D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺化（右）（裸尺（10µ=m5（裸尺010µ=个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比 相比 ，D01 <，D1相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度尦裺度 尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 切片 向 吋## 向## A 0,0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) e количественный анализ (справа) срезов сердца, окличественный анализ (справа) трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой другой протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Imaxes representativas (esquerda) e cuantificación (dereita) de seccións de corazón tinguidas con tinguidura tricrómica de Masson (branco = 500 µm) (n = 10 seccións/grupo, cada unha dun porco diferente, probadas mediante análise unidireccional da varianza; ### # p < 0,0001 en comparación con D0, ***p < 0,001 en comparación con D12 Ctrl).As barras de erro representan a media ± desviación estándar.
A nosa hipótese foi que, ao engadir pequenas moléculas ao medio de cultivo, podería mellorar a integridade dos cardiomiocitos e reducir o desenvolvemento de fibrose durante o cultivo CTCM. Polo tanto, buscamos pequenas moléculas empregando os nosos cultivos de control estático20,21 debido ao pequeno número de factores de confusión. Para esta selección, escollemos a dexametasona (Dex), a triiodotironina (T3) e o SB431542 (SB). Estas pequenas moléculas xa se empregaron previamente en cultivos hiPSC-CM para inducir a maduración dos cardiomiocitos aumentando a lonxitude do sarcómero, os túbulos T e a velocidade de condución. Ademais, sábese que tanto o Dex (un glucocorticoide) como o SB suprimen a inflamación29,30. Polo tanto, probamos se a inclusión dunha ou unha combinación destas pequenas moléculas melloraría a integridade estrutural das seccións cardíacas. Para a selección inicial, a dose de cada composto seleccionouse en función das concentracións que se usan habitualmente nos modelos de cultivo celular (1 μM de Dex27, 100 nM de T327 e 2,5 μM de SB31). Despois de 12 días de cultivo, a combinación de T3 e Dex deu lugar a unha integridade estrutural óptima dos cardiomiocitos e a unha remodelación fibrosa mínima (Figuras suplementarias 4 e 5). Ademais, o uso do dobre ou dobre destas concentracións de T3 e Dex produciu efectos nocivos en comparación coas concentracións normais (Figura suplementaria 6a,b).
Tras a selección inicial, realizamos unha comparación directa de 4 condicións de cultivo (Figura 4a): Ctrl: seccións de corazón cultivadas no noso cultivo estático descrito previamente usando o noso medio optimizado; 20,21 TD: T3 e Ctrl con Dex engadido o mércores; MC: seccións de corazón cultivadas en CTCM usando o noso medio optimizado previamente; e MT: CTCM con T3 e Dex engadidos ao medio. Despois de 12 días de cultivo, a viabilidade dos tecidos MS e MT mantívose igual que nos tecidos frescos avaliados mediante ensaio MTT (Fig. 4b). Curiosamente, a adición de T3 e Dex aos cultivos transpozo (TD) non deu lugar a unha mellora significativa na viabilidade en comparación coas condicións Ctrl, o que indica un papel importante da estimulación mecánica no mantemento da viabilidade das seccións de corazón.
Un diagrama de deseño experimental que representa as catro condicións de cultivo empregadas para avaliar os efectos da estimulación mecánica e a suplementación con T3/Dex no medio durante 12 días. b O gráfico de barras mostra a cuantificación da viabilidade 12 días despois do cultivo nas 4 condicións de cultivo (Ctrl, TD, MC e MT) en comparación con cortes de corazón fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) cortes/grupo de diferentes porcos, realizouse unha proba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 en comparación con D0 e **p < 0,01 en comparación con D12 Ctrl). b O gráfico de barras mostra a cuantificación da viabilidade 12 días despois do cultivo nas 4 condicións de cultivo (Ctrl, TD, MC e MT) en comparación con cortes de corazón fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) cortes/grupo de diferentes porcos, realizouse unha proba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 en comparación con D0 e **p < 0,01 en comparación con D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней посленку кулрез всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами срезами срезами серезами сероль (D1) (D1) (D1) (D1) (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 por сравнению с D0 e **p < 0,01 por сравнению с D12 Ctrl). b O gráfico de barras mostra a cuantificación da viabilidade aos 12 días posteriores ao cultivo nas 4 condicións de cultivo (control, TD, MC e MT) en comparación coas seccións de corazón fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) seccións/grupo de diferentes porcos, proba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 fronte a D0 e **p < 0,01 en comparación con D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D150)、D12、D12、D12 TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，##D01，0##D01相比，**p < 0,01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнения сравнения сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), ata разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, одннос#тороднос#той <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histograma que mostra as 4 condicións de cultivo (control, TD, MC e MT) comparadas con seccións de corazón fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), de diferentes porcos, 12 seccións/grupo (D12 MC), proba ANOVA unidireccional; ####p<0,0001, ###p<0,001 fronte a D0, **p<0,01 fronte a control D12). c O gráfico de barras mostra a cuantificación do fluxo de glicosa 12 días despois do cultivo nas 4 condicións de cultivo (Ctrl, TD, MC e MT) en comparación con cortes de corazón fresco (D0) (n = 6 cortes/grupo de diferentes porcos, realizouse unha proba ANOVA unidireccional; ###p < 0,001, en comparación con D0 e ***p < 0,001 en comparación con D12 Ctrl). c O gráfico de barras mostra a cuantificación do fluxo de glicosa 12 días despois do cultivo nas 4 condicións de cultivo (Ctrl, TD, MC e MT) en comparación con cortes de corazón fresco (D0) (n = 6 cortes/grupo de diferentes porcos, realizouse unha proba ANOVA unidireccional; ###p < 0,001, en comparación con D0 e ***p < 0,001 en comparación con D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после кулхтиви кульвтозы через 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC e MT) по сравнению со свежими срезами сердца = (D0 псрению) от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c O histograma mostra a cuantificación do fluxo de glicosa 12 días despois do cultivo nas 4 condicións de cultivo (control, TD, MC e MT) en comparación con seccións de corazón fresco (D0) (n = 6 seccións/grupo de diferentes porcos, realizouse unha proba ANOVA unidireccional; ###p < 0,001 en comparación con D0 e ***p < 0,001 en comparación con D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 盌柯1％）天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；####p < 0.0不相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片片片培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней послетвика всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC e MT) по сравнению со свежими срезами серезами сердца (D) срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histograma que mostra a cuantificación do fluxo de glicosa 12 días despois do cultivo para as 4 condicións de cultivo (control, TD, MC e MT) en comparación con seccións de corazón fresco (D0) (n = 6 seccións/grupo, de diferentes porcos, unilaterais. Se realizaron probas ANOVA, ###p < 0,001 en comparación con D0, ***p < 0,001 en comparación con D12 (control).d Gráficos de análise de cepas de tecidos frescos (azul), MC do día 12 (verde) e MT do día 12 (vermello) en dez puntos de sección rexional de tecido (n = 4 cortes/grupo, proba ANOVA unidireccional; non houbo diferenzas significativas entre os grupos). e Gráfico do volcán que mostra os xenes expresados diferencialmente en seccións de corazón frescos (D0) en comparación coas seccións de corazón cultivadas en condicións estáticas (Ctrl) ou en condicións MT (MT) durante 10-12 días. f Mapa de calor dos xenes dos sarcómeros para seccións de corazón cultivadas en cada unha das condicións de cultivo. As barras de erro representan a media ± desviación estándar.
