Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર.તમે મર્યાદિત CSS સપોર્ટ સાથે બ્રાઉઝર સંસ્કરણનો ઉપયોગ કરી રહ્યાં છો.શ્રેષ્ઠ અનુભવ માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે અપડેટ કરેલ બ્રાઉઝરનો ઉપયોગ કરો (અથવા Internet Explorer માં સુસંગતતા મોડને અક્ષમ કરો).વધુમાં, ચાલુ સમર્થનની ખાતરી કરવા માટે, અમે શૈલીઓ અને JavaScript વિના સાઇટ બતાવીએ છીએ.
એક સાથે ત્રણ સ્લાઇડ્સનું કેરોયુઝલ પ્રદર્શિત કરે છે.એક સમયે ત્રણ સ્લાઇડ્સમાંથી આગળ વધવા માટે પાછલા અને આગલા બટનોનો ઉપયોગ કરો અથવા એક સમયે ત્રણ સ્લાઇડ્સમાંથી આગળ વધવા માટે અંતે સ્લાઇડર બટનનો ઉપયોગ કરો.
રક્ત-મગજ અવરોધ અને રક્ત-મગજ અવરોધ બાયોથેરાપ્યુટિક એજન્ટોને કેન્દ્રીય ચેતાતંત્રમાં તેમના લક્ષ્યો સુધી પહોંચતા અટકાવે છે, ત્યાં ન્યુરોલોજીકલ રોગોની અસરકારક સારવારમાં અવરોધે છે.વિવોમાં નવલકથા મગજ ટ્રાન્સપોર્ટર્સ શોધવા માટે, અમે T7 ફેજ પેપ્ટાઇડ લાઇબ્રેરી રજૂ કરી અને ઉંદરોના કેન્યુલેટેડ કોન્શિયસ લાર્જ પૂલ મોડલનો ઉપયોગ કરીને સીરીયલ રીતે લોહી અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી (CSF) એકત્રિત કર્યું.પસંદગીના ચાર રાઉન્ડ પછી CSF માં ચોક્કસ ફેજ ક્લોન્સ અત્યંત સમૃદ્ધ થયા હતા.વ્યક્તિગત ઉમેદવાર પેપ્ટાઇડ્સના પરીક્ષણથી CSF માં 1000-ગણાથી વધુ સંવર્ધન જણાયું છે.ઓળખાયેલ નવલકથા ટ્રાન્ઝિટ પેપ્ટાઇડ સાથે જોડાયેલા BACE1 પેપ્ટાઇડ અવરોધકનો ઉપયોગ કરીને મગજમાં પેપ્ટાઇડ-મધ્યસ્થી ડિલિવરીની બાયોએક્ટિવિટી સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં amyloid-β ના સ્તરમાં 40% ઘટાડા દ્વારા પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી.આ પરિણામો સૂચવે છે કે વિવો ફેજ પસંદગી પદ્ધતિઓ દ્વારા ઓળખવામાં આવેલા પેપ્ટાઈડ્સ રોગનિવારક અસર સાથે મગજમાં મેક્રોમોલેક્યુલ્સના પ્રણાલીગત વિતરણ માટે ઉપયોગી વાહનો હોઈ શકે છે.
સેન્ટ્રલ નર્વસ સિસ્ટમ (CNS) લક્ષિત ઉપચાર સંશોધન મોટાભાગે ઑપ્ટિમાઇઝ દવાઓ અને એજન્ટોને ઓળખવા પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કરે છે જે CNS- લક્ષ્યીકરણ ગુણધર્મોને પ્રદર્શિત કરે છે, મગજમાં સક્રિય દવા પહોંચાડતી પદ્ધતિઓ શોધવામાં ઓછા પ્રયત્નો સાથે.દવાની ડિલિવરી, ખાસ કરીને મોટા પરમાણુઓ, આધુનિક ન્યુરોસાયન્સ ડ્રગ ડેવલપમેન્ટનો એક અભિન્ન ભાગ હોવાથી આ હવે બદલાવાનું શરૂ થઈ રહ્યું છે.સેન્ટ્રલ નર્વસ સિસ્ટમનું વાતાવરણ સેરેબ્રોવેસ્ક્યુલર બેરિયર સિસ્ટમ દ્વારા સારી રીતે સુરક્ષિત છે, જેમાં બ્લડ-બ્રેઈન બેરિયર (BBB) ​​અને બ્લડ-બ્રેઈન બેરિયર (BCBB)1નો સમાવેશ થાય છે, જે મગજમાં દવાઓ પહોંચાડવાનું પડકારજનક બનાવે છે.એવો અંદાજ છે કે લગભગ તમામ મોટા પરમાણુ દવાઓ અને 98% થી વધુ નાના પરમાણુ દવાઓ મગજમાંથી દૂર કરવામાં આવે છે3.તેથી જ મગજની નવી પરિવહન પ્રણાલીઓને ઓળખવી ખૂબ જ મહત્વપૂર્ણ છે જે CNS 4,5 ને રોગનિવારક દવાઓની કાર્યક્ષમ અને ચોક્કસ ડિલિવરી પૂરી પાડે છે.જો કે, BBB અને BCSFB દવાની ડિલિવરી માટે એક ઉત્તમ તક પણ રજૂ કરે છે કારણ કે તેઓ મગજના તમામ માળખામાં પ્રવેશ કરે છે અને તેના વ્યાપક વેસ્ક્યુલેચર દ્વારા પ્રવેશ કરે છે.આમ, મગજમાં પહોંચાડવાની બિન-આક્રમક પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરવાના વર્તમાન પ્રયાસો મોટાભાગે અંતર્જાત BBB6 રીસેપ્ટરનો ઉપયોગ કરીને રીસેપ્ટર-મીડિયેટેડ ટ્રાન્સપોર્ટ (PMT) ની પદ્ધતિ પર આધારિત છે.ટ્રાન્સફરિન રીસેપ્ટર પાથવે 7,8 નો ઉપયોગ કરીને તાજેતરની કી એડવાન્સિસ હોવા છતાં, સુધારેલ ગુણધર્મો સાથે નવી ડિલિવરી સિસ્ટમનો વધુ વિકાસ જરૂરી છે.આ માટે, અમારો ધ્યેય CSF પરિવહનની મધ્યસ્થી કરવામાં સક્ષમ પેપ્ટાઇડ્સને ઓળખવાનો હતો, કારણ કે તેનો ઉપયોગ સૈદ્ધાંતિક રીતે CNS સુધી મેક્રોમોલેક્યુલ્સ પહોંચાડવા અથવા નવા રીસેપ્ટર પાથવે ખોલવા માટે થઈ શકે છે.ખાસ કરીને, સેરેબ્રોવેસ્ક્યુલર સિસ્ટમના ચોક્કસ રીસેપ્ટર્સ અને ટ્રાન્સપોર્ટર્સ (BBB અને BSCFB) બાયોથેરાપ્યુટિક દવાઓના સક્રિય અને ચોક્કસ વિતરણ માટે સંભવિત લક્ષ્યો તરીકે સેવા આપી શકે છે.સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડ (CSF) એ કોરોઇડ પ્લેક્સસ (CS) નું સિક્રેટરી ઉત્પાદન છે અને સબરાકનોઇડ સ્પેસ અને વેન્ટ્રિક્યુલર સ્પેસ4 દ્વારા મગજના ઇન્ટર્સ્ટિશલ પ્રવાહી સાથે સીધા સંપર્કમાં છે.તાજેતરમાં એવું દર્શાવવામાં આવ્યું છે કે સબરાક્નોઇડ સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી મગજના ઇન્ટરસ્ટિટિયમમાં વધુ પડતું ફેલાય છે9.અમે આ સબરાકનોઇડ ઇનફ્લો ટ્રેક્ટનો ઉપયોગ કરીને અથવા સીધા BBB દ્વારા પેરેન્ચાઇમલ જગ્યાને ઍક્સેસ કરવાની આશા રાખીએ છીએ.આ હાંસલ કરવા માટે, અમે વિવો ફેજ પસંદગીની વ્યૂહરચનાનો અમલ કર્યો છે જે આદર્શ રીતે આ બે અલગ-અલગ માર્ગોમાંથી કોઈપણ એક દ્વારા પરિવહન કરાયેલા પેપ્ટાઈડ્સને ઓળખે છે.
અમે હવે ઉચ્ચતમ લાઇબ્રેરી વિવિધતા સાથે પ્રારંભિક પસંદગી રાઉન્ડને મોનિટર કરવા માટે ઉચ્ચ થ્રુપુટ સિક્વન્સિંગ (HTS) સાથે CSF સેમ્પલિંગ સાથે વિવો ફેજ ડિસ્પ્લે સ્ક્રીનીંગ પદ્ધતિમાં અનુક્રમનું વર્ણન કરીએ છીએ.રક્ત દૂષિતતાને ટાળવા માટે સભાન ઉંદરો પર કાયમી રીતે રોપાયેલા મોટા સિસ્ટર્ના (CM) કેન્યુલા સાથે સ્ક્રીનીંગ કરવામાં આવી હતી.અગત્યની રીતે, આ અભિગમ મગજ-લક્ષ્ય અને પેપ્ટાઇડ્સ બંનેને સેરેબ્રોવેસ્ક્યુલર અવરોધમાં પરિવહન પ્રવૃત્તિ સાથે પસંદ કરે છે.અમે T7 ફેજીસનો ઉપયોગ તેમના નાના કદ (~60 nm)10ને કારણે કર્યો અને સૂચવ્યું કે તેઓ વેસિકલ્સના પરિવહન માટે યોગ્ય છે જે એન્ડોથેલિયલ અને/અથવા ઉપકલા-મેડુલા અવરોધને ટ્રાન્સસેલ્યુલર ક્રોસિંગની મંજૂરી આપે છે.પૅનિંગના ચાર રાઉન્ડ પછી, વિવો CSF સંવર્ધન અને સેરેબ્રલ માઇક્રોવેસલ એસોસિએશનમાં મજબૂત દર્શાવતા ફેજ વસ્તીને અલગ કરવામાં આવી હતી.મહત્ત્વપૂર્ણ રીતે, અમે એ દર્શાવીને અમારા તારણોની પુષ્ટિ કરવામાં સક્ષમ હતા કે પસંદગીના અને રાસાયણિક રીતે સંશ્લેષિત શ્રેષ્ઠ ઉમેદવાર પેપ્ટાઇડ્સ પ્રોટીન કાર્ગોને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં પરિવહન કરવામાં સક્ષમ છે.પ્રથમ, CNS ની ફાર્માકોડાયનેમિક અસરો BACE1 પેપ્ટાઈડના અવરોધક સાથે અગ્રણી ટ્રાન્ઝિટ પેપ્ટાઈડને જોડીને સ્થાપિત કરવામાં આવી હતી.વિવો ફંક્શનલ સ્ક્રિનિંગ વ્યૂહરચનાઓ અસરકારક પ્રોટીન કાર્ગો કેરિયર્સ તરીકે નવલકથા મગજ પરિવહન પેપ્ટાઈડ્સને ઓળખી શકે છે તે દર્શાવવા ઉપરાંત, અમે અપેક્ષા રાખીએ છીએ કે સમાન કાર્યાત્મક પસંદગીના અભિગમો નવલકથા મગજ પરિવહન માર્ગોને ઓળખવામાં પણ મહત્વપૂર્ણ બનશે.
પ્લેક-ફોર્મિંગ યુનિટ્સ (PFU) ના આધારે, ફેજ પેકેજિંગ સ્ટેપ પછી, લગભગ 109 ની વિવિધતા સાથે રેન્ડમ 12-મેર રેખીય T7 ફેજ પેપ્ટાઇડ્સની લાઇબ્રેરી ડિઝાઇન અને બનાવવામાં આવી હતી (જુઓ સામગ્રી અને પદ્ધતિઓ).એ નોંધવું અગત્યનું છે કે અમે વિવો પેનિંગ પહેલા આ લાઇબ્રેરીનું કાળજીપૂર્વક વિશ્લેષણ કર્યું હતું.સંશોધિત પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરીને ફેજ લાઇબ્રેરી નમૂનાઓનું PCR એમ્પ્લીફિકેશન એમ્પ્લીકોન્સ જનરેટ કરે છે જે સીધા HTS (પૂરક ફિગ. 1a) ને લાગુ પડતા હતા.a) HTS11 સિક્વન્સિંગ ભૂલો, b) પ્રાઇમરની ગુણવત્તા પર અસર (NNK)1-12, અને c) સ્ટેન્ડબાય લાઇબ્રેરીમાં વાઇલ્ડ-ટાઇપ (wt) ફેજ (સ્કેલેટન ઇન્સર્ટ્સ) ની હાજરીને કારણે, ક્રમ ફિલ્ટરિંગ પ્રક્રિયા માત્ર ચકાસાયેલ પ્લીગઅપ ક્રમ માહિતી (FigSb) મેળવવા માટે અમલમાં મૂકવામાં આવી હતી.આ ફિલ્ટર પગલાં તમામ HTS સિક્વન્સિંગ લાઇબ્રેરીઓને લાગુ પડે છે.પ્રમાણભૂત પુસ્તકાલય માટે, કુલ 233,868 વાંચન પ્રાપ્ત થયું હતું, જેમાંથી 39% ફિલ્ટર માપદંડોમાંથી પસાર થયા હતા અને તેનો ઉપયોગ પુસ્તકાલય વિશ્લેષણ અને અનુગામી રાઉન્ડ માટે પસંદગી માટે કરવામાં આવ્યો હતો (પૂરક આકૃતિ 1c–e).રીડ્સ મુખ્યત્વે 36 ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ (પૂરક ફિગ. 1c) પર ટોચ સાથે લંબાઈમાં 3 બેઝ જોડીના ગુણાકાર હતા, જે લાઇબ્રેરી ડિઝાઇન (NNK) 1-12 ની પુષ્ટિ કરે છે.નોંધનીય રીતે, લાઇબ્રેરીના લગભગ 11% સભ્યોમાં 12-પરિમાણીય વાઇલ્ડ-ટાઇપ (wt) બેકબોન PAGISRELVDKL ઇન્સર્ટ હોય છે, અને લગભગ અડધા સિક્વન્સ (49%)માં ઇન્સર્ટેશન અથવા ડિલીટ હોય છે.લાઇબ્રેરી લાઇબ્રેરીના HTS એ લાઇબ્રેરીમાં પેપ્ટાઇડ્સની ઉચ્ચ વિવિધતાની પુષ્ટિ કરી: 81% થી વધુ પેપ્ટાઇડ સિક્વન્સ માત્ર એક જ વાર મળી આવ્યા હતા અને માત્ર 1.5% ≥4 નકલોમાં જોવા મળ્યા હતા (પૂરક ફિગ. 2a).ભંડારમાં તમામ 12 સ્થાનો પર એમિનો એસિડ (એએ) ની ફ્રીક્વન્સી ડિજનરેટ NKK ભંડાર (પૂરક ફિગ. 2b) દ્વારા જનરેટ કરાયેલ કોડનની સંખ્યા માટે અપેક્ષિત આવર્તન સાથે સારી રીતે સંબંધ ધરાવે છે.આ ઇન્સર્ટ્સ દ્વારા એન્કોડ કરાયેલ aa અવશેષોની અવલોકન કરેલ આવર્તન ગણતરી કરેલ આવર્તન (r = 0.893) (પૂરક ફિગ. 2c) સાથે સારી રીતે સંબંધિત છે.ઇન્જેક્શન માટે ફેજ લાઇબ્રેરીઓની તૈયારીમાં એમ્પ્લીફિકેશન અને એન્ડોટોક્સિન દૂર કરવાના પગલાંનો સમાવેશ થાય છે.આ અગાઉ 12,13 ફેજ લાઇબ્રેરીઓની વિવિધતાને સંભવિતપણે ઘટાડવા માટે દર્શાવવામાં આવ્યું છે.તેથી, અમે એક પ્લેટ-એમ્પ્લીફાઇડ ફેજ લાઇબ્રેરીને અનુક્રમિત કરી જે એન્ડોટોક્સિન દૂર કરવામાં આવી હતી અને AA ની આવર્તનનો અંદાજ કાઢવા માટે તેની મૂળ લાઇબ્રેરી સાથે સરખામણી કરી.મૂળ પૂલ અને એમ્પ્લીફાઇડ અને પ્યુરિફાઇડ પૂલ (પૂરક ફિગ. 2d) વચ્ચે મજબૂત સહસંબંધ (r = 0.995) જોવા મળ્યો હતો, જે દર્શાવે છે કે T7 ફેજનો ઉપયોગ કરીને પ્લેટો પર એમ્પ્લીફાઇડ કરાયેલા ક્લોન્સ વચ્ચેની સ્પર્ધા મોટા પક્ષપાતનું કારણ નથી.આ સરખામણી દરેક લાઇબ્રેરીમાં ટ્રિપેપ્ટાઇડ મોટિફ્સની આવર્તન પર આધારિત છે, કારણ કે લાઇબ્રેરીઓની વિવિધતા (~109) HTS સાથે પણ સંપૂર્ણપણે કેપ્ચર કરી શકાતી નથી.દરેક પોઝિશન પર aa ના આવર્તન વિશ્લેષણે દાખલ કરેલ ભંડારની છેલ્લી ત્રણ સ્થિતિઓમાં એક નાની સ્થિતિ-આધારિત પૂર્વગ્રહ જાહેર કર્યો (પૂરક ફિગ. 2e).નિષ્કર્ષમાં, અમે નિષ્કર્ષ પર આવ્યા કે લાઇબ્રેરીની ગુણવત્તા અને વિવિધતા સ્વીકાર્ય હતી અને પસંદગીના કેટલાક રાઉન્ડ વચ્ચે ફેજ લાઇબ્રેરીઓના એમ્પ્લીફિકેશન અને તૈયારીને કારણે વિવિધતામાં માત્ર નાના ફેરફારો જોવા મળ્યા હતા.
