Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર. તમે જે બ્રાઉઝર વર્ઝનનો ઉપયોગ કરી રહ્યા છો તેમાં CSS માટે મર્યાદિત સપોર્ટ છે. શ્રેષ્ઠ અનુભવ માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે અપડેટેડ બ્રાઉઝરનો ઉપયોગ કરો (અથવા ઇન્ટરનેટ એક્સપ્લોરરમાં સુસંગતતા મોડ બંધ કરો). આ દરમિયાન, સતત સપોર્ટ સુનિશ્ચિત કરવા માટે, અમે શૈલીઓ અને જાવાસ્ક્રિપ્ટ વિના સાઇટ પ્રદર્શિત કરીશું.
માનવ આંતરડાના મોર્ફોજેનેસિસ 3D ઉપકલા માઇક્રોઆર્કિટેક્ચર અને અવકાશી સંગઠનના ક્રિપ્ટ-વિલસ લક્ષણો સ્થાપિત કરે છે. આ અનન્ય રચના બેઝલ ક્રિપ્ટમાં સ્ટેમ સેલ માળખાને બાહ્ય માઇક્રોબાયલ એન્ટિજેન્સ અને તેમના મેટાબોલાઇટ્સથી સુરક્ષિત કરીને આંતરડાના હોમિયોસ્ટેસિસ જાળવવા માટે જરૂરી છે. વધુમાં, આંતરડાના વિલી અને સ્ત્રાવક લાળ આંતરડાના મ્યુકોસલ સપાટી પર રક્ષણાત્મક અવરોધ સાથે કાર્યાત્મક રીતે અલગ ઉપકલા કોષો રજૂ કરે છે. તેથી, ઇન વિટ્રો ગટ મોડેલ્સના નિર્માણ માટે 3D ઉપકલા માળખાંને ફરીથી બનાવવું મહત્વપૂર્ણ છે. નોંધપાત્ર રીતે, કાર્બનિક મીમેટિક ગટ-ઓન-એ-ચિપ ઉન્નત શારીરિક કાર્યો અને બાયોમિકેનિક્સ સાથે આંતરડાના ઉપકલાના સ્વયંભૂ 3D મોર્ફોજેનેસિસને પ્રેરિત કરી શકે છે. અહીં, અમે માઇક્રોફ્લુઇડિક ચિપ તેમજ ટ્રાન્સવેલ એમ્બેડેડ હાઇબ્રિડ ચિપ પર આંતરડામાં આંતરડાના મોર્ફોજેનેસિસને મજબૂત રીતે પ્રેરિત કરવા માટે એક પ્રજનનક્ષમ પ્રોટોકોલ પ્રદાન કરીએ છીએ. અમે ઉપકરણ ફેબ્રિકેશન, પરંપરાગત સેટિંગ્સમાં તેમજ માઇક્રોફ્લુઇડિક પ્લેટફોર્મ પર Caco-2 અથવા આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ ઉપકલા કોષોનું સંવર્ધન, 3D મોર્ફોજેનેસિસનું ઇન્ડક્શન અને સ્થાપિત લાક્ષણિકતા માટે વિગતવાર પદ્ધતિઓનું વર્ણન કરીએ છીએ. બહુવિધ ઇમેજિંગ મોડલિટીઝનો ઉપયોગ કરીને 3D એપિથેલિયા. આ પ્રોટોકોલ 5 દિવસ માટે બેસોલેટરલ પ્રવાહી પ્રવાહને નિયંત્રિત કરીને કાર્યાત્મક આંતરડાના માઇક્રોઆર્કિટેક્ચરનું પુનર્જીવન પ્રાપ્ત કરે છે. અમારી ઇન વિટ્રો મોર્ફોજેનેસિસ પદ્ધતિ શારીરિક રીતે સંબંધિત શીયર સ્ટ્રેસ અને યાંત્રિક ગતિનો ઉપયોગ કરે છે અને તેને જટિલ સેલ એન્જિનિયરિંગ અથવા મેનીપ્યુલેશનની જરૂર નથી, જે અન્ય હાલની તકનીકોને પાછળ રાખી શકે છે. અમે કલ્પના કરીએ છીએ કે અમારા પ્રસ્તાવિત પ્રોટોકોલમાં બાયોમેડિકલ સંશોધન સમુદાય માટે વ્યાપક અસરો હોઈ શકે છે, જે બાયોમેડિકલ, ક્લિનિકલ અને ફાર્માસ્યુટિકલ એપ્લિકેશનો માટે ઇન વિટ્રોમાં 3D આંતરડાના ઉપકલા સ્તરોને પુનર્જીવિત કરવાની પદ્ધતિ પ્રદાન કરે છે.
પ્રયોગો દર્શાવે છે કે ગટ-ઓન-એ-ચિપ1,2,3,4,5 અથવા બાયલેયર માઇક્રોફ્લુઇડિક ઉપકરણો6,7 માં સંવર્ધિત આંતરડાના ઉપકલા Caco-2 કોષો અંતર્ગત પદ્ધતિની સ્પષ્ટ સમજણ વિના ઇન વિટ્રોમાં સ્વયંભૂ 3D મોર્ફોજેનેસિસમાંથી પસાર થઈ શકે છે. અમારા તાજેતરના અભ્યાસમાં, અમે શોધી કાઢ્યું છે કે કલ્ચર ઉપકરણોમાંથી બેસોલેટરલી સ્ત્રાવિત મોર્ફોજેનેસિસ વિરોધીઓને દૂર કરવું જરૂરી છે અને ઇન વિટ્રોમાં 3D ઉપકલા મોર્ફોજેનેસિસને પ્રેરિત કરવા માટે પૂરતું છે, જે Caco-2 અને દર્દી-વ્યુત્પન્ન આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ્સ દ્વારા દર્શાવવામાં આવ્યું છે. ઉપકલા કોષોને માન્ય કરવામાં આવ્યા હતા. આ અભ્યાસમાં, અમે ખાસ કરીને ગટ-ઓન-એ-ચિપ અને ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સ ધરાવતા સંશોધિત માઇક્રોફ્લુઇડિક ઉપકરણોમાં, જેને "હાઇબ્રિડ ચિપ" કહેવામાં આવે છે, એક શક્તિશાળી Wnt વિરોધી, ડિકકોપ-1 (DKK-1) ના કોષ ઉત્પાદન અને સાંદ્રતા વિતરણ પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કર્યું. અમે દર્શાવીએ છીએ કે ઓન-ચિપ ગટમાં બાહ્ય Wnt વિરોધીઓ (જેમ કે DKK-1, Wnt રિપ્રેસર 1, સ્ત્રાવિત ફ્રિઝલ્ડ-સંબંધિત પ્રોટીન 1, અથવા સોગી-1) નો ઉમેરો મોર્ફોજેનેસિસને અટકાવે છે અથવા પૂર્વ-સંરચિત 3D ઉપકલા સ્તરને વિક્ષેપિત કરે છે, જે સૂચવે છે કે સંસ્કૃતિ દરમિયાન વિરોધી તણાવ ઇન વિટ્રોમાં આંતરડાના મોર્ફોજેનેસિસ માટે જવાબદાર છે. તેથી, ઉપકલા ઇન્ટરફેસ પર મજબૂત મોર્ફોજેનેસિસ પ્રાપ્ત કરવા માટેનો વ્યવહારુ અભિગમ એ છે કે સક્રિય ફ્લશિંગ (દા.ત., ગટ-ઓન-એ-ચિપ અથવા હાઇબ્રિડ-ઓન-એ-ચિપ પ્લેટફોર્મમાં) અથવા પ્રસરણ દ્વારા બેસોલેટરલ કમ્પાર્ટમેન્ટમાં Wnt વિરોધીઓના સ્તરને દૂર કરવા અથવા ન્યૂનતમ રીતે જાળવવા. બેસોલેટરલ મીડિયા (દા.ત., ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સમાંથી મોટા બેસોલેટરલ જળાશયોમાં કુવાઓમાં).
આ પ્રોટોકોલમાં, અમે ગટ-ઓન-એ-ચિપ માઇક્રોડિવાઇસીસ અને ટ્રાન્સવેલ-ઇન્સર્ટેબલ હાઇબ્રિડ ચિપ્સ (પગલાં 1-5) બનાવવા માટે પોલિડાઇમિથિલસિલોક્સેન (PDMS)-આધારિત છિદ્રાળુ પટલ (પગલાં 6A, 7A, 8, 9) અથવા ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સ (પગલાં 6B, 7B, 8, 9) ના પોલિએસ્ટર પટલ અને પ્રેરિત 3D મોર્ફોજેનેસિસ ઇન વિટ્રો (પગલાં 10) પર આંતરડાના ઉપકલા કોષોને સંવર્ધન કરવા માટે એક વિગતવાર પદ્ધતિ પ્રદાન કરીએ છીએ. અમે બહુવિધ ઇમેજિંગ મોડલિટીઝ (પગલાં 11-24) લાગુ કરીને પેશી-વિશિષ્ટ હિસ્ટોજેનેસિસ અને વંશ-આધારિત સેલ્યુલર ભિન્નતાના સૂચક સેલ્યુલર અને મોલેક્યુલર સુવિધાઓ પણ ઓળખી કાઢી છે. અમે માનવ આંતરડાના ઉપકલા કોષો, જેમ કે Caco-2 અથવા આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ્સનો ઉપયોગ કરીને મોર્ફોજેનેસિસને પ્રેરિત કરીએ છીએ, જેમાં છિદ્રાળુ પટલના સપાટીમાં ફેરફાર, 2D મોનોલેયર્સનું નિર્માણ અને આંતરડાના બાયોકેમિકલ અને બાયોમિકેનિકલ માઇક્રોએનવાયરમેન્ટનું પ્રજનન સહિતની તકનીકી વિગતોનો સમાવેશ થાય છે. 2D ઉપકલા મોનોલેયર્સમાંથી 3D મોર્ફોજેનેસિસને પ્રેરિત કરવા માટે, અમે મોર્ફોજેનેસિસને દૂર કર્યું. સંસ્કૃતિના બેસોલેટરલ કમ્પાર્ટમેન્ટમાં માધ્યમને વહેતા કરીને બંને સંવર્ધિત સ્વરૂપોમાં વિરોધીઓ. અંતે, અમે પુનર્જીવિત 3D ઉપકલા સ્તરની ઉપયોગિતાનું પ્રતિનિધિત્વ પ્રદાન કરીએ છીએ જેનો ઉપયોગ મોર્ફોજન-આધારિત ઉપકલા વૃદ્ધિ, રેખાંશ યજમાન-માઇક્રોબાયોમ સહ-સંસ્કૃતિઓ, રોગકારક ચેપ, બળતરા ઇજા, ઉપકલા અવરોધ નિષ્ક્રિયતા અને પ્રોબાયોટિક-આધારિત ઉપચારોના મોડેલ માટે થઈ શકે છે. ઉદાહરણ. પ્રભાવો.
