Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર. તમે જે બ્રાઉઝર સંસ્કરણનો ઉપયોગ કરી રહ્યાં છો તેમાં CSS માટે મર્યાદિત સમર્થન છે. શ્રેષ્ઠ અનુભવ માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે અપડેટેડ બ્રાઉઝરનો ઉપયોગ કરો (અથવા Internet Explorer માં સુસંગતતા મોડ બંધ કરો). તે દરમિયાન, સતત સમર્થનની ખાતરી કરવા માટે, અમે શૈલીઓ અને JavaScript વિના સાઇટ પ્રદર્શિત કરીશું.
હ્યુમન ગટ મોર્ફોજેનેસિસ 3D એપિથેલિયલ માઇક્રોઆર્કિટેક્ચર અને અવકાશી સંસ્થાના ક્રિપ્ટ-વિલસ લક્ષણો સ્થાપિત કરે છે. આ અનન્ય માળખું બાહ્ય માઇક્રોબાયલ એન્ટિજેન્સ અને તેમના ચયાપચયથી બેઝલ ક્રિપ્ટમાં સ્ટેમ સેલ માળખાને સુરક્ષિત કરીને ગટ હોમિયોસ્ટેસિસ જાળવવા માટે જરૂરી છે. વધુમાં, આંતરડાના વિભિન્ન કોશિકાઓનું રક્ષણ કરે છે. આંતરડાની મ્યુકોસલ સપાટી પર અવરોધ. તેથી, ઈન વિટ્રો ગટ મોડલ્સના નિર્માણ માટે 3D ઉપકલા માળખાને ફરીથી બનાવવું મહત્વપૂર્ણ છે. નોંધનીય છે કે, કાર્બનિક મિમેટિક ગટ-ઓન-એ-ચીપ આંતરડાના સ્વયંસ્ફુરિત 3D મોર્ફોજેનેસિસને પ્રેરિત કરી શકે છે, જે બાયોફિસિસ એપિથેલૉજિકલ ફંક્શન પ્રદાન કરે છે. માઇક્રોફ્લુઇડિક ચિપ પર તેમજ ટ્રાન્સવેલ એમ્બેડેડ હાઇબ્રિડ ચિપમાં આંતરડામાં આંતરડાના મોર્ફોજેનેસિસને મજબૂત રીતે પ્રેરિત કરવા માટે પ્રજનનક્ષમ પ્રોટોકોલ. અમે ઉપકરણ બનાવટ, Caco-2 નું સંવર્ધન અથવા આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ એપિથેલિયલ કોશિકાઓમાં માઇક્રોફ્લુઇડ 3 પર માઇક્રોફ્લુઇડિક સેટિંગ તરીકે વિગતવાર પદ્ધતિઓનું વર્ણન કરીએ છીએ. છે, અને બહુવિધ ઇમેજિંગ મોડલિટીઝનો ઉપયોગ કરીને સ્થાપિત 3D એપિથેલિયાની લાક્ષણિકતા છે .આ પ્રોટોકોલ 5 દિવસ માટે બેસોલેટરલ પ્રવાહી પ્રવાહને નિયંત્રિત કરીને કાર્યાત્મક આંતરડાના માઇક્રોઆર્કિટેક્ચરનું પુનર્જીવન પ્રાપ્ત કરે છે. અમારી ઇન વિટ્રો મોર્ફોજેનેસિસ પદ્ધતિ શારીરિક રીતે સંબંધિત શીયર સ્ટ્રેસ અને યાંત્રિક ગતિને રોજગારી આપે છે અને અમને અસ્તિત્વમાં રહેલા કોષો અથવા અન્ય જટિલ તકનીકો કે જે આપણને માનવીય કોષો માટે જરૂરી નથી. સૂચિત પ્રોટોકોલ બાયોમેડિકલ સંશોધન સમુદાય માટે વ્યાપક અસરો ધરાવી શકે છે, જે બાયોમેડિકલ, ક્લિનિકલ અને ફાર્માસ્યુટિકલ એપ્લિકેશન્સ માટે વિટ્રોમાં 3D આંતરડાના ઉપકલા સ્તરોને પુનર્જીવિત કરવાની પદ્ધતિ પ્રદાન કરે છે.
પ્રયોગો દર્શાવે છે કે આંતરડાના ઉપકલા Caco-2 કોષો આંતરડા-ઓન-એ-ચિપ1,2,3,4,5 અથવા બાયલેયર માઇક્રોફ્લુઇડિક ઉપકરણો 6,7 માં સંવર્ધિત થાય છે તે અંતર્ગત પદ્ધતિની સ્પષ્ટ સમજણ વિના સ્વયંસ્ફુરિત 3D મોર્ફોજેનેસિસમાંથી પસાર થઈ શકે છે. અમારા તાજેતરના અધ્યયનમાં અમને જાણવા મળ્યું છે કે અમે એક ગુપ્ત ઉપકરણના પુનઃપ્રાપ્તિકરણના સંશોધનમાં જણાવ્યું છે. s એ વિટ્રોમાં 3D એપિથેલિયલ મોર્ફોજેનેસિસને પ્રેરિત કરવા માટે જરૂરી અને પૂરતું છે, જે Caco-2 અને દર્દી દ્વારા મેળવેલા આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ્સ દ્વારા દર્શાવવામાં આવ્યું છે.ઉપકલા કોષોને માન્ય કરવામાં આવ્યા હતા. આ અભ્યાસમાં, અમે ખાસ કરીને ગટ-ઓન-એ-ચીપ અને ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ ધરાવતા સંશોધિત માઇક્રોફ્લુઇડિક ઉપકરણોમાં શક્તિશાળી Wnt પ્રતિસ્પર્ધી, Dickkopf-1 (DKK-1) ના સેલ ઉત્પાદન અને એકાગ્રતા વિતરણ પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કર્યું હતું, જેને "Hybrid Chipnoous DW-Demont" તરીકે ઓળખવામાં આવે છે. -1, Wnt repressor 1, secreted frizzled-related protein 1, or Soggy-1) ઓન-ચીપ ગટમાં મોર્ફોજેનેસિસને અટકાવે છે અથવા પ્રિસ્ટ્રક્ચર્ડ 3D ઉપકલા સ્તરને વિક્ષેપિત કરે છે, જે સૂચવે છે કે સંસ્કૃતિ દરમિયાન વિરોધી તણાવ આંતરડાના મોર્ફોજેનેસિસ માટે જવાબદાર છે, જે રોબસ્ટિક અભિગમમાં વિટ્રોપ્રોજેન્સમાં આંતરડાના મોર્ફોજેનેસિસ માટે જવાબદાર છે. એલિયલ ઇન્ટરફેસ એ સક્રિય ફ્લશિંગ (દા.ત., ગટ-ઓન-એ-ચિપ અથવા હાઇબ્રિડ-ઓન-એ-ચિપ પ્લેટફોર્મમાં) અથવા પ્રસાર દ્વારા બેસોલેટરલ કમ્પાર્ટમેન્ટમાં Wnt પ્રતિસ્પર્ધીઓના સ્તરને દૂર કરવા અથવા ન્યૂનતમ જાળવી રાખવાનો છે .બેસોલેટરલ મીડિયા (દા.ત., મોટા બેસોલેટરલ વેલ રિઝર્વોમાં ટ્રાન્સવેલ દાખલ કરવાથી).
આ પ્રોટોકોલમાં, અમે ગટ-ઓન-એ-ચીપ માઇક્રોડિવાઇસીસ અને ટ્રાન્સવેલ-ઇન્સર્ટેબલ હાઇબ્રિડ ચિપ્સ (પગલાં 1-5)ને પોલિડીમેથિલસિલોક્સેન (PDMS) આધારિત છિદ્રાળુ પટલ પર સંવર્ધન કરવા માટે વિગતવાર પદ્ધતિ પ્રદાન કરીએ છીએ. 6B, 7B, 8, 9) અને પ્રેરિત 3D મોર્ફોજેનેસીસ ઇન વિટ્રો (પગલું 10).અમે પણ પેશી-વિશિષ્ટ હિસ્ટોજેનેસિસ અને વંશ-આધારિત સેલ્યુલર ભિન્નતાના સૂચક સેલ્યુલર અને પરમાણુ લક્ષણોને બહુવિધ ઇમેજિંગ મોડલિટીઝ (પગલાં 11-24) ને લાગુ કરીને ઓળખી કાઢ્યા છે (પગલાં 11-24). 2 અથવા આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ્સ, છિદ્રાળુ પટલની સપાટીમાં ફેરફાર, 2D મોનોલેયર્સનું નિર્માણ, અને આંતરડાની બાયોકેમિકલ અને બાયોમેકનિકલ માઇક્રોએનવાયર્નમેન્ટનું પ્રજનન સહિતની તકનીકી વિગતો સાથેના બે સંસ્કૃતિના સ્વરૂપમાં. સંસ્કૃતિના બેસોલેટરલ કમ્પાર્ટમેન્ટમાં માધ્યમ. અંતે, અમે પુનર્જીવિત 3D ઉપકલા સ્તરની ઉપયોગિતાનું પ્રતિનિધિત્વ પ્રદાન કરીએ છીએ જેનો ઉપયોગ મોર્ફોજેન-આધારિત ઉપકલા વૃદ્ધિ, રેખાંશ યજમાન-માઇક્રોબાયોમ સહ-સંસ્કૃતિઓ, પેથોજેન ચેપ, દાહક ઇજાઓ, બૅરિથલ બેક્ટેરિયા, બેરોજિકલ રોગોના વિકાસને મોડેલ કરવા માટે થઈ શકે છે. .પ્રભાવ કરે છે.
