Grazas por visitar Nature.com. A versión do navegador que estás a usar ten compatibilidade limitada con CSS. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que uses un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Mentres tanto, para garantir a compatibilidade continua, renderizaremos o sitio sen estilos nin JavaScript.
Novos métodos inmunolóxicos e espectrométricos de masas para a análise complexa de oligosacáridos persistentes en palla de millo pretratada con AFEX. A biomasa lignocelulósica é unha alternativa sostible aos combustibles fósiles e utilízase amplamente para desenvolver biotecnoloxías para a produción de produtos como alimentos, pensos, combustibles e produtos químicos. A clave destas tecnoloxías é o desenvolvemento de procesos competitivos en custos para converter os carbohidratos complexos presentes nas paredes celulares das plantas en azucres simples como a glicosa, a xilosa e a arabinosa. Debido a que a biomasa lignocelulósica é moi resistente, debe someterse a tratamentos termoquímicos (por exemplo, exfoliación de fibras de amoníaco (AFEX), ácidos diluídos (DA), líquidos iónicos (IL)) e tratamentos biolóxicos (por exemplo, hidrólise encimática e fermentación microbiana) en combinación para obter o produto desexado. Non obstante, cando se usan encimas fúnxicos comerciais no proceso de hidrólise, só o 75-85 % dos azucres solubles formados son monosacáridos, e o 15-25 % restante son oligosacáridos solubles e intratables, que non sempre están dispoñibles para os microorganismos. Anteriormente, illamos e purificamos con éxito oligosacáridos teimudos solubles empregando unha combinación de separación por carbono e terra de diatomeas e cromatografía de exclusión por tamaño, e tamén investigamos as súas propiedades inhibitorias de encimas. Descubrimos que os oligosacáridos que conteñen substitucións de ácido urónico metilado con maior grao de polimerización (DP) son máis difíciles de procesar con mesturas de encimas comerciais que os oligosacáridos de baixo DP e neutros. Aquí informamos do uso de varios métodos adicionais, incluíndo a elaboración de perfís de glicanos empregando anticorpos monoclonais (mAbs) específicos para glicanos de biomasa vexetal para caracterizar os enlaces de glicanos nas paredes celulares das plantas e hidrolizados encimáticos, ionización por desorción láser asistida por matriz e espectrometría de masas por tempo de voo. MALDI-TOF-MS) utiliza picos de diagnóstico informativos sobre a estrutura obtidos por espectroscopia despois da desintegración secundaria de ións negativos, cromatografía de gases e espectrometría de masas (GC-MS) para caracterizar os enlaces de oligosacáridos con e sen derivatización. Debido ao pequeno tamaño dos oligosacáridos (DP 4–20), estas moléculas son difíciles de usar para a unión e caracterización de anticorpos monoclonais. Para superar este problema, aplicamos un novo método de inmobilización de oligosacáridos baseado na conxugación de biotina que marcou con éxito a maioría dos oligosacáridos solubles con baixo DP na superficie da microplaca, que logo se utilizou nun sistema de anticorpos monoclonais de alto rendemento para a análise de ligación específica. Este novo método facilitará o desenvolvemento de ensaios de glicoma de alto rendemento máis avanzados no futuro que se poidan usar para illar e caracterizar os oligosacáridos presentes en biomarcadores con fins diagnósticos.
A biomasa lignocelulósica, composta por materiais agrícolas, forestais, herbáceos e leñosos, é unha materia prima potencial para a produción de produtos biolóxicos, incluíndo alimentos, pensos, combustibles e precursores químicos para producir produtos de maior valor1. Os carbohidratos (como a celulosa e a hemicelulosa) presentes nas paredes celulares das plantas despolimerizanse en monosacáridos mediante procesamento químico e biotransformación (como a hidrólise encimática e a fermentación microbiana). Os pretratamentos comúns inclúen a expansión da fibra de amoníaco (AFEX), o ácido diluído (DA), o líquido iónico (IL) e a explosión de vapor (SE), que usan unha combinación de produtos químicos e calor para reducir a produción de lignocelulosa ao abrir as paredes celulares das plantas3,4. teimosía da materia, 5. A hidrólise encimática lévase a cabo cunha alta carga de sólidos utilizando encimas comerciais que conteñen carbohidratos activos (CAZymes) e fermentación microbiana utilizando lévedos ou bacterias transxénicas para producir combustibles e produtos químicos biolóxicos6.