અમારો પ્રોટોકોલ મૂળભૂત (દા.ત., આંતરડાના મ્યુકોસલ બાયોલોજી, સ્ટેમ સેલ બાયોલોજી, અને ડેવલપમેન્ટલ બાયોલોજી) અને એપ્લાઇડ રિસર્ચ (દા.ત., પ્રીક્લિનિકલ ડ્રગ ટેસ્ટિંગ, ડિસીઝ મોડેલિંગ, ટીશ્યુ એન્જિનિયરિંગ અને ગેસ્ટ્રોએન્ટેરોલોજી) ના વ્યાપક પ્રભાવમાં વૈજ્ઞાનિકોની વિશાળ શ્રેણી માટે ઉપયોગી થઈ શકે છે. ઇન વિટ્રોમાં આંતરડાના ઉપકલાના 3D મોર્ફોજેનેસિસને પ્રેરિત કરવા માટે અમારા પ્રોટોકોલની પ્રજનનક્ષમતા અને મજબૂતાઈને કારણે, અમે કલ્પના કરીએ છીએ કે અમારી તકનીકી વ્યૂહરચના આંતરડાના વિકાસ, પુનર્જીવન અથવા હોમિયોસ્ટેસિસ દરમિયાન કોષ સિગ્નલિંગની ગતિશીલતાનો અભ્યાસ કરતા પ્રેક્ષકોને પ્રસારિત કરી શકાય છે. વધુમાં, અમારો પ્રોટોકોલ નોરોવાયરસ 8, ગંભીર તીવ્ર શ્વસન સિન્ડ્રોમ કોરોનાવાયરસ 2 (SARS-CoV-2), ક્લોસ્ટ્રિડિયમ ડિફિસિલ, સૅલ્મોનેલા ટાઇફીમ્યુરિયમ 9 અથવા વિબ્રિઓ કોલેરા જેવા વિવિધ ચેપી એજન્ટો હેઠળ ચેપની તપાસ કરવા માટે ઉપયોગી છે. રોગ રોગવિજ્ઞાન અને પેથોજેનેસિસના પ્રેક્ષકો પણ ઉપયોગી છે. ઓન-ચીપ ગટ માઇક્રોફિઝિયોલોજી સિસ્ટમનો ઉપયોગ લોંગિટ્યુડનલ કો-કલ્ચર 10 અને ગેસ્ટ્રોઇન્ટેસ્ટાઇનલ (GI) ટ્રેક્ટ 11 માં યજમાન સંરક્ષણ, રોગપ્રતિકારક પ્રતિભાવો અને પેથોજેન-સંબંધિત ઇજા સમારકામના અનુગામી મૂલ્યાંકનને મંજૂરી આપી શકે છે. લીકી ગટ સિન્ડ્રોમ, સેલિયાક રોગ, ક્રોહન રોગ, અલ્સેરેટિવ કોલાઇટિસ, પાઉચાઇટિસ અથવા ઇરિટેબલ બોવેલ સિન્ડ્રોમ સાથે સંકળાયેલ અન્ય GI વિકૃતિઓનું અનુકરણ કરી શકાય છે જ્યારે દર્દીના 3D આંતરડાના ઉપકલા સ્તરોનો ઉપયોગ કરીને 3D આંતરડાના ઉપકલા સ્તરો તૈયાર કરવામાં આવે છે. આ રોગોમાં વિલસ એટ્રોફી, ક્રિપ્ટ શોર્ટનિંગ, મ્યુકોસલ નુકસાન અથવા ક્ષતિગ્રસ્ત ઉપકલા અવરોધનો સમાવેશ થાય છે. બાયોપ્સી અથવા સ્ટેમ સેલ-ડેરિવેટેડ આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ્સ12,13. રોગ પર્યાવરણની ઉચ્ચ જટિલતાને વધુ સારી રીતે મોડેલ કરવા માટે, વાચકો 3D આંતરડાના વિલુસ-ક્રિપ્ટ માઇક્રોઆર્કિટેક્ચર ધરાવતા મોડેલોમાં રોગ-સંબંધિત કોષ પ્રકારો, જેમ કે દર્દીના પેરિફેરલ બ્લડ મોનોન્યુક્લિયર કોષો (PBMCs) ઉમેરવાનું વિચારી શકે છે. પેશી-વિશિષ્ટ રોગપ્રતિકારક કોષો, 5.
3D એપિથેલિયલ માઇક્રોસ્ટ્રક્ચરને સેક્શનિંગ પ્રક્રિયા વિના ફિક્સ અને વિઝ્યુઅલાઈઝ કરી શકાય છે, તેથી સ્પેશિયલ ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક્સ અને હાઇ-રિઝોલ્યુશન અથવા સુપર-રિઝોલ્યુશન ઇમેજિંગ પર કામ કરતા દર્શકોને એપિથેલિયલ નિશેસ પર જનીનો અને પ્રોટીનના સ્પેટીયોટેમ્પોરલ ડાયનેમિક્સનું મેપિંગ કરવામાં રસ હોઈ શકે છે. ટેકનોલોજીમાં રસ. માઇક્રોબાયોમ અથવા રોગપ્રતિકારક ઉત્તેજનાના પ્રતિભાવ. વધુમાં, ગટ હોમિયોસ્ટેસિસનું સંકલન કરતા રેખાંશિક યજમાન-માઇક્રોબાયોમ ક્રોસસ્ટોક 10, 14, 3D આંતરડાના મ્યુકોસલ સ્તરમાં વિવિધ માઇક્રોબાયલ પ્રજાતિઓ, માઇક્રોબાયલ સમુદાયો અથવા ફેકલ માઇક્રોબાયોટા, ખાસ કરીને ગટ-ઓન-એ-ચિપમાં સહ-સંવર્ધન દ્વારા સ્થાપિત કરી શકાય છે. પ્લેટફોર્મમાં. આ અભિગમ ખાસ કરીને મ્યુકોસલ ઇમ્યુનોલોજી, ગેસ્ટ્રોએન્ટેરોલોજી, હ્યુમન માઇક્રોબાયોમ, કલ્ચ્યુરોમિક્સ અને ક્લિનિકલ માઇક્રોબાયોલોજીનો અભ્યાસ કરતા પ્રેક્ષકો માટે આકર્ષક છે જેઓ પ્રયોગશાળામાં અગાઉ અસંસ્કૃત ગટ માઇક્રોબાયોટાને કેળવવા માંગતા હોય છે. જો અમારા ઇન વિટ્રો મોર્ફોજેનેસિસ પ્રોટોકોલને સ્કેલેબલ કલ્ચર ફોર્મેટમાં અનુકૂલિત કરી શકાય છે, જેમ કે 24, 96 અથવા 384 વેલ પ્લેટ્સમાં મલ્ટિવેલ ઇન્સર્ટ્સ જે સતત બેસોલેટરલ કમ્પાર્ટમેન્ટ્સને ફરીથી ભરે છે, તો પ્રોટોકોલને ફાર્માસ્યુટિકલ, બાયોમેડિકલ અથવા હાઇ-થ્રુપુટ સ્ક્રીનીંગ અથવા ફૂડ ઉદ્યોગ માટે માન્યતા પ્લેટફોર્મ વિકસાવનારાઓને પણ પ્રસારિત કરી શકાય છે. સિદ્ધાંતના પુરાવા તરીકે, અમે તાજેતરમાં 24-વેલ પ્લેટ ફોર્મેટમાં સ્કેલેબલ મલ્ટિપ્લેક્સ હાઇ-થ્રુપુટ મોર્ફોજેનેસિસ સિસ્ટમની શક્યતા દર્શાવી છે. વધુમાં, બહુવિધ ઓર્ગન-ઓન-એ-ચિપ ઉત્પાદનોનું વ્યાપારીકરણ કરવામાં આવ્યું છે16,17,18. તેથી, અમારી ઇન વિટ્રો મોર્ફોજેનેસિસ પદ્ધતિની માન્યતાને ઝડપી બનાવી શકાય છે અને ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક સ્તરે ઇન વિટ્રો ગટ મોર્ફોજેનેસિસના સેલ્યુલર રિપ્રોગ્રામિંગને સમજવા માટે ઘણી સંશોધન પ્રયોગશાળાઓ, ઉદ્યોગ અથવા સરકાર અને નિયમનકારી એજન્સીઓ દ્વારા સંભવિત રીતે અપનાવી શકાય છે. દવાઓ અથવા બાયોથેરાપ્યુટિક્સ ગટ મોર્ફોજેનેસિસ પ્રક્રિયાની પ્રજનનક્ષમતાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે 3D ગટ સરોગેટ્સનો ઉપયોગ કરીને અથવા કસ્ટમ અથવા કોમર્શિયલ ઓર્ગન-ઓન-એ-ચિપ મોડેલ્સનો ઉપયોગ કરીને ડ્રગ ઉમેદવારોના શોષણ અને પરિવહનનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું.
આંતરડાના ઉપકલા મોર્ફોજેનેસિસનો અભ્યાસ કરવા માટે મર્યાદિત સંખ્યામાં માનવ-સંબંધિત પ્રાયોગિક મોડેલોનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો છે, જે મુખ્યત્વે 3D મોર્ફોજેનેસિસ ઇન વિટ્રોને પ્રેરિત કરવા માટે અમલમાં મૂકી શકાય તેવા પ્રોટોકોલના અભાવને કારણે છે. હકીકતમાં, આંતરડાના મોર્ફોજેનેસિસ વિશેનું મોટાભાગનું વર્તમાન જ્ઞાન પ્રાણીઓના અભ્યાસ પર આધારિત છે (દા.ત., ઝેબ્રાફિશ20, ઉંદર21 અથવા ચિકન22). જો કે, તે શ્રમ- અને ખર્ચ-સઘન છે, નૈતિક રીતે શંકાસ્પદ હોઈ શકે છે, અને સૌથી અગત્યનું, માનવ વિકાસ પ્રક્રિયાઓને ચોક્કસપણે નક્કી કરતા નથી. આ મોડેલો બહુ-માર્ગી સ્કેલેબલ રીતે પરીક્ષણ કરવાની તેમની ક્ષમતામાં પણ ખૂબ મર્યાદિત છે. તેથી, વિટ્રોમાં 3D પેશી માળખાને પુનર્જીવિત કરવા માટેનો અમારો પ્રોટોકોલ વિવો પ્રાણી મોડેલો તેમજ અન્ય પરંપરાગત સ્થિર 2D સેલ કલ્ચર મોડેલોમાં શ્રેષ્ઠ પ્રદર્શન કરે છે. અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ, 3D ઉપકલા માળખાનો ઉપયોગ કરવાથી અમને વિવિધ મ્યુકોસલ અથવા રોગપ્રતિકારક ઉત્તેજનાના પ્રતિભાવમાં ક્રિપ્ટ-વિલસ અક્ષમાં વિભિન્ન કોષોના અવકાશી સ્થાનિકીકરણની તપાસ કરવાની મંજૂરી મળી. 3D ઉપકલા સ્તરો યજમાન પરિબળો (દા.ત., આંતરિક વિરુદ્ધ બાહ્ય મ્યુકસ સ્તરો, સ્ત્રાવ) ના પ્રતિભાવમાં માઇક્રોબાયલ કોષો અવકાશી માળખા બનાવવા માટે કેવી રીતે સ્પર્ધા કરે છે તેનો અભ્યાસ કરવા માટે જગ્યા પૂરી પાડી શકે છે. IgA અને એન્ટિમાઇક્રોબાયલ પેપ્ટાઇડ્સ). વધુમાં, 3D એપિથેલિયલ મોર્ફોલોજી આપણને સમજવામાં મદદ કરી શકે છે કે આંતરડાના માઇક્રોબાયોટા તેના સમુદાયોની રચના કેવી રીતે કરે છે અને સિનર્જિસ્ટિકલી માઇક્રોબાયોટા મેટાબોલાઇટ્સ (દા.ત., શોર્ટ-ચેઇન ફેટી એસિડ્સ) ઉત્પન્ન કરે છે જે બેઝલ ક્રિપ્ટ્સમાં સેલ્યુલર સંગઠન અને સ્ટેમ સેલ માળખાને આકાર આપે છે. આ લક્ષણો ફક્ત ત્યારે જ દર્શાવી શકાય છે જ્યારે 3D એપિથેલિયલ સ્તરો ઇન વિટ્રો સ્થાપિત થાય છે.
