Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર. તમે જે બ્રાઉઝર વર્ઝનનો ઉપયોગ કરી રહ્યા છો તેમાં મર્યાદિત CSS સપોર્ટ છે. શ્રેષ્ઠ અનુભવ માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે અપડેટેડ બ્રાઉઝરનો ઉપયોગ કરો (અથવા ઇન્ટરનેટ એક્સપ્લોરરમાં સુસંગતતા મોડને અક્ષમ કરો). તે દરમિયાન, સતત સપોર્ટ સુનિશ્ચિત કરવા માટે, અમે સાઇટને સ્ટાઇલ અને JavaScript વિના રેન્ડર કરીશું.
દવા પરીક્ષણ માટે હૃદયના શારીરિક વાતાવરણને સચોટ રીતે પ્રજનન કરી શકે તેવી વિશ્વસનીય ઇન વિટ્રો સિસ્ટમની જરૂર છે. માનવ હૃદય ટીશ્યુ કલ્ચર સિસ્ટમ્સની મર્યાદિત ઉપલબ્ધતાને કારણે કાર્ડિયાક ડ્રગ અસરોના ખોટા અર્થઘટન થયા છે. અહીં, અમે કાર્ડિયાક ટીશ્યુ કલ્ચર મોડેલ (CTCM) વિકસાવ્યું છે જે ઇલેક્ટ્રોમિકેનિકલ રીતે હૃદયના ટુકડાઓને ઉત્તેજિત કરે છે અને કાર્ડિયાક ચક્રના સિસ્ટોલિક અને ડાયસ્ટોલિક તબક્કાઓ દરમિયાન શારીરિક ખેંચાણમાંથી પસાર થાય છે. 12 દિવસના કલ્ચર પછી, આ અભિગમ હૃદયના વિભાગોની કાર્યક્ષમતામાં આંશિક સુધારો કરે છે, પરંતુ તેમની માળખાકીય અખંડિતતાને સંપૂર્ણપણે જાળવી શકતો નથી. તેથી, નાના પરમાણુ તપાસ પછી, અમને જાણવા મળ્યું કે અમારા માધ્યમમાં 100 nM ટ્રાયોડોથિરોનાઇન (T3) અને 1 μM ડેક્સામેથાસોન (Dex) ઉમેરવાથી 12 દિવસ માટે વિભાગોની માઇક્રોસ્ટ્રક્ચર જાળવી રાખવામાં આવી હતી. T3/Dex સારવાર સાથે સંયોજનમાં, CTCM સિસ્ટમે 12 દિવસ માટે તાજા હૃદયના પેશીઓ જેવા જ સ્તરે ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ પ્રોફાઇલ્સ, કાર્યક્ષમતા, મેટાબોલિક પ્રવૃત્તિ અને માળખાકીય અખંડિતતા જાળવી રાખી હતી. વધુમાં, કલ્ચરમાં કાર્ડિયાક ટીશ્યુનું વધુ પડતું ખેંચાણ હાઇપરટ્રોફિક કાર્ડિયાક સિગ્નલિંગને પ્રેરિત કરે છે, જે કાર્ડિયાક સ્ટ્રેચ દ્વારા પ્રેરિત હાઇપરટ્રોફિક પરિસ્થિતિઓની નકલ કરવાની CTCM ની ક્ષમતાના પુરાવા પૂરા પાડે છે. નિષ્કર્ષમાં, CTCM લાંબા સમય સુધી કલ્ચરમાં હૃદયના શરીરવિજ્ઞાન અને પેથોફિઝિયોલોજીનું મોડેલ બનાવી શકે છે, જેનાથી વિશ્વસનીય દવા તપાસ શક્ય બને છે.
ક્લિનિકલ સંશોધન પહેલાં, વિશ્વસનીય ઇન વિટ્રો સિસ્ટમ્સની જરૂર છે જે માનવ હૃદયના શારીરિક વાતાવરણને સચોટ રીતે પ્રજનન કરી શકે. આવી સિસ્ટમોએ બદલાયેલા યાંત્રિક ખેંચાણ, હૃદયના ધબકારા અને ઇલેક્ટ્રોફિઝીયોલોજીકલ ગુણધર્મોનું અનુકરણ કરવું જોઈએ. પ્રાણી મોડેલોનો ઉપયોગ સામાન્ય રીતે કાર્ડિયાક ફિઝીયોલોજી માટે સ્ક્રીનીંગ પ્લેટફોર્મ તરીકે થાય છે જેમાં માનવ હૃદયમાં દવાઓની અસરોને પ્રતિબિંબિત કરવામાં મર્યાદિત વિશ્વસનીયતા હોય છે1,2. આખરે, આદર્શ કાર્ડિયાક ટીશ્યુ કલ્ચર એક્સપેરિમેન્ટલ મોડેલ (CTCM) એક મોડેલ છે જે વિવિધ ઉપચારાત્મક અને ફાર્માકોલોજિકલ હસ્તક્ષેપો માટે અત્યંત સંવેદનશીલ અને વિશિષ્ટ છે, જે માનવ હૃદયના શરીરવિજ્ઞાન અને પેથોફિઝીયોલોજીનું સચોટ રીતે પુનઃઉત્પાદન કરે છે3. આવી સિસ્ટમની ગેરહાજરી હૃદયની નિષ્ફળતા માટે નવી સારવારોની શોધને મર્યાદિત કરે છે4,5 અને બજારમાંથી બહાર નીકળવાના મુખ્ય કારણ તરીકે ડ્રગ કાર્ડિયોટોક્સિસિટી તરફ દોરી ગઈ છે6.
છેલ્લા દાયકામાં, આઠ બિન-કાર્ડિયોવાસ્ક્યુલર દવાઓ ક્લિનિકલ ઉપયોગમાંથી પાછી ખેંચી લેવામાં આવી છે કારણ કે તે QT અંતરાલને લંબાવવાનું કારણ બને છે જે વેન્ટ્રિક્યુલર એરિથમિયા અને અચાનક મૃત્યુ તરફ દોરી જાય છે. આમ, કાર્ડિયોવેસ્ક્યુલર અસરકારકતા અને ઝેરીતાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે વિશ્વસનીય પ્રીક્લિનિકલ સ્ક્રીનીંગ વ્યૂહરચનાઓની જરૂરિયાત વધી રહી છે. દવા સ્ક્રીનીંગ અને ઝેરીતા પરીક્ષણમાં માનવ-પ્રેરિત પ્લુરીપોટેન્ટ સ્ટેમ સેલ-ડેરિવ્ડ કાર્ડિયોમાયોસાઇટ્સ (hiPS-CM) નો તાજેતરનો ઉપયોગ આ સમસ્યાનો આંશિક ઉકેલ પૂરો પાડે છે. જો કે, hiPS-CM ની અપરિપક્વ પ્રકૃતિ અને કાર્ડિયાક પેશીઓની બહુકોષીય જટિલતાનો અભાવ આ પદ્ધતિની મુખ્ય મર્યાદાઓ છે. તાજેતરના અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે સ્વયંસ્ફુરિત સંકોચનની શરૂઆત પછી તરત જ કાર્ડિયાક ટીશ્યુ હાઇડ્રોજેલ્સ બનાવવા માટે પ્રારંભિક hiPS-CM નો ઉપયોગ કરીને અને સમય જતાં ધીમે ધીમે વિદ્યુત ઉત્તેજનામાં વધારો કરીને આ મર્યાદાને આંશિક રીતે દૂર કરી શકાય છે. જો કે, આ hiPS-CM માઇક્રોટીશ્યુમાં પુખ્ત મ્યોકાર્ડિયમના પરિપક્વ ઇલેક્ટ્રોફિઝીયોલોજીકલ અને સંકોચન ગુણધર્મોનો અભાવ છે. વધુમાં, માનવ હૃદય પેશીઓમાં વધુ જટિલ રચના હોય છે, જેમાં વિવિધ પ્રકારના કોષનું વિજાતીય મિશ્રણ હોય છે, જેમાં એન્ડોથેલિયલ કોષો, ચેતાકોષો અને સ્ટ્રોમલ ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટનો સમાવેશ થાય છે, જે બાહ્યકોષીય મેટ્રિક્સ પ્રોટીનના ચોક્કસ સેટ દ્વારા એકબીજા સાથે જોડાયેલા હોય છે. પુખ્ત સસ્તન પ્રાણીઓના હૃદયમાં બિન-કાર્ડિયોમાયોસાઇટ વસ્તી 11,12,13 ની આ વિજાતીયતા વ્યક્તિગત કોષ પ્રકારોનો ઉપયોગ કરીને કાર્ડિયાક પેશીઓનું મોડેલિંગ કરવામાં એક મુખ્ય અવરોધ છે. આ મુખ્ય મર્યાદાઓ શારીરિક અને રોગવિજ્ઞાનવિષયક પરિસ્થિતિઓ હેઠળ અખંડ મ્યોકાર્ડિયલ પેશીઓનું સંવર્ધન કરવા માટે પદ્ધતિઓ વિકસાવવાના મહત્વ પર ભાર મૂકે છે.
માનવ હૃદયના કલ્ચર્ડ પાતળા (300 µm) વિભાગો અખંડ માનવ મ્યોકાર્ડિયમનું આશાસ્પદ મોડેલ સાબિત થયા છે. આ પદ્ધતિ માનવ હૃદય પેશીઓ જેવી જ સંપૂર્ણ 3D બહુકોષીય પ્રણાલીની ઍક્સેસ પ્રદાન કરે છે. જો કે, 2019 સુધી, કલ્ચર્ડ હૃદય વિભાગોનો ઉપયોગ ટૂંકા (24 કલાક) સંસ્કૃતિ અસ્તિત્વ દ્વારા મર્યાદિત હતો. આ ભૌતિક-યાંત્રિક ખેંચાણનો અભાવ, હવા-પ્રવાહી ઇન્ટરફેસ અને સરળ માધ્યમોનો ઉપયોગ સહિત અનેક પરિબળોને કારણે છે જે કાર્ડિયાક પેશીઓની જરૂરિયાતોને ટેકો આપતા નથી. 2019 માં, ઘણા સંશોધન જૂથોએ દર્શાવ્યું હતું કે કાર્ડિયાક ટીશ્યુ સંસ્કૃતિ પ્રણાલીઓમાં યાંત્રિક પરિબળોનો સમાવેશ સંસ્કૃતિ જીવનને લંબાવી શકે છે, કાર્ડિયાક અભિવ્યક્તિમાં સુધારો કરી શકે છે અને કાર્ડિયાક પેથોલોજીની નકલ કરી શકે છે. બે ભવ્ય અભ્યાસો 17 અને 18 દર્શાવે છે કે એકાક્ષીય યાંત્રિક લોડિંગ સંસ્કૃતિ દરમિયાન કાર્ડિયાક ફેનોટાઇપ પર હકારાત્મક અસર કરે છે. જો કે, આ અભ્યાસોમાં કાર્ડિયાક ચક્રના ગતિશીલ ત્રિ-પરિમાણીય ભૌતિક-યાંત્રિક લોડિંગનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો ન હતો, કારણ કે હૃદય વિભાગો આઇસોમેટ્રિક ટેન્સાઇલ ફોર્સ 17 અથવા રેખીય ઓક્સોટોનિક લોડિંગ 18 સાથે લોડ કરવામાં આવ્યા હતા. ટીશ્યુ સ્ટ્રેચિંગની આ પદ્ધતિઓના પરિણામે ઘણા કાર્ડિયાક જનીનો દબાઈ ગયા અથવા અસામાન્ય સ્ટ્રેચ પ્રતિભાવો સાથે સંકળાયેલા જનીનોનું વધુ પડતું અભિવ્યક્તિ થયું. નોંધનીય છે કે, પિટોલિસ એટ અલ. 19 એ ફોર્સ ટ્રાન્સડ્યુસર ફીડબેક અને ટેન્શન ડ્રાઇવનો ઉપયોગ કરીને કાર્ડિયાક સાયકલ રિકન્સ્ટ્રક્શન માટે ડાયનેમિક હાર્ટ સ્લાઇસ કલ્ચર બાથ વિકસાવ્યો. જોકે આ સિસ્ટમ વધુ સચોટ ઇન વિટ્રો કાર્ડિયાક સાયકલ મોડેલિંગ માટે પરવાનગી આપે છે, પદ્ધતિની જટિલતા અને ઓછી થ્રુપુટ આ સિસ્ટમના ઉપયોગને મર્યાદિત કરે છે. અમારી પ્રયોગશાળાએ તાજેતરમાં ઇલેક્ટ્રિકલ સ્ટીમ્યુલેશન અને એક ઑપ્ટિમાઇઝ્ડ માધ્યમનો ઉપયોગ કરીને એક સરળ કલ્ચર સિસ્ટમ વિકસાવી છે જે ડુક્કર અને માનવ હૃદય પેશીઓના વિભાગોની 6 દિવસ સુધી કાર્યક્ષમતા જાળવી રાખે છે20,21.
વર્તમાન હસ્તપ્રતમાં, અમે કાર્ડિયાક ટીશ્યુ કલ્ચર મોડેલ (CTCM) નું વર્ણન કરીએ છીએ જેમાં પોર્સિન હાર્ટના વિભાગોનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે જેમાં કાર્ડિયાક ચક્ર દરમિયાન ત્રિ-પરિમાણીય કાર્ડિયાક ફિઝિયોલોજી અને પેથોફિઝિયોલોજિકલ ડિસ્ટેન્શનનું પુનરાવર્તન કરવા માટે હ્યુમરલ સંકેતોનો સમાવેશ થાય છે. આ CTCM પ્રી-ક્લિનિકલ ડ્રગ પ્રેડિક્શનની ચોકસાઈને એક એવા સ્તર સુધી વધારી શકે છે જે પહેલા ક્યારેય પ્રાપ્ત ન થઈ હોય તેવી કિંમત-અસરકારક, મધ્યમ-થ્રુપુટ કાર્ડિયાક સિસ્ટમ પ્રદાન કરીને મેળવી શકાય છે જે પ્રી-ક્લિનિકલ ડ્રગ પરીક્ષણ માટે સસ્તન હૃદયના ફિઝિયોલોજી/પેથોફિઝિયોલોજીનું અનુકરણ કરે છે.
હેમોડાયનેમિક યાંત્રિક સંકેતો કાર્ડિયોમાયોસાઇટ કાર્યને જાળવવામાં મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવે છે 22,23,24. વર્તમાન હસ્તપ્રતમાં, અમે એક CTCM (આકૃતિ 1a) વિકસાવ્યું છે જે શારીરિક ફ્રીક્વન્સીઝ (1.2 Hz, 72 ધબકારા પ્રતિ મિનિટ) પર વિદ્યુત અને યાંત્રિક ઉત્તેજના બંનેને પ્રેરિત કરીને પુખ્ત વયના હૃદયના વાતાવરણની નકલ કરી શકે છે. ડાયસ્ટોલ દરમિયાન વધુ પડતા પેશીઓના ખેંચાણને ટાળવા માટે, પેશીઓના કદમાં 25% વધારો કરવા માટે 3D પ્રિન્ટિંગ ઉપકરણનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો (આકૃતિ 1b). કાર્ડિયાક ચક્રને સંપૂર્ણપણે પુનઃઉત્પાદિત કરવા માટે ડેટા એક્વિઝિશન સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરીને C-PACE સિસ્ટમ દ્વારા પ્રેરિત ઇલેક્ટ્રિકલ પેસિંગને સિસ્ટોલ પહેલાં 100 ms શરૂ કરવા માટે સમય આપવામાં આવ્યો હતો. ટીશ્યુ કલ્ચર સિસ્ટમ પ્રોગ્રામેબલ ન્યુમેટિક એક્ટ્યુએટર (LB એન્જિનિયરિંગ, જર્મની) નો ઉપયોગ કરે છે જેથી ઉપલા ચેમ્બરમાં હૃદયના ટુકડાઓનું વિસ્તરણ થાય તે માટે એક લવચીક સિલિકોન પટલને ચક્રીય રીતે વિસ્તૃત કરી શકાય. સિસ્ટમ પ્રેશર ટ્રાન્સડ્યુસર દ્વારા બાહ્ય હવા રેખા સાથે જોડાયેલ હતી, જેના કારણે દબાણ (± 1 mmHg) અને સમય (± 1 ms) (આકૃતિ 1c) ને સચોટ રીતે ગોઠવવાનું શક્ય બન્યું.
a ઉપકરણના કલ્ચર ચેમ્બરની અંદર વાદળી રંગમાં બતાવેલ 7 મીમી સપોર્ટ રિંગ સાથે ટીશ્યુ સેક્શન જોડો. કલ્ચર ચેમ્બરને પાતળા લવચીક સિલિકોન મેમ્બ્રેન દ્વારા એર ચેમ્બરથી અલગ કરવામાં આવે છે. લીક અટકાવવા માટે દરેક ચેમ્બર વચ્ચે ગાસ્કેટ મૂકો. ઉપકરણના ઢાંકણમાં ગ્રેફાઇટ ઇલેક્ટ્રોડ હોય છે જે વિદ્યુત ઉત્તેજના પ્રદાન કરે છે. b મોટા ટીશ્યુ ડિવાઇસ, ગાઇડ રિંગ અને સપોર્ટ રિંગનું યોજનાકીય પ્રતિનિધિત્વ. ટીશ્યુ સેક્શન (ભુરો) મોટા કદના ડિવાઇસ પર મૂકવામાં આવે છે જેમાં ગાઇડ રિંગ ઉપકરણની બાહ્ય ધાર પર ખાંચમાં મૂકવામાં આવે છે. માર્ગદર્શિકાનો ઉપયોગ કરીને, કાર્ડિયાક ટીશ્યુના સેક્શન પર ટીશ્યુ એક્રેલિક એડહેસિવથી કોટેડ સપોર્ટ રિંગ કાળજીપૂર્વક મૂકો. c પ્રોગ્રામેબલ ન્યુમેટિક એક્ટ્યુએટર (PPD) દ્વારા નિયંત્રિત હવા ચેમ્બર દબાણના કાર્ય તરીકે વિદ્યુત ઉત્તેજનાના સમયને દર્શાવતો ગ્રાફ. પ્રેશર સેન્સરનો ઉપયોગ કરીને વિદ્યુત ઉત્તેજનાને સિંક્રનાઇઝ કરવા માટે ડેટા એક્વિઝિશન ડિવાઇસનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. જ્યારે કલ્ચર ચેમ્બરમાં દબાણ સેટ થ્રેશોલ્ડ સુધી પહોંચે છે, ત્યારે વિદ્યુત ઉત્તેજના ટ્રિગર કરવા માટે C-PACE-EM ને પલ્સ સિગ્નલ મોકલવામાં આવે છે. d ઇન્ક્યુબેટર શેલ્ફ પર મૂકવામાં આવેલા ચાર CTCM ની છબી. ચાર ઉપકરણો એક PPD સાથે ન્યુમેટિક સર્કિટ દ્વારા જોડાયેલા હોય છે, અને ન્યુમેટિક સર્કિટમાં દબાણનું નિરીક્ષણ કરવા માટે હેમોસ્ટેટિક વાલ્વમાં પ્રેશર સેન્સર દાખલ કરવામાં આવે છે. દરેક ઉપકરણમાં છ પેશી વિભાગો હોય છે.