BBB અને/અથવા BCSFB (ફિગ. 1a-b) દ્વારા નસમાં ઇન્જેક્ટ કરાયેલ T7 ફેજની ઓળખને સરળ બનાવવા માટે સભાન ઉંદરોના સીએમમાં ​​શસ્ત્રક્રિયા દ્વારા કેન્યુલાનું પ્રત્યારોપણ કરીને સીરીયલ સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડ સેમ્પલિંગ કરી શકાય છે.અમે વિવો પસંદગીના પ્રથમ ત્રણ રાઉન્ડમાં બે સ્વતંત્ર પસંદગીના આર્મ્સ (આર્મ્સ A અને B) નો ઉપયોગ કર્યો (ફિગ. 1c).અમે પસંદગીના પ્રથમ ત્રણ રાઉન્ડમાં રજૂ કરાયેલા ફેજની કુલ માત્રામાં ઘટાડો કરીને પસંદગીની કડકતામાં ધીમે ધીમે વધારો કર્યો.પૅનિંગના ચોથા રાઉન્ડ માટે, અમે શાખા A અને B ના નમૂનાઓ ભેગા કર્યા અને ત્રણ વધારાની સ્વતંત્ર પસંદગીઓ કરી.આ મોડેલમાં T7 ફેજ કણોના ઇન વિવો ગુણધર્મોનો અભ્યાસ કરવા માટે, વાઇલ્ડ-ટાઇપ ફેજ (PAGISRELVDKL માસ્ટર ઇન્સર્ટ)ને પૂંછડીની નસ દ્વારા ઉંદરોમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યું હતું.સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડ અને લોહીમાંથી અલગ-અલગ સમયે ફેજીસની પુનઃપ્રાપ્તિ દર્શાવે છે કે પ્રમાણમાં નાના T7 આઇકોસહેડ્રલ ફેજીસમાં લોહીના કમ્પાર્ટમેન્ટમાંથી ઝડપી પ્રારંભિક મંજૂરીનો તબક્કો હતો (પૂરક ફિગ. 3).સંચાલિત ટાઇટર્સ અને ઉંદરોના લોહીના જથ્થાના આધારે, અમે ગણતરી કરી કે માત્ર આશરે 1% wt.ઇન્ટ્રાવેનસ ઇન્જેક્શન પછી 10 મિનિટ પછી સંચાલિત ડોઝમાંથી ફેજ લોહીમાં મળી આવ્યું હતું.આ પ્રારંભિક ઝડપી ઘટાડા પછી, ધીમી પ્રાથમિક મંજૂરી 27.7 મિનિટની અર્ધ-જીવન સાથે માપવામાં આવી હતી.મહત્વની વાત એ છે કે, CSF કમ્પાર્ટમેન્ટમાંથી માત્ર બહુ ઓછા ફેજીસ પુનઃપ્રાપ્ત કરવામાં આવ્યા હતા, જે CSF કમ્પાર્ટમેન્ટ (પૂરક ફિગ. 3) માં જંગલી પ્રકારના ફેજ સ્થળાંતર માટે ઓછી પૃષ્ઠભૂમિ દર્શાવે છે.સરેરાશ, લોહીમાં T7 ફેજના માત્ર 1 x 10-3% ટાઇટર્સ અને 4 x 10-8% પ્રારંભિક ઇન્ફ્યુઝ્ડ ફેજીસ સમગ્ર સેમ્પલિંગ સમયગાળા (0-250 મિનિટ) દરમિયાન સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં મળી આવ્યા હતા.નોંધનીય રીતે, સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં જંગલી પ્રકારના ફેજનું અર્ધ-જીવન (25.7 મિનિટ) લોહીમાં જોવા મળતા સમાન હતું.આ ડેટા દર્શાવે છે કે સીએમ-કેન્યુલેટેડ ઉંદરોમાં CSF કમ્પાર્ટમેન્ટને લોહીથી અલગ કરતો અવરોધ અકબંધ છે, જે ક્લોન્સને ઓળખવા માટે ફેજ લાઇબ્રેરીઓની વિવો પસંદગીને મંજૂરી આપે છે જે લોહીમાંથી CSF કમ્પાર્ટમેન્ટમાં સરળતાથી પરિવહન થાય છે.
(a) મોટા પૂલમાંથી સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડ (CSF) ને ફરીથી સેમ્પલિંગ કરવા માટેની પદ્ધતિ સેટ કરવી.(b) સેન્ટ્રલ નર્વસ સિસ્ટમ (CNS) અવરોધનું સેલ્યુલર સ્થાન અને રક્ત-મગજ અવરોધ (BBB) ​​અને રક્ત-મગજ અવરોધને પાર કરતા પેપ્ટાઇડ્સને ઓળખવા માટે વપરાતી પસંદગીની વ્યૂહરચના દર્શાવતો આકૃતિ.(c) વિવો ફેજ ડિસ્પ્લે સ્ક્રીનીંગ ફ્લોચાર્ટમાં.પસંદગીના દરેક રાઉન્ડમાં, ફેજીસ (તીરોની અંદર પ્રાણી ઓળખકર્તા) નસમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા.પસંદગીના ચોથા રાઉન્ડ સુધી બે સ્વતંત્ર વૈકલ્પિક શાખાઓ (A, B) અલગ રાખવામાં આવે છે.પસંદગીના રાઉન્ડ 3 અને 4 માટે, CSF માંથી કાઢવામાં આવેલ દરેક ફેજ ક્લોન મેન્યુઅલી ક્રમબદ્ધ કરવામાં આવ્યા હતા.(d) T7 પેપ્ટાઇડ લાઇબ્રેરી (2 x 1012 ફેજીસ/પ્રાણી) ના ઇન્ટ્રાવેનસ ઇન્જેક્શન પછી બે કેન્યુલેટેડ ઉંદરોમાં પસંદગીના પ્રથમ રાઉન્ડ દરમિયાન લોહી (લાલ વર્તુળો) અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી (લીલા ત્રિકોણ) થી અલગ કરાયેલા ફેજના ગતિશાસ્ત્ર.બ્લુ સ્ક્વેર લોહીમાં ફેજની સરેરાશ પ્રારંભિક સાંદ્રતા સૂચવે છે, ઇન્જેક્ટેડ ફેજના જથ્થામાંથી ગણતરી કરવામાં આવે છે, કુલ લોહીના જથ્થાને ધ્યાનમાં લેતા.કાળા ચોરસ રક્ત ફેજ સાંદ્રતામાંથી એક્સ્ટ્રાપોલેટેડ y રેખાના આંતરછેદના બિંદુને દર્શાવે છે.(e,f) પેપ્ટાઇડમાં જોવા મળતા તમામ સંભવિત ઓવરલેપિંગ ટ્રિપેપ્ટાઇડ મોટિફ્સની સંબંધિત આવર્તન અને વિતરણ પ્રસ્તુત કરો.1000 રીડિંગ્સમાં જોવા મળેલા ઉદ્દેશ્યની સંખ્યા બતાવવામાં આવી છે.નોંધપાત્ર રીતે (p <0.001) સમૃદ્ધ મોટિફ્સ લાલ બિંદુઓથી ચિહ્નિત થયેલ છે.(e) સહસંબંધ સ્કેટરપ્લોટ ઇન્જેક્ટેડ લાઇબ્રેરીના ટ્રિપેપ્ટાઇડ મોટિફની સંબંધિત આવર્તનની તુલના પ્રાણીઓ #1.1 અને #1.2 માંથી લોહીમાંથી મેળવેલા ફેજ સાથે કરે છે.(f) રક્ત અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં અલગ પડેલા પ્રાણી ફેજ ટ્રિપેપ્ટાઇડ મોટિફ્સ #1.1 અને #1.2ની સંબંધિત ફ્રીક્વન્સીઝની તુલના કરતો સહસંબંધ સ્કેટરપ્લોટ.(g, h) બંને પ્રાણીઓમાં વિવો પસંદગીના રાઉન્ડ પછી રક્તમાં સમૃદ્ધ થયેલ ફેજ (g) વિરુદ્ધ ઇન્જેક્ટેડ લાઇબ્રેરીઓ અને CSF (h) વિરુદ્ધ રક્તમાં સમૃદ્ધ ફેજની સિક્વન્સ ID રજૂઆત.એક-અક્ષરના કોડનું કદ સૂચવે છે કે તે સ્થાન પર તે એમિનો એસિડ કેટલી વાર થાય છે.લીલો = ધ્રુવીય, જાંબલી = તટસ્થ, વાદળી = મૂળભૂત, લાલ = એસિડિક અને કાળો = હાઇડ્રોફોબિક એમિનો એસિડ.આકૃતિ 1a, b એડ્યુઅર્ડ યુરિચ દ્વારા ડિઝાઇન અને ઉત્પાદિત કરવામાં આવી હતી.