3D આંતરડાના ઉપકલા માળખા બનાવવાની અમારી પદ્ધતિ ઉપરાંત, ઘણી ઇન વિટ્રો પદ્ધતિઓ છે. આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ કલ્ચર એ એક અત્યાધુનિક ટીશ્યુ એન્જિનિયરિંગ તકનીક છે જે ચોક્કસ મોર્ફોજન પરિસ્થિતિઓ 23,24,25 હેઠળ આંતરડાના સ્ટેમ કોષોની ખેતી પર આધારિત છે. જો કે, પરિવહન વિશ્લેષણ અથવા યજમાન-માઇક્રોબાયોમ કો-કલ્ચર માટે 3D ઓર્ગેનોઇડ મોડેલનો ઉપયોગ ઘણીવાર પડકારજનક હોય છે કારણ કે આંતરડાના લ્યુમેન ઓર્ગેનોઇડની અંદર બંધ હોય છે અને તેથી, માઇક્રોબાયલ કોષો અથવા બાહ્ય એન્ટિજેન્સ જેવા લ્યુમિનલ ઘટકોનો પરિચય મર્યાદિત હોય છે. માઇક્રોઇન્જેક્ટરનો ઉપયોગ કરીને ઓર્ગેનોઇડ લ્યુમેનની ઍક્સેસ સુધારી શકાય છે, 26,27 પરંતુ આ પદ્ધતિ આક્રમક અને શ્રમ-સઘન છે અને તેને કરવા માટે વિશિષ્ટ જ્ઞાનની જરૂર છે. વધુમાં, સ્થિર પરિસ્થિતિઓમાં હાઇડ્રોજેલ સ્કેફોલ્ડમાં જાળવવામાં આવતી પરંપરાગત ઓર્ગેનોઇડ સંસ્કૃતિઓ વિવો બાયોમિકેનિક્સમાં સક્રિય રીતે પ્રતિબિંબિત થતી નથી.
ઘણા સંશોધન જૂથો દ્વારા ઉપયોગમાં લેવાતા અન્ય અભિગમો જેલ સપાટી પર અલગ માનવ આંતરડાના કોષોને સંવર્ધન કરીને આંતરડાના ઉપકલા માળખાની નકલ કરવા માટે પ્રીસ્ટ્રક્ચર્ડ 3D હાઇડ્રોજેલ સ્કેફોલ્ડનો ઉપયોગ કરે છે. 3D-પ્રિન્ટેડ, માઇક્રો-મિલ્ડ અથવા લિથોગ્રાફિકલી ફેબ્રિકેટ મોલ્ડનો ઉપયોગ કરીને હાઇડ્રોજેલ સ્કેફોલ્ડ્સનું ઉત્પાદન કરો. આ પદ્ધતિ શારીરિક રીતે સંબંધિત મોર્ફોજન ગ્રેડિયન્ટ્સ સાથે વિટ્રોમાં અલગ ઉપકલા કોષોની સ્વ-સંગઠિત ગોઠવણી દર્શાવે છે, સ્કેફોલ્ડમાં સ્ટ્રોમલ કોષોનો સમાવેશ કરીને ઉચ્ચ પાસા ગુણોત્તર ઉપકલા માળખું અને સ્ટ્રોમા-એપિથેલિયલ ક્રોસટોક સ્થાપિત કરે છે. જો કે, પ્રીસ્ટ્રક્ચર્ડ સ્કેફોલ્ડ્સની પ્રકૃતિ સ્વયંભૂ મોર્ફોજેનેટિક પ્રક્રિયાના પ્રદર્શનને અટકાવી શકે છે. આ મોડેલો ગતિશીલ લ્યુમિનલ અથવા ઇન્ટર્સ્ટિશલ પ્રવાહ પણ પ્રદાન કરતા નથી, પ્રવાહી શીયર તણાવનો અભાવ છે જે આંતરડાના કોષોને મોર્ફોજેનેસિસમાંથી પસાર થવા અને શારીરિક કાર્ય મેળવવા માટે જરૂરી છે. તાજેતરના અન્ય એક અભ્યાસમાં માઇક્રોફ્લુઇડિક પ્લેટફોર્મમાં હાઇડ્રોજેલ સ્કેફોલ્ડ્સ અને લેસર-એચિંગ તકનીકોનો ઉપયોગ કરીને પેટર્નવાળી આંતરડાની ઉપકલા રચનાઓનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. માઉસ આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ્સ આંતરડાના ટ્યુબ્યુલર માળખા બનાવવા માટે કોતરેલા પેટર્નને અનુસરે છે, અને ઇન્ટ્રાલ્યુમિનલ પ્રવાહી પ્રવાહને એકનો ઉપયોગ કરીને ફરીથી ગોઠવી શકાય છે. માઇક્રોફ્લુઇડિક્સ મોડ્યુલ. જો કે, આ મોડેલ ન તો સ્વયંભૂ મોર્ફોજેનેટિક પ્રક્રિયાઓ દર્શાવે છે અને ન તો આંતરડાના મિકેનિકલ હલનચલનનો સમાવેશ કરે છે. સમાન જૂથમાંથી 3D પ્રિન્ટિંગ તકનીકો સ્વયંભૂ મોર્ફોજેનેટિક પ્રક્રિયાઓ સાથે લઘુચિત્ર આંતરડા ટ્યુબ બનાવવામાં સક્ષમ હતી. ટ્યુબની અંદર વિવિધ આંતરડાના ભાગોના જટિલ નિર્માણ હોવા છતાં, આ મોડેલમાં લ્યુમિનલ પ્રવાહી પ્રવાહ અને યાંત્રિક વિકૃતિનો પણ અભાવ છે. વધુમાં, મોડેલ કાર્યક્ષમતા મર્યાદિત હોઈ શકે છે, ખાસ કરીને બાયોપ્રિંટિંગ પ્રક્રિયા પૂર્ણ થયા પછી, પ્રાયોગિક પરિસ્થિતિઓ અથવા કોષ-થી-કોષ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને ખલેલ પહોંચાડે છે. તેના બદલે, અમારો પ્રસ્તાવિત પ્રોટોકોલ સ્વયંભૂ આંતરડા મોર્ફોજેનેસિસ, શારીરિક રીતે સંબંધિત શીયર સ્ટ્રેસ, આંતરડાની ગતિશીલતાની નકલ કરતી બાયોમિકેનિક્સ, સ્વતંત્ર એપિકલ અને બેસોલેટરલ કમ્પાર્ટમેન્ટ્સની સુલભતા અને મોડ્યુલરિટીના જટિલ જૈવિક સૂક્ષ્મ પર્યાવરણોનું પુનઃનિર્માણ પ્રદાન કરે છે. તેથી, અમારો ઇન વિટ્રો 3D મોર્ફોજેનેસિસ પ્રોટોકોલ હાલની પદ્ધતિઓના પડકારોને દૂર કરવા માટે પૂરક અભિગમ પ્રદાન કરી શકે છે.
અમારો પ્રોટોકોલ સંપૂર્ણપણે 3D ઉપકલા મોર્ફોજેનેસિસ પર કેન્દ્રિત છે, જેમાં સંસ્કૃતિમાં ફક્ત ઉપકલા કોષો છે અને મેસેનકાઇમલ કોષો, એન્ડોથેલિયલ કોષો અને રોગપ્રતિકારક કોષો જેવા અન્ય કોઈ પ્રકારના આસપાસના કોષો નથી. અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ, અમારા પ્રોટોકોલનો મુખ્ય ભાગ રજૂ કરાયેલ માધ્યમની બેસોલેટરલ બાજુએ સ્ત્રાવિત મોર્ફોજેનેસિસ અવરોધકોને દૂર કરીને ઉપકલા મોર્ફોજેનેસિસનું ઇન્ડક્શન છે. જ્યારે અમારા ગટ-ઓન-એ-ચિપ અને હાઇબ્રિડ-ઓન-એ-ચિપની મજબૂત મોડ્યુલરિટી અમને અનડ્યુલેટિંગ 3D ઉપકલા સ્તરને ફરીથી બનાવવાની મંજૂરી આપે છે, ત્યારે ઉપકલા-મેસેનકાઇમલ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ 33,34, એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર મેટ્રિક્સ (ECM) ડિપોઝિશન 35 અને, અમારા મોડેલમાં, બેઝલ ક્રિપ્ટ્સમાં સ્ટેમ સેલ માળખાને પહોંચાડતી ક્રિપ્ટ-વિલસ સુવિધાઓ જેવી વધારાની જૈવિક જટિલતાઓ પર વધુ વિચારણા કરવાની બાકી છે. મેસેનકાઇમમાં સ્ટ્રોમલ કોષો (દા.ત., ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ્સ) ECM પ્રોટીનના ઉત્પાદનમાં અને વિવોમાં આંતરડાના મોર્ફોજેનેસિસના નિયમનમાં મુખ્ય ભૂમિકા ભજવે છે35,37,38. અમારા મોડેલમાં મેસેનકાઇમલ કોષોના ઉમેરાથી મોર્ફોજેનેટિક પ્રક્રિયા અને કોષ જોડાણ કાર્યક્ષમતા. એન્ડોથેલિયલ સ્તર (એટલે ​​કે, રુધિરકેશિકાઓ અથવા લસિકા) આંતરડાના સૂક્ષ્મ પર્યાવરણમાં પરમાણુ પરિવહન39 અને રોગપ્રતિકારક કોષ ભરતી40 ને નિયંત્રિત કરવામાં મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવે છે. વધુમાં, જ્યારે ટીશ્યુ મોડેલો બહુ-અંગ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ દર્શાવવા માટે રચાયેલ હોય ત્યારે ટીશ્યુ મોડેલો વચ્ચે જોડાયેલા વેસ્ક્યુલેચર ઘટકો પૂર્વશરત છે. તેથી, અંગ-સ્તરના રિઝોલ્યુશન સાથે વધુ સચોટ શારીરિક સુવિધાઓનું મોડેલ બનાવવા માટે એન્ડોથેલિયલ કોષોનો સમાવેશ કરવાની જરૂર પડી શકે છે. દર્દી દ્વારા મેળવેલા રોગપ્રતિકારક કોષો આંતરડાના રોગની નકલ કરવાના સંદર્ભમાં જન્મજાત રોગપ્રતિકારક પ્રતિભાવો, એન્ટિજેન પ્રસ્તુતિ, જન્મજાત અનુકૂલનશીલ રોગપ્રતિકારક ક્રોસટોક અને પેશી-વિશિષ્ટ રોગપ્રતિકારક શક્તિ પ્રદર્શિત કરવા માટે પણ આવશ્યક છે.
હાઇબ્રિડ ચિપ્સનો ઉપયોગ ગટ-ઓન-એ-ચિપ કરતાં વધુ સીધો છે કારણ કે ડિવાઇસ સેટઅપ સરળ છે અને ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સનો ઉપયોગ ગટ એપિથેલિયમના સ્કેલેબલ કલ્ચરને મંજૂરી આપે છે. જો કે, પોલિએસ્ટર મેમ્બ્રેન સાથે વ્યાપારી રીતે ઉપલબ્ધ ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સ સ્થિતિસ્થાપક નથી અને પેરીસ્ટાલ્ટિક જેવી હિલચાલનું અનુકરણ કરી શકતા નથી. વધુમાં, હાઇબ્રિડ ચિપમાં મૂકવામાં આવેલા ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સનો એપિકલ કમ્પાર્ટમેન્ટ એપિકલ બાજુ પર કોઈ શીયર સ્ટ્રેસ વિના સ્થિર રહ્યો. સ્પષ્ટપણે, એપિકલ કમ્પાર્ટમેન્ટમાં સ્થિર ગુણધર્મો ભાગ્યે જ હાઇબ્રિડ ચિપ્સમાં લાંબા ગાળાના બેક્ટેરિયલ કો-કલ્ચરને સક્ષમ કરે છે. જ્યારે આપણે હાઇબ્રિડ ચિપ્સનો ઉપયોગ કરતી વખતે ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સમાં 3D મોર્ફોજેનેસિસને મજબૂત રીતે પ્રેરિત કરી શકીએ છીએ, ત્યારે શારીરિક રીતે સંબંધિત બાયોમિકેનિક્સ અને એપિકલ પ્રવાહી પ્રવાહની અછત સંભવિત એપ્લિકેશનો માટે હાઇબ્રિડ ચિપ પ્લેટફોર્મની શક્યતાને મર્યાદિત કરી શકે છે.