A dependencia metabólica do cambio da oxidación de ácidos graxos á glicólise é unha característica da desdiferenciación dos cardiomiocitos. Os cardiomiocitos inmaduros usan principalmente glicosa para a produción de ATP e teñen mitocondrias hipoplásicas con poucas cristas5,32. As análises de utilización da glicosa mostraron que, en condicións de MC e MT, a utilización da glicosa foi similar á dos tecidos do día 0 (Figura 4c). Non obstante, as mostras Ctrl mostraron un aumento significativo na utilización da glicosa en comparación co tecido fresco. Isto indica que a combinación de CTCM e T3/Dex mellora a viabilidade dos tecidos e preserva o fenotipo metabólico das seccións cardíacas cultivadas durante 12 días. Ademais, a análise de cepa mostrou que os niveis de cepa permaneceron os mesmos que no tecido cardíaco fresco durante 12 días en condicións de MT e MS (Fig. 4d).
Para analizar o impacto global de CTCM e T3/Dex na paisaxe transcricional global do tecido cardíaco en cortes, realizamos RNAseq en cortes cardíacos de catro condicións de cultivo diferentes (Datos suplementarios 1). Curiosamente, as seccións MT mostraron unha alta semellanza transcricional co tecido cardíaco fresco, con só 16 xenes expresados diferencialmente de 13.642. Non obstante, como mostramos anteriormente, os cortes Ctrl mostraron 1229 xenes expresados diferencialmente despois de 10-12 días de cultivo (Fig. 4e). Estes datos confirmáronse mediante qRT-PCR de xenes cardíacos e de fibroblastos (Fig. suplementaria 7a-c). Curiosamente, as seccións Ctrl mostraron unha regulación á baixa dos xenes cardíacos e do ciclo celular e a activación de programas xénicos inflamatorios. Estes datos suxiren que a desdiferenciación, que normalmente ocorre despois dun cultivo a longo prazo, aténuase completamente en condicións MT (Fig. suplementaria 8a,b). Un estudo coidadoso dos xenes dos sarcómeros mostrou que só en condicións de MT se preservan os xenes que codifican o sarcómero (Fig. 4f) e o canal iónico (Fig. suplementaria 9), protexéndoos da supresión en condicións Ctrl, TD e MC. Estes datos demostran que cunha combinación de estimulación mecánica e humoral (T3/Dex), o transcriptoma da porción de corazón pode permanecer similar ás porcións de corazón frescas despois de 12 días de cultivo.
Estes achados transcricionais están respaldados polo feito de que a integridade estrutural dos cardiomiocitos en seccións de corazón se preserva mellor en condicións de MT durante 12 días, como demostra a conexina 43 intacta e localizada (Fig. 5a). Ademais, a fibrose en seccións de corazón en condicións de MT reduciuse significativamente en comparación con Ctrl e de xeito similar ás seccións de corazón frescas (Fig. 5b). Estes datos demostran que a combinación de estimulación mecánica e tratamento con T3/Dex preserva eficazmente a estrutura cardíaca en seccións de corazón en cultivo.
Imaxes de inmunofluorescencia representativas da troponina T (verde), a conexina 43 (vermello) e o DAPI (azul) en seccións de corazón recentemente illadas (D0) ou cultivadas durante 12 días nas catro condicións de cultivo da sección de corazón (barra de escala = 100 µm). Cuantificación por intelixencia artificial da integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) cortes/grupo de diferentes porcos, realizouse unha proba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparación con D0 e *p < 0,05, ou ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). Cuantificación por intelixencia artificial da integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) cortes/grupo de diferentes porcos, realizouse unha proba ANOVA unidireccional; #### p < 0,0001 en comparación con D0 e *p < 0,05, ou ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного = D70 (D01) Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA p сравнению с D0 e *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Cuantificación da integridade estrutural do tecido cardíaco mediante intelixencia artificial (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) seccións/grupo de diferentes porcos, realizouse unha proba ANOVA unidireccional; #### p < 0,0001 en comparación con D0 e *p < 0,05 ou ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p ）切*p < 0.0. 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc＼1 （d12 mc） （d12）人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 和*p，斈**** p < 0,05 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.Cuantificación da integridade estrutural do tecido cardíaco mediante intelixencia artificial en diferentes porcos (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) seccións/grupo) cunha proba ANOVA unidireccional;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 en comparación con D0 e *p < 0,05 ou ****p < 0,0001 en comparación con D12 (Ctrl). b Imaxes representativas e cuantificación para cortes de corazón tinguidos con tinguidura tricrómica de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) cortes/grupo de diferentes porcos, realizouse unha proba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparación con D0 e ***p < 0,001, ou ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). b Imaxes representativas e cuantificación para cortes de corazón tinguidos con tinguidura tricrómica de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) cortes/grupo de diferentes porcos, realizouse unha proba ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparación con D0 e ***p < 0,001, ou ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения e количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных трашенных траственная Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/групапу, срезов/грунхпу зони пу выполняется односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p <; 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Imaxes representativas e cuantificación de seccións de corazón tinguidas con tinguidura tricroma de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) seccións/grupo de diferentes porcos, realizada ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 fronte a D0 e ***p < 0,001 ou ****p < 0,0001 fronte a D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）㼈D12010（D12010 Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单单因素方#单同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单单因素方#单因素方#单切素方#单＆0.与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm = 500 µmd d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,00 方差分析；####p < 0,00 旎p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных тросомна тросо (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных сразных свинудипы способ ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001; по сравнению с D12 Ctrl). b Imaxes representativas e cuantificación de seccións de corazón tinguidas con tricromo de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) seccións de diferentes porcos/grupo, un método ANOVA; ####p < 0,0001 en comparación con D0, ***p < 0,001 ou ****p < 0,0001 en comparación con D12 Ctrl).As barras de erro representan a media ± desviación estándar.
