Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર.તમે જે બ્રાઉઝર સંસ્કરણનો ઉપયોગ કરી રહ્યાં છો તે મર્યાદિત CSS સપોર્ટ ધરાવે છે.શ્રેષ્ઠ અનુભવ માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે અપડેટ કરેલ બ્રાઉઝરનો ઉપયોગ કરો (અથવા Internet Explorer માં સુસંગતતા મોડને અક્ષમ કરો).આ દરમિયાન, સતત સમર્થન સુનિશ્ચિત કરવા માટે, અમે શૈલીઓ અને JavaScript વિના સાઇટને રેન્ડર કરીશું.
લિક્વિડ બાયોપ્સી (LB) એ એક ખ્યાલ છે જે બાયોમેડિકલ ક્ષેત્રમાં ઝડપથી લોકપ્રિયતા મેળવી રહી છે.આ ખ્યાલ મુખ્યત્વે પરિભ્રમણ કરતા એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર ડીએનએ (ccfDNA) ના ટુકડાઓની શોધ પર આધારિત છે, જે મુખ્યત્વે વિવિધ પેશીઓમાં કોષના મૃત્યુ પછી નાના ટુકડા તરીકે પ્રકાશિત થાય છે.આ ટુકડાઓનો એક નાનો હિસ્સો વિદેશી (વિદેશી) પેશીઓ અથવા સજીવોમાંથી ઉદ્ભવે છે.વર્તમાન કાર્યમાં, અમે આ ખ્યાલને છીપમાં લાગુ કર્યો છે, જે એક સેન્ટિનલ પ્રજાતિ છે જે તેમની ઉચ્ચ દરિયાઈ પાણીની શુદ્ધિકરણ ક્ષમતા માટે જાણીતી છે.અમે દરિયાઇ દરિયાકાંઠાની ઇકોસિસ્ટમની જૈવવિવિધતા વિશે માહિતી પ્રદાન કરવા માટે વિવિધ સ્રોતોમાંથી પર્યાવરણીય ડીએનએ ટુકડાઓ મેળવવા માટે કુદરતી ફિલ્ટર તરીકે કાર્ય કરવા માટે મસલ્સની ક્ષમતાનો ઉપયોગ કરીએ છીએ.અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે મસલ હેમોલિમ્ફમાં DNA ટુકડાઓ છે જે 1 થી 5 kb સુધીના કદમાં મોટા પ્રમાણમાં બદલાય છે.શોટગન સિક્વન્સિંગ દર્શાવે છે કે મોટી સંખ્યામાં ડીએનએ ટુકડાઓ વિદેશી માઇક્રોબાયલ મૂળના છે.તેમાંથી, અમને બેક્ટેરિયા, આર્કિઆ અને વાયરસમાંથી ડીએનએ ટુકડાઓ મળ્યા, જેમાં સામાન્ય રીતે દરિયાકાંઠાના દરિયાઇ ઇકોસિસ્ટમ્સમાં જોવા મળતા વિવિધ યજમાનોને ચેપ લગાડવા માટે જાણીતા વાયરસનો સમાવેશ થાય છે.નિષ્કર્ષમાં, અમારો અભ્યાસ દર્શાવે છે કે મસલ્સ પર લાગુ LB ની વિભાવના દરિયાઇ દરિયાકાંઠાની ઇકોસિસ્ટમ્સમાં માઇક્રોબાયલ વિવિધતા વિશે જ્ઞાનના સમૃદ્ધ પરંતુ હજુ સુધી અન્વેષિત સ્ત્રોતનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે.
દરિયાઈ જીવસૃષ્ટિની જૈવવિવિધતા પર આબોહવા પરિવર્તન (CC) ની અસર એ સંશોધનનો ઝડપથી વિકસતો વિસ્તાર છે.ગ્લોબલ વોર્મિંગ માત્ર મહત્વપૂર્ણ શારીરિક તાણનું કારણ નથી, પરંતુ દરિયાઇ જીવોની થર્મલ સ્થિરતાની ઉત્ક્રાંતિની મર્યાદાઓને પણ દબાણ કરે છે, સંખ્યાબંધ પ્રજાતિઓના નિવાસસ્થાનને અસર કરે છે, તેમને વધુ અનુકૂળ પરિસ્થિતિઓ [1, 2] શોધવા માટે પ્રોત્સાહિત કરે છે.મેટાઝોઆનની જૈવવિવિધતાને અસર કરવા ઉપરાંત, CC યજમાન-માઈક્રોબાયલ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓના નાજુક સંતુલનને વિક્ષેપિત કરે છે.આ માઇક્રોબાયલ ડિસબેક્ટેરિયોસિસ દરિયાઈ જીવસૃષ્ટિ માટે ગંભીર ખતરો છે કારણ કે તે દરિયાઈ જીવોને ચેપી રોગાણુઓ માટે વધુ સંવેદનશીલ બનાવે છે [3, 4].એવું માનવામાં આવે છે કે સામૂહિક મૃત્યુમાં SS મહત્વની ભૂમિકા ભજવે છે, જે વૈશ્વિક દરિયાઈ ઇકોસિસ્ટમના સંચાલન માટે ગંભીર સમસ્યા છે [5, 6].ઘણી દરિયાઈ પ્રજાતિઓની આર્થિક, પર્યાવરણીય અને પોષક અસરોને જોતાં આ એક મહત્વપૂર્ણ મુદ્દો છે.આ ખાસ કરીને ધ્રુવીય પ્રદેશોમાં રહેતા બાયવાલ્વ માટે સાચું છે, જ્યાં CK ની અસરો વધુ તાત્કાલિક અને ગંભીર હોય છે [6, 7].હકીકતમાં, બાયવલ્વ્સ જેમ કે માયટીલસ એસપીપી.દરિયાઈ જીવસૃષ્ટિ પર સીસીની અસરોને મોનિટર કરવા માટે વ્યાપકપણે ઉપયોગમાં લેવાય છે.આશ્ચર્યની વાત નથી કે, તેમના સ્વાસ્થ્યની દેખરેખ રાખવા માટે પ્રમાણમાં મોટી સંખ્યામાં બાયોમાર્કર્સ વિકસાવવામાં આવ્યા છે, ઘણીવાર એન્ઝાઈમેટિક પ્રવૃત્તિ અથવા સેલ્યુલર ફંક્શન્સ જેમ કે સેલ સદ્ધરતા અને ફેગોસિટીક પ્રવૃત્તિ [8] પર આધારિત કાર્યાત્મક બાયોમાર્કર્સનો સમાવેશ કરતા બે-સ્તરના અભિગમનો ઉપયોગ કરે છે.આ પદ્ધતિઓમાં ચોક્કસ દબાણ સૂચકાંકોની સાંદ્રતાના માપનનો પણ સમાવેશ થાય છે જે મોટા પ્રમાણમાં દરિયાના પાણીના શોષણ પછી નરમ પેશીઓમાં એકઠા થાય છે.જો કે, ઉચ્ચ ગાળણ ક્ષમતા અને બાયવલ્વ્સની અર્ધ-ખુલ્લી રુધિરાભિસરણ પ્રણાલી પ્રવાહી બાયોપ્સી (LB) ના ખ્યાલનો ઉપયોગ કરીને નવા હેમોલિમ્ફ બાયોમાર્કર્સ વિકસાવવાની તક પૂરી પાડે છે, જે દર્દીના સંચાલન માટે એક સરળ અને ન્યૂનતમ આક્રમક અભિગમ છે.લોહીના નમૂનાઓ [9, 10].જોકે માનવ LB માં અનેક પ્રકારના ફરતા અણુઓ મળી શકે છે, આ ખ્યાલ મુખ્યત્વે પ્લાઝ્મામાં ફરતા એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર DNA (ccfDNA) ટુકડાઓના ડીએનએ સિક્વન્સિંગ વિશ્લેષણ પર આધારિત છે.વાસ્તવમાં, માનવ પ્લાઝ્મામાં ફરતા ડીએનએની હાજરી 20મી સદીના મધ્યભાગથી જાણીતી છે [૧૧], પરંતુ તાજેતરના વર્ષોમાં જ ઉચ્ચ-થ્રુપુટ સિક્વન્સિંગ પદ્ધતિઓના આગમનથી ccfDNA પર આધારિત ક્લિનિકલ નિદાન થયું છે.આ ફરતા ડીએનએ ટુકડાઓની હાજરી સેલ મૃત્યુ પછી જીનોમિક ડીએનએ (પરમાણુ અને મિટોકોન્ડ્રીયલ) ના નિષ્ક્રિય પ્રકાશનને કારણે છે. સ્વસ્થ વ્યક્તિઓમાં, ccfDNA ની સાંદ્રતા સામાન્ય રીતે ઓછી હોય છે (<10 ng/mL) પરંતુ વિવિધ પેથોલોજીથી પીડિત અથવા તણાવનો ભોગ બનેલા દર્દીઓમાં 5-10 ગણો વધારો થઈ શકે છે, જેના પરિણામે પેશીઓને નુકસાન થાય છે. સ્વસ્થ વ્યક્તિઓમાં, ccfDNA ની સાંદ્રતા સામાન્ય રીતે ઓછી હોય છે (<10 ng/mL) પરંતુ વિવિધ પેથોલોજીથી પીડિત અથવા તણાવનો ભોગ બનેલા દર્દીઓમાં 5-10 ગણો વધારો થઈ શકે છે, જેના પરિણામે પેશીઓને નુકસાન થાય છે. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больный низкая ергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. તંદુરસ્ત લોકોમાં, cccDNA ની સાંદ્રતા સામાન્ય રીતે ઓછી હોય છે (<10 ng/mL), પરંતુ વિવિધ પેથોલોજી ધરાવતા દર્દીઓમાં અથવા તણાવ હેઠળના દર્દીઓમાં તે 5-10 ગણો વધી શકે છે જે પેશીઓને નુકસાન તરફ દોરી જાય છે.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力渂，但在患有各种病理或承受压力渂从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 叀受 或 承受 厗5-10 倍, 从而 组织.。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 ng/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у павциманчемотого павцимазинто или стрессом, что приводит к повреждению тканей. તંદુરસ્ત વ્યક્તિઓમાં ccfDNA સાંદ્રતા સામાન્ય રીતે ઓછી (<10 ng/ml) હોય છે, પરંતુ વિવિધ પેથોલોજી અથવા તણાવ ધરાવતા દર્દીઓમાં 5-10-ગણો વધારો થઈ શકે છે, જેના પરિણામે પેશીઓને નુકસાન થાય છે.ccfDNA ટુકડાઓનું કદ વ્યાપકપણે બદલાય છે, પરંતુ સામાન્ય રીતે 150 થી 200 bp સુધીની હોય છે.[12].સ્વ-ઉત્પન્ન ccfDNA નું વિશ્લેષણ, એટલે કે, સામાન્ય અથવા રૂપાંતરિત યજમાન કોષોમાંથી ccfDNA, નો ઉપયોગ પરમાણુ અને/અથવા માઇટોકોન્ડ્રીયલ જીનોમમાં હાજર આનુવંશિક અને એપિજેનેટિક ફેરફારોને શોધવા માટે થઈ શકે છે, જેનાથી ચિકિત્સકોને ચોક્કસ મોલેક્યુલર-લક્ષિત ઉપચાર પસંદ કરવામાં મદદ મળે છે [13].જોકે, ccfDNA સગર્ભાવસ્થા દરમિયાન ગર્ભના કોષોમાંથી અથવા ટ્રાન્સપ્લાન્ટેડ અંગો [14,15,16,17] માંથી ccfDNA જેવા વિદેશી સ્ત્રોતોમાંથી મેળવી શકાય છે.ccfDNA એ ચેપી એજન્ટ (વિદેશી) ના ન્યુક્લીક એસિડની હાજરી શોધવા માટે પણ માહિતીનો એક મહત્વપૂર્ણ સ્ત્રોત છે, જે ચેપગ્રસ્ત પેશીઓની આક્રમક બાયોપ્સી ટાળીને, રક્ત સંસ્કૃતિઓ દ્વારા ઓળખાતા ન હોય તેવા વ્યાપક ચેપને બિન-આક્રમક શોધવાની મંજૂરી આપે છે [18].તાજેતરના અભ્યાસોએ ખરેખર દર્શાવ્યું છે કે માનવ રક્તમાં માહિતીનો સમૃદ્ધ સ્ત્રોત છે જેનો ઉપયોગ વાયરલ અને બેક્ટેરિયલ પેથોજેન્સને ઓળખવા માટે થઈ શકે છે, અને માનવ પ્લાઝમામાં જોવા મળતા લગભગ 1% ccfDNA વિદેશી મૂળના છે [19].આ અભ્યાસો દર્શાવે છે કે જીવતંત્રના ફરતા માઇક્રોબાયોમની જૈવવિવિધતાનું મૂલ્યાંકન ccfDNA વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરીને કરી શકાય છે.જો કે, તાજેતરમાં સુધી, આ ખ્યાલનો ઉપયોગ ફક્ત મનુષ્યોમાં જ થતો હતો અને ઓછા પ્રમાણમાં, અન્ય કરોડરજ્જુમાં [20, 21].