ગટ-ઓન-એ-ચિપ અને હાઇબ્રિડ-ઓન-એ-ચિપ સંસ્કૃતિઓમાં માનવ ક્રિપ્ટ-વિલસ અક્ષનું પૂર્ણ-સ્તરીય પુનર્નિર્માણ સંપૂર્ણપણે સ્થાપિત થયું નથી. મોર્ફોજેનેસિસ ઉપકલા મોનોલેયરથી શરૂ થાય છે, તેથી 3D માઇક્રોઆર્કિટેક્ચર્સ આવશ્યકપણે ક્રિપ્ટ્સમાં મોર્ફોલોજિકલ સમાનતા પ્રદાન કરતા નથી. જો કે અમે માઇક્રોએન્જિનિયર્ડ 3D એપિથેલિયમમાં બેઝલ ક્રિપ્ટ ડોમેનની નજીક ફેલાયેલી કોષ વસ્તીનું વર્ણન કર્યું છે, ક્રિપ્ટ અને વિલસ પ્રદેશો સ્પષ્ટ રીતે સીમાંકિત કરવામાં આવ્યા ન હતા. જોકે ચિપ પર ઉચ્ચ ઉપલા ચેનલો માઇક્રોએન્જિનિયર્ડ એપિથેલિયમની ઊંચાઈમાં વધારો તરફ દોરી જાય છે, મહત્તમ ઊંચાઈ હજુ પણ ~300–400 µm સુધી મર્યાદિત છે. નાના અને મોટા આંતરડામાં માનવ આંતરડાના ક્રિપ્ટ્સની વાસ્તવિક ઊંડાઈ અનુક્રમે ~135 µm અને ~400 µm છે, અને નાના આંતરડાના વિલીની ઊંચાઈ ~600 µm41 છે.
ઇમેજિંગના દૃષ્ટિકોણથી, 3D માઇક્રોઆર્કિટેક્ચર્સની ઇન સિટુ સુપર-રિઝોલ્યુશન ઇમેજિંગ ચિપ પરના આંતરડા સુધી મર્યાદિત હોઈ શકે છે, કારણ કે ઑબ્જેક્ટિવ લેન્સથી એપિથેલિયલ લેયર સુધી જરૂરી કાર્યકારી અંતર થોડા મિલીમીટર જેટલું છે. આ સમસ્યાને દૂર કરવા માટે, દૂરના ઑબ્જેક્ટિવની જરૂર પડી શકે છે. વધુમાં, PDMS ની ઉચ્ચ સ્થિતિસ્થાપકતાને કારણે ઇમેજિંગ નમૂનાની તૈયારી માટે પાતળા વિભાગો બનાવવા પડકારજનક છે. વધુમાં, ચિપ પર ગટના સ્તર-દર-સ્તર માઇક્રોફેબ્રિકેશનમાં દરેક સ્તર વચ્ચે કાયમી સંલગ્નતા શામેલ હોવાથી, એપિથેલિયલ લેયરની સપાટીની રચનાની તપાસ કરવા માટે ઉપલા સ્તરને ખોલવું અથવા દૂર કરવું અત્યંત પડકારજનક છે. ઉદાહરણ તરીકે, સ્કેનિંગ ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપ (SEM) નો ઉપયોગ કરીને.
હાઇડ્રોફોબિક નાના અણુઓ સાથે કામ કરતા માઇક્રોફ્લુઇડિક-આધારિત અભ્યાસોમાં PDMS ની હાઇડ્રોફોબિસિટી એક મર્યાદિત પરિબળ રહી છે, કારણ કે PDMS આવા હાઇડ્રોફોબિક અણુઓને બિન-વિશિષ્ટ રીતે શોષી શકે છે. PDMS ના વિકલ્પોને અન્ય પોલિમરીક પદાર્થો સાથે ધ્યાનમાં લઈ શકાય છે. વૈકલ્પિક રીતે, PDMS ની સપાટીમાં ફેરફાર (દા.ત., લિપોફિલિક પદાર્થો 42 અથવા પોલી(ઇથિલિન ગ્લાયકોલ) 43 સાથે કોટિંગ) ને હાઇડ્રોફોબિક અણુઓના શોષણને ઘટાડવા માટે ધ્યાનમાં લઈ શકાય છે.
છેલ્લે, અમારી પદ્ધતિ ઉચ્ચ-થ્રુપુટ સ્ક્રીનીંગ અથવા "એક-કદ-બંધબેસતા-બધા" વપરાશકર્તા-મૈત્રીપૂર્ણ પ્રાયોગિક પ્લેટફોર્મ પ્રદાન કરવાના સંદર્ભમાં સારી રીતે વર્ગીકૃત કરવામાં આવી નથી. વર્તમાન પ્રોટોકોલમાં દરેક માઇક્રોડિવાઇસ માટે સિરીંજ પંપની જરૂર છે, જે CO2 ઇન્ક્યુબેટરમાં જગ્યા લે છે અને મોટા પાયે પ્રયોગોને અટકાવે છે. આ મર્યાદાને નવીન સંસ્કૃતિ ફોર્મેટ (દા.ત., 24-વેલ, 96-વેલ, અથવા 384-વેલ છિદ્રાળુ ઇન્સર્ટ્સ જે સતત ફરી ભરવા અને બેસોલેટરલ મીડિયાને દૂર કરવાની મંજૂરી આપે છે) ની માપનીયતા દ્વારા નોંધપાત્ર રીતે સુધારી શકાય છે.
માનવ આંતરડાના ઉપકલાના 3D મોર્ફોજેનેસિસને પ્રેરિત કરવા માટે, અમે લ્યુમેન-કેપિલરી ઇન્ટરફેસ બનાવવા માટે બે સમાંતર માઇક્રોચેનલ અને વચ્ચે એક સ્થિતિસ્થાપક છિદ્રાળુ પટલ ધરાવતા માઇક્રોફ્લુઇડિક ચિપ આંતરડાના ઉપકરણનો ઉપયોગ કર્યો. અમે સિંગલ-ચેનલ માઇક્રોફ્લુઇડિક ઉપકરણ (એક હાઇબ્રિડ ચિપ) નો ઉપયોગ પણ દર્શાવીએ છીએ જે ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સ પર ઉગાડવામાં આવેલા ધ્રુવીકૃત ઉપકલા સ્તરો હેઠળ સતત બેસોલેટરલ પ્રવાહ પૂરો પાડે છે. બંને પ્લેટફોર્મમાં, બેસોલેટરલ કમ્પાર્ટમેન્ટમાંથી મોર્ફોજન વિરોધીઓને દૂર કરવા માટે પ્રવાહના દિશાત્મક મેનિપ્યુલેશન લાગુ કરીને વિવિધ માનવ આંતરડાના ઉપકલા કોષોના મોર્ફોજેનેસિસનું પ્રદર્શન કરી શકાય છે. સમગ્ર પ્રાયોગિક પ્રક્રિયા (આકૃતિ 1) માં પાંચ ભાગોનો સમાવેશ થાય છે: (i) ગટ ચિપ અથવા ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટેબલ હાઇબ્રિડ ચિપનું માઇક્રોફેબ્રિકેશન (પગલાં 1-5; બોક્સ 1), (ii) આંતરડાના ઉપકલા કોષો (Caco-2 કોષો) અથવા માનવ આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ્સની તૈયારી; બોક્સ 2-5), (iii) આંતરડાના ચિપ્સ અથવા હાઇબ્રિડ ચિપ્સ પર આંતરડાના ઉપકલા કોષોનું સંવર્ધન (પગલાં 6-9), (iv) 3D ઉપકલા માઇક્રોસ્ટ્રક્ચર (પગલાં 11-24) ને લાક્ષણિકતા આપવા માટે ઇન વિટ્રો મોર્ફોજેનેસિસ (પગલું 10) અને (v) નું ઇન્ડક્શન. અંતે, ઉપકલા મોર્ફોજેનેસિસની તુલના અવકાશી, ટેમ્પોરલ, શરતી અથવા પ્રક્રિયાગત નિયંત્રણો સાથે કરીને ઇન વિટ્રો મોર્ફોજેનેસિસની અસરકારકતાને માન્ય કરવા માટે એક યોગ્ય નિયંત્રણ જૂથ (નીચે વધુ ચર્ચા કરેલ) ડિઝાઇન કરવામાં આવ્યું હતું.
અમે બે અલગ અલગ કલ્ચર પ્લેટફોર્મનો ઉપયોગ કર્યો: ગટ-ઓન-એ-ચિપ જેમાં સીધી ચેનલો અથવા નોનલાઇનર કન્વોલ્યુટેડ ચેનલો હોય, અથવા માઇક્રોફ્લુઇડિક ડિવાઇસમાં ટ્રાન્સવેલ (TW) ઇન્સર્ટ્સ ધરાવતી હાઇબ્રિડ ચિપ્સ, જે બોક્સ 1 અને સ્ટેપ 1 -5 માં વર્ણવ્યા મુજબ બનાવવામાં આવી છે. "ડિવાઇસ ફેબ્રિકેશન" સિંગલ ચિપ અથવા હાઇબ્રિડ ચિપ બનાવવાના મુખ્ય પગલાં બતાવે છે. "કલ્ચર ઓફ હ્યુમન ઇન્ટેસ્ટાઇનલ એપિથેલિયલ સેલ" આ પ્રોટોકોલમાં ઉપયોગમાં લેવાતા કોષ સ્ત્રોત (કેકો-2 અથવા માનવ આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ્સ) અને કલ્ચર પ્રક્રિયા સમજાવે છે. "ઇન વિટ્રો મોર્ફોજેનેસિસ" એકંદર પગલાં બતાવે છે જેમાં કેકો-2 અથવા ઓર્ગેનોઇડ-ડેરિવ્ડ એપિથેલિયલ કોષોને આંતરડાની ચિપ પર અથવા હાઇબ્રિડ ચિપના ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સ પર કલ્ચર કરવામાં આવે છે, ત્યારબાદ 3D મોર્ફોજેનેસિસનો ઇન્ડક્શન અને લાક્ષણિક ઉપકલા માળખાની રચના થાય છે. પ્રોગ્રામ સ્ટેપ નંબર અથવા બોક્સ નંબર દરેક તીરની નીચે પ્રદર્શિત થાય છે. એપ્લિકેશન સ્થાપિત આંતરડાના ઉપકલા સ્તરોનો ઉપયોગ કેવી રીતે કરી શકાય તેના ઉદાહરણો પ્રદાન કરે છે, ઉદાહરણ તરીકે, કોષ ભિન્નતા લાક્ષણિકતા, ગટ ફિઝિયોલોજી અભ્યાસ, હોસ્ટ-માઇક્રોબાયોમ ઇકોસિસ્ટમ્સની સ્થાપના અને રોગ મોડેલિંગમાં. ઇમ્યુનોફ્લોરોસેન્સ છબીઓ "કોષ ભિન્નતા" માં ગટ ચિપ પર ઉત્પન્ન થતા 3D Caco-2 ઉપકલા સ્તરમાં વ્યક્ત કરાયેલ ન્યુક્લી, F-એક્ટિન અને MUC2 દર્શાવે છે. MUC2 સિગ્નલિંગ ગોબ્લેટ કોષો અને મ્યુકોસલ સપાટીઓમાંથી સ્ત્રાવ થતા લાળમાં હાજર છે. ગટ ફિઝિયોલોજીમાં ફ્લોરોસન્ટ છબીઓ ફ્લોરોસન્ટ ઘઉંના જંતુ એગ્લુટીનિનનો ઉપયોગ કરીને સિયાલિક એસિડ અને N-એસિટિલગ્લુકોસામાઇન અવશેષો માટે સ્ટેનિંગ દ્વારા ઉત્પાદિત લાળ દર્શાવે છે. "હોસ્ટ-માઇક્રોબ કો-કલ્ચર્સ" માં બે ઓવરલેપિંગ છબીઓ ચિપ પર આંતરડામાં પ્રતિનિધિ યજમાન-માઇક્રોબાયોમ સહ-સંસ્કૃતિઓ દર્શાવે છે. ડાબી પેનલ માઇક્રોએન્જિનિયર્ડ 3D Caco-2 ઉપકલા કોષો સાથે લીલા ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન (GFP) વ્યક્ત કરતી E. coli ની સહ-સંસ્કૃતિ દર્શાવે છે. જમણી પેનલ GFP E. coli નું સ્થાનિકીકરણ દર્શાવે છે જે 3D Caco-2 ઉપકલા કોષો સાથે સહ-સંસ્કૃતિકૃત છે, ત્યારબાદ F-એક્ટિન (લાલ) અને ન્યુક્લી (વાદળી) સાથે ઇમ્યુનોફ્લોરોસેન્સ સ્ટેનિંગ છે. રોગ મોડેલિંગ બેક્ટેરિયલ એન્ટિજેન્સ (દા.ત., લિપોપોલિસેકરાઇડ, LPS) અને રોગપ્રતિકારક શક્તિ સાથે શારીરિક પડકાર હેઠળ આંતરડાના બળતરા ચિપ્સમાં સ્વસ્થ વિરુદ્ધ લીકી આંતરડા દર્શાવે છે. કોષો (દા.ત., PBMC; લીલો). Caco-2 કોષોને 3D ઉપકલા સ્તર સ્થાપિત કરવા માટે સંવર્ધન કરવામાં આવ્યા હતા.સ્કેલ બાર, 50 µm.નીચલી હરોળમાં છબીઓ: "કોષોનો ભિન્નતા" સંદર્ભની પરવાનગીથી અનુકૂલિત.2. ઓક્સફોર્ડ યુનિવર્સિટી પ્રેસ; સંદર્ભ.5. NAS.ની પરવાનગીથી પુનઃઉત્પાદિત; "યજમાન-માઇક્રોબ કો-કલ્ચર" સંદર્ભ.3. NAS.ની પરવાનગીથી અનુકૂલિત; "રોગ મોડેલિંગ" સંદર્ભ.5. NAS.