અમે બે CM ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટ ઉંદરો (ક્લેડ્સ A અને B) માં ફેજ પેપ્ટાઇડ લાઇબ્રેરીનું ઇન્જેક્ટ કર્યું અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી અને રક્ત (આકૃતિ 1d) માંથી અલગ ફેજ.લાઇબ્રેરીની પ્રારંભિક ઝડપી મંજૂરી જંગલી પ્રકારના ફેજની તુલનામાં ઓછી ઉચ્ચારણ હતી.બંને પ્રાણીઓમાં ઇન્જેક્ટેડ લાઇબ્રેરીનું સરેરાશ અર્ધ જીવન 24.8 મિનિટ લોહીમાં હતું, જે જંગલી પ્રકારના ફેજ જેવું જ હતું અને CSFમાં 38.5 મિનિટ હતું.દરેક પ્રાણીમાંથી લોહી અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડ ફેજ નમૂનાઓ HTS ને આધિન હતા અને ટૂંકા ટ્રિપેપ્ટાઇડ મોટિફની હાજરી માટે તમામ ઓળખાયેલ પેપ્ટાઇડ્સનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.ટ્રિપેપ્ટાઇડ ઉદ્દેશો પસંદ કરવામાં આવ્યા હતા કારણ કે તેઓ બંધારણની રચના અને પેપ્ટાઇડ-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ14,15 માટે ન્યૂનતમ આધાર પૂરો પાડે છે.અમને ઇન્જેક્ટેડ ફેજ લાઇબ્રેરી અને બંને પ્રાણીઓના લોહીમાંથી કાઢવામાં આવેલા ક્લોન્સ વચ્ચેના ઉદ્દેશોના વિતરણમાં સારો સંબંધ જોવા મળ્યો (ફિગ. 1e).ડેટા સૂચવે છે કે લાઇબ્રેરીની રચના માત્ર લોહીના કમ્પાર્ટમેન્ટમાં નજીવી રીતે સમૃદ્ધ છે.Weblogo16 સોફ્ટવેરના અનુકૂલનનો ઉપયોગ કરીને દરેક સ્થાન પર એમિનો એસિડ ફ્રીક્વન્સીઝ અને સર્વસંમતિ સિક્વન્સનું વધુ વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.રસપ્રદ રીતે, અમને લોહીમાં ગ્લાયસીન અવશેષો (ફિગ. 1 જી) માં મજબૂત સંવર્ધન જોવા મળ્યું.જ્યારે CSF માંથી પસંદ કરાયેલા ક્લોન્સ સાથે લોહીની સરખામણી કરવામાં આવી હતી, ત્યારે મજબૂત પસંદગી અને કેટલાક ઉદ્દેશ્યની પસંદગીનું અવલોકન કરવામાં આવ્યું હતું (ફિગ. 1f), અને ચોક્કસ એમિનો એસિડ 12-સભ્ય (ફિગ. 1h) માં પૂર્વનિર્ધારિત સ્થાનો પર પ્રાધાન્યરૂપે હાજર હતા.નોંધપાત્ર રીતે, વ્યક્તિગત પ્રાણીઓ સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં નોંધપાત્ર રીતે અલગ હતા, જ્યારે બંને પ્રાણીઓમાં રક્ત ગ્લાયસીન સંવર્ધન જોવા મળ્યું હતું (પૂરક ફિગ. 4a–j).પ્રાણીઓ #1.1 અને #1.2 ના સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં ક્રમ ડેટાના કડક ફિલ્ટરિંગ પછી, કુલ 964 અને 420 અનન્ય 12-મેર પેપ્ટાઇડ્સ મેળવવામાં આવ્યા હતા (પૂરક ફિગ. 1d–e).આઇસોલેટેડ ફેજ ક્લોન્સ એમ્પ્લીફાઇડ કરવામાં આવ્યા હતા અને વિવો સિલેક્શનના બીજા રાઉન્ડને આધિન હતા.પસંદગીના બીજા રાઉન્ડમાંથી કાઢવામાં આવેલ ફેજ દરેક પ્રાણીમાં HTSને આધિન કરવામાં આવ્યા હતા અને તમામ ઓળખાયેલ પેપ્ટાઈડ્સનો ઉપયોગ ટ્રિપેપ્ટાઈડ મોટિફ્સ (ફિગ. 2a, b, ef) ની ઘટનાનું પૃથ્થકરણ કરવા માટે મોટિફ રેકગ્નિશન પ્રોગ્રામમાં ઇનપુટ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો.CSF માંથી પુનઃપ્રાપ્ત થયેલ ફેજના પ્રથમ ચક્રની તુલનામાં, અમે શાખા A અને B (ફિગ. 2) માં CSF માં ઘણા બધા ઉદ્દેશ્યની વધુ પસંદગી અને ડિસેલેક્શનનું અવલોકન કર્યું.એક નેટવર્ક આઇડેન્ટિફિકેશન એલ્ગોરિધમ એ નક્કી કરવા માટે લાગુ કરવામાં આવ્યું હતું કે શું તેઓ સુસંગત ક્રમની વિવિધ પેટર્નનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે.વૈકલ્પિક ક્લેડ A (ફિગ. 2c, d) અને ક્લેડ B (ફિગ. 2g, h) માં CSF દ્વારા પુનઃપ્રાપ્ત કરાયેલ 12-પરિમાણીય સિક્વન્સ વચ્ચે સ્પષ્ટ સમાનતા જોવા મળી હતી.દરેક બ્રાન્ચમાં એકત્રિત વિશ્લેષણમાં 12-મેર પેપ્ટાઈડ્સ (પૂરક ફિગ. 5c,d) માટે અલગ-અલગ પસંદગી પ્રોફાઇલ્સ અને પસંદગીના પ્રથમ રાઉન્ડની તુલનામાં પસંદગીના બીજા રાઉન્ડ પછી પૂલ કરેલા ક્લોન્સ માટે સમય જતાં CSF/બ્લડ ટાઇટર રેશિયોમાં વધારો (પૂરક ફિગ. 5e) જાહેર થયો.).
ઇન વિવો ફંક્શનલ ફેજ ડિસ્પ્લે સિલેક્શનના બે ક્રમિક રાઉન્ડ દ્વારા સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડમાં મોટિફ્સ અને પેપ્ટાઇડ્સનું સંવર્ધન.
દરેક પ્રાણી (પ્રાણીઓ #1.1 અને #1.2) ના પ્રથમ રાઉન્ડમાંથી પુનઃપ્રાપ્ત થયેલા તમામ સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડ ફેજને એકસાથે એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા, એમ્પ્લીફાઇડ કરવામાં આવ્યા હતા, એચટી-સિક્વન્સ્ડ અને ફરીથી ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા (2 x 1010 ફેજ/પ્રાણી) 2 SM કેન્યુલેટેડ ઉંદરો (#1.1 → #).2.1 અને 2.2, 1.2 → 2.3 અને 2.4).(a,b,e,f) સહસંબંધ સ્કેટરપ્લોટ્સ પ્રથમ અને બીજા પસંદગી રાઉન્ડમાં તમામ CSF-પ્રાપ્ત ફેજીસના ટ્રિપેપ્ટાઇડ મોટિફ્સની સંબંધિત આવર્તનની તુલના કરે છે.સાપેક્ષ આવર્તન અને તમામ સંભવિત ઓવરલેપિંગ ટ્રિપેપ્ટાઇડ્સનું પ્રતિનિધિત્વ કરતી રચનાઓનું વિતરણ બંને દિશાઓમાં પેપ્ટાઇડ્સમાં જોવા મળે છે.1000 રીડિંગ્સમાં જોવા મળેલા ઉદ્દેશ્યની સંખ્યા બતાવવામાં આવી છે.તુલનાત્મક લાઇબ્રેરીઓમાંથી એકમાં નોંધપાત્ર રીતે (p <0.001) પસંદ કરાયેલ અથવા બાકાત રાખવામાં આવેલા મોટિફ્સ લાલ ટપકાંથી પ્રકાશિત થાય છે.(c, d, g, h) વિવો પસંદગીમાં રાઉન્ડ 2 અને 1 પર આધારિત તમામ CSF-સમૃદ્ધ 12 એમિનો એસિડ લાંબા સિક્વન્સનું સિક્વન્સ લોગોનું પ્રતિનિધિત્વ.એક-અક્ષરના કોડનું કદ સૂચવે છે કે તે સ્થાન પર તે એમિનો એસિડ કેટલી વાર થાય છે.લોગોનું પ્રતિનિધિત્વ કરવા માટે, બે પસંદગીના રાઉન્ડ વચ્ચે વ્યક્તિગત પ્રાણીઓમાંથી કાઢવામાં આવેલા CSF સિક્વન્સની આવર્તનની સરખામણી કરવામાં આવે છે અને બીજા રાઉન્ડમાં સમૃદ્ધ સિક્વન્સ બતાવવામાં આવે છે: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 અને (h) #1.2–#2.(c, d) પ્રાણીઓમાં આપેલ સ્થાન પર સૌથી વધુ સમૃદ્ધ એમિનો એસિડ.2.1 અને નં.2.2 અથવા (જી, એચ) પ્રાણીઓમાં નં.2.3 અને નં.2.4 રંગમાં બતાવવામાં આવે છે.લીલો = ધ્રુવીય, જાંબલી = તટસ્થ, વાદળી = મૂળભૂત, લાલ = એસિડિક અને કાળો = હાઇડ્રોફોબિક એમિનો એસિડ.
પસંદગીના ત્રીજા રાઉન્ડ પછી, અમે 332 CSF-પુનઃરચિત ફેજ ક્લોન્સમાંથી 124 અનન્ય પેપ્ટાઈડ સિક્વન્સ (#3.1 અને #3.2) ઓળખ્યા જે બે પ્રાણીઓ (પૂરક ફિગ. 6a)થી અલગ છે.અનુક્રમ LGSVS (18.7%) માં સૌથી વધુ સંબંધિત પ્રમાણ હતું, ત્યારબાદ જંગલી પ્રકારના દાખલ PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), અને SARGSWREIVSLS (2.2%).અંતિમ ચોથા રાઉન્ડમાં, અમે ત્રણ અલગ-અલગ પ્રાણીઓ (ફિગ. 1c) માંથી સ્વતંત્ર રીતે પસંદ કરેલી બે શાખાઓ એકત્રિત કરી.CSF માંથી પુનઃપ્રાપ્ત કરાયેલા 925 અનુક્રમિત ફેજ ક્લોન્સમાંથી, ચોથા રાઉન્ડમાં અમને 64 અનન્ય પેપ્ટાઇડ સિક્વન્સ (પૂરક ફિગ. 6b) મળ્યા, જેમાંથી જંગલી પ્રકારના ફેજનું સંબંધિત પ્રમાણ ઘટીને 0.8% થયું.ચોથા રાઉન્ડમાં સૌથી સામાન્ય CSF ક્લોન્સ LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%), GRPQKINGARVC (3.6%).%)).NNK લાઇબ્રેરી ડિઝાઇન માટે ડિજનરેટ કોડન્સનો ઉપયોગ કરતી વખતે લાઇબ્રેરી પ્રાઇમરમાં ન્યુક્લિયોટાઇડ દાખલ/કાઢી નાખવા અથવા અકાળ સ્ટોપ કોડન્સને કારણે પસંદ કરેલ પેપ્ટાઇડ્સની લંબાઈની શ્રેણી છે.પ્રિમેચ્યોર સ્ટોપ કોડોન ટૂંકા પેપ્ટાઈડ્સ પેદા કરે છે અને પસંદ કરવામાં આવે છે કારણ કે તેમાં અનુકૂળ એએ મોટિફ હોય છે.સિન્થેટિક લાઇબ્રેરીઓના પ્રાઈમરમાં દાખલ/કાઢી નાખવાથી લાંબા સમય સુધી પેપ્ટાઈડ્સ પરિણમી શકે છે.આ ડિઝાઇન કરેલ સ્ટોપ કોડનને ફ્રેમની બહાર રાખે છે અને જ્યાં સુધી નવો સ્ટોપ કોડન ડાઉનસ્ટ્રીમ ન દેખાય ત્યાં સુધી તેને વાંચે છે.સામાન્ય રીતે, અમે નમૂનાના આઉટપુટ ડેટા સાથે ઇનપુટ ડેટાની સરખામણી કરીને તમામ ચાર પસંદગી રાઉન્ડ માટે સંવર્ધન પરિબળોની ગણતરી કરી છે.સ્ક્રીનીંગના પ્રથમ રાઉન્ડ માટે, અમે બિન-વિશિષ્ટ પૃષ્ઠભૂમિ સંદર્ભ તરીકે વાઇલ્ડ-ટાઇપ ફેજ ટાઇટર્સનો ઉપયોગ કર્યો.રસપ્રદ રીતે, પ્રથમ CSF ચક્રમાં નકારાત્મક ફેજની પસંદગી ખૂબ જ મજબૂત હતી, પરંતુ લોહીમાં નહીં (ફિગ. 3a), જે CSF કમ્પાર્ટમેન્ટમાં પેપ્ટાઈડ લાઇબ્રેરીના મોટાભાગના સભ્યોના નિષ્ક્રિય પ્રસારની ઓછી સંભાવનાને કારણે હોઈ શકે છે અથવા સંબંધિત ફેજીસ બેક્ટેરિયો કરતાં લોહીના પ્રવાહમાંથી વધુ કાર્યક્ષમ રીતે જાળવી રાખવામાં આવે છે અથવા દૂર કરવામાં આવે છે.જો કે, પેનિંગના બીજા રાઉન્ડમાં, બંને ક્લેડમાં CSF માં ફેજીસની મજબૂત પસંદગી જોવા મળી હતી, જે સૂચવે છે કે અગાઉના રાઉન્ડ પેપ્ટાઈડ્સ દર્શાવતા ફેજીસમાં સમૃદ્ધ હતા જે CSF શોષણને પ્રોત્સાહન આપે છે (ફિગ. 3a).ફરીથી, નોંધપાત્ર રક્ત સંવર્ધન વિના.ત્રીજા અને ચોથા રાઉન્ડમાં પણ, ફેજ ક્લોન્સ CSF માં નોંધપાત્ર રીતે સમૃદ્ધ થયા હતા.પસંદગીના છેલ્લા બે રાઉન્ડ વચ્ચેના દરેક અનન્ય પેપ્ટાઈડ ક્રમની સંબંધિત આવર્તનની તુલના કરતા, અમે જોયું કે પસંદગીના ચોથા રાઉન્ડમાં શ્રેણીઓ વધુ સમૃદ્ધ હતી (ફિગ. 3b).બંને પેપ્ટાઇડ ઓરિએન્ટેશનનો ઉપયોગ કરીને તમામ 64 અનન્ય પેપ્ટાઇડ સિક્વન્સમાંથી કુલ 931 ટ્રિપેપ્ટાઇડ મોટિફ્સ કાઢવામાં આવ્યા હતા.ઇન્જેક્ટેડ લાઇબ્રેરી (કટ-ઓફ: 10% સંવર્ધન) (પૂરક ફિગ. 6c) ની તુલનામાં ચોથા રાઉન્ડમાં સૌથી વધુ સમૃદ્ધ રૂપરેખાઓને તમામ રાઉન્ડમાં તેમની સંવર્ધન પ્રોફાઇલ્સ માટે વધુ નજીકથી તપાસવામાં આવી હતી.પસંદગીના સામાન્ય દાખલાઓ દર્શાવે છે કે અભ્યાસ કરાયેલ મોટાભાગના હેતુઓ બંને પસંદગી શાખાઓના અગાઉના તમામ રાઉન્ડમાં સમૃદ્ધ હતા.જો કે, કેટલાક ઉદ્દેશો (દા.ત. SGL, VSG, LGS GSV) મુખ્યત્વે વૈકલ્પિક ક્લેડ Aમાંથી હતા, જ્યારે અન્ય (દા.ત. FGW, RTN, WGF, NTR) વૈકલ્પિક ક્લેડ Bમાં સમૃદ્ધ થયા હતા.
CSF-સમૃદ્ધ ફેજ-પ્રદર્શિત પેપ્ટાઇડ્સ અને સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન પેલોડ્સ સાથે સંયોજિત બાયોટિનિલેટેડ લીડર પેપ્ટાઇડ્સના CSF પરિવહનની માન્યતા.
