Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર. તમે જે બ્રાઉઝર વર્ઝનનો ઉપયોગ કરી રહ્યા છો તેમાં મર્યાદિત CSS સપોર્ટ છે. શ્રેષ્ઠ અનુભવ માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે અપડેટેડ બ્રાઉઝરનો ઉપયોગ કરો (અથવા ઇન્ટરનેટ એક્સપ્લોરરમાં સુસંગતતા મોડને અક્ષમ કરો). તે દરમિયાન, સતત સપોર્ટ સુનિશ્ચિત કરવા માટે, અમે સાઇટને સ્ટાઇલ અને JavaScript વિના રેન્ડર કરીશું.
AFEX સાથે પ્રીટ્રીટેડ કોર્ન સ્ટોવરમાં પર્સિસ્ટન્ટ ઓલિગોસેકરાઇડ્સના જટિલ વિશ્લેષણ માટે નવી ઇમ્યુનોલોજિકલ અને માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રિક પદ્ધતિઓ. લિગ્નોસેલ્યુલોસિક બાયોમાસ એ અશ્મિભૂત ઇંધણનો ટકાઉ વિકલ્પ છે અને તેનો ઉપયોગ ખોરાક, ફીડ, ઇંધણ અને રસાયણો જેવા ઉત્પાદનોના ઉત્પાદન માટે બાયોટેકનોલોજી વિકસાવવા માટે વ્યાપકપણે થાય છે. આ તકનીકોની ચાવી એ છોડની કોષ દિવાલોમાં હાજર જટિલ કાર્બોહાઇડ્રેટ્સને ગ્લુકોઝ, ઝાયલોઝ અને એરાબીનોઝ જેવી સરળ શર્કરામાં રૂપાંતરિત કરવા માટે ખર્ચ-સ્પર્ધાત્મક પ્રક્રિયાઓનો વિકાસ છે. કારણ કે લિગ્નોસેલ્યુલોસિક બાયોમાસ ખૂબ જ હઠીલા છે, તેને ઇચ્છિત ઉત્પાદન મેળવવા માટે થર્મોકેમિકલ સારવાર (દા.ત., એમોનિયા ફાઇબર એક્સ્ફોલિયેશન (AFEX), પાતળું એસિડ (DA), આયનીય પ્રવાહી (IL)) અને જૈવિક સારવાર (દા.ત., એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસિસ અને માઇક્રોબાયલ આથો) ના સંયોજનમાં આધિન હોવું આવશ્યક છે. . જોકે, જ્યારે હાઇડ્રોલિસિસ પ્રક્રિયામાં વાણિજ્યિક ફંગલ ઉત્સેચકોનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે, ત્યારે રચાયેલી દ્રાવ્ય શર્કરામાંથી માત્ર 75-85% મોનોસેકરાઇડ્સ હોય છે, અને બાકીના 15-25% દ્રાવ્ય, અવ્યવસ્થિત ઓલિગોસેકરાઇડ્સ હોય છે, જે હંમેશા સુક્ષ્મસજીવો માટે ઉપલબ્ધ હોતા નથી. અગાઉ, અમે કાર્બન અને ડાયટોમેસિયસ પૃથ્વી વિભાજન અને કદ બાકાત ક્રોમેટોગ્રાફીના મિશ્રણનો ઉપયોગ કરીને દ્રાવ્ય હઠીલા ઓલિગોસેકરાઇડ્સને સફળતાપૂર્વક અલગ અને શુદ્ધ કર્યા છે, અને તેમના એન્ઝાઇમ અવરોધક ગુણધર્મોની પણ તપાસ કરી છે. અમે શોધી કાઢ્યું છે કે ઉચ્ચ ડિગ્રી પોલિમરાઇઝેશન (DP) મેથિલેટેડ યુરોનિક એસિડ અવેજીકરણ ધરાવતા ઓલિગોસેકરાઇડ્સને ઓછા DP અને તટસ્થ ઓલિગોસેકરાઇડ્સ કરતાં વાણિજ્યિક એન્ઝાઇમ મિશ્રણો સાથે પ્રક્રિયા કરવી વધુ મુશ્કેલ છે. અહીં અમે ઘણી વધારાની પદ્ધતિઓના ઉપયોગની જાણ કરીએ છીએ, જેમાં છોડના કોષ દિવાલો અને એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસેટ્સમાં ગ્લાયકન બોન્ડને લાક્ષણિકતા આપવા માટે છોડના બાયોમાસ ગ્લાયકન્સ માટે વિશિષ્ટ મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝ (mAbs) નો ઉપયોગ કરીને ગ્લાયકન પ્રોફાઇલિંગ, મેટ્રિક્સ-સહાયિત લેસર ડિસોર્પ્શન આયનાઇઝેશન, ફ્લાઇટનો સમય માસ-સ્પેક્ટ્રોમેટ્રીનો સમાવેશ થાય છે. MALDI-TOF-MS) નકારાત્મક આયનોના ગૌણ સડો પછી સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી, ગેસ ક્રોમેટોગ્રાફી અને માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (GC-MS) દ્વારા મેળવેલા માળખાકીય-માહિતીપ્રદ ડાયગ્નોસ્ટિક શિખરોનો ઉપયોગ ડેરિવેટાઇઝેશન સાથે અને વગર ઓલિગોસેકરાઇડ બોન્ડને લાક્ષણિકતા આપવા માટે કરે છે. ઓલિગોસેકરાઇડ્સના નાના કદ (DP 4–20) ને કારણે, આ પરમાણુઓનો mAb બંધન અને લાક્ષણિકતા માટે ઉપયોગ કરવો મુશ્કેલ છે. આ સમસ્યાને દૂર કરવા માટે, અમે એક નવી બાયોટિન કન્જુગેશન-આધારિત ઓલિગોસેકરાઇડ સ્થિરતા પદ્ધતિ લાગુ કરી જેણે માઇક્રોપ્લેટ સપાટી પર મોટાભાગના ઓછા DP દ્રાવ્ય ઓલિગોસેકરાઇડ્સને સફળતાપૂર્વક લેબલ કર્યા, જેનો ઉપયોગ પછી ચોક્કસ બંધન વિશ્લેષણ માટે ઉચ્ચ થ્રુપુટ mAb સિસ્ટમમાં કરવામાં આવ્યો. આ નવી પદ્ધતિ ભવિષ્યમાં વધુ અદ્યતન ઉચ્ચ થ્રુપુટ ગ્લાયકોમ એસેસના વિકાસને સરળ બનાવશે જેનો ઉપયોગ ડાયગ્નોસ્ટિક હેતુઓ માટે બાયોમાર્કર્સમાં હાજર ઓલિગોસેકરાઇડ્સને અલગ કરવા અને લાક્ષણિકતા આપવા માટે થઈ શકે છે.
કૃષિ, વનસંવર્ધન, ઘાસ અને લાકડાની સામગ્રીથી બનેલું લિગ્નોસેલ્યુલોસિક બાયોમાસ, ઉચ્ચ મૂલ્યના ઉત્પાદનો ઉત્પન્ન કરવા માટે ખોરાક, ખોરાક, બળતણ અને રાસાયણિક પુરોગામી સહિત જૈવ-આધારિત ઉત્પાદનોના ઉત્પાદન માટે સંભવિત ફીડસ્ટોક છે. છોડની કોષ દિવાલોમાં હાજર કાર્બોહાઇડ્રેટ્સ (જેમ કે સેલ્યુલોઝ અને હેમીસેલ્યુલોઝ) રાસાયણિક પ્રક્રિયા અને બાયોટ્રાન્સફોર્મેશન (જેમ કે એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસિસ અને માઇક્રોબાયલ આથો) દ્વારા મોનોસેકરાઇડ્સમાં ડિપોલિમરાઇઝ્ડ થાય છે. સામાન્ય પૂર્વ-સારવારમાં એમોનિયા ફાઇબર વિસ્તરણ (AFEX), પાતળું એસિડ (DA), આયનીય પ્રવાહી (IL), અને સ્ટીમ વિસ્ફોટ (SE) શામેલ છે, જે છોડની કોષ દિવાલો ખોલીને લિગ્નોસેલ્યુલોઝ ઉત્પાદન ઘટાડવા માટે રસાયણો અને ગરમીના મિશ્રણનો ઉપયોગ કરે છે3,4. પદાર્થની હઠીલાપણું, 5. એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસિસ વ્યાપારી સક્રિય કાર્બોહાઇડ્રેટ-ધરાવતા ઉત્સેચકો (CAZymes) અને માઇક્રોબાયલ આથોનો ઉપયોગ કરીને જૈવ-આધારિત ઇંધણ અને રસાયણો ઉત્પન્ન કરવા માટે ટ્રાન્સજેનિક યીસ્ટ અથવા બેક્ટેરિયાનો ઉપયોગ કરીને ઉચ્ચ ઘન લોડ પર હાથ ધરવામાં આવે છે. 6.