ગટ-ઓન-ચિપ અને હાઇબ્રિડ ચિપ્સ બંને PDMS પ્રતિકૃતિઓનો ઉપયોગ કરીને બનાવવામાં આવ્યા હતા જે સોફ્ટ લિથોગ્રાફી1,44 દ્વારા સિલિકોન મોલ્ડમાંથી ડિમોલ્ડ કરવામાં આવ્યા હતા અને SU-8 સાથે પેટર્ન કરવામાં આવ્યા હતા. દરેક ચિપમાં માઇક્રોચેનલ્સની ડિઝાઇન શીયર સ્ટ્રેસ અને હાઇડ્રોડાયનેમિક પ્રેશર1,4,12 જેવા હાઇડ્રોડાયનેમિક્સને ધ્યાનમાં લઈને નક્કી કરવામાં આવે છે. મૂળ ગટ-ઓન-એ-ચિપ ડિઝાઇન (વિસ્તૃત ડેટા ફિગ. 1a), જેમાં બે સંયુક્ત સમાંતર સીધી માઇક્રોચેનલ્સનો સમાવેશ થતો હતો, તે એક જટિલ ગટ-ઓન-એ-ચિપ (વિસ્તૃત ડેટા ફિગ. 1b) માં વિકસિત થયો છે જેમાં વક્ર માઇક્રોચેનલ્સની જોડીનો સમાવેશ થાય છે જે વધેલા પ્રવાહી નિવાસ સમય, બિન-રેખીય પ્રવાહ પેટર્ન અને સંવર્ધિત કોષોના બહુઅક્ષીય વિકૃતિને પ્રેરિત કરે છે (આકૃતિ 2a–f) 12. જ્યારે વધુ જટિલ ગટ બાયોમિકેનિક્સને ફરીથી બનાવવાની જરૂર હોય, ત્યારે જટિલ ગટ-ઓન-એ-ચિપ્સ પસંદ કરી શકાય છે. અમે દર્શાવ્યું છે કે કન્વોલ્યુટેડ ગટ-ચિપ પણ સમાન ડિગ્રીના ઉપકલા વૃદ્ધિ સાથે સમાન સમયમર્યાદામાં 3D મોર્ફોજેનેસિસને મજબૂત રીતે પ્રેરિત કરે છે. મૂળ ગટ-ચિપની તુલનામાં, કલ્ચર્ડ સેલ પ્રકારને ધ્યાનમાં લીધા વિના. તેથી, 3D મોર્ફોજેનેસિસને પ્રેરિત કરવા માટે, રેખીય અને જટિલ ઓન-ચિપ ગટ ડિઝાઇન એકબીજાને બદલી શકાય છે. SU-8 પેટર્નવાળા સિલિકોન મોલ્ડ પર ક્યોર્ડ PDMS પ્રતિકૃતિઓ ડિમોલ્ડિંગ પછી નકારાત્મક સુવિધાઓ પૂરી પાડે છે (આકૃતિ 2a). ચિપ પર ગટ બનાવવા માટે, તૈયાર ઉપલા PDMS સ્તરને ક્રમિક રીતે છિદ્રાળુ PDMS ફિલ્મ સાથે જોડવામાં આવ્યું હતું અને પછી કોરોના ટ્રીટર (આકૃતિ 2b-f) નો ઉપયોગ કરીને અપરિવર્તનીય બંધન દ્વારા નીચલા PDMS સ્તર સાથે ગોઠવવામાં આવ્યું હતું. હાઇબ્રિડ ચિપ્સ બનાવવા માટે, ક્યોર્ડ PDMS પ્રતિકૃતિઓને કાચની સ્લાઇડ્સ સાથે જોડવામાં આવી હતી જેથી સિંગલ-ચેનલ માઇક્રોફ્લુઇડિક ઉપકરણો બનાવવામાં આવે જે ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સને સમાવી શકે (આકૃતિ 2h અને વિસ્તૃત ડેટા ફિગ. 2). બોન્ડિંગ પ્રક્રિયા PDMS પ્રતિકૃતિ અને કાચની સપાટીઓને ઓક્સિજન પ્લાઝ્મા અથવા કોરોના ટ્રીટમેન્ટથી સારવાર કરીને કરવામાં આવે છે. સિલિકોન ટ્યુબ સાથે જોડાયેલા માઇક્રોફેબ્રિકેટેડ ઉપકરણના વંધ્યીકરણ પછી, ઉપકરણ સેટઅપ આંતરડાના ઉપકલા (આકૃતિ 2g) ના 3D મોર્ફોજેનેસિસ કરવા માટે તૈયાર હતું.
a, SU-8 પેટર્નવાળા સિલિકોન મોલ્ડમાંથી PDMS ભાગોની તૈયારીનું યોજનાકીય ચિત્ર. અશુદ્ધ PDMS સોલ્યુશનને સિલિકોન મોલ્ડ (ડાબે) પર રેડવામાં આવ્યું હતું, 60 °C (મધ્યમ) પર ક્યુર કરવામાં આવ્યું હતું અને ડિમોલ્ડ કરવામાં આવ્યું હતું (જમણે). ડિમોલ્ડેડ PDMS ને ટુકડાઓમાં કાપીને વધુ ઉપયોગ માટે સાફ કરવામાં આવ્યું હતું.b, PDMS ઉપલા સ્તરને તૈયાર કરવા માટે ઉપયોગમાં લેવાતા સિલિકોન મોલ્ડનો ફોટોગ્રાફ.c, PDMS છિદ્રાળુ પટલ બનાવવા માટે ઉપયોગમાં લેવાતા સિલિકોન મોલ્ડનો ફોટોગ્રાફ.d, ઉપલા અને નીચલા PDMS ઘટકો અને એસેમ્બલ ઓન-ચિપ આંતરડાના ઉપકરણના ફોટોગ્રાફ્સની શ્રેણી.e, ઉપલા, પટલ અને નીચલા PDMS ઘટકોના સંરેખણનું યોજનાકીય.દરેક સ્તર પ્લાઝ્મા અથવા કોરોના ટ્રીટમેન્ટ દ્વારા ઉલટાવી શકાય તેવું બંધાયેલ છે.f, સુપરઇમ્પોઝ્ડ કન્વોલ્યુટેડ માઇક્રોચેનલ્સ અને વેક્યુમ ચેમ્બર સાથે ફેબ્રિકેટ ગટ-ઓન-એ-ચિપ ઉપકરણનું યોજનાકીય.g, માઇક્રોફ્લુઇડિક સેલ કલ્ચર માટે ગટ-ઓન-એ-ચિપનું સેટઅપ. સિલિકોન ટ્યુબ અને સિરીંજ સાથે એસેમ્બલ કરેલી ચિપ પર ફેબ્રિકેટ ગટ કવરસ્લિપ પર મૂકવામાં આવ્યું હતું. ચિપ ઉપકરણ પર મૂકવામાં આવ્યું હતું પ્રોસેસિંગ માટે 150 મીમી પેટ્રી ડીશનું ઢાંકણ. સિલિકોન ટ્યુબ બંધ કરવા માટે બાઈન્ડરનો ઉપયોગ થાય છે. h, હાઇબ્રિડ ચિપ ફેબ્રિકેશન અને હાઇબ્રિડ ચિપ્સનો ઉપયોગ કરીને 3D મોર્ફોજેનેસિસના વિઝ્યુઅલ સ્નેપશોટ. આંતરડાના ઉપકલા કોષોના 2D મોનોલેયર્સને કલ્ચર કરવા માટે સ્વતંત્ર રીતે તૈયાર કરાયેલ ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સને આંતરડાના 3D મોર્ફોજેનેસિસને પ્રેરિત કરવા માટે હાઇબ્રિડ ચિપમાં દાખલ કરવામાં આવ્યા હતા. ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સ પર સ્થાપિત કોષ સ્તરની નીચે માઇક્રોચેનલ્સ દ્વારા માધ્યમ પરફ્યુઝ કરવામાં આવે છે.સ્કેલ બાર, 1 સે.મી.h સંદર્ભની પરવાનગી સાથે ફરીથી છાપેલ.4. એલ્સેવિયર.