(a) ઇન્જેક્ટેડ (ઇનપુટ = I) ફેજ (PFU) ટાઇટર્સ અને નિર્ધારિત CSF ફેજ ટાઇટર્સ (આઉટપુટ = O) પર આધારિત તમામ ચાર રાઉન્ડ (R1-R4) માં ગણવામાં આવેલ એનરિચમેન્ટ રેશિયો.છેલ્લા ત્રણ રાઉન્ડ (R2-R4) માટેના સંવર્ધન પરિબળોની ગણતરી અગાઉના રાઉન્ડ અને પ્રથમ રાઉન્ડ (R1) સાથે વજન ડેટા સાથે સરખામણી કરીને કરવામાં આવી હતી.ઓપન બાર સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી છે, શેડ બાર પ્લાઝ્મા છે.(***p<0.001, વિદ્યાર્થીની ટી-ટેસ્ટ પર આધારિત).(b) પસંદગીના રાઉન્ડ 4 પછી CSF માં એકત્રિત કરાયેલા તમામ ફેજીસના સાપેક્ષ પ્રમાણ અનુસાર સૌથી વધુ વિપુલ પ્રમાણમાં ફેજ પેપ્ટાઈડ્સની યાદી.છ સૌથી સામાન્ય ફેજ ક્લોન્સ પસંદગીના રાઉન્ડ 3 અને 4 (ઇન્સેટ) વચ્ચે રંગ, ક્રમાંકિત અને તેમના સંવર્ધન પરિબળોમાં પ્રકાશિત થાય છે.(c,d) રાઉન્ડ 4માંથી છ સૌથી વધુ સમૃદ્ધ ફેજ ક્લોન્સ, ખાલી ફેજ અને પેરેંટલ ફેજ પેપ્ટાઇડ લાઇબ્રેરીઓનું CSF સેમ્પલિંગ મોડેલમાં વ્યક્તિગત રીતે વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.CSF અને રક્તના નમૂનાઓ દર્શાવેલ સમય બિંદુઓ પર એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા.(c) સમાન માત્રામાં 6 ઉમેદવાર ફેજ ક્લોન્સ (2 x 1010 ફેજીસ/પ્રાણીઓ), ખાલી ફેજ (#1779) (2 x 1010 ફેજીસ/પ્રાણીઓ) અને સ્ટોક ફેજ પેપ્ટાઇડ લાઇબ્રેરીઓ (2 x 1012 ફેજીસ/પ્રાણીઓ) ઓછામાં ઓછા 3 સીએમ દ્વારા પૂંછડીમાં અલગથી ઇન્જેક્ટ કરી શકાય છે.દરેક ઇન્જેક્ટેડ ફેજ ક્લોન અને ફેજ પેપ્ટાઇડ લાઇબ્રેરીના CSF ફાર્માકોકેનેટિક્સ સમયાંતરે બતાવવામાં આવે છે.(d) નમૂના લેવાના સમય દરમિયાન તમામ પુનઃપ્રાપ્ત થયેલા ફેજીસ/એમએલ માટે સરેરાશ CSF/બ્લડ રેશિયો દર્શાવે છે.(e) ચાર સિન્થેટીક લીડર પેપ્ટાઈડ્સ અને એક સ્ક્રેમ્બલ્ડ કંટ્રોલ બાયોટિન સાથે સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન સાથે તેમના એન-ટર્મિનસ (ટેટ્રામર ડિસ્પ્લે) દ્વારા જોડાયેલા હતા અને ત્યારબાદ ઈન્જેક્શન (ટેઈલ વેઈન iv, 10 મિલિગ્રામ સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન/કિલો).ઓછામાં ઓછા ત્રણ ઇન્ટ્યુટેડ ઉંદરો (N = 3).).CSF નમૂનાઓ દર્શાવેલ સમય બિંદુઓ પર એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા અને સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન સાંદ્રતા CSF એન્ટિ-સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન ELISA (nd = શોધાયેલ નથી) દ્વારા માપવામાં આવી હતી.(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA ટેસ્ટ પર આધારિત).(f) પસંદગીના ચોથા રાઉન્ડમાંથી અન્ય પસંદ કરેલા ફેજ પેપ્ટાઈડ ક્લોન્સ સાથે સૌથી વધુ સમૃદ્ધ ફેજ પેપ્ટાઈડ ક્લોન #2002 (જાંબલી) ના એમિનો એસિડ ક્રમની સરખામણી.સમાન અને સમાન એમિનો એસિડ ટુકડાઓ રંગ-કોડેડ છે.
ચોથા રાઉન્ડમાં (ફિગ. 3b) તમામ સમૃદ્ધ તબક્કાઓમાંથી, CSF સેમ્પલિંગ મોડેલમાં વધુ વ્યક્તિગત વિશ્લેષણ માટે છ ઉમેદવાર ક્લોન્સ પસંદ કરવામાં આવ્યા હતા.છ ઉમેદવાર ફેજ, ખાલી ફેજ (કોઈ ઇન્સર્ટ નહીં) અને પ્રોફેજ પેપ્ટાઇડ લાઇબ્રેરીની સમાન માત્રા ત્રણ કેન્યુલેટેડ CM પ્રાણીઓમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવી હતી, અને ફાર્માકોકાઇનેટિક્સ CSF (ફિગ. 3c) અને રક્ત (પૂરક ફિગ. 7) પરીક્ષણોમાં નક્કી કરવામાં આવ્યા હતા.પરીક્ષણ કરાયેલા તમામ ફેજ ક્લોન્સે CSF કમ્પાર્ટમેન્ટને ખાલી કંટ્રોલ ફેજ (#1779) કરતા 10-1000 ગણા ઊંચા સ્તરે લક્ષ્યાંકિત કર્યું.ઉદાહરણ તરીકે, ક્લોન્સ #2020 અને #2077 માં કંટ્રોલ ફેજ કરતાં લગભગ 1000 ગણા વધારે CSF ટાઇટર્સ હતા.દરેક પસંદ કરેલ પેપ્ટાઈડની ફાર્માકોકાઈનેટીક રૂપરેખા અલગ હોય છે, પરંતુ તે બધામાં ઉચ્ચ CSF હોમિંગ ક્ષમતા હોય છે.અમે ક્લોન્સ #1903 અને #2011 માટે સમય જતાં સતત ઘટાડો જોયો છે, જ્યારે ક્લોન્સ #2077, #2002 અને #2009 માટે પ્રથમ 10 મિનિટમાં વધારો સક્રિય પરિવહન સૂચવી શકે છે પરંતુ તેની ચકાસણી કરવાની જરૂર છે.ક્લોન્સ #2020, #2002, અને #2077 ઉચ્ચ સ્તરે સ્થિર થયા, જ્યારે ક્લોન #2009 ની CSF સાંદ્રતામાં પ્રારંભિક વધારો પછી ધીમે ધીમે ઘટાડો થયો.અમે પછી દરેક CSF ઉમેદવારની સાપેક્ષ આવર્તનની તુલના તેના લોહીની સાંદ્રતા (ફિગ. 3d) સાથે કરી.દરેક CSF ઉમેદવારના સરેરાશ ટાઈટરનો તેના લોહીના ટાઈટર સાથેના તમામ સેમ્પલિંગ સમયે સહસંબંધ દર્શાવે છે કે છમાંથી ત્રણ ઉમેદવારો રક્ત CSFમાં નોંધપાત્ર રીતે સમૃદ્ધ હતા.રસપ્રદ વાત એ છે કે, ક્લોન #2077 એ ઉચ્ચ રક્ત સ્થિરતા દર્શાવી (પૂરક આકૃતિ 7).ખાતરી કરવા માટે કે પેપ્ટાઈડ્સ પોતે ફેજ કણો સિવાયના અન્ય કાર્ગોને CSF કમ્પાર્ટમેન્ટમાં સક્રિયપણે પરિવહન કરવા સક્ષમ છે, અમે N-ટર્મિનસ પર જ્યાં પેપ્ટાઈડ્સ ફેજ કણ સાથે જોડાય છે ત્યાં બાયોટિન સાથે વ્યુત્પન્ન ચાર લીડર પેપ્ટાઈડ્સનું સંશ્લેષણ કર્યું.બાયોટિનલેટેડ પેપ્ટાઇડ્સ (નં. 2002, 2009, 2020 અને 2077) ને સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન (SA) સાથે સંયોજિત કરવામાં આવ્યા હતા જેથી ફેજ ભૂમિતિની નકલ કરતા મલ્ટિમેરિક સ્વરૂપો પ્રાપ્ત થાય.આ ફોર્મેટે અમને કાર્ગો-ટ્રાન્સપોર્ટિંગ પ્રોટીન પેપ્ટાઇડ્સ તરીકે લોહી અને મગજના પ્રવાહીમાં SA એક્સપોઝરને માપવાની પણ મંજૂરી આપી.અગત્યની રીતે, જ્યારે કૃત્રિમ પેપ્ટાઈડ્સ આ SA-સંયોજિત ફોર્મેટ (ફિગ. 3e) માં સંચાલિત કરવામાં આવે ત્યારે ફેજ ડેટા વારંવાર પુનઃઉત્પાદિત કરી શકાય છે.સ્ક્રેમ્બલ્ડ પેપ્ટાઈડ્સમાં પ્રારંભિક એક્સપોઝર ઓછું હતું અને 48 કલાકની અંદર શોધી ન શકાય તેવા સ્તર સાથે ઝડપી CSF ક્લિયરન્સ હતું.CSF સ્પેસમાં આ પેપ્ટાઈડ ફેજ ક્લોન્સના ડિલિવરી માર્ગોની સમજ મેળવવા માટે, અમે વિવોમાં ઈન્ટ્રાવેનસ ઈન્જેક્શનના 1 કલાક પછી ફેજ કણોને સીધો શોધવા માટે ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિસ્ટ્રી (IHC) નો ઉપયોગ કરીને વ્યક્તિગત ફેજ પેપ્ટાઈડ હિટના સ્થાનિકીકરણનું વિશ્લેષણ કર્યું.નોંધનીય રીતે, ક્લોન્સ #2002, #2077, અને #2009 મગજની રુધિરકેશિકાઓમાં મજબૂત સ્ટેનિંગ દ્વારા શોધી શકાય છે, જ્યારે કંટ્રોલ ફેજ (#1779) અને ક્લોન #2020 શોધી શકાયા નથી (પૂરક આકૃતિ 8).આ સૂચવે છે કે આ પેપ્ટાઈડ્સ BBB ને પાર કરીને મગજ પર ચોક્કસ અસરમાં ફાળો આપે છે.આ પૂર્વધારણાને ચકાસવા માટે વધુ વિગતવાર વિશ્લેષણ જરૂરી છે, કારણ કે BSCFB માર્ગ પણ સામેલ હોઈ શકે છે.સૌથી વધુ સમૃદ્ધ ક્લોન (#2002) ના એમિનો એસિડ ક્રમની અન્ય પસંદ કરેલ પેપ્ટાઈડ્સ સાથે સરખામણી કરતી વખતે, તે નોંધવામાં આવ્યું હતું કે તેમાંના કેટલાકમાં સમાન એમિનો એસિડ એક્સટેન્શન છે, જે સમાન પરિવહન પદ્ધતિ (ફિગ. 3f) સૂચવી શકે છે.
તેની અનન્ય પ્લાઝ્મા પ્રોફાઇલ અને સમય જતાં CSF માં નોંધપાત્ર વધારાને કારણે, ફેજ ડિસ્પ્લે ક્લોન #2077 નું વધુ લાંબા 48-કલાકના સમયગાળામાં સંશોધન કરવામાં આવ્યું હતું અને સતત SA સ્તરો (ફિગ. 4a) સાથે જોડાણમાં જોવામાં આવેલ CSF માં ઝડપી વધારાનું પુનઃઉત્પાદન કરવામાં સક્ષમ હતું.અન્ય ઓળખાયેલા ફેજ ક્લોન્સ અંગે, #2077 મગજની રુધિરકેશિકાઓ માટે મજબૂત રીતે ડાઘાવાળું છે અને જ્યારે ઉચ્ચ રીઝોલ્યુશન પર જોવામાં આવે ત્યારે કેશિલરી માર્કર લેક્ટીન સાથે નોંધપાત્ર સ્થાનિકીકરણ દર્શાવ્યું હતું અને સંભવતઃ પેરેનકાઇમલ સ્પેસમાં કેટલાક સ્ટેનિંગ (આકૃતિ 4b).CNS માં પેપ્ટાઈડ-મધ્યસ્થી ફાર્માકોલોજિકલ અસરો મેળવી શકાય છે કે કેમ તેની તપાસ કરવા માટે, અમે એક પ્રયોગ કર્યો જેમાં i) #2077 ટ્રાન્ઝિટ પેપ્ટાઈડ અને ii) BACE1 અવરોધક પેપ્ટાઈડને SA સાથે બે અલગ-અલગ રેશિયોમાં મિશ્રિત કરવામાં આવ્યા હતા.એક સંયોજન માટે અમે ફક્ત BACE1 પેપ્ટાઈડ અવરોધકનો ઉપયોગ કર્યો અને બીજા માટે અમે #2077 પેપ્ટાઈડ માટે BACE1 પેપ્ટાઈડ અવરોધકનો 1:3 ગુણોત્તરનો ઉપયોગ કર્યો.બંને નમૂનાઓ નસમાં સંચાલિત કરવામાં આવ્યા હતા અને સમય જતાં બીટા-એમિલોઇડ પેપ્ટાઇડ 40 (એબેટા 40) ના રક્ત અને મગજના પ્રવાહીનું સ્તર માપવામાં આવ્યું હતું.Abeta40 CSF માં માપવામાં આવ્યું હતું કારણ કે તે મગજના પેરેન્ચાઇમામાં BACE1 અવરોધને પ્રતિબિંબિત કરે છે.અપેક્ષા મુજબ, બંને સંકુલોએ Abeta40 (Fig. 4c, d) ના રક્ત સ્તરમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો કર્યો.જો કે, માત્ર પેપ્ટાઈડનું મિશ્રણ ધરાવતા નમૂનાઓ નં.2077 અને SA સાથે જોડાયેલા BACE1 પેપ્ટાઇડના અવરોધકને કારણે સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી (ફિગ. 4c) માં Abeta40 માં નોંધપાત્ર ઘટાડો થયો.ડેટા દર્શાવે છે કે પેપ્ટાઈડ નં.2077 60 kDa SA પ્રોટીનને CNS માં પરિવહન કરવામાં સક્ષમ છે અને BACE1 પેપ્ટાઈડના SA-સંયોજિત અવરોધકો સાથે ફાર્માકોલોજિકલ અસરોને પણ પ્રેરિત કરે છે.