Finalmente, avaliouse a capacidade do CTCM para imitar a hipertrofia cardíaca aumentando o estiramento do tecido cardíaco. No CTCM, a presión máxima da cámara de aire aumentou de 80 mmHg a 80 mmHg (estiramento normal) ata 140 mmHg (Fig. 6a). Isto corresponde a un aumento do 32 % no estiramento (Fig. 6b), que se mostrou previamente como a porcentaxe de estiramento correspondente necesaria para que as seccións cardíacas alcancen unha lonxitude de sarcómero similar á observada na hipertrofia. O estiramento e a velocidade do tecido cardíaco durante a contracción e a relaxación permaneceron constantes durante os seis días de cultivo (Fig. 6c). O tecido cardíaco procedente de condicións de MT foi sometido a estiramento normal (MT (Normal)) ou condicións de sobreestiramento (MT (OS)) durante seis días. Xa despois de catro días de cultivo, o biomarcador hipertrófico NT-ProBNP elevouse significativamente no medio en condicións de MT (OS) en comparación coas condicións de MT (normais) (Fig. 7a). Ademais, despois de seis días de cultivo, o tamaño das células en MT (OS) (Fig. 7b) aumentou significativamente en comparación coas seccións de corazón MT (normal). Ademais, a translocación nuclear de NFATC4 aumentou significativamente nos tecidos sobreestirados (Fig. 7c). Estes resultados mostran o desenvolvemento progresivo da remodelación patolóxica despois da hiperdistensión e apoian o concepto de que o dispositivo CTCM pode utilizarse como plataforma para estudar a sinalización da hipertrofia cardíaca inducida polo estiramento.
As trazas representativas das medicións da presión da cámara de aire, da presión da cámara de fluído e do movemento dos tecidos confirman que a presión da cámara cambia a presión da cámara de fluído, causando un movemento correspondente da sección de tecido. b Curvas representativas de porcentaxe de estiramento e taxa de estiramento para seccións de tecido normalmente estiradas (laranxa) e sobreestiradas (azul). c Gráfico de barras que mostra o tempo de ciclo (n = 19 seccións por grupo, de diferentes porcos), o tempo de contracción (n = 18-19 seccións por grupo, de diferentes porcos), o tempo de relaxación (n = 19 seccións por grupo, de diferentes porcos)), a amplitude do movemento do tecido (n = 14 seccións/grupo, de diferentes porcos), a velocidade sistólica máxima (n = 14 seccións/grupo, de diferentes porcos) e a taxa de relaxación máxima (n = 14 (D0), 15 (D6)) seccións/grupos) de diferentes porcos), a proba t de Student bilateral non mostrou diferenzas significativas en ningún parámetro, o que indica que estes parámetros permaneceron constantes durante os 6 días de cultivo con sobrevoltaxe. As barras de erro representan a media ± desviación estándar.
Cuantificación en gráfico de barras da concentración de NT-ProBNP en medios de cultivo procedentes de cortes de corazón cultivados en condicións de estiramento normal MT (Norm) ou de sobreestiramento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4 MTOS) cortes/grupo de diferentes porcos. Realizouse unha ANOVA bidireccional; **p < 0,01 en comparación co estiramento normal). Cuantificación mediante gráfico de barras da concentración de NT-ProBNP en medios de cultivo procedentes de cortes de corazón cultivados en condicións de estiramento normal MT (Norm) ou de sobreestiramento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4 MTOS) cortes/grupo de diferentes porcos. Realizouse unha ANOVA bidireccional; **p < 0,01 en comparación co estiramento normal).Histograma cuantitativo da concentración de NT-ProBNP no medio de cultivo procedente de cortes de corazón cultivados en condicións de estiramento MT normal (norma) ou sobreestiramento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4) MTOS) cortes/grupo de diferentes porcos, realizouse unha análise de varianza de dous factores;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 en comparación co estiramento normal). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01） a Cuantificación da concentración de NT-ProBNP en cortes de corazón cultivados en condicións de estiramento normal MT (Norm) ou sobreestiramento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) de diferentes猪的切片/组，可以双向方方发发动 **en comparación co estiramento normal, p < 0,01).histograma Cuantificación das concentracións de NT-ProBNP en cortes de corazón cultivados en condicións de estiramento MT normal (norma) ou sobreestiramento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) e D4 MTOS) cortes/grupo de diferentes porcos, análise de varianza bidireccional;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 en comparación co estiramento normal). b Imaxes representativas de cortes de corazón tinguidos con troponina-T e WGA (esquerda) e cuantificación do tamaño das células (dereita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) células/grupo de 10 cortes diferentes de diferentes porcos, realizouse a proba t de Student bilateral; ****p < 0,0001 en comparación co estiramento normal). b Imaxes representativas de cortes de corazón tinguidos con troponina-T e WGA (esquerda) e cuantificación do tamaño das células (dereita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) células/grupo de 10 cortes diferentes de diferentes porcos, realizouse a proba t de Student bilateral; ****p < 0,0001 en comparación co estiramento normal). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестова) ичнных определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезных срезных срезных срезных срезных срезох срезных два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Imaxes representativas de seccións de corazón tinguidas con troponina-T e AZP (esquerda) e cuantificación do tamaño das células (dereita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) células/grupo de 10 seccións diferentes de diferentes porcos, realizouse a proba t de Student bilateral; ****p < 0,0001 en comparación coa cepa normal). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表怏30表怏（（右）染色的心脏切片的代表怏） MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）. b Imaxes representativas de cortes de corazón tinguidos con calcareína-T e WGA (esquerda) e tamaño das células (dereita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 de 10 cortes diferentes (D6 MTNorm)). Células/cm³, proba t de estiramento en comparación con estiramento normal, ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестова) ичнтативные оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разныей разныей Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным; descomposición). b Imaxes representativas de seccións de corazón tinguidas con troponina-T e AZP (esquerda) e cuantificación do tamaño das células (dereita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) de 10 seccións diferentes de diferentes porcos) Células/grupo, criterio bilateral t de Student; ****p < 0,0001 en comparación coa cepa normal). c Imaxes representativas para os cortes de corazón MTOS do día 0 e do día 6 inmunomarcados para troponina-T e NFATC4 e cuantificación da translocación de NFATC4 aos núcleos das CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) cortes/grupo de diferentes porcos, realizouse a proba t de Student bilateral; *p < 0,05). c Imaxes representativas para os cortes de corazón MTOS do día 0 e do día 6 inmunomarcados para troponina-T e NFATC4 e cuantificación da translocación de NFATC4 aos núcleos das CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) cortes/grupo de diferentes porcos, realizouse a proba t de Student bilateral; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 e 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропон, тропон 4и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезных пузнозных клеток свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента *p < 0,05). c Imaxes representativas de seccións cardíacas a 0 e 6 días MTOS, inmunomarcadas para troponina T e NFATC4, e cuantificación da translocación de NFATC4 no núcleo de células cavernosas (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) cortes/grupo de diferentes porcos) realizada unha proba t de Student bilateral; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（D0) 、（D06 、（D06切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Imaxes representativas de cortes de corazón 第0天和第6天MTOS de calcanina-T e NFATC4 e NFATC4 de diferentes cantidades de núcleo celular NFATC4 易位至CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS)时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тромуномаркировки тромпоТТи тромзентативные MTOS на 0 и 6 количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезных/грутай свиней t-критерий Стьюдента *p < 0,05). c Imaxes representativas de cortes de corazón MTOS nos días 0 e 6 para a inmunomarcaxe de troponina-T e NFATC4 e a cuantificación da translocación de NFATC4 no núcleo de CM de diferentes porcos (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) cortes/grupo, criterio t bilateral de Student; *p < 0,05).As barras de erro representan a media ± desviación estándar.