આ પ્રોટોકોલમાં, Caco-2 કોષ રેખા અને આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ્સનો ઉપકલા સ્ત્રોત તરીકે ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો (આકૃતિ 3a). બંને પ્રકારના કોષો સ્વતંત્ર રીતે સંવર્ધન કરવામાં આવ્યા હતા (બોક્સ 2 અને બોક્સ 5) અને ઓન-ચિપ ગટ અથવા ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સના ECM-કોટેડ માઇક્રોચેનલ્સને બીજ આપવા માટે ઉપયોગમાં લેવાય છે. જ્યારે કોષો સંગમિત હોય છે (> ફ્લાસ્કમાં 95% કવરેજ), ત્યારે T-ફ્લાસ્કમાં નિયમિતપણે સંવર્ધિત Caco-2 કોષો (પેસેજ 10 અને 50 વચ્ચે) ટ્રાયપ્સિનાઇઝેશન પ્રવાહી (બોક્સ 2) દ્વારા વિચ્છેદિત સેલ સસ્પેન્શન તૈયાર કરવા માટે કાપવામાં આવે છે. આંતરડાના બાયોપ્સી અથવા સર્જિકલ રિસેક્શનમાંથી માનવ આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ્સને માળખાકીય સૂક્ષ્મ પર્યાવરણને ટેકો આપવા માટે 24-કુવા પ્લેટોમાં મેટ્રિજેલ સ્કેફોલ્ડ ડોમમાં સંવર્ધન કરવામાં આવ્યા હતા. આવશ્યક મોર્ફોજેન્સ (જેમ કે Wnt, R-સ્પોન્ડિન અને નોગિન) ધરાવતા માધ્યમ અને બોક્સ 3 માં વર્ણવ્યા મુજબ તૈયાર કરાયેલ વૃદ્ધિ પરિબળો દર બીજા દિવસે પૂરક બનાવવામાં આવ્યા હતા જ્યાં સુધી ઓર્ગેનોઇડ્સ ~500 µm વ્યાસ સુધી ન વધે. સંપૂર્ણ રીતે ઉગાડવામાં આવેલા ઓર્ગેનોઇડ્સ કાપવામાં આવે છે અને ચિપ પર આંતરડા અથવા ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સ પર બીજ માટે એક કોષોમાં વિભાજીત. જેમ આપણે અગાઉ જાણ કરી છે, તે રોગના પ્રકાર 12,13 (દા.ત. અલ્સેરેટિવ કોલાઇટિસ, ક્રોહન રોગ, કોલોરેક્ટલ કેન્સર, અથવા સામાન્ય દાતા), જખમ સ્થળ (દા.ત., જખમ વિરુદ્ધ બિન-જખમ વિસ્તાર) અને માર્ગમાં જઠરાંત્રિય સ્થાન (દા.ત., ડ્યુઓડેનમ, જેજુનમ, ઇલિયમ, સેકમ, કોલોન અથવા ગુદામાર્ગ) અનુસાર અલગ કરી શકાય છે. અમે કોલોનિક ઓર્ગેનોઇડ્સ (કોલોઇડ્સ) ને સંવર્ધન માટે બોક્સ 5 માં એક ઑપ્ટિમાઇઝ્ડ પ્રોટોકોલ પ્રદાન કરીએ છીએ જેને સામાન્ય રીતે નાના આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ્સ કરતાં મોર્ફોજેન્સની વધુ સાંદ્રતાની જરૂર હોય છે.
a, ગટ ચિપમાં ગટ મોર્ફોજેનેસિસના ઇન્ડક્શન માટે વર્કફ્લો. આ પ્રોટોકોલમાં Caco-2 માનવ આંતરડાના ઉપકલા અને આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ્સનો ઉપયોગ 3D મોર્ફોજેનેસિસ દર્શાવવા માટે થાય છે. અલગ ઉપકલા કોષો તૈયાર ગટ-ઓન-એ-ચિપ ઉપકરણ (ચિપ તૈયારી) માં સીડ કરવામાં આવ્યા હતા. એકવાર કોષોને બીજ (બીજ) અને PDMS છિદ્રાળુ પટલ સાથે જોડવામાં આવે (જોડાયેલ) દિવસ 0 (D0), ટોચ (AP) પ્રવાહ શરૂ કરવામાં આવે છે અને પ્રથમ 2 દિવસ (પ્રવાહ, AP, D0-D2) માટે જાળવવામાં આવે છે. જ્યારે સંપૂર્ણ 2D મોનોલેયર રચાય છે ત્યારે બેસોલેટરલ (BL) પ્રવાહ પણ ચક્રીય ખેંચાણ ગતિ (સ્ટ્રેચ, ફ્લો, AP અને BL) સાથે શરૂ કરવામાં આવે છે. આંતરડાની 3D મોર્ફોજેનેસિસ 5 દિવસના માઇક્રોફ્લુઇડિક કલ્ચર (મોર્ફોજેનેસિસ, D5) પછી સ્વયંભૂ થઈ. તબક્કા વિપરીત છબીઓ દરેક પ્રાયોગિક પગલા અથવા સમય બિંદુ (બાર ગ્રાફ, 100 µm) પર Caco-2 કોષોના પ્રતિનિધિ મોર્ફોલોજી દર્શાવે છે. ગટ મોર્ફોજેનેસિસના અનુરૂપ કાસ્કેડ્સ દર્શાવતા ચાર યોજનાકીય આકૃતિઓ (ટોચ જમણે). યોજનામાં ડેશવાળા તીરો પ્રવાહી પ્રવાહની દિશા દર્શાવે છે. b, સ્થાપિત 3D Caco-2 ઉપકલા (ડાબે) ની સપાટી ટોપોલોજી દર્શાવતી SEM છબી. વિસ્તૃત વિસ્તાર (સફેદ ડેશવાળા બોક્સ) ને હાઇલાઇટ કરતી ઇનસેટ 3D Caco-2 સ્તર (જમણે) પર પુનર્જીવિત માઇક્રોવિલી દર્શાવે છે. c, સ્થાપિત Caco-2 3D, ક્લાઉડિન (ZO-1, લાલ) અને સતત બ્રશ બોર્ડર મેમ્બ્રેનનું આડું આગળનું દૃશ્ય, જે આંતરડાના ચિપ્સ પર ઉપકલા કોષોનું F-એક્ટિન (લીલો) અને ન્યુક્લી (વાદળી) ઇમ્યુનોફ્લોરોસેન્સ કોન્ફોકલ વિઝ્યુલાઇઝેશન લેબલ કરે છે. મધ્યમ યોજના તરફ નિર્દેશ કરતા તીર દરેક કોન્ફોકલ વ્યૂ માટે ફોકલ પ્લેનનું સ્થાન સૂચવે છે. d, 3, 7, 9, 11 અને 13 ના દિવસે ફેઝ કોન્ટ્રાસ્ટ માઇક્રોસ્કોપી દ્વારા મેળવેલ ચિપ પર કલ્ચર કરાયેલ ઓર્ગેનોઇડ્સમાં મોર્ફોલોજિકલ ફેરફારોનો સમય કોર્સ. ઇનસેટ (ઉપર જમણે) આપેલ છબીનું ઉચ્ચ વિસ્તરણ દર્શાવે છે. e, 7 ના દિવસે લેવામાં આવેલા સ્લાઇસ પર આંતરડામાં સ્થાપિત ઓર્ગેનોઇડ 3D ઉપકલાનો DIC ફોટોમાઇક્રોગ્રાફ, ઉપકલા સ્તર પર અનુક્રમે 3 દિવસ માટે ગટ ચિપ્સ પર ઉગાડવામાં આવેલા સ્ટેમ સેલ (LGR5; મેજેન્ટા), ગોબ્લેટ સેલ (MUC2; લીલો), F-એક્ટિન (ગ્રે) અને ન્યુક્લી (સ્યાન) માટે માર્કર્સ દર્શાવતી ઓવરલેડ ઇમ્યુનોફ્લોરેસેન્સ છબીઓ (ડાબે) અને 13-દિવસ (મધ્યમ) ઓર્ગેનોઇડ્સ. વિસ્તૃત ડેટા આકૃતિ 3 પણ જુઓ, જે MUC2 સિગ્નલિંગ વિના LGR5 સિગ્નલિંગને હાઇલાઇટ કરે છે. સંસ્કૃતિના 13મા દિવસે સેલમાસ્ક ડાઇ (જમણે) સાથે પ્લાઝ્મા મેમ્બ્રેનને સ્ટેન કરીને ચિપ પર ગટમાં સ્થાપિત 3D ઓર્ગેનોઇડ એપિથેલિયમનું ઉપકલા માઇક્રોસ્ટ્રક્ચર (જમણે) દર્શાવતી ફ્લોરોસેન્સ છબીઓ. સ્કેલ બાર 50 μm છે સિવાય કે અન્યથા જણાવવામાં આવે.b સંદર્ભમાંથી પરવાનગી સાથે ફરીથી છાપેલ.2. ઓક્સફોર્ડ યુનિવર્સિટી પ્રેસ; c સંદર્ભમાંથી પરવાનગી સાથે અનુકૂલિત.2. ઓક્સફોર્ડ યુનિવર્સિટી પ્રેસ; e અને f સંદર્ભમાંથી પરવાનગી સાથે અનુકૂલિત.12 ક્રિએટિવ કોમન્સ લાઇસન્સ CC BY 4.0 હેઠળ.
ચિપ પરના આંતરડામાં, સફળ ECM કોટિંગ માટે PDMS છિદ્રાળુ પટલની હાઇડ્રોફોબિક સપાટીને સંશોધિત કરવી જરૂરી છે. આ પ્રોટોકોલમાં, અમે PDMS પટલની હાઇડ્રોફોબિસિટીને સંશોધિત કરવા માટે બે અલગ અલગ પદ્ધતિઓ લાગુ કરીએ છીએ. Caco-2 કોષોનું સંવર્ધન કરવા માટે, UV/ઓઝોન સારવાર દ્વારા સપાટી સક્રિયકરણ PDMS સપાટીની હાઇડ્રોફોબિસિટી ઘટાડવા, ECM ને કોટ કરવા અને Caco-2 કોષોને PDMS પટલ સાથે જોડવા માટે પૂરતું હતું. જો કે, ઓર્ગેનોઇડ એપિથેલિયમના માઇક્રોફ્લુઇડિક કલ્ચર માટે રાસાયણિક-આધારિત સપાટી કાર્યાત્મકકરણની જરૂર પડે છે જેથી PDMS માઇક્રોચેનલમાં પોલિઇથિલિનાઇમાઇન (PEI) અને ગ્લુટારાલ્ડીહાઇડનો ક્રમિક ઉપયોગ કરીને ECM પ્રોટીનનું કાર્યક્ષમ નિક્ષેપણ પ્રાપ્ત થાય. સપાટીમાં ફેરફાર કર્યા પછી, ECM પ્રોટીન કાર્યાત્મક PDMS સપાટીને આવરી લેવા માટે જમા કરવામાં આવ્યા હતા અને પછી અલગ ઓર્ગેનોઇડ એપિથેલિયમમાં દાખલ કરવામાં આવ્યા હતા. કોષો જોડાયેલા થયા પછી, માઇક્રોફ્લુઇડિક સેલ કલ્ચર ફક્ત માધ્યમને ઉપલા માઇક્રોચેનલમાં પરફ્યુઝ કરીને શરૂ થાય છે જ્યાં સુધી કોષો સંપૂર્ણ મોનોલેયર ન બનાવે, જ્યારે નીચલું માઇક્રોચેનલ સ્થિર સ્થિતિ જાળવી રાખે છે. સપાટી સક્રિયકરણ અને ECM કોટિંગ માટે આ ઑપ્ટિમાઇઝ પદ્ધતિ ઓર્ગેનોઇડ એપિથેલિયમના જોડાણને પ્રેરિત કરવા સક્ષમ બનાવે છે. PDMS સપાટી પર 3D મોર્ફોજેનેસિસ.
ટ્રાન્સવેલ કલ્ચર્સને સેલ સીડીંગ પહેલાં ECM કોટિંગની પણ જરૂર પડે છે; જોકે, ટ્રાન્સવેલ કલ્ચર્સને છિદ્રાળુ ઇન્સર્ટ્સની સપાટીને સક્રિય કરવા માટે જટિલ પ્રીટ્રીટમેન્ટ પગલાંની જરૂર હોતી નથી. ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સ પર Caco-2 કોષો ઉગાડવા માટે, છિદ્રાળુ ઇન્સર્ટ્સ પર ECM કોટિંગ વિખરાયેલા Caco-2 કોષો (<1 કલાક) અને ચુસ્ત જંકશન અવરોધ રચના (<1-2 દિવસ) ના જોડાણને વેગ આપે છે. ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સ પર કલ્ચર ઓર્ગેનોઇડ્સ માટે, આઇસોલેટેડ ઓર્ગેનોઇડ્સ ECM-કોટેડ ઇન્સર્ટ્સ પર સીડ કરવામાં આવે છે, પટલ સપાટી સાથે જોડાયેલ હોય છે (<3 કલાક) અને જ્યાં સુધી ઓર્ગેનોઇડ્સ અવરોધ અખંડિતતા સાથે સંપૂર્ણ મોનોલેયર ન બનાવે ત્યાં સુધી જાળવવામાં આવે છે. હાઇબ્રિડ ચિપ્સના ઉપયોગ વિના ટ્રાન્સવેલ કલ્ચર 24-વેલ પ્લેટોમાં કરવામાં આવે છે.
