Mahalo no kou kipa ʻana iā Nature.com.ʻO ka polokalamu kele pūnaewele āu e hoʻohana nei he kākoʻo CSS kaupalena.No ka ʻike maikaʻi loa, manaʻo mākou e hoʻohana i kahi polokalamu kele pūnaewele hou (a i ʻole e hoʻopau i ke ʻano Compatibility Mode ma Internet Explorer).I kēia manawa, e hōʻoia i ke kākoʻo mau ʻana, e hāʻawi mākou i ka pūnaewele me ka ʻole o nā ʻano a me JavaScript.
Pono ka ʻōnaehana in vitro hilinaʻi e hiki ke hana hou i ke ʻano physiological o ka puʻuwai no ka hoʻāʻo ʻana i ka lāʻau.ʻO ka loaʻa ʻana o nā ʻōnaehana moʻomeheu puʻuwai kanaka i alakaʻi i ka wehewehe pololei ʻole o nā hopena lāʻau lapaʻau naʻau.Maʻaneʻi, ua hoʻomohala mākou i kahi ʻano moʻomeheu cardiac tissue culture (CTCM) e hoʻoulu ai i ka electromechanically i nā ʻāpana puʻuwai a loaʻa i ka hoʻolōʻihi physiological i ka wā systolic a me ka diastolic phases o ka pōʻai cardiac.Ma hope o 12 mau lā o ka moʻomeheu, ua hoʻomaikaʻi iki kēia ala i ka hiki ʻana o nā ʻāpana puʻuwai, akā ʻaʻole i mālama pono i ko lākou ʻano pono.No laila, ma hope o ka nānā ʻana i nā mole liʻiliʻi, ua ʻike mākou ʻo ka hoʻohui ʻana o 100 nM triiodothyronine (T3) a me 1 μM dexamethasone (Dex) i kā mākou kikowaena mālama i ka microstructure o nā ʻāpana no nā lā 12.Ma ka hui pū ʻana me ka mālama ʻana iā T3/Dex, ua mālama ka ʻōnaehana CTCM i nā moʻolelo transcriptional, viability, metabolic activity, and structural integrity ma ka pae like me ka puʻuwai hou no nā lā 12.Eia kekahi, ʻo ka hoʻolōʻihi nui ʻana o ka ʻiʻo cardiac i ka moʻomeheu e hoʻoulu i ka hōʻailona cardiac hypertrophic, e hāʻawi ana i nā hōʻike no ka hiki o CTCM ke hoʻohālike i nā kūlana hypertrophic i hoʻoulu ʻia e ka puʻuwai puʻuwai.I ka hopena, hiki i ka CTCM ke hoʻohālike i ka physiology a me ka pathophysiology o ka naʻau i ka moʻomeheu i nā manawa lōʻihi, e hiki ai ke nānā pono i ka lāʻau lapaʻau.
Ma mua o ka noiʻi lapaʻau, pono ʻia nā ʻōnaehana in vitro hiki ke hoʻopuka pololei i ka ʻōnaehana physiological o ka puʻuwai kanaka.Pono ia mau ʻōnaehana e hoʻohālike i ka hoʻololi ʻana i ka mechanical stretch, heart rate, a me nā waiwai electrophysiological.Hoʻohana maʻamau ʻia nā ʻano holoholona ma ke ʻano he papa screening no ka physiology cardiac me ka liʻiliʻi o ka hilinaʻi i ka noʻonoʻo ʻana i nā hopena o nā lāʻau lapaʻau i loko o ka puʻuwai kanaka1,2.ʻO ka hope loa, ʻo ka Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) he kumu hoʻohālike i koʻikoʻi a kikoʻī no nā ʻano hana lapaʻau a me nā lāʻau lapaʻau, e hoʻopuka pololei ana i ka physiology a me ka pathophysiology o ka puʻuwai kanaka3.ʻO ka loaʻa ʻole o ia ʻōnaehana e kaupalena i ka loaʻa ʻana o nā lāʻau lapaʻau hou no ka pau ʻole o ka naʻau4,5 a ua alakaʻi i ka cardiotoxicity lāʻau i kumu nui no ka haʻalele ʻana i ka mākeke6.
I loko o nā makahiki he ʻumi i hala iho nei, ua hoʻihoʻi ʻia nā lāʻau lapaʻau non-cardiovascular mai ka hoʻohana lāʻau lapaʻau no ka mea e hoʻolōʻihi ʻia ka manawa QT e alakaʻi ana i ka ventricular arrhythmias a me ka make koke.No laila, ke hoʻonui nei ka pono no nā hoʻolālā screening preclinical pono e loiloi i ka pono cardiovascular a me nā mea ʻona.ʻO ka hoʻohana hou ʻana i nā cardiomyocytes pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPS-CM) i ka nānā ʻana i ka lāʻau lapaʻau a me ka hoʻāʻo ʻana i nā mea ʻawaʻawa e hāʻawi i kahi hopena ʻāpana i kēia pilikia.Eia nō naʻe, ʻo ke ʻano oʻo ʻole o ka hiPS-CMs a me ka nele o ka paʻakikī multicellular o ka ʻiʻo cardiac nā palena nui o kēia ʻano.Ua hōʻike ʻia nā haʻawina hou e hiki ke hoʻopau ʻia kēia palena ma o ka hoʻohana ʻana i ka hiPS-CM mua e hana i nā hydrogels ʻiʻo cardiac ma hope koke o ka hoʻomaka ʻana o nā kuʻekuʻe kūʻokoʻa a me ka hoʻonui ʻana i ka hoʻoulu uila i ka manawa.Eia naʻe, nele kēia mau hiPS-CM microtissues i nā waiwai electrophysiological a contractile o ka myocardium makua.Eia kekahi, ʻoi aku ka paʻakikī o ka ʻiʻo naʻau o ke kanaka, ʻo ia ka hui heterogeneous o nā ʻano cell like ʻole, me nā cell endothelial, neurons, a me stromal fibroblasts, i hoʻopili ʻia e nā pūʻulu kikoʻī o nā protein matrix extracellular.ʻO kēia heterogeneity o non-cardiomyocyte populations11,12,13 i loko o ka puʻuwai mammalian makua he mea pale nui ia i ka hoʻohālikelike ʻana i ka ʻiʻo cardiac me ka hoʻohana ʻana i nā ʻano kelepona pākahi.Hoʻomaopopo kēia mau palena nui i ke koʻikoʻi o ka hoʻomohala ʻana i nā ala no ka hoʻoulu ʻana i ka ʻiʻo myocardial intact ma lalo o nā kūlana physiological a pathological.