અમારો પ્રોટોકોલ મૂળભૂત (દા.ત., આંતરડાના મ્યુકોસલ બાયોલોજી, સ્ટેમ સેલ બાયોલોજી, અને ડેવલપમેન્ટલ બાયોલોજી) અને લાગુ સંશોધન (દા.ત., પ્રીક્લિનિકલ ડ્રગ ટેસ્ટિંગ, ડિસીઝ મોડેલિંગ, ટીશ્યુ એન્જિનિયરિંગ અને ગેસ્ટ્રોએન્ટેરોલોજી)માં વૈજ્ઞાનિકોની વ્યાપક શ્રેણી માટે ઉપયોગી થઈ શકે છે. વિટ્રોમાં આંતરડાના ઉપકલા, અમે કલ્પના કરીએ છીએ કે અમારી તકનીકી વ્યૂહરચના આંતરડાના વિકાસ, પુનર્જીવન અથવા હોમિયોસ્ટેસિસ દરમિયાન સેલ સિગ્નલિંગની ગતિશીલતાનો અભ્યાસ કરતા પ્રેક્ષકો સુધી પ્રસારિત કરી શકાય છે .આ ઉપરાંત, અમારો પ્રોટોકોલ વિવિધ ચેપી એજન્ટો જેમ કે નોરોવાયરસ 8, ક્લોરોવાયરસ કોર્પોરેટરી કોર્પોરેટરી કોર્પોરેટરી કોર્પોરેટરી કોર્પોરેટરી કોર્પોરેટરી કોર્પોરેટરી-એક્સી-2 (કોર્પોરેટરી કોર્પોરેટરી કોર્પોરેટરી કોર્પોરેશન) ની તપાસ માટે ઉપયોગી છે. ium difficile, Salmonella Typhimurium 9 અથવા Vibrio cholerae.રોગ પેથોલોજી અને પેથોજેનેસિસના પ્રેક્ષકો પણ ઉપયોગી છે. ઓન-ચીપ ગટ માઇક્રોફિઝીયોલોજી સિસ્ટમનો ઉપયોગ રેખાંશિત સહ-સંસ્કૃતિ 10 અને યજમાન સંરક્ષણ, રોગપ્રતિકારક પ્રતિક્રિયાઓ અને જઠરાંત્રિય (GI) માર્ગમાં રોગકારક-સંબંધિત ઇજાના સમારકામના અનુગામી મૂલ્યાંકનને મંજૂરી આપી શકે છે. જ્યારે દર્દીના 3D આંતરડાના ઉપકલા સ્તરોનો ઉપયોગ કરીને 3D આંતરડાના ઉપકલા સ્તરો તૈયાર કરવામાં આવે છે ત્યારે રોગ, અલ્સેરેટિવ કોલાઇટિસ, પાઉચાઇટિસ અથવા બાવલ સિંડ્રોમનું અનુકરણ કરી શકાય છે, આ રોગોમાં વિલસ એટ્રોફી, ક્રિપ્ટ શોર્ટનિંગ, મ્યુકોસલ ડેમેજ અથવા ક્ષતિગ્રસ્ત કોષો અથવા ક્ષતિગ્રસ્ત કોશિકાઓ શામેલ છે. oids12,13. રોગના વાતાવરણની ઉચ્ચ જટિલતાને વધુ સારી રીતે મોડેલ કરવા માટે, વાચકો 3D આંતરડાના વિલસ-ક્રિપ્ટ માઇક્રોઆર્કિટેક્ચર્સ ધરાવતા મોડેલોમાં રોગ-સંબંધિત કોષના પ્રકારો, જેમ કે દર્દી પેરિફેરલ બ્લડ મોનોન્યુક્લિયર સેલ (PBMCs) ઉમેરવાનું વિચારી શકે છે.પેશી-વિશિષ્ટ રોગપ્રતિકારક કોષો, 5.
3D ઉપકલા માઇક્રોસ્ટ્રક્ચરને સેક્શનિંગ પ્રક્રિયા વિના નિશ્ચિત અને વિઝ્યુઅલાઈઝ કરી શકાય છે, તેથી અવકાશી ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક્સ અને ઉચ્ચ-રિઝોલ્યુશન અથવા સુપર-રિઝોલ્યુશન ઇમેજિંગ પર કામ કરતા દર્શકો ઉપકલા માળખાં પર જનીનો અને પ્રોટીનની અવકાશી ટેમ્પોરલ ગતિશીલતાના અમારા મેપિંગમાં રસ ધરાવી શકે છે.ટેક્નોલોજીમાં રસ છે. માઇક્રોબાયલ અથવા રોગપ્રતિકારક ઉત્તેજનાની પ્રતિક્રિયા. વધુમાં, રેખાંશ હોસ્ટ-માઇક્રોબાયોમ ક્રોસસ્ટૉક 10, 14 જે આંતરડાના હોમિયોસ્ટેસિસનું સંકલન કરે છે તે 3D આંતરડાના મ્યુકોસલ સ્તરમાં વિવિધ માઇક્રોબાયલ પ્રજાતિઓ, માઇક્રોબાયલ કોમ્યુનિટીઓ, ખાસ કરીને માઇક્રોબાયલ કોમ્યુનિટીઓમાં સહ-સંવર્ધન દ્વારા સ્થાપિત કરી શકાય છે.પ્લેટફોર્મમાં. આ અભિગમ ખાસ કરીને મ્યુકોસલ ઇમ્યુનોલોજી, ગેસ્ટ્રોએન્ટેરોલોજી, હ્યુમન માઇક્રોબાયોમ, કલ્ચરોમિક્સ અને ક્લિનિકલ માઇક્રોબાયોલોજીનો અભ્યાસ કરતા પ્રેક્ષકો માટે આકર્ષક છે જે પ્રયોગશાળામાં અગાઉના અસંસ્કૃત ગટ માઇક્રોબાયોટાની ખેતી કરવા માગે છે. જો આપણો ઇન વિટ્રો મોર્ફોજેનેસિસ પ્રોટોકોલ, મલ્ટીવેલ 46 અથવા 49 માં સ્કેલેબલ કલ્ચરમાં સારી રીતે અનુકૂળ થઈ શકે છે. tes જે સતત બેસોલેટરલ કમ્પાર્ટમેન્ટ્સને ફરી ભરે છે, પ્રોટોકોલને ફૂડ ઉદ્યોગ માટે ફાર્માસ્યુટિકલ, બાયોમેડિકલ અથવા ઉચ્ચ-થ્રુપુટ સ્ક્રિનિંગ અથવા માન્યતા પ્લેટફોર્મ વિકસાવનારાઓને પણ પ્રસારિત કરી શકાય છે. સિદ્ધાંતના પુરાવા તરીકે, અમે તાજેતરમાં મલ્ટિપ્લેક્સ હાઇ-થ્રુપુટ સિસ્ટમમાં વધારાની શક્યતા દર્શાવી છે. -એ-ચીપ ઉત્પાદનોનું વ્યાપારીકરણ કરવામાં આવ્યું છે16,17,18. તેથી, અમારી ઇન વિટ્રો મોર્ફોજેનેસિસ પદ્ધતિની માન્યતાને વેગ આપી શકાય છે અને ઘણી સંશોધન પ્રયોગશાળાઓ, ઉદ્યોગ અથવા સરકાર અને નિયમનકારી એજન્સીઓ દ્વારા ઇન વિટ્રો ગટ મોર્ફોજેનેસિસના સેલ્યુલર રિપ્રોગ્રામિંગને સમજવા માટે સંભવિત રીતે અપનાવવામાં આવી શકે છે અને ટ્રાંસ્ક્રિપ્ટોમિક્સ અથવા બાયોમેન્ડિકેટેડ ટ્રાન્સપોર્ટેશનના સ્તરે ડ્રગ્સ અથવા ટ્રાન્સક્રિપ્ટો અથવા ટેસ્ટિંગ લેવલના પરીક્ષણો લેવામાં આવ્યા હતા. ગટ મોર્ફોજેનેસિસ પ્રક્રિયાની પુનઃઉત્પાદનક્ષમતાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે 3D ગટ સરોગેટ્સનો ઉપયોગ કરીને અથવા કસ્ટમ અથવા કોમર્શિયલ ઓર્ગન-ઓન-એ-ચિપ મોડલ્સનો ઉપયોગ કરીને.
મર્યાદિત સંખ્યામાં માનવીય સંબંધિત પ્રાયોગિક મોડેલોનો ઉપયોગ આંતરડાના ઉપકલા મોર્ફોજેનેસિસનો અભ્યાસ કરવા માટે કરવામાં આવે છે, મુખ્યત્વે વિટ્રોમાં 3 ડી મોર્ફોજેનેસિસને પ્રેરિત કરવા માટે અમલીકરણ પ્રોટોકોલ્સના અભાવને કારણે, આંતરડા મોર્ફોજેનેસિસ વિશેના વર્તમાન જ્ knowledge ાનનો મોટાભાગનો જ્ knowledge ાન પ્રાણીઓના અભ્યાસ પર આધારિત છે (ઇજી, ઝેબ્રાફિશ 20, તેઓ 21, ચાઇનાસ, મોટા પ્રમાણમાં કેન, એરીસી, એટીવ, એટીવ, એટીવ, એટીવ, એ. માનવ વિકાસની પ્રક્રિયાઓને ચોક્કસપણે નક્કી કરશો નહીં. આ મોડેલો મલ્ટિ-વે સ્કેલેબલ રીતે પરીક્ષણ કરવાની તેમની ક્ષમતામાં પણ ખૂબ મર્યાદિત છે. તેથી, વિવો એનિમલ 2 ડી સેલ કલ્ચર મોડેલોમાં વિટ્રો એનિમલ 2 ડી સેલ કલ્ચર મોડેલોમાં વિટ્રો આઉટપર્ફોર્મ્સમાં 3 ડી ટીશ્યુ સ્ટ્રક્ચર્સમાં 3 ડી પેશીઓની રચનાઓ તેમજ ક્રિસ્ટીયલ એક્સ્ટિલીસના અભ્યાસના વિવિધતાનો ઉપયોગ કરીને. વિવિધ મ્યુકોસલ અથવા રોગપ્રતિકારક ઉત્તેજના .3 ડી ઉપકલાના સ્તરોમાં માઇક્રોબાયલ કોષો હોસ્ટ પરિબળો (દા.ત., આંતરિક વિરુદ્ધ બાહ્ય લ્યુકસ સ્તરો, આઇજીએ અને એન્ટિમાઇક્રોબાયલ પેપ્ટાઇડ્સના સ્ત્રાવને કેવી રીતે સમજાવે છે. ઇસ્ટિકલી માઇક્રોબાયલ મેટાબોલિટ્સ (દા.ત., શોર્ટ-ચેન ફેટી એસિડ્સ) ઉત્પન્ન કરે છે જે મૂળભૂત ક્રિપ્ટ્સમાં સેલ્યુલર સંસ્થા અને સ્ટેમ સેલ વિશિષ્ટને આકાર આપે છે. આ સુવિધાઓ ફક્ત ત્યારે જ પ્રદર્શિત થઈ શકે છે જ્યારે 3 ડી ઉપકલા સ્તરો વિટ્રોમાં સ્થાપિત થાય છે.