(a) T7 ફેજનું ક્લોનલ ઇન્જેક્શન (2 × 10 ફેજ/પ્રાણી) ઓછામાં ઓછા ત્રણ CM-ઇનટ્યુબેટેડ ઉંદરોમાં CSF પેપ્ટાઇડ #2077 (RLSSVDSDLSGC) અને અનઇન્જેક્ટેડ કંટ્રોલ ફેજ (#1779) ની લાંબા ગાળાની ફાર્માકોકાઇનેટિક પ્રોફાઇલ દર્શાવે છે.(b) ફેજ-ઇન્જેક્ટેડ ઉંદરો (2 × 10 10 ફેજીસ/પ્રાણી) માં પ્રતિનિધિ કોર્ટિકલ માઇક્રોવેસેલ્સની કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપિક છબી પેપ્ટાઇડ #2077 અને જહાજો (લેક્ટીન) ના કાઉન્ટરસ્ટેનિંગ દર્શાવે છે.આ ફેજ ક્લોન્સ 3 ઉંદરોને આપવામાં આવ્યા હતા અને પરફ્યુઝન પહેલા 1 કલાક સુધી ફરવા દેવામાં આવ્યા હતા.મગજને ટી7 ફેજ કેપ્સિડ સામે પોલીક્લોનલ FITC-લેબલવાળા એન્ટિબોડીઝથી વિભાજિત અને ડાઘવાળું હતું.પરફ્યુઝન અને અનુગામી ફિક્સેશનની દસ મિનિટ પહેલાં, DyLight594-લેબલવાળી લેકટિન નસમાં આપવામાં આવી હતી.રુધિરકેશિકાઓ અને પેરીવાસ્ક્યુલર મગજની પેશીઓના લ્યુમેનમાં માઇક્રોવેસેલ્સ અને ફેજીસ (લીલા) ની લ્યુમિનલ બાજુની લેક્ટીન સ્ટેનિંગ (લાલ) દર્શાવતી ફ્લોરોસન્ટ છબીઓ.સ્કેલ બાર 10 µm ને અનુરૂપ છે.(c, d) બાયોટીનીલેટેડ BACE1 અવરોધક પેપ્ટાઈડ એકલા અથવા બાયોટીનીલેટેડ ટ્રાન્ઝિટ પેપ્ટાઈડ #2077 સાથે સંયોજનમાં સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન સાથે જોડવામાં આવ્યું હતું અને ત્યારબાદ ઓછામાં ઓછા ત્રણ કેન્યુલેટેડ સીએમ ઉંદરો (10 મિલિગ્રામ સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન/કિલો) ના ઇન્ટ્રાવેનસ ઈન્જેક્શન દ્વારા.Aβ40 માં BACE1 પેપ્ટાઇડ ઇન્હિબિટર-મધ્યસ્થી ઘટાડાને Aβ1-40 ELISA દ્વારા રક્ત (લાલ) અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી (નારંગી) દ્વારા માપવામાં આવ્યો હતો.વધુ સારી સ્પષ્ટતા માટે, ગ્રાફ પર 100% ના સ્કેલ પર ડોટેડ રેખા દોરવામાં આવે છે.(c) 3:1 રેશિયોમાં ટ્રાન્ઝિટ પેપ્ટાઇડ #2077 અને BACE1 અવરોધક પેપ્ટાઇડ સાથે સંયોજિત સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન સાથે સારવાર કરાયેલા ઉંદરોમાં Aβ40 (લાલ ત્રિકોણ) અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી (નારંગી ત્રિકોણ) માં ટકાવારીમાં ઘટાડો.(d) માત્ર BACE1 અવરોધક પેપ્ટાઇડ સાથે સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન સાથે સારવાર કરાયેલા ઉંદરોના Aβ40 (લાલ વર્તુળો) અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી (નારંગી વર્તુળો)માં લોહીમાં ટકાવારીમાં ઘટાડો.નિયંત્રણમાં Aβ સાંદ્રતા 420 pg/ml (માનક વિચલન = 101 pg/ml) હતી.
બાયોમેડિકલ સંશોધન17ના કેટલાક ક્ષેત્રોમાં ફેજ ડિસ્પ્લે સફળતાપૂર્વક લાગુ કરવામાં આવ્યું છે.આ પદ્ધતિનો ઉપયોગ વિવો વેસ્ક્યુલર ડાયવર્સિટી સ્ટડીઝ 18,19 તેમજ સેરેબ્રલ વેસલ્સ 20,21,22,23,24,25,26ને લક્ષિત અભ્યાસ માટે કરવામાં આવ્યો છે.આ અભ્યાસમાં, અમે આ પસંદગી પદ્ધતિનો ઉપયોગ માત્ર મગજની વાહિનીઓને લક્ષ્યાંકિત કરતા પેપ્ટાઈડ્સની સીધી ઓળખ માટે જ નહીં, પણ રક્ત-મગજના અવરોધને પાર કરવા માટે સક્રિય પરિવહન ગુણધર્મો ધરાવતા ઉમેદવારોની શોધ માટે પણ વિસ્તૃત કર્યો છે.અમે હવે સીએમ ઇન્ટ્યુબેટેડ ઉંદરોમાં ઇન વિવો પસંદગી પ્રક્રિયાના વિકાસનું વર્ણન કરીએ છીએ અને CSF હોમિંગ પ્રોપર્ટીઝ સાથે પેપ્ટાઇડ્સને ઓળખવાની તેની સંભવિતતા દર્શાવીએ છીએ.12-મેર રેન્ડમ પેપ્ટાઈડ્સની લાઈબ્રેરી દર્શાવતા T7 ફેજનો ઉપયોગ કરીને, અમે દર્શાવવામાં સક્ષમ હતા કે T7 ફેજ એટલો નાનો છે (આશરે 60 nm વ્યાસમાં) 10 રક્ત-મગજ અવરોધને અનુકૂલિત થઈ શકે છે, ત્યાંથી સીધા રક્ત-મગજ અવરોધ અથવા પ્લેક્સસ ચોરોઈડને પાર કરે છે.અમે અવલોકન કર્યું કે કેન્યુલેટેડ CM ઉંદરોમાંથી CSF લણણી એ વિવો ફંક્શનલ સ્ક્રિનિંગ પદ્ધતિમાં સારી રીતે નિયંત્રિત હતી, અને એક્સટ્રેક્ટેડ ફેજ માત્ર વેસ્ક્યુલેચર સાથે જ બંધાયેલું નથી પણ લોહી-મગજના અવરોધને પાર ટ્રાન્સપોર્ટર તરીકે પણ કાર્ય કરે છે.વધુમાં, એકસાથે રક્ત એકત્ર કરીને અને CSF અને લોહીથી મેળવેલા ફેજીસ પર HTS લાગુ કરીને, અમે પુષ્ટિ કરી છે કે CSF ની અમારી પસંદગી રક્ત સંવર્ધન અથવા પસંદગીના રાઉન્ડ વચ્ચે વિસ્તરણ માટે ફિટનેસ દ્વારા પ્રભાવિત નથી.જો કે, લોહીનો ડબ્બો એ પસંદગીની પ્રક્રિયાનો એક ભાગ છે, કારણ કે CSF કમ્પાર્ટમેન્ટ સુધી પહોંચવા માટે સક્ષમ ફેજીસ મગજમાં પોતાને સમૃદ્ધ બનાવવા માટે લોહીના પ્રવાહમાં લાંબા સમય સુધી જીવતા અને ફરતા હોવા જોઈએ.કાચા HTS ડેટામાંથી વિશ્વસનીય ક્રમ માહિતી મેળવવા માટે, અમે વિશ્લેષણ વર્કફ્લોમાં પ્લેટફોર્મ-વિશિષ્ટ અનુક્રમ ભૂલોને અનુકૂલિત ફિલ્ટર્સ લાગુ કર્યા છે.સ્ક્રિનિંગ પદ્ધતિમાં ગતિના પરિમાણોનો સમાવેશ કરીને, અમે રક્ત24, 27, 28 માં જંગલી પ્રકારના T7 ફેજ (t½ ~ 28 મિનિટ) ના ઝડપી ફાર્માકોકાઇનેટિક્સની પુષ્ટિ કરી અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી (t½ ~ 26 મિનિટ) પ્રતિ મિનિટમાં તેમનું અર્ધ જીવન પણ નક્કી કર્યું.લોહી અને CSF માં સમાન ફાર્માકોકેનેટિક પ્રોફાઇલ્સ હોવા છતાં, CSF માં ફેજની રક્ત સાંદ્રતાના માત્ર 0.001% જ શોધી શકાય છે, જે રક્ત-મગજના અવરોધમાં જંગલી પ્રકારના T7 ફેજની ઓછી પૃષ્ઠભૂમિ ગતિશીલતા દર્શાવે છે.આ કાર્ય વિવો પૅનિંગ વ્યૂહરચનાનો ઉપયોગ કરતી વખતે પસંદગીના પ્રથમ રાઉન્ડના મહત્વને પ્રકાશિત કરે છે, ખાસ કરીને ફેજ સિસ્ટમ્સ માટે જે ઝડપથી પરિભ્રમણમાંથી સાફ થઈ જાય છે, કારણ કે થોડા ક્લોન્સ CNS કમ્પાર્ટમેન્ટ સુધી પહોંચવામાં સક્ષમ છે.આમ, પ્રથમ રાઉન્ડમાં, પુસ્તકાલયની વિવિધતામાં ઘટાડો ઘણો મોટો હતો, કારણ કે આ અત્યંત કડક CSF મોડેલમાં માત્ર મર્યાદિત સંખ્યામાં જ ક્લોન્સ એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા.આમાં વિવો પૅનિંગ વ્યૂહરચનામાં CSF કમ્પાર્ટમેન્ટમાં સક્રિય સંચય, લોહીના ડબ્બામાં ક્લોન સર્વાઇવલ, અને પ્રથમ 10 મિનિટમાં લોહીમાંથી T7 ફેજ ક્લોન્સને ઝડપથી દૂર કરવા (ફિગ. 1d અને પૂરક ફિગ. 4M) જેવા કેટલાક પસંદગીના પગલાંનો સમાવેશ થાય છે.).આમ, પ્રથમ રાઉન્ડ પછી, CSF માં અલગ-અલગ ફેજ ક્લોન્સ ઓળખવામાં આવ્યા હતા, જોકે વ્યક્તિગત પ્રાણીઓ માટે સમાન પ્રારંભિક પૂલનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.આ સૂચવે છે કે મોટી સંખ્યામાં લાઇબ્રેરી સભ્યો સાથે સ્ત્રોત લાઇબ્રેરીઓ માટે બહુવિધ કડક પસંદગીના પગલાં વિવિધતામાં નોંધપાત્ર ઘટાડો તરફ દોરી જાય છે.તેથી, અવ્યવસ્થિત ઘટનાઓ પ્રારંભિક પસંદગી પ્રક્રિયાનો એક અભિન્ન ભાગ બની જશે, જે પરિણામને મોટા પ્રમાણમાં પ્રભાવિત કરશે.સંભવ છે કે મૂળ લાઇબ્રેરીમાંના ઘણા ક્લોન્સમાં CSF સંવર્ધનની ખૂબ જ સમાનતા હતી.જો કે, સમાન પ્રાયોગિક પરિસ્થિતિઓ હેઠળ પણ, પ્રારંભિક પૂલમાં દરેક ચોક્કસ ક્લોનની નાની સંખ્યાને કારણે પસંદગીના પરિણામો અલગ હોઈ શકે છે.
CSF માં સમૃદ્ધ બનેલા ઉદ્દેશો લોહીમાં રહેલા લોકો કરતા અલગ છે.રસપ્રદ રીતે, અમે વ્યક્તિગત પ્રાણીઓના લોહીમાં ગ્લાયસીન-સમૃદ્ધ પેપ્ટાઇડ્સ તરફ પ્રથમ પાળી નોંધ્યું છે.(ફિગ. 1g, પૂરક ફિગ. 4e, 4f).ગ્લાયસીન પેપ્ટાઈડ્સ ધરાવતું ફેજ વધુ સ્થિર હોઈ શકે છે અને પરિભ્રમણમાંથી બહાર કાઢવાની શક્યતા ઓછી હોય છે.જો કે, સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીના નમૂનાઓમાં આ ગ્લાયસીન-સમૃદ્ધ પેપ્ટાઇડ્સ મળી આવ્યા ન હતા, જે સૂચવે છે કે ક્યુરેટેડ લાઇબ્રેરીઓ બે અલગ-અલગ પસંદગીના પગલાઓમાંથી પસાર થાય છે: એક લોહીમાં અને બીજું સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં એકઠા થવા દે છે.પસંદગીના ચોથા રાઉન્ડના પરિણામે CSF-સમૃદ્ધ ક્લોન્સનું વ્યાપકપણે પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું છે.ખાલી કંટ્રોલ ફેજની તુલનામાં લગભગ તમામ વ્યક્તિગત રીતે પરીક્ષણ કરાયેલા ક્લોન્સ CSF માં સમૃદ્ધ હોવાની પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી.એક પેપ્ટાઈડ હિટ (#2077) ની વધુ વિગતવાર તપાસ કરવામાં આવી હતી.તે અન્ય હિટ (આકૃતિ 3d અને પૂરક આકૃતિ 7) ની તુલનામાં લાંબું પ્લાઝ્મા અર્ધ-જીવન દર્શાવે છે, અને રસપ્રદ રીતે, આ પેપ્ટાઇડમાં સી-ટર્મિનસ પર સિસ્ટીન અવશેષો છે.તાજેતરમાં એવું દર્શાવવામાં આવ્યું છે કે પેપ્ટાઇડ્સમાં સિસ્ટીનનો ઉમેરો એલ્બ્યુમિન 29 સાથે જોડાઈને તેમના ફાર્માકોકેનેટિક ગુણધર્મોને સુધારી શકે છે.આ હાલમાં પેપ્ટાઈડ #2077 માટે અજ્ઞાત છે અને વધુ અભ્યાસની જરૂર છે.કેટલાક પેપ્ટાઈડ્સે CSF સંવર્ધનમાં સંયોજકતા-નિર્ભરતા દર્શાવી હતી (ડેટા બતાવેલ નથી), જે T7 કેપ્સિડની પ્રદર્શિત સપાટીની ભૂમિતિ સાથે સંબંધિત હોઈ શકે છે.અમે જે T7 સિસ્ટમનો ઉપયોગ કર્યો તે દરેક પેપ્ટાઈડની 5-15 નકલો પ્રતિ ફેજ કણ દર્શાવે છે.IHC ઉંદરોના મગજનો આચ્છાદન (પૂરક ફિગ. 8) માં નસમાં ઇન્જેક્ટ કરાયેલ ઉમેદવાર લીડ ફેજ ક્લોન્સ પર કરવામાં આવ્યું હતું.ડેટા દર્શાવે છે કે ઓછામાં ઓછા ત્રણ ક્લોન્સ (નં. 2002, નંબર 2009 અને નંબર 2077) BBB સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે.તે નક્કી કરવાનું બાકી છે કે શું આ BBB ક્રિયાપ્રતિક્રિયા CSF ના સંચયમાં પરિણમે છે અથવા આ ક્લોન્સની હિલચાલ સીધી BCSFB માં થાય છે.મહત્ત્વપૂર્ણ રીતે, અમે બતાવીએ છીએ કે પસંદ કરેલ પેપ્ટાઈડ્સ તેમની CSF પરિવહન ક્ષમતા જાળવી રાખે છે જ્યારે સંશ્લેષણ કરવામાં આવે છે અને પ્રોટીન કાર્ગો સાથે જોડાય છે.એન-ટર્મિનલ બાયોટિનીલેટેડ પેપ્ટાઇડ્સનું SA સાથે બંધન આવશ્યકપણે રક્ત અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી (ફિગ. 3e) માં તેમના સંબંધિત ફેજ ક્લોન્સ સાથે પ્રાપ્ત પરિણામોનું પુનરાવર્તન કરે છે.છેલ્લે, અમે બતાવીએ છીએ કે લીડ પેપ્ટાઈડ #2077 એ SA સાથે જોડાયેલા BACE1 ના બાયોટીનીલેટેડ પેપ્ટાઈડ અવરોધકની મગજની ક્રિયાને પ્રોત્સાહન આપવા માટે સક્ષમ છે, જે CSF (ફિગ. 4) માં Abeta40 સ્તરને નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડીને CNS માં ઉચ્ચારણ ફાર્માકોડાયનેમિક અસરોનું કારણ બને છે.અમે તમામ હિટની પેપ્ટાઈડ સિક્વન્સ હોમોલોજી શોધ કરીને ડેટાબેઝમાં કોઈપણ હોમોલોગ્સને ઓળખવામાં અસમર્થ હતા.એ નોંધવું અગત્યનું છે કે T7 લાઇબ્રેરીનું કદ આશરે 109 છે, જ્યારે 12-mers માટે સૈદ્ધાંતિક લાઇબ્રેરીનું કદ 4 x 1015 છે. તેથી, અમે 12-મેર પેપ્ટાઇડ લાઇબ્રેરીની વિવિધતા જગ્યાનો માત્ર એક નાનો અંશ પસંદ કર્યો છે, જેનો અર્થ એ થઈ શકે છે કે આ પેપ્ટાઇડ્સની વધુ ઑપ્ટિમાઇઝ સ્પેસને ઓળખી શકાય છે.કાલ્પનિક રીતે, આપણને આ પેપ્ટાઈડ્સના કોઈ કુદરતી હોમોલોગ્સ મળ્યા નથી તેનું એક કારણ ઉત્ક્રાંતિ દરમિયાન મગજમાં અમુક પેપ્ટાઈડ્સના અનિયંત્રિત પ્રવેશને રોકવા માટે ડિસેલેક્શન હોઈ શકે છે.