એક જ ન્યુમેટિક એક્ટ્યુએટરનો ઉપયોગ કરીને, અમે 4 CTCM ઉપકરણોને નિયંત્રિત કરવામાં સક્ષમ હતા, જેમાંથી દરેક 6 પેશી વિભાગો (આકૃતિ 1d) પકડી શકે છે. CTCM માં, હવાના ચેમ્બરમાં હવાનું દબાણ પ્રવાહી ચેમ્બરમાં સિંક્રનસ દબાણમાં રૂપાંતરિત થાય છે અને હૃદયના ટુકડાના શારીરિક વિસ્તરણને પ્રેરિત કરે છે (આકૃતિ 2a અને પૂરક મૂવી 1). 80 mm Hg પર પેશીના ખેંચાણનું મૂલ્યાંકન. આર્ટ. માં પેશીના ભાગોનું 25% (આકૃતિ 2b) દ્વારા ખેંચાણ દર્શાવવામાં આવ્યું છે. આ ટકાવારી ખેંચાણ સામાન્ય કાર્ડિયાક વિભાગ સંકોચન માટે 2.2–2.3 µm ની શારીરિક સાર્કોમેર લંબાઈને અનુરૂપ હોવાનું દર્શાવવામાં આવ્યું છે17,19,25. કસ્ટમ કેમેરા સેટિંગ્સનો ઉપયોગ કરીને પેશીઓની હિલચાલનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું (પૂરક આકૃતિ 1). પેશીઓની હિલચાલનું કંપનવિસ્તાર અને વેગ (આકૃતિ 2c, d) કાર્ડિયાક ચક્ર દરમિયાન ખેંચાણ અને સિસ્ટોલ અને ડાયસ્ટોલ દરમિયાન સમયને અનુરૂપ હતું (આકૃતિ 2b). સંકોચન અને આરામ દરમિયાન કાર્ડિયાક પેશીઓનો ખેંચાણ અને વેગ સંસ્કૃતિમાં 12 દિવસ સુધી સ્થિર રહ્યો (આકૃતિ 2f). કલ્ચર દરમિયાન સંકોચનશીલતા પર વિદ્યુત ઉત્તેજનાની અસરનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે, અમે શેડિંગ અલ્ગોરિધમનો ઉપયોગ કરીને સક્રિય વિકૃતિ નક્કી કરવા માટે એક પદ્ધતિ વિકસાવી (પૂરક આકૃતિ 2a,b) અને વિદ્યુત ઉત્તેજના સાથે અને વગર વિકૃતિઓ વચ્ચે તફાવત કરવામાં સક્ષમ હતા. હૃદયનો સમાન ભાગ (આકૃતિ 2f). કટના ગતિશીલ પ્રદેશમાં (R6-9), વિદ્યુત ઉત્તેજના દરમિયાન વોલ્ટેજ વિદ્યુત ઉત્તેજનાની ગેરહાજરી કરતા 20% વધારે હતો, જે સંકોચનશીલ કાર્યમાં વિદ્યુત ઉત્તેજનાના યોગદાનને દર્શાવે છે.
હવાના ચેમ્બરના દબાણ, પ્રવાહી ચેમ્બરના દબાણ અને પેશીઓની ગતિ માપનના પ્રતિનિધિ નિશાન પુષ્ટિ કરે છે કે ચેમ્બરનું દબાણ પ્રવાહી ચેમ્બરના દબાણમાં ફેરફાર કરે છે, જેના કારણે પેશીઓના ટુકડાની અનુરૂપ ગતિ થાય છે. b ટકાવારી ખેંચાણ (નારંગી) ને અનુરૂપ પેશીઓના વિભાગોના ટકાવારી ખેંચાણ (વાદળી) ના પ્રતિનિધિ નિશાન. c કાર્ડિયાક સ્લાઇસની માપેલ ગતિ ગતિની માપેલ ગતિ સાથે સુસંગત છે. (d) હૃદયના ટુકડામાં ચક્રીય ગતિ (વાદળી રેખા) અને વેગ (નારંગી ડોટેડ રેખા) ના પ્રતિનિધિ માર્ગો. e ચક્ર સમયનું પ્રમાણ (n = 19 સ્લાઇસ પ્રતિ જૂથ, વિવિધ ડુક્કરમાંથી), સંકોચન સમય (n = 19 સ્લાઇસ પ્રતિ જૂથ, વિવિધ ડુક્કરમાંથી), પેશીઓની ગતિ (n = 25). સ્લાઇસ)/જૂથ), પીક સિસ્ટોલિક વેગ (n = 24(D0), 25(D12) સ્લાઇસ/જૂથ વિવિધ ડુક્કરમાંથી) અને પીક રિલેક્સેશન દર (n=24(D0), 25(D12) સ્લાઇસ/જૂથ વિવિધ ડુક્કરમાંથી). બે-પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીના ટી-ટેસ્ટમાં કોઈપણ પરિમાણમાં કોઈ નોંધપાત્ર તફાવત જોવા મળ્યો નથી. f પ્રતિનિધિ તાણ વિશ્લેષણ (લાલ) અને (વાદળી) વિદ્યુત ઉત્તેજના વિના પેશી વિભાગોના નિશાન, સમાન વિભાગમાંથી પેશી વિભાગોના દસ પ્રાદેશિક વિસ્તારો. નીચેના પેનલ વિવિધ વિભાગોમાંથી દસ વિસ્તારોમાં વિદ્યુત ઉત્તેજના સાથે અને વગર પેશી વિભાગોમાં તાણમાં ટકાવારી તફાવતનું પ્રમાણ દર્શાવે છે. (n = વિવિધ ડુક્કરમાંથી 8 સ્લાઇસેસ/જૂથ, બે-પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થી ટી-ટેસ્ટ કરવામાં આવે છે; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = વિવિધ ડુક્કરમાંથી 8 સ્લાઇસેસ/જૂથ, બે-પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થી ટી-ટેસ્ટ કરવામાં આવે છે; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = વિવિધ ડુક્કરમાંથી 8 વિભાગો/જૂથ, બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીનો ટી-ટેસ્ટ; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001，**p < 0.01,*p < 0.05）. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001，**p < 0.01,*p < 0.05）. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 વિભાગો/જૂથ, વિવિધ ડુક્કરમાંથી, બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીનો ટી-ટેસ્ટ; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).ભૂલ બાર સરેરાશ ± માનક વિચલન દર્શાવે છે.
અમારી અગાઉની સ્ટેટિક બાયોમિમેટિક હાર્ટ સ્લાઇસ કલ્ચર સિસ્ટમ [20, 21] માં, અમે વિદ્યુત ઉત્તેજના લાગુ કરીને અને માધ્યમ રચનાને ઑપ્ટિમાઇઝ કરીને 6 દિવસ સુધી હૃદયના ટુકડાઓની કાર્યક્ષમતા, કાર્ય અને માળખાકીય અખંડિતતા જાળવી રાખી હતી. જો કે, 10 દિવસ પછી, આ આંકડાઓમાં તીવ્ર ઘટાડો થયો. અમે અમારી અગાઉની સ્ટેટિક બાયોમિમેટિક કલ્ચર સિસ્ટમ 20, 21 નિયંત્રણ પરિસ્થિતિઓ (Ctrl) માં સંવર્ધિત વિભાગોનો ઉલ્લેખ કરીશું અને અમે અમારા અગાઉ ઑપ્ટિમાઇઝ માધ્યમનો ઉપયોગ એક સાથે યાંત્રિક અને વિદ્યુત ઉત્તેજના (CTCM) હેઠળ MC સ્થિતિઓ અને સંસ્કૃતિ તરીકે કરીશું. જેને કહેવાય છે. પ્રથમ, અમે નક્કી કર્યું કે વિદ્યુત ઉત્તેજના વિના યાંત્રિક ઉત્તેજના 6 દિવસ સુધી પેશીઓની કાર્યક્ષમતા જાળવવા માટે અપૂરતી હતી (પૂરક આકૃતિ 3a,b). રસપ્રદ વાત એ છે કે, STCM નો ઉપયોગ કરીને ફિઝિયો-મિકેનિકલ અને વિદ્યુત ઉત્તેજનાની રજૂઆત સાથે, 12-દિવસના હૃદય વિભાગોની કાર્યક્ષમતા MS પરિસ્થિતિઓ હેઠળ તાજા હૃદય વિભાગો જેવી જ રહી, પરંતુ Ctrl પરિસ્થિતિઓ હેઠળ નહીં, જેમ કે MTT વિશ્લેષણ (આકૃતિ 1) દ્વારા દર્શાવવામાં આવ્યું છે. 3a). આ સૂચવે છે કે કાર્ડિયાક ચક્રનું યાંત્રિક ઉત્તેજના અને સિમ્યુલેશન, આપણી અગાઉની સ્ટેટિક કલ્ચર સિસ્ટમમાં નોંધાયેલા સમય કરતાં બમણા સમય સુધી પેશી વિભાગોને સક્ષમ રાખી શકે છે. જો કે, કાર્ડિયાક ટ્રોપોનિન T અને કોનેક્સિન 43 ના ઇમ્યુનોલેબલિંગ દ્વારા પેશી વિભાગોની માળખાકીય અખંડિતતાના મૂલ્યાંકનમાં દર્શાવવામાં આવ્યું છે કે 12મા દિવસે MC પેશીઓમાં તે જ દિવસે નિયંત્રણો કરતાં કોનેક્સિન 43 અભિવ્યક્તિ નોંધપાત્ર રીતે વધારે હતી. જો કે, સમાન કોનેક્સિન 43 અભિવ્યક્તિ અને Z-ડિસ્ક રચના સંપૂર્ણપણે જાળવવામાં આવી ન હતી (આકૃતિ 3b). અમે પેશી માળખાકીય અખંડિતતા26 ને માપવા માટે કૃત્રિમ બુદ્ધિ (AI) ફ્રેમવર્કનો ઉપયોગ કરીએ છીએ, ટ્રોપોનિન-T અને કોનેક્સિન સ્ટેનિંગ43 પર આધારિત છબી-આધારિત ડીપ લર્નિંગ પાઇપલાઇન સ્થાનિકીકરણની મજબૂતાઈના સંદર્ભમાં હૃદયના ટુકડાઓની માળખાકીય અખંડિતતા અને ફ્લોરોસેન્સને આપમેળે માપવા માટે. આ પદ્ધતિ કન્વોલ્યુશનલ ન્યુરલ નેટવર્ક (CNN) અને ડીપ લર્નિંગ ફ્રેમવર્કનો ઉપયોગ કરે છે જેથી કાર્ડિયાક પેશીઓની માળખાકીય અખંડિતતાને વિશ્વસનીય રીતે પ્રમાણિત કરી શકાય, જેમ કે સંદર્ભમાં વર્ણવેલ છે. 26. સ્ટેટિક કંટ્રોલ વિભાગોની તુલનામાં MC પેશીઓએ દિવસ 0 સાથે સુધારેલ માળખાકીય સમાનતા દર્શાવી. વધુમાં, મેસનના ટ્રાઇક્રોમ સ્ટેનિંગે કલ્ચરના 12મા દિવસે નિયંત્રણની સ્થિતિની તુલનામાં MS પરિસ્થિતિઓમાં ફાઇબ્રોસિસનું પ્રમાણ નોંધપાત્ર રીતે ઓછું જાહેર કર્યું (આકૃતિ 3c). જ્યારે CTCM એ 12મા દિવસે હૃદયના પેશીઓના વિભાગોની કાર્યક્ષમતાને તાજા હૃદયના પેશીઓના સ્તર જેટલી જ વધારી દીધી, તે હૃદયના વિભાગોની માળખાકીય અખંડિતતામાં નોંધપાત્ર સુધારો કરી શક્યું નહીં.