વાણિજ્યિક ઉત્સેચકોમાં CAZymes ઉત્સેચકોના જટિલ મિશ્રણથી બનેલા હોય છે જે જટિલ કાર્બોહાઇડ્રેટ-ખાંડ બંધનોને સિનર્જિસ્ટિક રીતે તોડીને મોનોસેકરાઇડ્સ 2,7 બનાવે છે. જેમ આપણે પહેલા અહેવાલ આપ્યો હતો, કાર્બોહાઇડ્રેટ્સ સાથે લિગ્નિનના સુગંધિત પોલિમરનું જટિલ નેટવર્ક તેમને ખૂબ જ અવ્યવસ્થિત બનાવે છે, જે અપૂર્ણ ખાંડ રૂપાંતર તરફ દોરી જાય છે, જે 15-25% સેક્સ ઓલિગોસેકરાઇડ્સ એકઠા કરે છે જે પ્રીટ્રીટેડ બાયોમાસના એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસિસ દરમિયાન ઉત્પન્ન થતા નથી. વિવિધ બાયોમાસ પ્રીટ્રીટમેન્ટ પદ્ધતિઓ સાથે આ એક સામાન્ય સમસ્યા છે. આ અવરોધના કેટલાક કારણોમાં હાઇડ્રોલિસિસ દરમિયાન એન્ઝાઇમ અવરોધ, અથવા છોડના બાયોમાસમાં ખાંડ બંધ તોડવા માટે જરૂરી આવશ્યક ઉત્સેચકોની ગેરહાજરી અથવા નીચું સ્તર શામેલ છે. ઓલિગોસેકરાઇડ્સમાં ખાંડ બંધન જેવી ખાંડની રચના અને માળખાકીય લાક્ષણિકતાઓને સમજવાથી, હાઇડ્રોલિસિસ દરમિયાન ખાંડ રૂપાંતરને સુધારવામાં મદદ મળશે, બાયોટેકનોલોજીકલ પ્રક્રિયાઓને પેટ્રોલિયમ-ઉત્પાદિત ઉત્પાદનો સાથે ખર્ચ-સ્પર્ધાત્મક બનાવવામાં મદદ મળશે.
કાર્બોહાઇડ્રેટ્સની રચના નક્કી કરવી પડકારજનક છે અને તેના માટે લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી (LC)11,12, ન્યુક્લિયર મેગ્નેટિક રેઝોનન્સ સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી (NMR)13, કેશિકા ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ (CE)14,15,16 અને માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (MS)17 જેવી પદ્ધતિઓનું સંયોજન જરૂરી છે. ,અઢાર. MS પદ્ધતિઓ જેમ કે ટાઇમ-ઓફ-ફ્લાઇટ માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી લેસર ડિસોર્પ્શન અને મેટ્રિક્સ (MALDI-TOF-MS) નો ઉપયોગ કરીને આયનીકરણ કાર્બોહાઇડ્રેટ માળખાને ઓળખવા માટે એક બહુમુખી પદ્ધતિ છે. તાજેતરમાં, ઓલિગોસેકરાઇડ જોડાણ સ્થિતિઓ, એનોમેરિક રૂપરેખાંકનો, સિક્વન્સ અને બ્રાન્ચિંગ સ્થિતિઓ 20, 21 ને અનુરૂપ ફિંગરપ્રિન્ટ્સ ઓળખવા માટે સોડિયમ આયન એડક્ટ્સના કોલિઝન-ઇન્ડ્યુસ્ડ ડિસોસિએશન (CID) ટેન્ડમ MS નો સૌથી વધુ ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો છે.
કાર્બોહાઇડ્રેટ બોન્ડ્સ22 ની ઊંડાણપૂર્વક ઓળખ માટે ગ્લાયકેન વિશ્લેષણ એક ઉત્તમ સાધન છે. આ પદ્ધતિ જટિલ કાર્બોહાઇડ્રેટ જોડાણોને સમજવા માટે પ્લાન્ટ કોષ દિવાલ ગ્લાયકેન તરફ નિર્દેશિત મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝ (mAbs) નો ઉપયોગ કરે છે. વિશ્વભરમાં 250 થી વધુ mAbs ઉપલબ્ધ છે, જે વિવિધ સેકરાઇડ્સ24 નો ઉપયોગ કરીને વિવિધ રેખીય અને શાખાવાળા ઓલિગોસેકરાઇડ્સ સામે રચાયેલ છે. છોડ કોષ દિવાલની રચના, રચના અને ફેરફારોને લાક્ષણિકતા આપવા માટે ઘણા mAbs નો વ્યાપકપણે ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો છે, કારણ કે છોડ કોષ પ્રકાર, અંગ, ઉંમર, વિકાસના તબક્કા અને વૃદ્ધિ પર્યાવરણ25,26 પર આધાર રાખીને નોંધપાત્ર તફાવતો છે. તાજેતરમાં, આ પદ્ધતિનો ઉપયોગ છોડ અને પ્રાણી પ્રણાલીઓમાં વેસિકલ વસ્તી અને સબસેલ્યુલર માર્કર્સ, વિકાસના તબક્કા અથવા પર્યાવરણીય ઉત્તેજના દ્વારા નક્કી કરાયેલ ગ્લાયકેન પરિવહનમાં તેમની સંબંધિત ભૂમિકાઓને સમજવા અને એન્ઝાઇમેટિક પ્રવૃત્તિ નક્કી કરવા માટે કરવામાં આવ્યો છે. ગ્લાયકેન્સ અને ઝાયલાન્સની કેટલીક વિવિધ રચનાઓ જે ઓળખવામાં આવી છે તેમાં પેક્ટીન (P), ઝાયલાન (X), મન્નાન (M), ઝાયલોગ્લુકન્સ (XylG), મિશ્ર બોન્ડ ગ્લુકન્સ (MLG), અરાબિનોક્સીલન (ArbX), ગેલેક્ટોમેનન (GalG), ગ્લુક્યુરોનિક એસિડ-અરબિનોક્સીલન (GArbX) અને અરાબિનો-ગેલેક્ટન (ArbG)29નો સમાવેશ થાય છે.
જો કે, આ બધા સંશોધન પ્રયાસો છતાં, ઉચ્ચ ઘન લોડ (HSL) હાઇડ્રોલિસિસ દરમિયાન ઓલિગોસેકરાઇડ સંચયની પ્રકૃતિ પર માત્ર થોડા અભ્યાસો ધ્યાન કેન્દ્રિત કરે છે, જેમાં ઓલિગોસેકરાઇડ પ્રકાશન, હાઇડ્રોલિસિસ દરમિયાન ઓલિગોમેરિક સાંકળ લંબાઈમાં ફેરફાર, વિવિધ ઓછા DP પોલિમર્સ અને તેમના વળાંકોનો સમાવેશ થાય છે. વિતરણો 30,31,32. દરમિયાન, ગ્લાયકેન વિશ્લેષણ ગ્લાયકેન માળખાના વ્યાપક વિશ્લેષણ માટે ઉપયોગી સાધન સાબિત થયું હોવા છતાં, એન્ટિબોડી પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરીને પાણીમાં દ્રાવ્ય ઓછા DP ઓલિગોસેકરાઇડ્સનું મૂલ્યાંકન કરવું મુશ્કેલ છે. 5-10 kDa કરતા ઓછા પરમાણુ વજનવાળા નાના DP ઓલિગોસેકરાઇડ્સ ELISA પ્લેટ્સ 33, 34 સાથે જોડાતા નથી અને એન્ટિબોડી ઉમેરાતા પહેલા ધોવાઇ જાય છે.
અહીં, પ્રથમ વખત, અમે મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ કરીને એવિડિન-કોટેડ પ્લેટો પર ELISA પરીક્ષણનું પ્રદર્શન કરીએ છીએ, જે ગ્લાયકોમ વિશ્લેષણ સાથે દ્રાવ્ય પ્રત્યાવર્તન ઓલિગોસેકરાઇડ્સ માટે એક-પગલાની બાયોટીનાઇલેશન પ્રક્રિયાને જોડે છે. ગ્લાયકોમ વિશ્લેષણ પ્રત્યેનો અમારો અભિગમ MALDI-TOF-MS અને GC-MS આધારિત હાઇડ્રોલાઇઝ્ડ ખાંડ રચનાઓના ટ્રાઇમેથિલસિલિલ (TMS) ડેરિવેટાઇઝેશનનો ઉપયોગ કરીને પૂરક ઓલિગોસેકરાઇડ લિંકેજના વિશ્લેષણ દ્વારા માન્ય કરવામાં આવ્યો હતો. આ નવીન અભિગમ ભવિષ્યમાં ઉચ્ચ-થ્રુપુટ પદ્ધતિ તરીકે વિકસાવવામાં આવી શકે છે અને બાયોમેડિકલ સંશોધનમાં વ્યાપક એપ્લિકેશન શોધી શકાય છે.
ગ્લાયકોસિલેશન જેવા ઉત્સેચકો અને એન્ટિબોડીઝમાં અનુવાદ પછીના ફેરફારો, 36 તેમની જૈવિક પ્રવૃત્તિને અસર કરે છે. ઉદાહરણ તરીકે, સીરમ પ્રોટીનના ગ્લાયકોસિલેશનમાં ફેરફાર બળતરા સંધિવામાં મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવે છે, અને ગ્લાયકોસિલેશનમાં ફેરફારોનો ઉપયોગ ડાયગ્નોસ્ટિક માર્કર્સ તરીકે થાય છે37. સાહિત્યમાં વિવિધ ગ્લાયકેન્સ વિવિધ રોગોમાં સરળતાથી દેખાય છે તે નોંધાયું છે, જેમાં જઠરાંત્રિય માર્ગ અને યકૃતના ક્રોનિક બળતરા રોગો, વાયરલ ચેપ, અંડાશય, સ્તન અને પ્રોસ્ટેટ કેન્સરનો સમાવેશ થાય છે38,39,40. એન્ટિબોડી-આધારિત ગ્લાયકેન ELISA પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરીને ગ્લાયકેન્સની રચનાને સમજવાથી જટિલ MS પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કર્યા વિના રોગ નિદાનમાં વધારાનો વિશ્વાસ મળશે.