વર્તમાન પેપરમાં, અમે 35 મિલિયન વર્ષો પહેલા રચાયેલા વિશાળ ઉચ્ચપ્રદેશની ઉપરના ટાપુઓનું જૂથ, સબઅન્ટાર્કટિક કેર્ગ્યુલેન ટાપુઓમાં સામાન્ય રીતે જોવા મળતી દક્ષિણી પ્રજાતિ ઓલાકોમ્યા અટ્રાના ccfDNAનું વિશ્લેષણ કરવા માટે LB સંભવિતનો ઉપયોગ કરીએ છીએ.જ્વાળામુખી ફાટી નીકળવો.ઇન વિટ્રો પ્રાયોગિક પ્રણાલીનો ઉપયોગ કરીને, અમે જોયું કે દરિયાઈ પાણીમાં ડીએનએ ટુકડાઓ ઝડપથી મસલ્સ દ્વારા લેવામાં આવે છે અને હેમોલિમ્ફ કમ્પાર્ટમેન્ટમાં પ્રવેશ કરે છે.શોટગન સિક્વન્સિંગ દર્શાવે છે કે મસલ હેમોલિમ્ફ સીસીએફડીએનએ તેના પોતાના અને બિન-સ્વયં મૂળના ડીએનએ ટુકડાઓ ધરાવે છે, જેમાં સિમ્બાયોટિક બેક્ટેરિયા અને ઠંડા જ્વાળામુખી દરિયાઇ દરિયાઇ ઇકોસિસ્ટમના લાક્ષણિક બાયોમમાંથી ડીએનએ ટુકડાઓનો સમાવેશ થાય છે.હેમોલિમ્ફ સીસીએફડીએનએ વિવિધ યજમાન શ્રેણીઓ સાથેના વાયરસમાંથી મેળવેલા વાયરલ સિક્વન્સ પણ ધરાવે છે.અમને મલ્ટિસેલ્યુલર પ્રાણીઓ જેમ કે હાડકાની માછલી, દરિયાઈ એનિમોન્સ, શેવાળ અને જંતુઓમાંથી ડીએનએ ટુકડાઓ પણ મળ્યા.નિષ્કર્ષમાં, અમારો અભ્યાસ દર્શાવે છે કે દરિયાઈ જીવસૃષ્ટિમાં સમૃદ્ધ જીનોમિક ભંડાર બનાવવા માટે દરિયાઈ અપૃષ્ઠવંશી પ્રાણીઓ પર એલબી ખ્યાલ સફળતાપૂર્વક લાગુ કરી શકાય છે.
પુખ્ત (55-70 મીમી લાંબી) માયટીલસ પ્લેટેન્સીસ (એમ. પ્લેટેન્સીસ) અને ઓલાકોમ્યા એટ્રા (એ. એટ્રા) પોર્ટ-ઓ-ફ્રાન્સ (049°21.235 S, 070°13.490 E.) ના આંતર ભરતીના ખડકાળ કિનારાઓમાંથી એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા.ડિસેમ્બર 2018 માં કેર્ગ્યુલેન ટાપુઓ. અન્ય પુખ્ત વાદળી મસલ્સ (Mytilus spp.) વ્યાપારી સપ્લાયર (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) પાસેથી મેળવવામાં આવ્યા હતા અને 32‰ કૃત્રિમ બ્રિનનું 10-20 L ધરાવતા તાપમાન નિયંત્રિત (4°C) વાયુયુક્ત ટાંકીમાં મૂકવામાં આવ્યા હતા.(કૃત્રિમ દરિયાઈ મીઠું રીફ ક્રિસ્ટલ, ઇન્સ્ટન્ટ ઓશન, વર્જિનિયા, યુએસએ).દરેક પ્રયોગ માટે, વ્યક્તિગત શેલની લંબાઈ અને વજન માપવામાં આવ્યા હતા.
આ પ્રોગ્રામ માટે મફત ઓપન એક્સેસ પ્રોટોકોલ ઓનલાઈન ઉપલબ્ધ છે (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).સંક્ષિપ્તમાં, LB હેમોલિમ્ફ અપહરણકર્તા સ્નાયુઓમાંથી એકત્ર કરવામાં આવ્યું હતું [22].હેમોલિમ્ફને સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા 1200×g પર 3 મિનિટ માટે સ્પષ્ટ કરવામાં આવ્યું હતું, ઉપયોગ થાય ત્યાં સુધી સુપરનેટન્ટ સ્થિર (-20°C) હતું.સીએફડીએનએના અલગતા અને શુદ્ધિકરણ માટે, ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર ન્યુક્લિયોસ્નેપ સીએફડીએનએ કીટ (મેચેરી-નાગેલ, બેથલેહેન, PA) નો ઉપયોગ કરીને નમૂનાઓ (1.5-2.0 મિલી) પીગળી અને પ્રક્રિયા કરવામાં આવી હતી.વધુ વિશ્લેષણ સુધી ccfDNA -80°C પર સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યું હતું.કેટલાક પ્રયોગોમાં, ccfDNA ને QIAamp DNA ઇન્વેસ્ટિગેટર કિટ (QIAGEN, ટોરોન્ટો, ઑન્ટારિયો, કેનેડા) નો ઉપયોગ કરીને અલગ અને શુદ્ધ કરવામાં આવ્યું હતું.શુદ્ધ ડીએનએ પ્રમાણભૂત પીકોગ્રીન એસેનો ઉપયોગ કરીને પરિમાણ કરવામાં આવ્યું હતું.એજિલેન્ટ 2100 બાયોએનાલાઇઝર (એજિલેન્ટ ટેક્નોલોજીસ ઇન્ક., સાન્ટા ક્લેરા, CA) નો ઉપયોગ કરીને ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા DNA કિટનો ઉપયોગ કરીને કેશિલરી ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ દ્વારા અલગ ccfDNA ના ટુકડા વિતરણનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર ccfDNA નમૂનાના 1 µl નો ઉપયોગ કરીને પરખ કરવામાં આવી હતી.
હેમોલિમ્ફ ccfDNA ટુકડાઓના ક્રમ માટે, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) એ Illumina MiSeq PE75 કિટની Illumina DNA મિક્સ કીટનો ઉપયોગ કરીને શોટગન લાઇબ્રેરીઓ તૈયાર કરી.પ્રમાણભૂત એડેપ્ટર (BioO) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.કાચો ડેટા ફાઇલો NCBI સિક્વન્સ રીડ આર્કાઇવ (SRR8924808 અને SRR8924809)માંથી ઉપલબ્ધ છે.FastQC [23] નો ઉપયોગ કરીને મૂળભૂત વાંચન ગુણવત્તાનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું.ટ્રિમમોમેટિક [24] ક્લિપિંગ એડેપ્ટરો અને નબળી ગુણવત્તા વાંચવા માટે ઉપયોગમાં લેવાય છે.જોડીવાળા છેડા સાથે શોટગન રીડને FLASH ને મિસમેચ ટાળવા માટે ઓછામાં ઓછા 20 bp ના ઓવરલેપ સાથે લાંબા સિંગલ રીડમાં મર્જ કરવામાં આવ્યું હતું [25]. મર્જ કરેલ રીડને બાયવલ્વ NCBI વર્ગીકરણ ડેટાબેઝ (e વેલ્યુ < 1e−3 અને 90% હોમોલોજી) નો ઉપયોગ કરીને BLASTN સાથે ટીકા કરવામાં આવી હતી, અને DUST [26] નો ઉપયોગ કરીને ઓછી-જટિલતા સિક્વન્સનું માસ્કિંગ કરવામાં આવ્યું હતું. મર્જ કરેલ રીડને બાયવલ્વ NCBI વર્ગીકરણ ડેટાબેઝ (e વેલ્યુ < 1e−3 અને 90% હોમોલોજી) નો ઉપયોગ કરીને BLASTN સાથે ટીકા કરવામાં આવી હતી, અને DUST [26] નો ઉપયોગ કરીને ઓછી-જટિલતા સિક્વન્સનું માસ્કિંગ કરવામાં આવ્યું હતું. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых двустворчатых и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. NCBI બાયવાલ્વ વર્ગીકરણ ડેટાબેઝ (e વેલ્યુ <1e-3 અને 90% હોમોલોજી) નો ઉપયોગ કરીને BLASTN સાથે પૂલ્ડ રીડ્સ એનોટેટ કરવામાં આવ્યા હતા, અને DUST [26] નો ઉપયોગ કરીને ઓછી જટિલતા સિક્વન્સ માસ્કિંગ કરવામાં આવી હતી.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读俶释合并的读俶释合并的读俶]复杂度序列的掩蔽.આ复杂度 序列 的 . . . . .掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных -3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. NCBI બાયવાલ્વ વર્ગીકરણ ડેટાબેઝ (e વેલ્યુ <1e-3 અને 90% હોમોલોજી) નો ઉપયોગ કરીને BLASTN સાથે પૂલ કરેલ રીડ્સ એનોટેટ કરવામાં આવ્યા હતા, અને ઓછી જટિલતા ક્રમ માસ્કીંગ DUST [26] નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું.વાંચનને બે જૂથોમાં વિભાજિત કરવામાં આવ્યા હતા: બાયવલ્વ સિક્વન્સથી સંબંધિત (અહીં સ્વ-વાંચન કહેવાય છે) અને અસંબંધિત (બિન-સ્વ-વાંચન).કોન્ટિગ્સ [27] જનરેટ કરવા માટે મેગાહીટનો ઉપયોગ કરીને બે જૂથોને અલગથી એસેમ્બલ કરવામાં આવ્યા હતા.દરમિયાન, એલિયન માઇક્રોબાયોમ રીડ્સનું વર્ગીકરણ ક્રેકન2 [28] નો ઉપયોગ કરીને વર્ગીકૃત કરવામાં આવ્યું હતું અને ગેલેક્સી [29, 30] પર ક્રોના પાઇ ચાર્ટ દ્વારા ગ્રાફિકલી રજૂ કરવામાં આવ્યું હતું.અમારા પ્રારંભિક પ્રયોગોમાંથી શ્રેષ્ઠ કિમીર્સ કિમર્સ-59 હોવાનું નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું. ત્યારપછી અંતિમ એનોટેશન માટે BLASTN (bivalve NCBI ડેટાબેઝ, e મૂલ્ય < 1e−10 અને 60% હોમોલોજી) સાથે સંરેખણ દ્વારા સ્વ કોન્ટિગ્સને ઓળખવામાં આવ્યા હતા. ત્યારપછી અંતિમ એનોટેશન માટે BLASTN (bivalve NCBI ડેટાબેઝ, e મૂલ્ય < 1e−10 અને 60% હોમોલોજી) સાથે સંરેખણ દ્વારા સ્વ કોન્ટિગ્સને ઓળખવામાં આવ્યા હતા. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых , e омология 60%) для окончательной аннотации. ત્યારપછી અંતિમ એનોટેશન માટે BLASTN (NCBI બાયવાલ્વ ડેટાબેઝ, e વેલ્યુ <1e-10 અને 60% હોમોલોજી) સામે મેચ કરીને સ્વ-કોન્ટિગ્સને ઓળખવામાં આવ્યા હતા.