સાથે મળીને, અમારા પરિણામો વધુ વિગતવાર વિવોમાં સેરેબ્રોવેસ્ક્યુલર અવરોધની પરિવહન પ્રણાલીઓને ઓળખવા અને લાક્ષણિકતા આપવા માટે ભાવિ કાર્ય માટે આધાર પૂરો પાડે છે.આ પદ્ધતિનું મૂળભૂત સેટઅપ કાર્યાત્મક પસંદગી વ્યૂહરચના પર આધારિત છે જે માત્ર સેરેબ્રલ વેસ્ક્યુલર બંધનકર્તા ગુણધર્મો સાથેના ક્લોન્સને ઓળખે છે, પરંતુ તેમાં એક મહત્વપૂર્ણ પગલું પણ શામેલ છે જેમાં સફળ ક્લોન્સ સીએનએસ કમ્પાર્ટમેન્ટમાં વિવોમાં જૈવિક અવરોધોને પાર કરવા માટે આંતરિક પ્રવૃત્તિ ધરાવે છે.આ પેપ્ટાઈડ્સના પરિવહનની પદ્ધતિ અને મગજના ક્ષેત્ર માટે વિશિષ્ટ માઇક્રોવેસ્ક્યુલેચર સાથે જોડાવા માટેની તેમની પસંદગીને સ્પષ્ટ કરવાનો છે.આ BBB અને રીસેપ્ટર્સના પરિવહન માટે નવા માર્ગોની શોધ તરફ દોરી શકે છે.અમે અપેક્ષા રાખીએ છીએ કે ઓળખાયેલ પેપ્ટાઇડ્સ સીધા સેરેબ્રોવેસ્ક્યુલર રીસેપ્ટર્સ સાથે અથવા BBB અથવા BCSFB દ્વારા પરિવહન કરાયેલા ફરતા લિગાન્ડ્સ સાથે જોડાઈ શકે છે.આ કાર્યમાં CSF પરિવહન પ્રવૃત્તિ સાથેના પેપ્ટાઈડ વેક્ટરની વધુ તપાસ કરવામાં આવશે.અમે હાલમાં BBB અને/અથવા BCSFB ને પાર કરવાની તેમની ક્ષમતા માટે આ પેપ્ટાઈડ્સની મગજની વિશિષ્ટતાની તપાસ કરી રહ્યા છીએ.આ નવા પેપ્ટાઈડ્સ નવા રીસેપ્ટર્સ અથવા પાથવેની સંભવિત શોધ માટે અને મગજમાં જીવવિજ્ઞાન જેવા મેક્રોમોલેક્યુલ્સના વિતરણ માટે નવા અત્યંત કાર્યક્ષમ પ્લેટફોર્મના વિકાસ માટે અત્યંત મૂલ્યવાન સાધનો હશે.
અગાઉ વર્ણવેલ પદ્ધતિના ફેરફારનો ઉપયોગ કરીને મોટા સિસ્ટર્ના (CM)ને કેન્યુલેટ કરો.એનેસ્થેટાઇઝ્ડ વિસ્ટાર ઉંદરો (200-350 ગ્રામ) એક સ્ટીરિયોટેક્સિક ઉપકરણ પર માઉન્ટ કરવામાં આવ્યા હતા અને ખોપરી બહાર કાઢવા માટે શેવ્ડ અને એસેપ્ટીકલી તૈયાર ખોપરી ઉપરની ચામડી પર એક મધ્ય ચીરો કરવામાં આવ્યો હતો.ઉપલા સૅશના વિસ્તારમાં બે છિદ્રો ડ્રિલ કરો અને છિદ્રોમાં ફિક્સિંગ સ્ક્રૂને જોડો.સીએમમાં ​​સ્ટેનલેસ સ્ટીલ કેન્યુલાના સ્ટીરિયોટેક્ટિક માર્ગદર્શન માટે બાજુની ઓસીપીટલ ક્રેસ્ટમાં વધારાનું છિદ્ર ડ્રિલ કરવામાં આવ્યું હતું.કેન્યુલાની આસપાસ ડેન્ટલ સિમેન્ટ લગાવો અને સ્ક્રૂ વડે સુરક્ષિત કરો.ફોટો-ક્યોરિંગ અને સિમેન્ટ સખ્તાઇ પછી, ચામડીના ઘાને 4/0 સુપ્રામિડ સીવ સાથે બંધ કરવામાં આવ્યો હતો.કેન્યુલાનું યોગ્ય સ્થાન સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી (CSF) ના સ્વયંસ્ફુરિત લિકેજ દ્વારા પુષ્ટિ થયેલ છે.સ્ટીરિયોટેક્સિક ઉપકરણમાંથી ઉંદરને દૂર કરો, યોગ્ય પોસ્ટઓપરેટિવ સંભાળ અને પીડા વ્યવસ્થાપન મેળવો અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં લોહીના ચિહ્નો જોવા મળે ત્યાં સુધી તેને ઓછામાં ઓછા એક અઠવાડિયા સુધી પુનઃપ્રાપ્ત થવા દો.વિસ્ટાર ઉંદરો (Crl:WI/Han) ચાર્લ્સ નદી (ફ્રાન્સ)માંથી મેળવવામાં આવ્યા હતા.બધા ઉંદરોને ચોક્કસ પેથોજેન-મુક્ત પરિસ્થિતિઓ હેઠળ રાખવામાં આવ્યા હતા.તમામ પ્રાણીઓના પ્રયોગો સ્વિટ્ઝર્લૅન્ડના બેસલ શહેરની વેટરનરી ઑફિસ દ્વારા મંજૂર કરવામાં આવ્યા હતા અને એનિમલ લાયસન્સ નંબર 2474 (સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડ અને બ્રેઇન ઑફ રૅટમાં રોગનિવારક ઉમેદવારોના સ્તરને માપવા દ્વારા સક્રિય મગજના પરિવહનનું મૂલ્યાંકન) અનુસાર કરવામાં આવ્યા હતા.
સીએમ કેન્યુલા હાથમાં રાખીને ઉંદરને હળવેથી સભાન રાખો.દાતુરાને કેન્યુલામાંથી દૂર કરો અને 10 µl સ્વયંભૂ વહેતું સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી એકત્રિત કરો.કેન્યુલાની પેટન્સી સાથે આખરે ચેડા કરવામાં આવ્યા હોવાથી, આ અભ્યાસમાં માત્ર સ્પષ્ટ સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીના નમૂનાઓનો સમાવેશ કરવામાં આવ્યો હતો જેમાં લોહીના દૂષણ અથવા વિકૃતિકરણના કોઈ પુરાવા નથી.સમાંતર રીતે, પૂંછડીની ટોચ પરના નાના ચીરામાંથી આશરે 10-20 μl રક્ત હેપરિન (સિગ્મા-એલ્ડ્રીચ) સાથેની નળીઓમાં લેવામાં આવ્યું હતું.T7 ફેજના ઇન્ટ્રાવેનસ ઇન્જેક્શન પછી વિવિધ સમયે CSF અને લોહી એકત્ર કરવામાં આવ્યું હતું.પ્રત્યેક CSF નમૂના એકત્રિત કરવામાં આવે તે પહેલાં આશરે 5-10 μl પ્રવાહી કાઢી નાખવામાં આવ્યું હતું, જે મૂત્રનલિકાના મૃત વોલ્યુમને અનુરૂપ છે.
લાઇબ્રેરીઓ T7Select 10-3b વેક્ટરનો ઉપયોગ કરીને જનરેટ કરવામાં આવી હતી જેમ કે T7Select સિસ્ટમ મેન્યુઅલ (નોવાજેન, રોસેનબર્ગ એટ અલ., ઇનોવેશન્સ 6, 1-6, 1996) માં વર્ણવવામાં આવ્યું છે.સંક્ષિપ્તમાં, રેન્ડમ 12-મેર ડીએનએ દાખલ નીચેના ફોર્મેટમાં સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું:
NNK કોડનનો ઉપયોગ ઇન્સર્ટમાં ડબલ સ્ટોપ કોડન અને એમિનો એસિડ ઓવરએક્સપ્રેશનને ટાળવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.N એ દરેક ન્યુક્લિયોટાઇડનો મેન્યુઅલી મિશ્રિત સમકક્ષ ગુણોત્તર છે, અને K એ એડેનાઇન અને સાયટોસિન ન્યુક્લિયોટાઇડ્સનો મેન્યુઅલી મિશ્રિત સમાન ગુણોત્તર છે.37 ડિગ્રી સેલ્સિયસ તાપમાને 3 કલાક માટે ક્લેનોવ બફર (ન્યૂ ઇંગ્લેન્ડ બાયોલેબ્સ) માં dNTP (નોવાજેન) અને ક્લેનોઉ એન્ઝાઇમ (ન્યૂ ઇંગ્લેન્ડ બાયોલેબ્સ) સાથે વધુ ઇન્ક્યુબેશન દ્વારા સિંગલ સ્ટ્રેન્ડેડ પ્રદેશોને ડબલ સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએમાં રૂપાંતરિત કરવામાં આવ્યા હતા.પ્રતિક્રિયા પછી, EtOH વરસાદ દ્વારા ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ પુનઃપ્રાપ્ત કરવામાં આવ્યું હતું.પરિણામી ડીએનએ પ્રતિબંધિત ઉત્સેચકો EcoRI અને HindIII (બંને રોચેથી) વડે પચવામાં આવ્યું હતું.ક્લીવ્ડ અને પ્યુરિફાઇડ (QIAquick, Qiagen) ઇન્સર્ટ (T4 ligase, New England Biolabs) પછી 10B કેપ્સિડ જનીનનાં એમિનો એસિડ 348 પછી પ્રી-ક્લીવ્ડ T7 વેક્ટરમાં ફ્રેમમાં બંધાયેલું હતું.ઈન વિટ્રો પેકેજિંગના 18 કલાક પહેલા લિગેશન રિએક્શન્સ 16° સે. તાપમાને ઉકાળવામાં આવ્યા હતા.વિટ્રોમાં ફેજ પેકેજિંગ T7Select 10-3b ક્લોનિંગ કીટ (નોવાજેન) સાથે પૂરી પાડવામાં આવેલ સૂચનાઓ અનુસાર કરવામાં આવ્યું હતું અને પેકેજિંગ સોલ્યુશનને એસ્ચેરીચિયા કોલી (BLT5615, નોવાજેન) નો ઉપયોગ કરીને લિસિસ માટે એકવાર વિસ્તૃત કરવામાં આવ્યું હતું.ગ્લિસેરોલના સ્ટોક સોલ્યુશન તરીકે લિસેટ્સને સેન્ટ્રીફ્યુજ, ટાઇટ્રેટેડ અને -80° સે. પર સ્થિર કરવામાં આવ્યા હતા.
પ્રોપ્રાઇટરી 454/Roche-amplicon ફ્યુઝન પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરીને બ્રોથ અથવા પ્લેટમાં એમ્પ્લીફાઇડ ફેજ વેરિયેબલ વિસ્તારોનું ડાયરેક્ટ પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન.ફોરવર્ડ ફ્યુઝન પ્રાઈમરમાં વેરિયેબલ રિજન (NNK) 12 (ટેમ્પલેટ-સ્પેસિફિક), GS FLX ટાઇટેનિયમ એડેપ્ટર A, અને ફોર-બેઝ લાઇબ્રેરી કી સિક્વન્સ (TCAG) (પૂરક આકૃતિ 1a) સાથે જોડાયેલા સિક્વન્સનો સમાવેશ થાય છે:
રિવર્સ ફ્યુઝન પ્રાઈમરમાં કેપ્ચર બીડ્સ સાથે જોડાયેલ બાયોટિન અને ઇમલ્સન પીસીઆર દરમિયાન ક્લોનલ એમ્પ્લીફિકેશન માટે જરૂરી GS FLX ટાઇટેનિયમ એડેપ્ટર B પણ હોય છે:
ત્યારબાદ 454 GS-FLX ટાઇટેનિયમ પ્રોટોકોલ અનુસાર એમ્પ્લીકોન્સને 454/Roche pyrosequencing ને આધિન કરવામાં આવ્યું હતું.મેન્યુઅલ સેંગર સિક્વન્સિંગ માટે (એપ્લાઇડ બાયોસિસ્ટમ્સ હિટાચી 3730 xl ડીએનએ વિશ્લેષક), T7 ફેજ ડીએનએને પીસીઆર દ્વારા વિસ્તૃત કરવામાં આવ્યું હતું અને નીચેના પ્રાઈમર જોડી સાથે અનુક્રમિત કરવામાં આવ્યું હતું:
રોશે ફાસ્ટ સ્ટાર્ટ ડીએનએ પોલિમરેઝ કીટ (ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર) નો ઉપયોગ કરીને વ્યક્તિગત તકતીઓમાંથી દાખલ કરવામાં આવતા પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશનને આધિન કરવામાં આવ્યું હતું.હોટ સ્ટાર્ટ (95 °C પર 10 મિનિટ) અને 35 બૂસ્ટ સાઇકલ (95 °C પર 50 સે, 50 °C પર 1 મિનિટ અને 72 °C પર 1 મિનિટ) કરો.