અમારા અગાઉના અભ્યાસમાં દર્શાવવામાં આવ્યું હતું કે પ્રીટ્રીટમેન્ટ અને એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસિસ પછી હઠીલા ઓલિગોસેકરાઇડ્સ અનહાઇડ્રોલાઇઝ્ડ રહ્યા હતા (આકૃતિ 1). અમારા અગાઉ પ્રકાશિત કાર્યમાં, અમે AFEX-પ્રીટ્રીટેડ કોર્ન સ્ટોવર હાઇડ્રોલાઇઝેટ (ACSH)8 માંથી ઓલિગોસેકરાઇડ્સને અલગ કરવા માટે સક્રિય ચારકોલ સોલિડ-ફેઝ નિષ્કર્ષણ પદ્ધતિ વિકસાવી હતી. પ્રારંભિક નિષ્કર્ષણ અને અલગ થયા પછી, ઓલિગોસેકરાઇડ્સને કદ બાકાત ક્રોમેટોગ્રાફી (SEC) દ્વારા વધુ વિભાજિત કરવામાં આવ્યા હતા અને પરમાણુ વજનના ક્રમમાં એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા. વિવિધ પ્રીટ્રીટમેન્ટ્સમાંથી મુક્ત થયેલા ખાંડ મોનોમર્સ અને ઓલિગોમરનું ખાંડ રચના વિશ્લેષણ દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. વિવિધ પ્રીટ્રીટમેન્ટ પદ્ધતિઓ દ્વારા મેળવેલા ખાંડ ઓલિગોમર્સની સામગ્રીની તુલના કરતી વખતે, હઠીલા ઓલિગોસેકરાઇડ્સની હાજરી બાયોમાસના મોનોસેકરાઇડ્સમાં રૂપાંતરમાં એક સામાન્ય સમસ્યા છે અને ખાંડની ઉપજમાં ઓછામાં ઓછા 10-15% અને 18% સુધીનો ઘટાડો તરફ દોરી શકે છે. યુ.એસ. આ પદ્ધતિનો ઉપયોગ ઓલિગોસેકરાઇડ અપૂર્ણાંકોના વધુ મોટા પાયે ઉત્પાદન માટે થાય છે. પરિણામી ACH અને તેના અનુગામી અપૂર્ણાંકોનો ઉપયોગ વિવિધ પરમાણુ વજન સાથે આ કાર્યમાં ઓલિગોસેકરાઇડ્સના પાત્રાલેખન માટે પ્રાયોગિક સામગ્રી તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો.
પ્રીટ્રીટમેન્ટ અને એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસિસ પછી, સતત ઓલિગોસેકરાઇડ્સ અનહાઇડ્રોલાઇઝ્ડ રહ્યા. અહીં (A) એક ઓલિગોસેકરાઇડ અલગ કરવાની પદ્ધતિ છે જેમાં ઓલિગોસેકરાઇડ્સને AFEX-પ્રીટ્રીટેડ કોર્ન સ્ટોવર હાઇડ્રોલાઇઝેટ (ACSH) થી સક્રિય કાર્બન અને ડાયટોમેસિયસ અર્થના પેક્ડ બેડનો ઉપયોગ કરીને અલગ કરવામાં આવે છે; (B) ઓલિગોસેકરાઇડ્સને અલગ કરવાની પદ્ધતિ. ઓલિગોસેકરાઇડ્સને કદ બાકાત ક્રોમેટોગ્રાફી (SEC) દ્વારા વધુ અલગ કરવામાં આવ્યા હતા; (C) વિવિધ પ્રીટ્રીટમેન્ટ્સમાંથી મુક્ત કરાયેલા સેકરાઇડ મોનોમર્સ અને ઓલિગોમર્સ (પાતળું એસિડ: DA, આયનીય પ્રવાહી: IL અને AFEX). એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસિસ સ્થિતિઓ: 25% (w/w) નું ઉચ્ચ ઘન લોડિંગ (લગભગ 8% ગ્લુકન લોડિંગ), 96 કલાક હાઇડ્રોલિસિસ, 20 મિલિગ્રામ/ગ્રામ કોમર્શિયલ એન્ઝાઇમ લોડિંગ (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 ગુણોત્તર) અને (D) AFEX પ્રી-ટ્રીટેડ કોર્ન સ્ટોવર (ACS) માંથી મુક્ત કરાયેલા ગ્લુકોઝ, ઝાયલોઝ અને એરાબીનોઝના ખાંડ મોનોમર્સ અને ઓલિગોમર્સ.
ઘન બાયોમાસ અવશેષોમાંથી અલગ કરાયેલા અર્કમાં ગ્લાયકેન્સના વ્યાપક માળખાકીય વિશ્લેષણ માટે ગ્લાયકેન વિશ્લેષણ એક ઉપયોગી સાધન સાબિત થયું છે. જો કે, આ પરંપરાગત પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને પાણીમાં દ્રાવ્ય સેકરાઇડ્સનું પ્રતિનિધિત્વ ઓછું કરવામાં આવે છે41 કારણ કે ઓછા પરમાણુ વજનવાળા ઓલિગોસેકરાઇડ્સ ELISA પ્લેટો પર સ્થિર થવું મુશ્કેલ છે અને એન્ટિબોડી ઉમેરતા પહેલા ધોવાઇ જાય છે. તેથી, એન્ટિબોડી બંધન અને લાક્ષણિકતા માટે, એવિડિન-કોટેડ ELISA પ્લેટો પર દ્રાવ્ય, બિન-અનુપાલન કરનારા ઓલિગોસેકરાઇડ્સને કોટ કરવા માટે એક-પગલાની બાયોટીનાઇલેશન પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. આ પદ્ધતિનું પરીક્ષણ અમારા અગાઉ ઉત્પાદિત ACSH અને તેના પરમાણુ વજન (અથવા પોલિમરાઇઝેશનની ડિગ્રી, DP) પર આધારિત અપૂર્ણાંકનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. કાર્બોહાઇડ્રેટના ઘટાડાવાળા છેડામાં બાયોટિન-LC-હાઇડ્રેઝાઇડ ઉમેરીને ઓલિગોસેકરાઇડ બંધન આકર્ષણ વધારવા માટે એક-પગલાની બાયોટીનાઇલેશનનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો (આકૃતિ 2). દ્રાવણમાં, ઘટાડાવાળા છેડા પર હેમિયાસેટલ જૂથ હાઇડ્રાઝોન બોન્ડ બનાવવા માટે બાયોટીન-LC-હાઇડ્રેઝાઇડના હાઇડ્રાઝાઇડ જૂથ સાથે પ્રતિક્રિયા આપે છે. રિડ્યુસિંગ એજન્ટ NaCNBH3 ની હાજરીમાં, હાઇડ્રાઝોન બોન્ડને સ્થિર બાયોટીનાઇલેટેડ એન્ડ પ્રોડક્ટમાં ઘટાડવામાં આવે છે. સુગર રિડ્યુસિંગ એન્ડમાં ફેરફાર સાથે, લો DP ઓલિગોસેકરાઇડ્સનું ELISA પ્લેટો સાથે જોડાણ શક્ય બન્યું, અને અમારા અભ્યાસમાં આ ગ્લાયકેન-લક્ષિત mAbs નો ઉપયોગ કરીને એવિડિન-કોટેડ પ્લેટો પર કરવામાં આવ્યું હતું.
બાયોટીનાઇલેટેડ ઓલિગોસેકરાઇડ્સ માટે ELISA પર આધારિત મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝનું સ્ક્રીનીંગ. અહીં (A) ઓલિગોસેકરાઇડ્સનું સંયુક્ત બાયોટીનાઇલેશન અને ન્યુટ્રાએવિડિન કોટેડ પ્લેટો પર ગ્લાયકેન-લક્ષિત mAbs સાથે અનુગામી ELISA સ્ક્રીનીંગ અને (B) પ્રતિક્રિયા ઉત્પાદનોના બાયોટીનાઇલેશન માટે એક-પગલાની પ્રક્રિયા દર્શાવે છે.
ત્યારબાદ ઓલિગોસેકરાઇડ-કન્જુગેટેડ એન્ટિબોડીઝ સાથે એવિડિન-કોટેડ પ્લેટોને પ્રાથમિક અને ગૌણ એન્ટિબોડીઝમાં ઉમેરવામાં આવી અને પ્રકાશ અને સમય-સંવેદનશીલ માધ્યમમાં ધોવામાં આવી. એન્ટિબોડી બંધન પૂર્ણ થયા પછી, પ્લેટને ઉકાળવા માટે TMB સબસ્ટ્રેટ ઉમેરો. આખરે સલ્ફ્યુરિક એસિડ સાથે પ્રતિક્રિયા બંધ કરવામાં આવી. એન્ટિબોડી-વિશિષ્ટ ક્રોસ-લિંકિંગ શોધવા માટે દરેક એન્ટિબોડીની બંધન શક્તિ નક્કી કરવા માટે ELISA રીડરનો ઉપયોગ કરીને ઉકાળવામાં આવેલી પ્લેટોનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું. પ્રયોગની વિગતો અને પરિમાણો માટે, અનુરૂપ વિભાગ "સામગ્રી અને પદ્ધતિઓ" જુઓ.