બ્લાસ્ટન终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (bazat моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). પછી BLASTN (NCBI બાયવલ્વ ડેટાબેઝ, e વેલ્યુ <1e-10 અને 60% હોમોલોજી) સામે મેચ કરીને અંતિમ એનોટેશન માટે સ્વ-કોન્ટિગ્સની ઓળખ કરવામાં આવી હતી. સમાંતરમાં, બિનસેલ્ફ ગ્રૂપ કોન્ટિગ્સ BLASTN (nt NCBI ડેટાબેઝ, e મૂલ્ય < 1e−10 અને 60% હોમોલોજી) સાથે ટીકા કરવામાં આવ્યા હતા. સમાંતરમાં, બિનસેલ્ફ ગ્રૂપ કોન્ટિગ્સ BLASTN (nt NCBI ડેટાબેઝ, e મૂલ્ય < 1e−10 અને 60% હોમોલોજી) સાથે ટીકા કરવામાં આવ્યા હતા. Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10%06мои ). સમાંતરમાં, વિદેશી જૂથ કોન્ટિગ્સ BLASTN (NT NCBI ડેટાબેઝ, e મૂલ્ય <1e-10 અને 60% હોમોલોજી) સાથે ટીકા કરવામાં આવ્યા હતા.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群. Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, база данных nt NCBI, 60%). સમાંતર, બિન-સ્વ-જૂથ કોન્ટિગ્સ BLASTN (nt NCBI ડેટાબેઝ, e મૂલ્ય <1e-10 અને 60% હોમોલોજી) સાથે ટીકા કરવામાં આવ્યા હતા. BLASTX nr અને RefSeq પ્રોટીન NCBI ડેટાબેસેસ (e મૂલ્ય < 1e−10 અને 60% હોમોલોજી) નો ઉપયોગ કરીને નોનસેલ્ફ કોન્ટિગ્સ પર પણ હાથ ધરવામાં આવ્યું હતું. BLASTX nr અને RefSeq પ્રોટીન NCBI ડેટાબેસેસ (e મૂલ્ય < 1e−10 અને 60% હોમોલોજી) નો ઉપયોગ કરીને નોનસેલ્ફ કોન્ટિગ્સ પર પણ હાથ ધરવામાં આવ્યું હતું. BLASTX ટૅક્ઝે был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (<%1-e06магион). BLASTX એ nr અને RefSeq NCBI પ્રોટીન ડેટાબેસેસ (e વેલ્યુ < 1e-10 અને 60% હોમોલોજી) નો ઉપયોગ કરીને નોન-સેલ્ફ કોન્ટિગ્સ પર પણ કરવામાં આવ્યું હતું.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%. BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e %0лог1 e <1016). BLASTX એ nr અને RefSeq NCBI પ્રોટીન ડેટાબેસેસ (e મૂલ્ય <1e-10 અને 60% હોમોલોજી) નો ઉપયોગ કરીને બિન-સેલ્ફ કોન્ટિગ્સ પર પણ કરવામાં આવ્યું હતું.બિન-સ્વ-કોન્ટિગ્સના BLASTN અને BLASTX પૂલ અંતિમ કોન્ટિગ્સનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે (જુઓ પૂરક ફાઇલ).
PCR માટે વપરાતા પ્રાઇમર્સ કોષ્ટક S1 માં સૂચિબદ્ધ છે.તાક ડીએનએ પોલિમરેઝ (બાયો બેઝિક કેનેડા, માર્કહામ, ઓન) નો ઉપયોગ ccfDNA લક્ષ્ય જનીનોને વિસ્તૃત કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.નીચેની પ્રતિક્રિયા શરતોનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો: 3 મિનિટ માટે 95°C પર વિકૃતીકરણ, 1 મિનિટ માટે 95°C, 1 મિનિટ માટે એનિલિંગ તાપમાન સેટ કરો, 1 મિનિટ માટે 72°C પર લંબાવવું, 35 ચક્રો અને અંતે 10 મિનિટની અંદર 72°C..95 V પર SYBRTM સેફ ડીએનએ જેલ સ્ટેન (ઈનવિટ્રોજન, બર્લિંગ્ટન, ઓન, કેનેડા) ધરાવતા એગરોઝ જેલ્સ (1.5%) માં PCR ઉત્પાદનોને ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા અલગ કરવામાં આવ્યા હતા.
મસલ્સ (માયટીલસ એસપીપી.) 4 ° સે તાપમાને 24 કલાક માટે 500 મિલી ઓક્સિજનયુક્ત દરિયાઈ પાણી (32 PSU) માં અનુકૂળ થયા હતા.190 μg/μl ની અંતિમ સાંદ્રતામાં શીશીમાં માનવ ગેલેકટીન-7 cDNA ક્રમ (NCBI એક્સેસન નંબર L07769) એન્કોડિંગ ઇન્સર્ટ ધરાવતું પ્લાઝમિડ ડીએનએ ઉમેરવામાં આવ્યું હતું.ડીએનએ ઉમેર્યા વિના સમાન પરિસ્થિતિઓમાં ઉકાળવામાં આવેલા છીપનું નિયંત્રણ હતું.ત્રીજી કંટ્રોલ ટાંકીમાં મસલ્સ વગરના ડીએનએ હતા.દરિયાઈ પાણીમાં ડીએનએની ગુણવત્તા પર દેખરેખ રાખવા માટે, દર્શાવેલ સમયે દરેક ટાંકીમાંથી દરિયાઈ પાણીના નમૂનાઓ (20 μl; ત્રણ પુનરાવર્તનો) લેવામાં આવ્યા હતા.પ્લાઝમિડ DNA ટ્રેસેબિલિટી માટે, LB મસલની લણણી દર્શાવેલ સમયે કરવામાં આવી હતી અને qPCR અને ddPCR દ્વારા તેનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.દરિયાઈ પાણીમાં ક્ષારનું પ્રમાણ વધુ હોવાને કારણે, તમામ પીસીઆર પરીક્ષણો પહેલા પીસીઆર ગુણવત્તાવાળા પાણીમાં (1:10) એલીકોટ્સ ભેળવવામાં આવ્યા હતા.
ડિજિટલ ડ્રોપલેટ PCR (ddPCR) BioRad QX200 પ્રોટોકોલ (મિસીસૌગા, ઑન્ટારિયો, કેનેડા) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું.મહત્તમ તાપમાન (કોષ્ટક S1) નક્કી કરવા માટે તાપમાન પ્રોફાઇલનો ઉપયોગ કરો.QX200 ડ્રોપ જનરેટર (BioRad) નો ઉપયોગ કરીને ટીપાં જનરેટ કરવામાં આવ્યા હતા.ddPCR નીચે પ્રમાણે હાથ ધરવામાં આવ્યું હતું: 5 મિનિટ માટે 95°C, 30 s માટે 95°Cના 50 ચક્ર અને 1 મિનિટ માટે આપેલ એનિલિંગ તાપમાન અને 30 સે. માટે 72°C, 5 મિનિટ માટે 4°C અને 5 મિનિટની અંદર 90°C.QX200 ડ્રોપ રીડર (BioRad) નો ઉપયોગ કરીને ટીપાંની સંખ્યા અને હકારાત્મક પ્રતિક્રિયાઓ (પ્રતો/µlની સંખ્યા) માપવામાં આવી હતી.10,000 થી ઓછા ટીપાંવાળા નમૂનાઓ નકારી કાઢવામાં આવ્યા હતા.દર વખતે ddPCR ચલાવવામાં આવે ત્યારે પેટર્ન નિયંત્રણ કરવામાં આવતું ન હતું.
qPCR એ Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) અને LGALS7 વિશિષ્ટ પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું.QuantiFast SYBR ગ્રીન પીસીઆર કીટ (QIAGEN) નો ઉપયોગ કરીને તમામ જથ્થાત્મક PCR 20 μl માં કરવામાં આવ્યા હતા.qPCR ની શરૂઆત 95°C પર 15 મિનિટના ઇન્ક્યુબેશન સાથે કરવામાં આવી હતી, ત્યારબાદ 40 સાયકલ 95°C પર 10 સેકન્ડ માટે અને 60°C પર 60 સેકન્ડ માટે એક ડેટા સંગ્રહ સાથે.5 સેકન્ડ માટે 95°C, 60s માટે 65°C અને qPCRના અંતે 97°C પર ક્રમિક માપનો ઉપયોગ કરીને મેલ્ટિંગ કર્વ્સ જનરેટ કરવામાં આવ્યા હતા.નિયંત્રણ નમૂનાઓ સિવાય, દરેક qPCR ત્રિવિધમાં કરવામાં આવ્યું હતું.
મસલ તેમના ઉચ્ચ ગાળણ દર માટે જાણીતા હોવાથી, અમે સૌપ્રથમ તપાસ કરી કે શું તેઓ દરિયાના પાણીમાં હાજર ડીએનએ ટુકડાઓને ફિલ્ટર અને જાળવી શકે છે કે કેમ.અમને એમાં પણ રસ હતો કે શું આ ટુકડાઓ તેમની અર્ધ-ખુલ્લી લસિકા પ્રણાલીમાં એકઠા થાય છે.અમે વાદળી છીપવાળી ટાંકીમાં ઉમેરવામાં આવેલા દ્રાવ્ય ડીએનએ ટુકડાઓના ભાવિને શોધીને પ્રાયોગિક રીતે આ સમસ્યાનું નિરાકરણ કર્યું.ડીએનએ ટુકડાઓના ટ્રેકિંગને સરળ બનાવવા માટે, અમે માનવ ગેલેક્ટીન-7 જનીન ધરાવતા વિદેશી (સ્વયં નહીં) પ્લાઝમિડ ડીએનએનો ઉપયોગ કર્યો.ડીડીપીસીઆર દરિયાઈ પાણી અને મસલ્સમાં પ્લાઝમિડ ડીએનએ ટુકડાઓ શોધી કાઢે છે.અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે જો સમુદ્રના પાણીમાં ડીએનએ ટુકડાઓનું પ્રમાણ સમયાંતરે (7 દિવસ સુધી) છીપની ગેરહાજરીમાં પ્રમાણમાં સ્થિર રહે છે, તો પછી છીપની હાજરીમાં આ સ્તર લગભગ 8 કલાકની અંદર સંપૂર્ણપણે અદૃશ્ય થઈ જાય છે (ફિગ. 1a,b).ઇન્ટ્રાવાલ્વલ્યુલર પ્રવાહી અને હેમોલિમ્ફ (ફિગ. 1c) માં એક્સોજેનસ ડીએનએના ટુકડાઓ 15 મિનિટની અંદર સરળતાથી શોધી કાઢવામાં આવ્યા હતા.આ ટુકડાઓ એક્સપોઝર પછી 4 કલાક સુધી શોધી શકાય છે.ડીએનએ ટુકડાઓના સંદર્ભમાં આ ફિલ્ટરિંગ પ્રવૃત્તિ બેક્ટેરિયા અને શેવાળની ​​ફિલ્ટરિંગ પ્રવૃત્તિ સાથે તુલનાત્મક છે [31].આ પરિણામો સૂચવે છે કે મસલ્સ તેમના પ્રવાહી ભાગોમાં વિદેશી ડીએનએને ફિલ્ટર કરી શકે છે અને એકઠા કરી શકે છે.