Ua ʻike ʻia nā ʻāpana lahilahi (300 µm) o ka puʻuwai kanaka he kumu hoʻohālike o ka myocardium kanaka.Hāʻawi kēia ʻano hana i kahi ʻōnaehana 3D multicellular piha e like me ka ʻiʻo puʻuwai kanaka.Eia nō naʻe, a hiki i ka makahiki 2019, ua kaupalena ʻia ka hoʻohana ʻana i nā ʻāpana naʻau moʻomeheu e ke ola moʻomeheu pōkole (24 h).ʻO kēia ma muli o nā kumu he nui e like me ka nele o ke kino-mechanical stretch, ka ea-wai interface, a me ka hoʻohana ʻana i nā media maʻalahi i kākoʻo ʻole i nā pono o ka ʻiʻo cardiac.I ka makahiki 2019, ua hōʻike kekahi mau pūʻulu noiʻi i ka hoʻopili ʻana i nā mea mechanical i loko o nā ʻōnaehana moʻomeheu cardiac tissue hiki ke hoʻonui i ke ola moʻomeheu, hoʻomaikaʻi i ka hōʻike ʻana o ka naʻau, a hoʻohālikelike i ka pathology cardiac.ʻElua mau haʻawina nani 17 a me 18 e hōʻike ana he hopena maikaʻi ka hoʻouka mīkini uniaxial i ka phenotype cardiac i ka wā moʻomeheu.Eia naʻe, ʻaʻole i hoʻohana kēia mau haʻawina i ka hoʻouka ʻana i ka physico-mechanical ʻekolu-dimensional o ka pōʻai cardiac, no ka mea, ua hoʻouka ʻia nā ʻāpana puʻuwai me nā mana isometric tensile 17 a i ʻole linear auxotonic loading 18.ʻO kēia mau ʻano o ka hoʻolōʻihi ʻana i ka ʻiʻo ka hopena i ka hoʻopau ʻana i nā genes cardiac he nui a i ʻole ka overexpression o nā genes e pili ana i nā pane kikoʻī ʻole.ʻO ka mea nui, ʻo Pitoulis et al.Ua hoʻomohala ʻo 19 i kahi ʻauʻau moʻomeheu ʻāpana puʻuwai ikaika no ke kūkulu hou ʻana i ka pōʻai puʻuwai me ka hoʻohana ʻana i ka manaʻo transducer ikaika a me nā hoʻokele hoʻopaʻapaʻa.ʻOiai e ʻae kēia ʻōnaehana i ka hoʻohālikelike ʻana i ka pōʻaiapili puʻuwai in vitro, ʻo ka paʻakikī a me ka haʻahaʻa haʻahaʻa o ke ala e kaupalena ʻia ai ka noi o kēia ʻōnaehana.Ua hoʻomohala hou kā mākou hale hana i kahi ʻōnaehana moʻomeheu maʻalahi e hoʻohana ana i ka hoʻoulu ʻana i ka uila a me kahi ʻano i hoʻopaʻa ʻia e mālama i ka hiki ʻana o nā ʻāpana o ka puaʻa a me ka puʻuwai kanaka a hiki i 6 mau lā20,21.
I loko o ka manuscript o kēia manawa, wehewehe mākou i kahi ʻano moʻomeheu cardiac tissue culture (CTCM) me ka hoʻohana ʻana i nā ʻāpana o ka puʻuwai puaʻa e hoʻopili ana i nā cues humoral e hoʻopaʻa hou i ka physiology cardiac ʻekolu-dimensional a me ka distension pathophysiological i ka wā o ka pōʻai cardiac.Hiki i kēia CTCM ke hoʻonui i ka pololei o ka wānana lāʻau pre-clinical i kahi pae i loaʻa ʻole ma mua o ka hoʻolako ʻana i kahi ʻōnaehana cardiac kumu kūʻai, mid-throughput e hoʻohālike i ka physiology / pathophysiology o ka puʻuwai mammalian no ka hoʻāʻo ʻana i ka lāʻau lapaʻau pre-clinical.
He mea koʻikoʻi nā hōʻailona mechanical hemodynamic i ka mālama ʻana i ka hana cardiomyocyte in vitro 22,23,24.Ma ka manuscript o kēia manawa, ua hoʻomohala mākou i kahi CTCM (Figure 1a) hiki ke hoʻohālikelike i ke ʻano o ka naʻau o ke kanaka makua ma o ka hoʻoulu ʻana i ka uila a me ka mechanical stimulation i nā alapine physiological (1.2 Hz, 72 beats i kēlā me kēia minuke).I mea e pale aku ai i ka nui o ke kiko i ka wā diastole, ua hoʻohana ʻia kahi mea paʻi 3D e hoʻonui i ka nui o ka ʻiʻo e 25% (Fig. 1b).Ua hoʻomaka ʻia ka wikiwiki uila e ka ʻōnaehana C-PACE e hoʻomaka i ka 100 ms ma mua o ka systole me ka hoʻohana ʻana i kahi ʻōnaehana loaʻa ʻikepili e hana hou i ka pōʻai puʻuwai.Hoʻohana ka ʻōnaehana moʻomeheu i ka polokalamu pneumatic actuator (LB Engineering, Kelemānia) e hoʻonui i kahi membrane silicone maʻalahi e hoʻonui ai i nā ʻāpana puʻuwai ma ke keʻena luna.Hoʻopili ʻia ka ʻōnaehana i kahi laina ea waho ma o ka transducer kaomi, i hiki ai ke hoʻoponopono pololei i ke kaomi (± 1 mmHg) a me ka manawa (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Hoʻopili i ka ʻāpana kiko i ke apo kākoʻo 7 mm, i hōʻike ʻia i ka uliuli, i loko o ke keʻena moʻomeheu o ka mea hana.Hoʻokaʻawale ʻia ke keʻena moʻomeheu mai ke keʻena ea e kahi membrane silicone maʻalahi.E kau i kahi pahu ma waena o kēlā me kēia keʻena e pale ai i ka leak.Aia i loko o ka po'i o ka hāme'a nā electrodes graphite e hā'awi i ka ho'oulu uila.b Hōʻike hoʻohālike o ka mea ʻiʻo nui, ke apo alakaʻi a me ke apo kākoʻo.Hoʻokomo ʻia nā ʻāpana kiko (ʻulaʻula) ma luna o ka mea nui me ke apo alakaʻi i hoʻokomo ʻia i loko o ke awāwa ma ka ʻaoʻao o waho o ka hāmeʻa.Me ka hoʻohana ʻana i ke alakaʻi, e kau pono i ke apo kākoʻo i uhi ʻia me ka ʻili acrylic adhesive ma luna o ka ʻāpana o ka ʻiʻo naʻau.c Kipi e hōʻike ana i ka manawa o ka hoʻoulu ʻana i ka uila ma ke ʻano he hana o ke kaomi o ke keʻena ea i hoʻomalu ʻia e kahi polokalamu pneumatic actuator (PPD).Ua hoʻohana ʻia kahi mea ʻike ʻikepili e hoʻohui i ka hoʻoulu uila me ka hoʻohana ʻana i nā mea ʻike kaomi.Ke piʻi ka paʻi i loko o ke keʻena moʻomeheu i ka paepae i hoʻonohonoho ʻia, hoʻouna ʻia kahi hōʻailona pulse i ka C-PACE-EM e hoʻoulu i ka hoʻoulu uila.d Kiʻi o ʻehā CTCM i kau ʻia ma kahi papa incubator.Hoʻopili ʻia nā mea ʻehā i hoʻokahi PPD ma o kahi kaapuni pneumatic, a ua hoʻokomo ʻia nā mea ʻike kaomi i loko o ka valve hemostatic e nānā i ke kaomi i loko o ke kaapuni pneumatic.Loaʻa i kēlā me kēia mea hana ʻeono mau ʻāpana kiko.
Ke hoʻohana nei i hoʻokahi mea hana pneumatic, hiki iā mākou ke hoʻomalu i nā mea hana 4 CTCM, hiki i kēlā me kēia mea ke hoʻopaʻa i nā ʻāpana kiko 6 (Fig. 1d).Ma CTCM, ua hoʻololi ʻia ke kaomi ea i loko o ke keʻena ea i ke kaomi synchronous i loko o ke keʻena wai a hoʻoulu i ka hoʻonui physiological o ka ʻāpana puʻuwai (Figure 2a a me ke Kiʻiʻoniʻoni Hoʻohui 1).ʻO ka loiloi o ka kikoo kiko ma 80 mm Hg.Art.hōʻike i ka hohola ʻana o nā ʻāpana kiko e 25% (Fig. 2b).Ua hōʻike ʻia kēia pākēneka e pili ana i kahi sarcomere physiological lōʻihi o 2.2-2.3 µm no ka contractility pauku cardiac maʻamau17,19,25.Ua loiloi ʻia ka neʻe ʻana o ka ʻili me ka hoʻohana ʻana i nā hoʻonohonoho kāmela maʻamau (Supplementary Figure 1).ʻO ka amplitude a me ka wikiwiki o ka neʻe ʻana o ka ʻiʻo (Fig. 2c, d) pili i ka hoʻolōʻihi ʻana i ka wā o ka puʻuwai puʻuwai a me ka manawa i ka systole a me ka diastole (Fig. 2b).ʻO ke kikoo a me ka wikiwiki o ka ʻiʻo cardiac i ka wā o ka ʻoki ʻana a me ka hoʻomaha ʻana i mau no nā lā 12 i ka moʻomeheu (Fig. 2f).No ka loiloi i ka hopena o ka hoʻoulu ʻana i ka uila i ka contractility i ka wā moʻomeheu, ua hoʻomohala mākou i kahi ala no ka hoʻoholo ʻana i ka deformity hana me ka hoʻohana ʻana i kahi algorithm shading (Supplementary Fig. 2a, b) a ua hiki ke hoʻokaʻawale i waena o nā deformities me ka ʻole o ka hoʻoulu uila.ʻO ka māhele like o ka puʻuwai (Fig. 2f).Ma ka ʻāpana hoʻoneʻe o ka ʻoki (R6-9), ʻo ka volta i ka wā o ka hoʻoulu uila he 20% kiʻekiʻe ma mua o ka loaʻa ʻole o ka hoʻoulu uila, e hōʻike ana i ka hāʻawi ʻana o ka hoʻoulu uila i ka hana contractile.