અમે ACSH માં હાજર દ્રાવ્ય ઓલિગોસેકરાઇડ્સ તેમજ લિગ્નોસેલ્યુલોસિક હાઇડ્રોલિસેટ્સથી અલગ કરાયેલા ક્રૂડ અને શુદ્ધ ઓલિગોસેકરાઇડ અપૂર્ણાંકોને લાક્ષણિકતા આપીને ચોક્કસ એપ્લિકેશનો માટે આ નવી વિકસિત પદ્ધતિની ઉપયોગિતા દર્શાવીએ છીએ. આકૃતિ 3 માં બતાવ્યા પ્રમાણે, બાયોએસિલેટેડ ગ્લાયકોમ એસે પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરીને ACSH માં ઓળખાતા સૌથી સામાન્ય એપિટોપ-અવેજીકૃત ઝાયલેન્સ સામાન્ય રીતે યુરોનિક (U) અથવા મેથાઈલ્યુરોનિક (MeU) અને પેક્ટીક એરાબીનોગેલેક્ટન્સ છે. તેમાંના મોટાભાગના નોન-હાઇડ્રોલાઇઝ્ડ સોલિડ્સ (UHS)43 ના ગ્લાયકેન્સના વિશ્લેષણ પરના અમારા અગાઉના અભ્યાસમાં પણ મળી આવ્યા હતા.
કોષ દિવાલ ગ્લાયકેન તરફ નિર્દેશિત મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીનો ઉપયોગ કરીને રિકેલ્સિટ્રન્ટ ઓલિગોસેકરાઇડ એપિટોપ્સની શોધ. "તટસ્થ" અપૂર્ણાંક એ ACN અપૂર્ણાંક છે અને "એસિડિક" અપૂર્ણાંક એ FA અપૂર્ણાંક છે. હીટમેપ પર તેજસ્વી લાલ રંગ એપિટોપનું પ્રમાણ વધારે દર્શાવે છે, અને તેજસ્વી વાદળી રંગ ખાલી પૃષ્ઠભૂમિ દર્શાવે છે. સ્કેલ પર રંગ મૂલ્યો ફોર્મ્યુલેશન N=2 માટે કાચા OD મૂલ્યો પર આધારિત છે. એન્ટિબોડીઝ દ્વારા ઓળખાતા મુખ્ય એપિટોપ્સ જમણી બાજુએ દર્શાવવામાં આવ્યા છે.
આ બિન-સેલ્યુલોઝ રચનાઓને પરીક્ષણ કરાયેલા વ્યાપારી ઉત્સેચક મિશ્રણમાં સૌથી સામાન્ય સેલ્યુલેઝ અને હેમીસેલ્યુલેઝ દ્વારા તોડી શકાયા નથી, જેમાં સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાતા વ્યાપારી ઉત્સેચકો શામેલ છે. તેથી, તેમના હાઇડ્રોલિસિસ માટે નવા સહાયક ઉત્સેચકોની જરૂર પડે છે. જરૂરી બિન-સેલ્યુલોઝ સહાયક ઉત્સેચકો વિના, આ બિન-સેલ્યુલોઝ બોન્ડ્સ મોનોસેકરાઇડ્સમાં સંપૂર્ણ રૂપાંતર અટકાવે છે, ભલે તેમના મૂળ ખાંડ પોલિમરને ટૂંકા ટુકડાઓમાં વ્યાપકપણે હાઇડ્રોલાઇઝ કરવામાં આવે અને વ્યાપારી ઉત્સેચક મિશ્રણનો ઉપયોગ કરીને ઓગાળવામાં આવે.
સિગ્નલ વિતરણ અને તેની બંધન શક્તિના વધુ અભ્યાસમાં દર્શાવવામાં આવ્યું છે કે બંધનકર્તા એપિટોપ્સ ઉચ્ચ DP ખાંડ અપૂર્ણાંક (A, B, C, DP 20+ સુધી) માં ઓછા DP અપૂર્ણાંક (D, E, F, DP) કરતા ઓછા હતા (આકૃતિ 1). એસિડ ટુકડાઓ તટસ્થ ટુકડાઓ કરતાં બિન-સેલ્યુલોઝ એપિટોપ્સમાં વધુ સામાન્ય છે. આ ઘટના અમારા અગાઉના અભ્યાસમાં જોવા મળેલી પેટર્ન સાથે સુસંગત છે, જ્યાં ઉચ્ચ DP અને એસિડ મોઇટીઝ એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસિસ માટે વધુ પ્રતિરોધક હતા. તેથી, બિન-સેલ્યુલોઝ ગ્લાયકન એપિટોપ્સ અને U અને MeU અવેજીની હાજરી ઓલિગોસેકરાઇડ્સની સ્થિરતામાં મોટા પ્રમાણમાં ફાળો આપી શકે છે. એ નોંધવું જોઈએ કે બંધન અને શોધ કાર્યક્ષમતા ઓછી DP ઓલિગોસેકરાઇડ્સ માટે સમસ્યારૂપ બની શકે છે, ખાસ કરીને જો એપિટોપ ડાયમેરિક અથવા ટ્રાઇમેરિક ઓલિગોસેકરાઇડ હોય. આનું પરીક્ષણ વિવિધ લંબાઈના વ્યાપારી ઓલિગોસેકરાઇડ્સનો ઉપયોગ કરીને કરી શકાય છે, દરેકમાં ફક્ત એક જ એપિટોપ હોય છે જે ચોક્કસ mAb સાથે જોડાય છે.
આમ, રચના-વિશિષ્ટ એન્ટિબોડીઝના ઉપયોગથી ચોક્કસ પ્રકારના રિકેલ્સિટ્રન્ટ બોન્ડ્સ જાહેર થયા. ઉપયોગમાં લેવાતા એન્ટિબોડીના પ્રકાર, યોગ્ય લિગેશન પેટર્ન અને તે ઉત્પન્ન કરતા સિગ્નલની મજબૂતાઈ (સૌથી વધુ અને ઓછામાં ઓછા વિપુલ પ્રમાણમાં) પર આધાર રાખીને, નવા ઉત્સેચકો ઓળખી શકાય છે અને વધુ સંપૂર્ણ ગ્લાયકોકન્વર્ઝન માટે એન્ઝાઇમ મિશ્રણમાં અર્ધ-માત્રાત્મક રીતે ઉમેરી શકાય છે. ACSH ઓલિગોસેકરાઇડ્સના વિશ્લેષણને ઉદાહરણ તરીકે લેતા, આપણે દરેક બાયોમાસ સામગ્રી માટે ગ્લાયકેન બોન્ડ્સનો ડેટાબેઝ બનાવી શકીએ છીએ. અહીં એ નોંધવું જોઈએ કે એન્ટિબોડીઝના વિવિધ આકર્ષણને ધ્યાનમાં લેવું જોઈએ, અને જો તેમનો આકર્ષણ અજાણ હોય, તો આ વિવિધ એન્ટિબોડીઝના સંકેતોની તુલના કરતી વખતે ચોક્કસ મુશ્કેલીઓ ઊભી કરશે. વધુમાં, સમાન એન્ટિબોડી માટે નમૂનાઓ વચ્ચે ગ્લાયકેન બોન્ડ્સની સરખામણી શ્રેષ્ઠ રીતે કાર્ય કરી શકે છે. આ હઠીલા બોન્ડ્સને પછી CAZyme ડેટાબેઝ સાથે જોડી શકાય છે, જેમાંથી આપણે ઉત્સેચકો ઓળખી શકીએ છીએ, ઉમેદવાર ઉત્સેચકો પસંદ કરી શકીએ છીએ અને બોન્ડ-બ્રેકિંગ ઉત્સેચકો માટે પરીક્ષણ કરી શકીએ છીએ, અથવા બાયોરિફાઇનરીઓમાં ઉપયોગ માટે આ ઉત્સેચકોને વ્યક્ત કરવા માટે માઇક્રોબાયલ સિસ્ટમ્સ વિકસાવી શકીએ છીએ44.
લિગ્નોસેલ્યુલોસિક હાઇડ્રોલિસેટ્સમાં હાજર ઓછા પરમાણુ વજનવાળા ઓલિગોસેકરાઇડ્સને લાક્ષણિકતા આપવા માટે રોગપ્રતિકારક પદ્ધતિઓ વૈકલ્પિક પદ્ધતિઓને કેવી રીતે પૂરક બનાવે છે તેનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે, અમે MALDI (આકૃતિ 4, S1-S8) અને GC-MS પર આધારિત TMS-વ્યુત્પન્ન સેકરાઇડ્સનું વિશ્લેષણ સમાન પેનલ (આકૃતિ 5) ઓલિગોસેકરાઇડ ભાગ પર કર્યું. MALDI નો ઉપયોગ ઓલિગોસેકરાઇડ પરમાણુઓનું સમૂહ વિતરણ ઇચ્છિત રચના સાથે મેળ ખાય છે કે કેમ તેની તુલના કરવા માટે થાય છે. આકૃતિ 4 પર તટસ્થ ઘટકો ACN-A અને ACN-B ના MC બતાવે છે. ACN-A વિશ્લેષણે DP 4-8 (આકૃતિ 4) થી DP 22 (આકૃતિ S1) સુધીની પેન્ટોઝ શર્કરાની શ્રેણીની પુષ્ટિ કરી, જેનું વજન MeU-xylan ઓલિગોસેકરાઇડ્સને અનુરૂપ છે. ACN-B વિશ્લેષણે DP 8-15 સાથે પેન્ટોઝ અને ગ્લુકોક્સિલન શ્રેણીની પુષ્ટિ કરી. આકૃતિ S3 જેવી પૂરક સામગ્રીમાં, FA-C એસિડિક મોઇટી માસ ડિસ્ટ્રિબ્યુશન નકશા 8-15 ના DP સાથે (Me)U અવેજીકૃત પેન્ટોઝ શર્કરાની શ્રેણી દર્શાવે છે જે ELISA-આધારિત mAb સ્ક્રીનીંગમાં જોવા મળતા અવેજીકૃત ઝાયલેન્સ સાથે સુસંગત છે. એપિટોપ્સ સુસંગત છે.