દરિયાઈ પાણીમાં પ્લાઝમિડ ડીએનએની સાપેક્ષ સાંદ્રતા (A) અથવા મસલ્સની ગેરહાજરી (B) માં, ddPCR દ્વારા માપવામાં આવે છે.A માં, પરિણામોને ટકાવારી તરીકે દર્શાવવામાં આવે છે, જેમાં બોક્સની કિનારીઓ 75મી અને 25મી પર્સેન્ટાઈલ દર્શાવે છે.ફીટ કરેલ લઘુગણક વળાંક લાલ રંગમાં બતાવવામાં આવે છે, અને ગ્રે રંગમાં શેડ કરેલ વિસ્તાર 95% આત્મવિશ્વાસ અંતરાલનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે.B માં, લાલ રેખા સરેરાશનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે અને વાદળી રેખા એકાગ્રતા માટે 95% આત્મવિશ્વાસ અંતરાલનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે.C પ્લાઝમિડ ડીએનએ ઉમેર્યા પછી જુદા જુદા સમયે હિમોલિમ્ફ અને મસલ્સના વાલ્વ્યુલર પ્રવાહીમાં પ્લાઝમિડ ડીએનએનું સંચય.પરિણામો સંપૂર્ણ નકલો શોધી/એમએલ (±SE) તરીકે રજૂ કરવામાં આવે છે.
આગળ, અમે કેર્ગ્યુલેન ટાપુઓ પર છીપવાળી પથારીમાંથી એકત્ર કરાયેલા છીપમાં ccfDNA ની ઉત્પત્તિની તપાસ કરી, જે મર્યાદિત માનવશાસ્ત્રીય પ્રભાવ ધરાવતા ટાપુઓના દૂરના જૂથ છે.આ હેતુ માટે, મસલ ​​હેમોલિમ્ફ્સમાંથી સીસીસીડીએનએને સામાન્ય રીતે માનવ cccDNA [32, 33] ને શુદ્ધ કરવા માટે ઉપયોગમાં લેવાતી પદ્ધતિઓ દ્વારા અલગ અને શુદ્ધ કરવામાં આવ્યું હતું.અમને જાણવા મળ્યું છે કે મસલ્સમાં સરેરાશ હેમોલિમ્ફ ccfDNA સાંદ્રતા ઓછી માઇક્રોગ્રામ પ્રતિ મિલી હેમોલિમ્ફ રેન્જમાં છે (કોષ્ટક S2, પૂરક માહિતી જુઓ).આ સાંદ્રતાની શ્રેણી તંદુરસ્ત લોકો (મિલિલીટર દીઠ ઓછા નેનોગ્રામ) કરતા ઘણી મોટી છે, પરંતુ દુર્લભ કિસ્સાઓમાં, કેન્સરના દર્દીઓમાં, ccfDNA નું સ્તર મિલિલીટર દીઠ કેટલાક માઇક્રોગ્રામ સુધી પહોંચી શકે છે [34, 35].હેમોલિમ્ફ સીસીએફડીએનએના કદના વિતરણનું વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે આ ટુકડાઓ 1000 bp થી 1000 bp સુધીના કદમાં મોટા પ્રમાણમાં બદલાય છે.5000 bp સુધી (ફિગ. 2).સિલિકા-આધારિત QIAamp ઇન્વેસ્ટિગેટર કીટનો ઉપયોગ કરીને સમાન પરિણામો મેળવવામાં આવ્યા હતા, જે સામાન્ય રીતે ફોરેન્સિક વિજ્ઞાનમાં ઉપયોગમાં લેવાતી પદ્ધતિ છે જે ccfDNA [36] સહિત ઓછી સાંદ્રતા ધરાવતા ડીએનએ નમૂનાઓમાંથી જીનોમિક ડીએનએને ઝડપથી અલગ અને શુદ્ધ કરે છે.
મસલ હેમોલિમ્ફનું પ્રતિનિધિ સીસીએફડીએનએ ઇલેક્ટ્રોફોરેગ્રામ.ન્યુક્લિયોસ્નેપ પ્લાઝ્મા કીટ (ટોપ) અને QIAamp ડીએનએ ઇન્વેસ્ટિગેટર કીટ સાથે કાઢવામાં આવે છે.B વાયોલિન પ્લોટ મસલ્સમાં હેમોલિમ્ફ ccfDNA સાંદ્રતા (±SE) નું વિતરણ દર્શાવે છે.કાળી અને લાલ રેખાઓ અનુક્રમે મધ્ય અને પ્રથમ અને ત્રીજા ચતુર્થાંશનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે.
મનુષ્યો અને પ્રાઈમેટ્સમાં આશરે 1% ccfDNA વિદેશી સ્ત્રોત ધરાવે છે [21, 37].બાયવલ્વ્સની અર્ધ-ખુલ્લી રુધિરાભિસરણ પ્રણાલી, માઇક્રોબાયલ-સમૃદ્ધ દરિયાઈ પાણી અને મસલ ccfDNA ના કદના વિતરણને જોતાં, અમે અનુમાન કર્યું છે કે મસલ હેમોલિમ્ફ ccfDNA માં માઇક્રોબાયલ ડીએનએનો સમૃદ્ધ અને વૈવિધ્યસભર પૂલ હોઈ શકે છે.આ પૂર્વધારણાને ચકાસવા માટે, અમે કેર્ગ્યુલેન ટાપુઓમાંથી એકત્ર કરાયેલા ઓલાકોમ્યા એટ્રા નમૂનાઓમાંથી હેમોલિમ્ફ ccfDNA ક્રમાંકિત કર્યા, જેમાંથી 10 મિલિયનથી વધુ વાંચન પ્રાપ્ત થયું, જેમાંથી 97.6% ગુણવત્તા નિયંત્રણમાં પાસ થયા.ત્યારબાદ BLASTN અને NCBI બાયવલ્વ ડેટાબેસેસ (ફિગ. S1, પૂરક માહિતી) નો ઉપયોગ કરીને સ્વ અને બિન-સ્વયં સ્ત્રોતો અનુસાર વાંચનનું વર્ગીકરણ કરવામાં આવ્યું હતું.
મનુષ્યોમાં, ન્યુક્લિયર અને મિટોકોન્ડ્રીયલ ડીએનએ બંને લોહીના પ્રવાહમાં મુક્ત થઈ શકે છે [38].જો કે, હાલના અભ્યાસમાં, મસલના ન્યુક્લિયર જીનોમિક ડીએનએનું વિગતવાર વર્ણન કરવું શક્ય નહોતું, જો કે A. એટ્રા જીનોમનું ક્રમ અથવા વર્ણન કરવામાં આવ્યું નથી.જો કે, અમે બાયવલ્વ લાઇબ્રેરી (ફિગ. S2, પૂરક માહિતી) નો ઉપયોગ કરીને અમારા પોતાના મૂળના સંખ્યાબંધ ccfDNA ટુકડાઓ ઓળખવામાં સક્ષમ હતા.અમે તે A. અટ્રા જનીનોના નિર્દેશિત PCR એમ્પ્લીફિકેશન દ્વારા આપણા પોતાના મૂળના ડીએનએ ટુકડાઓની હાજરીની પુષ્ટિ પણ કરી છે (ફિગ. 3).એ જ રીતે, એ. એટ્રાનો માઇટોકોન્ડ્રીયલ જીનોમ જાહેર ડેટાબેઝમાં ઉપલબ્ધ છે તે જોતાં, એ. એટ્રાના હેમોલિમ્ફમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ સીસીએફડીએનએ ટુકડાઓની હાજરી માટે કોઈ પુરાવા શોધી શકે છે.પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન (ફિગ. 3) દ્વારા મિટોકોન્ડ્રીયલ ડીએનએ ટુકડાઓની હાજરીની પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી.
A. અટ્રા (લાલ બિંદુઓ - સ્ટોક નંબર: SRX5705969) અને M. પ્લેટેન્સિસ (વાદળી બિંદુઓ - સ્ટોક નંબર: SRX5705968) ના હેમોલિમ્ફમાં વિવિધ મિટોકોન્ડ્રીયલ જનીનો હાજર હતા. PCR દ્વારા વિસ્તૃત.બ્રેટોન એટ અલ., 2011 B એમ્પ્લીફિકેશન ઓફ હેમોલિમ્ફ સુપરનેટન્ટ એ. એટ્રામાંથી એફટીએ પેપર પર સંગ્રહિત.પીસીઆર મિશ્રણ ધરાવતી પીસીઆર ટ્યુબમાં સીધું ઉમેરવા માટે 3 મીમી પંચનો ઉપયોગ કરો.