As CAZímicas nas enzimas comerciais están compostas por unha mestura complexa de enzimas que clivan sinerxicamente enlaces complexos entre carbohidratos e azucres para formar monosacáridos2,7. Como informamos anteriormente, a complexa rede de polímeros aromáticos da lignina cos carbohidratos fainos moi intratables, o que leva a unha conversión incompleta de azucres, acumulando entre o 15 e o 25 % de oligosacáridos sexuais que non se producen durante a hidrólise encimática da biomasa pretratada. Este é un problema común con varios métodos de pretratamento de biomasa. Algunhas das razóns para este obstáculo inclúen a inhibición encimática durante a hidrólise ou a ausencia ou os baixos niveis de enzimas esenciais que se requiren para romper os enlaces de azucres na biomasa vexetal. Comprender a composición e as características estruturais dos azucres, como os enlaces de azucres nos oligosacáridos, axudaranos a mellorar a conversión de azucres durante a hidrólise, facendo que os procesos biotecnolóxicos sexan competitivos en custos cos produtos derivados do petróleo.
Determinar a estrutura dos carbohidratos é un reto e require unha combinación de métodos como a cromatografía líquida (LC)11,12, a espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN)13, a electroforese capilar (CE)14,15,16 e a espectrometría de masas (MS)17., dezaoito. Os métodos de MS como a espectrometría de masas de tempo de voo con desorción láser e ionización usando unha matriz (MALDI-TOF-MS) son un método versátil para identificar estruturas de carbohidratos. Recentemente, a MS en tándem de disociación inducida por colisión (CID) de adutos de ións de sodio foi o máis utilizado para identificar impresións dixitais correspondentes a posicións de unión de oligosacáridos, configuracións anoméricas, secuencias e posicións de ramificación20, 21.
A análise de glicanos é unha ferramenta excelente para a identificación en profundidade das unións de carbohidratos22. Este método emprega anticorpos monoclonais (mAbs) dirixidos ao glicano da parede celular vexetal como sondas para comprender as ligazóns complexas de carbohidratos. Hai máis de 250 mAbs dispoñibles en todo o mundo, deseñados contra varios oligosacáridos lineais e ramificados utilizando varios sacáridos24. Varios mAbs foron amplamente utilizados para caracterizar a estrutura, a composición e as modificacións da parede celular vexetal, xa que existen diferenzas significativas dependendo do tipo de célula vexetal, o órgano, a idade, a etapa de desenvolvemento e o ambiente de crecemento25,26. Máis recentemente, este método utilizouse para comprender as poboacións de vesículas nos sistemas vexetais e animais e os seus respectivos papeis no transporte de glicanos segundo o determinado por marcadores subcelulares, etapas de desenvolvemento ou estímulos ambientais, e para determinar a actividade encimática. Algunhas das diferentes estruturas de glicanos e xilanos que foron identificadas inclúen pectina (P), xilano (X), manano (M), xiloglucanos (XylG), glucanos de enlaces mixtos (MLG), arabinoxilano (ArbX), galactomanano (GalG), ácido glucurónico-arabinoxilano (GArbX) e arabino-galactano (ArbG)29.
Non obstante, a pesar de todos estes esforzos de investigación, só uns poucos estudos se centraron na natureza da acumulación de oligosacáridos durante a hidrólise por alta carga de sólidos (HSL), incluíndo a liberación de oligosacáridos, os cambios na lonxitude da cadea oligomérica durante a hidrólise, varios polímeros de baixa DP e as súas curvas. distribucións 30,31,32. Mentres tanto, aínda que a análise de glicanos demostrou ser unha ferramenta útil para unha análise exhaustiva da estrutura dos glicanos, é difícil avaliar os oligosacáridos de baixa DP solubles en auga utilizando métodos de anticorpos. Os oligosacáridos de DP máis pequenos cun peso molecular inferior a 5-10 kDa non se unen ás placas ELISA 33, 34 e son lavados antes da adición de anticorpos.
Aquí, por primeira vez, demostramos un ensaio ELISA en placas recubertas de avidina usando anticorpos monoclonais, combinando un procedemento de biotinilación dun só paso para oligosacáridos refractarios solubles con análise de glicoma. O noso enfoque para a análise de glicoma foi validado mediante análise baseada en MALDI-TOF-MS e GC-MS de enlaces de oligosacáridos complementarios usando derivatización con trimetilsililo (TMS) de composicións de azucres hidrolizados. Este enfoque innovador pode desenvolverse como un método de alto rendemento no futuro e atopar unha aplicación máis ampla na investigación biomédica35.
As modificacións postraducionais de encimas e anticorpos, como a glicosilación36, afectan á súa actividade biolóxica. Por exemplo, os cambios na glicosilación das proteínas séricas xogan un papel importante na artrite inflamatoria, e os cambios na glicosilación utilízanse como marcadores de diagnóstico37. Na literatura informouse de que varios glicanos aparecen facilmente nunha variedade de enfermidades, incluíndo enfermidades inflamatorias crónicas do tracto gastrointestinal e do fígado, infeccións virais, cancros de ovario, mama e próstata38,39,40. Comprender a estrutura dos glicanos mediante métodos ELISA de glicanos baseados en anticorpos proporcionará unha confianza adicional no diagnóstico de enfermidades sen o uso de métodos complexos de MS.