Ua hōʻoia nā ʻāpana o ke kaomi o ke keʻena ea, ke kaomi ʻana o ke keʻena wai, a me nā ana neʻe ʻana o ka ʻiʻo e hoʻololi ke kaomi o ke keʻena i ke kaomi ʻana o ke keʻena wai, me ka neʻe ʻana o ka ʻāpana kiko.b Nā ʻāpana hōʻike o ka pākēneka kikoo (uliuli) o nā ʻāpana ʻiʻo e pili ana i ka pākēneka o ke kiko (alani).c Ua kūlike ka neʻe ana o ka ʻāpana puʻuwai me ka wikiwiki o ka neʻe ʻana.(d) Nā alahele o ka neʻe ʻana o ka pōʻai (laina uliuli) a me ka wikiwiki (laina kiko ʻalani) i loko o kahi ʻāpana o ka puʻuwai.e Ka helu o ka manawa pōʻai (n = 19 mau ʻāpana no kēlā me kēia hui, mai nā puaʻa like ʻole), ka manawa hoʻokaʻawale (n = 19 mau ʻāpana i kēlā me kēia hui), ka manawa hoʻomaha (n = 19 mau ʻāpana no kēlā me kēia hui, mai nā puaʻa like ʻole), ka neʻe ʻana o ke kino (n = 25).ʻāpana)/hui mai nā puaʻa like ʻole), ka wikiwiki systolic kiʻekiʻe (n = 24(D0), 25(D12) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole) a me ka helu hoʻomaha kiʻekiʻe (n=24(D0), 25(D12) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole).ʻAʻohe ʻokoʻa koʻikoʻi o ka hoʻāʻo ʻana o ka Haumāna ʻelua huelo ma kekahi ʻāpana.f Ka nānā 'ana i nā 'āpana 'ula'ula me ka ho'oulu uila 'ole (uliuli), he 'umi 'āpana 'āpana o nā māhele kiko mai ka pauku like.Hōʻike nā ʻaoʻao lalo i ka helu o ka pākēneka o ka ʻokoʻa o ke kaila ma nā ʻāpana kiko me ka hoʻoulu ʻana i ka uila ma nā wahi he ʻumi mai nā ʻāpana like ʻole. (n = 8 mau ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, Hana ʻia ka hoʻāʻo t-haumāna ʻelua; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 mau ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, Hana ʻia ka hoʻāʻo t-haumāna ʻelua; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, ʻelua-huelo ho'āʻo Haumana; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 ʻāpana/hui, mai nā puaʻa like ʻole, ʻelua-huelo hōʻike haumāna haumāna; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Hōʻike nā pahu kuhi i ka mean ± ka hoʻokaʻawale maʻamau.
I kā mākou ʻōnaehana moʻomeheu static biomimetic heart slice [20, 21], mālama mākou i ka viability, hana, a me ka hoʻonohonoho pono o nā ʻāpana puʻuwai no nā lā 6 ma o ka hoʻohana ʻana i ka hoʻoulu uila a me ka hoʻonui ʻana i ka haku mele.Eia naʻe, ma hope o 10 mau lā, ua hāʻule nui kēia mau helu.E nānā mākou i nā ʻāpana i hoʻomaʻamaʻa ʻia i kā mākou ʻōnaehana moʻomeheu biomimetic static mua 20, 21 mau kūlana mana (Ctrl) a e hoʻohana mākou i kā mākou mea i hoʻopaʻa ʻia ma mua e like me nā kūlana MC a me ka moʻomeheu ma lalo o ka hoʻoulu ʻana i ka mechanical a me ka uila (CTCM).kāhea ʻia .ʻO ka mea mua, ua hoʻoholo mākou he lawaʻole ka hoʻouluʻana i ka mechanical me ka hoʻouluʻana i ka uila no ka mālamaʻana i ka ola kino no nā lā 6 (Supplementary Fig. 3a,b).ʻO ka mea e mahalo ai, me ka hoʻokomoʻana i ka physio-mechanical a me ka hoʻoulu uila me ka STCM, ua mau ka viability o nā māhele puʻuwai 12-lā e like me nā'āpana puʻuwai hou ma lalo o nā kūlana MS, akā,ʻaʻole ma lalo o nā kūlana Ctrl, e like me ka hōʻikeʻana o ka MTT analysis (Fig. 1).3a).Hōʻike kēia i ka hoʻoulu ʻana i ka mechanical a me ka simulation o ka pōʻai cardiac hiki ke mālama i nā ʻāpana kiko i ʻelua mau manawa i hōʻike ʻia ma kā mākou ʻōnaehana moʻomeheu static mua.Eia naʻe, ʻo ka loiloi ʻana i ka paʻa o nā ʻāpana kiko ma o ka immunolabeling o ka cardiac troponin T a me ka connexin 43 i hōʻike i ka ʻōlelo connexin 43 i ʻoi aku ka kiʻekiʻe ma nā kiko MC ma ka lā 12 ma mua o nā mana i ka lā hoʻokahi.Eia naʻe, ʻaʻole i mālama pono ʻia ka ʻōlelo connexin 43 a me ka hoʻokumu Z-disc (Fig. 3b).Hoʻohana mākou i kahi hoʻolālā naʻauao (AI) no ka helu ʻana i ka integrity structural tissue26, kahi pipeline aʻo hohonu e pili ana i ke kiʻi e pili ana i ka troponin-T a me ka connexin staining43 e hoʻopaʻa ʻokoʻa i ka pono o ka hana a me ka fluorescence o nā ʻāpana puʻuwai e pili ana i ka ikaika o ka localization.Ke hoʻohana nei kēia ʻano hana i kahi Convolutional Neural Network (CNN) a me kahi hoʻolālā aʻo hohonu e hoʻohālikelike pono i ka paʻa o ka ʻiʻo cardiac ma ke ʻano automated a me ka ʻole, e like me ka mea i wehewehe ʻia ma ka kuhikuhi.26. Ua hōʻike ka ʻiʻo MC i ka hoʻomaikaʻi ʻana i ke ʻano like me ka lā 0 i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana mana static.Eia hou, ua hōʻike ʻo Masson's trichrome staining i ka haʻahaʻa haʻahaʻa haʻahaʻa o ka fibrosis ma lalo o nā kūlana MS i hoʻohālikelike ʻia i nā kūlana hoʻomalu i ka lā 12 o ka moʻomeheu (Fig. 3c).ʻOiai ua hoʻonui ʻo CTCM i ka hiki ʻana o nā ʻāpana o ka naʻau i ka lā 12 i kahi pae like me ka ʻiʻo o ka naʻau hou, ʻaʻole ia i hoʻomaikaʻi maikaʻi i ka paʻa o nā ʻāpana naʻau.