દરિયાઈ પાણીમાં વિપુલ પ્રમાણમાં માઇક્રોબાયલ સામગ્રીને જોતાં, અમે શરૂઆતમાં હેમોલિમ્ફમાં માઇક્રોબાયલ ડીએનએ સિક્વન્સની લાક્ષણિકતા પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કર્યું.આ કરવા માટે, અમે બે અલગ અલગ વ્યૂહરચનાઓનો ઉપયોગ કરીએ છીએ.પ્રથમ વ્યૂહરચના ક્રેકેન2નો ઉપયોગ કરે છે, જે અલ્ગોરિધમ આધારિત ક્રમ વર્ગીકરણ કાર્યક્રમ છે જે BLAST અને અન્ય સાધનો [28] સાથે તુલનાત્મક ચોકસાઈ સાથે માઇક્રોબાયલ સિક્વન્સને ઓળખી શકે છે.6719 થી વધુ રીડ્સ બેક્ટેરિયલ મૂળના હોવાનું નિર્ધારિત કરવામાં આવ્યું હતું, જ્યારે 124 અને 64 અનુક્રમે આર્કિઆ અને વાયરસના હતા (ફિગ. 4).સૌથી વિપુલ પ્રમાણમાં બેક્ટેરિયલ ડીએનએ ટુકડાઓ ફર્મિક્યુટ્સ (46%), પ્રોટીઓબેક્ટેરિયા (27%), અને બેક્ટેરોઇડેટ્સ (17%) (ફિગ. 4a) હતા.આ વિતરણ દરિયાઈ વાદળી મસલ માઇક્રોબાયોમ [39, 40] ના અગાઉના અભ્યાસો સાથે સુસંગત છે.ગામાપ્રોટીઓબેક્ટેરિયા પ્રોટીઓબેક્ટેરિયાનો મુખ્ય વર્ગ હતો (44%), જેમાં ઘણા વાઇબ્રિયોનેલ્સ (ફિગ. 4b)નો સમાવેશ થાય છે.ddPCR પદ્ધતિએ A. atra hemolymph (Fig. 4c) [41] ના ccfDNA માં Vibrio DNA ટુકડાઓની હાજરીની પુષ્ટિ કરી.ccfDNA ના બેક્ટેરિયલ મૂળ વિશે વધુ માહિતી મેળવવા માટે, એક વધારાનો અભિગમ લેવામાં આવ્યો (ફિગ. S2, પૂરક માહિતી). આ કિસ્સામાં, વાંચે છે કે ઓવરલેપ પેર-એન્ડ રીડ તરીકે એસેમ્બલ કરવામાં આવ્યા હતા અને BLASTN અને 1e−3 નું e મૂલ્ય અને >90% હોમોલોજી સાથે કટઓફનો ઉપયોગ કરીને સ્વ (બાયવલ્વ્સ) અથવા બિન-સ્વયં મૂળ તરીકે વર્ગીકૃત કરવામાં આવ્યા હતા. આ કિસ્સામાં, વાંચે છે કે ઓવરલેપ પેર-એન્ડ રીડ તરીકે એસેમ્બલ કરવામાં આવ્યા હતા અને BLASTN અને 1e−3 નું e મૂલ્ય અને >90% હોમોલોજી સાથે કટઓફનો ઉપયોગ કરીને સ્વ (બાયવલ્વ્સ) અથવા બિન-સ્વયં મૂળ તરીકે વર્ગીકૃત કરવામાં આવ્યા હતા. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как собраны как собраны ски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. આ કિસ્સામાં, ઓવરલેપિંગ રીડને જોડી-એન્ડેડ રીડ તરીકે એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા અને BLASTN અને 1e-3ના e મૂલ્યનો ઉપયોગ કરીને મૂળ (બાયવાલ્વ) અથવા બિન-મૂળ તરીકે વર્ગીકૃત કરવામાં આવ્યા હતા અને >90% હોમોલોજી સાથે કટઓફ કરવામાં આવ્યા હતા.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90% 吪吀为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 的 使用 的 使用 9e%0 匐> 使用 બ્લાસ્ટ 和1和1源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。 .. . . . . В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собствения или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. આ કિસ્સામાં, ઓવરલેપિંગ રીડ્સ જોડી-એન્ડેડ રીડ તરીકે એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા અને e BLASTN અને 1e-3 મૂલ્યો અને હોમોલોજી થ્રેશોલ્ડ > 90% નો ઉપયોગ કરીને પોતાના (બાયવલ્વ્સ) અથવા બિન-મૂળ તરીકે વર્ગીકૃત કરવામાં આવ્યા હતા.A. અટ્રા જીનોમ હજુ સુધી ક્રમબદ્ધ ન હોવાથી, અમે મેગાહીટ નેક્સ્ટ જનરેશન સિક્વન્સિંગ (NGS) એસેમ્બલરની ડી નોવો એસેમ્બલી વ્યૂહરચનાનો ઉપયોગ કર્યો છે.કુલ 147,188 કોન્ટિગ્સને મૂળના આશ્રિત (બાયવલ્વ્સ) તરીકે ઓળખવામાં આવ્યા છે.આ કોન્ટિગ્સ પછી BLASTN અને BLASTX નો ઉપયોગ કરીને 1e-10 ના ઈ-મૂલ્યો સાથે વિસ્ફોટ કરવામાં આવ્યા હતા.આ વ્યૂહરચના અમને A. atra ccfDNA માં હાજર 482 બિન-બાયવાલ્વ ટુકડાઓ ઓળખવાની મંજૂરી આપે છે.આ ડીએનએ ટુકડાઓમાંથી અડધા કરતાં વધુ (57%) બેક્ટેરિયામાંથી મેળવવામાં આવ્યા હતા, મુખ્યત્વે ગિલ સિમ્બિઓન્ટ્સમાંથી, જેમાં સલ્ફોટ્રોફિક સિમ્બિઓન્ટ્સનો સમાવેશ થાય છે, અને ગિલ સિમ્બિઓન્ટ્સ સોલેમ્યા વેલમ (ફિગ. 5) માંથી.
પ્રકાર સ્તરે સંબંધિત વિપુલતા.B બે મુખ્ય ફાયલા (ફર્મિક્યુટ્સ અને પ્રોટીઓબેક્ટેરિયા) ની માઇક્રોબાયલ વિવિધતા.ddPCR C Vibrio spp નું પ્રતિનિધિત્વ એમ્પ્લીફિકેશન.A. ત્રણ અટ્રા હેમોલિમ્ફ્સમાં 16S rRNA જનીન (વાદળી) ના ટુકડા.
કુલ 482 એકત્રિત કોન્ટિગ્સનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.મેટાજેનોમિક કોન્ટિગ એનોટેશન્સ (પ્રોકેરીયોટ્સ અને યુકેરીયોટ્સ) ના વર્ગીકરણ વિતરણની સામાન્ય પ્રોફાઇલ.B BLASTN અને BLASTX દ્વારા ઓળખાયેલ બેક્ટેરિયલ DNA ટુકડાઓનું વિગતવાર વિતરણ.
Kraken2 વિશ્લેષણ એ પણ બતાવ્યું કે મસલ ccfDNA માં પ્રાચીન ડીએનએ ટુકડાઓનો સમાવેશ થાય છે, જેમાં યુરીઆર્ચીઓટા (65%), ક્રેનારચેઓટા (24%), અને થૌરમાર્ચિયોટા (11%) (ફિગ. 6a) ના ડીએનએ ટુકડાઓનો સમાવેશ થાય છે.અગાઉ કેલિફોર્નિયાના મસલ્સના માઇક્રોબાયલ સમુદાયમાં જોવા મળતા યુરીઆર્ચીઓટા અને ક્રેનારચેઓટામાંથી મેળવેલા ડીએનએ ટુકડાઓની હાજરી આશ્ચર્યજનક ન હોવી જોઈએ [42].યુરીઆર્ચીઓટા ઘણીવાર આત્યંતિક પરિસ્થિતિઓ સાથે સંકળાયેલા હોવા છતાં, તે હવે ઓળખાય છે કે યુરીઆર્ચીઓટા અને ક્રેનારચેઓટા બંને દરિયાઈ ક્રાયોજેનિક વાતાવરણમાં સૌથી સામાન્ય પ્રોકેરીયોટ્સમાંના છે [43, 44].કેર્ગ્યુલેન ટાપુઓ [45] પર તળિયેથી લીક થયેલા વ્યાપક મિથેન લીકના તાજેતરના અહેવાલો અને કેર્ગ્યુલેન ટાપુઓ [46]ના કિનારે જોવા મળેલ સંભવિત માઇક્રોબાયલ મિથેન ઉત્પાદનના તાજેતરના અહેવાલોને જોતાં, મસલ્સમાં મિથેનોજેનિક સુક્ષ્મસજીવોની હાજરી આશ્ચર્યજનક નથી.
પછી અમારું ધ્યાન ડીએનએ વાયરસના વાંચન તરફ ગયું.અમારી શ્રેષ્ઠ જાણકારી મુજબ, છીપમાં વાયરસની સામગ્રીનો આ પહેલો લક્ષ્યાંક વિનાનો અભ્યાસ છે.અપેક્ષા મુજબ, અમને બેક્ટેરિયોફેજેસ (કાઉડોવાયરેલ્સ) (ફિગ. 6બી) ના ડીએનએ ટુકડાઓ મળ્યા.જો કે, સૌથી સામાન્ય વાયરલ ડીએનએ ન્યુક્લિયોસાયટોવાયરસના ફિલમમાંથી આવે છે, જેને ન્યુક્લિયર સાયટોપ્લાઝમિક લાર્જ ડીએનએ વાયરસ (NCLDV) તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે, જે કોઈપણ વાયરસનો સૌથી મોટો જીનોમ ધરાવે છે.આ ફિલમમાં, મોટાભાગના ડીએનએ સિક્વન્સ પરિવારો મિમિમિડોવિરિડે (58%) અને પોક્સવિરિડે (21%) છે, જેમના કુદરતી યજમાનોમાં કરોડરજ્જુ અને આર્થ્રોપોડ્સનો સમાવેશ થાય છે, જ્યારે આ ડીએનએ સિક્વન્સનો એક નાનો હિસ્સો જાણીતા વાયરોલોજીકલ શેવાળનો છે.દરિયાઈ યુકેરીયોટિક શેવાળને ચેપ લગાડે છે.સિક્વન્સ પેન્ડોરા વાયરસમાંથી પણ મેળવવામાં આવ્યા હતા, જે કોઈપણ જાણીતા વાયરલ જનરા કરતા સૌથી મોટા જીનોમ કદ સાથેનો વિશાળ વાયરસ છે.રસપ્રદ વાત એ છે કે, હેમોલિમ્ફ સીસીએફડીએનએ સિક્વન્સિંગ દ્વારા નિર્ધારિત વાઇરસથી સંક્રમિત તરીકે ઓળખાતા યજમાનોની શ્રેણી પ્રમાણમાં મોટી હતી (આકૃતિ S3, પૂરક માહિતી).તેમાં એવા વાયરસનો સમાવેશ થાય છે જે જંતુઓને ચેપ લગાડે છે જેમ કે બેક્યુલોવિરિડે અને ઇરિડોવિરિડે, તેમજ વાયરસ કે જે અમીબા, શેવાળ અને કરોડરજ્જુને ચેપ લગાડે છે.અમને પિથોવાયરસ સાઇબેરિકમ જીનોમ સાથે મેળ ખાતી સિક્વન્સ પણ મળી.પિટોવાયરસ (જેને "ઝોમ્બી વાયરસ" તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે) સૌપ્રથમ સાઇબિરીયામાં 30,000 વર્ષ જૂના પર્માફ્રોસ્ટથી અલગ કરવામાં આવ્યા હતા [47].આમ, અમારા પરિણામો અગાઉના અહેવાલો સાથે સુસંગત છે જે દર્શાવે છે કે આ વાયરસની તમામ આધુનિક પ્રજાતિઓ લુપ્ત થઈ નથી [48] અને આ વાયરસ દૂરસ્થ સબઅર્કટિક દરિયાઈ ઇકોસિસ્ટમમાં હાજર હોઈ શકે છે.
છેલ્લે, અમે અન્ય બહુકોષીય પ્રાણીઓમાંથી ડીએનએના ટુકડા શોધી શકીએ કે કેમ તે જોવા માટે અમે પરીક્ષણ કર્યું.BLASTN અને BLASTX દ્વારા nt, nr અને RefSeq પુસ્તકાલયો (જીનોમિક અને પ્રોટીન) સાથે કુલ 482 વિદેશી કોન્ટિગ્સ ઓળખવામાં આવ્યા હતા.અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે મલ્ટિસેલ્યુલર પ્રાણીઓના ccfDNA ના વિદેશી ટુકડાઓમાં હાડકાના હાડકાંના DNA પ્રબળ છે (ફિગ. 5).જંતુઓ અને અન્ય પ્રજાતિઓમાંથી ડીએનએ ટુકડાઓ પણ મળી આવ્યા છે.ડીએનએ ટુકડાઓના પ્રમાણમાં મોટા ભાગની ઓળખ કરવામાં આવી નથી, સંભવતઃ પાર્થિવ પ્રજાતિઓ [49] ની સરખામણીમાં જીનોમિક ડેટાબેઝમાં મોટી સંખ્યામાં દરિયાઈ પ્રજાતિઓની ઓછી રજૂઆતને કારણે.