3D આંતરડાની ઉપકલા રચનાઓ બનાવવાની અમારી પદ્ધતિ ઉપરાંત, ઘણી ઇન વિટ્રો પદ્ધતિઓ છે. આંતરડાની ઓર્ગેનોઇડ કલ્ચર એ એક અત્યાધુનિક ટીશ્યુ એન્જિનિયરિંગ તકનીક છે જે ચોક્કસ મોર્ફોજન પરિસ્થિતિઓમાં આંતરડાના સ્ટેમ સેલની ખેતી પર આધારિત છે. પડકારજનક કારણ કે આંતરડાની લ્યુમેન ઓર્ગેનોઇડની અંદર બંધ હોય છે અને તેથી, માઇક્રોબાયલ કોષો અથવા એક્સોજેનસ એન્ટિજેન્સ જેવા લ્યુમિનલ ઘટકોનો પરિચય મર્યાદિત છે.માઇક્રોઇંજેક્ટર,26,27નો ઉપયોગ કરીને ઓર્ગેનોઇડ લ્યુમેન્સની ઍક્સેસને સુધારી શકાય છે, પરંતુ આ પદ્ધતિ આક્રમક અને શ્રમ-સઘન છે અને તેને કરવા માટે વિશિષ્ટ જ્ઞાનની જરૂર છે. વધુમાં, હાઇડ્રોજેલ સ્કેફોલ્ડ્સમાં સ્થિર પરિસ્થિતિઓમાં જાળવવામાં આવતી પરંપરાગત ઓર્ગેનોઇડ સંસ્કૃતિઓ વિવો બાયોમિકેનિક્સમાં ચોક્કસ રીતે સક્રિય પ્રતિબિંબિત કરતી નથી.
કેટલાક સંશોધન જૂથો દ્વારા નિયુક્ત અન્ય અભિગમો જેલ સપાટી પર અલગ માનવ આંતરડાના કોષોને સંવર્ધન કરીને આંતરડાના ઉપકલા માળખાની નકલ કરવા માટે પ્રીસ્ટ્રક્ચર્ડ 3D હાઇડ્રોજેલ સ્કેફોલ્ડ્સનો ઉપયોગ કરે છે. 3D-પ્રિન્ટેડ, માઇક્રો-મિલેડ અથવા લિથોગ્રાફિકલી ફેબ્રિકેટેડ કોષોની ગોઠવણીમાં હાઇડ્રોજેલ સ્કેફોલ્ડ્સનું નિર્માણ કરવામાં આવે છે. સ્કેફોલ્ડમાં સ્ટ્રોમલ કોશિકાઓનો સમાવેશ કરીને, શારીરિક રીતે સંબંધિત મોર્ફોજેન ગ્રેડિયન્ટ્સ સાથે વિટ્રો, ઉચ્ચ પાસા રેશિયો ઉપકલા માળખું અને સ્ટ્રોમા-એપિથેલિયલ ક્રોસસ્ટૉક સ્થાપિત કરે છે. જો કે, પ્રિસ્ટ્રક્ચર્ડ સ્કેફોલ્ડ્સની પ્રકૃતિ સ્વયંસ્ફુરિત મોર્ફોજેનેટિક પ્રક્રિયાના પ્રદર્શનને અટકાવી શકે છે. આંતરડાના કોષોને મોર્ફોજેનેસિસમાંથી પસાર થવું અને શારીરિક કાર્ય પ્રાપ્ત કરવાની જરૂર છે. અન્ય તાજેતરના અભ્યાસમાં માઇક્રોફ્લુઇડિક પ્લેટફોર્મમાં હાઇડ્રોજેલ સ્કેફોલ્ડ્સનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો અને લેસર-ઇચિંગ તકનીકોનો ઉપયોગ કરીને પેટર્નવાળી આંતરડાની ઉપકલા રચનાઓ. માઉસ આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ્સ ઇચ્ડ પેટર્નને અનુસરીને આંતરડાની રચના અને માઇક્રોફ્લુઇડ સ્ટ્રક્ચરમાં માઇક્રોફ્લુઇડ સ્ટ્રક્ચરનો ઉપયોગ કરી શકે છે. ics મોડ્યુલ.જો કે, આ મોડલ ન તો સ્વયંસ્ફુરિત મોર્ફોજેનેટિક પ્રક્રિયાઓ દર્શાવે છે અને ન તો તેમાં ગટ મિકેનોબાયોલોજીકલ હિલચાલનો સમાવેશ થાય છે. સમાન જૂથની 3D પ્રિન્ટીંગ તકનીકો સ્વયંસ્ફુરિત મોર્ફોજેનેટિક પ્રક્રિયાઓ સાથે લઘુચિત્ર ગટ ટ્યુબ બનાવવા માટે સક્ષમ હતી. વિવિધ ગટ ટ્યુબિકલ મોડલની અંદરના જટિલ ફેબ્રિકેશન હોવા છતાં, આ ફ્લૂ અને ફ્લૂના વિવિધ મોડલની અંદર ફ્લુમિન ફ્લોવમેન્ટની ખામી છે. વધુમાં, મોડલ ઓપરેબિલિટી મર્યાદિત હોઈ શકે છે, ખાસ કરીને બાયોપ્રિંટિંગ પ્રક્રિયા પૂર્ણ થયા પછી, પ્રાયોગિક પરિસ્થિતિઓ અથવા સેલ-ટુ-સેલ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને ખલેલ પહોંચાડે છે. તેના બદલે, અમારો પ્રસ્તાવિત પ્રોટોકોલ સ્વયંસ્ફુરિત ગટ મોર્ફોજેનેસિસ, શારીરિક રીતે સંબંધિત શીયર સ્ટ્રેસ, બાયોમિકેનિક્સ કે જે આંતરડાની ગતિશીલતાની નકલ કરે છે, માઇક્રોસોલોજિકલ રિપેન્ડન્ટ અને સંકુલની સુલભતાની અનુકરણ કરે છે. મોડ્યુલરિટીનું વાતાવરણ. તેથી, અમારો ઇન વિટ્રો 3D મોર્ફોજેનેસિસ પ્રોટોકોલ હાલની પદ્ધતિઓના પડકારોને દૂર કરવા માટે પૂરક અભિગમ પ્રદાન કરી શકે છે.
અમારો પ્રોટોકોલ સંપૂર્ણપણે 3D એપિથેલિયલ મોર્ફોજેનેસિસ પર કેન્દ્રિત છે, જેમાં સંસ્કૃતિમાં માત્ર ઉપકલા કોષો છે અને અન્ય કોઈ પ્રકારના આસપાસના કોષો જેવા કે મેસેનકાઇમલ કોશિકાઓ, એન્ડોથેલિયલ કોશિકાઓ અને રોગપ્રતિકારક કોષો નથી. અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ, અમારા પ્રોટોકોલનો મુખ્ય ભાગ એપિથેલિયલ મોર્ફોજેનેસિસના ઇન્ડક્શન છે જે રિમોર્શિયલ સિક્રેટ સાઇડ મોર્ફોજેનેસિસ દ્વારા રજૂ કરવામાં આવે છે. medium.જ્યારે અમારી ગટ-ઓન-એ-ચીપ અને હાઇબ્રિડ-ઓન-એ-ચીપની મજબૂત મોડ્યુલારિટી અમને અનડ્યુલેટિંગ 3D ઉપકલા સ્તરને ફરીથી બનાવવાની મંજૂરી આપે છે, વધારાની જૈવિક જટિલતાઓ જેમ કે ઉપકલા-મેસેન્ચિમલ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ 33,34, એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર મેટ્રિક્સ (ECM) અને 3D સેલમાં જમા થાય છે, જે આપણા મોડેલો, 3D એપિથેલિયલ લેયરને ફરીથી બનાવે છે. બેઝલ ક્રિપ્ટ્સમાં વિશિષ્ટતાઓ વધુ ધ્યાનમાં લેવાના બાકી છે. મેસેનકાઇમમાં સ્ટ્રોમલ કોષો (દા.ત., ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ્સ) ઇસીએમ પ્રોટીનના ઉત્પાદનમાં અને વિવો35,37,38 માં આંતરડાના મોર્ફોજેનેસિસના નિયમનમાં મુખ્ય ભૂમિકા ભજવે છે. અમારા મોડેલમાં મેસેનચીમલ કોશિકાઓના ઉમેરાથી મોર્ફોજેનેટિક લેયર, કેપેલિલા અને કોષની પ્રક્રિયામાં વધારો થાય છે. ) આંતરડાના સૂક્ષ્મ વાતાવરણમાં પરમાણુ પરિવહન39 અને રોગપ્રતિકારક કોષની ભરતી 40 ના નિયમનમાં મહત્વની ભૂમિકા ભજવે છે. વધુમાં, વેસ્ક્યુલેચર ઘટકો કે જે ટીશ્યુ મોડલ્સ વચ્ચે જોડાઈ શકે તે પૂર્વશરત છે જ્યારે પેશીના મોડલ બહુ-અંગોની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ દર્શાવવા માટે રચાયેલ હોય છે. તેથી કોષો સાથે અંત્યત વિશેષતાઓને સમાવી શકાય છે, જેથી કોશિકાઓ અને કોષોને વધુ સંતુલિત કરવાની જરૂર હોય. રિઝોલ્યુશન. દર્દીમાંથી મેળવેલા રોગપ્રતિકારક કોષો આંતરડાના રોગની નકલ કરવાના સંદર્ભમાં જન્મજાત રોગપ્રતિકારક પ્રતિક્રિયાઓ, એન્ટિજેન પ્રસ્તુતિ, જન્મજાત અનુકૂલનશીલ રોગપ્રતિકારક શક્તિ અને પેશી-વિશિષ્ટ પ્રતિરક્ષા પ્રદર્શિત કરવા માટે પણ આવશ્યક છે.
હાઇબ્રિડ ચિપ્સનો ઉપયોગ ગટ-ઓન-એ-ચીપ કરતાં વધુ સીધો છે કારણ કે ઉપકરણનું સેટઅપ સરળ છે અને ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટનો ઉપયોગ ગટ એપિથેલિયમના સ્કેલેબલ કલ્ચર માટે પરવાનગી આપે છે. જો કે, પોલિએસ્ટર મેમ્બ્રેન સાથે વ્યાપારી રીતે ઉપલબ્ધ ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સ સ્થિતિસ્થાપક હોતા નથી અને પેરીસ્ટાલ્ટિક-જેવી ટ્રાન્સવેલ હિલચાલની જગ્યાએ ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટનું અનુકરણ કરી શકતા નથી. d ચિપ એપિકલ બાજુ પર કોઈ શીયર સ્ટ્રેસ વિના સ્થિર રહી. સ્પષ્ટપણે, એપિકલ કમ્પાર્ટમેન્ટમાં સ્ટેટિક પ્રોપર્ટીઝ ભાગ્યે જ હાઇબ્રિડ ચિપ્સમાં લાંબા ગાળાના બેક્ટેરિયલ કો-કલ્ચરને સક્ષમ કરે છે. જ્યારે આપણે ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટમાં 3D મોર્ફોજેનેસિસને મજબૂત રીતે પ્રેરિત કરી શકીએ છીએ, જ્યારે હાઇબ્રિડ થેપ્લિકલ થેરેપિકલ થેરેપિક્સનો ઉપયોગ કરી શકીએ છીએ. id ફ્લો સંભવિત એપ્લિકેશનો માટે હાઇબ્રિડ ચિપ પ્લેટફોર્મની શક્યતાને મર્યાદિત કરી શકે છે.