O noso estudo anterior demostrou que os oligosacáridos teimudos permaneceron sen hidrolizar despois do pretratamento e a hidrólise encimática (Figura 1). No noso traballo publicado anteriormente, desenvolvemos un método de extracción en fase sólida con carbón activado para illar oligosacáridos do hidrolizado de folla de millo pretratado con AFEX (ACSH)8. Despois da extracción e separación iniciais, os oligosacáridos fraccionáronse aínda máis mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) e recolléronse por orde de peso molecular. Os monómeros e oligómeros de azucre liberados de varios pretratamentos analizáronse mediante análise da composición do azucre. Ao comparar o contido de oligómeros de azucre obtidos por varios métodos de pretratamento, a presenza de oligosacáridos teimudos é un problema común na conversión de biomasa en monosacáridos e pode levar a unha redución no rendemento de azucre de polo menos o 10-15 % e incluso ata o 18 %. Este método utilízase para a produción a grande escala de fraccións de oligosacáridos. A ACH resultante e as súas fraccións posteriores con diferentes pesos moleculares utilizáronse como material experimental para a caracterización de oligosacáridos neste traballo.
Tras o pretratamento e a hidrólise encimática, os oligosacáridos persistentes permaneceron sen hidrolizar. Aquí (A) móstrase un método de separación de oligosacáridos no que os oligosacáridos se illan do hidrolizado de millo pretratado con AFEX (ACSH) utilizando un leito compactado de carbón activado e terra de diatomeas; (B) Método para a separación de oligosacáridos. Os oligosacáridos separáronse adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC); (C) Monómeros e oligómeros de sacáridos liberados de varios pretratamentos (ácido diluído: DA, líquido iónico: IL e AFEX). Condicións de hidrólise encimática: alta carga de sólidos do 25 % (p/p) (aproximadamente un 8 % de carga de glucano), hidrólise de 96 horas, carga de encima comercial de 20 mg/g (proporción Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) e (D) Monómeros e oligómeros de azucre de glicosa, xilosa e arabinosa liberados do millo pretratado con AFEX (ACS).
A análise de glicanos demostrou ser unha ferramenta útil para unha análise estrutural exhaustiva dos glicanos en extractos illados de residuos de biomasa sólida. Non obstante, os sacáridos solubles en auga están infrarrepresentados usando este método tradicional41 porque os oligosacáridos de baixo peso molecular son difíciles de inmobilizar en placas ELISA e lávanse antes da adición de anticorpos. Polo tanto, para a unión e caracterización dos anticorpos, utilizouse un método de biotinilación dun só paso para recubrir oligosacáridos solubles e non conformes en placas ELISA recubertas con avidina. Este método probouse usando o noso ACSH producido previamente e unha fracción baseada no seu peso molecular (ou grao de polimerización, DP). Utilizouse biotinilación dun só paso para aumentar a afinidade de unión aos oligosacáridos engadindo biotina-LC-hidrazida ao extremo redutor do carbohidrato (Fig. 2). En solución, o grupo hemiacetal no extremo redutor reacciona co grupo hidrazida da biotina-LC-hidrazida para formar unha unión hidrazona. En presenza do axente redutor NaCNBH3, a unión hidrazona redúcese a un produto final biotinilado estable. Coa modificación do extremo redutor de azucres, fíxose posible a unión de oligosacáridos de baixo DP a placas ELISA, e no noso estudo isto fíxose en placas recubertas de avidina usando anticorpos monoclonais dirixidos a glicanos.
Cribado de anticorpos monoclonais baseado en ELISA para oligosacáridos biotinilados. Aquí (A) combinouse a biotinilación de oligosacáridos e a posterior cribado por ELISA con anticorpos monoclonais dirixidos a glicanos en placas recubertas con NeutrAvidina e (B) móstrase un procedemento dun só paso para a biotinilación de produtos de reacción.
A continuación, engadíronse placas recubertas de avidina con anticorpos conxugados con oligosacáridos aos anticorpos primarios e secundarios e laváronse nun medio sensible á luz e ao tempo. Unha vez completada a unión dos anticorpos, engádese o substrato TMB para incubar a placa. A reacción detívose finalmente con ácido sulfúrico. As placas incubadas analizáronse cun lector ELISA para determinar a forza de unión de cada anticorpo para detectar a reticulación específica de anticorpos. Para obter detalles e parámetros do experimento, consulte a sección correspondente "Materiais e métodos".