Hōʻike ka pakuhi Bar i ka helu ʻana o ka hiki ʻana o ka MTT o nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) a i ʻole ka moʻomeheu ʻāpana puʻuwai no 12 mau lā ma ka moʻomeheu static (D12 Ctrl) a i ʻole ma CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) ʻāpana/hui i hoʻohālikelike ʻia me ka D##0 puaʻa. **p <0.01 hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). Hōʻike ka pakuhi Bar i ka nui o ka MTT ola o nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) a i ʻole ka moʻomeheu ʻāpana puʻuwai no 12 mau lā ma ka moʻomeheu static (D12 Ctrl) a i ʻole ma CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) nā ʻāpana/hui i hoʻohālikelike ʻia ʻo AN##0. a me **p <0.01 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl).hōʻike ka histogram i ka helu o ka hiki ʻana o nā ʻāpana puʻuwai hou MTT (D0) a i ʻole ka moʻomeheu o nā ʻāpana naʻau no 12 mau lā ma ka moʻomeheu static (D12 control) a i ʻole CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 control).####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 hoʻohālikelike ʻia me D0 a me **p <0.01 hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切年片(D0) 幇(D0) 片12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与 <1 D0 ， 盎是0 D0 ， ##0 我 切片相比，**p < 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切) 中新鲜心脏切)片(D12 MC)猇(D0) 12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)histogram e hōʻike ana i ka nui o ka MTT viability ma nā ʻāpana naʻau hou (D0) a i ʻole nā ​​​​ʻāpana naʻau i moʻomeheu no 12 mau lā ma ka moʻomeheu static (D12 control) a i ʻole CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 control)), 12 (D12 MC) ʻāpana/hui mai nā ʻano puaʻa like ʻole, hoʻokahi ʻaoʻao ANOVA;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0, **p < 0.01 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl).b Troponin-T ('ōmaʻomaʻo), connexin 43 (ʻulaʻula) a me DAPI (uliuli) ma nā ʻāpana puʻuwai i hoʻokaʻawale hou ʻia (D0) a i ʻole nā ​​​​ʻāpana puʻuwai i moʻomeheu ʻia ma lalo o nā kūlana static (Ctrl) a i ʻole nā ​​kūlana CTCM (MC) no nā lā 12) o nā kiʻi immunofluorescence hōʻikeʻike (palākiō = 100 µm). ʻO ka helu ʻana o ka naʻau akamai o ka ʻili o ka naʻau (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ʻāpana/hui i kēlā me kēia puaʻa like ʻole, hana ʻia kahi hoʻokolohua ANOVA; ####p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ****p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). ʻO ka helu ʻana o ka naʻau o ka puʻuwai (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) nā ʻāpana/hui i kēlā me kēia mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia kahi hoʻokolohua ANOVA; ####p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ****p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). LIKE LIKE LIKE зных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению Ctrlс D12). ʻO ka helu o ka paʻa pono o ka puʻuwai puʻuwai e ka naʻauao (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ʻāpana / pūʻulu mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi;人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ʻāpana/hui o kēlā me kēia puaʻa like ʻole, hoʻāʻo ANOVA ʻaoʻao hoʻokahi;####00 玸0. 001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ʻāpana/hui o kēlā me kēia puaʻa like ʻole, hoʻāʻo ANOVA ʻaoʻao hoʻokahi;##p00 < 0.****p ， ##p 0. 001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), Ctrl7 (D12) у каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12). Naʻauao akamai e hoʻohālikelike i ka paʻa o ke kino o ka naʻau (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ʻāpana / hui i kēlā me kēia puaʻa like ʻole, hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi; c Nā kiʻi makaʻāinana (hema) a me ka helu ʻana (ʻākau) no nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka stain trichrome o Masson (Scale bare = 500 µm) (n = 10 ʻāpana/hui kēlā me kēia mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi; ####p <0.0001 hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ***p1 <0.00). c Nā kiʻi makaʻāinana (hema) a me ka helu ʻana (ʻākau) no nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka ʻili trichrome o Masson (Scale bare = 500 µm) (n = 10 ʻāpana/hui kēlā me kēia mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi; #### p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ***ptr <0.0. c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, ытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных посвиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 D по синей, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 D по синев <1 ***0нсе нию с D12 Ctrl). c Nā kiʻi makaʻāinana (hema) a me ka helu ʻana (ʻākau) o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka ʻili trichrome o Masson (uncoated scale = 500 µm) (n = 10 pauku/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi; #### p <0 .0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ***p <0.001). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度（裸尺度 （裸尺度 （尺0 度片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D1 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸度500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 Anova 测##00； 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测##01； 测##0；0. p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихроямным красите5чарсите мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсио ;## 0 позаго;#0 нлиосио ;## нению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Nā kiʻi makaʻāinana (hema) a me ka helu ʻana (ʻākau) o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka stain trichrome a Masson (blank = 500 µm) (n = 10 pauku/hui, kēlā me kēia mai ka puaʻa ʻokoʻa, i hoʻāʻo ʻia e ka nānā ʻana o ka ʻokoʻa ;### # p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0, ***ptr <0.1).Hōʻike nā pahu kuhi i ka mean ± ka hoʻokaʻawale maʻamau.
Manaʻo mākou ma ka hoʻohui ʻana i nā molekala liʻiliʻi i ka moʻomeheu moʻomeheu, hiki ke hoʻomaikaʻi ʻia ka pono cardiomyocyte a hoʻemi ʻia ka ulu ʻana o ka fibrosis i ka wā o ka moʻomeheu CTCM.No laila, ua nānā mākou no nā mole liʻiliʻi me ka hoʻohana ʻana i kā mākou mau moʻomeheu static control20,21 ma muli o ka liʻiliʻi o nā kumu hoʻohālikelike.Ua koho ʻia ʻo Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), a me SB431542 (SB) no kēia pale.Ua hoʻohana mua ʻia kēia mau molekala liʻiliʻi i nā moʻomeheu hiPSC-CM e hoʻoulu i ka maturation o nā cardiomyocytes ma o ka hoʻonui ʻana i ka lōʻihi sarcomere, T-tubules, a me ka wikiwiki conduction.Eia kekahi, ʻike ʻia ʻo Dex (a glucocorticoid) a me SB e hoʻopau i ka mumū29,30.No laila, ua hoʻāʻo mākou inā ʻo ka hoʻokomo ʻana o hoʻokahi a i ʻole ka hui pū ʻana o kēia mau molekele liʻiliʻi e hoʻomaikaʻi i ka paʻa o nā ʻāpana puʻuwai.No ka nānā mua ʻana, ua koho ʻia ka nui o kēlā me kēia pūhui e pili ana i nā manaʻo i hoʻohana mau ʻia i nā hiʻohiʻona moʻomeheu cell (1 μM Dex27, 100 nM T327, a me 2.5 μM SB31).Ma hope o 12 mau lā o ka moʻomeheu, ʻo ka hui pū ʻana o T3 a me Dex i hopena i ka pono o ka cardiomyocyte structural integrity a me ka liʻiliʻi fibrous remodeling (Supplementary Figures 4 a me 5).Eia hou, hoʻohana ʻelua a pālua paha i kēia mau manaʻo o T3 a me Dex i hana i nā hopena deleterious i hoʻohālikelike ʻia i nā ʻano maʻamau (Supplementary Fig. 6a,b).