વર્તમાન પેપરમાં, અમે એલબી ખ્યાલને છીપમાં લાગુ કરીએ છીએ, એવી દલીલ કરીએ છીએ કે હેમોલિમ્ફ સીસીએફડીએનએ શોટ સિક્વન્સિંગ દરિયાઇ દરિયાકાંઠાની ઇકોસિસ્ટમ્સની રચનામાં આંતરદૃષ્ટિ પ્રદાન કરી શકે છે.ખાસ કરીને, અમે જોયું કે 1) મસલ હેમોલિમ્ફ પ્રમાણમાં મોટા (~1-5 kb) ફરતા ડીએનએ ટુકડાઓની પ્રમાણમાં ઊંચી સાંદ્રતા (માઈક્રોગ્રામ સ્તરો) ધરાવે છે;2) આ ડીએનએ ટુકડાઓ સ્વતંત્ર અને બિન-સ્વતંત્ર બંને છે 3) આ ડીએનએ ટુકડાઓના વિદેશી સ્ત્રોતોમાં, અમને બેક્ટેરિયલ, આર્કિયલ અને વાયરલ ડીએનએ, તેમજ અન્ય બહુકોષીય પ્રાણીઓના ડીએનએ મળ્યાં છે;4) હેમોલિમ્ફમાં આ વિદેશી ccfDNA ટુકડાઓનું સંચય ઝડપથી થાય છે અને મસલ્સની આંતરિક ફિલ્ટરિંગ પ્રવૃત્તિમાં ફાળો આપે છે.નિષ્કર્ષમાં, અમારો અભ્યાસ દર્શાવે છે કે LB ની વિભાવના, જે અત્યાર સુધી મુખ્યત્વે બાયોમેડિસિન ક્ષેત્રે લાગુ કરવામાં આવી છે, જ્ઞાનના સમૃદ્ધ પરંતુ અન્વેષિત સ્ત્રોતને એન્કોડ કરે છે જેનો ઉપયોગ સેન્ટિનલ પ્રજાતિઓ અને તેમના પર્યાવરણ વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને વધુ સારી રીતે સમજવા માટે કરી શકાય છે.
પ્રાઈમેટ ઉપરાંત, ઉંદર, કૂતરા, બિલાડીઓ અને ઘોડા [50, 51, 52] સહિતના સસ્તન પ્રાણીઓમાં ccfDNA અલગતા નોંધવામાં આવી છે.જો કે, અમારા જ્ઞાન મુજબ, અમારો અભ્યાસ ઓપન સર્ક્યુલેશન સિસ્ટમ સાથે દરિયાઈ પ્રજાતિઓમાં ccfDNA ની શોધ અને અનુક્રમની જાણ કરનારો પ્રથમ અભ્યાસ છે.આ શરીરરચનાત્મક લક્ષણ અને મસલ્સની ફિલ્ટરિંગ ક્ષમતા, ઓછામાં ઓછા ભાગમાં, અન્ય પ્રજાતિઓની તુલનામાં ફરતા ડીએનએ ટુકડાઓની વિવિધ કદની લાક્ષણિકતાઓને સમજાવી શકે છે.મનુષ્યોમાં, લોહીમાં ફરતા મોટાભાગના ડીએનએ ટુકડાઓ 150 થી 200 bp સુધીના કદના નાના ટુકડાઓ છે.167 bp [34, 53] ની મહત્તમ ટોચ સાથે.ડીએનએ ટુકડાઓનો એક નાનો પણ નોંધપાત્ર ભાગ 300 અને 500 bp ની વચ્ચે છે અને લગભગ 5% 900 bp કરતા લાંબો છે.[54].આ કદના વિતરણનું કારણ એ છે કે પ્લાઝ્મામાં સીસીએફડીએનએનો મુખ્ય સ્ત્રોત કોષ મૃત્યુના પરિણામે થાય છે, કાં તો કોષ મૃત્યુને કારણે અથવા તંદુરસ્ત વ્યક્તિઓમાં ફરતા હેમેટોપોએટીક કોશિકાઓના નેક્રોસિસને કારણે અથવા કેન્સરના દર્દીઓમાં ગાંઠ કોશિકાઓના એપોપ્ટોસિસને કારણે થાય છે (જેને પરિભ્રમણ ગાંઠ ડીએનએ તરીકે ઓળખવામાં આવે છે)., ctDNA).હિમોલિમ્ફ ccfDNA નું કદ વિતરણ કે જે અમને છીપમાં જોવા મળ્યું તે 1000 થી 5000 bp સુધીનું છે, જે સૂચવે છે કે મસલ ccfDNA નું મૂળ અલગ છે.આ એક તાર્કિક પૂર્વધારણા છે, કારણ કે છીપમાં અર્ધ-ખુલ્લી વેસ્ક્યુલર સિસ્ટમ હોય છે અને તે માઇક્રોબાયલ જીનોમિક ડીએનએની ઉચ્ચ સાંદ્રતા ધરાવતા દરિયાઈ જળચર વાતાવરણમાં રહે છે.વાસ્તવમાં, એક્સોજેનસ ડીએનએનો ઉપયોગ કરીને અમારા પ્રયોગશાળાના પ્રયોગોએ દર્શાવ્યું છે કે મસલ દરિયાના પાણીમાં ડીએનએ ટુકડાઓ એકઠા કરે છે, ઓછામાં ઓછા થોડા કલાકો પછી તેઓ સેલ્યુલર શોષણ અને/અથવા મુક્ત થયા પછી અને/અથવા વિવિધ સંસ્થાઓમાં સંગ્રહિત થાય છે.કોષોની વિરલતાને જોતાં (બંને પ્રોકાર્યોટિક અને યુકેરીયોટિક), ઇન્ટ્રાવાલ્વલ્યુલર કમ્પાર્ટમેન્ટનો ઉપયોગ સ્વ-સ્રોતો તેમજ વિદેશી સ્ત્રોતોમાંથી ccfDNA ની માત્રામાં ઘટાડો કરશે.બાયવલ્વ જન્મજાત રોગપ્રતિકારક શક્તિના મહત્વ અને પરિભ્રમણ કરતી ફેગોસાઇટ્સની મોટી સંખ્યાને ધ્યાનમાં લેતા, અમે આગળ અનુમાન કર્યું કે વિદેશી ccfDNA પણ ફરતા ફેગોસાઇટ્સમાં સમૃદ્ધ છે જે સુક્ષ્મસજીવો અને/અથવા સેલ્યુલર કચરાના ઇન્જેશન પર વિદેશી DNA એકઠા કરે છે.એકસાથે લેવામાં આવે તો, અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે બાયવલ્વ હેમોલિમ્ફ ccfDNA એ પરમાણુ માહિતીનો એક અનન્ય ભંડાર છે અને સેન્ટિનલ પ્રજાતિ તરીકે તેમની સ્થિતિને વધુ મજબૂત બનાવે છે.
અમારો ડેટા સૂચવે છે કે બેક્ટેરિયાથી મેળવેલા હેમોલિમ્ફ સીસીએફડીએનએ ટુકડાઓનું અનુક્રમ અને વિશ્લેષણ યજમાન બેક્ટેરિયલ ફ્લોરા અને આસપાસના દરિયાઇ ઇકોસિસ્ટમમાં હાજર બેક્ટેરિયા વિશે મુખ્ય માહિતી પ્રદાન કરી શકે છે.શૉટ સિક્વન્સિંગ તકનીકોએ કોમન્સલ બેક્ટેરિયા A. એટ્રા ગિલના ક્રમ જાહેર કર્યા છે જે જો સંદર્ભ લાઇબ્રેરી પૂર્વગ્રહને કારણે પરંપરાગત 16S rRNA ઓળખ પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હોત તો ચૂકી ગયો હોત.વાસ્તવમાં, કેર્ગ્યુલેન ખાતે સમાન મસલ સ્તરમાં M. પ્લેટેન્સિસમાંથી એકત્ર કરાયેલ LB ડેટાનો અમારો ઉપયોગ દર્શાવે છે કે ગિલ-સંબંધિત બેક્ટેરિયલ સિમ્બિઓન્ટ્સની રચના બંને મસલ પ્રજાતિઓ માટે સમાન હતી (ફિગ. S4, પૂરક માહિતી).બે આનુવંશિક રીતે અલગ મસલ્સની આ સમાનતા કેર્ગ્યુલેન [55, 56, 57, 58] ના ઠંડા, સલ્ફર અને જ્વાળામુખી થાપણોમાં બેક્ટેરિયલ સમુદાયોની રચનાને પ્રતિબિંબિત કરી શકે છે.બાયોટર્બેટેડ દરિયાકાંઠાના વિસ્તારો [59], જેમ કે પોર્ટ-ઓ-ફ્રાન્સના દરિયાકાંઠેથી મસલની લણણી કરતી વખતે સલ્ફર-ઘટાડતા સૂક્ષ્મજીવોના ઉચ્ચ સ્તરનું સારી રીતે વર્ણન કરવામાં આવ્યું છે.બીજી શક્યતા એ છે કે કોમન્સલ મસલ ફ્લોરા આડી ટ્રાન્સમિશન [60, 61] દ્વારા પ્રભાવિત થઈ શકે છે.દરિયાઈ વાતાવરણ, દરિયાઈ તળની સપાટી અને મસલ્સમાં સહજીવન બેક્ટેરિયાની રચના વચ્ચેનો સંબંધ નક્કી કરવા માટે વધુ સંશોધનની જરૂર છે.આ અભ્યાસ હાલમાં ચાલુ છે.
હેમોલિમ્ફ ccfDNA ની લંબાઈ અને સાંદ્રતા, તેની શુદ્ધિકરણની સરળતા, અને ઝડપી શૉટગન સિક્વન્સિંગને મંજૂરી આપવા માટે ઉચ્ચ ગુણવત્તા એ દરિયાઈ તટવર્તી ઇકોસિસ્ટમ્સમાં જૈવવિવિધતાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે મસલ ccfDNA નો ઉપયોગ કરવાના ઘણા ફાયદા છે.આ અભિગમ ખાસ કરીને આપેલ ઇકોસિસ્ટમ [62, 63] માં વાયરલ સમુદાયો (વાયરોમ્સ) ને દર્શાવવા માટે અસરકારક છે.બેક્ટેરિયા, આર્ચીઆ અને યુકેરીયોટ્સથી વિપરીત, વાયરલ જીનોમમાં 16S સિક્વન્સ જેવા ફાયલોજેનેટિકલી સંરક્ષિત જનીનો હોતા નથી.અમારા પરિણામો સૂચવે છે કે સામાન્ય રીતે દરિયાકાંઠાના દરિયાઈ જીવસૃષ્ટિમાં વસતા યજમાનોને સંક્રમિત કરવા માટે જાણીતા પ્રમાણમાં મોટી સંખ્યામાં ccfDNA વાયરસના ટુકડાઓ ઓળખવા માટે છીપ જેવી સૂચક પ્રજાતિઓમાંથી પ્રવાહી બાયોપ્સીનો ઉપયોગ કરી શકાય છે.આમાં પ્રોટોઝોઆ, આર્થ્રોપોડ્સ, જંતુઓ, છોડ અને બેક્ટેરિયલ વાયરસ (દા.ત., બેક્ટેરિયોફેજ) ને સંક્રમિત કરવા માટે જાણીતા વાયરસનો સમાવેશ થાય છે.જ્યારે અમે કેર્ગ્યુલેન (કોષ્ટક S2, પૂરક માહિતી) ખાતે સમાન મસલ સ્તરમાં એકત્રિત વાદળી મસલ (એમ. પ્લેટેન્સિસ) ના હેમોલિમ્ફ ccfDNA વાઇરોમની તપાસ કરી ત્યારે સમાન વિતરણ જોવા મળ્યું.ccfDNA ની શોટગન સિક્વન્સિંગ એ ખરેખર એક નવો અભિગમ છે જે મનુષ્યો અથવા અન્ય પ્રજાતિઓ [21, 37, 64]ના વાઈરોમના અભ્યાસમાં વેગ પ્રાપ્ત કરે છે.આ અભિગમ ખાસ કરીને ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ વાયરસનો અભ્યાસ કરવા માટે ઉપયોગી છે, કારણ કે બાલ્ટીમોર [65] માં સૌથી વધુ વૈવિધ્યસભર અને વ્યાપક વર્ગના વાયરસનું પ્રતિનિધિત્વ કરતા તમામ ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ વાયરસમાં કોઈ એક જનીન સુરક્ષિત નથી.જો કે આમાંના મોટાભાગના વાઈરસ અવર્ગીકૃત રહે છે અને તેમાં વાઈરલ વિશ્વના સંપૂર્ણપણે અજાણ્યા ભાગના વાયરસનો સમાવેશ થઈ શકે છે [66], અમે જોયું કે A. atra અને M. platensis ના વાઈરોમ્સ અને હોસ્ટ રેન્જ બે પ્રજાતિઓ વચ્ચે આવે છે.તેવી જ રીતે (આકૃતિ S3 જુઓ, વધારાની માહિતી).આ સમાનતા આશ્ચર્યજનક નથી, કારણ કે તે પર્યાવરણમાં હાજર ડીએનએના શોષણમાં પસંદગીના અભાવને પ્રતિબિંબિત કરી શકે છે.RNA વાઈરોમને દર્શાવવા માટે હાલમાં શુદ્ધ RNA નો ઉપયોગ કરીને ભાવિ અભ્યાસની જરૂર છે.