ACS માં હાજર દ્રાવ્ય બિન-અનુપાલક ઓલિગોસેકરાઇડ્સનો MALDI-MS સ્પેક્ટ્રમ. અહીં, (A) ACN-A ઓછા વજન શ્રેણીના અપૂર્ણાંક જેમાં મિથાઈલેટેડ યુરોનિક એસિડ (DP 4-8) ગ્લુકોરોક્સિલન ઓલિગોસેકરાઇડ્સ અને (B) ACN-B ઝાયલાન અને મિથાઈલેટેડ યુરોનિક એસિડ ઓલિગોસેકરાઇડ્સ ગ્લુકોરોક્સિલન (DP 8-15) સાથે બદલાયા છે.
પ્રત્યાવર્તન ઓલિગોસેકરાઇડ્સના ગ્લાયકેન અવશેષોની રચનાનું વિશ્લેષણ. અહીં (A) GC-MS વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરીને મેળવેલા વિવિધ ઓલિગોસેકરાઇડ અપૂર્ણાંકોની TMS સેકરાઇડ રચના. (B) ઓલિગોસેકરાઇડ્સમાં હાજર વિવિધ TMS-ઉત્પન્ન શર્કરાની રચના. ACN - તટસ્થ ઓલિગોસેકરાઇડ્સ ધરાવતું એસિટોનિટ્રાઇલ અપૂર્ણાંક અને FA - એસિડ ઓલિગોસેકરાઇડ્સ ધરાવતું ફેરુલિક એસિડ અપૂર્ણાંક.
આકૃતિ S9 માં બતાવ્યા પ્રમાણે, ઓલિગોસેકરાઇડ અપૂર્ણાંકના LC-MS વિશ્લેષણમાંથી બીજો એક રસપ્રદ નિષ્કર્ષ કાઢવામાં આવ્યો હતો (પદ્ધતિઓ ઇલેક્ટ્રોનિક પૂરક સામગ્રીમાં જોઈ શકાય છે). ACN-B અપૂર્ણાંકના બંધન દરમિયાન હેક્સોઝ અને -OAc જૂથોના ટુકડાઓ વારંવાર જોવા મળ્યા હતા. આ શોધ માત્ર ગ્લાયકોમ અને MALDI-TOF વિશ્લેષણમાં જોવા મળેલા વિભાજનની પુષ્ટિ કરતી નથી, પરંતુ પ્રીટ્રીટેડ લિગ્નોસેલ્યુલોસિક બાયોમાસમાં સંભવિત કાર્બોહાઇડ્રેટ ડેરિવેટિવ્ઝ વિશે નવી માહિતી પણ પ્રદાન કરે છે.
અમે TMS સુગર ડેરિવેટાઇઝેશનનો ઉપયોગ કરીને ઓલિગોસેકરાઇડ અપૂર્ણાંકની ખાંડ રચનાનું પણ વિશ્લેષણ કર્યું. GC-MS નો ઉપયોગ કરીને, અમે ઓલિગોસેકરાઇડ અપૂર્ણાંકમાં ન્યુરલ (નોન-ડેરિવેટિવ) અને એસિડિક શર્કરા (GluA અને GalA) ની રચના નક્કી કરી (આકૃતિ 5). ગ્લુકોરોનિક એસિડ એસિડિક ઘટકો C અને D માં જોવા મળે છે, જ્યારે ગેલેક્ટ્યુરોનિક એસિડ એસિડિક ઘટકો A અને B માં જોવા મળે છે, જે બંને એસિડિક શર્કરાના ઉચ્ચ DP ઘટકો છે. આ પરિણામો ફક્ત અમારા ELISA અને MALDI ડેટાની પુષ્ટિ કરતા નથી, પરંતુ ઓલિગોસેકરાઇડ સંચયના અમારા અગાઉના અભ્યાસો સાથે પણ સુસંગત છે. તેથી, અમે માનીએ છીએ કે ઓલિગોસેકરાઇડ્સના બાયોટીનાઇલેશન અને ત્યારબાદ ELISA સ્ક્રીનીંગનો ઉપયોગ કરીને આધુનિક રોગપ્રતિકારક પદ્ધતિઓ વિવિધ જૈવિક નમૂનાઓમાં દ્રાવ્ય રિકેલ્સિટ્રન્ટ ઓલિગોસેકરાઇડ્સ શોધવા માટે પૂરતી છે.
ELISA-આધારિત mAb સ્ક્રીનીંગ પદ્ધતિઓ ઘણી અલગ અલગ પદ્ધતિઓ દ્વારા માન્ય કરવામાં આવી હોવાથી, અમે આ નવી જથ્થાત્મક પદ્ધતિની સંભાવનાને વધુ શોધવા માંગતા હતા. બે વ્યાપારી ઓલિગોસેકરાઇડ્સ, ઝાયલોહેક્સાસેકરાઇડ ઓલિગોસેકરાઇડ (XHE) અને 23-α-L-અરાબીનોફ્યુરાનોસિલ-ઝાયલોટ્રિઓઝ (A2XX), કોષ દિવાલ ગ્લાયકેનને લક્ષ્ય બનાવતા નવા mAb અભિગમનો ઉપયોગ કરીને ખરીદવામાં આવ્યા હતા અને તેનું પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું. આકૃતિ 6 બાયોટીનાઇલેટેડ બંધનકર્તા સિગ્નલ અને ઓલિગોસેકરાઇડ સાંદ્રતાના લોગ સાંદ્રતા વચ્ચેનો રેખીય સહસંબંધ દર્શાવે છે, જે સંભવિત લેંગમુઇર શોષણ મોડેલ સૂચવે છે. mAbs માં, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, અને CCRC-M151 XHE સાથે સહસંબંધિત છે, અને CCRC-M108, CCRC-M109, અને LM11 1 nm થી 100 નેનોની શ્રેણીમાં A2XX સાથે સહસંબંધિત છે. પ્રયોગ દરમિયાન એન્ટિબોડીઝની મર્યાદિત ઉપલબ્ધતાને કારણે, દરેક ઓલિગોસેકરાઇડ સાંદ્રતા સાથે મર્યાદિત પ્રયોગો કરવામાં આવ્યા હતા. અહીં એ નોંધવું જોઈએ કે કેટલાક એન્ટિબોડીઝ સબસ્ટ્રેટ તરીકે સમાન ઓલિગોસેકરાઇડ પર ખૂબ જ અલગ રીતે પ્રતિક્રિયા આપે છે, સંભવતઃ કારણ કે તેઓ થોડા અલગ એપિટોપ્સ સાથે જોડાય છે અને ખૂબ જ અલગ બંધનકર્તા જોડાણો ધરાવી શકે છે. જ્યારે નવો mAb અભિગમ વાસ્તવિક નમૂનાઓ પર લાગુ કરવામાં આવશે ત્યારે સચોટ એપિટોપ ઓળખની પદ્ધતિઓ અને અસરો વધુ જટિલ હશે.
વિવિધ ગ્લાયકેન-ટાર્ગેટિંગ mAbs ની શોધ શ્રેણી નક્કી કરવા માટે બે વ્યાપારી ઓલિગોસેકરાઇડ્સનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. અહીં, ઓલિગોસેકરાઇડ સાંદ્રતાના લોગ સાંદ્રતા સાથે રેખીય સહસંબંધો (A) mAb સાથે XHE અને (B) mAb સાથે A2XX માટે લેંગમુઇર શોષણ પેટર્ન સૂચવે છે. અનુરૂપ એપિટોપ્સ પરીક્ષણમાં સબસ્ટ્રેટ તરીકે ઉપયોગમાં લેવાતા વ્યાપારી ઓલિગોસેકરાઇડ્સની રચનાઓ સૂચવે છે.