બાર ગ્રાફ 12 દિવસ માટે તાજા હૃદયના ટુકડા (D0) અથવા હૃદયના ટુકડા સંસ્કૃતિના MTT સધ્ધરતાનું પ્રમાણીકરણ દર્શાવે છે, કાં તો સ્ટેટિક કલ્ચર (D12 Ctrl) માં અથવા CTCM (D12 MC) માં (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) વિવિધ ડુક્કરમાંથી સ્લાઇસેસ/જૂથમાં, એક રીતે ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે; ####p < 0.0001 ની સરખામણીમાં D0 અને **p < 0.01 ની સરખામણીમાં D12 Ctrl). બાર ગ્રાફ 12 દિવસ માટે તાજા હૃદયના ટુકડા (D0) અથવા હૃદયના ટુકડા કલ્ચરની MTT સધ્ધરતાનું પ્રમાણીકરણ દર્શાવે છે, કાં તો સ્ટેટિક કલ્ચર (D12 Ctrl) અથવા CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) વિવિધ ડુક્કરમાંથી સ્લાઇસેસ/જૂથમાં, એક રીતે ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે; ####p < 0.0001 D0 ની સરખામણીમાં અને **p < 0.01 D12 Ctrl ની સરખામણીમાં).હિસ્ટોગ્રામ વિવિધ ડુક્કરમાંથી સ્ટેટિક કલ્ચર (D12 કંટ્રોલ) અથવા CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 કંટ્રોલ)), 12 (D12 MC) સેક્શન/ગ્રુપમાં 12 દિવસ માટે MTT ફ્રેશ હાર્ટ સેક્શન (D0) અથવા હાર્ટ સેક્શનના કલ્ચરની સધ્ધરતાનું પ્રમાણ દર્શાવે છે, એક-માર્ગી ANOVA ટેસ્ટ કરવામાં આવે છે;####p < 0,0001 по сравнению с D0 અને **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 ની સરખામણીમાં D0 અને **p < 0.01 ની સરખામણીમાં D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单启曯丕DNOVA相比，####p < 0.0001,与D12 Ctrl 相比,**p <0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，###p < 0.0001，CtrlD12，与p.તાજા હૃદય વિભાગો (D0) અથવા સ્ટેટિક કલ્ચર (D12 નિયંત્રણ) અથવા CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 નિયંત્રણ)), 12 (D12 MC) વિભાગો/જૂથમાં વિવિધ ડુક્કરમાંથી MTT સધ્ધરતાનું પ્રમાણ દર્શાવતો હિસ્ટોગ્રામ, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 ની સરખામણીમાં D0, **p < 0.01 ની સરખામણીમાં D12 Ctrl).b ટ્રોપોનિન-ટી (લીલો), કોનેક્સિન 43 (લાલ) અને DAPI (વાદળી) તાજા અલગ કરાયેલા હૃદય વિભાગો (D0) અથવા સ્થિર પરિસ્થિતિઓ (Ctrl) અથવા CTCM સ્થિતિઓ (MC) હેઠળ 12 દિવસ માટે કલ્ચર કરાયેલા હૃદય વિભાગોમાં પ્રતિનિધિ ઇમ્યુનોફ્લોરોસેન્સ છબીઓ (ખાલી સ્કેલ = 100 µm). હૃદયની પેશીઓની માળખાકીય અખંડિતતાનું કૃત્રિમ બુદ્ધિમત્તાનું પ્રમાણીકરણ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) અલગ-અલગ ડુક્કરમાંથી દરેક સ્લાઇસેસ/જૂથ, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે; ####p < 0.0001 ની સરખામણીમાં D0 અને ****p < 0.0001 ની સરખામણીમાં D12 Ctrl). હૃદયની પેશીઓની માળખાકીય અખંડિતતાનું કૃત્રિમ બુદ્ધિમત્તાનું પ્રમાણીકરણ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) વિવિધ ડુક્કરમાંથી દરેક સ્લાઇસેસ/જૂથ, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે; ####p < 0.0001 ની સરખામણીમાં D0 અને ****p < 0.0001 ની સરખામણીમાં D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности селостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5/повDMC (5/5) разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 અને ****p < 0,0001 по сравнению). કૃત્રિમ બુદ્ધિ દ્વારા કાર્ડિયાક પેશીઓની માળખાકીય અખંડિતતાનું પ્રમાણીકરણ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) વિભાગો/જૂથો વિવિધ ડુક્કરમાંથી, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું; ####p < 0.0001 વિરુદ્ધ D0 અને ****p < 0.0001 ની સરખામણીમાં D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) સ્લાઇસેસ/ગ્રુપ દરેક અલગ-અલગ ડુક્કર, વન-વે ANOVA ટેસ્ટ.相比,****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) સ્લાઇસેસ/ગ્રુપ દરેક અલગ-અલગ પિગ, વન-વે ANOVA ટેસ્ટ.与D0相比，****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl/D05), каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 વિ. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению сrl12). કાર્ડિયાક પેશીઓની માળખાકીય અખંડિતતા માપવા માટે કૃત્રિમ બુદ્ધિ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) વિભાગો/જૂથ દરેક અલગ અલગ ડુક્કર, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ; ####p<0.0001 vs .D0 સરખામણી માટે ****p < 0.0001 D12 Ctrl ની સરખામણીમાં). c મેસનના ટ્રાઇક્રોમ સ્ટેનથી રંગાયેલા હૃદયના ટુકડા માટે પ્રતિનિધિ છબીઓ (ડાબે) અને જથ્થાત્મકતા (જમણે) (સ્કેલ બેર = 500 µm) (n = અલગ અલગ ડુક્કરમાંથી 10 ટુકડા/જૂથ, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે; ####p < 0.0001 ની સરખામણીમાં D0 અને ***p < 0.001 ની સરખામણીમાં D12 Ctrl). c મેસનના ટ્રાઇક્રોમ સ્ટેનથી રંગાયેલા હૃદયના ટુકડા માટે પ્રતિનિધિ છબીઓ (ડાબે) અને જથ્થાત્મકતા (જમણે) (સ્કેલ બેર = 500 µm) (n = વિવિધ ડુક્કરમાંથી 10 ટુકડા/જૂથ, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે; #### p < 0.0001 ની સરખામણીમાં D0 અને ***p < 0.001 ની સરખામણીમાં D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красибаслева трихромным покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,000p *** D 0,0001 0,001 પો сравнению с D12 Ctrl). c મેસનના ટ્રાઇક્રોમ સ્ટેન (અનકોટેડ સ્કેલ = 500 µm) થી રંગાયેલા હૃદયના વિભાગોની પ્રતિનિધિ છબીઓ (ડાબે) અને જથ્થાત્મકતા (જમણે) (n = વિવિધ ડુક્કરમાંથી 10 વિભાગો/જૂથ, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું; #### p < 0 .0001 D0 ની સરખામણીમાં અને ***p < 0.001 D12 Ctrl ની સરખામણીમાં). c 用મેસન 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺則0µm0µm0µ个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p0 0.0.相比). સી 用 મેસન 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度度度带裸度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单勐 单勐 单勐 单勐 અનોવા 0.0001 与D0 相比,***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным (слева) 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного однофакторного дисперсионного ####### 0,0001 પો сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c મેસનના ટ્રાઇક્રોમ સ્ટેન (ખાલી = 500 µm) થી રંગાયેલા હૃદય વિભાગોની પ્રતિનિધિ છબીઓ (ડાબે) અને જથ્થાત્મકતા (જમણે) (n = 10 વિભાગો/જૂથ, દરેક અલગ ડુક્કરમાંથી, ભિન્નતાના એક-માર્ગી વિશ્લેષણ દ્વારા પરીક્ષણ કરાયેલ;### # p < 0.0001 ની સરખામણીમાં D0, ***p < 0.001 ની સરખામણીમાં D12 Ctrl).ભૂલ બાર સરેરાશ ± માનક વિચલન દર્શાવે છે.
અમે અનુમાન લગાવ્યું હતું કે કલ્ચર માધ્યમમાં નાના અણુઓ ઉમેરીને, કાર્ડિયોમાયોસાઇટ અખંડિતતામાં સુધારો થઈ શકે છે અને CTCM કલ્ચર દરમિયાન ફાઇબ્રોસિસ વિકાસ ઘટાડી શકાય છે. તેથી અમે અમારા સ્ટેટિક કંટ્રોલ કલ્ચરનો ઉપયોગ કરીને નાના અણુઓ માટે સ્ક્રીનીંગ કર્યું 20,21 કારણ કે તેમાં ઓછી સંખ્યામાં ગૂંચવણભર્યા પરિબળો હતા. આ સ્ક્રીન માટે ડેક્સામેથાસોન (ડેક્સ), ટ્રાઇઓડોથાયરોનિન (T3), અને SB431542 (SB) પસંદ કરવામાં આવ્યા હતા. આ નાના અણુઓનો ઉપયોગ અગાઉ hiPSC-CM કલ્ચરમાં સાર્કોમેર લંબાઈ, T-ટ્યુબ્યુલ્સ અને વહન વેગ વધારીને કાર્ડિયોમાયોસાઇટ્સની પરિપક્વતાને પ્રેરિત કરવા માટે કરવામાં આવ્યો છે. વધુમાં, ડેક્સ (એક ગ્લુકોકોર્ટિકોઇડ) અને SB બંને બળતરાને દબાવવા માટે જાણીતા છે 29,30. તેથી, અમે પરીક્ષણ કર્યું કે શું આ નાના અણુઓના એક અથવા મિશ્રણનો સમાવેશ હૃદય વિભાગોની માળખાકીય અખંડિતતામાં સુધારો કરશે. પ્રારંભિક સ્ક્રીનીંગ માટે, દરેક સંયોજનનો ડોઝ સેલ કલ્ચર મોડેલોમાં સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાતી સાંદ્રતા (1 μM Dex27, 100 nM T327, અને 2.5 μM SB31) ના આધારે પસંદ કરવામાં આવ્યો હતો. 12 દિવસના કલ્ચર પછી, T3 અને Dex ના મિશ્રણથી શ્રેષ્ઠ કાર્ડિયોમાયોસાઇટ માળખાકીય અખંડિતતા અને ન્યૂનતમ તંતુમય પુનઃનિર્માણ થયું (પૂરક આકૃતિઓ 4 અને 5). વધુમાં, T3 અને Dex ની આ સાંદ્રતાઓને બમણી અથવા બમણી કરવાના ઉપયોગથી સામાન્ય સાંદ્રતાની તુલનામાં હાનિકારક અસરો ઉત્પન્ન થાય છે (પૂરક આકૃતિ 6a,b).
પ્રારંભિક સ્ક્રીનીંગ પછી, અમે 4 કલ્ચર પરિસ્થિતિઓની સીધી સરખામણી કરી (આકૃતિ 4a): Ctrl: અમારા ઑપ્ટિમાઇઝ્ડ માધ્યમનો ઉપયોગ કરીને અમારા અગાઉ વર્ણવેલ સ્ટેટિક કલ્ચરમાં હૃદય વિભાગો કલ્ચર કરવામાં આવ્યા; 20.21 TD: T3 અને Ctrl બુધવારે ઉમેરાયેલ Dex; MC: અમારા અગાઉ ઑપ્ટિમાઇઝ્ડ માધ્યમનો ઉપયોગ કરીને CTCM માં હૃદય વિભાગો કલ્ચર કરવામાં આવ્યા; અને MT: માધ્યમમાં T3 અને Dex ઉમેરવા સાથે CTCM. ખેતીના 12 દિવસ પછી, MS અને MT પેશીઓની સધ્ધરતા MTT પરીક્ષણ દ્વારા મૂલ્યાંકન કરાયેલ તાજા પેશીઓ જેટલી જ રહી (આકૃતિ 4b). રસપ્રદ વાત એ છે કે, ટ્રાન્સવેલ કલ્ચર (TD) માં T3 અને Dex ઉમેરવાથી Ctrl પરિસ્થિતિઓની તુલનામાં સધ્ધરતામાં નોંધપાત્ર સુધારો થયો નથી, જે હૃદય વિભાગોની સધ્ધરતા જાળવવામાં યાંત્રિક ઉત્તેજનાની મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા દર્શાવે છે.
12 દિવસ માટે માધ્યમ પર યાંત્રિક ઉત્તેજના અને T3/Dex પૂરકની અસરોનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે ઉપયોગમાં લેવાતી ચાર સંસ્કૃતિ પરિસ્થિતિઓ દર્શાવતો પ્રાયોગિક ડિઝાઇન આકૃતિ. b બાર ગ્રાફ તાજા હૃદયના ટુકડા (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD અને D12 MT), 12 (D12 MC) ટુકડા/જૂથની સરખામણીમાં તમામ 4 સંસ્કૃતિ પરિસ્થિતિઓ (Ctrl, TD, MC, અને MT) માં સંસ્કૃતિ પછી 12 દિવસની સધ્ધરતાનું પ્રમાણીકરણ દર્શાવે છે, વિવિધ ડુક્કરના, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 D0 ની સરખામણીમાં અને **p < 0.01 D12 Ctrl ની સરખામણીમાં). b બાર ગ્રાફ તાજા હૃદયના ટુકડા (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD અને D12 MT), 12 (D12 MC) ટુકડા/જૂથની સરખામણીમાં તમામ 4 સંસ્કૃતિ પરિસ્થિતિઓ (Ctrl, TD, MC, અને MT) માં સંસ્કૃતિ પછી 12 દિવસની સધ્ધરતાનું પ્રમાણીકરણ દર્શાવે છે, વિવિધ ડુક્કરના, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 D0 ની સરખામણીમાં અને **p < 0.01 D12 ctrl ની સરખામણીમાં). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 усеховирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD અને D12 MT), 12 (D12 MC) разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 અને **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b બાર ગ્રાફ તાજા હૃદય વિભાગો (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, અને D12 MT), 12 (D12 MC) વિભાગો/જૂથ, વિવિધ ડુક્કરમાંથી, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 વિરુદ્ધ D0 અને **p < 0.01 D12 Ctrl ની તુલનામાં) ની સરખામણીમાં તમામ 4 સંસ્કૃતિ પરિસ્થિતિઓ (નિયંત્રણ, TD, MC, અને MT) માં સંસ્કૃતિ પછી 12 દિવસ પછી સધ્ધરતાનું પ્રમાણ દર્શાવે છે. b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片、D0) (n = 18 (D1r1D0) (D0) TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p <0p <0.0** 0.01 与D12控制).બી ૪ ૧૨ (ડી૧૨ એમસી) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (કોન્ટ્રોલ, TD, MC и MT) 15 (D12 Ctrl, D12 TD અને D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001,0001, D0, **p <0,01 по сравнению (કન્ટ્રોલેમ D12 સાથે). b હિસ્ટોગ્રામ, જે તાજા હૃદય વિભાગો (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD અને D12 MT) ની તુલનામાં, વિવિધ પિગ 12 (D12 MC) વિભાગો/જૂથ, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ; ####p<0.0001, ###p<0.001 વિરુદ્ધ D0, **p<0.01 વિરુદ્ધ નિયંત્રણ D12) દર્શાવે છે. c બાર ગ્રાફ તાજા હૃદયના ટુકડા (D0) ની સરખામણીમાં તમામ 4 સંસ્કૃતિ પરિસ્થિતિઓ (Ctrl, TD, MC, અને MT) માં સંસ્કૃતિ પછી 12 દિવસ પછી ગ્લુકોઝ પ્રવાહનું પ્રમાણ દર્શાવે છે (n = વિવિધ ડુક્કરમાંથી 6 સ્લાઇસેસ/જૂથ, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે; ###p < 0.001, D0 ની સરખામણીમાં અને ***p < 0.001 D12 Ctrl ની સરખામણીમાં). c બાર ગ્રાફ તાજા હૃદયના ટુકડા (D0) ની સરખામણીમાં તમામ 4 સંસ્કૃતિ પરિસ્થિતિઓ (Ctrl, TD, MC, અને MT) માં સંસ્કૃતિ પછી 12 દિવસ પછી ગ્લુકોઝ પ્રવાહનું પ્રમાણ દર્શાવે છે (n = વિવિધ ડુક્કરમાંથી 6 સ્લાઇસેસ/જૂથ, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે; ###p < 0.001, D0 ની સરખામણીમાં અને ***p < 0.001 D12 Ctrl ની સરખામણીમાં). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 усех усеховирования (કોન્ટ્રોલ, ટીડી, એમસી અને એમટી) ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 અને ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c હિસ્ટોગ્રામ તાજા હૃદય વિભાગો (D0) ની સરખામણીમાં તમામ 4 સંસ્કૃતિ પરિસ્થિતિઓ (નિયંત્રણ, TD, MC અને MT) હેઠળ ગ્લુકોઝ પ્રવાહનું 12 દિવસ પછીનું પ્રમાણ દર્શાવે છે (n = વિવિધ ડુક્કરમાંથી 6 વિભાગો/જૂથ, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું; ###p < 0.001 ની સરખામણીમાં D0 અને ***p < 0.001 ની સરખામણીમાં D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比养切片(D0)天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p <0.001，.0p <0.与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 心脏 切片 切片培养 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 , , , , , , , ， ， 猪 猪单单吡 VA测试；###p <0.001，与D0 相比,***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всеховивирования для всехественную (કોન્ટ્રોલ, ટીડી, એમસી અને એમટી) тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c હિસ્ટોગ્રામ, જે તાજા હૃદય વિભાગો (D0) (n = 6 વિભાગો/જૂથ, વિવિધ ડુક્કરમાંથી, એકપક્ષીય) ની સરખામણીમાં, બધી 4 સંસ્કૃતિ સ્થિતિઓ (નિયંત્રણ, TD, MC, અને MT) માટે 12 દિવસ પછી ગ્લુકોઝ પ્રવાહનું પ્રમાણ દર્શાવે છે. ANOVA પરીક્ષણો કરવામાં આવ્યા હતા, ###p < 0.001 ની સરખામણીમાં D0, ***p < 0.001 ની સરખામણીમાં D12 (નિયંત્રણ).d દસ પ્રાદેશિક પેશી વિભાગ બિંદુઓ પર તાજા (વાદળી), દિવસ 12 MC (લીલો), અને દિવસ 12 MT (લાલ) પેશીઓના સ્ટ્રેન વિશ્લેષણ પ્લોટ (n = 4 સ્લાઇસેસ/જૂથ, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ; જૂથો વચ્ચે કોઈ નોંધપાત્ર તફાવત નહોતો). e જ્વાળામુખી પ્લોટ 10-12 દિવસ માટે સ્થિર પરિસ્થિતિઓ (Ctrl) અથવા MT પરિસ્થિતિઓ (MT) હેઠળ સંવર્ધિત હૃદય વિભાગોની તુલનામાં તાજા હૃદય વિભાગો (D0) માં વિભેદક રીતે વ્યક્ત જનીનો દર્શાવે છે. f દરેક સંસ્કૃતિ સ્થિતિ હેઠળ સંવર્ધિત હૃદય વિભાગો માટે સાર્કોમેર જનીનોનો હીટમેપ. ભૂલ બાર સરેરાશ ± માનક વિચલન દર્શાવે છે.