અમારા અભ્યાસમાં, અમે કોવાર્સ્કી અને સહકર્મીઓ [37]ના કાર્યમાંથી અનુકૂલિત ખૂબ જ સખત પાઈપલાઈનનો ઉપયોગ કર્યો હતો, જેમણે મૂળ ccfDNA ની એસેમ્બલી પહેલાં અને પછી પુલ કરેલા રીડ અને કોન્ટિગના બે-પગલાંના કાઢી નાખવાનો ઉપયોગ કર્યો હતો, પરિણામે અનમેપ કરેલા વાંચનનું ઊંચું પ્રમાણ હતું.તેથી, અમે નકારી શકતા નથી કે આમાંના કેટલાક અનમેપ કરેલા વાંચનનું હજી પણ પોતાનું મૂળ હોઈ શકે છે, મુખ્યત્વે કારણ કે અમારી પાસે આ છીપવાળી પ્રજાતિ માટે સંદર્ભ જીનોમ નથી.અમે આ પાઈપલાઈનનો ઉપયોગ પણ કર્યો કારણ કે અમે સ્વયં અને બિન-સ્વયં વાંચન અને ઈલુમિના MiSeq PE75 દ્વારા જનરેટ કરાયેલ વાંચન લંબાઈ વચ્ચેના ચિમેરા વિશે ચિંતિત હતા.મોટાભાગના અપ્રમાણિત વાંચન માટેનું બીજું કારણ એ છે કે મોટાભાગના દરિયાઈ જીવાણુઓ, ખાસ કરીને કેર્ગ્યુલેન જેવા દૂરના વિસ્તારોમાં, ટીકા કરવામાં આવી નથી.અમે ccfDNA ફ્રેગમેન્ટ લંબાઈ માનવ ccfDNA જેવી જ ધારીને, Illumina MiSeq PE75 નો ઉપયોગ કર્યો.ભવિષ્યના અભ્યાસો માટે, હેમોલિમ્ફ ccfDNA મનુષ્યો અને/અથવા સસ્તન પ્રાણીઓ કરતાં વધુ વાંચે છે તે દર્શાવતા અમારા પરિણામોને જોતાં, અમે લાંબા સમય સુધી ccfDNA ટુકડાઓ માટે વધુ યોગ્ય સિક્વન્સિંગ પ્લેટફોર્મનો ઉપયોગ કરવાની ભલામણ કરીએ છીએ.આ પ્રેક્ટિસ ઊંડા વિશ્લેષણ માટે વધુ સંકેતોને ઓળખવાનું વધુ સરળ બનાવશે.હાલમાં અનુપલબ્ધ સંપૂર્ણ A. અટ્રા ન્યુક્લિયર જીનોમ સિક્વન્સ મેળવવાથી સ્વ અને બિન-સ્વયં સ્ત્રોતોમાંથી ccfDNA ના ભેદભાવને પણ મોટા પ્રમાણમાં સરળ બનશે.અમારા સંશોધને પ્રવાહી બાયોપ્સીની વિભાવનાને છીપમાં લાગુ કરવાની સંભાવના પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કર્યું છે તે જોતાં, અમે આશા રાખીએ છીએ કે આ ખ્યાલનો ભાવિ સંશોધનમાં ઉપયોગ થતો હોવાથી, નવા સાધનો અને પાઈપલાઈન વિકસાવવામાં આવશે જેથી મસલ્સની માઇક્રોબાયલ વિવિધતાનો અભ્યાસ કરવા માટે આ પદ્ધતિની સંભાવનાને વધારવામાં આવશે.દરિયાઈ ઇકોસિસ્ટમ.
બિન-આક્રમક ક્લિનિકલ બાયોમાર્કર તરીકે, ccfDNA ના એલિવેટેડ માનવ પ્લાઝ્મા સ્તરો વિવિધ રોગો, પેશીઓને નુકસાન અને તણાવની પરિસ્થિતિઓ [67,68,69] સાથે સંકળાયેલા છે.આ વધારો પેશીના નુકસાન પછી તેના પોતાના મૂળના ડીએનએ ટુકડાઓના પ્રકાશન સાથે સંકળાયેલ છે.અમે તીવ્ર ગરમીના તાણનો ઉપયોગ કરીને આ મુદ્દાને સંબોધિત કર્યો, જેમાં છીપને થોડા સમય માટે 30 °C તાપમાને ખુલ્લું મૂક્યું હતું.અમે ત્રણ સ્વતંત્ર પ્રયોગોમાં ત્રણ અલગ-અલગ પ્રકારના મસલ પર આ વિશ્લેષણ કર્યું.જો કે, તીવ્ર ગરમીના તાણ પછી અમને ccfDNA સ્તરોમાં કોઈ ફેરફાર જોવા મળ્યો નથી (જુઓ આકૃતિ S5, વધારાની માહિતી).આ શોધ ઓછામાં ઓછું આંશિક રીતે, એ હકીકતને સમજાવી શકે છે કે છીપમાં અર્ધ-ખુલ્લી રુધિરાભિસરણ પ્રણાલી હોય છે અને તેમની ઉચ્ચ ફિલ્ટરિંગ પ્રવૃત્તિને કારણે મોટા પ્રમાણમાં વિદેશી ડીએનએ એકઠા કરે છે.બીજી બાજુ, મસલ્સ, ઘણા અપૃષ્ઠવંશી પ્રાણીઓની જેમ, તણાવ-પ્રેરિત પેશીઓના નુકસાન માટે વધુ પ્રતિરોધક હોઈ શકે છે, ત્યાં તેમના હેમોલિમ્ફ [70, 71] માં ccfDNA ના પ્રકાશનને મર્યાદિત કરે છે.
આજની તારીખે, જળચર ઇકોસિસ્ટમ્સમાં જૈવવિવિધતાના ડીએનએ વિશ્લેષણ મુખ્યત્વે પર્યાવરણીય ડીએનએ (ઇડીએનએ) મેટાબારકોડિંગ પર કેન્દ્રિત છે.જો કે, જ્યારે પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરવામાં આવે ત્યારે આ પદ્ધતિ સામાન્ય રીતે જૈવવિવિધતા વિશ્લેષણમાં મર્યાદિત હોય છે.શોટગન સિક્વન્સિંગનો ઉપયોગ પીસીઆરની મર્યાદાઓ અને પ્રાઈમર સેટની પક્ષપાતી પસંદગીને અટકાવે છે.આમ, એક અર્થમાં, અમારી પદ્ધતિ તાજેતરમાં ઉપયોગમાં લેવાતી ઉચ્ચ-થ્રુપુટ eDNA શોટગન સિક્વન્સિંગ પદ્ધતિની નજીક છે, જે ખંડિત ડીએનએને સીધો ક્રમ આપવા અને લગભગ તમામ જીવોનું વિશ્લેષણ કરવામાં સક્ષમ છે [72, 73].જો કે, ત્યાં સંખ્યાબંધ મૂળભૂત મુદ્દાઓ છે જે LB ને પ્રમાણભૂત eDNA પદ્ધતિઓથી અલગ પાડે છે.અલબત્ત, eDNA અને LB વચ્ચેનો મુખ્ય તફાવત કુદરતી ફિલ્ટર હોસ્ટનો ઉપયોગ છે.eDNA નો અભ્યાસ કરવા માટે કુદરતી ફિલ્ટર તરીકે દરિયાઈ પ્રજાતિઓ જેમ કે જળચરો અને બાયવલ્વ્સ (ડ્રેસીના એસપીપી.) નો ઉપયોગ નોંધવામાં આવ્યો છે [74, 75].જો કે, ડ્રીસેનાના અભ્યાસમાં ટીશ્યુ બાયોપ્સીનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો જેમાંથી ડીએનએ કાઢવામાં આવ્યું હતું.એલબીમાંથી સીસીએફડીએનએના વિશ્લેષણ માટે ટીશ્યુ બાયોપ્સી, ઇડીએનએ અથવા ટીશ્યુ બાયોપ્સી સાથે સંકળાયેલ વિશિષ્ટ અને ક્યારેક ખર્ચાળ સાધનો અને લોજિસ્ટિક્સની જરૂર નથી.વાસ્તવમાં, અમે તાજેતરમાં અહેવાલ આપ્યો છે કે એલબીમાંથી ccfDNA કોલ્ડ ચેઇનને જાળવી રાખ્યા વિના FTA સપોર્ટ સાથે સંગ્રહિત અને વિશ્લેષણ કરી શકાય છે, જે દૂરના વિસ્તારોમાં સંશોધન માટે એક મોટો પડકાર છે [76].લિક્વિડ બાયોપ્સીમાંથી ccfDNA નું નિષ્કર્ષણ પણ સરળ છે અને શોટગન સિક્વન્સિંગ અને PCR વિશ્લેષણ માટે ઉચ્ચ ગુણવત્તાવાળા DNA પ્રદાન કરે છે.eDNA વિશ્લેષણ [77] સાથે સંકળાયેલ કેટલીક તકનીકી મર્યાદાઓને જોતાં આ એક મોટો ફાયદો છે.સેમ્પલિંગ પદ્ધતિની સરળતા અને ઓછી કિંમત પણ ખાસ કરીને લાંબા ગાળાના મોનિટરિંગ પ્રોગ્રામ માટે યોગ્ય છે.તેમની ઉચ્ચ ફિલ્ટરિંગ ક્ષમતા ઉપરાંત, બાયવલ્વ્સની અન્ય જાણીતી વિશેષતા તેમના લાળની રાસાયણિક મ્યુકોપોલિસેકરાઇડ રચના છે, જે વાયરસના શોષણને પ્રોત્સાહન આપે છે [78, 79].આ બાયવલ્વ્સને આપેલ જળચર ઇકોસિસ્ટમમાં જૈવવિવિધતા અને આબોહવા પરિવર્તનની અસરને દર્શાવવા માટે એક આદર્શ કુદરતી ફિલ્ટર બનાવે છે.જો કે યજમાન-ઉત્પન્ન ડીએનએ ટુકડાઓની હાજરીને eDNA ની તુલનામાં પદ્ધતિની મર્યાદા તરીકે જોઈ શકાય છે, eDNA ની સરખામણીમાં આવા મૂળ ccfDNA સાથે સંકળાયેલ ખર્ચ આરોગ્ય અભ્યાસ માટે ઉપલબ્ધ વિશાળ માહિતી માટે એક સાથે સમજી શકાય તેવું છે.ઑફસેટ યજમાન.આમાં હોસ્ટ હોસ્ટના જિનોમમાં સંકલિત વાયરલ સિક્વન્સની હાજરીનો સમાવેશ થાય છે.આ ખાસ કરીને મસલ્સ માટે મહત્વપૂર્ણ છે, બાયવલ્વ [80, 81] માં આડા ટ્રાન્સમિટેડ લ્યુકેમિક રેટ્રોવાયરસની હાજરીને જોતાં.ઇડીએનએ પર એલબીનો બીજો ફાયદો એ છે કે તે હેમોલિમ્ફમાં રક્ત કોશિકાઓના પરિભ્રમણની ફેગોસાયટીક પ્રવૃત્તિનું શોષણ કરે છે, જે સુક્ષ્મસજીવો (અને તેમના જીનોમ) ને સમાવે છે.