A investigación cardiovascular translacional require modelos celulares que reproduzan con precisión o ambiente cardíaco. Neste estudo, desenvolveuse e caracterizouse un dispositivo CTCM que pode estimular seccións ultrafinas do corazón. O sistema CTCM inclúe estimulación electromecánica fisioloxicamente sincronizada e enriquecemento con fluídos T3 e Dex. Cando as seccións de corazón porcino foron expostas a estes factores, a súa viabilidade, integridade estrutural, actividade metabólica e expresión transcricional permaneceron igual que no tecido cardíaco fresco despois de 12 días de cultivo. Ademais, o estiramento excesivo do tecido cardíaco pode causar hipertrofia do corazón causada pola hiperextensión. En xeral, estes resultados apoian o papel fundamental das condicións de cultivo fisiolóxicas no mantemento dun fenotipo cardíaco normal e proporcionan unha plataforma para a detección de fármacos.
Moitos factores contribúen a crear un ambiente óptimo para o funcionamento e a supervivencia dos cardiomiocitos. Os máis obvios destes factores están relacionados con (1) interaccións intercelulares, (2) estimulación electromecánica, (3) factores humorais e (4) substratos metabólicos. As interaccións fisiolóxicas entre células requiren redes tridimensionais complexas de múltiples tipos de células soportadas por unha matriz extracelular. Estas interaccións celulares complexas son difíciles de reconstruír in vitro mediante o cocultivo de tipos de células individuais, pero pódense conseguir facilmente utilizando a natureza organotípica das seccións cardíacas.
O estiramento mecánico e a estimulación eléctrica dos cardiomiocitos son fundamentais para manter o fenotipo cardíaco33,34,35. Aínda que a estimulación mecánica se empregou amplamente para o acondicionamento e a maduración da hiPSC-CM, varios estudos elegantes tentaron recentemente a estimulación mecánica de cortes de corazón en cultivo mediante carga uniaxial. Estes estudos mostran que a carga mecánica uniaxial 2D ten un efecto positivo no fenotipo do corazón durante o cultivo. Nestes estudos, as seccións do corazón cargáronse con forzas de tracción isométricas17, carga auxotónica lineal18, ou o ciclo cardíaco recreouse mediante retroalimentación de transdutores de forza e accionamentos de tensión. Non obstante, estes métodos empregan o estiramento uniaxial do tecido sen optimización ambiental, o que resulta na supresión de moitos xenes cardíacos ou na sobreexpresión de xenes asociados a respostas de estiramento anormais. O CTCM descrito aquí proporciona un estímulo electromecánico 3D que imita o ciclo cardíaco natural en termos de tempo de ciclo e estiramento fisiolóxico (25 % de estiramento, 40 % de sístole, 60 % de diástole e 72 latexos por minuto). Aínda que esta estimulación mecánica tridimensional por si soa non é suficiente para manter a integridade dos tecidos, requírese unha combinación de estimulación humoral e mecánica mediante T3/Dex para manter adecuadamente a viabilidade, a función e a integridade dos tecidos.
Os factores humorais desempeñan un papel importante na modulación do fenotipo do corazón adulto. Isto destacouse nos estudos de HiPS-CM nos que se engadiu T3 e Dex a medios de cultivo para acelerar a maduración celular. A T3 pode influír no transporte de aminoácidos, azucres e calcio a través das membranas celulares36. Ademais, a T3 promove a expresión de MHC-α e a regulación á baixa de MHC-β, promovendo a formación de miofibrilas de contracción rápida en cardiomiocitos maduros en comparación coas miofibrilas de contracción lenta na CM fetal. A deficiencia de T3 en pacientes hipotiroideos provoca a perda de bandas miofibrilares e unha taxa reducida de desenvolvemento do ton37. A Dex actúa sobre os receptores de glucocorticoides e demostrouse que aumenta a contractilidade miocárdica en corazóns perfundidos illados;38 pénsase que esta mellora está relacionada co efecto sobre a entrada impulsada por depósitos de calcio (SOCE)39,40. Ademais, a Dex únese aos seus receptores, causando unha ampla resposta intracelular que suprime a función inmunitaria e a inflamación30.
Os nosos resultados indican que a estimulación física mecánica (MS) mellorou o rendemento xeral do cultivo en comparación con Ctrl, pero non conseguiu manter a viabilidade, a integridade estrutural e a expresión cardíaca durante 12 días de cultivo. En comparación con Ctrl, a adición de T3 e Dex aos cultivos CTCM (MT) mellorou a viabilidade e mantivo perfís de transcrición, integridade estrutural e actividade metabólica similares con tecido cardíaco fresco durante 12 días. Ademais, ao controlar o grao de estiramento do tecido, creouse un modelo de hipertrofia cardíaca inducida por hiperextensión usando STCM, o que ilustra a versatilidade do sistema STCM. Cómpre sinalar que, aínda que a remodelación cardíaca e a fibrose adoitan implicar órganos intactos cuxas células circulantes poden proporcionar as citocinas axeitadas, así como a fagocitose e outros factores de remodelación, as seccións do corazón aínda poden imitar o proceso fibrótico en resposta ao estrés e ao trauma en miofibroblastos. Isto avaliouse previamente neste modelo de corte cardíaco. Cómpre sinalar que os parámetros CTCM poden modularse cambiando a presión/amplitude eléctrica e a frecuencia para simular moitas condicións como a taquicardia, a bradicardia e o soporte circulatorio mecánico (corazón con descarga mecánica). Isto converte o sistema nun sistema de rendemento medio para as probas de drogas. A capacidade da CTCM para modelar a hipertrofia cardíaca inducida por sobreesforzo abre o camiño para probar este sistema para unha terapia personalizada. En conclusión, o presente estudo demostra que o estiramento mecánico e a estimulación humoral son fundamentais para manter o cultivo de seccións de tecido cardíaco.