ગટ-ઓન-એ-ચિપ અને હાઇબ્રિડ-ઓન-એ-ચીપ સંસ્કૃતિઓમાં માનવ ક્રિપ્ટ-વિલસ અક્ષનું સંપૂર્ણ પાયે પુનઃનિર્માણ સંપૂર્ણપણે સ્થાપિત થયું નથી. મોર્ફોજેનેસિસ એપિથેલિયલ મોનોલેયરથી શરૂ થાય છે, તેથી 3D માઇક્રોઆર્કિટેક્ચર્સ જરૂરી નથી કે આપણે વસ્તીની નજીકના મોર્ફોલોજિકલ સમાનતા માટે મોર્ફોલોજિકલ સમાનતા પ્રદાન કરીએ. માઇક્રોએન્જિનીયર્ડ 3D એપિથેલિયમમાં બેઝલ ક્રિપ્ટ ડોમેન, ક્રિપ્ટ અને વિલસ પ્રદેશો સ્પષ્ટ રીતે સીમાંકિત ન હતા. જો કે ચિપ પરની ઉચ્ચ ઉપલા ચેનલો માઇક્રોએન્જિનીયર્ડ એપિથેલિયમની ઊંચાઈમાં વધારો કરે છે, મહત્તમ ઊંચાઈ હજુ પણ ~300-400 સુધી મર્યાદિત છે. es અનુક્રમે ~135 µm અને ~ 400 µm છે, અને નાના આંતરડાની વિલીની ઊંચાઈ ~ 600 µm41 છે.
ઇમેજિંગના દૃષ્ટિકોણથી, 3D માઇક્રોઆર્કિટેક્ચરનું સુપર-રિઝોલ્યુશન ઇમેજિંગ એક ચિપ પરના આંતરડા સુધી મર્યાદિત હોઈ શકે છે, કારણ કે ઉદ્દેશ્ય લેન્સથી ઉપકલા સ્તર સુધીનું જરૂરી કાર્ય અંતર થોડા મિલીમીટરના ક્રમ પર છે. આ સમસ્યાને દૂર કરવા માટે, દૂરના ઉદ્દેશ્યની જરૂર પડી શકે છે. વધુમાં, ઉચ્ચ સ્તરની તૈયારી માટે ઉચ્ચ સ્પેસિફિકેશન વિભાગો જરૂરી છે. PDMS.વધુમાં, ચિપ પર આંતરડાના સ્તર-દર-સ્તર માઇક્રોફેબ્રિકેશનમાં દરેક સ્તર વચ્ચે કાયમી સંલગ્નતાનો સમાવેશ થતો હોવાથી, ઉપકલા સ્તરની સપાટીની રચનાની તપાસ કરવા માટે ઉપલા સ્તરને ખોલવું અથવા દૂર કરવું અત્યંત પડકારજનક છે. ઉદાહરણ તરીકે, સ્કેનિંગ ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપ (SEM) નો ઉપયોગ કરીને.
PDMS ની હાઇડ્રોફોબિસિટી એ હાઇડ્રોફોબિક નાના પરમાણુઓ સાથે કામ કરતા માઇક્રોફ્લુઇડિક આધારિત અભ્યાસમાં મર્યાદિત પરિબળ છે, કારણ કે PDMS આવા હાઇડ્રોફોબિક અણુઓને બિન-વિશિષ્ટ રીતે શોષી શકે છે. PDMS ના વિકલ્પને અન્ય પોલિમેરિક સામગ્રીઓ સાથે ગણવામાં આવે છે. ene glycol) 43) હાઇડ્રોફોબિક પરમાણુઓના શોષણને ઘટાડવા માટે ગણી શકાય.
છેવટે, અમારી પદ્ધતિ ઉચ્ચ-થ્રુપુટ સ્ક્રીનીંગ અથવા "એક-કદ-ફિટ-ઑલ" વપરાશકર્તા-મૈત્રીપૂર્ણ પ્રાયોગિક પ્લેટફોર્મ પ્રદાન કરવાના સંદર્ભમાં સારી રીતે દર્શાવવામાં આવી નથી. વર્તમાન પ્રોટોકોલ માટે માઇક્રોડિવાઈસ દીઠ સિરીંજ પંપની જરૂર છે, જે CO2 ઇન્ક્યુબેટરમાં જગ્યા લે છે અને મોટા પાયે પ્રયોગોને અટકાવે છે. આ મર્યાદા નોંધપાત્ર રીતે સુધારી શકાય છે. , અથવા 384-વેલ છિદ્રાળુ ઇન્સર્ટ કે જે બેસોલેટરલ મીડિયાને સતત ફરી ભરવા અને દૂર કરવાની મંજૂરી આપે છે).
વિટ્રોમાં માનવ આંતરડાના ઉપકલાના 3D મોર્ફોજેનેસિસને પ્રેરિત કરવા માટે, અમે લ્યુમેન-કેપિલરી ઇન્ટરફેસ બનાવવા માટે બે સમાંતર માઇક્રોચેનલ અને વચ્ચે એક સ્થિતિસ્થાપક છિદ્રાળુ પટલ ધરાવતા માઇક્રોફ્લુઇડિક ચિપ આંતરડાના ઉપકરણનો ઉપયોગ કર્યો. અમે એક સિંગલ-ચેનલ માઇક્રોફ્લુઇડિક ઉપકરણનો ઉપયોગ પણ દર્શાવીએ છીએ જે સતત માઇક્રોફ્લ્યુડિક ઉપકરણ (બેસમાંતર માઇક્રોચેનલ) પ્રદાન કરે છે. ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સ પર ઉગાડવામાં આવેલા ધ્રુવીકૃત ઉપકલા સ્તરો. બંને પ્લેટફોર્મમાં, વિવિધ માનવ આંતરડાના ઉપકલા કોષોના મોર્ફોજેનેસિસને બેસોલેટરલ કમ્પાર્ટમેન્ટમાંથી મોર્ફોજેન વિરોધીઓને દૂર કરવા માટે પ્રવાહના દિશાત્મક મેનીપ્યુલેશનને લાગુ કરીને દર્શાવી શકાય છે. સમગ્ર પ્રાયોગિક પ્રક્રિયા (આકૃતિ 1) પાંચ માઇક્રોવેલ પાર્ટ્સનો સમાવેશ કરે છે. ચિપ (પગલાં 1-5; બોક્સ 1), (ii) આંતરડાના ઉપકલા કોષો (Caco-2 કોષો) અથવા માનવ આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ્સની તૈયારી;બોક્સ 2-5), (iii) આંતરડાની ચિપ્સ અથવા હાઇબ્રિડ ચિપ્સ પર આંતરડાના ઉપકલા કોષોની સંસ્કૃતિ (પગલાં 6-9), (iv) વિટ્રોમાં 3D મોર્ફોજેનેસિસનું ઇન્ડક્શન (પગલું 10) અને (v) ) 3D એપિથેલિયલ નિયંત્રણને લાક્ષણિકતા આપવા માટે (1-2-4) નીચે યોગ્ય ગ્રૂપમાં 3D ઉપકલા નિયંત્રણ. અવકાશી, ટેમ્પોરલ, શરતી અથવા પ્રક્રિયાગત નિયંત્રણો સાથે ઉપકલા મોર્ફોજેનેસિસની તુલના કરીને ઇન વિટ્રો મોર્ફોજેનેસિસની અસરકારકતાને માન્ય કરવા માટે ડિઝાઇન કરવામાં આવી હતી.
અમે બે અલગ-અલગ કલ્ચર પ્લેટફોર્મનો ઉપયોગ કર્યો છે: ગટ-ઓન-એ-ચીપ જેમાં સીધી ચેનલો અથવા બિન-રેખીય કન્વોલ્યુટેડ ચેનલો, અથવા માઇક્રોફ્લુઇડિક ઉપકરણમાં ટ્રાન્સવેલ (TW) ઇન્સર્ટ ધરાવતી હાઇબ્રિડ ચિપ્સ, બોક્સ 1 માં વર્ણવ્યા પ્રમાણે ફેબ્રિકેટેડ છે, અને પગલું 1 -5. "ડિવાઇસ ફેબ્રિકેશન" એક સિંગલ-ચીપ મેન અથવા સિંગલ-પી-ચીપ બનાવવાના મુખ્ય પગલાઓ દર્શાવે છે. lial Cells” આ પ્રોટોકોલમાં વપરાતા કોષ સ્ત્રોત (Caco-2 અથવા માનવ આંતરડાના ઓર્ગેનોઈડ્સ) અને સંસ્કૃતિ પ્રક્રિયાને સમજાવે છે.“ઈન વિટ્રો મોર્ફોજેનેસિસ” એ એકંદર પગલાંઓ દર્શાવે છે જેમાં Caco-2 અથવા ઓર્ગેનોઈડ-ઉત્પન્ન ઉપકલા કોષો આંતરડાની ચિપ પર સંવર્ધિત કરવામાં આવે છે અથવા ટ્રાન્સહાઈબ્રીડ્યુસ અને ટ્રાન્સહાઈબ્રીડ્યુસ3 દ્વારા અનુસરવામાં આવે છે. લાક્ષણિક ઉપકલા રચનાની રચના. પ્રોગ્રામ સ્ટેપ નંબર અથવા બૉક્સ નંબર દરેક તીરની નીચે પ્રદર્શિત થાય છે. એપ્લિકેશન આંતરડાના ઉપકલા સ્તરોનો કેવી રીતે ઉપયોગ કરી શકાય છે તેના ઉદાહરણો પ્રદાન કરે છે, ઉદાહરણ તરીકે, સેલ ડિફરન્સિએશન પાત્રાલેખનમાં, ગટ ફિઝિયોલોજી અભ્યાસ, યજમાન-માઈક્રોબાયોમ ઇકોસિસ્ટમ્સની સ્થાપના, અને ડિસીઝ મોડેલિંગમાં "એફ-મ્યુનિકલ ઇમેજ ડિસપ્લેસમેન્ટ" દર્શાવે છે. એક્ટિન અને MUC2 ગટ ચિપ પર જનરેટ થયેલા 3D Caco-2 ઉપકલા સ્તરમાં વ્યક્ત થાય છે. MUC2 સિગ્નલિંગ ગોબ્લેટ કોશિકાઓમાં હાજર છે અને મ્યુકોસલ સપાટીઓમાંથી સ્ત્રાવ થતા લાળમાં છે. ગટ ફિઝિયોલોજીમાં ફ્લોરોસન્ટ ઈમેજીસ સિઆલિક એસિડ અને એન-એસેસ્ટીલ્યુસેસેન્ટીનો ઉપયોગ કરીને સ્ટેનિંગ દ્વારા ઉત્પાદિત લાળ દર્શાવે છે. in.“હોસ્ટ-માઈક્રોબ કો-કલ્ચર્સ”માં બે ઓવરલેપિંગ ઈમેજો એક ચિપ પર આંતરડામાં પ્રતિનિધિ હોસ્ટ-માઈક્રોબાયોમ સહ-સંસ્કૃતિ દર્શાવે છે. ડાબી પેનલ E. coli ની સહ-સંસ્કૃતિ દર્શાવે છે જે માઈક્રોએન્જિનીયર્ડ 3D Caco-2 સાથે ગ્રીન ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન (GFP) વ્યક્ત કરે છે. GF કોશિકાઓના કો-ક્યુલ્યુલાઇઝેશન સાથે સ્થાનિક કો-કલ્ચર કો-કલ્ચર દર્શાવે છે. 3D Caco-2 ઉપકલા કોષો, એફ-એક્ટિન (લાલ) અને ન્યુક્લી (વાદળી) સાથે ઇમ્યુનોફ્લોરોસેન્સ સ્ટેનિંગ દ્વારા અનુસરવામાં આવે છે. રોગનું મોડેલિંગ બેક્ટેરિયલ એન્ટિજેન્સ (દા.ત., લિપોપોલિસેચેરાઇડ, પીએમસીબી કોષો અને એલએમસીસી) સાથે શારીરિક પડકાર હેઠળ આંતરડાની બળતરા ચિપ્સમાં સ્વસ્થ વિરુદ્ધ લીકી ગટને દર્શાવે છે.લીલો).Caco-2 કોષોને 3D ઉપકલા સ્તર સ્થાપિત કરવા માટે સંવર્ધિત કરવામાં આવ્યા હતા. સ્કેલ બાર, 50 µm. નીચેની પંક્તિમાં છબીઓ: "કોષોનું ભિન્નતા" સંદર્ભની પરવાનગી સાથે અનુકૂલિત.2.ઓક્સફોર્ડ યુનિવર્સિટી પ્રેસ;Ref.5 ની પરવાનગી સાથે પુનઃઉત્પાદિત.NAS;"હોસ્ટ-માઈક્રોબ કો-કલ્ચર" સંદર્ભ 3 ની પરવાનગી સાથે અનુકૂલિત.NAS;"ડિસીઝ મોડેલિંગ" સંદર્ભની પરવાનગી સાથે અનુકૂલિત.5.NAS.