ફેટી એસિડ ઓક્સિડેશનથી ગ્લાયકોલિસિસમાં સ્વિચ પર મેટાબોલિક અવલંબન એ કાર્ડિયોમાયોસાઇટ ડિડિફરન્શિએશનનું એક લક્ષણ છે. અપરિપક્વ કાર્ડિયોમાયોસાઇટ્સ મુખ્યત્વે ATP ઉત્પાદન માટે ગ્લુકોઝનો ઉપયોગ કરે છે અને થોડા ક્રિસ્ટા સાથે હાયપોપ્લાસ્ટિક માઇટોકોન્ડ્રિયા ધરાવે છે5,32. ગ્લુકોઝ ઉપયોગ વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે MC અને MT પરિસ્થિતિઓમાં, ગ્લુકોઝનો ઉપયોગ દિવસ 0 પેશીઓમાં સમાન હતો (આકૃતિ 4c). જોકે, Ctrl નમૂનાઓએ તાજા પેશીઓની તુલનામાં ગ્લુકોઝ ઉપયોગમાં નોંધપાત્ર વધારો દર્શાવ્યો હતો. આ સૂચવે છે કે CTCM અને T3/Dex નું સંયોજન પેશીઓની સધ્ધરતા વધારે છે અને 12-દિવસના સંવર્ધિત હૃદય વિભાગોના મેટાબોલિક ફેનોટાઇપને સાચવે છે. વધુમાં, સ્ટ્રેન વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે MT અને MS પરિસ્થિતિઓમાં 12 દિવસ સુધી તાજા હૃદય પેશીઓમાં સ્ટ્રેન સ્તર સમાન રહ્યું (આકૃતિ 4d).
કાર્ડિયાક સ્લાઇસ ટીશ્યુના વૈશ્વિક ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ લેન્ડસ્કેપ પર CTCM અને T3/Dex ની એકંદર અસરનું વિશ્લેષણ કરવા માટે, અમે ચારેય અલગ અલગ કલ્ચર પરિસ્થિતિઓમાંથી કાર્ડિયાક સ્લાઇસ પર RNAseq કર્યું (પૂરક ડેટા 1). રસપ્રદ વાત એ છે કે, MT વિભાગોએ તાજા હૃદય પેશીઓ સાથે ઉચ્ચ ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ સમાનતા દર્શાવી, જેમાં 13,642 જનીનોમાંથી ફક્ત 16 જનીનો અલગ રીતે વ્યક્ત થયા. જો કે, જેમ આપણે પહેલા બતાવ્યું હતું, Ctrl સ્લાઇસે 10-12 દિવસના કલ્ચર પછી 1229 અલગ રીતે વ્યક્ત થયેલા જનીનો દર્શાવ્યા (આકૃતિ 4e). આ ડેટા હૃદય અને ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ જનીનોના qRT-PCR દ્વારા પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી (પૂરક આકૃતિ 7a-c). રસપ્રદ વાત એ છે કે, Ctrl વિભાગોએ કાર્ડિયાક અને કોષ ચક્ર જનીનોનું ડાઉનરેગ્યુલેશન અને બળતરા જનીન કાર્યક્રમોનું સક્રિયકરણ દર્શાવ્યું. આ ડેટા સૂચવે છે કે ડિડિફરન્શિએશન, જે સામાન્ય રીતે લાંબા ગાળાના કલ્ચરિંગ પછી થાય છે, તે MT પરિસ્થિતિઓ હેઠળ સંપૂર્ણપણે ઓછું થાય છે (પૂરક આકૃતિ 8a,b). સાર્કોમેર જનીનોના કાળજીપૂર્વક અભ્યાસથી જાણવા મળ્યું કે ફક્ત MT પરિસ્થિતિઓમાં જ સાર્કોમેર (આકૃતિ 4f) અને આયન ચેનલ (પૂરક આકૃતિ 9) ને એન્કોડ કરતા જનીનો સાચવવામાં આવે છે, જે તેમને Ctrl, TD અને MC પરિસ્થિતિઓ હેઠળ દમનથી સુરક્ષિત કરે છે. આ ડેટા દર્શાવે છે કે યાંત્રિક અને હ્યુમરલ ઉત્તેજના (T3/Dex) ના સંયોજન સાથે, હાર્ટ સ્લાઇસ ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ 12 દિવસ સંસ્કૃતિમાં રહ્યા પછી તાજા હાર્ટ સ્લાઇસ જેવું જ રહી શકે છે.
આ ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ તારણો એ હકીકત દ્વારા સમર્થિત છે કે હૃદય વિભાગોમાં કાર્ડિયોમાયોસાઇટ્સની માળખાકીય અખંડિતતા MT પરિસ્થિતિઓમાં 12 દિવસ સુધી શ્રેષ્ઠ રીતે સાચવવામાં આવે છે, જેમ કે અકબંધ અને સ્થાનિક કનેક્સિન 43 (આકૃતિ 5a) દ્વારા દર્શાવવામાં આવ્યું છે. વધુમાં, MT પરિસ્થિતિઓમાં હૃદય વિભાગોમાં ફાઇબ્રોસિસ Ctrl ની તુલનામાં નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડો થયો હતો અને તાજા હૃદય વિભાગો (આકૃતિ 5b) ની સમાન હતો. આ ડેટા દર્શાવે છે કે યાંત્રિક ઉત્તેજના અને T3/Dex સારવારનું સંયોજન સંસ્કૃતિમાં હૃદય વિભાગોમાં હૃદયની રચનાને અસરકારક રીતે સાચવે છે.
a ટ્રોપોનિન-ટી (લીલો), કોનેક્સિન 43 (લાલ), અને DAPI (વાદળી) ની પ્રતિનિધિ ઇમ્યુનોફ્લોરોસેન્સ છબીઓ તાજા અલગ કરાયેલા હૃદય વિભાગો (D0) માં અથવા ચારેય હૃદય વિભાગ સંસ્કૃતિ પરિસ્થિતિઓમાં 12 દિવસ માટે કલ્ચર કરવામાં આવી છે (સ્કેલ બાર = 100 µm). હૃદયની પેશીઓની માળખાકીય અખંડિતતા (n = 7 (D0 અને D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC અને D12 MT) ના વિવિધ ડુક્કરના ટુકડા/જૂથનું કૃત્રિમ બુદ્ધિમત્તાનું પ્રમાણીકરણ, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે; ####p < 0.0001 D0 ની સરખામણીમાં અને *p < 0.05, અથવા ****p < 0.0001 D12 Ctrl ની સરખામણીમાં). હૃદયની પેશીઓની માળખાકીય અખંડિતતા (n = 7 (D0 અને D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC અને D12 MT) ના વિવિધ ડુક્કરના ટુકડા/જૂથનું કૃત્રિમ બુદ્ધિમત્તાનું પ્રમાણીકરણ, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે; #### p < 0.0001 D0 ની સરખામણીમાં અને *p < 0.05, અથવા ****p < 0.0001 D12 Ctrl ની સરખામણીમાં). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl12), DMCTD12, DMC22 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p <0p <05,***00, сравнению с D12 Ctrl). વિવિધ ડુક્કરના કૃત્રિમ બુદ્ધિમત્તા (n = 7 (D0 અને D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC અને D12 MT) વિભાગો/જૂથનો ઉપયોગ કરીને હૃદયની પેશીઓની માળખાકીય અખંડિતતાનું પ્રમાણીકરણ, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું; #### p < 0.0001 D0 ની સરખામણીમાં અને *p < 0.05 અથવા ****p < 0.0001 D12 Ctrl ની સરખામણીમાં).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.0001 与D0 和*p <0. 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc ）＄td人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.0001 与D0 和*p <0.05 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ સાથે વિવિધ ડુક્કર (n = 7 (D0 અને D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC અને D12 MT) વિભાગો/જૂથ) માં કૃત્રિમ બુદ્ધિનો ઉપયોગ કરીને કાર્ડિયાક પેશીઓની માળખાકીય અખંડિતતાનું પ્રમાણીકરણ;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 અને *p < 0,05 અથવા ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### D0 ની સરખામણીમાં p < 0.0001 અને D12 Ctrl ની સરખામણીમાં *p < 0.05 અથવા ****p < 0.0001). b મેસનના ટ્રાઇક્રોમ સ્ટેન (સ્કેલ બાર = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, અને D12 MC), વિવિધ ડુક્કરમાંથી 9 (D12 MT) સ્લાઇસેસ/જૂથ સાથે રંગાયેલા હૃદયના ટુકડા માટે પ્રતિનિધિ છબીઓ અને જથ્થાત્મકતા, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે; ####p < 0.0001 D0 ની સરખામણીમાં અને ***p < 0.001, અથવા ****p < 0.0001 D12 Ctrl ની સરખામણીમાં). b મેસનના ટ્રાઇક્રોમ સ્ટેન (સ્કેલ બાર = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, અને D12 MC), વિવિધ ડુક્કરમાંથી 9 (D12 MT) સ્લાઇસેસ/જૂથ સાથે રંગાયેલા હૃદયના ટુકડા માટે પ્રતિનિધિ છબીઓ અને જથ્થાત્મકતા, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે; ####p < 0.0001 D0 ની સરખામણીમાં અને ***p < 0.001, અથવા ****p < 0.0001 D12 Ctrl ની સરખામણીમાં). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (= мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD અને D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторон, выполняется односторон; по сравнению с D0 અને ***p < 0,001 અથવા ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b મેસનના ટ્રાઇક્રોમ સ્ટેન (સ્કેલ બાર = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD અને D12 MC), 9 (D12 MT) વિભાગો/જૂથ વિવિધ ડુક્કરમાંથી, એક-માર્ગી ANOVA કરવામાં આવે છે; ####p < 0.0001 વિરુદ્ધ D0 અને ***p < 0.001 અથવા ****p < 0.0001 વિરુદ્ધ D12 Ctrl). b 用મેસન 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺=500 µm）（n = 10D Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分曠000<##D01<##相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 મેસન 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） = 0 d0m） d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片切片切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p <0.0001* 0.001,或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная =0макней = 05) (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC) 0,001 અથવા ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b મેસનના ટ્રાઇક્રોમ (સ્કેલ બાર = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD અને D12 MC), વિવિધ ડુક્કર/જૂથમાંથી 9 (D12 MT) વિભાગો, એક ANOVA પદ્ધતિ; ####p < 0.0001 ની સરખામણીમાં D0, ***p < 0.001 અથવા ****p < 0.0001 ની સરખામણીમાં D12 Ctrl) થી રંગાયેલા હૃદય વિભાગોની પ્રતિનિધિ છબીઓ અને પરિમાણીકરણ.ભૂલ બાર સરેરાશ ± માનક વિચલન દર્શાવે છે.
છેલ્લે, કાર્ડિયાક ટિશ્યુ સ્ટ્રેચ વધારીને કાર્ડિયાક હાઇપરટ્રોફીની નકલ કરવાની CTCM ની ક્ષમતાનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું. CTCM માં, પીક એર ચેમ્બર પ્રેશર 80 mmHg થી 80 mmHg સુધી વધ્યું. આર્ટ. (સામાન્ય સ્ટ્રેચ) 140 mmHg સુધી આર્ટ. (આકૃતિ 6a). આ સ્ટ્રેચમાં 32% વધારો (આકૃતિ 6b) ને અનુરૂપ છે, જે અગાઉ હાયપરટ્રોફીમાં જોવા મળતી સમાન સાર્કોમેર લંબાઈ પ્રાપ્ત કરવા માટે હૃદયના વિભાગો માટે જરૂરી અનુરૂપ ટકાવારી સ્ટ્રેચ તરીકે દર્શાવવામાં આવ્યું હતું. સંકોચન અને આરામ દરમિયાન કાર્ડિયાક ટિશ્યુનો સ્ટ્રેચ અને વેગ છ દિવસના કલ્ચર (આકૃતિ 6c) દરમિયાન સ્થિર રહ્યો. MT સ્થિતિઓમાંથી કાર્ડિયાક ટિશ્યુ છ દિવસ માટે સામાન્ય સ્ટ્રેચ (MT (સામાન્ય)) અથવા ઓવરસ્ટ્રેચ સ્થિતિઓ (MT (OS)) ને આધિન હતો. કલ્ચરમાં ચાર દિવસ પછી, હાઇપરટ્રોફિક બાયોમાર્કર NT-ProBNP MT (સામાન્ય) સ્થિતિઓ (આકૃતિ 7a) ની તુલનામાં MT (OS) સ્થિતિઓ હેઠળ માધ્યમમાં નોંધપાત્ર રીતે ઉન્નત થયું હતું. વધુમાં, છ દિવસના કલ્ચરિંગ પછી, MT (OS) (આકૃતિ 7b) માં કોષનું કદ MT હૃદયના વિભાગો (સામાન્ય) ની તુલનામાં નોંધપાત્ર રીતે વધ્યું. વધુમાં, ઓવરસ્ટ્રેચ્ડ પેશીઓમાં NFATC4 ન્યુક્લિયર ટ્રાન્સલોકેશન નોંધપાત્ર રીતે વધ્યું (આકૃતિ 7c). આ પરિણામો હાયપરડિસ્ટેન્શન પછી પેથોલોજીકલ રિમોડેલિંગના પ્રગતિશીલ વિકાસને દર્શાવે છે અને એ ખ્યાલને સમર્થન આપે છે કે CTCM ઉપકરણનો ઉપયોગ સ્ટ્રેચ-પ્રેરિત કાર્ડિયાક હાઇપરટ્રોફી સિગ્નલિંગનો અભ્યાસ કરવા માટે પ્લેટફોર્મ તરીકે થઈ શકે છે.
હવાના ચેમ્બર દબાણ, પ્રવાહી ચેમ્બર દબાણ અને પેશીઓની ગતિ માપનના પ્રતિનિધિ નિશાન પુષ્ટિ કરે છે કે ચેમ્બર દબાણ પ્રવાહી ચેમ્બર દબાણમાં ફેરફાર કરે છે, જેના કારણે પેશીઓના ટુકડાની અનુરૂપ ગતિ થાય છે. b સામાન્ય રીતે ખેંચાયેલા (નારંગી) અને વધુ પડતા ખેંચાયેલા (વાદળી) પેશીઓના વિભાગો માટે પ્રતિનિધિ સ્ટ્રેચ ટકાવારી અને ખેંચાણ દર વક્ર. c બાર ગ્રાફ ચક્ર સમય (n = 19 સ્લાઇસ પ્રતિ જૂથ, વિવિધ ડુક્કરમાંથી), સંકોચન સમય (n = 18-19 સ્લાઇસ પ્રતિ જૂથ, વિવિધ ડુક્કરમાંથી), આરામ સમય (n = 19 સ્લાઇસ પ્રતિ જૂથ, વિવિધ ડુક્કરમાંથી), પેશીઓની ગતિનું કંપનવિસ્તાર (n = 14 સ્લાઇસ/જૂથ, વિવિધ ડુક્કરમાંથી), પીક સિસ્ટોલિક વેગ (n = 14 સ્લાઇસ/જૂથ, વિવિધ ડુક્કરમાંથી) અને પીક રિલેક્સેશન દર (n = 14 (D0), 15 (D6) ) વિભાગો/જૂથો) દર્શાવે છે, બે-પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીના ટી-ટેસ્ટે કોઈપણ પરિમાણમાં કોઈ નોંધપાત્ર તફાવત દર્શાવ્યો નથી, જે દર્શાવે છે કે આ પરિમાણો ઓવરવોલ્ટેજ સાથે સંસ્કૃતિના 6 દિવસ દરમિયાન સ્થિર રહ્યા. ભૂલ બાર સરેરાશ ± માનક વિચલન દર્શાવે છે.