Ma hope o ka nānā mua ʻana, ua hana mākou i kahi hoʻohālikelike poʻo i ke poʻo o nā kūlana moʻomeheu 4 (Figure 4a): Ctrl: nā ʻāpana naʻau i hoʻomaʻamaʻa ʻia i kā mākou moʻomeheu static i wehewehe mua ʻia me ka hoʻohana ʻana i kā mākou mea i hoʻopaʻa ʻia;20.21 TD: T3 a me Ctrl s Added Dex ma ka Poakolu;MC: nā ʻāpana naʻau i hoʻomaʻamaʻa ʻia ma CTCM me ka hoʻohana ʻana i kā mākou mea i hoʻopaʻa ʻia ma mua;a me MT: CTCM me T3 a me Dex i hoʻohui ʻia i ke kikowaena.Ma hope o 12 mau lā o ka mahiʻai ʻana, ua like ke ola o nā ʻiʻo MS a me MT e like me nā ʻiʻo hou i loiloi ʻia e ka MTT assay (Fig. 4b).ʻO ka mea e mahalo ai, ʻo ka hoʻohui ʻana o T3 a me Dex i nā moʻomeheu transwell (TD) ʻaʻole i hopena i ka hoʻomaikaʻi nui ʻana i ka viability i hoʻohālikelike ʻia i nā kūlana Ctrl, e hōʻike ana i kahi hana koʻikoʻi o ka hoʻoulu ʻana i ka mechanical i ka mālama ʻana i ka viability o nā ʻāpana naʻau.
he kiʻi hoʻolālā hoʻokolohua e hōʻike ana i nā kūlana moʻomeheu ʻehā i hoʻohana ʻia no ka loiloi ʻana i nā hopena o ka hoʻoulu ʻana i ka mīkini a me ka hoʻohui T3/Dex ma ke kikowaena no 12 lā. b Hōʻike ka pakuhi pahu i ka nui o ka ola 12 lā ma hope o ka moʻomeheu i nā kūlana moʻomeheu 4 (Ctrl, TD, MC, a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a me D12 MT), 12 (D12 MC) nā ʻāpana/hui hoʻokahi ʻaoʻao ##0, ###0 hoʻāʻo ʻia mai nā puaʻa like ʻole. p <0.001 hoʻohālikelike ʻia me D0 a me **p <0.01 hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). b Hōʻike ka pakuhi pahu i ka nui o ka ola 12 lā ma hope o ka moʻomeheu i nā kūlana moʻomeheu 4 (Ctrl, TD, MC, a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a me D12 MT), 12 (D12 MC) nā ʻāpana/hui hoʻokahi ʻaoʻao ##0, ###0 hoʻāʻo ʻia mai nā puaʻa like ʻole. p <0.001 hoʻohālikelike ʻia me D0 a me **p <0.01 hoʻohālikelike ʻia me D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во вселоникроту (4 дней после роль, TD, MC a me MT) e pili ana i ka сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a me D12 MT), 12 (D12 MC) успред й, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ##p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Hōʻike ka pakuhi pahu i ka nui o ka viability ma 12 lā ma hope o ka moʻomeheu i nā kūlana moʻomeheu 4 āpau (ka mana, TD, MC, a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana naʻau hou (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, a me D12 MT), 12 (D12 MC, a me MT) nā ʻāpana ʻokoʻa, ##0 ʻaoʻao ʻaoʻao / ###0 puaʻa; p <0.001 vs. D0 a me **p <0.01 ma ka hoohalike ana me D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (Dl5) TD0 12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，##p < 0.001 与 D0 ， D0 .与与 D0 ， D0 . ）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими сердими (сердирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими средими (сердими серди) (0 D средими (сердими сердин) (8 DIRI) 12 Ctrl, D12 TD a me D12 MT), mai ka разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ####p <0,001 по внению с контролем D12). b Histogram e hōʻike ana i nā kūlana moʻomeheu 4 (ka mana, TD, MC a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana naʻau hou (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a me D12 MT), mai nā puaʻa like ʻole 12 (D12 MC) ʻāpana/hui, hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala; ####0<0.0. 1 vs. mana D12). c Bar graph hōʻike i ka quantification of glucose flux 12 lā ma hope o ka moʻomeheu ma nā kūlana moʻomeheu 4 (Ctrl, TD, MC, a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) (n = 6 ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi; ###p <0.001, hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ***p <0.001). c Bar graph hōʻike i ka quantification of glucose flux 12 lā ma hope o ka moʻomeheu ma nā kūlana moʻomeheu 4 (Ctrl, TD, MC, a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) (n = 6 ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi; ###p <0.001, hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ***p <0.001). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 лухник ь, TD, MC a me MT) mai ka сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, одностоялннин, одностотялнин 1 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). Hōʻike ka Histogram i ka helu o ka glucose flux 12 lā ma hope o ka moʻomeheu ma lalo o nā kūlana moʻomeheu 4 (ka mana, TD, MC a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) (n = 6 mau ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia kahi hoʻokolohua ANOVA; ###p <0.001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ***p <0.001 Ctrl i hoʻohālikelike ʻia me D12). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比 ，吹2通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比 ，***p 1.***p 。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 ， 切片后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执 猪单向执 ，不行向0.相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для вселехурования нтроль, TD, MC a me MT) no ka hoʻohana ʻana i ka hoʻopaʻa inoa ʻana i ka hoʻokele waiwai (D0) (n = 6 mau hola/группа, mai ka разных свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, #родиностросто; ##p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram e hōʻike ana i ka nui o ka glucose flux ma 12 lā ma hope o ka moʻomeheu no nā kūlana moʻomeheu 4 (ka mana, TD, MC, a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana naʻau hou (D0) (n = 6 ʻāpana / hui, mai nā puaʻa like ʻole, unilateral Ua hana ʻia nā hoʻokolohua ANOVA, ###p <0.001 i hoʻohālikelike ʻia me D0, ***p <0.d Nā ʻāpana hoʻoheheʻe ʻana o nā mea hou (uliuli), lā 12 MC ('ōmaʻomaʻo), a me ka lā 12 MT (ʻulaʻula) ma nā wahi ʻāpana ʻāpana ʻāpana he ʻumi (n = 4 ʻāpana/hui, hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala; ʻaʻohe ʻokoʻa nui ma waena o nā hui).e hōʻike ana i nā ʻano genes i hōʻike ʻokoʻa ʻia ma nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana puʻuwai i moʻomeheu ʻia ma lalo o nā kūlana paʻa (Ctrl) a i ʻole ma lalo o nā kūlana MT (MT) no 10-12 lā.f Heatmap o nā genes sarcomere no nā ʻāpana naʻau i moʻomeheu ʻia ma lalo o kēlā me kēia kūlana moʻomeheu.Hōʻike nā pahu kuhi i ka mean ± ka hoʻokaʻawale maʻamau.
ʻO ka hilinaʻi ʻana i ka metabolism i ka hoʻololi ʻana mai ka hoʻohemo ʻana i ka waikawa momona i ka glycolysis kahi hōʻailona o ka dedifferentiation cardiomyocyte.Hoʻohana mua nā cardiomyocytes ʻaʻole i ka glucose no ka hana ATP a loaʻa iā hypoplastic mitochondria me ka liʻiliʻi cristae5,32.Ua hōʻike ʻia nā loiloi hoʻohana ʻana i ka glucose ma lalo o nā kūlana MC a me MT, ua like ka hoʻohana ʻana i ka glucose me ka lā 0 mau kiko (Figure 4c).Eia naʻe, ua hōʻike ʻia nā laʻana Ctrl i ka piʻi nui ʻana o ka hoʻohana ʻana i ka glucose i hoʻohālikelike ʻia me ka ʻiʻo hou.Hōʻike kēia i ka hui pū ʻana o CTCM a me T3/Dex e hoʻonui i ka ola kino a mālama i ka phenotype metabolic o nā ʻāpana naʻau moʻomeheu 12-lā.Eia hou, ua hōʻike ka hōʻike ʻana i ke ʻano o ka hoʻopaʻapaʻa e like me ka ʻiʻo puʻuwai hou no nā lā 12 ma lalo o nā kūlana MT a me MS (Fig. 4d).