બંને ગટ-ઓન-ચિપ અને હાઇબ્રિડ ચિપ્સ PDMS પ્રતિકૃતિઓનો ઉપયોગ કરીને બનાવવામાં આવી હતી જે સોફ્ટ લિથોગ્રાફી 1,44 દ્વારા સિલિકોન મોલ્ડમાંથી ડિમોલ્ડ કરવામાં આવી હતી અને SU-8 સાથે પેટર્નવાળી હતી. દરેક ચિપમાં માઇક્રોચેનલની ડિઝાઇન હાઇડ્રોડાયનેમિક્સ જેવા કે શીયર સ્ટ્રેસ અને હાઇડ્રોડાયનામિક ડિઝાઇન, 1,44, 200000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000% ડેટા ફિગ. 1a), જેમાં બે સંયુક્ત સમાંતર સીધી માઇક્રોચેનલનો સમાવેશ થાય છે, તે જટિલ ગટ-ઓન-એ-ચિપ (વિસ્તૃત ડેટા ફિગ. 1b) માં વિકસિત થયો છે જેમાં વક્ર માઇક્રોચેનલની જોડીનો સમાવેશ થાય છે જેથી પ્રવાહી રહેઠાણનો સમય વધે, બિનરેખીય પ્રવાહ કોષો અને મલ્ટિએક્સીઅલ કલ્ચર (F2) ના મલ્ટિએક્સીઅલ કલ્ચર અને ડીફોમડબલ્યુ. વધુ જટિલ ગટ બાયોમિકેનિક્સને ફરીથી બનાવવાની જરૂર છે, જટિલ ગટ-ઓન-એ-ચિપ્સ પસંદ કરી શકાય છે. અમે દર્શાવ્યું છે કે જટિલ ગટ-ચિપ પણ મૂળ ગટ-ચિપની તુલનામાં સમાન સમયગાળામાં ઉપકલા વૃદ્ધિની સમાન ડિગ્રી સાથે સમાન સમયગાળામાં 3D મોર્ફોજેનેસિસને મજબૂત રીતે પ્રેરિત કરે છે, સંવર્ધિત અને સંસ્કારી કોષો પર સંસ્કારી અને કોષો, 3-ડી-મોર્ફોજેનેસિસના પ્રકારને ધ્યાનમાં લીધા વિના. ચિપ ગટ ડિઝાઈન અદલાબદલી કરી શકાય તેવી છે. SU-8 પેટર્ન સાથે સિલિકોન મોલ્ડ પર સાધેલી PDMS પ્રતિકૃતિઓ ડિમોલ્ડિંગ પછી નકારાત્મક લક્ષણો પ્રદાન કરે છે (ફિગ.2a). એક ચિપ પર આંતરડાને ફેબ્રિકેટ કરવા માટે, તૈયાર ઉપલા PDMS સ્તરને અનુક્રમે છિદ્રાળુ PDMS ફિલ્મ સાથે જોડવામાં આવ્યું હતું અને પછી કોરોના ટ્રીટરની મદદથી અફર બોન્ડિંગ દ્વારા નીચલા PDMS સ્તર સાથે સંરેખિત કરવામાં આવ્યું હતું (ફિગ. 2b–f). હાઇબ્રિડ ચિપ્સને ફેબ્રિકેટ કરવા માટે, માઈક્રો-ડીએમએસ લેયર બનાવવા માટે સિંગલ-ફ્રુડ ગ્લાસ બનાવવામાં આવ્યા હતા. idic ઉપકરણો કે જે ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટને સમાવી શકે છે (ફિગ. 2h અને વિસ્તૃત ડેટા ફિગ. 2). બોન્ડિંગ પ્રક્રિયા પીડીએમએસ પ્રતિકૃતિ અને કાચની સપાટીને ઓક્સિજન પ્લાઝ્મા અથવા કોરોના ટ્રીટમેન્ટ દ્વારા સારવાર દ્વારા કરવામાં આવે છે. સિલિકોન ટ્યુબ સાથે જોડાયેલ માઇક્રોફેબ્રિકેટેડ ઉપકરણની વંધ્યીકરણ પછી, સિલિકોન ટ્યુબમાં તૈયાર કરવામાં આવી હતી. હિલીયમ (આકૃતિ 2 જી).
a, SU-8 પેટર્નવાળા સિલિકોન મોલ્ડમાંથી PDMS ભાગોની તૈયારીનું યોજનાકીય ચિત્ર. અશુદ્ધ PDMS સોલ્યુશનને સિલિકોન મોલ્ડ (ડાબે) પર રેડવામાં આવ્યું હતું, 60 °C (મધ્યમ) પર મટાડવામાં આવ્યું હતું અને તેને તોડી પાડવામાં આવ્યું હતું (જમણે). ડિમોલ્ડેડ PDMSને ટુકડાઓમાં કાપવામાં આવ્યું હતું અને PDMS લેયર તૈયાર કરવા માટે, ફોટો ગ્રાફને વધુ ઉપયોગ કરવા માટે, moc લેયર તૈયાર કરવા માટે સાફ કરવામાં આવ્યું હતું. PDMS છિદ્રાળુ પટલ.d બનાવવા માટે વપરાતા સિલિકોન મોલ્ડનો, ઉપલા અને નીચલા PDMS ઘટકોના ફોટોગ્રાફ્સની શ્રેણી અને એસેમ્બલ ઓન-ચિપ આંતરડાના ઉપકરણ. એટલે કે, ઉપલા, પટલ અને નીચલા PDMS ઘટકોના સંરેખણની યોજનાકીય. દરેક સ્તરને અપ્રિય રીતે પ્લાસ્ટર અથવા પ્લાસ્ટીકની સારવાર દ્વારા સુધારેલ છે. સુપરઇમ્પોઝ્ડ કન્વોલ્યુટેડ માઈક્રોચેનલ અને વેક્યુમ ચેમ્બર્સ સાથે ut-on-a-chip ઉપકરણ.g, microfluidic સેલ કલ્ચર માટે ગટ-ઓન-એ-ચિપનું સેટઅપ. સિલિકોન ટ્યુબ અને સિરીંજ સાથે એસેમ્બલ કરેલી ચિપ પર ફેબ્રિકેટેડ ગટ કવરસ્લિપ પર મૂકવામાં આવ્યું હતું. ડિવાઈસ પર ડિસપ્લેસિંગ પ્રક્રિયા માટે લિડ્રિપ 5 ની જગ્યા હતી. સિલિકોન ટ્યુબ.h, હાઇબ્રિડ ચિપ ફેબ્રિકેશનના વિઝ્યુઅલ સ્નેપશોટ અને હાઇબ્રિડ ચિપ્સનો ઉપયોગ કરીને 3D મોર્ફોજેનેસિસને બંધ કરવા માટે વપરાય છે. આંતરડાના ઉપકલા કોશિકાઓના 2D મોનોલેયર્સને સંવર્ધન ચિપમાં દાખલ કરવામાં આવ્યા હતા. ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ પર સ્થાપિત સેલ લેયરની નીચે માઇક્રોચેનલ દ્વારા.સ્કેલ બાર, 1 સેમી.ક. સંદર્ભની પરવાનગી સાથે ફરીથી મુદ્રિત.4.એલ્સેવિઅર.