MT નોર્મલ સ્ટ્રેચ (નોર્મ) અથવા ઓવરસ્ટ્રેચિંગ (OS) સ્થિતિઓ (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, અને D4 MTOS) સ્લાઇસેસ/જૂથમાંથી વિવિધ ડુક્કરમાંથી કલ્ચર મીડિયામાં NT-ProBNP સાંદ્રતાનું બાર ગ્રાફ ક્વોન્ટિફિકેશન, ટુ-વે ANOVA કરવામાં આવે છે; **p < 0.01 સામાન્ય સ્ટ્રેચની તુલનામાં). MT નોર્મલ સ્ટ્રેચ (નોર્મ) અથવા ઓવરસ્ટ્રેચિંગ (OS) સ્થિતિઓ (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, અને D4 MTOS) સ્લાઇસેસ/જૂથમાંથી વિવિધ ડુક્કરમાંથી કલ્ચર મીડિયામાં NT-ProBNP સાંદ્રતાનું બાર ગ્રાફ પ્રમાણીકરણ, દ્વિ-માર્ગી ANOVA કરવામાં આવે છે; **p < 0.01 સામાન્ય સ્ટ્રેચની તુલનામાં).સામાન્ય MT સ્ટ્રેચ (નોર્મ) અથવા ઓવરસ્ટ્રેચ (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, અને D4).MTOS) સ્લાઇસેસ/જૂથ વિવિધ ડુક્કરમાંથી કલ્ચર માધ્યમમાં NT-ProBNP સાંદ્રતાનો જથ્થાત્મક હિસ્ટોગ્રામ, ભિન્નતાનું બે-પરિબળ વિશ્લેષણ કરવામાં આવે છે;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **સામાન્ય ખેંચાણની સરખામણીમાં p < 0.01). a 在MT 正常拉伸(નોર્મ) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度離坡離4 (D2 MTNorm) 、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比,p < ૦.૦૧). MT નોર્મલ સ્ટ્રેચ (નોર્મ) અથવા ઓવરસ્ટ્રેચ (OS) શરતો (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm猪的切片/组，可以双向方方发发动; **સામાન્ય સ્ટ્રેચિંગ સાથે સરખામણી, p <0.01).હિસ્ટોગ્રામ વિવિધ ડુક્કરમાંથી સામાન્ય MT સ્ટ્રેચ (નોર્મ) અથવા ઓવરસ્ટ્રેચ (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) અને D4 MTOS) સ્લાઇસેસ/જૂથની સ્થિતિમાં કલ્ચર કરાયેલા હૃદયના ટુકડાઓમાં NT-ProBNP સાંદ્રતાનું પરિમાણ, ભિન્નતાનું દ્વિ-માર્ગી વિશ્લેષણ;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **સામાન્ય ખેંચાણની સરખામણીમાં p < 0.01). b ટ્રોપોનિન-ટી અને WGA (ડાબે) થી રંગાયેલા હૃદયના ટુકડાઓ અને કોષ કદ પરિમાણ (જમણે) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) કોષો/જૂથ માટે પ્રતિનિધિ છબીઓ વિવિધ ડુક્કરના 10 અલગ અલગ ટુકડાઓમાંથી, બે-પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થી ટી-ટેસ્ટ કરવામાં આવે છે; ****p < 0.0001 સામાન્ય ખેંચાણની તુલનામાં). b ટ્રોપોનિન-ટી અને WGA (ડાબે) થી રંગાયેલા હૃદયના ટુકડાઓ અને કોષ કદ પરિમાણ (જમણે) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) કોષો/જૂથ માટે પ્રતિનિધિ છબીઓ વિવિધ ડુક્કરના 10 અલગ અલગ ટુકડાઓમાંથી, બે-પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થી ટી-ટેસ્ટ કરવામાં આવે છે; ****p < 0.0001 સામાન્ય ખેંચાણની તુલનામાં). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения (разов сердца) 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой;***Свостовой; 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b હૃદયના ભાગોની પ્રતિનિધિ છબીઓ જેમાં ટ્રોપોનિન-ટી અને AZP (ડાબે) અને કોષ કદ પરિમાણ (જમણે) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) કોષો/જૂથ વિવિધ ડુક્કરના 10 અલગ અલગ વિભાગોમાંથી રંગાયેલા છે, બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીનો ટી-ટેસ્ટ કરવામાં આવ્યો હતો; ****p < 0.0001 સામાન્ય તાણની તુલનામાં). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片的代表性图n3） MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比,****p <0.0001）. b કેલ્કેરીન-ટી અને WGA (ડાબે) અને કોષ કદ (જમણે) થી રંગાયેલા હૃદયના ટુકડાઓની પ્રતિનિધિ છબીઓ (n = 330 (D6 MTOS), 10 અલગ અલગ સ્લાઇસેસમાંથી 369 (D6 MTNorm)) કોષો/વિશિષ્ટતા, સામાન્ય સ્ટ્રેચિંગની તુલનામાં, ****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размева (36) MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента, ***0*p0 нормальным (રસ્તાજનિયમ). b ટ્રોપોનિન-ટી અને AZP (ડાબે) થી રંગાયેલા હૃદયના વિભાગોની પ્રતિનિધિ છબીઓ અને કોષના કદનું પ્રમાણીકરણ (જમણે) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) વિવિધ ડુક્કરના 10 અલગ અલગ વિભાગોમાંથી) કોષો/જૂથ, બે-પૂંછડીવાળા માપદંડ વિદ્યાર્થીનો t; ****p < સામાન્ય તાણની તુલનામાં 0.0001). c દિવસ 0 અને દિવસ 6 MTOS હાર્ટ સ્લાઇસેસ માટે પ્રતિનિધિ છબીઓ, જે ટ્રોપોનિન-T અને NFATC4 માટે ઇમ્યુનોલેબલ કરેલી છે અને NFATC4 ના CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) સ્લાઇસેસ/જૂથના વિવિધ ડુક્કરમાંથી સ્થાનાંતરણનું પ્રમાણીકરણ, બે-પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થી ટી-ટેસ્ટ કરવામાં આવે છે; *p < 0.05). c દિવસ 0 અને દિવસ 6 MTOS હાર્ટ સ્લાઇસેસ માટે પ્રતિનિધિ છબીઓ, જે ટ્રોપોનિન-T અને NFATC4 માટે ઇમ્યુનોલેબલ કરેલી છે અને NFATC4 ના CMs ના ન્યુક્લીમાં સ્થાનાંતરણનું પ્રમાણીકરણ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) સ્લાઇસેસ/જૂથ વિવિધ ડુક્કરમાંથી, બે-પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થી ટી-ટેસ્ટ કરવામાં આવે છે; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т અને NFATC4, и конолина срезов сердца ટ્રાંસ્લોકાસીઆઈ એનએફએટીસી4 યાદરા કેવરનોઝન્ыh ક્લેટોક (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/груптпу от разных свиней , выполняветрийское клеток સ્ટુડેન્ટા; *p < 0,05). c 0 અને 6 દિવસના MTOS પર હૃદય વિભાગો માટે પ્રતિનિધિ છબીઓ, ટ્રોપોનિન-T અને NFATC4 માટે ઇમ્યુનોલેબલ કરેલ, અને ગુફા કોષોના ન્યુક્લિયસમાં NFATC4 સ્થાનાંતરણનું પ્રમાણીકરણ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) સ્લાઇસેસ/જૂથ વિવિધ ડુક્કરમાંથી) બે-પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીનો ટી-ટેસ્ટ કરવામાં આવ્યો; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0) , 3 (D0)进行双尾学生t 检验；*p <0.05). c કેલ્કેનિન-T અને NFATC4 ઇમ્યુનોલેબલિંગ 第0天和第6天MTOS હૃદયના ટુકડા, અને NFATC4 વિવિધ NFATC4 易位至CM સેલ ન્યુક્લિયસની માત્રા 化 (n = 4 (D0) 化 (n = 4 (D0) , 廤/6 MT) ,时间双尾学生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS પર 0 અને 6 દિવસ માટે TRANSLOKACII NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Сть;05). c વિવિધ ડુક્કર (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) સ્લાઇસેસ/જૂથ, બે-પૂંછડીવાળા t-માપદંડ વિદ્યાર્થીઓ; *p < 0.05) માંથી CM ના ન્યુક્લિયસમાં ટ્રોપોનિન-T અને NFATC4 ઇમ્યુનોલેબલિંગ અને NFATC4 ટ્રાન્સલોકેશનના જથ્થા માટે દિવસ 0 અને 6 પર MTOS હૃદયના સ્લાઇસેસની પ્રતિનિધિ છબીઓ.ભૂલ બાર સરેરાશ ± માનક વિચલન દર્શાવે છે.
ટ્રાન્સલેશનલ કાર્ડિયોવેસ્ક્યુલર રિસર્ચ માટે સેલ્યુલર મોડેલ્સની જરૂર પડે છે જે કાર્ડિયાક પર્યાવરણને સચોટ રીતે પ્રજનન કરે છે. આ અભ્યાસમાં, એક CTCM ઉપકરણ વિકસાવવામાં આવ્યું હતું અને તેનું લક્ષણ દર્શાવવામાં આવ્યું હતું જે હૃદયના અલ્ટ્રાથિન વિભાગોને ઉત્તેજીત કરી શકે છે. CTCM સિસ્ટમમાં શારીરિક રીતે સિંક્રનાઇઝ્ડ ઇલેક્ટ્રોમિકેનિકલ ઉત્તેજના અને T3 અને ડેક્સ પ્રવાહી સંવર્ધનનો સમાવેશ થાય છે. જ્યારે પોર્સિન હૃદય વિભાગો આ પરિબળોના સંપર્કમાં આવ્યા હતા, ત્યારે તેમની કાર્યક્ષમતા, માળખાકીય અખંડિતતા, મેટાબોલિક પ્રવૃત્તિ અને ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ અભિવ્યક્તિ 12 દિવસના કલ્ચર પછી તાજા હૃદય પેશીઓ જેવી જ રહી હતી. વધુમાં, કાર્ડિયાક પેશીઓનું વધુ પડતું ખેંચાણ હાયપરએક્સટેન્શનને કારણે હૃદયની હાયપરટ્રોફીનું કારણ બની શકે છે. એકંદરે, આ પરિણામો સામાન્ય કાર્ડિયાક ફેનોટાઇપ જાળવવામાં શારીરિક સંસ્કૃતિ પરિસ્થિતિઓની મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકાને સમર્થન આપે છે અને ડ્રગ સ્ક્રીનીંગ માટે એક પ્લેટફોર્મ પૂરું પાડે છે.
કાર્ડિયોમાયોસાઇટ્સના કાર્ય અને અસ્તિત્વ માટે શ્રેષ્ઠ વાતાવરણ બનાવવામાં ઘણા પરિબળો ફાળો આપે છે. આ પરિબળોમાંથી સૌથી સ્પષ્ટ પરિબળો (1) આંતરકોષીય ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ, (2) ઇલેક્ટ્રોમિકેનિકલ ઉત્તેજના, (3) હ્યુમરલ પરિબળો અને (4) મેટાબોલિક સબસ્ટ્રેટ્સ સાથે સંબંધિત છે. શારીરિક કોષ-થી-કોષ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ માટે બાહ્યકોષીય મેટ્રિક્સ દ્વારા સમર્થિત બહુવિધ કોષ પ્રકારના જટિલ ત્રિ-પરિમાણીય નેટવર્કની જરૂર પડે છે. આવા જટિલ કોષીય ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ વ્યક્તિગત કોષ પ્રકારોના સહ-સંસ્કૃતિ દ્વારા ઇન વિટ્રોમાં પુનઃનિર્માણ કરવા મુશ્કેલ છે, પરંતુ હૃદય વિભાગોની ઓર્ગેનોટાઇપિક પ્રકૃતિનો ઉપયોગ કરીને સરળતાથી પ્રાપ્ત કરી શકાય છે.
કાર્ડિયાક ફેનોટાઇપ 33,34,35 જાળવવા માટે કાર્ડિયોમાયોસાઇટ્સનું યાંત્રિક ખેંચાણ અને વિદ્યુત ઉત્તેજના મહત્વપૂર્ણ છે. જ્યારે hiPSC-CM કન્ડીશનીંગ અને પરિપક્વતા માટે યાંત્રિક ઉત્તેજનાનો વ્યાપકપણે ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો છે, ત્યારે તાજેતરમાં ઘણા ભવ્ય અભ્યાસોએ યુનિએક્સિયલ લોડિંગનો ઉપયોગ કરીને કલ્ચરમાં હૃદયના ટુકડાઓનું યાંત્રિક ઉત્તેજના કરવાનો પ્રયાસ કર્યો છે. આ અભ્યાસો દર્શાવે છે કે 2D યુનિએક્સિયલ યાંત્રિક લોડિંગ કલ્ચર દરમિયાન હૃદયના ફેનોટાઇપ પર હકારાત્મક અસર કરે છે. આ અભ્યાસોમાં, હૃદયના ભાગો કાં તો આઇસોમેટ્રિક ટેન્સાઇલ ફોર્સ17, રેખીય ઓક્સોટોનિક લોડિંગ18 થી લોડ કરવામાં આવ્યા હતા, અથવા ફોર્સ ટ્રાન્સડ્યુસર ફીડબેક અને ટેન્શન ડ્રાઇવ્સનો ઉપયોગ કરીને કાર્ડિયાક ચક્ર ફરીથી બનાવવામાં આવ્યું હતું. જો કે, આ પદ્ધતિઓ પર્યાવરણીય ઑપ્ટિમાઇઝેશન વિના યુનિએક્સિયલ ટીશ્યુ સ્ટ્રેચનો ઉપયોગ કરે છે, જેના પરિણામે ઘણા કાર્ડિયાક જનીનો દબાય છે અથવા અસામાન્ય સ્ટ્રેચ પ્રતિભાવો સાથે સંકળાયેલ જનીનોનું વધુ પડતું અભિવ્યક્તિ થાય છે. અહીં વર્ણવેલ CTCM 3D ઇલેક્ટ્રોમિકેનિકલ ઉત્તેજના પ્રદાન કરે છે જે ચક્ર સમય અને શારીરિક ખેંચાણ (25% સ્ટ્રેચ, 40% સિસ્ટોલ, 60% ડાયસ્ટોલ અને 72 ધબકારા પ્રતિ મિનિટ) ના સંદર્ભમાં કુદરતી કાર્ડિયાક ચક્રનું અનુકરણ કરે છે. જોકે આ ત્રિ-પરિમાણીય યાંત્રિક ઉત્તેજના એકલા પેશીઓની અખંડિતતા જાળવવા માટે પૂરતી નથી, ટી3/ડેક્સનો ઉપયોગ કરીને હ્યુમરલ અને યાંત્રિક ઉત્તેજનાનું મિશ્રણ પેશીઓની સધ્ધરતા, કાર્ય અને અખંડિતતા પર્યાપ્ત રીતે જાળવવા માટે જરૂરી છે.
પુખ્ત વયના હૃદયના ફેનોટાઇપને મોડ્યુલેટ કરવામાં રમૂજી પરિબળો મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવે છે. HiPS-CM અભ્યાસોમાં આ વાત પર પ્રકાશ પાડવામાં આવ્યો હતો જેમાં કોષ પરિપક્વતાને વેગ આપવા માટે T3 અને Dex ને કલ્ચર મીડિયામાં ઉમેરવામાં આવ્યા હતા. T3 કોષ પટલમાં એમિનો એસિડ, શર્કરા અને કેલ્શિયમના પરિવહનને પ્રભાવિત કરી શકે છે36. વધુમાં, T3 MHC-α અભિવ્યક્તિ અને MHC-β ડાઉનરેગ્યુલેશનને પ્રોત્સાહન આપે છે, જે ગર્ભ CM માં ધીમા ટ્વિચ માયોફિબ્રિલ્સની તુલનામાં પરિપક્વ કાર્ડિયોમાયોસાઇટ્સમાં ઝડપી ટ્વિચ માયોફિબ્રિલ્સની રચનાને પ્રોત્સાહન આપે છે. હાઇપોથાઇરોઇડ દર્દીઓમાં T3 ની ઉણપ માયોફિબ્રિલર બેન્ડના નુકશાન અને સ્વર વિકાસના દરમાં ઘટાડો તરફ દોરી જાય છે37. ડેક્સ ગ્લુકોકોર્ટિકોઇડ રીસેપ્ટર્સ પર કાર્ય કરે છે અને અલગ પરફ્યુઝ્ડ હૃદયમાં મ્યોકાર્ડિયલ સંકોચનક્ષમતામાં વધારો કરે છે તે દર્શાવવામાં આવ્યું છે; 38 આ સુધારો કેલ્શિયમ ડિપોઝિટ-ડ્રાઇવ એન્ટ્રી (SOCE) 39,40 પર અસર સાથે સંબંધિત હોવાનું માનવામાં આવે છે. વધુમાં, ડેક્સ તેના રીસેપ્ટર્સ સાથે જોડાય છે, જેના કારણે વ્યાપક ઇન્ટ્રાસેલ્યુલર પ્રતિભાવ થાય છે જે રોગપ્રતિકારક કાર્ય અને બળતરાને દબાવી દે છે30.
અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે ભૌતિક યાંત્રિક ઉત્તેજના (MS) એ Ctrl ની તુલનામાં એકંદર કલ્ચર પ્રદર્શનમાં સુધારો કર્યો, પરંતુ 12 દિવસ સુધી કલ્ચરમાં કાર્યક્ષમતા, માળખાકીય અખંડિતતા અને કાર્ડિયાક અભિવ્યક્તિ જાળવવામાં નિષ્ફળ ગયા. Ctrl ની તુલનામાં, CTCM (MT) કલ્ચરમાં T3 અને Dex ઉમેરવાથી કાર્યક્ષમતામાં સુધારો થયો અને 12 દિવસ સુધી તાજા હૃદયના પેશીઓ સાથે સમાન ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રોફાઇલ્સ, માળખાકીય અખંડિતતા અને મેટાબોલિક પ્રવૃત્તિ જાળવી રાખી. વધુમાં, પેશીઓના ખેંચાણની ડિગ્રીને નિયંત્રિત કરીને, STCM નો ઉપયોગ કરીને હાઇપરએક્સટેન્શન-પ્રેરિત કાર્ડિયાક હાઇપરટ્રોફી મોડેલ બનાવવામાં આવ્યું હતું, જે STCM સિસ્ટમની વૈવિધ્યતાને દર્શાવે છે. એ નોંધવું જોઈએ કે કાર્ડિયાક રિમોડેલિંગ અને ફાઇબ્રોસિસમાં સામાન્ય રીતે અકબંધ અવયવોનો સમાવેશ થાય છે જેમના પરિભ્રમણ કોષો યોગ્ય સાયટોકાઇન્સ તેમજ ફેગોસાયટોસિસ અને અન્ય રિમોડેલિંગ પરિબળો પ્રદાન કરી શકે છે, હૃદયના ભાગો હજુ પણ તાણ અને આઘાતના પ્રતિભાવમાં ફાઇબ્રોટિક પ્રક્રિયાની નકલ કરી શકે છે. માયોફિબ્રોબ્લાસ્ટ્સમાં. આનું અગાઉ આ કાર્ડિયાક સ્લાઇસ મોડેલમાં મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું છે. એ નોંધવું જોઈએ કે CTCM પરિમાણોને ટાકીકાર્ડિયા, બ્રેડીકાર્ડિયા અને યાંત્રિક પરિભ્રમણ સપોર્ટ (યાંત્રિક અનલોડ હૃદય) જેવી ઘણી પરિસ્થિતિઓનું અનુકરણ કરવા માટે દબાણ/વિદ્યુત કંપનવિસ્તાર અને આવર્તન બદલીને મોડ્યુલેટ કરી શકાય છે. આ સિસ્ટમને દવા પરીક્ષણ માટે મધ્યમ થ્રુપુટ બનાવે છે. અતિશય શ્રમ-પ્રેરિત કાર્ડિયાક હાઇપરટ્રોફીનું મોડેલ બનાવવાની CTCM ની ક્ષમતા વ્યક્તિગત ઉપચાર માટે આ સિસ્ટમનું પરીક્ષણ કરવાનો માર્ગ મોકળો કરે છે. નિષ્કર્ષમાં, વર્તમાન અભ્યાસ દર્શાવે છે કે કાર્ડિયાક ટીશ્યુ વિભાગોના કલ્ચરને જાળવવા માટે યાંત્રિક ખેંચાણ અને હ્યુમરલ ઉત્તેજના મહત્વપૂર્ણ છે.
અહીં રજૂ કરાયેલા ડેટા સૂચવે છે કે CTCM એ અખંડ મ્યોકાર્ડિયમનું મોડેલિંગ કરવા માટે ખૂબ જ આશાસ્પદ પ્લેટફોર્મ છે, આ કલ્ચર પદ્ધતિમાં કેટલીક મર્યાદાઓ છે. CTCM કલ્ચરની મુખ્ય મર્યાદા એ છે કે તે સ્લાઇસેસ પર સતત ગતિશીલ યાંત્રિક તાણ લાદે છે, જે દરેક ચક્ર દરમિયાન કાર્ડિયાક સ્લાઇસ સંકોચનને સક્રિય રીતે મોનિટર કરવાની ક્ષમતાને બાકાત રાખે છે. વધુમાં, કાર્ડિયાક વિભાગોના નાના કદ (7 મીમી) ને કારણે, પરંપરાગત ફોર્સ સેન્સરનો ઉપયોગ કરીને કલ્ચર સિસ્ટમ્સની બહાર સિસ્ટોલિક કાર્યનું મૂલ્યાંકન કરવાની ક્ષમતા મર્યાદિત છે. વર્તમાન હસ્તપ્રતમાં, અમે સંકોચન કાર્યના સૂચક તરીકે ઓપ્ટિકલ વોલ્ટેજનું મૂલ્યાંકન કરીને આ મર્યાદાને આંશિક રીતે દૂર કરીએ છીએ. જો કે, આ મર્યાદાને વધુ કાર્યની જરૂર પડશે અને ભવિષ્યમાં કેલ્શિયમ અને વોલ્ટેજ-સંવેદનશીલ રંગોનો ઉપયોગ કરીને ઓપ્ટિકલ મેપિંગ જેવી સંસ્કૃતિમાં હૃદયના સ્લાઇસના કાર્યના ઓપ્ટિકલ મોનિટરિંગ માટેની પદ્ધતિઓ રજૂ કરીને તેને સંબોધિત કરી શકાય છે. CTCM ની બીજી મર્યાદા એ છે કે કાર્યકારી મોડેલ શારીરિક તાણ (પ્રીલોડ અને આફ્ટરલોડ) ને હેરફેર કરતું નથી. CTCM માં, ખૂબ મોટા પેશીઓમાં ડાયસ્ટોલ (સંપૂર્ણ ખેંચાણ) અને સિસ્ટોલ (વિદ્યુત ઉત્તેજના દરમિયાન સંકોચનની લંબાઈ) માં 25% શારીરિક ખેંચાણનું પુનઃઉત્પાદન કરવા માટે વિરુદ્ધ દિશામાં દબાણ પ્રેરિત કરવામાં આવ્યું હતું. ભવિષ્યમાં CTCM ડિઝાઇનમાં બંને બાજુથી હૃદયની પેશીઓ પર પૂરતું દબાણ કરીને અને હૃદયના ચેમ્બરમાં થતા ચોક્કસ દબાણ-વોલ્યુમ સંબંધો લાગુ કરીને આ મર્યાદા દૂર કરવી જોઈએ.
આ હસ્તપ્રતમાં નોંધાયેલ ઓવરસ્ટ્રેચ-પ્રેરિત રિમોડેલિંગ હાયપરટ્રોફિક હાઇપરસ્ટ્રેચ સિગ્નલોની નકલ કરવા સુધી મર્યાદિત છે. આમ, આ મોડેલ હ્યુમરલ અથવા ન્યુરલ પરિબળો (જે આ સિસ્ટમમાં અસ્તિત્વમાં નથી) ની જરૂરિયાત વિના સ્ટ્રેચ-પ્રેરિત હાઇપરટ્રોફિક સિગ્નલિંગના અભ્યાસમાં મદદ કરી શકે છે. CTCM ની બહુવિધતા વધારવા માટે વધુ અભ્યાસની જરૂર છે, ઉદાહરણ તરીકે, રોગપ્રતિકારક કોષો સાથે સહ-સંવર્ધન, પરિભ્રમણ કરતા પ્લાઝ્મા હ્યુમરલ પરિબળો, અને ન્યુરોનલ કોષો સાથે સહ-સંવર્ધન કરતી વખતે ઇનર્વેશન CTCM સાથે રોગ મોડેલિંગની શક્યતાઓમાં સુધારો કરશે.
આ અભ્યાસમાં તેર ડુક્કરનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. બધી પ્રાણી પ્રક્રિયાઓ સંસ્થાકીય માર્ગદર્શિકા અનુસાર કરવામાં આવી હતી અને લુઇસવિલે યુનિવર્સિટીના સંસ્થાકીય પ્રાણી સંભાળ અને ઉપયોગ સમિતિ દ્વારા મંજૂર કરવામાં આવી હતી. મહાધમની કમાનને ક્લેમ્પ કરવામાં આવી હતી અને હૃદયને 1 લિટર જંતુરહિત કાર્ડિયોપ્લેજિયા (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL હેપરિન, pH 7.4 સુધી) થી પરફ્યુઝ કરવામાં આવ્યું હતું; હૃદયને બરફ પર પ્રયોગશાળામાં લઈ જવામાં આવે ત્યાં સુધી બરફ-ઠંડા કાર્ડિયોપ્લેજિક દ્રાવણમાં સાચવવામાં આવ્યું હતું, જે સામાન્ય રીતે <10 મિનિટ હોય છે. હૃદયને બરફ પર પ્રયોગશાળામાં લઈ જવામાં આવે ત્યાં સુધી બરફ-ઠંડા કાર્ડિયોપ્લેજિક દ્રાવણમાં સાચવવામાં આવ્યું હતું, જે સામાન્ય રીતે <10 મિનિટ હોય છે. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. હૃદયને બરફ પર પ્રયોગશાળામાં પરિવહન ન થાય ત્યાં સુધી બરફ-ઠંડા કાર્ડિયોપ્લેજિક દ્રાવણમાં સંગ્રહિત કરવામાં આવતું હતું, જેમાં સામાન્ય રીતે <10 મિનિટ લાગે છે.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室,通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室,通常<10分钟. Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. હૃદયને બરફ પર પ્રયોગશાળામાં લઈ જવામાં ન આવે ત્યાં સુધી બરફ પર કાર્ડિયોપ્લેજિયા પર રાખો, સામાન્ય રીતે 10 મિનિટથી ઓછી ઉંમરના.
CTCM ઉપકરણ સોલિડવર્ક્સ કોમ્પ્યુટર-એઇડેડ ડિઝાઇન (CAD) સોફ્ટવેરમાં વિકસાવવામાં આવ્યું હતું. કલ્ચર ચેમ્બર, ડિવાઇડર અને એર ચેમ્બર CNC ક્લિયર એક્રેલિક પ્લાસ્ટિકથી બનેલા છે. 7mm વ્યાસની બેક-અપ રિંગ મધ્યમાં હાઇ ડેન્સિટી પોલિઇથિલિન (HDPE) થી બનેલી છે અને તેમાં ઓ-રિંગ ગ્રુવ છે જે સિલિકોન ઓ-રિંગને સમાવવા માટે વપરાય છે જે નીચે મીડિયાને સીલ કરે છે. એક પાતળી સિલિકા મેમ્બ્રેન કલ્ચર ચેમ્બરને સેપરેશન પ્લેટથી અલગ કરે છે. સિલિકોન મેમ્બ્રેન 0.02″ જાડી સિલિકોન શીટમાંથી લેસર કટ છે અને તેની કઠિનતા 35A છે. નીચે અને ઉપરના સિલિકોન ગાસ્કેટ 1/16″ જાડી સિલિકોન શીટમાંથી લેસર કટ છે અને તેની કઠિનતા 50A છે. બ્લોકને બાંધવા અને હવાચુસ્ત સીલ બનાવવા માટે 316L સ્ટેનલેસ સ્ટીલ સ્ક્રૂ અને વિંગ નટ્સનો ઉપયોગ થાય છે.
એક સમર્પિત પ્રિન્ટેડ સર્કિટ બોર્ડ (PCB) ને C-PACE-EM સિસ્ટમ સાથે સંકલિત કરવા માટે ડિઝાઇન કરવામાં આવ્યું છે. PCB પરના સ્વિસ મશીન કનેક્ટર સોકેટ્સ ચાંદીના પ્લેટેડ કોપર વાયર અને ઇલેક્ટ્રોડમાં સ્ક્રૂ કરેલા કાંસ્ય 0-60 સ્ક્રૂ દ્વારા ગ્રેફાઇટ ઇલેક્ટ્રોડ સાથે જોડાયેલા છે. પ્રિન્ટેડ સર્કિટ બોર્ડ 3D પ્રિન્ટરના કવરમાં મૂકવામાં આવે છે.
CTCM ઉપકરણ પ્રોગ્રામેબલ ન્યુમેટિક એક્ટ્યુએટર (PPD) દ્વારા નિયંત્રિત થાય છે જે કાર્ડિયાક ચક્રની જેમ નિયંત્રિત રુધિરાભિસરણ દબાણ બનાવે છે. જેમ જેમ એર ચેમ્બરની અંદર દબાણ વધે છે, તેમ તેમ લવચીક સિલિકોન પટલ ઉપર તરફ વિસ્તરે છે, જે ટીશ્યુ સાઇટ હેઠળના માધ્યમને દબાણ કરે છે. પ્રવાહીના આ નિષ્કાસન દ્વારા પેશીઓનો વિસ્તાર ખેંચાશે, જે ડાયસ્ટોલ દરમિયાન હૃદયના શારીરિક વિસ્તરણની નકલ કરશે. આરામની ટોચ પર, ગ્રેફાઇટ ઇલેક્ટ્રોડ્સ દ્વારા વિદ્યુત ઉત્તેજના લાગુ કરવામાં આવી હતી, જેણે એર ચેમ્બરમાં દબાણ ઘટાડ્યું હતું અને ટીશ્યુ વિભાગોનું સંકોચન કર્યું હતું. પાઇપની અંદર એક હેમોસ્ટેટિક વાલ્વ છે જેમાં હવા સિસ્ટમમાં દબાણ શોધવા માટે પ્રેશર સેન્સર છે. પ્રેશર સેન્સર દ્વારા અનુભવાયેલ દબાણ લેપટોપ સાથે જોડાયેલા ડેટા કલેક્ટર પર લાગુ થાય છે. આ ગેસ ચેમ્બરની અંદર દબાણનું સતત નિરીક્ષણ કરવાની મંજૂરી આપે છે. જ્યારે મહત્તમ ચેમ્બર દબાણ (માનક 80 mmHg, 140 mmHg OS) પર પહોંચી ગયું, ત્યારે ડેટા એક્વિઝિશન ડિવાઇસને C-PACE-EM સિસ્ટમને 2 ms માટે બાયફેસિક વોલ્ટેજ સિગ્નલ જનરેટ કરવા માટે સિગ્નલ મોકલવાનો આદેશ આપવામાં આવ્યો હતો, જે 4 V પર સેટ છે.
હૃદયના ભાગો મેળવવામાં આવ્યા હતા અને 6 કુવામાં કલ્ચરની સ્થિતિ નીચે મુજબ કરવામાં આવી હતી: કાપેલા હૃદયને ટ્રાન્સફર વાસણમાંથી ઠંડા (4° સે.) કાર્ડિયોપ્લેજિયા ધરાવતી ટ્રેમાં સ્થાનાંતરિત કરો. ડાબા વેન્ટ્રિકલને જંતુરહિત બ્લેડથી અલગ કરવામાં આવ્યું હતું અને 1-2 cm3 ના ટુકડાઓમાં કાપવામાં આવ્યું હતું. આ ટીશ્યુ બ્લોક્સને ટીશ્યુ એડહેસિવ સાથે ટીશ્યુ સપોર્ટ સાથે જોડવામાં આવ્યા હતા અને ટાયરોડના દ્રાવણ ધરાવતા વાઇબ્રેટિંગ માઇક્રોટોમ ટીશ્યુ બાથમાં મૂકવામાં આવ્યા હતા અને સતત ઓક્સિજનયુક્ત (3 g/L 2,3-બ્યુટેનેડિઓન મોનોઓક્સાઈમ (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g). ), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-ગ્લુકોઝ (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M દ્રાવણ), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M દ્રાવણ), 1 L ddH2O સુધી. વાઇબ્રેટિંગ માઇક્રોટોમ 80 Hz ની આવર્તન, 2 mm ના આડી વાઇબ્રેશન એમ્પ્લીટ્યુડ અને 0.03 mm/s ના એડવાન્સ રેટ પર 300 µm જાડા સ્લાઇસેસ કાપવા માટે સેટ કરવામાં આવ્યું હતું. દ્રાવણ ઠંડુ રાખવા માટે ટીશ્યુ બાથ બરફથી ઘેરાયેલું હતું અને તાપમાન 4°C પર જાળવવામાં આવ્યું હતું. માઇક્રોટોમ બાથમાંથી ટીશ્યુ વિભાગોને બરફ પર સતત ઓક્સિજનયુક્ત ટાયરોડ દ્રાવણ ધરાવતા ઇન્ક્યુબેશન બાથમાં સ્થાનાંતરિત કરો જ્યાં સુધી એક કલ્ચર પ્લેટ માટે પૂરતા વિભાગો ન મળે. ટ્રાન્સવેલ કલ્ચર માટે, ટીશ્યુ વિભાગોને જંતુરહિત 6 mm પહોળા પોલીયુરેથીન સપોર્ટ સાથે જોડવામાં આવ્યા હતા અને 6 મિલી ઑપ્ટિમાઇઝ્ડ માધ્યમ (199 માધ્યમ, 1x ITS સપ્લિમેન્ટ, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-આલ્કલાઇન અને 2X એન્ટિબાયોટિક-એન્ટિફંગલ) માં મૂકવામાં આવ્યા હતા. C-Pace દ્વારા ટીશ્યુ વિભાગો પર ઇલેક્ટ્રિકલ સ્ટીમ્યુલેશન (10 V, ફ્રીક્વન્સી 1.2 Hz) લાગુ કરવામાં આવ્યું હતું. TD ની સ્થિતિ માટે, દરેક માધ્યમ પરિવર્તન વખતે 100 nM અને 1 μM પર તાજા T3 અને Dex ઉમેરવામાં આવ્યા હતા. દિવસમાં 3 વખત બદલતા પહેલા માધ્યમ ઓક્સિજનથી સંતૃપ્ત થાય છે. ટીશ્યુ સેક્શનને 37°C અને 5% CO2 પર ઇન્ક્યુબેટરમાં કલ્ચર કરવામાં આવ્યા હતા.