પુસ્તકાલયોમાંથી ફેજ, વાઇલ્ડ-ટાઇપ ફેજ, CSF અને લોહીમાંથી બચાવેલ ફેજ, અથવા વ્યક્તિગત ક્લોન્સને એસ્ચેરીચિયા કોલી BL5615 માં TB બ્રોથ (સિગ્મા એલ્ડ્રીચ) અથવા 500 cm2 ડીશમાં (થર્મો સાયન્ટિફિક) 37 ° સે તાપમાને 4 કલાક માટે વિસ્તૃત કરવામાં આવ્યા હતા.પ્લેટોને ટ્રિસ-ઇડીટીએ બફર (ફ્લુકા એનાલિટીકલ) વડે કોગળા કરીને અથવા જંતુરહિત પીપેટ ટીપ્સ સાથે તકતીઓ એકઠી કરીને પ્લેટમાંથી ફેજ કાઢવામાં આવ્યા હતા.ફેજને પોલિઇથિલિન ગ્લાયકોલ (PEG 8000) રેસિપિટેશન (પ્રોમેગા)ના એક રાઉન્ડ સાથે કલ્ચર સુપરનેટન્ટ અથવા એક્સટ્રક્શન બફરથી અલગ કરવામાં આવ્યા હતા અને ટ્રિસ-EDTA બફરમાં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા હતા.
એમ્પ્લીફાઇડ ફેજને ઇન્ટ્રાવેનસ (IV) ઇન્જેક્શન (500 μl/પ્રાણી) પહેલાં એન્ડોટોક્સિન રિમૂવલ બીડ્સ (મિલટેની બાયોટેક) નો ઉપયોગ કરીને એન્ડોટોક્સિન દૂર કરવાના 2-3 રાઉન્ડ કરવામાં આવ્યા હતા.પ્રથમ રાઉન્ડમાં, 2×1012 ફેજીસ રજૂ કરવામાં આવ્યા હતા;બીજામાં, 2×1010 તબક્કા;ત્રીજા અને ચોથા પસંદગીના રાઉન્ડમાં, પ્રાણી દીઠ 2×109 તબક્કા.CSF માં ફેજની સામગ્રી અને સૂચવેલા સમયે એકત્રિત કરાયેલા લોહીના નમૂનાઓ ઉત્પાદકની સૂચનાઓ (T7 સિલેક્ટ સિસ્ટમ મેન્યુઅલ) અનુસાર પ્લેકની ગણતરી દ્વારા નક્કી કરવામાં આવી હતી.ફેજ સિલેક્શન પૂંછડીના નસમાં શુદ્ધ પુસ્તકાલયોના નસમાં ઇન્જેક્શન દ્વારા અથવા અગાઉના પસંદગીના રાઉન્ડમાંથી સીએસએફમાંથી કા ge ેલા ફેજના ફરીથી ઇન્જેક્શન દ્વારા કરવામાં આવ્યું હતું, અને ત્યારબાદની લણણી 10 મિનિટ, 30 મિનિટ, 60 મિનિટ, 90 મિનિટ, 120 મિનિટ, 180 મિનિટ, અને 240 મિનિટ અનુક્રમે સીએસએફ અને લોહીના નમૂનાઓ પર કરવામાં આવી હતી.ઇન વિવો પૅનિંગના કુલ ચાર રાઉન્ડ હાથ ધરવામાં આવ્યા હતા જેમાં પસંદગીના પ્રથમ ત્રણ રાઉન્ડ દરમિયાન પસંદ કરેલી બે શાખાઓ અલગ-અલગ સંગ્રહિત અને વિશ્લેષણ કરવામાં આવી હતી.પસંદગીના પ્રથમ બે રાઉન્ડમાંથી CSF માંથી કાઢવામાં આવેલા તમામ ફેજ ઇન્સર્ટ 454/Roche pyrosequencing ને આધિન હતા, જ્યારે પસંદગીના છેલ્લા બે રાઉન્ડમાંથી CSF માંથી કાઢવામાં આવેલા તમામ ક્લોન્સ મેન્યુઅલી ક્રમબદ્ધ હતા.પસંદગીના પ્રથમ રાઉન્ડના તમામ રક્ત તબક્કાઓ પણ 454/રોચે પાયરોસેક્વન્સિંગને આધિન હતા.ફેજ ક્લોન્સના ઇન્જેક્શન માટે, પસંદ કરેલા ફેજીસને E. coli (BL5615) માં 500 cm2 પ્લેટો પર 37°C પર 4 કલાક માટે વિસ્તૃત કરવામાં આવ્યા હતા.ટીબી માધ્યમમાં વ્યક્તિગત રીતે પસંદ કરેલ અને મેન્યુઅલી અનુક્રમિત ક્લોન્સનો પ્રચાર કરવામાં આવ્યો હતો.ફેજ નિષ્કર્ષણ, એન્ડોટોક્સિનનું શુદ્ધિકરણ અને દૂર કર્યા પછી (ઉપર વર્ણવ્યા પ્રમાણે), 300 μl માં 2×1010 ફેજ/પ્રાણીને એક પૂંછડીની નસમાં નસમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા.
સિક્વન્સ ડેટાનું પ્રીપ્રોસેસિંગ અને ગુણાત્મક ફિલ્ટરિંગ.Raw 454/Roche ડેટાને વિક્રેતા સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરીને બાઈનરી સ્ટાન્ડર્ડ સ્ટ્રીમ મેપ ફોર્મેટ (sff) માંથી Pearson Human Readable Format (fasta)માં રૂપાંતરિત કરવામાં આવ્યો હતો.ન્યુક્લિયોટાઇડ ક્રમની આગળની પ્રક્રિયા નીચે વર્ણવ્યા મુજબ માલિકીના C પ્રોગ્રામ્સ અને સ્ક્રિપ્ટ્સ (અપ્રકાશિત સોફ્ટવેર પેકેજ) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી.પ્રાથમિક માહિતીના વિશ્લેષણમાં સખત મલ્ટિ-સ્ટેજ ફિલ્ટરિંગ પ્રક્રિયાઓનો સમાવેશ થાય છે.To filter out reads that did not contain a valid 12mer insert DNA sequence, the reads were sequentially aligned to start label (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stop label (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) and background insert (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) using the global Needleman-Wunsch test.સંરેખણ પ્રતિ સંરેખણ 31 સુધી 2 વિસંગતતાઓને મંજૂરી આપે છે.તેથી, સ્ટાર્ટ અને સ્ટોપ ટૅગ્સ વિના વાંચે છે અને બેકગ્રાઉન્ડ ઇન્સર્ટ્સ ધરાવતા વાંચન, એટલે કે, અનુમતિની અનુમતિ કરતા સંખ્યા કરતાં વધુ ગોઠવણીઓ, લાઇબ્રેરીમાંથી દૂર કરવામાં આવી હતી.બાકીના વાંચન માટે, N-mer DNA ક્રમ જે સ્ટાર્ટ માર્કથી વિસ્તરે છે અને સ્ટોપ માર્ક પહેલાં સમાપ્ત થાય છે તે મૂળ રીડ સિક્વન્સમાંથી એક્સાઈઝ કરવામાં આવ્યો હતો અને આગળ પ્રક્રિયા કરવામાં આવી હતી (ત્યારબાદ "ઇનસર્ટ" તરીકે ઓળખવામાં આવે છે).દાખલના અનુવાદ પછી, પ્રાઈમરના 5′ છેડે પ્રથમ સ્ટોપ કોડન પછીનો ભાગ દાખલમાંથી દૂર કરવામાં આવે છે.વધુમાં, પ્રાઈમરના 3′ છેડે અપૂર્ણ કોડોન તરફ દોરી જતા ન્યુક્લિયોટાઈડ્સને પણ દૂર કરવામાં આવ્યા હતા.માત્ર બેકગ્રાઉન્ડ સિક્વન્સ ધરાવતા ઇન્સર્ટ્સને બાકાત રાખવા માટે, એમિનો એસિડ પેટર્ન "PAG" થી શરૂ થતા અનુવાદિત ઇન્સર્ટ્સ પણ દૂર કરવામાં આવ્યા હતા.લાઇબ્રેરીમાંથી 3 કરતાં ઓછી એમિનો એસિડની પોસ્ટ-ટ્રાન્સલેશનલ લંબાઈવાળા પેપ્ટાઇડ્સ દૂર કરવામાં આવ્યા હતા.છેલ્લે, ઇન્સર્ટ પૂલમાં રીડન્ડન્સી દૂર કરો અને દરેક અનન્ય ઇન્સર્ટની આવર્તન નક્કી કરો.આ વિશ્લેષણના પરિણામોમાં ન્યુક્લિયોટાઇડ સિક્વન્સ (ઇન્સર્ટ) અને તેમની (વાંચવા) ફ્રીક્વન્સીઝ (પૂરક આકૃતિઓ 1c અને 2) ની સૂચિ શામેલ છે.
ક્રમ સમાનતા દ્વારા જૂથ N-mer DNA દાખલ કરે છે: 454/Roche-વિશિષ્ટ સિક્વન્સિંગ ભૂલોને દૂર કરવા (જેમ કે હોમોપોલિમર એક્સ્ટેંશનના ક્રમમાં સમસ્યાઓ) અને ઓછી મહત્વની રીડન્ડન્સી દૂર કરવા માટે, અગાઉ ફિલ્ટર કરેલ N-mer DNA સિક્વન્સ ઇન્સર્ટ (ઇન્સર્ટ) સમાનતા દ્વારા સૉર્ટ કરવામાં આવે છે.નીચે પ્રમાણે વ્યાખ્યાયિત પુનરાવર્તિત અલ્ગોરિધમનો ઉપયોગ કરીને નિવેશ (2 બિન-મેળપાતી પાયા સુધીની મંજૂરી) : નિવેશને પ્રથમ તેમની આવર્તન (સૌથી વધુથી નીચું) દ્વારા વર્ગીકૃત કરવામાં આવે છે, અને જો તે સમાન હોય, તો લંબાઈ દ્વારા તેમના ગૌણ સૉર્ટ દ્વારા (સૌથી લાંબી થી ટૂંકી) ).આમ, સૌથી વધુ વારંવાર અને સૌથી લાંબી નિવેશ પ્રથમ "જૂથ" ને વ્યાખ્યાયિત કરે છે.જૂથ આવર્તન કી આવર્તન પર સેટ છે.પછી, સૉર્ટ કરેલ સૂચિમાં બાકી રહેલા દરેક નિવેશને જોડીમાં નીડલમેન-વુંચ ગોઠવણી દ્વારા જૂથમાં ઉમેરવાનો પ્રયાસ કરવામાં આવ્યો હતો.જો સંરેખણમાં અસંગતતા, નિવેશ અથવા કાઢી નાખવાની સંખ્યા 2 ની થ્રેશોલ્ડથી વધુ ન હોય, તો જૂથમાં એક નિવેશ ઉમેરવામાં આવે છે, અને એકંદર જૂથની આવર્તન કેટલી વાર નિવેશ ઉમેરવામાં આવી હતી તેનાથી વધે છે.જૂથમાં ઉમેરવામાં આવેલ નિવેશને વપરાયેલ તરીકે ચિહ્નિત કરવામાં આવે છે અને આગળની પ્રક્રિયામાંથી બાકાત રાખવામાં આવે છે.જો પહેલાથી અસ્તિત્વમાં રહેલા જૂથમાં દાખલ ક્રમ ઉમેરી શકાતો નથી, તો દાખલ ક્રમનો ઉપયોગ યોગ્ય દાખલ આવર્તન સાથે નવું જૂથ બનાવવા માટે થાય છે અને વપરાયેલ તરીકે ચિહ્નિત કરવામાં આવે છે.પુનરાવૃત્તિ સમાપ્ત થાય છે જ્યારે દરેક નિવેશ ક્રમનો ઉપયોગ કાં તો નવું જૂથ બનાવવા માટે કરવામાં આવે છે અથવા પહેલાથી અસ્તિત્વમાં રહેલા જૂથમાં સમાવેશ કરી શકાય છે.છેવટે, ન્યુક્લિયોટાઇડ્સનો સમાવેશ કરતી જૂથબદ્ધ દાખલો આખરે પેપ્ટાઇડ સિક્વન્સ (પેપ્ટાઇડ લાઇબ્રેરીઓ) માં અનુવાદિત થાય છે.આ વિશ્લેષણનું પરિણામ એ નિવેશનો સમૂહ અને તેમની અનુરૂપ ફ્રીક્વન્સીઝ છે જે સળંગ વાંચનની સંખ્યા બનાવે છે (પૂરક ફિગ. 2).
મોટિફ જનરેશન: અનન્ય પેપ્ટાઇડ્સની સૂચિના આધારે, નીચે બતાવ્યા પ્રમાણે તમામ સંભવિત એમિનો એસિડ પેટર્ન (AA) ધરાવતી લાઇબ્રેરી બનાવવામાં આવી હતી.લંબાઈ 3 ની દરેક સંભવિત પેટર્ન પેપ્ટાઇડમાંથી કાઢવામાં આવી હતી અને તેની વિપરીત પેટર્ન તમામ પેટર્ન (ટ્રિપેપ્ટાઇડ્સ) ધરાવતી સામાન્ય મોટિફ લાઇબ્રેરી સાથે ઉમેરવામાં આવી હતી.અત્યંત પુનરાવર્તિત ઉદ્દેશ્યની લાઇબ્રેરીઓ ક્રમબદ્ધ કરવામાં આવી હતી અને રીડન્ડન્સી દૂર કરવામાં આવી હતી.પછી, મોટિફ લાઇબ્રેરીમાં દરેક ટ્રિપેપ્ટાઇડ માટે, અમે કોમ્પ્યુટેશનલ ટૂલ્સનો ઉપયોગ કરીને લાઇબ્રેરીમાં તેની હાજરી માટે તપાસ કરી.આ કિસ્સામાં, મળેલ મોટિફ ટ્રિપેપ્ટાઇડ ધરાવતા પેપ્ટાઇડની આવૃત્તિ ઉમેરવામાં આવે છે અને મોટિફ લાઇબ્રેરી ("મોટિફ્સની સંખ્યા") માં મોટિફને સોંપવામાં આવે છે.મોટિફ જનરેશનનું પરિણામ એ દ્વિ-પરિમાણીય એરે છે જેમાં ટ્રિપેપ્ટાઇડ્સ (મોટિફ્સ) ની તમામ ઘટનાઓ અને તેમના સંબંધિત મૂલ્યો છે, જે ક્રમબદ્ધ રીડની સંખ્યા છે જે રીડ્સને ફિલ્ટર, જૂથબદ્ધ અને અનુવાદિત કરવામાં આવે ત્યારે અનુરૂપ મોટિફમાં પરિણમે છે.ઉપર વિગતવાર વર્ણવ્યા મુજબ મેટ્રિક્સ.