આ પ્રોટોકોલમાં, Caco-2 સેલ લાઇન અને આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ્સનો ઉપકલા સ્ત્રોત તરીકે ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો (ફિગ. 3a).બંને પ્રકારના કોષો સ્વતંત્ર રીતે સંવર્ધિત કરવામાં આવ્યા હતા (બોક્સ 2 અને બોક્સ 5) અને ઓન-ચીપ ગટ અથવા ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સના ECM-કોટેડ માઇક્રોચેનલને બીજ આપવા માટે વપરાય છે. ટી-ફલાસ્કમાં (ફકરાઓ 10 અને 50 વચ્ચે) ટ્રિપ્સિનાઇઝેશન પ્રવાહી (બોક્સ 2) દ્વારા વિચ્છેદિત કોષ સસ્પેન્શન તૈયાર કરવા માટે કાપવામાં આવે છે. આંતરડાની બાયોપ્સી અથવા સર્જીકલ રીસેક્શનમાંથી માનવ આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ્સને 24-વેલ પ્લાસ્ટરોનિયમ પ્લાસ્ટરને સપોર્ટ કરવા માટે મેટ્રિગેલ સ્કેફોલ્ડ ડોમમાં સંવર્ધન કરવામાં આવ્યું હતું. જેમ કે Wnt, R-spondin અને Noggin) અને બૉક્સ 3 માં વર્ણવ્યા પ્રમાણે તૈયાર કરેલ વૃદ્ધિના પરિબળોને દર બીજા દિવસે પૂરક કરવામાં આવ્યા હતા જ્યાં સુધી ઓર્ગેનોઇડ્સ વ્યાસમાં ~500 µm સુધી વધ્યા ન હતા. સંપૂર્ણ રીતે ઉગાડવામાં આવેલા ઓર્ગેનોઇડ્સની કાપણી કરવામાં આવે છે અને આંતરડા પર બીજ વાવવા માટે એક કોષમાં વિભાજિત કરવામાં આવે છે અથવા ટ્રાન્સવેલ દાખલ કરવામાં આવે છે (અમે અગાઉના વિવિધ રોગોની જાણ કરી શકીએ છીએ). પ્રકાર12,13 (દા.ત. અલ્સેરેટિવ કોલાઇટિસ, ક્રોહન રોગ, કોલોરેક્ટલ કેન્સર, અથવા સામાન્ય દાતા), જખમ સ્થળ (દા.ત., જખમ વિરુદ્ધ બિન-જખમ વિસ્તાર) અને માર્ગમાં જઠરાંત્રિય સ્થાન (દા.ત., ડ્યુઓડેનમ, જેજુનમ, ઇલિયમ, સેકમ, કોલોન, અથવા ગુદામાર્ગ).અમે એક ઑપ્ટિમાઇઝ્ડ કોલેટોઇડ્સ (બોકોલોઇડ્સ) પ્રદાન કરીએ છીએ. સામાન્ય રીતે નાના આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ્સ કરતાં મોર્ફોજેન્સની ઊંચી સાંદ્રતાની જરૂર પડે છે.
a, ગટ ચિપમાં ગટ મોર્ફોજેનેસિસના ઇન્ડક્શન માટે વર્કફ્લો. Caco-2 માનવ આંતરડાના ઉપકલા અને આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ્સનો ઉપયોગ આ પ્રોટોકોલમાં 3D મોર્ફોજેનેસિસને દર્શાવવા માટે કરવામાં આવે છે. અલગ કરાયેલા ઉપકલા કોષો તૈયાર ગટ-ઓન-એ-ચીપ સેલ્સ (એટેચ્ડ ડીવાઈસ) માં સીડ કરવામાં આવ્યા હતા. ) 0 (D0) દિવસે PDMS છિદ્રાળુ પટલમાં, apical (AP) પ્રવાહ શરૂ કરવામાં આવે છે અને પ્રથમ 2 દિવસ સુધી જાળવવામાં આવે છે (ફ્લો, AP, D0-D2). બેસોલેટરલ (BL) પ્રવાહ પણ ચક્રીય સ્ટ્રેચિંગ ગતિ સાથે શરૂ થાય છે (સ્ટ્રેચ, ફ્લો, AP અને BL) જ્યારે પૂર્ણ થાય છે. માઇક્રોફ્લુઇડિક કલ્ચર (મોર્ફોજેનેસિસ, D5) ના 5 દિવસ પછી સ્વયંભૂ લાલ.તબક્કો કોન્ટ્રાસ્ટ ઇમેજ દરેક પ્રાયોગિક પગલા અથવા સમય બિંદુ પર Caco-2 કોશિકાઓની પ્રતિનિધિ મોર્ફોલોજી દર્શાવે છે (બાર ગ્રાફ, 100 µm). ચાર યોજનાકીય આકૃતિઓ જમણી બાજુના આર્મોર્ફોજેનેસના અનુરૂપ કાસ્કેડને દર્શાવે છે. પ્રવાહી પ્રવાહ.b, સ્થાપિત 3D Caco-2 ઉપકલા (ડાબે) ની સપાટીની ટોપોલોજી દર્શાવતી SEM ઇમેજ. વિસ્તૃત વિસ્તાર (સફેદ ડૅશવાળા બૉક્સ)ને હાઇલાઇટ કરતી ઇનસેટ 3D Caco-2 સ્તર (જમણે) પર પુનર્જીવિત માઇક્રોવિલી બતાવે છે. c, સ્થાપિત Caco-2 અને લાંબોરેડ બોર્ડર (Caco-2) નું આડું આગળનું દૃશ્ય, સતત ક્લાઉડ બેલેન્સ (brushed) 3D. -એક્ટિન (લીલો) અને ન્યુક્લી (વાદળી) આંતરડાની ચિપ્સ પર ઉપકલા કોશિકાઓનું ઇમ્યુનોફ્લોરોસેન્સ કોન્ફોકલ વિઝ્યુલાઇઝેશન. મધ્યમ યોજના તરફ નિર્દેશ કરતા તીરો પ્રત્યેક કોન્ફોકલ વ્યુ માટે ફોકલ પ્લેનનું સ્થાન સૂચવે છે. એક ચિપ દ્વારા સંવર્ધિત ઓર્ગેનોઇડ્સમાં મોર્ફોલોજિકલ ફેરફારોનો સમય કોર્સ, માઈક્રો 19 અને 3 દિવસ પર સંવર્ધન. 13. ઇનસેટ (ઉપર જમણે) પ્રદાન કરેલી છબીનું ઉચ્ચ વિસ્તરણ દર્શાવે છે. એટલે કે, 7.f દિવસે લેવામાં આવેલી સ્લાઇસ પર આંતરડામાં સ્થાપિત ઓર્ગેનોઇડ 3D ઉપકલાનો DIC ફોટોમાઇક્રોગ્રાફ, સ્ટેમ સેલ (LGR5;કિરમજી), ગોબ્લેટ કોષો (MUC2; લીલો), એફ-એક્ટીન (ગ્રે) અને ન્યુક્લી (સ્યાન) ઉપકલા સ્તર પર અનુક્રમે (ડાબે) અને 13-દિવસ (મધ્યમ) ઓર્ગેનોઇડ્સ પર 3 દિવસ માટે ઉગાડવામાં આવે છે. વિસ્તૃત ડેટા આકૃતિ 3 પણ જુઓ, જે એલજીઆરએમયુ 5 સિગ્નલ હાઈલાઈટ કરે છે. કલ્ચરના 13મા દિવસે સેલમાસ્ક ડાય (જમણે) વડે પ્લાઝ્મા મેમ્બ્રેનને સ્ટેનિંગ કરીને ચિપ પર આંતરડામાં સ્થાપિત 3D ઓર્ગેનોઇડ એપિથેલિયમનું ઇથેલિયલ માઇક્રોસ્ટ્રક્ચર (જમણે).ઓક્સફોર્ડ યુનિવર્સિટી પ્રેસ;c સંદર્ભની પરવાનગી સાથે અનુકૂલિત.2.ઓક્સફોર્ડ યુનિવર્સિટી પ્રેસ;સંદર્ભ દ્વારા પરવાનગી સાથે અનુકૂલિત e અને f. ક્રિએટિવ કોમન્સ લાયસન્સ CC BY 4.0 હેઠળ.
ચિપ પરના આંતરડામાં, સફળ ECM કોટિંગ માટે PDMS છિદ્રાળુ પટલની હાઇડ્રોફોબિક સપાટીને સંશોધિત કરવી જરૂરી છે. આ પ્રોટોકોલમાં, અમે PDMS પટલની હાઇડ્રોફોબિસિટીને સંશોધિત કરવા માટે બે અલગ-અલગ પદ્ધતિઓ લાગુ કરીએ છીએ. Caco-2 કોષોના સંવર્ધન માટે, એકલા PDMS ની સપાટીની સક્રિયકરણ દ્વારા સપાટીની હાઇડ્રોફોબિક પ્રક્રિયાને સુનિશ્ચિત કરવામાં આવી હતી. ECM ને કોટ કરો અને Caco-2 કોષોને PDMS પટલ સાથે જોડો. જો કે, ઓર્ગેનોઇડ એપિથેલિયમના માઇક્રોફ્લુઇડિક કલ્ચરને PDMS પર પોલિઇથિલિનાઇમાઇન (PEI) અને ગ્લુટારાલ્ડિહાઇડને અનુક્રમે લાગુ કરીને ઇસીએમ પ્રોટીનના કાર્યક્ષમ જમાવતા હાંસલ કરવા માટે રાસાયણિક-આધારિત સપાટી કાર્યક્ષમતા જરૂરી છે, PDMS માઇક્રોચૅનલની સપાટી પર પ્રોટીન કવર ઇસીએમએમએસ કવર કરવામાં આવે છે. સપાટી અને પછી આઇસોલેટેડ ઓર્ગેનોઇડ એપિથેલિયમમાં દાખલ કરવામાં આવે છે. કોષો જોડાયા પછી, કોષો સંપૂર્ણ મોનોલેયર ન બને ત્યાં સુધી માઇક્રોફ્લુઇડિક સેલ કલ્ચર માત્ર માધ્યમને પરફ્યુઝ કરીને ઉપલા માઇક્રોચેનલમાં શરૂ થાય છે, જ્યારે નીચેની માઇક્રોચેનલ સ્થિર સ્થિતિ જાળવી રાખે છે. સપાટીના સક્રિયકરણ માટે આ ઑપ્ટિમાઇઝ પદ્ધતિ અને ECM કોટિંગ એપેસીડિયમ 3 પર સક્રિય થાય છે. PDMS સપાટી.
ટ્રાન્સવેલ સંસ્કૃતિઓને સેલ સીડીંગ પહેલા ECM કોટિંગની પણ જરૂર પડે છે;જોકે, ટ્રાન્સવેલ કલ્ચર્સને છિદ્રાળુ ઇન્સર્ટ્સની સપાટીને સક્રિય કરવા માટે જટિલ પ્રીટ્રીટમેન્ટ પગલાંની જરૂર હોતી નથી. ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સ પર Caco-2 કોષો ઉગાડવા માટે, છિદ્રાળુ ઇન્સર્ટ્સ પર ECM કોટિંગ ડિસોસિએટેડ Caco-2 કોશિકાઓના જોડાણને વેગ આપે છે (<1 કલાક) અને ચુસ્ત જંકશન બેરિયર રચના (<1-2 કલ્ચર અથવા ટ્રાંસવેલ ઇન્સર્ટ્સ પર વેલડેડ કલ્ચર છે). ECM-કોટેડ ઇન્સર્ટ, પટલની સપાટી (<3 h) સાથે જોડાયેલ અને જ્યાં સુધી ઓર્ગેનોઇડ્સ અવરોધ અખંડિતતા સાથે સંપૂર્ણ મોનોલેયર ન બનાવે ત્યાં સુધી જાળવવામાં આવે છે .ટ્રાન્સવેલ કલ્ચર હાઇબ્રિડ ચિપ્સના ઉપયોગ વિના 24-વેલ પ્લેટમાં કરવામાં આવે છે.