ગ્લાયકેન-લક્ષિત મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝ (ગ્લાયકોકોમિક વિશ્લેષણ અથવા ELISA-આધારિત mAb સ્ક્રીનીંગ) નો ઉપયોગ છોડના બાયોમાસ બનાવતા મોટાભાગના મુખ્ય કોષ દિવાલ ગ્લાયકેન્સના ઊંડાણપૂર્વકના લાક્ષણિકતા માટે એક શક્તિશાળી સાધન છે. જો કે, શાસ્ત્રીય ગ્લાયકેન વિશ્લેષણ ફક્ત મોટા કોષ દિવાલ ગ્લાયકેન્સનું લક્ષણ દર્શાવે છે, કારણ કે મોટાભાગના ઓલિગોસેકરાઇડ્સ ELISA પ્લેટો પર કાર્યક્ષમ રીતે સ્થિર થતા નથી. આ અભ્યાસમાં, AFEX-પ્રીટ્રીટેડ કોર્ન સ્ટોવરને ઉચ્ચ ઘન સામગ્રી પર એન્ઝાઇમેટિકલી હાઇડ્રોલાઇઝ્ડ કરવામાં આવ્યું હતું. હાઇડ્રોલાઇઝેટમાં રિકેલ્સિટ્રન્ટ કોષ દિવાલ કાર્બોહાઇડ્રેટ્સની રચના નક્કી કરવા માટે ખાંડ વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. જો કે, હાઇડ્રોલાઇઝેટ્સમાં નાના ઓલિગોસેકરાઇડ્સનું mAb વિશ્લેષણ ઓછું આંકવામાં આવે છે, અને ELISA પ્લેટો પર ઓલિગોસેકરાઇડ્સને અસરકારક રીતે સ્થિર કરવા માટે વધારાના સાધનોની જરૂર છે.
અમે અહીં ઓલિગોસેકરાઇડ બાયોટીનાઇલેશન અને ત્યારબાદ ન્યુટ્રાએવિડિન™ કોટેડ પ્લેટો પર ELISA સ્ક્રીનીંગને જોડીને mAb સ્ક્રીનીંગ માટે એક નવી અને કાર્યક્ષમ ઓલિગોસેકરાઇડ ઇમોબિલાઇઝેશન પદ્ધતિનો અહેવાલ આપીએ છીએ. સ્થાયી બાયોટીનાઇલેટેડ ઓલિગોસેકરાઇડ્સે એન્ટિબોડી માટે પૂરતું આકર્ષણ દર્શાવ્યું હતું જેથી રિકેલ્સિટ્રન્ટ ઓલિગોસેકરાઇડ્સની ઝડપી અને કાર્યક્ષમ શોધ શક્ય બને. માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી પર આધારિત આ હઠીલા ઓલિગોસેકરાઇડ્સની રચનાના વિશ્લેષણથી ઇમ્યુનોસ્ક્રીનિંગ માટેના આ નવા અભિગમના પરિણામોની પુષ્ટિ થઈ. આમ, આ અભ્યાસો દર્શાવે છે કે ઓલિગોસેકરાઇડ બાયોટીનાઇલેશન અને ELISA સ્ક્રીનીંગના ગ્લાયકેન-લક્ષિત મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝ સાથેના સંયોજનનો ઉપયોગ ઓલિગોસેકરાઇડ્સમાં ક્રોસલિંક્સ શોધવા માટે થઈ શકે છે અને ઓલિગોસેકરાઇડ્સની રચનાને દર્શાવતા અન્ય બાયોકેમિકલ અભ્યાસોમાં વ્યાપકપણે લાગુ કરી શકાય છે.
આ બાયોટિન-આધારિત ગ્લાયકેન પ્રોફાઇલિંગ પદ્ધતિ એ પ્રથમ રિપોર્ટ છે જે છોડના બાયોમાસમાં દ્રાવ્ય ઓલિગોસેકરાઇડ્સના રિકેલ્સીટ્રન્ટ કાર્બોહાઇડ્રેટ બોન્ડ્સની તપાસ કરવામાં સક્ષમ છે. આ બાયોફ્યુઅલ ઉત્પાદનની વાત આવે ત્યારે બાયોમાસના કેટલાક ભાગો આટલા હઠીલા કેમ છે તે સમજવામાં મદદ કરે છે. આ પદ્ધતિ ગ્લાયકોમ વિશ્લેષણ પદ્ધતિઓમાં એક મહત્વપૂર્ણ અંતર ભરે છે અને છોડના ઓલિગોસેકરાઇડ્સથી આગળ સબસ્ટ્રેટની વિશાળ શ્રેણીમાં તેનો ઉપયોગ વિસ્તૃત કરે છે. ભવિષ્યમાં, આપણે બાયોટીનાઇલેશન માટે રોબોટિક્સનો ઉપયોગ કરી શકીએ છીએ અને ELISA નો ઉપયોગ કરીને નમૂનાઓના ઉચ્ચ-થ્રુપુટ વિશ્લેષણ માટે આપણે વિકસાવેલી પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરી શકીએ છીએ.
પાયોનિયર 33A14 હાઇબ્રિડ બીજમાંથી ઉગાડવામાં આવેલ મકાઈના ભૂસા (CS) ને 2010 માં કોલોરાડોના રેમાં ક્રેમર ફાર્મ્સમાંથી કાપવામાં આવ્યો હતો. જમીન માલિકની પરવાનગીથી, આ બાયોમાસનો ઉપયોગ સંશોધન માટે કરી શકાય છે. આ નમૂનાઓ ઓરડાના તાપમાને ઝિપ-લોક બેગમાં 6% થી ઓછા ભેજવાળા સૂકા સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યા હતા. આ નમૂનાઓ ઓરડાના તાપમાને ઝિપ-લોક બેગમાં 6% થી ઓછા ભેજવાળા સૂકા સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યા હતા. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. નમૂનાઓ ઓરડાના તાપમાને ઝિપરવાળી બેગમાં <6% ભેજ પર સૂકા સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યા હતા.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥<6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. નમૂનાઓ ઝિપર બેગમાં ઓરડાના તાપમાને 6% થી ઓછા ભેજવાળા સંગ્રહિત થાય છે.આ અભ્યાસ સ્થાનિક અને રાષ્ટ્રીય માર્ગદર્શિકાનું પાલન કરે છે. NREL પ્રોટોકોલનો ઉપયોગ કરીને રચનાત્મક વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. આ રચનામાં 31.4% ગ્લુકન, 18.7% ઝાયલાન, 3.3% અરેબીનાન, 1.2% ગેલેક્ટન, 2.2% એસિટિલ, 14.3% લિગ્નીન, 1.7% પ્રોટીન અને 13.4% રાખ હોવાનું જાણવા મળ્યું હતું.
સેલિક® CTec2 (138 મિલિગ્રામ પ્રોટીન/મિલી, લોટ VCNI 0001) એ નોવોઝાઇમ્સ (ફ્રેન્કલિન્ટન, NC, USA) માંથી સેલ્યુલેઝ, β-ગ્લુકોસિડેઝ અને સેલિક® HTec2 (157 મિલિગ્રામ પ્રોટીન/મિલી, લોટ VHN00001) નું એક જટિલ મિશ્રણ છે. મલ્ટિફેક્ટ પેક્ટીનેઝ® (72 મિલિગ્રામ પ્રોટીન/મિલી), પેક્ટીન ડિગ્રેડિંગ એન્ઝાઇમનું એક જટિલ મિશ્રણ, ડ્યુપોન્ટ ઇન્ડસ્ટ્રિયલ બાયોસાયન્સ (પાલો અલ્ટો, CA, USA) દ્વારા દાન કરવામાં આવ્યું હતું. એન્ઝાઇમ પ્રોટીન સાંદ્રતા Kjeldahl નાઇટ્રોજન વિશ્લેષણ (AOAC પદ્ધતિ 2001.11, ડેરી વન કોઓપરેટિવ ઇન્ક., ઇથાકા, NY, USA) નો ઉપયોગ કરીને પ્રોટીન સામગ્રીનો અંદાજ (અને બિન-પ્રોટીન નાઇટ્રોજનના યોગદાનને બાદ કરીને) દ્વારા નક્કી કરવામાં આવી હતી. ડાયટોમેસિયસ અર્થ 545 EMD મિલિપોર (બિલેરિકા, MA) માંથી ખરીદવામાં આવ્યું હતું. સક્રિય કાર્બન (DARCO, 100 મેશ ગ્રાન્યુલ્સ), એવિસેલ (PH-101), બીચ ઝાયલાન, અને અન્ય તમામ રસાયણો સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ (સેન્ટ લૂઇસ, MO) પાસેથી ખરીદવામાં આવ્યા હતા.
AFEX પ્રીટ્રીટમેન્ટ GLBRC (બાયોમાસ કન્વર્ઝન રિસર્ચ લેબોરેટરી, MSU, લેન્સિંગ, MI, USA) ખાતે કરવામાં આવ્યું હતું. પ્રી-ટ્રીટમેન્ટ 140° સે. પર 15 મિનિટ માટે કરવામાં આવ્યું હતું. સ્ટેનલેસ સ્ટીલ બેન્ચટોપ બેચ રિએક્ટર (પાર ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટ્સ કંપની) માં 60% (w/w) લોડિંગ પર નિર્જળ એમોનિયા અને બાયોમાસના 1:1 ગુણોત્તરમાં 46 નિવાસ સમય. તેમાં 30 મિનિટ લાગી. રિએક્ટરને 140° સે. પર લાવવામાં આવ્યું અને એમોનિયા ઝડપથી મુક્ત કરવામાં આવ્યો, જેનાથી બાયોમાસ ઝડપથી ઓરડાના તાપમાને પાછો ફર્યો. AFEX પ્રી-ટ્રીટેડ કોર્ન સ્ટોવર (ACS) ની રચના સારવાર ન કરાયેલ કોર્ન સ્ટોવર (UT-CS) જેવી જ હતી.