Demostramos a utilidade deste método recentemente desenvolvido para aplicacións específicas mediante a caracterización dos oligosacáridos solubles presentes na ACSH, así como nas fraccións de oligosacáridos crus e purificados illados de hidrolizados lignocelulósicos. Como se mostra na Figura 3, os xilanos substituídos por epítopos máis comúns identificados na ACSH mediante métodos de ensaio de glicoma bioacilado adoitan ser os arabinogalactanos urónicos (U) ou metilurónicos (MeU) e pécticos. A maioría deles tamén se atoparon no noso estudo anterior sobre a análise de glicanos de sólidos non hidrolizados (UHS)43.
Detección de epítopos de oligosacáridos recalcitrantes mediante un anticorpo monoclonal dirixido ao glicano da parede celular. A fracción "neutra" é a fracción ACN e a fracción "ácida" é a fracción FA. Os vermellos máis brillantes no mapa de calor indican un maior contido de epítopos e os azuis máis brillantes indican un fondo en branco. Os valores de cor na escala baséanse nos valores de densidade óptica brutos para as formulacións N=2. Os principais epítopos recoñecidos polos anticorpos móstranse á dereita.
Estas estruturas non celulósicas non puideron ser clivadas polas celulases e hemicelulases máis comúns na mestura de encimas comerciais probada, que inclúe os encimas comerciais máis utilizados. Polo tanto, requírense novos encimas auxiliares para a súa hidrólise. Sen os encimas accesorios non celulósicos necesarios, estas ligazóns non celulósicas impiden a conversión completa en monosacáridos, mesmo se os seus polímeros de azucre orixinais se hidrolizan amplamente en fragmentos máis curtos e se disolven usando mesturas de encimas comerciais.
Un estudo máis profundo da distribución do sinal e a súa forza de unión mostrou que os epítopos de unión eran menores nas fraccións de azucres con alto DP (A, B, C, DP ata 20+) que nas fraccións con baixo DP (D, E, F, DP) en dímeros (Fig. 1). Os fragmentos ácidos son máis comúns en epítopos non celulósicos que en fragmentos neutros. Estes fenómenos son consistentes co patrón observado no noso estudo anterior, onde os restos ácidos e de DP alto eran máis resistentes á hidrólise encimática. Polo tanto, a presenza de epítopos de glicanos non celulósicos e as substitucións de U e MeU poden contribuír en gran medida á estabilidade dos oligosacáridos. Cómpre sinalar que a eficiencia de unión e detección pode ser problemática para os oligosacáridos con baixo DP, especialmente se o epítopo é un oligosacárido dimérico ou trimérico. Isto pódese probar utilizando oligosacáridos comerciais de diferentes lonxitudes, cada un contendo só un epítopo que se une a un anticorpo monoclonal específico.
Así, o uso de anticorpos específicos de estrutura revelou certos tipos de enlaces recalcitrantes. Dependendo do tipo de anticorpo empregado, o patrón de ligación axeitado e a forza do sinal que produce (máis e menos abundante), pódense identificar novos encimas e engadir semicuantitativamente á mestura de encimas para unha gliconversión máis completa. Tomando como exemplo a análise dos oligosacáridos ACSH, podemos crear unha base de datos de enlaces glicanos para cada material de biomasa. Débese ter en conta aquí que se debe ter en conta a diferente afinidade dos anticorpos e, se a súa afinidade é descoñecida, isto creará certas dificultades ao comparar os sinais de diferentes anticorpos. Ademais, a comparación de enlaces glicanos pode funcionar mellor entre mostras para o mesmo anticorpo. Estes enlaces teimudos pódense vincular á base de datos CAZyme, a partir da cal podemos identificar encimas, seleccionar encimas candidatos e probar encimas que rompen enlaces ou desenvolver sistemas microbianos para expresar estes encimas para o seu uso en biorrefinerías44.
Para avaliar como os métodos inmunolóxicos complementan os métodos alternativos para a caracterización de oligosacáridos de baixo peso molecular presentes en hidrolizados lignocelulósicos, realizamos MALDI (Fig. 4, S1-S8) e unha análise de sacáridos derivados de TMS baseada en GC-MS no mesmo panel (Fig. 5) de parte de oligosacáridos. MALDI utilízase para comparar se a distribución de masa das moléculas de oligosacáridos coincide coa estrutura pretendida. Na fig. 4 móstrase a MS dos compoñentes neutros ACN-A e ACN-B. A análise de ACN-A confirmou unha gama de azucres pentosos que van desde DP 4–8 (Fig. 4) ata DP 22 (Fig. S1), cuxos pesos corresponden a oligosacáridos MeU-xilano. A análise de ACN-B confirmou as series de pentosas e glicoxilanos con DP 8-15. En material complementario como a Figura S3, os mapas de distribución de masa de restos ácidos FA-C mostran un rango de azucres pentosos substituídos con (Me)U cun DP de 8-15 que son consistentes cos xilanos substituídos atopados na selección de anticorpos monoclonais baseada en ELISA. Os epítopos son consistentes.