ઇન વિટ્રો 3D મોર્ફોજેનેસિસ સ્થાપિત ઉપકલા સ્તરના બેસોલેટરલ પાસામાં પ્રવાહી પ્રવાહને લાગુ કરીને શરૂ કરી શકાય છે. એક ચિપ પરના આંતરડામાં, ઉપકલા મોર્ફોજેનેસિસ ત્યારે શરૂ થયું જ્યારે માધ્યમ ઉપલા અને નીચલા માઇક્રોચેનલ્સમાં પરફ્યુઝ કરવામાં આવ્યું હતું (ફિગ. 3a,).તે અગાઉ ક્રિટીકલ ફ્લુમાં વર્ણવેલ છે. ડાયરેક્શનલ સિક્રેટેડ મોર્ફોજેન અવરોધકોને સતત દૂર કરવા માટેનો ડબ્બો. છિદ્રાળુ પટલ પર બંધાયેલા કોષોને પૂરતા પોષક તત્વો અને સીરમ પ્રદાન કરવા અને લ્યુમિનલ શીયર સ્ટ્રેસ પેદા કરવા માટે, અમે સામાન્ય રીતે એક ચિપ પર આંતરડામાં ડ્યુઅલ ફ્લો લાગુ કરીએ છીએ. હાઇબ્રિડ ચિપ્સમાં, ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટમાં મોચીથ્થાઇલ્સ શામેલ હોય છે. માઇક્રોચેનલ દ્વારા છિદ્રાળુ ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટની બેસોલેટરલ બાજુ હેઠળ માધ્યમ લાગુ કરવામાં આવ્યું હતું. બંને કલ્ચર પ્લેટફોર્મમાં બેસોલેટરલ ફ્લો શરૂ થયાના 3-5 દિવસ પછી આંતરડાની મોર્ફોજેનેસિસ આવી હતી.
માઇક્રોએન્જિનીયર્ડ 3D ઉપકલા સ્તરોની મોર્ફોલોજિકલ લાક્ષણિકતાઓનું વિશ્લેષણ વિવિધ ઇમેજિંગ મોડલિટીઝનો ઉપયોગ કરીને કરી શકાય છે, જેમાં ફેઝ કોન્ટ્રાસ્ટ માઈક્રોસ્કોપી, ડિફરન્સિયલ ઈન્ટરફરન્સ કોન્ટ્રાસ્ટ (DIC) માઈક્રોસ્કોપી, SEM અથવા ઇમ્યુનોફ્લોરોસેન્સ કોન્ફોકલ માઈક્રોસ્કોપી (આકૃતિ 3 અને 4) નો સમાવેશ થાય છે. 3D ઉપકલા સ્તરો. PDMS અને પોલિએસ્ટર ફિલ્મોની ઓપ્ટિકલ પારદર્શિતાને કારણે, બંને ગટ-ઓન-એ-ચિપ અને હાઇબ્રિડ ચિપ પ્લેટફોર્મ ઉપકરણના વિભાગીકરણ અથવા ડિસએસેમ્બલીની જરૂરિયાત વિના સિટુ ઇમેજિંગમાં વાસ્તવિક સમય પ્રદાન કરી શકે છે. જ્યારે ઇમ્યુનોફ્લોરોસેન્સ ઇમેજિંગ કરવામાં આવે છે, ત્યારે c3, 4 અને કોષો ફિક્સ થાય છે. % (wt/vol) paraformaldehyde (PFA), ક્રમમાં ટ્રાઇટોન X-100 અને 2% (wt/vol) ) બોવાઇન સીરમ આલ્બ્યુમિન (BSA), ક્રમમાં. કોષના પ્રકાર પર આધાર રાખીને, વિવિધ ફિક્સેટિવ્સ, પરમેબિલાઇઝર્સ અને અવરોધક એજન્ટોનો ઉપયોગ કરી શકાય છે. પ્રાથમિક એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ કોશિકાઓ પર આધારિત છે, જે ઉચ્ચ કોશિકાઓ પર આધારિત છે. ન્યુક્લિયસ (દા.ત., 4′,6-ડાયામિડિનો-2-ફેનાઇલીન) ઇન્ડોલ, DAPI) અથવા F-એક્ટિન (દા.ત., ફ્લોરોસન્ટલી લેબલવાળા ફેલોઇડિન) ને લક્ષ્યાંકિત કરતા કાઉન્ટરસ્ટેન ડાઇ સાથે ગૌણ એન્ટિબોડીઝ દ્વારા ED. ફ્લોરોસેન્સ-આધારિત લાઇવ ઇમેજિંગ પણ પ્રોડક્શન સિટુ (મ્યુકસ સીટુ) માં કરી શકાય છે.1, "સેલ ડિફરન્સિએશન" અને "ગટ ફિઝિયોલોજી"), માઇક્રોબાયલ કોશિકાઓનું રેન્ડમ કોલોનાઇઝેશન (ફિગ. 1, "હોસ્ટ-માઇક્રોબ કો-કલ્ચર"), રોગપ્રતિકારક કોષોની ભરતી (ફિગ. 1, 'ડિસીઝ મોડેલિંગ') અથવા 3D એપિથેલિયલ અને 3D એપિથેલિયલ અને 3D એપિથેલિઅલ મોડલિંગ, એફમોરાઇફિક મોડલિંગ 4). ઉપલા સ્તરને નીચલા માઇક્રોચેનલ લેયરથી અલગ કરવા માટે ચિપ પર આંતરડા, સંદર્ભમાં વર્ણવ્યા મુજબ. ફિગ. 2 માં બતાવ્યા પ્રમાણે, 3D ઉપકલા મોર્ફોલોજી તેમજ એપિકલ બ્રશ બોર્ડર પરની માઇક્રોવિલીને SEM (ફિગ. 3b) દ્વારા વિઝ્યુઅલાઈઝ કરી શકાય છે. ડિફરન્સિએશન માર્કર્સની અભિવ્યક્તિ આ સિંગલ કેસમાં પીસીઆરએનએ 5 કેસમાં કરી શકાય છે. , ગટ ચિપ્સ અથવા હાઇબ્રિડ ચિપ્સમાં ઉગાડવામાં આવતા ઉપકલા કોષોના 3D સ્તરો ટ્રાયપ્સિનાઇઝેશન દ્વારા કાપવામાં આવે છે અને પછી મોલેક્યુલર અથવા આનુવંશિક વિશ્લેષણ માટે ઉપયોગમાં લેવાય છે.
a, હાઇબ્રિડ ચિપમાં આંતરડાના મોર્ફોજેનેસિસના ઇન્ડક્શન માટે વર્કફ્લો. હાઇબ્રિડ ચિપ પ્લેટફોર્મમાં 3D મોર્ફોજેનેસિસ દર્શાવવા માટે આ પ્રોટોકોલમાં Caco-2 અને આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ્સનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે. ડિસોસિએટેડ એપિથેલિયલ કોષો તૈયાર કરવામાં આવ્યા હતા. ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટ્સમાં પોલિએસ્ટર મેમ્બ્રેન, તમામ કોષો સ્થિર પરિસ્થિતિઓ (TW કલ્ચર) હેઠળ સંવર્ધિત કરવામાં આવ્યા હતા. 7 દિવસ પછી, ઉપકલા કોશિકાઓના 2D મોનોલેયર ધરાવતી એક ટ્રાન્સવેલ ઇન્સર્ટને બેસોલેટરલ ફ્લો (ફ્લો, BL) રજૂ કરવા માટે હાઇબ્રિડ ચિપમાં સંકલિત કરવામાં આવી હતી, જે આખરે માઇક્રોસોલિસ 3-પી-3-એપીથેલિયલ જનરેશન તરફ દોરી જાય છે. દરેક પ્રાયોગિક પગલા અથવા સમય બિંદુ પર સામાન્ય દાતા (C103 લાઇન) ચડતા કોલોનમાંથી મેળવેલા માનવ અંગના ઉપકલા કોષોના મોર્ફોલોજિકલ લક્ષણો દર્શાવતા આલેખ. ઉપલા સ્તરોમાંની યોજનાઓ દરેક પગલા માટે પ્રાયોગિક રૂપરેખાંકન દર્શાવે છે. બી, હાઇબ્રિડ ચિપ્સ (ડાબી યોજનાકીય) 3D કોનફોરોઇડ કોશિકાઓ કે જે કોનફોરોઇડ કોશિકાઓ દ્વારા લેવામાં આવી શકે છે. વિવિધ Z સ્થાનો પર (ઉપલા, મધ્યમ અને નીચલા;જમણી યોજનાકીય અને અનુરૂપ ડોટેડ રેખાઓ જુઓ).સ્પષ્ટ મોર્ફોલોજિકલ લાક્ષણિકતાઓ દર્શાવે છે. F-actin (સ્યાન), ન્યુક્લિયસ (ગ્રે).c, સ્થિર ટ્રાન્સવેલ (TW; સફેદ ડેશેડ બૉક્સની અંદર ઇનસેટ) વિરૂદ્ધ હાઇબ્રિડ કોમ્પેસ્ટર્સ 3D હોટલોજી, કોમ્પ્લેરિંગ, 3D હોટલોજી (3D એંગ્લેડ વ્યુ) અનુક્રમ.એલ્સેવિઅર.
પરંપરાગત સ્થિર સંસ્કૃતિની પરિસ્થિતિઓ હેઠળ સમાન કોષો (Caco-2 અથવા આંતરડાના ઓર્ગેનોઇડ ઉપકલા કોષો) ને દ્વિ-પરિમાણીય મોનોલેયરમાં સંવર્ધન કરીને નિયંત્રણો તૈયાર કરી શકાય છે. નોંધનીય છે કે, માઇક્રોચેનલની મર્યાદિત વોલ્યુમ ક્ષમતા (એટલે ​​​​કે ~4 µL) ને કારણે પોષક તત્ત્વોની અવક્ષય થઈ શકે છે. બેસોલેટરલ ફ્લો લાગુ કર્યા પછી પણ સરખામણી કરી શકાય છે.