ઓલિગોસેકરાઇડ્સના મોટા પાયે ઉત્પાદન માટે પ્રારંભિક સામગ્રી તરીકે ઉચ્ચ ઘન પદાર્થો ACSH 25% (w/w) (આશરે 8% ડેક્સ્ટ્રાન લોડિંગ) તૈયાર કરવામાં આવ્યું હતું. ACS નું એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસિસ સેલિક® Ctec2 10 મિલિગ્રામ પ્રોટીન/ગ્રામ ગ્લુકન (પ્રીટ્રીટેડ બાયોમાસમાં), Htec2 (નોવોઝાઇમ્સ, ફ્રેન્કલિન્ટન, NC), 5 મિલિગ્રામ પ્રોટીન/ગ્રામ ગ્લુકન અને મલ્ટિફેક્ટ પેક્ટીનેઝ (જેનેન્કોર ઇન્ક, યુએસએ) સહિત કોમર્શિયલ એન્ઝાઇમ મિશ્રણનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. ), 5 મિલિગ્રામ પ્રોટીન/ગ્રામ ડેક્સ્ટ્રાન. એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસિસ 5-લિટર બાયોરિએક્ટરમાં 3 લિટર, pH 4.8, 50°C અને 250 rpm ના કાર્યકારી વોલ્યુમ સાથે હાથ ધરવામાં આવ્યું હતું. 96 કલાક સુધી હાઇડ્રોલિસિસ પછી, હાઇડ્રોલિઝેટને 30 મિનિટ માટે 6000 rpm પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા અને પછી 30 મિનિટ માટે 14000 rpm પર બિનહાઇડ્રોલાઇઝ્ડ ઘન પદાર્થોને દૂર કરવા માટે એકત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું. ત્યારબાદ હાઇડ્રોલાઇઝેટને 0.22 મીમી ફિલ્ટર બીકર દ્વારા જંતુરહિત ગાળણક્રિયા કરવામાં આવી. ફિલ્ટર કરેલ હાઇડ્રોલાઇઝેટને 4° સે. તાપમાને જંતુરહિત બોટલોમાં સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યું અને પછી કાર્બન પર વિભાજિત કરવામાં આવ્યું.
NREL પ્રયોગશાળા વિશ્લેષણ પ્રક્રિયાઓ અનુસાર અર્ક-આધારિત બાયોમાસ નમૂનાઓની રચનાનું વિશ્લેષણ: રચના વિશ્લેષણ (NREL/TP-510-42620) માટે નમૂનાઓની તૈયારી અને બાયોમાસમાં માળખાકીય કાર્બોહાઇડ્રેટ્સ અને લિગ્નિનનું નિર્ધારણ (NREL/TP-510 – 42618)47.
ઓટોક્લેવ-આધારિત એસિડ હાઇડ્રોલિસિસ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને 2 મિલી સ્કેલ પર હાઇડ્રોલાઇઝેટ સ્ટ્રીમનું ઓલિગોસેકરાઇડ વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. 10 મિલી સ્ક્રુ કેપ કલ્ચર ટ્યુબમાં 72% સલ્ફ્યુરિક એસિડના 69.7 μl સાથે હાઇડ્રોલાઇઝેટ નમૂનાને ભેળવી દો અને 121 °C પર બેન્ચટોપ પર 1 કલાક માટે ઇન્ક્યુબેટ કરો, બરફ પર ઠંડુ કરો અને ઉચ્ચ પ્રદર્શન પ્રવાહી ક્રોમેટોગ્રાફી (HPLC) શીશીમાં ફિલ્ટર કરો. એસિડ-હાઇડ્રોલાઇઝ્ડ નમૂનામાં કુલ ખાંડ સાંદ્રતામાંથી બિન-હાઇડ્રોલાઇઝ્ડ નમૂનામાં મોનોસેકરાઇડ્સની સાંદ્રતાને બાદ કરીને ઓલિગોસેકરાઇડ્સની સાંદ્રતા નક્કી કરવામાં આવી હતી.
બાયો-રેડ એમીનેક્સ HPX-87H કોલમ પર ઓટોસેમ્પલર, કોલમ હીટર, આઇસોક્રેટિક પંપ અને રીફ્રેક્ટિવ ઇન્ડેક્સ ડિટેક્ટરથી સજ્જ શિમાડઝુ HPLC સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરીને એસિડ હાઇડ્રોલાઇઝ્ડ બાયોમાસમાં ગ્લુકોઝ, ઝાયલોઝ અને એરાબીનોઝ સાંદ્રતાનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું. કોલમને 50°C પર જાળવવામાં આવ્યું હતું અને પાણીના પ્રવાહમાં 0.6 મિલી/મિનિટ 5 mM H2SO4 સાથે એલ્યુટ કરવામાં આવ્યું હતું.
હાઇડ્રોલાઇઝેટ સુપરનેટન્ટને પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું અને મોનોમર અને ઓલિગોસેકરાઇડ સામગ્રી માટે વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. એન્ઝાઇમેટિક હાઇડ્રોલિસિસ પછી મેળવેલ મોનોમેરિક શર્કરાનું વિશ્લેષણ HPLC દ્વારા બાયો-રેડ (હર્ક્યુલસ, CA) એમીનેક્સ HPX-87P કોલમ અને એશ ગાર્ડ કોલમથી સજ્જ કરવામાં આવ્યું હતું. કોલમનું તાપમાન 80°C પર જાળવવામાં આવ્યું હતું, પાણીનો ઉપયોગ 0.6 મિલી/મિનિટના પ્રવાહ દર સાથે મોબાઇલ ફેઝ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો. રેફ. 41, 48, 49 માં વર્ણવેલ પદ્ધતિઓ અનુસાર 121°C પર ડાયલ્યુટ એસિડમાં હાઇડ્રોલિસિસ દ્વારા ઓલિગોસેકરાઇડ્સ નક્કી કરવામાં આવ્યા હતા.
સેકરાઇડ વિશ્લેષણ કાચા, AFEX પૂર્વ-સારવાર કરાયેલ અને બધા બિન-હાઇડ્રોલાઇઝ્ડ બાયોમાસ અવશેષો (સીરીયલ કોષ દિવાલ અર્કનું ઉત્પાદન અને તેમના mAb સ્ક્રીનીંગ સહિત) પર અગાઉ વર્ણવેલ પ્રક્રિયાઓ 27, 43, 50, 51 નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. ગ્લાયકોમ વિશ્લેષણ માટે, છોડ કોષ દિવાલ સામગ્રીના આલ્કોહોલ-અદ્રાવ્ય અવશેષો બાયોમાસ અવશેષોમાંથી તૈયાર કરવામાં આવે છે અને એમોનિયમ ઓક્સાલેટ (50 mM), સોડિયમ કાર્બોનેટ (50 mM અને 0.5% w/v), CON. (1M અને 4M, બંને 1% w/v સોડિયમ બોરોહાઇડ્રાઇડ સાથે) અને એસિડ ક્લોરાઇટ જેવા વધુને વધુ આક્રમક રીએજન્ટ્સ સાથે સીરીયલ નિષ્કર્ષણને આધિન કરવામાં આવે છે જેમ કે અગાઉ વર્ણવેલ52,53. ત્યારબાદ અર્કને કોષ દિવાલ ગ્લાયકેન તરફ નિર્દેશિત mAb50s ના જટિલ પેનલ સામે ELISA ને આધિન કરવામાં આવ્યા હતા, અને mAb બંધનકર્તા પ્રતિક્રિયાઓ ગરમીના નકશા તરીકે રજૂ કરવામાં આવી હતી. છોડ કોષ દિવાલ ગ્લાયકેનને લક્ષ્ય બનાવતા mAbs પ્રયોગશાળા સ્ટોક્સ (CCRC, JIM અને MAC શ્રેણી) માંથી ખરીદવામાં આવ્યા હતા.
ઓલિગોસેકરાઇડ્સનું એક-પગલાંનું બાયોટીનાઇલેશન. બાયોટિન-LC-હાઇડ્રેઝાઇડ સાથે કાર્બોહાઇડ્રેટ્સનું જોડાણ નીચેની પ્રક્રિયાનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. બાયોટિન-LC-હાઇડ્રેઝાઇડ (4.6 mg/12 μmol) ને ડાયમિથાઇલ સલ્ફોક્સાઇડ (DMSO, 70 μl) માં 65° C પર 1 મિનિટ માટે જોરશોરથી હલાવીને અને ગરમ કરીને ઓગાળવામાં આવ્યું હતું. ગ્લેશિયલ એસિટિક એસિડ (30 μl) ઉમેરવામાં આવ્યું હતું અને મિશ્રણને સોડિયમ સાયનોબોરોહાઇડ્રાઇડ (6.4 mg/100 μmol) પર રેડવામાં આવ્યું હતું અને લગભગ 1 મિનિટ માટે 65° C પર ગરમ કર્યા પછી સંપૂર્ણપણે ઓગાળી દેવામાં આવ્યું હતું. પછી, પ્રતિક્રિયા મિશ્રણના 5 થી 8 μl સૂકા ઓલિગોસેકરાઇડ (1-100 nmol) માં ઉમેરવામાં આવ્યું હતું જેથી ઘટાડતા છેડા પર લેબલનો 10 ગણો કે તેથી વધુ દાઢ વધારાનો ભાગ મેળવી શકાય. પ્રતિક્રિયા 2 કલાક માટે 65°C પર હાથ ધરવામાં આવી હતી, ત્યારબાદ નમૂનાઓ તરત જ શુદ્ધ કરવામાં આવ્યા હતા. લેબલિંગ પ્રયોગોમાં ઘટાડા વિના સોડિયમ સાયનોબોરોહાઇડ્રાઇડનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો ન હતો, અને નમૂનાઓને 2.5 કલાક માટે 65° સે. પર પ્રતિક્રિયા આપવામાં આવી હતી.