Espectro MALDI-MS de oligosacáridos solubles non conformes presentes en ACS. Aquí, (A) fraccións de baixo rango de peso de ACN-A que conteñen oligosacáridos de glucuroxilano substituídos con ácido urónico metilado (DP 4-8) e (B) oligosacáridos de xilano ACN-B e ácido urónico metilado substituídos con glucuroxilano (DP 8-15).
Análise da composición do residuo de glicano de oligosacáridos refractarios. Aquí (A) Composición de sacáridos TMS de varias fraccións de oligosacáridos obtidas mediante análise GC-MS. (B) Estruturas de varios azucres derivados de TMS presentes en oligosacáridos. ACN: fracción de acetonitrilo que contén oligosacáridos neutros e FA: fracción de ácido ferúlico que contén oligosacáridos ácidos.
Outra conclusión interesante extraeuse da análise LC-MS da fracción de oligosacáridos, como se mostra na Figura S9 (os métodos pódense ver no material suplementario electrónico). Observáronse repetidamente fragmentos de grupos hexosa e -OAc durante a ligación da fracción ACN-B. Este achado non só confirma a fragmentación observada na análise de glicoma e MALDI-TOF, senón que tamén proporciona nova información sobre posibles derivados de carbohidratos na biomasa lignocelulósica pretratada.
Tamén realizamos unha análise da composición de glicanos nas fraccións de oligosacáridos mediante derivatización de glicanos por TMS. Mediante GC-MS, determinamos a composición dos azucres neurais (non derivados) e ácidos (GluA e GalA) na fracción de oligosacáridos (Fig. 5). O ácido glucurónico atópase nos compoñentes ácidos C e D, mentres que o ácido galacturónico atópase nos compoñentes ácidos A e B, ambos os cales son compoñentes de alto contido en DP dos azucres ácidos. Estes resultados non só confirman os nosos datos de ELISA e MALDI, senón que tamén son consistentes cos nosos estudos previos sobre a acumulación de oligosacáridos. Polo tanto, cremos que os métodos inmunolóxicos modernos que empregan a biotinilación de oligosacáridos e a posterior detección por ELISA son suficientes para detectar oligosacáridos recalcitrantes solubles en diversas mostras biolóxicas.
Dado que os métodos de cribado de anticorpos monoclonais baseados en ELISA foron validados por varios métodos diferentes, quixemos explorar máis a fondo o potencial deste novo método cuantitativo. Adquiríronse e probáronse dous oligosacáridos comerciais, o oligosacárido de xilohexasacárido (XHE) e a 23-α-L-arabinofuranosil-xilotriosa (A2XX), empregando un novo enfoque de anticorpos monoclonais dirixido ao glicano da parede celular. A figura 6 mostra unha correlación lineal entre o sinal de unión biotinilado e a concentración logarítmica da concentración de oligosacáridos, o que suxire un posible modelo de adsorción de Langmuir. Entre os anticorpos monoclonais, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 e CCRC-M151 correlacionáronse con XHE, e CCRC-M108, CCRC-M109 e LM11 correlacionáronse con A2XX nun rango de 1 nm a 100 nano. Debido á dispoñibilidade limitada de anticorpos durante o experimento, realizáronse experimentos limitados con cada concentración de oligosacárido. Cómpre sinalar aquí que algúns anticorpos reaccionan de xeito moi diferente ao mesmo oligosacárido como substrato, presumiblemente porque se unen a epítopos lixeiramente diferentes e poden ter afinidades de unión moi diferentes. Os mecanismos e as implicacións da identificación precisa de epítopos serán moito máis complexos cando o novo enfoque dos anticorpos monoclonais se aplique a mostras reais.
Empregáronse dous oligosacáridos comerciais para determinar o rango de detección de varios anticorpos monoclonais (ABC) dirixidos a glicanos. Aquí, as correlacións lineais coa concentración logarítmica da concentración de oligosacáridos indican patróns de adsorción de Langmuir para (A) XHE con ABC e (B) A2XX con ABC. Os epítopos correspondentes indican as estruturas dos oligosacáridos comerciais empregados como substratos no ensaio.
O uso de anticorpos monoclonais dirixidos a glicanos (análise glicómica ou cribado de anticorpos monoclonais baseado en ELISA) é unha ferramenta poderosa para a caracterización en profundidade da maioría dos principais glicanos da parede celular que compoñen a biomasa vexetal. Non obstante, a análise clásica de glicanos só caracteriza os glicanos máis grandes da parede celular, xa que a maioría dos oligosacáridos non se inmobilizaron eficientemente en placas ELISA. Neste estudo, o rabo de millo pretratado con AFEX foi hidrolizado encimaticamente cun alto contido de sólidos. A análise de azucres utilizouse para determinar a composición dos carbohidratos recalcitrantes da parede celular no hidrolizado. Non obstante, a análise de anticorpos monoclonais de oligosacáridos máis pequenos en hidrolizados está subestimada e necesítanse ferramentas adicionais para inmobilizar eficazmente os oligosacáridos en placas ELISA.