No ka nānā ʻana i ka hopena holoʻokoʻa o CTCM a me T3 / Dex ma ka ʻāina transcriptional honua o ka ʻāpana ʻāpana cardiac, hana mākou i ka RNAseq ma nā ʻāpana cardiac mai nā kūlana moʻomeheu ʻehā (Supplementary Data 1).ʻO ka mea mahalo, ua hōʻike nā ʻāpana MT i ka like ʻana o ka transcriptional kiʻekiʻe me ka ʻiʻo puʻuwai hou, me 16 wale nō i hōʻike ʻokoʻa ʻia mai 13,642 genes.Eia naʻe, e like me kā mākou i hōʻike mua ai, ua hōʻike ʻia nā ʻāpana Ctrl i 1229 i hōʻike ʻokoʻa i nā genes ma hope o 10-12 mau lā i ka moʻomeheu (Fig. 4e).Ua hōʻoia ʻia kēia mau ʻikepili e ka qRT-PCR o ka puʻuwai a me ka fibroblast genes (Supplementary Fig. 7a-c).ʻO ka mea e mahalo ai, ua hōʻike nā ʻāpana Ctrl i ka hoʻohaʻahaʻa ʻana i nā genes puʻuwai a me nā cell cycle a me ka hoʻāla ʻana o nā papahana gene inflammatory.Hōʻike kēia mau ʻikepili i ka dedifferentiation, ka mea maʻamau ma hope o ka moʻomeheu lōʻihi, ua hoʻopau ʻia ma lalo o nā kūlana MT (Supplementary Fig. 8a,b).ʻO ka nānā pono ʻana i nā genes sarcomere i hōʻike ʻia ma lalo o nā kūlana MT wale nō ka mālama ʻana o nā genes i ka sarcomere (Fig. 4f) a me ke kahawai ion (Supplementary Fig. 9) i mālama ʻia, e pale ana iā lākou mai ka hoʻopau ʻana ma lalo o nā kūlana Ctrl, TD, a me MC.Hōʻike kēia mau ʻikepili me ka hui pū ʻana o ka mechanical and humoral stimulation (T3/Dex), hiki ke noho like ka transcriptome ʻāpana puʻuwai me nā ʻāpana puʻuwai hou ma hope o 12 mau lā i ka moʻomeheu.
Ua kākoʻo ʻia kēia mau ʻike transcriptional e ka ʻoiaʻiʻo o ka mālama pono ʻana o ka cardiomyocytes i nā ʻāpana puʻuwai ma lalo o nā kūlana MT no nā lā 12, e like me ka mea i hōʻike ʻia e ka connexin intact a localized 43 (Fig. 5a).Eia kekahi, ua hoʻemi nui ʻia ka fibrosis ma nā ʻāpana naʻau ma lalo o nā kūlana MT i ka hoʻohālikelike ʻia me Ctrl a like me nā ʻāpana naʻau hou (Fig. 5b).Hōʻike kēia mau ʻikepili i ka hui pū ʻana o ka hoʻoulu ʻana i ka mechanical a me ka mālama ʻana i ka T3/Dex e mālama pono i ke ʻano o ka naʻau i nā ʻāpana naʻau i ka moʻomeheu.
He kiʻi immunofluorescence Lunamakaʻāinana o troponin-T ('ōmaʻomaʻo), connexin 43 (ʻulaʻula), a me DAPI (uliuli) ma nā ʻāpana puʻuwai i hoʻokaʻawale hou ʻia (D0) a i ʻole moʻomeheu no 12 mau lā ma nā kūlana moʻomeheu ʻehā ʻehā (paʻa pālākiō = 100 µm).). ʻO ka heluʻana o ka naʻau akamai o ka puʻuwai o ke kino (n = 7 (D0 a me D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a me D12 MT) paʻi / hui mai nā puaʻa likeʻole, hanaʻia ka ho'āʻo ANOVA hoʻokahi; ʻO ka helu ʻana o ka naʻau akamai o ka puʻuwai hoʻonohonoho pono (n = 7 (D0 a me D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a me D12 MT) ʻāpana / hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia kahi hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi; Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 2 MC ), D12 MC (D0 2 D15) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,005 или 2 Ctrl). ʻO ka helu o ka paʻa paʻa o ka puʻuwai puʻuwai me ka hoʻohana ʻana i ka naʻauao artificial (n = 7 (D0 a me D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a me D12 MT) ʻāpana / hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia kahi hoʻokolohua ANOVA hoʻokahi;对不同猪的心脏组织结构完整性性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和人/廷行猉智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与缛毀。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mc 和）量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.05 相比，或****p < 0.0.ʻO ka helu o ka paʻa paʻa o ka ʻiʻo cardiac me ka hoʻohana ʻana i ka naʻauao kūlohelohe i nā puaʻa like ʻole (n = 7 (D0 a me D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a me D12 MT) ʻāpana / hui) me kahi hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 a i ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0.0001 hoʻohālikelike ʻia me D0 a me *p <0.05 a i ʻole ****p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). b Nā kiʻi hōʻike a me ka helu ʻana no nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka ʻōpala trichrome a Masson (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, a me D12 MC), 9 (D12 MT) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hoʻohālikelike ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ʻaoʻao <0##0 <1 ***0. 1, a i ʻole ****p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). b Nā kiʻi hōʻike a me ka helu ʻana no nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka ʻōpala trichrome a Masson (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, a me D12 MC), 9 (D12 MT) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hoʻohālikelike ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ʻaoʻao <0##0 <1 ***0. 1, a i ʻole ****p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (массона 5) = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний теp01 ,##0 теp ANOVA; ##0 ***p < 0,001 a i ʻole ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Nā kiʻi hōʻikeʻike a me ka helu ʻana o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka ʻeleʻele trichrome o Masson (scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a me D12 MC), 9 (D12 MT) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia <1p 0 a i ʻole ***0 . p <0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）！D = 10）！D = 10（D 10（D 10（D 10） D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；##****##p < 0.0001 ，*p*p ​​< 0.0001 ，*p*p ​​< . 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） = 500 µm） 1（n） 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 ， 进行单因素方差分析；####p < 0.0001 ， 曾001 ， 曾001 ， 不是****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная = лим50й (масштабная = лим50) 2 Ctrl, D12 TD a me D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; по сравнению с D12 Ctrl). b Nā kiʻi hōʻike a me ka helu ʻana o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka trichrome o Masson (bar scale = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a me D12 MC), 9 (D12 MT) mau ʻāpana mai nā puaʻa/hui like ʻole, hoʻokahi ala ANOVA; ####00 <0. .0001 hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl).Hōʻike nā pahu kuhi i ka mean ± ka hoʻokaʻawale maʻamau.
ʻO ka mea hope loa, ua loiloi ʻia ka hiki o CTCM e hoʻohālikelike i ka hypertrophy cardiac ma o ka hoʻonui ʻana i ke kiko o ka naʻau.Ma CTCM, piʻi ka piʻi ʻana o ke keʻena ea kiʻekiʻe mai 80 mmHg a i 80 mmHg.Art.(ka lōʻihi maʻamau) a hiki i 140 mmHg Art.(Fig. 6a).Ua like kēia me ka piʻi ʻana o 32% i ka kikoo (Fig. 6b), i hōʻike mua ʻia e like me ka pākēneka pili i koi ʻia no nā ʻāpana puʻuwai e loaʻa ai kahi lōʻihi sarcomere e like me ka mea i ʻike ʻia i ka hypertrophy.ʻO ke kikoo a me ka wikiwiki o ka ʻiʻo puʻuwai i ka wā o ka hoʻopaʻa ʻana a me ka hoʻomaha i mau i nā lā ʻeono o ka moʻomeheu (Fig. 6c).Ua hoʻokuʻu ʻia ka ʻiʻo cardiac mai nā kūlana MT i ka maʻamau (MT (Normal)) a i ʻole nā ​​kūlana overstretch (MT (OS)) no nā lā ʻeono.Ma hope o nā lā ʻehā i ka moʻomeheu, ua hoʻokiʻekiʻe nui ʻia ka hypertrophic biomarker NT-ProBNP i ka waena ma lalo o nā kūlana MT (OS) i hoʻohālikelike ʻia me nā kūlana MT (maʻamau) (Fig. 7a).Eia kekahi, ma hope o nā lā ʻeono o ka moʻomeheu, ua hoʻonui nui ʻia ka nui o ka cell ma MT (OS) (Fig. 7b) i hoʻohālikelike ʻia i nā ʻāpana o ka naʻau MT (maʻamau).Eia kekahi, ua hoʻonui nui ʻia ka translocation nuklea NFATC4 i nā ʻiʻo overstretched (Fig. 7c).Hōʻike kēia mau hopena i ka holomua holomua o ka hoʻoponopono hou ʻana o ka pathological ma hope o ka hyperdistension a kākoʻo i ka manaʻo e hiki ke hoʻohana ʻia ka mea CTCM ma ke ʻano he kahua e aʻo ai i ka hōʻailona hypertrophy cardiac stretch-induced.