Aínda que os datos presentados aquí suxiren que a CTCM é unha plataforma moi prometedora para modelar miocardio intacto, este método de cultivo ten algunhas limitacións. A principal limitación do cultivo CTCM é que impón tensións mecánicas dinámicas continuas nos cortes, o que impide a capacidade de monitorizar activamente as contraccións dos cortes cardíacos durante cada ciclo. Ademais, debido ao pequeno tamaño das seccións cardíacas (7 mm), a capacidade de avaliar a función sistólica fóra dos sistemas de cultivo utilizando sensores de forza tradicionais é limitada. No manuscrito actual, superamos parcialmente esta limitación avaliando a voltaxe óptica como indicador da función contráctil. Non obstante, esta limitación requirirá máis traballo e pode abordarse no futuro introducindo métodos para a monitorización óptica da función dos cortes cardíacos en cultivo, como o mapeo óptico utilizando colorantes sensibles ao calcio e á voltaxe. Outra limitación da CTCM é que o modelo de traballo non manipula a tensión fisiolóxica (precarga e poscarga). Na CTCM, a presión induciuse en direccións opostas para reproducir un estiramento fisiolóxico do 25 % na diástole (estiramento completo) e na sístole (duración da contracción durante a estimulación eléctrica) en tecidos moi grandes. Esta limitación debería eliminarse nos futuros deseños de CTCM mediante unha presión axeitada sobre o tecido cardíaco desde ambos os lados e aplicando as relacións exactas de presión-volume que se producen nas cámaras do corazón.
A remodelación inducida por sobreestiramento descrita neste manuscrito limítase a imitar sinais de hiperestiramento hipertrófico. Polo tanto, este modelo pode axudar no estudo da sinalización hipertrófica inducida por estiramento sen necesidade de factores humorais ou neurais (que non existen neste sistema). Necesítanse máis estudos para aumentar a multiplicidade de CTCM, por exemplo, o cocultivo con células inmunitarias, os factores humorais do plasma circulante e a inervación cando se cocultiva con células neuronais mellorará as posibilidades de modelado de enfermidades con CTCM.
Neste estudo empregáronse trece porcos. Todos os procedementos con animais realizáronse de acordo coas directrices institucionais e foron aprobados polo Comité Institucional de Coidado e Uso de Animais da Universidade de Louisville. Pinzouse o arco aórtico e perfundiuse o corazón con 1 L de cardioplexia estéril (110 mM de NaCl, 1,2 mM de CaCl2, 16 mM de KCl, 16 mM de MgCl2, 10 mM de NaHCO3, 5 U/mL de heparina, pH de ata 7,4); Os corazóns conserváronse en solución cardiopléxica xeada ata o seu transporte ao laboratorio en xeo, o que normalmente é <10 min. Os corazóns conserváronse en solución cardiopléxica xeada ata o seu transporte ao laboratorio en xeo, o que normalmente é <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на, лчытон занимает <10 мин. Os corazóns almacenáronse en solución cardiopléxica xeada ata o seu transporte ao laboratorio en xeo, o que normalmente leva <10 minutos.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычмно <10. Manter os corazóns en xeo para cardioplexia ata o transporte ao laboratorio en xeo, normalmente <10 min.
O dispositivo CTCM foi desenvolvido co software de deseño asistido por ordenador (CAD) SolidWorks. As cámaras de cultivo, os divisores e as cámaras de aire están feitos de plástico acrílico transparente CNC. O anel de apoio de 7 mm de diámetro está feito de polietileno de alta densidade (HDPE) no centro e ten unha ranura para a xunta tórica para acomodar a xunta tórica de silicona utilizada para selar o medio debaixo. Unha fina membrana de sílice separa a cámara de cultivo da placa de separación. A membrana de silicona está cortada con láser a partir dunha lámina de silicona de 0,02″ de grosor e ten unha dureza de 35 A. As xuntas de silicona inferior e superior están cortadas con láser a partir dunha lámina de silicona de 1/16″ de grosor e teñen unha dureza de 50 A. Para fixar o bloque e crear un selo hermético utilízanse parafusos e porcas de ás de aceiro inoxidable 316L.
Unha placa de circuíto impreso (PCB) dedicada está deseñada para integrarse co sistema C-PACE-EM. Os conectores swiss machine da PCB están conectados a electrodos de grafito mediante fíos de cobre chapados en prata e parafusos de bronce 0-60 atornillados aos electrodos. A placa de circuíto impreso colócase na cuberta da impresora 3D.
O dispositivo CTCM está controlado por un actuador pneumático programable (PPD) que crea unha presión circulatoria controlada similar a un ciclo cardíaco. A medida que a presión dentro da cámara de aire aumenta, a membrana de silicona flexible expándese cara arriba, forzando o medio a pasar debaixo do sitio do tecido. A área de tecido estirarase entón por esta expulsión de fluído, imitando a expansión fisiolóxica do corazón durante a diástole. No pico da relaxación, aplicouse estimulación eléctrica a través de eléctrodos de grafito, o que reduciu a presión na cámara de aire e provocou a contracción das seccións de tecido. Dentro do tubo hai unha válvula hemostática cun sensor de presión para detectar a presión no sistema de aire. A presión detectada polo sensor de presión aplícase a un colector de datos conectado ao portátil. Isto permite a monitorización continua da presión dentro da cámara de gas. Cando se alcanzou a presión máxima da cámara (estándar 80 mmHg, 140 mmHg SO), ordenouse ao dispositivo de adquisición de datos que enviase un sinal ao sistema C-PACE-EM para xerar un sinal de tensión bifásico durante 2 ms, axustado a 4 V.