Presentamos aquí un método novo e eficiente de inmobilización de oligosacáridos para a detección de anticorpos monoclonais mediante a combinación da biotinilación de oligosacáridos seguida da detección por ELISA en placas recubertas de NeutrAvidin™. Os oligosacáridos biotinilados inmobilizados mostraron unha afinidade suficiente polo anticorpo para permitir unha detección rápida e eficiente de oligosacáridos recalcitrantes. A análise da composición destes oligosacáridos teimudos baseada na espectrometría de masas confirmou os resultados desta nova abordaxe para a inmunocribaxe. Polo tanto, estes estudos demostran que a combinación da biotinilación de oligosacáridos e a detección por ELISA con anticorpos monoclonais dirixidos a glicanos pode usarse para detectar enlaces cruzados en oligosacáridos e pode aplicarse amplamente noutros estudos bioquímicos que caracterizan a estrutura dos oligosacáridos.
Este método de elaboración de perfís de glicanos baseado na biotina é o primeiro informe capaz de investigar as unións de carbohidratos recalcitrantes dos oligosacáridos solubles na biomasa vexetal. Isto axuda a comprender por que algunhas partes da biomasa son tan teimosas á hora de producir biocombustibles. Este método enche unha lagoa importante nos métodos de análise de glicoma e amplía a súa aplicación a unha gama máis ampla de substratos máis alá dos oligosacáridos vexetais. No futuro, poderemos usar a robótica para a biotinilación e usar o método que desenvolvemos para a análise de alto rendemento de mostras mediante ELISA.
A palla de millo (CS) cultivada a partir de sementes do híbrido Pioneer 33A14 foi colleitada en 2010 en Kramer Farms en Ray, Colorado. Co permiso do propietario do terreo, esta biomasa pódese usar para a investigación. As mostras almacenáronse en bolsas con peche zip a temperatura ambiente, cunha humidade inferior ao 6 %. As mostras almacenáronse en bolsas con peche zip a temperatura ambiente, cunha humidade inferior ao 6 %. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комтнатной при комтности As mostras almacenáronse en seco a <6 % de humidade en bolsas con cremalleira a temperatura ambiente.样品在室温下以干燥< 6 % 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6 % Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. As mostras almacénanse en bolsas con peche zip a temperatura ambiente e cunha humidade < 6 %.O estudo cumpriu coas directrices locais e nacionais. A análise da composición realizouse mediante o protocolo NREL. Atopouse que a composición contiña 31,4 % de glucano, 18,7 % de xilano, 3,3 % de arabinano, 1,2 % de galactano, 2,2 % de acetil, 14,3 % de lignina, 1,7 % de proteínas e 13,4 % de cinzas.
Cellic® CTec2 (138 mg de proteína/ml, lote VCNI 0001) é unha mestura complexa de celulase, β-glicosidase e Cellic® HTec2 (157 mg de proteína/ml, lote VHN00001) de Novozymes (Franklinton, NC, EUA)). Multifect Pectinase® (72 mg de proteína/ml), unha mestura complexa de encimas degradantes de pectina, foi doada por DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, EUA). As concentracións de proteínas encimáticas determináronse estimando o contido de proteínas (e restando a contribución do nitróxeno non proteico) mediante a análise de nitróxeno de Kjeldahl (método AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, EUA). A terra de diatomeas 545 adquiriuse a EMD Millipore (Billerica, MA). O carbón activado (DARCO, gránulos de malla 100), Avicel (PH-101), xilano de faia e todos os demais produtos químicos foron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
O pretratamento con AFEX realizouse no GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, EUA). O pretratamento levouse a cabo a 140 °C durante 15 minutos. Tempo de residencia de 46 a unha proporción 1:1 de amoníaco anhidro e biomasa cun 60 % de carga (p/p) nun reactor discontinuo de aceiro inoxidable (Parr Instruments Company). Levou 30 minutos. O reactor levouse a 140 °C e o amoníaco liberouse rapidamente, o que permitiu que a biomasa volvese rapidamente á temperatura ambiente. A composición da herba de millo pretratada con AFEX (ACS) foi similar á da herba de millo non tratada (UT-CS).