સ્થાપિત ઉપકલા સ્તરના બેસોલેટરલ પાસામાં પ્રવાહી પ્રવાહ લાગુ કરીને ઇન વિટ્રો 3D મોર્ફોજેનેસિસ શરૂ કરી શકાય છે. ચિપ પરના આંતરડામાં, ઉપકલા મોર્ફોજેનેસિસ ત્યારે શરૂ થયું જ્યારે માધ્યમ ઉપલા અને નીચલા માઇક્રોચેનલમાં પરફ્યુઝ કરવામાં આવ્યું (આકૃતિ 3a). અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ, દિશાત્મક સ્ત્રાવિત મોર્ફોજેન અવરોધકોને સતત દૂર કરવા માટે નીચલા (બેસોલેટરલ) કમ્પાર્ટમેન્ટમાં પ્રવાહી પ્રવાહ રજૂ કરવો મહત્વપૂર્ણ છે. છિદ્રાળુ પટલ પર બંધાયેલા કોષોને પૂરતા પોષક તત્વો અને સીરમ પ્રદાન કરવા અને લ્યુમિનલ શીયર સ્ટ્રેસ ઉત્પન્ન કરવા માટે, અમે સામાન્ય રીતે ચિપ પર આંતરડામાં ડ્યુઅલ ફ્લો લાગુ કરીએ છીએ. હાઇબ્રિડ ચિપ્સમાં, ઉપકલા મોનોલેયર્સ ધરાવતા ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સ હાઇબ્રિડ ચિપ્સમાં દાખલ કરવામાં આવ્યા હતા. પછી, માઇક્રોચેનલ દ્વારા છિદ્રાળુ ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સની બેસોલેટરલ બાજુ હેઠળ માધ્યમ લાગુ કરવામાં આવ્યું હતું. બંને કલ્ચર પ્લેટફોર્મમાં બેસોલેટરલ પ્રવાહ શરૂ થયાના 3-5 દિવસ પછી આંતરડાનું મોર્ફોજેનેસિસ થયું.
માઇક્રોએન્જિનિયર્ડ 3D એપિથેલિયલ લેયર્સની મોર્ફોલોજિકલ લાક્ષણિકતાઓનું વિશ્લેષણ ફેઝ કોન્ટ્રાસ્ટ માઇક્રોસ્કોપી, ડિફરન્શિયલ ઇન્ટરફરેન્સ કોન્ટ્રાસ્ટ (DIC) માઇક્રોસ્કોપી, SEM, અથવા ઇમ્યુનોફ્લોરોસેન્સ કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપી (આકૃતિઓ 3 અને 4) સહિત વિવિધ ઇમેજિંગ મોડલિટીઝ લાગુ કરીને કરી શકાય છે. 3D એપિથેલિયલ લેયર્સના આકાર અને પ્રોટ્રુઝનનું નિરીક્ષણ કરવા માટે કલ્ચર દરમિયાન કોઈપણ સમયે ફેઝ કોન્ટ્રાસ્ટ અથવા DIC ઇમેજિંગ સરળતાથી કરી શકાય છે. PDMS અને પોલિએસ્ટર ફિલ્મોની ઓપ્ટિકલ પારદર્શિતાને કારણે, ગટ-ઓન-એ-ચિપ અને હાઇબ્રિડ ચિપ પ્લેટફોર્મ બંને ઉપકરણના સેક્શનિંગ અથવા ડિસએસેમ્બલીની જરૂર વગર રીઅલ-ટાઇમ ઇન સિટુ ઇમેજિંગ પ્રદાન કરી શકે છે. ઇમ્યુનોફ્લોરોસેન્સ ઇમેજિંગ કરતી વખતે (આકૃતિઓ 1, 3c, f અને 4b, c), કોષોને સામાન્ય રીતે 4% (wt/vol) પેરાફોર્માલ્ડિહાઇડ (PFA) સાથે ફિક્સ કરવામાં આવે છે, ત્યારબાદ ટ્રાઇટોન X-100 અને 2% (wt/vol) ) બોવાઇન સીરમ આલ્બ્યુમિન (BSA) ક્રમમાં આવે છે. કોષના પ્રકાર પર આધાર રાખીને, વિવિધ ફિક્સેટિવ્સ, પરમીબિલાઇઝર્સ અને બ્લોકિંગ એજન્ટો હોઈ શકે છે. વપરાય છે. વંશ-આધારિત કોષ અથવા પ્રદેશ માર્કર્સને લક્ષ્ય બનાવતા પ્રાથમિક એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ ચિપ પર સ્થિર કોષોને પ્રકાશિત કરવા માટે થાય છે, ત્યારબાદ ગૌણ એન્ટિબોડીઝ સાથે કાઉન્ટરસ્ટેઇન ડાઇ ન્યુક્લિયસ (દા.ત., 4′,6-ડાયમિડિનો-2-ફેનાઇલીન) ઇન્ડોલ, DAPI) અથવા F-એક્ટિન (દા.ત., ફ્લોરોસન્ટલી લેબલ થયેલ ફેલોઇડિન) ને લક્ષ્ય બનાવે છે. ફ્લોરોસેન્સ-આધારિત લાઇવ ઇમેજિંગ પણ લાળ ઉત્પાદન (આકૃતિ 1, "કોષ ભિન્નતા" અને "આંતરડાનું શરીરવિજ્ઞાન"), માઇક્રોબાયલ કોષોનું રેન્ડમ વસાહતીકરણ (આકૃતિ 1, "યજમાન-માઇક્રોબ કો-કલ્ચર"), રોગપ્રતિકારક કોષોની ભરતી (આકૃતિ 1, 'રોગ મોડેલિંગ') અથવા 3D ઉપકલા મોર્ફોલોજી (આકૃતિ 3c,f અને 4b,c) ના રૂપરેખા શોધવા માટે સિટુમાં કરી શકાય છે. સંદર્ભમાં વર્ણવ્યા મુજબ, નીચલા માઇક્રોચેનલ સ્તરથી ઉપલા સ્તરને અલગ કરવા માટે ચિપ પર આંતરડામાં ફેરફાર કરતી વખતે. આકૃતિ 2 માં બતાવ્યા પ્રમાણે, 3D ઉપકલા મોર્ફોલોજી તેમજ ટોચના બ્રશ બોર્ડર પર માઇક્રોવિલી SEM (આકૃતિ 3b) દ્વારા વિઝ્યુઅલાઈઝ કરી શકાય છે. ડિફરન્સિયેશન માર્કર્સની અભિવ્યક્તિનું મૂલ્યાંકન માત્રાત્મક PCR5 અથવા સિંગલ-સેલ RNA સિક્વન્સિંગ દ્વારા કરી શકાય છે. આ કિસ્સામાં, ગટ ચિપ્સ અથવા હાઇબ્રિડ ચિપ્સમાં ઉગાડવામાં આવતા ઉપકલા કોષોના 3D સ્તરો ટ્રિપ્સિનાઇઝેશન દ્વારા એકત્રિત કરવામાં આવે છે અને પછી તેનો ઉપયોગ મોલેક્યુલર અથવા આનુવંશિક વિશ્લેષણ માટે થાય છે.
a, હાઇબ્રિડ ચિપમાં આંતરડાના મોર્ફોજેનેસિસના ઇન્ડક્શન માટે વર્કફ્લો. હાઇબ્રિડ ચિપ પ્લેટફોર્મમાં 3D મોર્ફોજેનેસિસ દર્શાવવા માટે આ પ્રોટોકોલમાં Caco-2 અને આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ્સનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે. ડિસોસિએટેડ એપિથેલિયલ કોષો તૈયાર ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સમાં સીડ કરવામાં આવ્યા હતા (TW પ્રેપ; નીચે આકૃતિ જુઓ). એકવાર કોષોને સીડ કરવામાં આવ્યા હતા (બીજ) અને ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સમાં પોલિએસ્ટર મેમ્બ્રેન સાથે જોડવામાં આવ્યા હતા, પછી બધા કોષોને સ્થિર પરિસ્થિતિઓ (TW કલ્ચર) હેઠળ કલ્ચર કરવામાં આવ્યા હતા. 7 દિવસ પછી, બેસોલેટરલ ફ્લો (ફ્લો, BL) રજૂ કરવા માટે ઉપકલા કોષોના 2D મોનોલેયર ધરાવતું એક ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સ હાઇબ્રિડ ચિપમાં એકીકૃત કરવામાં આવ્યું હતું, જે આખરે 3D ઉપકલા સ્તર (મોર્ફોજેનેસિસ) નું નિર્માણ તરફ દોરી ગયું. દરેક પ્રાયોગિક પગલા અથવા સમય બિંદુ પર સામાન્ય દાતા (C103 લાઇન) ચડતા કોલોનમાંથી મેળવેલા માનવ અંગ ઉપકલા કોષોના મોર્ફોલોજિકલ લક્ષણો દર્શાવતા ફેઝ કોન્ટ્રાસ્ટ માઇક્રોગ્રાફ્સ. ઉપલા સ્તરોમાં સ્કીમેટિક્સ દરેક પગલા માટે પ્રાયોગિક રૂપરેખાંકન દર્શાવે છે.b, હાઇબ્રિડ ચિપ્સ (ડાબી યોજના) ટોપ-ડાઉન કોન્ફોકલ સાથે ઓર્ગેનોઇડ ઉપકલા કોષોના 3D મોર્ફોજેનેસિસ તરફ દોરી શકે છે. વિવિધ Z સ્થાનો (ઉપલા, મધ્યમ અને નીચલા; જમણી યોજનાકીય અને અનુરૂપ ડોટેડ રેખાઓ જુઓ) પર લેવામાં આવેલા માઇક્રોસ્કોપી દૃશ્યો. સ્પષ્ટ મોર્ફોલોજિકલ લાક્ષણિકતાઓ દર્શાવે છે. F-એક્ટિન (સ્યાન), ન્યુક્લિયસ (ગ્રે).c, સ્થિર ટ્રાન્સવેલ (TW; સફેદ ડેશેડ બોક્સમાં ઇનસેટ) વિરુદ્ધ હાઇબ્રિડ ચિપ (સૌથી મોટો પૂર્ણ શોટ) માં સંવર્ધિત ઓર્ગેનોઇડ-ડેરિવ્ડ એપિથેલિયલ કોષોના ફ્લોરોસેન્સ કોન્ફોકલ માઇક્રોગ્રાફ્સ (3D કોણીય દૃશ્ય) અનુક્રમે 2D વિરુદ્ધ 3D મોર્ફોલોજીની તુલના કરે છે. 2D વર્ટિકલ ક્રોસ-કટ દૃશ્યોની જોડી (ઉપલા જમણા ખૂણામાં ઇનસેટ; "XZ") પણ 2D અને 3D સુવિધાઓ દર્શાવે છે.સ્કેલ બાર, 100 µm.c સંદર્ભની પરવાનગી સાથે ફરીથી છાપેલ.4. એલ્સેવિયર.