ફેગોસાયટોસિસ એ બાયવલ્વ [82] માં રક્ત કોશિકાઓનું મુખ્ય કાર્ય છે.અંતે, પદ્ધતિ મસલ્સની ઉચ્ચ ફિલ્ટરિંગ ક્ષમતા (સરેરાશ 1.5 l/h દરિયાઈ પાણી) અને બે દિવસના પરિભ્રમણનો લાભ લે છે, જે દરિયાઈ પાણીના વિવિધ સ્તરોના મિશ્રણમાં વધારો કરે છે, જે હેટરોલોગસ ઇડીએનએને પકડવાની મંજૂરી આપે છે.[83, 84].આમ, મસલની પોષક, આર્થિક અને પર્યાવરણીય અસરોને જોતાં મસલ સીસીએફડીએનએ વિશ્લેષણ એ એક રસપ્રદ માર્ગ છે.મનુષ્યો પાસેથી એકત્ર કરાયેલ એલબીના વિશ્લેષણની જેમ, આ પદ્ધતિ પણ બાહ્ય પદાર્થોના પ્રતિભાવમાં યજમાન ડીએનએમાં આનુવંશિક અને એપિજેનેટિક ફેરફારોને માપવાની શક્યતા ખોલે છે.ઉદાહરણ તરીકે, નેનોપોર સિક્વન્સિંગનો ઉપયોગ કરીને મૂળ ccfDNA માં જીનોમ-વ્યાપી મેથિલેશન વિશ્લેષણ કરવા માટે ત્રીજી પેઢીની સિક્વન્સિંગ ટેક્નોલોજીઓની કલ્પના કરી શકાય છે.આ પ્રક્રિયાને એ હકીકત દ્વારા સુવિધા આપવી જોઈએ કે મસલ સીસીએફડીએનએ ટુકડાઓની લંબાઈ આદર્શ રીતે લાંબા-વાંચેલા સિક્વન્સીંગ પ્લેટફોર્મ્સ સાથે સુસંગત છે જે રાસાયણિક પરિવર્તનની જરૂરિયાત વિના એક જ સિક્વન્સીંગ રનથી જીનોમ-વાઇડ ડીએનએ મેથિલેશન વિશ્લેષણને મંજૂરી આપે છે. 85,86] આ એક રસપ્રદ સંભાવના છે, કારણ કે તે બતાવવામાં આવ્યું છે કે ડી.એન.એ.તેથી, તે આબોહવા પરિવર્તન અથવા પ્રદૂષકો [87]ના સંપર્કમાં આવ્યા પછી પ્રતિભાવને સંચાલિત કરતી અંતર્ગત પદ્ધતિઓમાં મૂલ્યવાન આંતરદૃષ્ટિ પ્રદાન કરી શકે છે.જો કે, એલબીનો ઉપયોગ મર્યાદાઓ વિના નથી.કહેવાની જરૂર નથી, આ માટે ઇકોસિસ્ટમમાં સૂચક પ્રજાતિઓની હાજરી જરૂરી છે.ઉપર જણાવ્યા મુજબ, આપેલ ઇકોસિસ્ટમની જૈવવિવિધતાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે LB નો ઉપયોગ કરવા માટે સખત બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ પાઇપલાઇનની પણ જરૂર છે જે સ્ત્રોતમાંથી DNA ટુકડાઓની હાજરીને ધ્યાનમાં લે છે.બીજી મોટી સમસ્યા દરિયાઈ પ્રજાતિઓ માટે સંદર્ભ જીનોમની ઉપલબ્ધતા છે.એવી આશા છે કે મરીન મેમલ જીનોમ પ્રોજેક્ટ અને તાજેતરમાં સ્થપાયેલ ફિશ10k પ્રોજેક્ટ [88] જેવી પહેલ ભવિષ્યમાં આવા વિશ્લેષણને સરળ બનાવશે.દરિયાઈ ફિલ્ટર-ફીડિંગ સજીવો માટે LB ખ્યાલનો ઉપયોગ સિક્વન્સિંગ ટેક્નોલોજીમાં નવીનતમ એડવાન્સિસ સાથે પણ સુસંગત છે, જે તેને પર્યાવરણીય તણાવના પ્રતિભાવમાં દરિયાઈ વસવાટોના સ્વાસ્થ્ય વિશે મહત્વપૂર્ણ માહિતી પ્રદાન કરવા માટે મલ્ટિ-ઓહ્મ બાયોમાર્કર્સના વિકાસ માટે સારી રીતે અનુકૂળ બનાવે છે.
જીનોમ સિક્વન્સિંગ ડેટા બાયોપ્રોજેક્ટ્સ SRR8924808 હેઠળ NCBI સિક્વન્સ રીડ આર્કાઇવ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 માં જમા કરવામાં આવ્યો છે.
બ્રિઅરલી એએસ, કિંગ્સફોર્ડ એમજે ઇમ્પેક્ટ ઓફ ક્લાઇમેટ ચેન્જ ઓન મરીન લાઇફ એન્ડ ઇકોસિસ્ટમ્સ.કોલ બાયોલોજી.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.દરિયાઈ પર્યાવરણ પર આબોહવા પરિવર્તન અને અન્ય સ્થાનિક તણાવની સંયુક્ત અસરોને ધ્યાનમાં લો.સામાન્ય વૈજ્ઞાનિક વાતાવરણ.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).પ્રથમ માર્ચનું વિજ્ઞાન.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. પુનરાવર્તિત ગરમીના તાણની સ્થિતિમાં ઘટાડો ગરમી સહનશીલતા વાદળી છીપના ઉચ્ચ ઉનાળામાં મૃત્યુદર સમજાવે છે.વૈજ્ઞાનિક અહેવાલ 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.પ્રાણીઓના મૃત્યુની આવર્તન, કારણો અને હદમાં તાજેતરના ફેરફારો.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
સ્કાર્પા એફ, સન્ના ડી, અઝેના I, મુગેટી ડી, સેરુટી એફ, હોસેની એસ, એટ અલ.બહુવિધ બિન-જાતિ-વિશિષ્ટ પેથોજેન્સ પિન્ના નોબિલિસના સામૂહિક મૃત્યુનું કારણ બની શકે છે.જીવન.2020; 10:238.
બ્રેડલી એમ, કાઉટ્સ એસજે, જેનકિન્સ ઇ, ઓ'હારા ટીએમ.આર્કટિક ઝૂનોટિક રોગો પર આબોહવા પરિવર્તનની સંભવિત અસર.ઇન્ટ જે સર્કમ્પોલર હેલ્થ.2005;64:468–77.
બેયર જે., ગ્રીન એનડબ્લ્યુ, બ્રૂક્સ એસ., એલન આઈજે, રુસ એ., ગોમેઝ ટી. એટ અલ.કોસ્ટલ પોલ્યુશન મોનિટરિંગમાં સિગ્નલ ઓર્ગેનિઝમ્સ તરીકે બ્લુ મસેલ્સ (માયટીલસ એડ્યુલિસ એસપીપી.: એક સમીક્ષા.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
સિરાવેગ્ના જી, માર્સોની એસ, સિએના એસ, બાર્ડેલી એ. કેન્સરની સારવારમાં પ્રવાહી બાયોપ્સીનું એકીકરણ.નેટ રેવ ક્લીન ઓન્કોલ.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.લિક્વિડ બાયોપ્સી પરિપક્વતા: ગાંઠના ડીએનએને પરિભ્રમણ કરવાની મંજૂરી આપે છે.નેટ રેવ કેન્સર.2017;17:223–38.
મેન્ડેલ પી., મેટાઇસ પી. માનવ પ્લાઝ્મામાં ન્યુક્લિક એસિડ્સ.Soc Biol પેટાકંપનીઓની મીટિંગ મિનિટ્સ.1948;142:241-3.
બ્રોન્કહોર્સ્ટ એજે, ઉંગેરર ડબ્લ્યુ, હોલ્ડનરીડર એસ. કેન્સરની સારવાર માટે મોલેક્યુલર માર્કર તરીકે સેલ-ફ્રી ડીએનએ માટે નવી ભૂમિકા.બાયોમોલર વિશ્લેષણનું પ્રમાણીકરણ.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS લિક્વિડ બાયોપ્સી ક્લિનિકમાં પ્રવેશ કરે છે - અમલીકરણ મુદ્દાઓ અને ભાવિ પડકારો.નેટ રેવ ક્લિન ઓન્કોલ.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW અને અન્ય.ફેટલ ડીએનએ માતાના પ્લાઝ્મા અને સીરમમાં હાજર છે.લેન્સેટ.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR ગર્ભાવસ્થા દરમિયાન સ્ત્રીઓના લોહીમાં પરિભ્રમણ કરતા એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર આરએનએનો ઉપયોગ કરીને ગર્ભાવસ્થાના કોર્સ અને તેની જટિલતાઓનો અભ્યાસ.ડોપેડિયાટ્રિક્સ.2020;8:605219.
ઓલેરીચ એમ, શેરવુડ કે, કેવન પી, શૂટ્ઝ ઇ, બેક જે, સ્ટેગબાઉર જે, એટ અલ.લિક્વિડ બાયોપ્સી: દાતા કોષ-મુક્ત ડીએનએનો ઉપયોગ કિડની કલમમાં એલોજેનિક જખમ શોધવા માટે થાય છે.નેટ રેવ નેફ્રોલ.2021;17:591–603.
જુઆન એફસી, લો વાયએમ ઇનોવેશન્સ ઇન પ્રિનેટલ ડાયગ્નોસ્ટિક્સ: મેટરનલ પ્લાઝ્મા જીનોમ સિક્વન્સિંગ.અન્ના એમ.ડી.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.ચેપગ્રસ્ત શારીરિક પ્રવાહીના નેક્સ્ટ જનરેશન મેટાજેનોમિક સિક્વન્સિંગ સાથે ઝડપી પેથોજેન શોધ.નેટ દવા.2021;27:115-24.