સોફ્ટ લિથોગ્રાફી પ્રક્રિયા સ્વચ્છ રૂમમાં થવી જોઈએ. ચિપ (ઉપલા અને નીચલા સ્તરો અને પટલ) અને હાઇબ્રિડ ચિપ્સ પરના દરેક સ્તરો માટે, અલગ-અલગ સિલિકોન વેફર્સ પર અલગ-અલગ ફોટોમાસ્કનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો અને બનાવટ કરવામાં આવ્યો હતો કારણ કે માઇક્રોચેનલની ઊંચાઈઓ અલગ હતી. ઉપરના અને નીચલા સ્તરોની લક્ષિત ઊંચાઈ g50µ0p0µ0p0µ0p microchannels પર છે. m, અનુક્રમે. હાઇબ્રિડ ચિપની ચેનલ લક્ષ્ય ઊંચાઈ 200 µm છે.
એસીટોનવાળી થાળીમાં 3-ઇંચની સિલિકોન વેફર મૂકો. પ્લેટને 30 સેકન્ડ માટે હળવેથી ફેરવો, પછી વેફરને હવામાં સૂકવી દો. વેફરને IPA સાથે પ્લેટમાં સ્થાનાંતરિત કરો, પછી સાફ કરવા માટે પ્લેટને 30 સેકન્ડ સુધી સ્પિન કરો.
પિરાન્હા સોલ્યુશન (હાઈડ્રોજન પેરોક્સાઇડ અને કેન્દ્રિત સલ્ફ્યુરિક એસિડનું મિશ્રણ, 1:3 (વોલ/વોલ)) નો ઉપયોગ વૈકલ્પિક રીતે સિલિકોન વેફર સપાટી પરથી કાર્બનિક અવશેષોને મહત્તમ રીતે દૂર કરવા માટે કરી શકાય છે.
પિરાન્હા સોલ્યુશન અત્યંત ક્ષતિગ્રસ્ત છે અને ગરમી ઉત્પન્ન કરે છે. વધારાની સલામતી સાવચેતીઓ જરૂરી છે. કચરાના નિકાલ માટે, સોલ્યુશનને ઠંડુ થવા દો અને સ્વચ્છ, સૂકા કચરાના કન્ટેનરમાં સ્થાનાંતરિત કરો. ગૌણ કન્ટેનરનો ઉપયોગ કરો અને કચરાના કન્ટેનરને યોગ્ય રીતે લેબલ કરો. વધુ વિગતવાર પ્રક્રિયાઓ માટે કૃપા કરીને સુવિધાના સલામતી માર્ગદર્શિકાને અનુસરો.
વેફરને 200 °C હોટ પ્લેટમાં 10 મિનિટ માટે મૂકીને ડીહાઇડ્રેટ કરો. ડિહાઇડ્રેશન પછી, વેફરને ઠંડુ કરવા માટે હવામાં પાંચ વખત હલાવવામાં આવ્યું હતું.
સાફ કરેલ સિલિકોન વેફરની મધ્યમાં ~10 ગ્રામ ફોટોરેસિસ્ટ SU-8 2100 રેડો. વેફર પર ફોટોરેસિસ્ટને સરખી રીતે ફેલાવવા માટે ટ્વીઝરનો ઉપયોગ કરો. ફોટોરેસિસ્ટને ઓછી ચીકણી અને ફેલાવવામાં સરળ બનાવવા માટે વેફરને ક્યારેક-ક્યારેક 65 ડિગ્રી સેલ્સિયસ હોટ પ્લેટ પર મૂકો. હોટલેટને સીધું ન મૂકો.
SU-8 સ્પિન કોટિંગ ચલાવીને વેફર પર સમાનરૂપે વિતરિત કરવામાં આવ્યું હતું. 100 rpm/s ના પ્રવેગક પર 500 rpm પર પ્રચાર કરવા માટે 5-10 s માટે SU-8 નું ઇનકમિંગ રોટેશન પ્રોગ્રામ કરો. 200 µm જાડાઈ પેટર્નિંગ માટે મુખ્ય સ્પિન સેટ કરો અથવા 1µ0m5 જાડાઈ, 1µm5 કિંગ પર ચિપ પરના આંતરડાના ઉપલા સ્તર માટે 500 µm ઊંચાઈ; નીચે "જટિલ પગલાં" જુઓ) 1,200 rpm પર 300 rpm/s 30 સેકન્ડના પ્રવેગ પર સેટ કરો.
મુખ્ય સ્પિન ઝડપ સિલિકોન વેફર પર SU-8 પેટર્નની લક્ષ્ય જાડાઈ અનુસાર ગોઠવી શકાય છે.
ચિપ પરના આંતરડાના ઉપલા સ્તર માટે 500 µm ઊંચાઈની SU-8 પેટર્ન બનાવવા માટે, આ બૉક્સના સ્પિન કોટિંગ અને સોફ્ટ બેક સ્ટેપ્સ (પગલાં 7 અને 8) ક્રમિક રીતે પુનરાવર્તિત કરવામાં આવ્યાં હતાં (પગલું 9 જુઓ) જેથી 250 µm A ના બે સ્તરો ઉત્પન્ન થાય, જે SU-8 ના એક જાડા સ્તરને અને SU-8 બૉક્સના એક જાડા સ્તરમાં જોડી શકાય. , એક સ્તર 500 µm ઊંચું બનાવે છે.
SU-8 કોટેડ વેફર્સને 5 મિનિટ માટે 65 °C પર હોટ પ્લેટ પર કાળજીપૂર્વક મૂકીને નરમ બેક કરો, પછી સેટિંગને 95 °C પર સ્વિચ કરો અને વધારાના 40 મિનિટ માટે સેવન કરો.
ઉપલા માઇક્રોચેનલમાં SU-8 પેટર્નની 500 μm ઊંચાઈ હાંસલ કરવા માટે, બે 250 μm જાડા SU-8 સ્તરો બનાવવા માટે પગલાં 7 અને 8નું પુનરાવર્તન કરો.
યુવી માસ્ક એલાઈનરનો ઉપયોગ કરીને, વેફરના એક્સપોઝર સમયની ગણતરી કરવા ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર લેમ્પ ટેસ્ટ કરો.(એક્સપોઝર ટાઈમ, એમએસ) = (એક્સપોઝર ડોઝ, mJ/cm2)/(લેમ્પ પાવર, mW/cm2).
એક્સપોઝરનો સમય નક્કી કર્યા પછી, ફોટોમાસ્કને યુવી માસ્ક એલાઈનરના માસ્ક ધારક પર મૂકો અને ફોટોમાસ્કને SU-8 કોટેડ વેફર પર મૂકો.
ફોટોમાસ્કની પ્રિન્ટેડ સપાટીને સીલીકોન વેફરની SU-8 કોટેડ બાજુ પર સીધું મૂકો જેથી કરીને UV ફેલાવો ઓછો થાય.
પૂર્વનિર્ધારિત એક્સપોઝર સમય માટે SU-8 કોટેડ વેફર અને ફોટોમાસ્કને યુવી લાઇટના 260 mJ/cm2 પર ઊભી રીતે એક્સપોઝ કરો (આ બોક્સનું પગલું 10 જુઓ).
યુવી એક્સપોઝર પછી, SU-8-કોટેડ સિલિકોન વેફરને 200 μm ની ઊંચાઈ સાથે પેટર્ન બનાવવા માટે દરેક હોટ પ્લેટ પર 5 મિનિટ માટે 65°C અને 95°C પર 15 મિનિટ માટે શેકવામાં આવી હતી. 200 μm ની ઊંચાઈ સાથે 95 °C થી 30 મિનિટ સુધી 5µ00 મિનિટની પેટર્ન સાથે પકવવા પછીનો સમય વધારવો.
ડેવલપરને કાચની ડીશમાં રેડવામાં આવે છે, અને બેકડ વેફરને ડીશમાં મૂકવામાં આવે છે. ગ્લાસ પ્લેટના કદના આધારે SU-8 ડેવલપરનું વોલ્યુમ બદલાઈ શકે છે. SU-8 ને સંપૂર્ણપણે દૂર કરવા માટે પૂરતા SU-8 ડેવલપરનો ઉપયોગ કરવાનું સુનિશ્ચિત કરો. ઉદાહરણ તરીકે, જ્યારે 150 mm વ્યાસની કાચની ડીશનો ઉપયોગ કરો. પ્રસંગોપાત હળવા પરિભ્રમણ સાથે 25 મિનિટ માટે ઘાટ.
વિકસિત મોલ્ડને ~10 એમએલ તાજા ડેવલપર સાથે વીંછળવું અને ત્યારબાદ આઇપીએ દ્વારા પીપેટનો ઉપયોગ કરીને ઉકેલનો છંટકાવ કરવો.
વેફરને પ્લાઝ્મા ક્લીનરમાં મૂકો અને 1.5 મિનિટ માટે ઓક્સિજન પ્લાઝ્મા (વાતાવરણ ગેસ, લક્ષ્ય દબાણ 1 × 10−5 ટોર, પાવર 125 ડબ્લ્યુ) ના સંપર્કમાં રાખો.
વેફરને વેક્યૂમ ડેસીકેટરમાં કાચની સ્લાઈડ સાથે અંદર મૂકો. વેફર અને સ્લાઈડ્સ બાજુમાં મૂકી શકાય છે. જો વેક્યૂમ ડેસીકેટરને પ્લેટ દ્વારા અનેક સ્તરોમાં વિભાજિત કરવામાં આવે, તો સ્લાઈડ્સને નીચલા ચેમ્બરમાં અને વેફર્સને ઉપલા ચેમ્બરમાં મૂકો. કાચની સ્લાઇડ પર fluorooctyl) સિલેન સોલ્યુશન અને સિલેનાઇઝેશન માટે વેક્યૂમ લગાવો.
37°C પાણીના સ્નાનમાં સ્થિર Caco-2 કોષોની એક શીશી પીગળી દો, પછી પીગળેલા કોષોને T75 ફ્લાસ્કમાં સ્થાનાંતરિત કરો જેમાં 37°C પ્રી-વોર્મ્ડ Caco-2 માધ્યમનું 15 mL હોય.
Caco-2 કોષોને ~90% સંગમ પર પસાર કરવા માટે, પ્રથમ ગરમ Caco-2 માધ્યમ, PBS, અને 0.25% ટ્રિપ્સિન/1 mM EDTA 37°C પાણીના સ્નાનમાં.
શૂન્યાવકાશ એસ્પિરેશન દ્વારા માધ્યમને એસ્પિરેટ કરો. વેક્યૂમ એસ્પિરેશનને પુનરાવર્તિત કરીને અને તાજા પીબીએસ ઉમેરીને 5 એમએલ ગરમ પીબીએસથી કોષોને બે વાર ધોઈ લો.