Obtivéronse seccións de corazón e realizáronse as condicións de cultivo en 6 pozos do seguinte xeito: transferíronse os corazóns recollidos do recipiente de transferencia a unha bandexa que contiña cardioplexia fría (4 °C). O ventrículo esquerdo illouse cunha lámina estéril e cortouse en anacos de 1-2 cm3. Estes bloques de tecido uníronse a soportes de tecido con adhesivo para tecidos e colocáronse nun baño de tecido de microtomo vibratorio que contiña solución de Tyrode e osixenouse continuamente (3 g/L de monooxima de 2,3-butanodiona (BDM), 140 mM de NaCl (8,18 g), 6 mM de KCl (0,447 g), 10 mM de D-glicosa (1,86 g), 10 mM de HEPES (2,38 g), 1 mM de MgCl2 (1 ml de solución 1 M), 1,8 mM de CaCl2 (1,8 ml de solución 1 M), ata 1 L de ddH2O). O micrótomo vibratorio configurouse para cortar cortes de 300 µm de grosor a unha frecuencia de 80 Hz, unha amplitude de vibración horizontal de 2 mm e unha velocidade de avance de 0,03 mm/s. O baño de tecido rodeouse de xeo para manter a solución fría e a temperatura mantívose a 4 °C. Transferir as seccións de tecido do baño de microtomo a un baño de incubación que contiña unha solución Tyrode osixenada continuamente sobre xeo ata que se obtivesen seccións suficientes para unha placa de cultivo. Para os cultivos transpozos, as seccións de tecido uníronse a soportes de poliuretano estériles de 6 mm de ancho e colocáronse en 6 ml de medio optimizado (medio 199, suplemento ITS 1x, FBS ao 10 %, VEGF a 5 ng/ml, FGF alcalino a 10 ng/ml e antibiótico antifúnxico 2X). Aplicouse estimulación eléctrica (10 V, frecuencia 1,2 Hz) ás seccións de tecido a través do C-Pace. Para as condicións TD, engadíronse T3 e Dex frescos a 100 nM e 1 μM en cada cambio de medio. O medio satúrase con osíxeno antes da súa substitución 3 veces ao día. As seccións de tecido cultiváronse nunha incubadora a 37 °C e 5 % de CO2.
Para os cultivos CTCM, as seccións de tecido colocáronse nunha impresora 3D feita á medida nunha placa de Petri que contiña unha solución de Tyrode modificada. O dispositivo está deseñado para aumentar o tamaño da porción do corazón nun 25 % da área do anel de soporte. Isto faise para que as seccións do corazón non se estiren despois de seren transferidas da solución de Tyrode ao medio e durante a diástole. Usando cola histoacrílica, fixáronse seccións de 300 µm de grosor nun anel de soporte de 7 mm de diámetro. Despois de fixar as seccións de tecido ao anel de soporte, corte o exceso de seccións de tecido e coloque as seccións de tecido adheridas de novo no baño de solución de Tyrode sobre xeo (4 °C) ata que se preparen suficientes seccións para un dispositivo. O tempo total de procesamento para todos os dispositivos non debe exceder as 2 horas. Despois de fixar 6 seccións de tecido aos seus aneis de soporte, montouse o dispositivo CTCM. A cámara de cultivo CTCM está preenchida con 21 ml de medio preoxixenado. Transfira as seccións de tecido á cámara de cultivo e elimine coidadosamente as burbullas de aire cunha pipeta. A continuación, guíase a sección de tecido cara ao interior do orificio e prémese suavemente no seu lugar. Finalmente, colócase a tapa do eléctrodo no dispositivo e transfírese o dispositivo á incubadora. A continuación, conecte o CTCM ao tubo de aire e ao sistema C-PACE-EM. O actuador pneumático ábrese e a válvula de aire abre o CTCM. O sistema C-PACE-EM configurouse para subministrar 4 V a 1,2 Hz durante a estimulación bifásica durante 2 ms. O medio cambiouse dúas veces ao día e os eléctrodos cambiáronse unha vez ao día para evitar a acumulación de grafito nos eléctrodos. Se é necesario, as seccións de tecido poden retirarse dos seus pozos de cultivo para expulsar calquera burbulla de aire que poida caer debaixo deles. Para as condicións de tratamento MT, engadiuse T3/Dex fresco con cada cambio de medio con 100 nM de T3 e 1 μM de Dex. Os dispositivos CTCM cultiváronse nunha incubadora a 37 °C e 5 % de CO2.
Para obter traxectorias estiradas de cortes de corazón, desenvolveuse un sistema de cámara especial. Empregouse unha cámara SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Toquio, Xapón) cunha lente macro Navitar Zoom 7000 de 18-108 mm (Navitar, San Francisco, California). A visualización realizouse a temperatura ambiente despois de substituír o medio por medio fresco. A cámara colócase nun ángulo de 51° e o vídeo grávase a 30 fotogramas por segundo. Primeiro, utilizouse software de código aberto (MUSCLEMOTION43) con Image-J para cuantificar o movemento dos cortes de corazón. A máscara creouse usando MATLAB (MathWorks, Natick, MA, EUA) para definir rexións de interese para os cortes de corazón latexante para evitar o ruído. Aplícanse máscaras segmentadas manualmente a todas as imaxes dunha secuencia de fotogramas e despois pásanse ao complemento MUSCLEMOTION. Muscle Motion usa a intensidade media dos píxeles en cada fotograma para cuantificar o seu movemento en relación co fotograma de referencia. Os datos rexistráronse, filtráronse e utilizáronse para cuantificar o tempo de ciclo e avaliar o estiramento dos tecidos durante o ciclo cardíaco. O vídeo gravado foi posprocesado cun filtro dixital de fase cero de primeira orde. Para cuantificar o estiramento dos tecidos (pico a pico), realizouse unha análise de pico a pico para distinguir entre picos e vales no sinal gravado. Ademais, a eliminación de tendencias realízase mediante un polinomio de sexta orde para eliminar a deriva do sinal. O código do programa foi desenvolvido en MATLAB para determinar o movemento global dos tecidos, o tempo de ciclo, o tempo de relaxación e o tempo de contracción (Código de programa suplementario 44).
Para a análise de deformación, empregando os mesmos vídeos creados para a avaliación do estiramento mecánico, primeiro trazamos dúas imaxes que representaban os picos de movemento (os puntos de movemento máis altos (superiores) e máis baixos (inferiores)) segundo o software MUSCLEMOTION. Despois, segmentamos as rexións do tecido e aplicamos unha forma de algoritmo de sombreado ao tecido segmentado (Figura suplementaria 2a). O tecido segmentado dividiuse entón en dez subsuperficies e a tensión en cada superficie calculouse empregando a seguinte ecuación: Deformación = (Sup-Sdown)/Sdown, onde Sup e Sdown son as distancias da forma desde as sombras superior e inferior do tecido, respectivamente (Figura suplementaria 2b).