Ua hōʻoia nā ʻāpana o ke kaomi o ke keʻena ea, ke kaomi ʻana o ke keʻena wai, a me nā ana neʻe ʻana o ka ʻiʻo e hoʻololi ke kaomi o ke keʻena i ke kaomi ʻana o ke keʻena wai, me ka neʻe ʻana o ka ʻāpana kiko.b E hōʻike i nā pākēneka hoʻolōʻihi a me nā ʻāpana kikoo kikoʻī no nā ʻāpana kikoo maʻamau (ʻalani) a me nā ʻāpana kikoo (uliuli).c Paʻi pahu e hōʻike ana i ka manawa pōʻai (n = 19 mau ʻāpana no kēlā me kēia hui, mai nā puaʻa like ʻole), ka manawa ʻoki (n = 18-19 mau ʻāpana i kēlā me kēia hui, mai nā puaʻa like ʻole), ka manawa hoʻomaha (n = 19 mau ʻāpana i kēlā me kēia hui, mai nā puaʻa like ʻole) ), ka nui o ka neʻe ʻana o ka ʻiʻo (n = 14 mau ʻāpana/hui, mai nā puaʻa like ʻole), kiʻekiʻe kiʻekiʻe (nā ʻāpana puaʻa / hui ʻokoʻa) n = 14 (D0), 15 (D6) ) pauku / pūʻulu) mai nā puaʻa like ʻole), ʻaʻole i hōʻike ʻia ka hōʻike ʻana o ka haumāna t-huela ʻelua i ka ʻokoʻa nui ma kekahi ʻāpana, e hōʻike ana ua mau kēia mau ʻāpana i nā lā 6 o ka moʻomeheu me ka overvoltage.Hōʻike nā pahu kuhi i ka mean ± ka hoʻokaʻawale maʻamau.
He kiʻi paʻi kiʻi ka helu o ka NT-ProBNP i loko o ka media moʻomeheu mai nā ʻāpana puʻuwai i hoʻoulu ʻia ma lalo o ke kūlana maʻamau MT (Norm) a i ʻole overstretching (OS) kūlana (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, a me D4 MTOS) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, Hana ʻia ʻo ANOVA ʻelua ala; **p <0.01. He kiʻikuhi Bar ka helu ʻana o ka NT-ProBNP i loko o ka media moʻomeheu mai nā ʻāpana puʻuwai i hoʻoulu ʻia ma lalo o ke kūlana maʻamau MT (Norm) a i ʻole ka overstretching (OS) kūlana (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, a me D4 MTOS) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, Hana ʻia ʻo ANOVA ʻelua ala; **p <0.01 maʻamau.Histogram quantitative o ka NT-ProBNP hoʻopaʻa 'ia i loko o ka moʻomeheu'āpana mai naʻau slices moʻomeheu ma lalo o nā kūlana o ka maʻamau MT kikoo (maʻamau) a overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, a me D4).MTOS) paʻi / pūʻulu mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ʻelua-factor analysis of varice;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 i hoʻohālikelike ʻia me ke kiko maʻamau). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的条度的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的浓度的2 MT2 Norma)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正伛**与正伯三与与正帉。 He helu o ka NT-ProBNP kaila i loko o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻoulu ʻia ma lalo o ke kūlana MT maʻamau (Norm) a i ʻole overstretch (OS) kūlana (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) mai nā ʻano like ʻole , p < 0.01).histogram Ka helu ʻana o ka NT-ProBNP i loko o nā ʻāpana puʻuwai i moʻomeheu ʻia ma lalo o nā kūlana o ka MT maʻamau (maʻamau) a i ʻole overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) a me D4 MTOS) mau ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, ʻelua ʻaoʻao ka nānā ʻana o ka ʻokoʻa;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 i hoʻohālikelike ʻia me ke kiko maʻamau). b Nā kiʻi makaʻāinana no nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka troponin-T a me WGA (hema) a me ka helu ʻana o ka nui o ke kelepona (akau) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) pūʻulu/hui mai 10 mau ʻāpana ʻokoʻa mai nā puaʻa like ʻole, Hana ʻia ka hoʻāʻo t-haumāna ʻelua; ****p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me ke kiko maʻamau). b Nā kiʻi makaʻāinana no nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka troponin-T a me WGA (hema) a me ka helu ʻana o ka nui o ke kelepona (akau) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) pūʻulu/hui mai 10 mau ʻāpana ʻokoʻa mai nā puaʻa like ʻole, Hana ʻia ka hoʻāʻo t-haumāna ʻelua; ****p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me ke kiko maʻamau). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного опрякред (раследца) 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-крид **** ; сравнению с нормальным растяжением). b Nā kiʻi makaʻāinana o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka troponin-T a me AZP (hema) a me ka helu ʻana o ka nui o ka cell (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) pūʻulu / pūʻulu mai 10 mau ʻāpana like ʻole mai nā puaʻa like ʻole, ua hana ʻia ka t-test a ka haumāna; ****p <0.001 i hoʻohālikelike ʻia i ka strain maʻamau). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性（小量化（右）染色的心脏切片的代表性（3图图自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与曉学生t 检验；与曉，00与曣，00与曉学生t ）. b Nā kiʻi hōʻikeʻike o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka calcarein-T a me WGA (hema) a me ka nui o ke kelepona (akau) (n = 330 (D6 MTOS), 369 mai 10 mau ʻāpana like ʻole (D6 MTNorm)) Cells/组，两方法有尾学生t test；0.0 pared test；0.compatred maʻamau. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оцленка (сленка) 6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; льным растяжением). b Nā kiʻi hōʻikeʻike o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka troponin-T a me AZP (hema) a me ka helu ʻana o ka nui o ka cell (akau) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) mai 10 mau ʻāpana like ʻole mai nā puaʻa like ʻole) Cells/group, two-tailed criterion Student's t;****p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me ke ʻano maʻamau). c Nā kiʻi makaʻāinana no ka lā 0 a me ka lā 6 MTOS nā ʻāpana puʻuwai immunolabeled no ka troponin-T a me ka NFATC4 a me ka helu ʻana o ka unuhi ʻana o NFATC4 i ka nuclei o CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, Hana ʻia ka hoʻāʻo t-haumālua ʻelua; *p <0.05). c Nā kiʻi makaʻāinana no ka lā 0 a me ka lā 6 MTOS mau ʻāpana puʻuwai immunolabeled no ka troponin-T a me NFATC4 a me ka helu ʻana o ka unuhi ʻana o NFATC4 i ka nuclei o CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole , Hana ʻia ka ho'āʻo t-haumāna ʻelua; *p <0.0. c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, a me NFATC4, и колкацнч FATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двустонюнид двустонюд5 * нестороннид . c Lunamakaainana kiʻi no naʻau pauku ma 0 a me 6 lā MTOS, immunolabeled no troponin-T a me NFATC4, a me quantification o NFATC4 translocation i loko o ka nucleus o cavernous keena (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) slices / hui mai okoa puaʻa) hana elua-huelo haumāna t-ho'āʻo;*p <0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图像，中图像，中国像，于于易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.0. c Nā kiʻi makaʻāinana o ka calcanin-T a me ka NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS ʻāpana puʻuwai, a me ka NFATC4 mai nā ʻokoʻa NFATC4 易位至CM cell nucleus的 quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 德生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS ma 0 и 6 день для иммуномаркировки трононином-Т и NFATC4 a me NFATC4 столка цинч FATC4 i loko o ka CM mai ka разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Nā kiʻi makaʻāinana o nā ʻāpana puʻuwai MTOS i ka lā 0 a me 6 no ka troponin-T a me ka NFATC4 immunolabeling a me ka helu ʻana o ka NFATC4 translocation i loko o ka nucleus o CM mai nā puaʻa like ʻole (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ʻāpana/hui, ʻelua-tailed t -criterion haumāna; *p <0.05).Hōʻike nā pahu hewa i ka mean ± deviation maʻamau.