Preparouse ACSH de alto contido en sólidos ao 25 ​​% (p/p) (aproximadamente un 8 % de carga de dextrano) como material de partida para a produción a grande escala de oligosacáridos. A hidrólise encimática do ACS realizouse empregando unha mestura de encimas comercial que incluía Cellic® Ctec2 10 mg de proteína/g de glucano (en biomasa pretratada), Htec2 (Novozymes, Franklinton, Carolina do Norte), 5 mg de proteína/g de glucano e Multifect Pectinase (Genencor Inc, EUA). ), 5 mg de proteína/g de dextrano. A hidrólise encimática levouse a cabo nun biorreactor de 5 litros cun volume de traballo de 3 litros, pH 4,8, 50 °C e 250 rpm. Despois da hidrólise durante 96 horas, o hidrolizado recolleuse por centrifugación a 6000 rpm durante 30 minutos e despois a 14000 rpm durante 30 minutos para eliminar os sólidos non hidrolizados. O hidrolizado foi entón sometido a filtración estéril a través dun vaso de precipitados de 0,22 mm. O hidrolizado filtrado almacenouse en botellas estériles a 4 °C e despois fraccionouse sobre carbón.
Análise da composición de mostras de biomasa baseadas en extractos segundo os procedementos de análise de laboratorio do NREL: preparación de mostras para a análise de composición (NREL/TP-510-42620) e determinación de carbohidratos estruturais e lignina na biomasa (NREL/TP-510-42618)47.
A análise de oligosacáridos do fluxo de hidrolizado realizouse a unha escala de 2 ml empregando un método de hidrólise ácida baseado en autoclave. Mesturar a mostra de hidrolizado con 69,7 µl de ácido sulfúrico ao 72 % nun tubo de cultivo con tapa de rosca de 10 ml e incubar durante 1 h nunha mesa de traballo a 121 °C, arrefriar en xeo e filtrar nun vial de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). A concentración de oligosacáridos determinouse restando a concentración de monosacáridos na mostra non hidrolizada da concentración total de azucres na mostra hidrolizada con ácido.
As concentracións de glicosa, xilosa e arabinosa na biomasa hidrolizada con ácido analizáronse empregando un sistema HPLC Shimadzu equipado cun mostrador automático, un quentador de columna, unha bomba isocrática e un detector de índice de refracción nunha columna Bio-Rad Aminex HPX-87H. A columna mantívose a 50 °C e eluíuse con 0,6 ml/min de H2SO4 5 mM en fluxo de auga.
O sobrenadante do hidrolizado diluíuse e analizouse para determinar o contido de monómeros e oligosacáridos. Os azucres monoméricos obtidos despois da hidrólise encimática analizáronse mediante HPLC equipada cunha columna Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P e unha columna de protección de cinzas. A temperatura da columna mantívose a 80 °C e utilizouse auga como fase móbil cun caudal de 0,6 ml/min. Os oligosacáridos determináronse mediante hidrólise en ácido diluído a 121 °C segundo os métodos descritos nas referencias 41, 48 e 49.
A análise de sacáridos realizouse en residuos de biomasa crus, pretratados con AFEX e en todos os residuos de biomasa non hidrolizados (incluída a produción de extractos seriados da parede celular e a súa selección de anticorpos monoclonais) utilizando procedementos descritos previamente 27, 43, 50, 51. Para a análise do glicoma, prepáranse residuos insolubles en alcohol de material da parede celular vexetal a partir de residuos de biomasa e sométense a extracción seriada con reactivos cada vez máis agresivos, como oxalato de amonio (50 mM), carbonato de sodio (50 mM e 0,5 % p/v), CON. (1 M e 4 M, ambos con borohidruro de sodio ao 1 % p/v) e clorito ácido como se describiu previamente 52, 53. Os extractos sometéronse entón a ELISA contra un panel complexo de anticorpos monoclonais (mAb50) dirixidos ao glicano da parede celular, e as reaccións de unión aos mAb presentáronse como un mapa de calor. Os mAb dirixidos ao glicano da parede celular vexetal adquirironse de existencias de laboratorio (series CCRC, JIM e MAC).
Biotinilación dun só paso de oligosacáridos. A conxugación de carbohidratos con biotina-LC-hidrazida realizouse mediante o seguinte procedemento. A biotina-LC-hidrazida (4,6 mg/12 μmol) disolveuse en dimetilsulfóxido (DMSO, 70 μl) mediante axitación vigorosa e quecemento a 65 °C durante 1 minuto. Engadiuse ácido acético glacial (30 µl) e a mestura verteuse sobre cianoborohidruro de sodio (6,4 mg/100 µmol) e disolveuse completamente despois de quecemento a 65 °C durante aproximadamente 1 minuto. Despois, engadíronse de 5 a 8 μl da mestura de reacción ao oligosacárido seco (1-100 nmol) para obter un exceso molar de 10 veces ou máis do marcador sobre o extremo redutor. A reacción levouse a cabo a 65 °C durante 2 h, tras o cal as mostras purificáronse inmediatamente. Non se empregou cianoborohidruro de sodio nos experimentos de marcaxe sen redución e as mostras reaccionaron a 65 °C durante 2,5 horas.