As seccións de corazón fixáronse en paraformaldehido ao 4 % durante 48 horas. Os tecidos fixados deshidratáronse en sacarosa ao 10 % e ao 20 % durante 1 h e, a continuación, en sacarosa ao 30 % durante a noite. Despois, as seccións incluíronse nun composto de temperatura de corte óptima (composto OCT) e conxeláronse gradualmente nun baño de isopentano/xeo seco. Gardar os bloques de inclusión OCT a -80 °C ata a súa separación. As láminas preparáronse como seccións cun grosor de 8 μm.
Para eliminar a OCT das seccións do corazón, quentar as láminas nun bloque de calefacción a 95 °C durante 5 minutos. Engadir 1 ml de PBS a cada lámina e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente, despois permear as seccións axustando Triton-X ao 0,1 % en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Para evitar que os anticorpos non específicos se unan á mostra, engadir 1 ml de solución de BSA ao 3 % ás láminas e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Despois, retirarse a BSA e laváronse as láminas con PBS. Marcar cada mostra cun lapis. Engadíronse anticorpos primarios (diluídos 1:200 en BSA ao 1%) (conexina 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) e troponina-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) durante 90 minutos, e despois engadíronse anticorpos secundarios (diluídos 1:200 en BSA ao 1%) contra o Alexa Fluor 488 de rato (Thermo Scientific; #A16079) e contra o Alexa Fluor 594 de coello (Thermo Scientific; #T6391) durante 90 minutos adicionais. Laváronse 3 veces con PBS. Para distinguir a tinción do obxectivo do fondo, empregamos só o anticorpo secundario como control. Finalmente, engadiuse a tinción nuclear DAPI e os portaobxectivos colocáronse nun Vectashield (Vector Laboratories) e seláronse con esmalte de uñas. (aumento de -x) e un microscopio Keyence cun aumento de 40x.
Para a tinguidura con WGA empregouse WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) a 5 μg/ml en PBS e aplicouse a seccións fixadas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Despois, as láminas laváronse con PBS e engadiuse negro de Sudán a cada lámina e incubáronse durante 30 minutos. Despois, as láminas laváronse con PBS e engadiuse medio de inclusión Vectashield. As láminas visualizáronse nun microscopio Keyence cun aumento de 40x.
A OCT retirouse das mostras como se describiu anteriormente. Despois de retirar a OCT, mergulláronse os portaobxectos na solución de Bouin durante a noite. Despois, os portaobxectos enxágáronse con auga destilada durante 1 hora e colocáronse nunha solución de fucsina ácida de aloe Bibrich durante 10 minutos. A continuación, os portaobxectos laváronse con auga destilada e colocáronse nunha solución de fosfomolibdeno ao 5 %/ácido fosfotúngstico ao 5 % durante 10 minutos. Sen enxaugar, transferir os portaobxectos directamente á solución de azul de anilina durante 15 minutos. Despois, os portaobxectos laváronse con auga destilada e colocáronse nunha solución de ácido acético ao 1 % durante 2 minutos. Os portaobxectos secáronse en etanol 200 N e transferíronse a xileno. Os portaobxectos tinguidos visualizáronse cun microscopio Keyence cun obxectivo de 10x. A porcentaxe de área de fibrose cuantificouse co software Keyence Analyzer.
Ensaio de viabilidade celular CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), número de catálogo V13154, segundo o protocolo do fabricante con algunhas modificacións. En particular, utilizouse un punzón cirúrxico cun diámetro de 6 mm para garantir un tamaño uniforme do tecido durante a análise MTT. Os tecidos colocáronse individualmente nos pozos dunha placa de 12 pozos que contiña substrato MTT segundo o protocolo do fabricante. As seccións incubáronse a 37 °C durante 3 horas e o tecido vivo metaboliza o substrato MTT para formar un composto de formazán púrpura. Substitúese a solución MTT por 1 ml de DMSO e incubase a 37 °C durante 15 minutos para extraer o formazán púrpura das seccións do corazón. As mostras diluíronse 1:10 en DMSO en placas de fondo transparente de 96 pozos e a intensidade da cor púrpura mediuse a 570 nm usando un lector de placas Cytation (BioTek). As lecturas normalizáronse ao peso de cada corte do corazón.
O medio para cortes de corazón substituíuse por un medio que contiña 1 μCi/ml de [5-3H]-glicosa (Moravek Biochemicals, Brea, CA, EUA) para o ensaio de utilización da glicosa, como se describiu anteriormente. Despois de 4 horas de incubación, engádense 100 µl de medio a un tubo de microcentrífuga aberto que contiña 100 µl de HCl 0,2 N. A continuación, o tubo colocouse nun tubo de escintilación que contiña 500 μl de dH2O para evaporar [3H]2O durante 72 horas a 37 °C. A continuación, retírase o tubo de microcentrífuga do tubo de escintilación e engádense 10 ml de líquido de escintilación. As contaxes de escintilación realizáronse cun analizador de escintilación líquida Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, EUA). A utilización da glicosa calculouse entón tendo en conta a actividade específica da [5-3H]-glicosa, o equilibrio incompleto e o fondo, a dilución de [5-3H]-glicosa a glicosa non marcada e a eficiencia do contador de escintilación. Os datos están normalizados á masa das seccións do corazón.