પ્રધાનતત્ત્વ અને અનુરૂપ સ્કેટરપ્લોટ્સની સંખ્યાનું સામાન્યકરણ: દરેક નમૂના માટેના પ્રધાનતત્ત્વોની સંખ્યાનો ઉપયોગ કરીને સામાન્ય કરવામાં આવી હતી
જ્યાં ni એ વિષય i ધરાવતા વાંચનની સંખ્યા છે.આમ, vi એ નમૂનામાં મોટિફ i ધરાવતા રીડ (અથવા પેપ્ટાઇડ્સ)ની ટકાવારી આવર્તન દર્શાવે છે.ફિશરની ચોક્કસ કસોટીનો ઉપયોગ કરીને બિન-સામાન્ય રૂપરેખાઓની સંખ્યા માટે પી-મૂલ્યોની ગણતરી કરવામાં આવી હતી.હેતુઓની સંખ્યાના સહસંબંધોના સંદર્ભમાં, સ્પીયરમેનના સહસંબંધોની ગણતરી આર સાથેના હેતુઓની સામાન્ય સંખ્યાનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી.
પેપ્ટાઇડ લાઇબ્રેરીમાં દરેક સ્થાન પર એમિનો એસિડની સામગ્રીની કલ્પના કરવા માટે, વેબ લોગોગ્રામ 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) બનાવવામાં આવ્યા હતા.પ્રથમ, 12-મેર પેપ્ટાઈડની દરેક સ્થિતિ પર એમિનો એસિડની સામગ્રી 20×12 મેટ્રિક્સમાં સંગ્રહિત થાય છે.તે પછી, દરેક સ્થાન પર સમાન સંબંધિત એમિનો એસિડ સામગ્રી ધરાવતા 1000 પેપ્ટાઈડ્સનો સમૂહ ફાસ્ટા-સિક્વન્સ ફોર્મેટમાં જનરેટ થાય છે અને વેબ-લોગો 3 માટે ઇનપુટ તરીકે પ્રદાન કરવામાં આવે છે, જે દરેક સ્થાન પર સંબંધિત એમિનો એસિડ સામગ્રીનું ગ્રાફિકલ રજૂઆત કરે છે.આપેલ પેપ્ટાઇડ લાઇબ્રેરી માટે.બહુપરીમાણીય ડેટાસેટ્સને વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવા માટે, R માં આંતરિક રીતે વિકસિત સાધનનો ઉપયોગ કરીને હીટ નકશા બનાવવામાં આવ્યા હતા (બાયોસહીટમેપ, હજુ સુધી રિલીઝ થનાર R પેકેજ).ગરમીના નકશામાં પ્રસ્તુત ડેન્ડ્રોગ્રામની ગણતરી યુક્લિડિયન અંતર મેટ્રિક સાથે વોર્ડની અધિક્રમિક ક્લસ્ટરિંગ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી.મોટિફ સ્કોરિંગ ડેટાના આંકડાકીય વિશ્લેષણ માટે, ફિશરની ચોક્કસ કસોટીનો ઉપયોગ કરીને અસાધારણ સ્કોરિંગ માટે P મૂલ્યોની ગણતરી કરવામાં આવી હતી.વિદ્યાર્થીની ટી-ટેસ્ટ અથવા ANOVA નો ઉપયોગ કરીને અન્ય ડેટાસેટ્સ માટે P-મૂલ્યોની ગણતરી R માં કરવામાં આવી હતી.
પસંદ કરેલ ફેજ ક્લોન્સ અને ઇન્સર્ટ્સ વગરના ફેજીસને પૂંછડીની નસ (300 μl PBS માં 2×1010 ફેજીસ/પ્રાણી) દ્વારા નસમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા.પરફ્યુઝન અને અનુગામી ફિક્સેશનની દસ મિનિટ પહેલાં, તે જ પ્રાણીઓને 100 μl DyLight594-લેબલવાળા લેક્ટીન (વેક્ટર લેબોરેટરીઝ ઇન્ક., DL-1177) સાથે નસમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા.ફેજ ઈન્જેક્શનની 60 મિનિટ પછી, ઉંદરોને 50 મિલી પીબીએસ અને 50 મિલી 4% પીએફએ/પીબીએસ સાથે હૃદય દ્વારા પરફ્યુઝ કરવામાં આવ્યા હતા.મગજના નમૂનાઓ 4% PFA/PBS માં રાતોરાત નિશ્ચિત કરવામાં આવ્યા હતા અને 4°C પર રાતોરાત 30% સુક્રોઝમાં પલાળવામાં આવ્યા હતા.નમૂનાઓ OCT મિશ્રણમાં ફ્લેશ સ્થિર છે.સ્થિર નમૂનાઓનું ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિકલ વિશ્લેષણ ઓરડાના તાપમાને 1% BSA સાથે અવરોધિત 30 µm ક્રાયોસેક્શન પર કરવામાં આવ્યું હતું અને 4 °C તાપમાને T7 ફેજ (Novus NB 600-376A) સામે પોલીક્લોનલ FITC-લેબલ એન્ટિબોડીઝ સાથે ઉકાળવામાં આવ્યું હતું.રાતોરાત સેવન કરો.અંતે, વિભાગોને PBS વડે 3 વખત ધોવામાં આવ્યા અને કોન્ફોકલ લેસર માઈક્રોસ્કોપ (Leica TCS SP5) વડે તપાસ કરવામાં આવી.
98% ની ન્યૂનતમ શુદ્ધતા સાથેના તમામ પેપ્ટાઇડ્સ જેનસ્ક્રિપ્ટ યુએસએ દ્વારા સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યા હતા, બાયોટિનાલેટેડ અને લાયોફિલાઇઝ્ડ.બાયોટિન એન-ટર્મિનસ પર વધારાના ટ્રિપલ ગ્લાયસીન સ્પેસર દ્વારા બંધાયેલું છે.માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રીનો ઉપયોગ કરીને તમામ પેપ્ટાઈડ્સ તપાસો.
સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન (સિગ્મા S0677)ને બાયોટિનાલેટેડ પેપ્ટાઈડના 5-ગણા સમતુલ્ય વધારા સાથે, બાયોટિનીલેટેડ BACE1 અવરોધક પેપ્ટાઈડ, અથવા બાયોટિનિલેટેડ BACE1 અવરોધક પેપ્ટાઈડના સંયોજન (3:1 ગુણોત્તર) અને BACE1 અવરોધક પેપ્ટાઈડ- SOBS101% માં SOBS1% માં મિશ્રિત કરવામાં આવ્યું હતું.ઈન્જેક્શન પહેલાં ઓરડાના તાપમાને 1 કલાક.સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન-કન્જુગેટેડ પેપ્ટાઈડ્સને 10 મિલિગ્રામ/કિલોગ્રામની માત્રામાં મગજની પોલાણવાળા ઉંદરોની પૂંછડીની નસોમાંની એકમાં નસમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા.
ELISA દ્વારા સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન-પેપ્ટાઇડ સંકુલની સાંદ્રતાનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું.Nunc મેક્સિસોર્પ માઇક્રોટાઇટર પ્લેટ્સ (સિગ્મા) 1.5 μg/ml માઉસ એન્ટિ-સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન એન્ટિબોડી (થર્મો, MA1-20011) સાથે 4°C પર રાતોરાત કોટેડ કરવામાં આવી હતી.ઓરડાના તાપમાને 2 કલાક સુધી બ્લોક કર્યા પછી (બ્લૉકિંગ બફર: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% જિલેટીન, 1% BSA), પ્લેટને 0.05% Tween-20/PBS (વૉશ બફર) વડે ધોઈ નાખો અને 3 પ્લુફ સેમ્પલ સાથે બ્લૉક વેલ ઉમેરવામાં આવ્યા હતા. લાસ્મા 1:10,000, CSF 1:115).પછી પ્લેટને ડિટેક્શન એન્ટિબોડી (1 μg/ml, એન્ટિ-સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન-HRP, Novus NB120-7239) સાથે 4°C પર રાતોરાત ઉકાળવામાં આવી હતી.ધોવાના ત્રણ પગલાં પછી, 20 મિનિટ સુધી ટીએમબી સબસ્ટ્રેટ સોલ્યુશન (રોચે) માં ઇન્ક્યુબેશન દ્વારા સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન શોધી કાઢવામાં આવ્યું હતું.1M H2SO4 સાથે રંગ વિકાસ બંધ કર્યા પછી, શોષણને 450 nm પર માપો.
ઉત્પાદકના પ્રોટોકોલ (વાકો, 294-64701) અનુસાર Aβ(1-40) ELISA દ્વારા streptavidin-peptide-BACE1 અવરોધક સંકુલના કાર્યનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું.સંક્ષિપ્તમાં, CSF નમૂનાઓ પ્રમાણભૂત મંદ (1:23) માં પાતળું કરવામાં આવ્યા હતા અને BNT77 કેપ્ચર એન્ટિબોડી સાથે કોટેડ 96-વેલ પ્લેટોમાં 4°C પર રાતોરાત ઉકાળવામાં આવ્યા હતા.ધોવાના પાંચ પગલાંઓ પછી, HRP-સંયોજિત BA27 એન્ટિબોડી ઉમેરવામાં આવી હતી અને તેને 4° સે. પર 2 કલાક માટે ઉકાળવામાં આવી હતી, ત્યારબાદ પાંચ ધોવાના પગલાંઓ.Aβ(1–40) TMB સોલ્યુશનમાં ઓરડાના તાપમાને 30 મિનિટ સુધી ઉકાળવાથી શોધી કાઢવામાં આવ્યું હતું.સ્ટોપ સોલ્યુશન સાથે રંગનો વિકાસ બંધ થઈ ગયા પછી, શોષણને 450 એનએમ પર માપો.Aβ(1–40) ELISA પહેલા પ્લાઝ્મા નમૂનાઓ ઘન તબક્કાના નિષ્કર્ષણને આધિન હતા.96-વેલ પ્લેટમાં પ્લાઝ્મા 0.2% DEA (સિગ્મા) માં ઉમેરવામાં આવ્યું હતું અને ઓરડાના તાપમાને 30 મિનિટ સુધી ઉકાળવામાં આવ્યું હતું.SPE પ્લેટ્સ (ઓએસિસ, 186000679) ને પાણી અને 100% મિથેનોલથી ક્રમિક રીતે ધોવા પછી, પ્લાઝ્મા સેમ્પલ SPE પ્લેટ્સમાં ઉમેરવામાં આવ્યા અને તમામ પ્રવાહી દૂર કરવામાં આવ્યા.નમૂનાઓ ધોવાઇ ગયા હતા (પહેલા 5% મિથેનોલ સાથે પછી 30% મિથેનોલ) અને 2% NH4OH/90% મિથેનોલથી અલગ કરવામાં આવ્યા હતા.સતત N2 કરંટ પર 99 મિનિટ માટે 55°C પર ઇલ્યુએટને સૂકવ્યા પછી, નમૂનાઓ પ્રમાણભૂત મંદીમાં ઘટાડી દેવામાં આવ્યા હતા અને ઉપર વર્ણવ્યા પ્રમાણે Aβ(1–40) માપવામાં આવ્યા હતા.
આ લેખ કેવી રીતે ટાંકવો: Urich, E. et al.વિવોમાં ઓળખાયેલ ટ્રાન્ઝિટ પેપ્ટાઇડ્સનો ઉપયોગ કરીને મગજમાં કાર્ગો ડિલિવરી.વિજ્ઞાન5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
લિખોટા જે., સ્કજોરીંજ ટી., થોમસેન એલબી અને મૂસ ટી. લક્ષિત ઉપચારનો ઉપયોગ કરીને મગજમાં મેક્રોમોલેક્યુલર દવાઓની ડિલિવરી.જર્નલ ઓફ ન્યુરોકેમિસ્ટ્રી 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., અને Martinez-Martinez, P. રક્ત-મગજના અવરોધને પાર પેપ્ટાઈડ અને પ્રોટીન દવાઓની ડિલિવરી.પ્રોગ ન્યુરોબાયોલ 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
પાર્ડ્રિજ, ડબ્લ્યુએમ બ્લડ-બ્રેઈન બેરિયરઃ એ બોટલનેક ઈન બ્રેઈન ડ્રગ ડેવલપમેન્ટ.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
જોહાન્સન, કેઇ, ડંકન, જેએ, સ્ટોપા, ઇજી, અને બાયર્ડ, એ. કોરોઇડ પ્લેક્સસ-સીએસએફ પાથવે દ્વારા મગજને સુધારેલ ડ્રગ ડિલિવરી અને લક્ષ્યીકરણ માટેની સંભાવનાઓ.ફાર્માસ્યુટિકલ સંશોધન 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
પાર્ડ્રીજ, ડબલ્યુએમ મગજની ડિલિવરી માટે મોલેક્યુલર ટ્રોજન હોર્સ સાથે બાયોફાર્માસ્યુટિકલ્સનું આધુનિકીકરણ.બાયોકોનજુગ કેમ 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
પાર્ડ્રીજ, WM રીસેપ્ટર-મધ્યસ્થી પેપ્ટાઈડ રક્ત-મગજના અવરોધને પાર કરે છે.એન્ડોક્ર રેવ. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.મોનોવેલેન્ટ મોલેક્યુલર શટલનો ઉપયોગ કરીને મગજના પ્રવેશ અને ઉપચારાત્મક એન્ટિબોડીઝની અસરકારકતામાં વધારો.ન્યુરોન 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
બિએન-લી, એન. એટ અલ.ટ્રાન્સફરિન રીસેપ્ટર (TfR) ટ્રાન્સપોર્ટ TfR એન્ટિબોડીઝના એફિનિટી વેરિઅન્ટ્સના મગજના શોષણને નિર્ધારિત કરે છે.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).