પરંપરાગત સ્ટેટિક કલ્ચર પરિસ્થિતિઓ હેઠળ સમાન કોષો (કેકો-2 અથવા આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ ઉપકલા કોષો) ને દ્વિ-પરિમાણીય મોનોલેયર્સમાં સંવર્ધન કરીને નિયંત્રણો તૈયાર કરી શકાય છે. નોંધપાત્ર રીતે, માઇક્રોચેનલ્સની મર્યાદિત વોલ્યુમ ક્ષમતા (એટલે ​​કે મૂળ ગટ-ચિપ ડિઝાઇન પર ટોચની ચેનલમાં ~4 µL) ને કારણે પોષક તત્વોનો ઘટાડો થઈ શકે છે. તેથી, બેસોલેટરલ પ્રવાહના ઉપયોગ પહેલાં અને પછી ઉપકલા મોર્ફોલોજીની પણ તુલના કરી શકાય છે.
સોફ્ટ લિથોગ્રાફી પ્રક્રિયા સ્વચ્છ રૂમમાં થવી જોઈએ. ચિપ પરના દરેક સ્તર (ઉપલા અને નીચલા સ્તરો અને પટલ) અને હાઇબ્રિડ ચિપ્સ માટે, અલગ અલગ ફોટોમાસ્કનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો અને અલગ સિલિકોન વેફર્સ પર બનાવવામાં આવ્યા હતા કારણ કે માઇક્રોચેનલ્સની ઊંચાઈ અલગ હતી. ચિપ પરના આંતરડાના ઉપલા અને નીચલા માઇક્રોચેનલ્સની લક્ષ્ય ઊંચાઈ અનુક્રમે 500 µm અને 200 µm છે. હાઇબ્રિડ ચિપની ચેનલ લક્ષ્ય ઊંચાઈ 200 µm છે.
એસીટોન વાળી ડીશમાં ૩ ઇંચનું સિલિકોન વેફર મૂકો. પ્લેટને ૩૦ સેકન્ડ માટે હળવેથી ફેરવો, પછી વેફરને હવામાં સૂકવો. વેફરને IPA વાળી પ્લેટમાં ટ્રાન્સફર કરો, પછી પ્લેટને સાફ કરવા માટે ૩૦ સેકન્ડ માટે ફેરવો.
સિલિકોન વેફર સપાટી પરથી કાર્બનિક અવશેષોને મહત્તમ રીતે દૂર કરવા માટે પિરાન્હા દ્રાવણ (હાઇડ્રોજન પેરોક્સાઇડ અને કેન્દ્રિત સલ્ફ્યુરિક એસિડનું મિશ્રણ, 1:3 (વોલ્યુમ/વોલ્યુમ)) નો વૈકલ્પિક રીતે ઉપયોગ કરી શકાય છે.
પિરાન્હા દ્રાવણ અત્યંત કાટ લાગતું હોય છે અને ગરમી ઉત્પન્ન કરે છે. વધારાની સલામતી સાવચેતીઓ જરૂરી છે. કચરાના નિકાલ માટે, દ્રાવણને ઠંડુ થવા દો અને સ્વચ્છ, સૂકા કચરાના કન્ટેનરમાં સ્થાનાંતરિત કરો. ગૌણ કન્ટેનરનો ઉપયોગ કરો અને કચરાના કન્ટેનરને યોગ્ય રીતે લેબલ કરો. વધુ વિગતવાર પ્રક્રિયાઓ માટે કૃપા કરીને સુવિધાના સલામતી માર્ગદર્શિકાનું પાલન કરો.
વેફર્સને ૨૦૦ °C ગરમ પ્લેટ પર ૧૦ મિનિટ માટે મૂકીને ડીહાઇડ્રેટ કરો. ડીહાઇડ્રેશન પછી, વેફરને ઠંડુ કરવા માટે હવામાં પાંચ વખત હલાવવામાં આવ્યું.
સાફ કરેલા સિલિકોન વેફરના મધ્યમાં ~10 ગ્રામ ફોટોરેઝિસ્ટ SU-8 2100 રેડો. વેફર પર ફોટોરેઝિસ્ટને સમાનરૂપે ફેલાવવા માટે ટ્વીઝરનો ઉપયોગ કરો. ફોટોરેઝિસ્ટ ઓછું ચીકણું અને ફેલાવવામાં સરળ બનાવવા માટે ક્યારેક વેફરને 65°C હોટ પ્લેટ પર મૂકો. વેફરને સીધા હોટ પ્લેટ પર ન મૂકો.
સ્પિન કોટિંગ ચલાવીને SU-8 ને વેફર પર સમાનરૂપે વિતરિત કરવામાં આવ્યું હતું. SU-8 ના ઇનકમિંગ રોટેશનને 5-10 સેકન્ડ માટે પ્રોગ્રામ કરો જેથી તે 500 rpm પર 100 rpm/s ના પ્રવેગ પર પ્રચારિત થાય. 1,500 rpm પર 200 µm જાડાઈ પેટર્નિંગ માટે મુખ્ય સ્પિન સેટ કરો, અથવા 250 µm જાડાઈ પ્રાપ્ત કરો (ચિપ પર ગટના ઉપલા સ્તર માટે 500 µm ઊંચાઈ બનાવવી; નીચે "ક્રિટિકલ સ્ટેપ્સ" જુઓ) 1,200 rpm પર 30 સેકન્ડમાં 300 rpm/s ના પ્રવેગ પર સેટ કરો.
સિલિકોન વેફર પર SU-8 પેટર્નની લક્ષ્ય જાડાઈ અનુસાર મુખ્ય સ્પિન ગતિ ગોઠવી શકાય છે.
ચિપ પર ગટના ઉપરના સ્તર માટે 500 µm ઊંચાઈના SU-8 પેટર્ન બનાવવા માટે, આ બોક્સના સ્પિન કોટિંગ અને સોફ્ટ બેક સ્ટેપ્સ (પગલા 7 અને 8) ને ક્રમિક રીતે પુનરાવર્તિત કરવામાં આવ્યા હતા (પગલું 9 જુઓ) જેથી 250 µm ના બે સ્તરો ઉત્પન્ન થાય. SU-8 નું એક જાડું સ્તર, જેને સ્તરમાં મૂકી શકાય છે અને આ બોક્સના પગલા 12 માં યુવી એક્સપોઝર દ્વારા જોડાઈ શકે છે, જેનાથી 500 µm ઊંચો સ્તર બને છે.
SU-8 કોટેડ વેફર્સને ગરમ પ્લેટ પર 65 °C પર 5 મિનિટ માટે કાળજીપૂર્વક મૂકીને સોફ્ટ બેક કરો, પછી સેટિંગને 95 °C પર સ્વિચ કરો અને વધારાના 40 મિનિટ માટે ઇન્ક્યુબેટ કરો.
ઉપલા માઇક્રોચેનલમાં SU-8 પેટર્નની 500 μm ઊંચાઈ પ્રાપ્ત કરવા માટે, બે 250 μm જાડા SU-8 સ્તરો બનાવવા માટે પગલાં 7 અને 8 ને પુનરાવર્તિત કરો.
યુવી માસ્ક એલાઈનરનો ઉપયોગ કરીને, વેફરના એક્સપોઝર સમયની ગણતરી કરવા માટે ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર લેમ્પ ટેસ્ટ કરો. (એક્સપોઝર સમય, ms) = (એક્સપોઝર ડોઝ, mJ/cm2)/(લેમ્પ પાવર, mW/cm2).
એક્સપોઝર સમય નક્કી કર્યા પછી, ફોટોમાસ્કને UV માસ્ક એલાઈનરના માસ્ક હોલ્ડર પર મૂકો અને ફોટોમાસ્કને SU-8 કોટેડ વેફર પર મૂકો.
યુવી વિક્ષેપ ઘટાડવા માટે ફોટોમાસ્કની પ્રિન્ટેડ સપાટીને સિલિકોન વેફરની SU-8 કોટેડ બાજુ પર સીધી મૂકો.
પૂર્વનિર્ધારિત એક્સપોઝર સમય માટે SU-8 કોટેડ વેફર અને ફોટોમાસ્કને 260 mJ/cm2 UV પ્રકાશ સુધી ઊભી રીતે ખુલ્લા કરો (આ બોક્સનું પગલું 10 જુઓ).
યુવી એક્સપોઝર પછી, SU-8-કોટેડ સિલિકોન વેફર્સને 200 μm ની ઊંચાઈ સાથે પેટર્ન બનાવવા માટે દરેક હોટ પ્લેટ પર 65°C પર 5 મિનિટ અને 95°C પર 15 મિનિટ માટે બેક કરવામાં આવ્યા હતા. 500 μm ની ઊંચાઈ સાથે પેટર્ન બનાવવા માટે 95°C પર પોસ્ટ-બેક સમય 30 મિનિટ સુધી લંબાવો.
ડેવલપરને કાચની વાનગીમાં રેડવામાં આવે છે, અને બેક કરેલ વેફર ડીશમાં મૂકવામાં આવે છે. કાચની પ્લેટના કદના આધારે SU-8 ડેવલપરનું પ્રમાણ બદલાઈ શકે છે. ખુલ્લા ન હોય તેવા SU-8 ને સંપૂર્ણપણે દૂર કરવા માટે પૂરતા SU-8 ડેવલપરનો ઉપયોગ કરવાની ખાતરી કરો. ઉદાહરણ તરીકે, 1 લિટર ક્ષમતાવાળી 150 મીમી વ્યાસની કાચની વાનગીનો ઉપયોગ કરતી વખતે, ~300 mL SU-8 ડેવલપરનો ઉપયોગ કરો. ક્યારેક ક્યારેક હળવા પરિભ્રમણ સાથે 25 મિનિટ માટે મોલ્ડ વિકસાવો.
વિકસિત મોલ્ડને ~10 મિલી તાજા ડેવલપરથી ધોઈ લો અને ત્યારબાદ પીપેટનો ઉપયોગ કરીને દ્રાવણનો છંટકાવ કરીને IPA કરો.
વેફરને પ્લાઝ્મા ક્લીનરમાં મૂકો અને 1.5 મિનિટ માટે ઓક્સિજન પ્લાઝ્મા (વાતાવરણીય ગેસ, લક્ષ્ય દબાણ 1 × 10−5 ટોર, પાવર 125 W) ના સંપર્કમાં રાખો.
વેફરને વેક્યુમ ડેસીકેટરમાં મૂકો જેમાં કાચની સ્લાઇડ હોય. વેફર્સ અને સ્લાઇડ્સ બાજુ-બાજુ મૂકી શકાય છે. જો વેક્યુમ ડેસીકેટરને પ્લેટ દ્વારા અનેક સ્તરોમાં વિભાજિત કરવામાં આવે છે, તો સ્લાઇડ્સને નીચલા ચેમ્બરમાં અને વેફર્સ ઉપલા ચેમ્બરમાં મૂકો. કાચની સ્લાઇડ પર 100 μL ટ્રાઇક્લોરો(1H, 1H, 2H, 2H-પરફ્લુરોઓક્ટાઇલ) સિલેન દ્રાવણ નાખો અને સિલેનાઇઝેશન માટે વેક્યુમ લગાવો.
૩૭°C પાણીના સ્નાનમાં થીજી ગયેલા Caco-2 કોષોની એક શીશી પીગળી લો, પછી પીગળેલા કોષોને ૩૭°C પહેલાથી ગરમ કરેલા Caco-2 માધ્યમના ૧૫ મિલી ધરાવતા T75 ફ્લાસ્કમાં સ્થાનાંતરિત કરો.
~90% સંગમ પર Caco-2 કોષો પસાર કરવા માટે, પહેલા Caco-2 માધ્યમ, PBS, અને 0.25% ટ્રિપ્સિન/1 mM EDTA ને 37°C પાણીના સ્નાનમાં ગરમ ​​કરો.
વેક્યુમ એસ્પિરેશન દ્વારા માધ્યમને એસ્પિરેટ કરો. વેક્યુમ એસ્પિરેશનનું પુનરાવર્તન કરીને અને તાજા પીબીએસ ઉમેરીને કોષોને 5 મિલી ગરમ પીબીએસથી બે વાર ધોઈ લો.