Tras a homoxenización dos tecidos en Trizol, illouse o ARN de seccións cardíacas empregando o kit Qiagen miRNeasy Micro #210874 segundo o protocolo do fabricante. A preparación, secuenciación e análise de datos da biblioteca de RNAsec realizáronse do seguinte xeito:
Empregouse 1 μg de ARN por mostra como material de partida para a preparación da biblioteca de ARN. As bibliotecas de secuenciación xeráronse usando o kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext UltraTM para Illumina (NEB, EUA) seguindo as recomendacións do fabricante, e engadíronse códigos de índice ás secuencias de atributos para cada mostra. En resumo, o ARNm purificouse a partir do ARN total usando esferas magnéticas unidas a oligonucleótidos poli-T. A fragmentación lévase a cabo usando catións divalentes a alta temperatura en tampón de reacción de síntese de primeira cadea NEBNext (5X). O ADNc da primeira cadea sintetizouse usando cebadores hexámeros aleatorios e transcriptase inversa M-MuLV (RNase H-). O ADNc da segunda cadea sintetízase despois usando ADN polimerase I e RNase H. Os salientes restantes convértense en extremos romos mediante a actividade exonuclease/polimerase. Despois da adenilación do extremo 3' do fragmento de ADN, únese a el un adaptador NEBNext cunha estrutura de bucle en forquita para preparalo para a hibridación. Para a selección de fragmentos de ADNc de lonxitude preferida de 150-200 pb. Os fragmentos da biblioteca purificáronse empregando o sistema AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, EUA). Despois, utilizáronse 3 μl de encima USER (NEB, EUA) con ADNc seleccionado por tamaño ligado cun adaptador durante 15 minutos a 37 °C e despois durante 5 minutos a 95 °C antes da PCR. A PCR realizouse usando a ADN polimerase de alta fidelidade Phusion, cebadores universais de PCR e cebadores Index (X). Finalmente, purificáronse os produtos da PCR (sistema AMPure XP) e avaliouse a calidade da biblioteca nun sistema Agilent Bioanalyzer 2100. A biblioteca de ADNc secuenciouse entón usando un secuenciador Novaseq. Os ficheiros de imaxe en bruto de Illumina convertéronse en lecturas en bruto usando CASAVA Base Calling. Os datos en bruto almacénanse en ficheiros en formato FASTQ(fq) que conteñen secuencias lidas e as calidades das bases correspondentes. Seleccione HISAT2 para que as lecturas de secuenciación filtradas coincidan co xenoma de referencia de Sscrofa11.1. En xeral, HISAT2 admite xenomas de calquera tamaño, incluídos xenomas maiores de 4.000 millóns de bases, e establécense valores predeterminados para a maioría dos parámetros. As lecturas de empalme a partir de datos de secuenciación de ARN poden aliñarse eficientemente usando HISAT2, o sistema máis rápido dispoñible actualmente, coa mesma ou mellor precisión que calquera outro método.
A abundancia de transcritos reflicte directamente o nivel de expresión xénica. Os niveis de expresión xénica avalíanse pola abundancia de transcritos (contador de secuenciación) asociados co xenoma ou os exóns. O número de lecturas é proporcional aos niveis de expresión xénica, á lonxitude do xene e á profundidade de secuenciación. Calculáronse os FPKM (fragmentos por mil pares de bases de transcrito secuenciado por millón de pares de bases) e determináronse os valores P da expresión diferencial usando o paquete DESeq2. Despois calculamos a taxa de falsos descubrimentos (FDR) para cada valor P usando o método de Benjamini-Hochberg9 baseado na función R integrada "p.adjust".
O ARN illado de seccións cardíacas converteuse en ADNc a unha concentración de 200 ng/μl usando a mestura SuperScript IV Vilo Master de Thermo (Thermo, nº de cat. 11756050). A RT-PCR cuantitativa realizouse usando unha placa de reacción transparente Applied Biosystems Endura Plate Microamp de 384 pozos (Thermo, nº de cat. 4483319) e un adhesivo óptico microamp (Thermo, nº de cat. 4311971). A mestura de reacción consistiu en 5 µl de mestura Taqman Fast Advanced Master (Thermo, nº de cat. 4444557), 0,5 µl de cebador Taqman e 3,5 µl de H2O mesturados por pozo. Executáronse ciclos estándar de qPCR e os valores de CT medíronse usando un instrumento de PCR en tempo real Quantstudio 5 de Applied Biosystems (módulo de 384 pozos; nº de produto A28135). Os cebadores Taqman foron adquiridos de Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Os valores de CT de todas as mostras foron normalizados ao xene de mantemento GAPDH.
A liberación no medio de NT-ProBNP avaliouse empregando o kit NT-ProBNP (pig) (n.º de cat. MBS2086979, MyBioSource) segundo o protocolo do fabricante. En resumo, engadíronse 250 µl de cada mostra e estándar por duplicado a cada pozo. Inmediatamente despois de engadir a mostra, engadir 50 µl de reactivo de ensaio A a cada pozo. Axitar suavemente a placa e selala con selante. Despois, os comprimidos incubáronse a 37 °C durante 1 hora. Despois, aspirar a solución e lavar os pozos 4 veces con 350 µl de solución de lavado 1X, incubando a solución de lavado durante 1-2 minutos cada vez. Despois, engadir 100 µl de reactivo de ensaio B por pozo e selar con selante de placas. O comprimido axitouse suavemente e incubouse a 37 °C durante 30 minutos. Aspirar a solución e lavar os pozos 5 veces con 350 µl de solución de lavado 1X. Engadir 90 µl de solución de substrato a cada pozo e selar a placa. Incubar a placa a 37 °C durante 10-20 minutos. Engadir 50 µl de solución de parada a cada pozo. A placa mediuse inmediatamente cun lector de placas Cytation (BioTek) axustado a 450 nm.
Realizáronse análises de potencia para elixir os tamaños de grupo que proporcionarían unha potencia >80 % para detectar un cambio absoluto do 10 % no parámetro cunha taxa de erro de tipo I do 5 %. Realizáronse análises de potencia para elixir os tamaños de grupo que proporcionarían unha potencia >80 % para detectar un cambio absoluto do 10 % no parámetro cunha taxa de erro de tipo I do 5 %. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощносто беспечат 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Realizouse unha análise de potencia para seleccionar tamaños de grupo que proporcionasen unha potencia >80 % para detectar un cambio absoluto nos parámetros do 10 % cunha taxa de erro de tipo I do 5 %.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощнло обнаружения 10% абсолютного изменения параметров e 5% частоты ошибок типа I. Realizouse unha análise de potencia para seleccionar un tamaño de grupo que proporcionase unha potencia >80 % para detectar un cambio absoluto nos parámetros do 10 % e unha taxa de erro de tipo I do 5 %.As seccións de tecido foron seleccionadas aleatoriamente antes do experimento. Todas as análises foron cegas á condición e as mostras foron descodificadas só despois de analizar todos os datos. Empregouse o software GraphPad Prism (San Diego, CA) para realizar todas as análises estatísticas. Para todas as estatísticas, os valores de p consideráronse significativos en valores <0,05. Para todas as estatísticas, os valores p consideráronse significativos en valores <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Para todas as estatísticas, os valores p consideráronse significativos en valores <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Para todas as estatísticas, os valores p consideráronse significativos en valores <0,05.Realizouse a proba t de Student bilateral cos datos con só 2 comparacións. Empregouse ANOVA unidireccional ou bidireccional para determinar a significación entre varios grupos. Ao realizar probas post hoc, aplicouse a corrección de Tukey para ter en conta as comparacións múltiples. Os datos de RNAsec teñen consideracións estatísticas especiais ao calcular a FDR e o axuste p, como se describe na sección Métodos.
Para obter máis información sobre o deseño do estudo, consulta o resumo do Nature Research Report que aparece como ligazón a este artigo.
Data de publicación: 28 de setembro de 2022