Revestimento ELISA e lavado de mostras de oligosacáridos biotinilados. Engadíronse 25 μl de mostras biotiniladas (100 μl de cada mostra concentrada diluída en 5 ml de solución tampón Tris 0,1 M (TBS)) a cada pozo da placa recuberta con avidina. Os pozos de control recubríronse con 50 μl de biotina a unha concentración de 10 μg/ml en TBS 0,1 M. Utilizouse auga desionizada como revestimento para as medicións en branco. O comprimido incubouse durante 2 horas a temperatura ambiente na escuridade. Lavar a placa 3 veces con leite desnatado ao 0,1 % en TBS 0,1 M usando o programa nº 11 para Grenier flat 3A.
Adición e lavado de anticorpos primarios. Engadir 40 µl de anticorpo primario a cada pozo. Incubar a microplaca durante 1 hora a temperatura ambiente na escuridade. Despois, as placas laváronse 3 veces con leite ao 0,1 % en TBS 0,1 M usando o programa de lavado nº 11 para Grenier Flat 3A.
Engadir o anticorpo secundario e lavar. Engadir 50 µl de anticorpo secundario de rato/rata (diluído 1:5000 en leite ao 0,1 % en TBS 0,1 M) a cada pozo. Incubar a microplaca durante 1 hora a temperatura ambiente na escuridade. Despois, as microplacas laváronse 5 veces con leite ao 0,1 % en TBS 0,1 M usando o programa de lavado de placas Grenier Flat 5A n.º 12.
Engadir un substrato. Engadir 50 µl de 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) ao substrato base (engadindo 2 gotas de tampón, 3 gotas de TMB, 2 gotas de peróxido de hidróxeno a 15 ml de auga desionizada). Preparar o substrato TMB e axitar en vórtice antes de usalo). Incubar a microplaca a temperatura ambiente durante 30 minutos. Na escuridade.
Complete o paso e lea o comprimido. Engada 50 µl de ácido sulfúrico 1 N a cada pozo e rexistre a absorbancia de 450 a 655 nm usando un lector ELISA.
Preparar solucións de 1 mg/ml destes analitos en auga desionizada: arabinosa, ramnosa, fucosa, xilosa, ácido galacturónico (GalA), ácido glucurónico (GlcA), manosa, glicosa, galactosa, lactosa, N-acetilmanosamina (manNAc), N-acetilglicosamina (glcNAc), N-acetilgalactosamina (galNAc), inositol (estándar interno). Preparáronse dous estándares engadindo as solucións de azucre de 1 mg/ml que se mostran na Táboa 1. As mostras conxélanse e liofílanse a -80 °C ata que se elimina toda a auga (normalmente unhas 12-18 horas).
Engadir de 100 a 500 µg de mostra a tubos con tapa de rosca nunha balanza analítica. Rexistra a cantidade engadida. É mellor disolver a mostra nunha concentración específica de disolvente e engadila ao tubo como unha alícuota líquida. Usar 20 µl de inositol a 1 mg/ml como estándar interno para cada tubo de mostra. A cantidade de estándar interno engadida á mostra debe ser a mesma que a cantidade de estándar interno engadida ao tubo estándar.
Engadir 8 ml de metanol anhidro a un vial con tapa de rosca. Despois, engadir 4 ml dunha solución de HCl metanólico 3 N, tapar e axitar. Este proceso non emprega auga.
Engadir 500 µl de solución de metanol de HCl 1 M ás mostras de oligosacáridos e aos tubos TMS estándar. As mostras incubáronse durante a noite (168 horas) a 80 °C nun bloque térmico. Secar o produto da metanolise a temperatura ambiente usando un colector de secado. Engadir 200 µl de MeOH e secar de novo. Este proceso repítese dúas veces. Engadir 200 µl de metanol, 100 µl de piridina e 100 µl de anhídrido acético á mostra e mesturar ben. Incubar as mostras a temperatura ambiente durante 30 minutos e secar. Engadir 200 µl de metanol e secar de novo.
Engadir 200 µl de Tri-Sil e quentar o tubo tapado durante 20 minutos a 80 °C e despois arrefriar a temperatura ambiente. Usar un colector de secado para secar aínda máis a mostra ata un volume de aproximadamente 50 µl. É importante ter en conta que non deixamos que as mostras secasen completamente.
Engadir 2 ml de hexano e mesturar ben mediante vórtice. Encher as puntas das pipetas Pasteur (5-8 mm) cun anaco de la de vidro inserindo a la de vidro enriba dunha pipeta de 5-3/4 polgadas de diámetro. As mostras foron centrifugadas a 3000 g durante 2 minutos. Calquera residuo insoluble precipita. Secar a mostra a 100-150 µl. Inxectouse un volume de aproximadamente 1 μl no GC-MS a unha temperatura inicial de 80 °C e un tempo inicial de 2,0 minutos (Táboa 2).