CTCM કલ્ચર માટે, પેટ્રી ડીશમાં કસ્ટમ-મેઇડ 3D પ્રિન્ટર પર ટીશ્યુ સેક્શન મૂકવામાં આવ્યા હતા જેમાં સંશોધિત ટાયરોડનું દ્રાવણ હતું. આ ઉપકરણ હૃદયના ટુકડાના કદને સપોર્ટ રિંગના ક્ષેત્રફળના 25% સુધી વધારવા માટે રચાયેલ છે. આ કરવામાં આવે છે જેથી ટાયરોડના દ્રાવણમાંથી માધ્યમમાં સ્થાનાંતરિત થયા પછી અને ડાયસ્ટોલ દરમિયાન હૃદયના ભાગો ખેંચાય નહીં. હિસ્ટોએક્રીલિક ગુંદરનો ઉપયોગ કરીને, 300 µm જાડા ભાગોને 7 મીમી વ્યાસની સપોર્ટ રિંગ પર ફિક્સ કરવામાં આવ્યા હતા. ટીશ્યુ સેક્શનને સપોર્ટ રિંગ સાથે જોડ્યા પછી, વધારાના ટીશ્યુ સેક્શનને કાપી નાખો અને જોડાયેલા ટીશ્યુ સેક્શનને બરફ (4°C) પર ટાયરોડ સોલ્યુશનના બાથમાં પાછા મૂકો જ્યાં સુધી એક ઉપકરણ માટે પૂરતા વિભાગો તૈયાર ન થાય. બધા ઉપકરણો માટે કુલ પ્રક્રિયા સમય 2 કલાકથી વધુ ન હોવો જોઈએ. 6 ટીશ્યુ સેક્શનને તેમના સપોર્ટ રિંગ્સ સાથે જોડ્યા પછી, CTCM ડિવાઇસ એસેમ્બલ કરવામાં આવ્યું હતું. CTCM કલ્ચર ચેમ્બર 21 મિલી પ્રી-ઓક્સિજનયુક્ત માધ્યમથી પહેલાથી ભરેલું છે. ટીશ્યુ સેક્શનને કલ્ચર ચેમ્બરમાં સ્થાનાંતરિત કરો અને પીપેટ વડે કોઈપણ હવાના પરપોટા કાળજીપૂર્વક દૂર કરો. પછી ટીશ્યુ સેક્શનને છિદ્રમાં લઈ જવામાં આવે છે અને ધીમેધીમે જગ્યાએ દબાવવામાં આવે છે. અંતે, ઉપકરણ પર ઇલેક્ટ્રોડ કેપ મૂકો અને ઉપકરણને ઇન્ક્યુબેટરમાં સ્થાનાંતરિત કરો. પછી CTCM ને એર ટ્યુબ અને C-PACE-EM સિસ્ટમ સાથે જોડો. ન્યુમેટિક એક્ટ્યુએટર ખુલે છે અને એર વાલ્વ CTCM ખોલે છે. C-PACE-EM સિસ્ટમને બાયફેસિક પેસિંગ દરમિયાન 2 ms માટે 1.2 Hz પર 4 V પહોંચાડવા માટે ગોઠવવામાં આવી હતી. દિવસમાં બે વાર માધ્યમ બદલવામાં આવતું હતું અને ઇલેક્ટ્રોડ્સ પર ગ્રેફાઇટના સંચયને ટાળવા માટે દિવસમાં એકવાર ઇલેક્ટ્રોડ્સ બદલવામાં આવતા હતા. જો જરૂરી હોય તો, ટીશ્યુ સેક્શનને તેમના કલ્ચર કુવાઓમાંથી દૂર કરી શકાય છે જેથી તેમની નીચે પડેલા કોઈપણ હવાના પરપોટા બહાર નીકળી શકે. MT સારવારની સ્થિતિ માટે, T3/Dex ને દરેક માધ્યમ ફેરફાર સાથે 100 nM T3 અને 1 μM Dex સાથે તાજું ઉમેરવામાં આવ્યું હતું. CTCM ઉપકરણોને 37°C અને 5% CO2 પર ઇન્ક્યુબેટરમાં કલ્ચર કરવામાં આવ્યા હતા.
હૃદયના ટુકડાઓના ખેંચાયેલા માર્ગો મેળવવા માટે, એક ખાસ કેમેરા સિસ્ટમ વિકસાવવામાં આવી હતી. એક SLR કેમેરા (કેનન રેબેલ T7i, કેનન, ટોક્યો, જાપાન) નો ઉપયોગ નેવિટર ઝૂમ 7000 18-108mm મેક્રો લેન્સ (નેવિટર, સાન ફ્રાન્સિસ્કો, CA) સાથે કરવામાં આવ્યો હતો. માધ્યમને તાજા માધ્યમથી બદલ્યા પછી ઓરડાના તાપમાને વિઝ્યુલાઇઝેશન કરવામાં આવ્યું હતું. કેમેરા 51° ના ખૂણા પર સ્થિત છે અને વિડિઓ 30 ફ્રેમ પ્રતિ સેકન્ડ પર રેકોર્ડ કરવામાં આવે છે. પ્રથમ, હૃદયના ટુકડાઓની ગતિનું માપન કરવા માટે ઓપન સોર્સ સોફ્ટવેર (MUSCLEMOTION43) નો ઉપયોગ Image-J સાથે કરવામાં આવ્યો હતો. અવાજ ટાળવા માટે હૃદયના ટુકડાઓને ધબકાવવા માટે રસના ક્ષેત્રોને વ્યાખ્યાયિત કરવા માટે MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) નો ઉપયોગ કરીને માસ્ક બનાવવામાં આવ્યો હતો. મેન્યુઅલી સેગમેન્ટેડ માસ્ક ફ્રેમ સિક્વન્સમાં બધી છબીઓ પર લાગુ કરવામાં આવે છે અને પછી MUSCLEMOTION પ્લગ-ઇન પર પસાર થાય છે. મસલ મોશન દરેક ફ્રેમમાં પિક્સેલ્સની સરેરાશ તીવ્રતાનો ઉપયોગ સંદર્ભ ફ્રેમની તુલનામાં તેની ગતિને માપવા માટે કરે છે. કાર્ડિયાક ચક્ર દરમિયાન ચક્ર સમયનું પ્રમાણ નક્કી કરવા અને પેશીઓના ખેંચાણનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે ડેટા રેકોર્ડ, ફિલ્ટર અને ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. રેકોર્ડ કરેલા વિડીયોને ફર્સ્ટ-ઓર્ડર ઝીરો-ફેઝ ડિજિટલ ફિલ્ટરનો ઉપયોગ કરીને પોસ્ટ-પ્રોસેસ કરવામાં આવ્યો હતો. ટીશ્યુ સ્ટ્રેચ (પીક-ટુ-પીક) ને માપવા માટે, રેકોર્ડ કરેલા સિગ્નલમાં પીક અને ટ્રફ વચ્ચે તફાવત કરવા માટે પીક-ટુ-પીક વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. વધુમાં, સિગ્નલ ડ્રિફ્ટને દૂર કરવા માટે 6ઠ્ઠા ક્રમના બહુપદીનો ઉપયોગ કરીને ડિટ્રેન્ડિંગ કરવામાં આવે છે. વૈશ્વિક ટીશ્યુ ગતિ, ચક્ર સમય, આરામ સમય અને સંકોચન સમય નક્કી કરવા માટે MATLAB માં પ્રોગ્રામ કોડ વિકસાવવામાં આવ્યો હતો (સપ્લીમેન્ટરી પ્રોગ્રામ કોડ 44).
સ્ટ્રેન વિશ્લેષણ માટે, યાંત્રિક સ્ટ્રેચ મૂલ્યાંકન માટે બનાવેલા સમાન વિડિઓઝનો ઉપયોગ કરીને, અમે સૌપ્રથમ MUSCLEMOTION સોફ્ટવેર અનુસાર ગતિ શિખરો (ગતિના સૌથી ઉચ્ચ (ઉપલા) અને સૌથી નીચલા (નીચલા) બિંદુઓ) દર્શાવતી બે છબીઓ શોધી કાઢી. ત્યારબાદ અમે પેશી પ્રદેશોને વિભાજિત કર્યા અને વિભાજિત પેશી પર શેડિંગ અલ્ગોરિધમનો એક પ્રકાર લાગુ કર્યો (પૂરક આકૃતિ 2a). ત્યારબાદ વિભાજિત પેશીને દસ ઉપસપાટીમાં વિભાજિત કરવામાં આવી, અને દરેક સપાટી પરના તણાવની ગણતરી નીચેના સમીકરણનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી: સ્ટ્રેન = (સુપ-એસડાઉન)/એસડાઉન, જ્યાં સુપ અને એસડાઉન અનુક્રમે ફેબ્રિકના ઉપર અને નીચેના પડછાયાઓથી આકારનું અંતર છે (પૂરક આકૃતિ 2b).
હૃદયના ભાગોને 48 કલાક માટે 4% પેરાફોર્માલ્ડિહાઇડમાં ફિક્સ કરવામાં આવ્યા હતા. સ્થિર પેશીઓને 1 કલાક માટે 10% અને 20% સુક્રોઝમાં ડિહાઇડ્રેટ કરવામાં આવ્યા હતા, પછી રાતોરાત 30% સુક્રોઝમાં ડિહાઇડ્રેટ કરવામાં આવ્યા હતા. પછી વિભાગોને શ્રેષ્ઠ કટીંગ તાપમાન સંયોજન (OCT સંયોજન) માં એમ્બેડ કરવામાં આવ્યા હતા અને ધીમે ધીમે આઇસોપેન્ટેન/ડ્રાય આઈસ બાથમાં સ્થિર કરવામાં આવ્યા હતા. OCT એમ્બેડિંગ બ્લોક્સને અલગ ન થાય ત્યાં સુધી -80 °C પર સ્ટોર કરો. સ્લાઇડ્સને 8 μm ની જાડાઈવાળા વિભાગો તરીકે તૈયાર કરવામાં આવી હતી.
હૃદયના ભાગોમાંથી OCT દૂર કરવા માટે, સ્લાઇડ્સને 95 °C પર હીટિંગ બ્લોક પર 5 મિનિટ માટે ગરમ કરો. દરેક સ્લાઇડમાં 1 મિલી PBS ઉમેરો અને ઓરડાના તાપમાને 30 મિનિટ માટે ઇન્ક્યુબેટ કરો, પછી ઓરડાના તાપમાને 15 મિનિટ માટે PBS માં 0.1% ટ્રાઇટોન-X સેટ કરીને વિભાગોમાં પ્રવેશ કરો. બિન-વિશિષ્ટ એન્ટિબોડીઝને નમૂના સાથે જોડાતા અટકાવવા માટે, સ્લાઇડ્સમાં 1 મિલી 3% BSA દ્રાવણ ઉમેરો અને ઓરડાના તાપમાને 1 કલાક માટે ઇન્ક્યુબેટ કરો. ત્યારબાદ BSA દૂર કરવામાં આવ્યું અને સ્લાઇડ્સને PBS થી ધોવામાં આવી. દરેક નમૂનાને પેન્સિલથી ચિહ્નિત કરો. પ્રાથમિક એન્ટિબોડીઝ (૧% BSA માં ૧:૨૦૦ પાતળું) (કોનેક્સિન ૪૩ (એબકેમ; #AB૧૧૩૭૦), NFATC૪ (એબકેમ; #AB૯૯૪૩૧) અને ટ્રોપોનિન-ટી (થર્મો સાયન્ટિફિક; #MA5-12960) ૯૦ મિનિટમાં ઉમેરવામાં આવ્યા, પછી ગૌણ એન્ટિબોડીઝ (૧% BSA માં ૧:૨૦૦ પાતળું) ઉંદર એલેક્સા ફ્લોર ૪૮૮ (થર્મો સાયન્ટિફિક; #A૧૬૦૭૯), સસલાના એલેક્સા ફ્લોર ૫૯૪ (થર્મો સાયન્ટિફિક; #T6391) સામે વધારાના ૯૦ મિનિટ માટે PBS વડે ૩ વખત ધોવામાં આવ્યા. ટાર્ગેટ સ્ટેનિંગને બેકગ્રાઉન્ડથી અલગ પાડવા માટે, અમે નિયંત્રણ તરીકે ફક્ત ગૌણ એન્ટિબોડીનો ઉપયોગ કર્યો. અંતે, DAPI ન્યુક્લિયર સ્ટેન ઉમેરવામાં આવ્યું અને સ્લાઇડ્સને વેક્ટાશીલ્ડ (વેક્ટર લેબોરેટરીઝ) માં મૂકવામાં આવી અને નેઇલ પોલીશથી સીલ કરવામાં આવી. -x મેગ્નિફિકેશન) અને ૪૦x મેગ્નિફિકેશન સાથે કીન્સ માઇક્રોસ્કોપ.
WGA-Alexa Fluor 555 (થર્મો સાયન્ટિફિક; #W32464) 5 μg/ml PBS માં WGA સ્ટેનિંગ માટે ઉપયોગમાં લેવાયો હતો અને ઓરડાના તાપમાને 30 મિનિટ માટે નિશ્ચિત વિભાગો પર લાગુ કરવામાં આવ્યો હતો. ત્યારબાદ સ્લાઇડ્સને PBS થી ધોવામાં આવી હતી અને દરેક સ્લાઇડમાં સુદાન બ્લેક ઉમેરવામાં આવ્યું હતું અને 30 મિનિટ માટે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યું હતું. ત્યારબાદ સ્લાઇડ્સને PBS થી ધોવામાં આવી હતી અને વેક્ટાશીલ્ડ એમ્બેડિંગ માધ્યમ ઉમેરવામાં આવ્યું હતું. સ્લાઇડ્સને કીન્સ માઇક્રોસ્કોપ પર 40x મેગ્નિફિકેશન પર વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવામાં આવી હતી.
ઉપર વર્ણવ્યા મુજબ નમૂનાઓમાંથી OCT દૂર કરવામાં આવ્યું હતું. OCT દૂર કર્યા પછી, સ્લાઇડ્સને બોઇનના દ્રાવણમાં રાતોરાત ડૂબાડી રાખો. પછી સ્લાઇડ્સને 1 કલાક માટે નિસ્યંદિત પાણીથી ધોઈ નાખવામાં આવી અને પછી 10 મિનિટ માટે બિબ્રિચ એલો એસિડ ફ્યુચિન દ્રાવણમાં મૂકવામાં આવી. પછી સ્લાઇડ્સને નિસ્યંદિત પાણીથી ધોવામાં આવી અને 5% ફોસ્ફોમોલિબ્ડેનમ/5% ફોસ્ફોટંગસ્ટિક એસિડના દ્રાવણમાં 10 મિનિટ માટે મૂકવામાં આવી. કોગળા કર્યા વિના, સ્લાઇડ્સને 15 મિનિટ માટે સીધા એનિલિન બ્લુ દ્રાવણમાં સ્થાનાંતરિત કરો. પછી સ્લાઇડ્સને નિસ્યંદિત પાણીથી ધોવામાં આવી અને 1% એસિટિક એસિડ દ્રાવણમાં 2 મિનિટ માટે મૂકવામાં આવી. સ્લાઇડ્સને 200 N ઇથેનોલમાં સૂકવવામાં આવી અને ઝાયલીનમાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવી. 10x ઉદ્દેશ્ય સાથે કીન્સ માઇક્રોસ્કોપનો ઉપયોગ કરીને રંગીન સ્લાઇડ્સનું વિઝ્યુઅલાઈઝેશન કરવામાં આવ્યું. કીન્સ એનાલાઇઝર સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરીને ફાઇબ્રોસિસ વિસ્તારની ટકાવારીનું પ્રમાણ નક્કી કરવામાં આવ્યું.
ઉત્પાદકના પ્રોટોકોલ અનુસાર, કેટલાક ફેરફારો સાથે, CyQUANT™ MTT સેલ વાયબિલિટી એસે (ઇન્વિટ્રોજન, કાર્લ્સબેડ, CA), કેટલોગ નંબર V13154. ખાસ કરીને, MTT વિશ્લેષણ દરમિયાન એકસમાન પેશી કદ સુનિશ્ચિત કરવા માટે 6 મીમી વ્યાસવાળા સર્જિકલ પંચનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. ઉત્પાદકના પ્રોટોકોલ અનુસાર, MTT સબસ્ટ્રેટ ધરાવતી 12-કુવા પ્લેટના કુવામાં પેશીઓને વ્યક્તિગત રીતે પ્લેટ કરવામાં આવ્યા હતા. આ વિભાગોને 3 કલાક માટે 37° સે. પર ઉકાળવામાં આવે છે અને જીવંત પેશીઓ MTT સબસ્ટ્રેટને જાંબલી ફોર્માઝન સંયોજન બનાવવા માટે ચયાપચય કરે છે. હૃદયના ભાગોમાંથી જાંબલી ફોર્માઝન કાઢવા માટે MTT સોલ્યુશનને 1 મિલી DMSO થી બદલો અને 15 મિનિટ માટે 37°C પર ઉકાળો. નમૂનાઓને 96-કુવા સ્પષ્ટ તળિયાની પ્લેટોમાં DMSO માં 1:10 પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું અને સાયટેશન પ્લેટ રીડર (બાયોટેક) નો ઉપયોગ કરીને જાંબલી રંગની તીવ્રતા 570 nm પર માપવામાં આવી હતી. હૃદયના દરેક ટુકડાના વજન અનુસાર વાંચન સામાન્ય કરવામાં આવ્યું હતું.
અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ ગ્લુકોઝ ઉપયોગ પરીક્ષણ માટે હાર્ટ સ્લાઇસ મીડિયાને 1 μCi/ml [5-3H]-ગ્લુકોઝ (મોરાવેક બાયોકેમિકલ્સ, બ્રેઆ, CA, USA) ધરાવતા મીડિયાથી બદલવામાં આવ્યું. 4 કલાકના ઇન્ક્યુબેશન પછી, 100 μl 0.2 N HCl ધરાવતી ખુલ્લી માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં 100 μl માધ્યમ ઉમેરો. પછી ટ્યુબને 500 μl dH2O ધરાવતી સિન્ટિલેશન ટ્યુબમાં મૂકવામાં આવી જેથી 37°C પર 72 કલાક માટે [3H]2O બાષ્પીભવન થાય. પછી સિન્ટિલેશન ટ્યુબમાંથી માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબને દૂર કરો અને 10 મિલી સિન્ટિલેશન પ્રવાહી ઉમેરો. ટ્રાઇ-કાર્બ 2900TR લિક્વિડ સિન્ટિલેશન એનાલાઇઝર (પેકાર્ડ બાયોસાયન્સ કંપની, મેરિડેન, CT, USA) નો ઉપયોગ કરીને સિન્ટિલેશન ગણતરીઓ કરવામાં આવી. ત્યારબાદ ગ્લુકોઝના ઉપયોગની ગણતરી [5-3H]-ગ્લુકોઝ ચોક્કસ પ્રવૃત્તિ, અપૂર્ણ સંતુલન અને પૃષ્ઠભૂમિ, [5-3H]-નું લેબલ વગરના ગ્લુકોઝમાં મંદન અને સિન્ટિલેશન કાઉન્ટર કાર્યક્ષમતાને ધ્યાનમાં રાખીને કરવામાં આવી હતી. ડેટા હૃદયના ભાગોના સમૂહમાં સામાન્ય કરવામાં આવે છે.
ટ્રાઇઝોલમાં ટીશ્યુ હોમોજનાઇઝેશન પછી, ઉત્પાદકના પ્રોટોકોલ અનુસાર, Qiagen miRNeasy માઇક્રો કિટ #210874 નો ઉપયોગ કરીને હૃદયના ભાગોમાંથી RNA ને અલગ કરવામાં આવ્યું હતું. RNAsec લાઇબ્રેરીની તૈયારી, ક્રમ અને ડેટા વિશ્લેષણ નીચે મુજબ કરવામાં આવ્યું હતું:
RNA લાઇબ્રેરીની તૈયારી માટે પ્રતિ સેમ્પલ 1 μg RNA નો ઉપયોગ શરૂઆતની સામગ્રી તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો. ઉત્પાદકની ભલામણોને અનુસરીને NEBNext UltraTM RNA લાઇબ્રેરી પ્રિપેરેશન કીટ ફોર ઇલુમિના (NEB, USA) નો ઉપયોગ કરીને સિક્વન્સિંગ લાઇબ્રેરીઓ જનરેટ કરવામાં આવી હતી, અને દરેક સેમ્પલ માટે એટ્રિબ્યુટ સિક્વન્સમાં ઇન્ડેક્સ કોડ ઉમેરવામાં આવ્યા હતા. ટૂંકમાં, પોલી-ટી ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ સાથે જોડાયેલા ચુંબકીય મણકાનો ઉપયોગ કરીને કુલ RNA માંથી mRNA શુદ્ધ કરવામાં આવ્યું હતું. NEBNext ફર્સ્ટ સ્ટ્રેન્ડ સિન્થેસિસ રિએક્શન બફર (5X) માં ઉચ્ચ તાપમાને ડાયવેલેન્ટ કેશનનો ઉપયોગ કરીને ફ્રેગમેન્ટેશન હાથ ધરવામાં આવે છે. પ્રથમ સ્ટ્રેન્ડ cDNA ને રેન્ડમ હેક્સામર પ્રાઇમર્સ અને M-MuLV રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝ (RNase H-) નો ઉપયોગ કરીને સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. પછી બીજા સ્ટ્રેન્ડ cDNA ને DNA પોલિમરેઝ I અને RNase H નો ઉપયોગ કરીને સંશ્લેષણ કરવામાં આવે છે. બાકીના ઓવરહેંગ્સને એક્સોન્યુક્લીઝ/પોલિમરેઝ પ્રવૃત્તિ દ્વારા બ્લન્ટ એન્ડ્સમાં રૂપાંતરિત કરવામાં આવે છે. DNA ફ્રેગમેન્ટના 3′ છેડાના એડેનિલેશન પછી, હેરપિન લૂપ સ્ટ્રક્ચર સાથે NEBNext એડેપ્ટર તેને હાઇબ્રિડાઇઝેશન માટે તૈયાર કરવા માટે તેની સાથે જોડાયેલ છે. પસંદગીની લંબાઈ 150-200 bp ના cDNA ટુકડાઓની પસંદગી માટે. AMPure XP સિસ્ટમ (બેકમેન કુલ્ટર, બેવર્લી, યુએસએ) નો ઉપયોગ કરીને લાઇબ્રેરી ટુકડાઓ શુદ્ધ કરવામાં આવ્યા હતા. ત્યારબાદ, 3 μl USER એન્ઝાઇમ (NEB, યુએસએ) કદ-પસંદ કરેલ cDNA સાથે એડેપ્ટર સાથે બંધાયેલો ઉપયોગ 15 મિનિટ માટે 37°C પર અને પછી PCR પહેલાં 95°C પર 5 મિનિટ માટે કરવામાં આવ્યો હતો. ત્યારબાદ PCR ફ્યુઝન હાઇ-ફિડેલિટી DNA પોલિમરેઝ, યુનિવર્સલ PCR પ્રાઇમર્સ અને ઇન્ડેક્સ (X) પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. અંતે, PCR ઉત્પાદનોને શુદ્ધ કરવામાં આવ્યા હતા (AMPure XP સિસ્ટમ) અને એજિલેન્ટ બાયોએનાલિઝર 2100 સિસ્ટમ પર લાઇબ્રેરી ગુણવત્તાનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું. ત્યારબાદ cDNA લાઇબ્રેરીને નોવેસેક સિક્વન્સરનો ઉપયોગ કરીને સિક્વન્સ કરવામાં આવી હતી. ઇલુમિનાની કાચી છબી ફાઇલોને CASAVA બેઝ કોલિંગનો ઉપયોગ કરીને કાચી વાંચનમાં રૂપાંતરિત કરવામાં આવી હતી. કાચો ડેટા FASTQ(fq) ફોર્મેટ ફાઇલોમાં સંગ્રહિત થાય છે જેમાં વાંચી સિક્વન્સ અને અનુરૂપ બેઝ ગુણવત્તાઓ હોય છે. ફિલ્ટર કરેલ સિક્વન્સિંગ રીડ્સને Sscrofa11.1 સંદર્ભ જીનોમ સાથે મેચ કરવા માટે HISAT2 પસંદ કરો. સામાન્ય રીતે, HISAT2 કોઈપણ કદના જીનોમને સપોર્ટ કરે છે, જેમાં 4 બિલિયન બેઝથી મોટા જીનોમનો સમાવેશ થાય છે, અને મોટાભાગના પરિમાણો માટે ડિફોલ્ટ મૂલ્યો સેટ કરેલા છે. RNA Seq ડેટામાંથી સ્પ્લિસિંગ રીડ્સને HISAT2 નો ઉપયોગ કરીને કાર્યક્ષમ રીતે ગોઠવી શકાય છે, જે હાલમાં ઉપલબ્ધ સૌથી ઝડપી સિસ્ટમ છે, જે અન્ય કોઈપણ પદ્ધતિ કરતાં સમાન અથવા વધુ સારી ચોકસાઈ સાથે છે.
ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સની વિપુલતા જનીન અભિવ્યક્તિના સ્તરને સીધી રીતે પ્રતિબિંબિત કરે છે. જનીન અભિવ્યક્તિ સ્તરનું મૂલ્યાંકન જીનોમ અથવા એક્સોન્સ સાથે સંકળાયેલ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ (સિક્વન્સિંગ કાઉન્ટ) ની વિપુલતા દ્વારા કરવામાં આવે છે. વાંચનની સંખ્યા જનીન અભિવ્યક્તિ સ્તર, જનીન લંબાઈ અને સિક્વન્સિંગ ઊંડાઈના પ્રમાણસર છે. FPKM (પ્રતિ મિલિયન બેઝ જોડીઓ અનુક્રમિત ટ્રાન્સક્રિપ્ટના હજાર બેઝ જોડીઓ દીઠ ટુકડાઓ) ની ગણતરી કરવામાં આવી હતી અને DESeq2 પેકેજનો ઉપયોગ કરીને વિભેદક અભિવ્યક્તિના P-મૂલ્યો નક્કી કરવામાં આવ્યા હતા. ત્યારબાદ અમે બિલ્ટ-ઇન R-ફંક્શન "p.adjust" પર આધારિત બેન્જામીની-હોચબર્ગ પદ્ધતિ9 નો ઉપયોગ કરીને દરેક P મૂલ્ય માટે ખોટા શોધ દર (FDR) ની ગણતરી કરી.
હૃદયના ભાગોમાંથી અલગ કરાયેલ RNA ને થર્મો (થર્મો, બિલાડી નં. 11756050) ના સુપરસ્ક્રિપ્ટ IV વિલો માસ્ટર મિક્સનો ઉપયોગ કરીને 200 ng/μl ની સાંદ્રતા પર cDNA માં રૂપાંતરિત કરવામાં આવ્યું હતું. એપ્લાઇડ બાયોસિસ્ટમ્સ એન્ડુરા પ્લેટ માઇક્રોએમ્પ 384-વેલ પારદર્શક પ્રતિક્રિયા પ્લેટ (થર્મો, બિલાડી નં. 4483319) અને માઇક્રોએમ્પ ઓપ્ટિકલ એડહેસિવ (થર્મો, બિલાડી નં. 4311971) નો ઉપયોગ કરીને ક્વોન્ટિટેટિવ ​​RT-PCR કરવામાં આવ્યું હતું. પ્રતિક્રિયા મિશ્રણમાં 5 µl ટાકમેન ફાસ્ટ એડવાન્સ્ડ માસ્ટર મિક્સ (થર્મો, બિલાડી # 4444557), 0.5 µl ટાકમેન પ્રાઈમર અને 3.5 µl H2O મિશ્રિત પ્રતિ કૂવો હતો. સ્ટાન્ડર્ડ qPCR ચક્ર ચલાવવામાં આવ્યા હતા અને એપ્લાઇડ બાયોસિસ્ટમ્સ ક્વોન્ટસ્ટુડિયો 5 રીઅલ-ટાઇમ PCR સાધન (384-વેલ મોડ્યુલ; ઉત્પાદન # A28135) નો ઉપયોગ કરીને CT મૂલ્યો માપવામાં આવ્યા હતા. ટાકમેન પ્રાઇમર્સ થર્મો (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) માંથી ખરીદવામાં આવ્યા હતા. બધા નમૂનાઓના CT મૂલ્યો હાઉસકીપિંગ જનીન GAPDH માં સામાન્ય કરવામાં આવ્યા હતા.
ઉત્પાદકના પ્રોટોકોલ અનુસાર NT-ProBNP કીટ (ડુક્કર) (બિલાડી નં. MBS2086979, MyBioSource) નો ઉપયોગ કરીને NT-ProBNP ના મીડિયા રિલીઝનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું. ટૂંકમાં, દરેક કૂવામાં 250 μl દરેક નમૂના અને ધોરણની ડુપ્લિકેટમાં ઉમેરવામાં આવી હતી. નમૂના ઉમેર્યા પછી તરત જ, દરેક કૂવામાં 50 μl એસે રીએજન્ટ A ઉમેરો. પ્લેટને હળવેથી હળવેથી હલાવો અને સીલંટથી સીલ કરો. પછી ગોળીઓને 1 કલાક માટે 37°C પર ઉકાળવામાં આવી. પછી દ્રાવણને એસ્પિરેટ કરો અને કુવાઓને 350 μl 1X વોશ સોલ્યુશનથી 4 વખત ધોઈ લો, દરેક વખતે 1-2 મિનિટ માટે વોશ સોલ્યુશન ઉકાળો. પછી દરેક કૂવામાં 100 μl એસે રીએજન્ટ B ઉમેરો અને પ્લેટ સીલંટથી સીલ કરો. ટેબ્લેટને ધીમેથી હલાવીને 37°C પર 30 મિનિટ માટે ઉકાળવામાં આવી. દ્રાવણને એસ્પિરેટ કરો અને કુવાઓને 350 µl 1X વોશ સોલ્યુશનથી 5 વખત ધોઈ લો. દરેક કૂવામાં 90 µl સબસ્ટ્રેટ સોલ્યુશન ઉમેરો અને પ્લેટને સીલ કરો. પ્લેટને 37°C પર 10-20 મિનિટ માટે ઉકાળો. દરેક કૂવામાં 50 µl સ્ટોપ સોલ્યુશન ઉમેરો. 450 nm પર સેટ કરેલા સાયટેશન (બાયોટેક) પ્લેટ રીડરનો ઉપયોગ કરીને પ્લેટને તરત જ માપવામાં આવી.
જૂથ કદ પસંદ કરવા માટે પાવર વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું જે 5% પ્રકાર I ભૂલ દર સાથે પરિમાણમાં 10% સંપૂર્ણ ફેરફાર શોધવા માટે 80% થી વધુ શક્તિ પ્રદાન કરશે. જૂથ કદ પસંદ કરવા માટે પાવર વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યા હતા જે 5% પ્રકાર I ભૂલ દર સાથે પરિમાણમાં 10% સંપૂર્ણ ફેરફાર શોધવા માટે 80% થી વધુ શક્તિ પ્રદાન કરશે. અનાલિઝ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абнаружения параметра с 5% частотой ошибок TIPA I. 5% પ્રકાર I ભૂલ દર સાથે 10% સંપૂર્ણ પરિમાણ ફેરફાર શોધવા માટે 80% થી વધુ શક્તિ પ્રદાન કરનારા જૂથ કદ પસંદ કરવા માટે પાવર વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.进行功效分析以选择将提供 > 80％功效以检测参数中10进行功效分析以选择将提供 > 80％功效以检测参数中10 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения 10% параметров и 5% частоты ошибок типа I. ૧૦% સંપૂર્ણ પરિમાણ ફેરફાર અને ૫% પ્રકાર I ભૂલ દર શોધવા માટે ૮૦% થી વધુ શક્તિ પ્રદાન કરનાર જૂથ કદ પસંદ કરવા માટે પાવર વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.પ્રયોગ પહેલાં ટીશ્યુ વિભાગો રેન્ડમલી પસંદ કરવામાં આવ્યા હતા. બધા વિશ્લેષણો કન્ડિશન બ્લાઇન્ડ હતા અને બધા ડેટાનું વિશ્લેષણ થયા પછી જ નમૂનાઓ ડીકોડ કરવામાં આવ્યા હતા. બધા આંકડાકીય વિશ્લેષણ કરવા માટે ગ્રાફપેડ પ્રિઝમ સોફ્ટવેર (સાન ડિએગો, CA) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. બધા આંકડાઓ માટે, <0.05 મૂલ્યો પર p-મૂલ્યોને નોંધપાત્ર ગણવામાં આવ્યા હતા. બધા આંકડાઓ માટે, p-મૂલ્યો <0.05 મૂલ્યો પર નોંધપાત્ર ગણવામાં આવતા હતા. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. બધા આંકડાઓ માટે, p-મૂલ્યો <0.05 મૂલ્યો પર નોંધપાત્ર ગણવામાં આવતા હતા.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. બધા આંકડાઓ માટે, p-મૂલ્યો <0.05 મૂલ્યો પર નોંધપાત્ર ગણવામાં આવતા હતા.ડેટા પર બે-પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીનો ટી-ટેસ્ટ ફક્ત 2 સરખામણીઓ સાથે કરવામાં આવ્યો હતો. બહુવિધ જૂથો વચ્ચે મહત્વ નક્કી કરવા માટે એક-માર્ગી અથવા બે-માર્ગી ANOVA નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. પોસ્ટ હોક પરીક્ષણો કરતી વખતે, ટુકીના સુધારાને બહુવિધ સરખામણીઓ માટે એકાઉન્ટમાં લાગુ કરવામાં આવ્યો હતો. પદ્ધતિઓ વિભાગમાં વર્ણવ્યા મુજબ FDR અને p.adjust ની ગણતરી કરતી વખતે RNAsec ડેટામાં ખાસ આંકડાકીય વિચારણાઓ હોય છે.
અભ્યાસ ડિઝાઇન વિશે વધુ માહિતી માટે, આ લેખ સાથે જોડાયેલ નેચર રિસર્ચ રિપોર્ટનો સારાંશ જુઓ.