બાયોટીનાઇલેટેડ ઓલિગોસેકરાઇડ્સના નમૂનાઓનું ELISA કોટિંગ અને ધોવા. એવિડિન-કોટેડ પ્લેટના દરેક કૂવામાં 25 μl બાયોટીનાઇલેટેડ નમૂનાઓ (0.1 M ટ્રિસ બફર સોલ્યુશન (TBS) ના 5 મિલીમાં ભળેલ દરેક સાંદ્ર નમૂનાના 100 μl) ઉમેરવામાં આવ્યા. 0.1 M TBS માં 10 μg/ml ની સાંદ્રતા પર નિયંત્રણ કુવાઓને 50 μl બાયોટીનથી કોટ કરવામાં આવ્યા હતા. ખાલી માપન માટે ડીયોનાઇઝ્ડ પાણીનો ઉપયોગ કોટિંગ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો. ટેબ્લેટને ઓરડાના તાપમાને અંધારામાં 2 કલાક માટે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યું હતું. ગ્રેનિયર ફ્લેટ 3A માટે પ્રોગ્રામ નંબર 11 નો ઉપયોગ કરીને 0.1 M TBS માં 0.1% સ્કિમ્ડ દૂધથી પ્લેટને 3 વખત ધોઈ લો.
પ્રાથમિક એન્ટિબોડીઝ ઉમેરવા અને ધોવા. દરેક કૂવામાં 40 μl પ્રાથમિક એન્ટિબોડી ઉમેરો. માઇક્રોપ્લેટને ઓરડાના તાપમાને અંધારામાં 1 કલાક માટે ઉકાળો. ત્યારબાદ ગ્રેનિયર ફ્લેટ 3A માટે વોશ પ્રોગ્રામ #11 નો ઉપયોગ કરીને પ્લેટોને 0.1% દૂધ 0.1M TBS માં 3 વખત ધોવામાં આવી.
ગૌણ એન્ટિબોડી ઉમેરો અને ધોઈ લો. દરેક કૂવામાં ૫૦ μl ઉંદર/ઉંદર ગૌણ એન્ટિબોડી (૦.૧% દૂધમાં ૧:૫૦૦૦ ૦.૧ M TBS માં પાતળું) ઉમેરો. ઓરડાના તાપમાને અંધારામાં ૧ કલાક માટે માઇક્રોપ્લેટને ઉકાળો. ત્યારબાદ ગ્રેનિયર ફ્લેટ ૫A પ્લેટ વોશ પ્રોગ્રામ #૧૨ નો ઉપયોગ કરીને માઇક્રોપ્લેટ્સને ૦.૧% દૂધમાં ૦.૧ M TBS સાથે ૫ વખત ધોવામાં આવ્યા.
સબસ્ટ્રેટ ઉમેરી રહ્યા છીએ. બેઝ સબસ્ટ્રેટમાં 50 μl 3,3′,5,5′-ટેટ્રામેથાઈલબેન્ઝિડાઇન (TMB) ઉમેરો (15 મિલી ડીઆયોનાઇઝ્ડ પાણીમાં બફરના 2 ટીપાં, TMBના 3 ટીપાં, હાઇડ્રોજન પેરોક્સાઇડના 2 ટીપાં ઉમેરીને). TMB સબસ્ટ્રેટ તૈયાર કરો. અને ઉપયોગ કરતા પહેલા વમળ). માઇક્રોપ્લેટને ઓરડાના તાપમાને 30 મિનિટ માટે ઉકાળો. અંધારામાં.
પગલું પૂર્ણ કરો અને ટેબ્લેટ વાંચો. દરેક કૂવામાં 50 μl 1 N સલ્ફ્યુરિક એસિડ ઉમેરો અને ELISA રીડરનો ઉપયોગ કરીને 450 થી 655 nm સુધી શોષણ રેકોર્ડ કરો.
ડીયોનાઇઝ્ડ પાણીમાં આ વિશ્લેષકોના 1 મિલિગ્રામ/મિલી દ્રાવણ તૈયાર કરો: એરાબીનોઝ, રેમનોઝ, ફ્યુકોઝ, ઝાયલોઝ, ગેલેક્ટુરોનિક એસિડ (GalA), ગ્લુકોરોનિક એસિડ (GlcA), મેનોઝ, ગ્લુકોઝ, ગેલેક્ટોઝ, લેક્ટોઝ, N-એસીટીલમેનોસામાઇન (manNAc), N-એસીટીલગ્લુકોસામાઇન. (glcNAc), N-એસીટીલગેલેક્ટોસામાઇન (galNAc), ઇનોસિટોલ (આંતરિક ધોરણ). કોષ્ટક 1 માં બતાવેલ 1 મિલિગ્રામ/મિલી ખાંડના દ્રાવણ ઉમેરીને બે ધોરણો તૈયાર કરવામાં આવ્યા હતા. નમૂનાઓને -80° સે. પર સ્થિર કરવામાં આવે છે અને લ્યોફિલાઇઝ કરવામાં આવે છે જ્યાં સુધી બધું પાણી દૂર ન થાય (સામાન્ય રીતે લગભગ 12-18 કલાક).
વિશ્લેષણાત્મક સંતુલન પર સ્ક્રુ કેપ ટ્યુબમાં 100-500 µg નમૂના ઉમેરો. ઉમેરવામાં આવેલી રકમ રેકોર્ડ કરો. નમૂનાને દ્રાવકની ચોક્કસ સાંદ્રતામાં ઓગાળીને તેને પ્રવાહી એલિક્વોટ તરીકે ટ્યુબમાં ઉમેરવું શ્રેષ્ઠ છે. દરેક નમૂના ટ્યુબ માટે આંતરિક ધોરણ તરીકે 1 mg/ml ઇનોસિટોલના 20 µl નો ઉપયોગ કરો. નમૂનામાં ઉમેરવામાં આવેલા આંતરિક ધોરણની માત્રા પ્રમાણભૂત ટ્યુબમાં ઉમેરવામાં આવેલા આંતરિક ધોરણની માત્રા જેટલી જ હોવી જોઈએ.
સ્ક્રુ કેપ શીશીમાં 8 મિલી નિર્જળ મિથેનોલ ઉમેરો. પછી 4 મિલી 3 N. મિથેનોલિક HCl દ્રાવણ, ઢાંકીને હલાવો. આ પ્રક્રિયામાં પાણીનો ઉપયોગ થતો નથી.
ઓલિગોસેકરાઇડ નમૂનાઓ અને સ્ટાન્ડર્ડ TMS ટ્યુબમાં 500 μl 1 M HCl મિથેનોલ દ્રાવણ ઉમેરો. નમૂનાઓને થર્મલ બ્લોકમાં 80° સે. તાપમાને રાતોરાત (168 કલાક) ઉકાળવામાં આવ્યા હતા. મિથેનોલિસિસ ઉત્પાદનને ઓરડાના તાપમાને સૂકવવાના મેનીફોલ્ડનો ઉપયોગ કરીને સૂકવો. 200 μl MeOH ઉમેરો અને ફરીથી સૂકવો. આ પ્રક્રિયા બે વાર પુનરાવર્તિત થાય છે. નમૂનામાં 200 μl મિથેનોલ, 100 μl પાયરિડિન અને 100 μl એસિટિક એનહાઇડ્રાઇડ ઉમેરો અને સારી રીતે ભળી દો. નમૂનાઓને 30 મિનિટ માટે ઓરડાના તાપમાને ઉકાળવામાં આવ્યા હતા. અને સૂકવવામાં આવ્યા હતા. 200 μl મિથેનોલ ઉમેરો અને ફરીથી સૂકવો.
200 μl ટ્રાઇ-સિલ ઉમેરો અને 20 મિનિટ માટે ઢાંકેલી ટ્યુબને 80°C સુધી ગરમ કરો, પછી ઓરડાના તાપમાને ઠંડુ કરો. નમૂનાને લગભગ 50 μl ના જથ્થા સુધી વધુ સૂકવવા માટે ડ્રાયિંગ મેનીફોલ્ડનો ઉપયોગ કરો. એ નોંધવું મહત્વપૂર્ણ છે કે અમે નમૂનાઓને સંપૂર્ણપણે સૂકવવા દીધા નથી.
2 મિલી હેક્સેન ઉમેરો અને વમળ દ્વારા સારી રીતે મિક્સ કરો. 5-3/4 ઇંચ વ્યાસવાળા પીપેટની ઉપર કાચની ઊન દાખલ કરીને પાશ્ચર પીપેટ્સ (5-8 મીમી) ની ટોચને કાચની ઊનના ટુકડાથી ભરો. નમૂનાઓને 2 મિનિટ માટે 3000 ગ્રામ પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યા હતા. કોઈપણ અદ્રાવ્ય અવશેષો અવક્ષેપિત થાય છે. નમૂનાને 100-150 µl સુધી સૂકવો. 80 °C ના પ્રારંભિક તાપમાન અને 2.0 મિનિટના પ્રારંભિક સમય પર GC-MS માં આશરે 1 μl નું પ્રમાણ ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યું હતું (કોષ્ટક 2).