Pono ka noiʻi ʻana i ka maʻi cardiovascular i nā hiʻohiʻona kelepona e hoʻopuka pololei i ke ʻano o ka naʻau.I loko o kēia haʻawina, ua hoʻomohala ʻia kahi mea CTCM a hiki ke hoʻoulu i nā ʻāpana ultrathin o ka puʻuwai.Aia ka ʻōnaehana CTCM i ka hoʻoulu ʻana i ka electromechanical physiologically synchronized a me ka hoʻonui ʻana i ka wai T3 a me Dex.I ka wā i ʻike ʻia ai nā ʻāpana puʻuwai puaʻa i kēia mau mea, ʻo ko lākou viability, structural integrity, metabolic activity, a me transcriptional expression i mau like me ka puʻuwai hou ma hope o 12 mau lā o ka moʻomeheu.Eia kekahi, ʻo ka hoʻolōʻihi ʻana o ka ʻiʻo cardiac hiki ke hoʻoulu i ka hypertrophy o ka puʻuwai i hoʻokumu ʻia e ka hyperextension.Ma keʻano holoʻokoʻa, kākoʻo kēia mau hopena i ke kuleana koʻikoʻi o nā kūlana moʻomeheu physiological i ka mālama ʻana i kahi phenotype cardiac maʻamau a hāʻawi i kahi kahua no ka nānā ʻana i ka lāʻau.
Nui nā kumu i ka hoʻokumu ʻana i kahi kaiapuni maikaʻi loa no ka hana a me ke ola ʻana o nā cardiomyocytes.ʻO ka mea maopopo loa o kēia mau mea pili i (1) intercellular interactions, (2) electromechanical stimulation, (3) humoral factor, a (4) metabolic substrates.Pono nā pilina pili kino-a-cell i nā ʻupena ʻekolu-dimensional paʻakikī o nā ʻano kelepona lehulehu i kākoʻo ʻia e kahi matrix extracellular.He paʻakikī ke kūkulu hou ʻana o ia mau pilina pili pūnaewele i loko o ka vitro e ka moʻomeheu like o kēlā me kēia ʻano kelepona, akā hiki ke maʻalahi me ka hoʻohana ʻana i ke ʻano organotypic o nā ʻāpana naʻau.
He mea koʻikoʻi ka hoʻolōʻihi ʻana i ka mīkini a me ka hoʻoulu ʻana i ka uila o nā cardiomyocytes no ka mālama ʻana i ka phenotype cardiac33,34,35.ʻOiai ua hoʻohana nui ʻia ka hoʻoulu ʻana i ka mīkini no ka hiPSC-CM conditioning a me ka maturation, ua hoʻāʻo kekahi mau haʻawina nani i ka hoʻoulu ʻana i nā ʻāpana puʻuwai i ka moʻomeheu me ka hoʻohana ʻana i ka uniaxial loading.Hōʻike kēia mau haʻawina he hopena maikaʻi ka 2D uniaxial mechanical loading i ka phenotype o ka puʻuwai i ka wā moʻomeheu.I loko o kēia mau haʻawina, ua hoʻouka ʻia nā ʻāpana o ka puʻuwai me ka isometric tensile forces17, linear auxotonic loading18, a i ʻole ua hana hou ʻia ka pōʻai puʻuwai me ka hoʻohana ʻana i ka mana transducer ikaika a me nā hoʻokele hoʻopaʻapaʻa.Eia nō naʻe, hoʻohana kēia mau ʻano i ka uniaxial tissue stretch me ka ʻole o ka loiloi kaiapuni, ka hopena i ka hoʻopau ʻana i nā genes cardiac he nui a i ʻole overexpression o nā genes e pili ana i nā pane kikoʻī.ʻO ka CTCM i wehewehe ʻia ma ʻaneʻi e hāʻawi i kahi 3D electromechanical stimulus e hoʻohālikelike i ka pōʻai cardiac kūlohelohe ma ke ʻano o ka manawa pōʻai a me ka hoʻolōʻihi physiological (25% stretch, 40% systole, 60% diastole, a me 72 beats i kēlā me kēia minuke).ʻOiai ʻaʻole lawa kēia ʻano hoʻonaninani ʻekolu wale nō no ka mālama ʻana i ka pono o ka ʻiʻo, pono ka hui pū ʻana o ka humoral a me ka mechanical stimulation me ka hoʻohana ʻana i ka T3 / Dex e mālama pono i ka ola kino, ka hana, a me ka pono.
He kuleana koʻikoʻi nā mea hoʻomākeʻaka i ka hoʻololi ʻana i ka phenotype naʻau makua.Ua hōʻike ʻia kēia ma nā haʻawina HiPS-CM kahi i hoʻohui ʻia ai ʻo T3 a me Dex i ka media moʻomeheu e hoʻolalelale i ka maturation cell.Hiki i ka T3 ke hoʻoikaika i ka lawe ʻana i nā ʻakika amino, nā kō a me ka calcium ma waena o nā membrane cell36.Eia kekahi, hoʻolaha ʻo T3 i ka ʻōlelo MHC-α a me ka MHC-β downregulation, e hāpai ana i ka hoʻokumu ʻana o nā myofibrils twitch wikiwiki i nā cardiomyocytes makua i hoʻohālikelike ʻia me ka lohi twitch myofibrils i ka fetal CM.ʻO ka nele o T3 i nā poʻe maʻi hypothyroid ka hopena i ka nalowale o nā kaula myofibrillar a me ka emi ʻana o ka hoʻomohala ʻana o ka leo37.Hana ʻo Dex i nā mea loaʻa glucocorticoid a ua hōʻike ʻia e hoʻonui i ka contractility myocardial i nā puʻuwai perfused kaʻawale;38 manaʻo ʻia e pili ana kēia hoʻomaikaʻi ʻana i ka hopena ma ka hoʻokomo ʻana i ka hoʻokomo ʻana i ka waihona calcium (SOCE) 39,40.Eia kekahi, hoʻopaʻa ʻo Dex i kāna mau mea loaʻa, e hana ana i kahi pane intracellular ākea e kāohi i ka hana immune a me ka mumū30.
Hōʻike kā mākou mau hopena i ka hoʻoikaika kino ʻana o ka mechanical stimulation (MS) i ka hana moʻomeheu holoʻokoʻa i hoʻohālikelike ʻia me Ctrl, akā ʻaʻole i mālama i ka viability, structural integrity, a me ka hōʻike cardiac ma luna o 12 mau lā ma ka moʻomeheu.Hoʻohālikelike ʻia me Ctrl, ʻo ka hoʻohui ʻana o T3 a me Dex i nā moʻomeheu CTCM (MT) i hoʻomaikaʻi maikaʻi ʻia a mālama ʻia nā moʻolelo transcription like, kūpaʻa ʻano, a me ka hana metabolic me ka ʻiʻo puʻuwai hou no nā lā 12.Eia hou, ma ka hoʻomaluʻana i ke kiʻekiʻe o ke kiko o ke kiko, ua hanaʻia kekahiʻano hypertrophy cardiac hypertrophy i hoʻokomoʻia me ka hoʻohanaʻana i STCM, e hōʻike ana i ka maʻalahi o ka pūnaewele STCM.Pono e hoʻomaopopo ʻia ʻoiai ʻo ka hoʻoponopono hou ʻana o ka naʻau a me ka fibrosis e hoʻopili mau i nā ʻāpana paʻa i hiki ke hāʻawi i nā cytokines kūpono e like me ka phagocytosis a me nā mea hoʻoponopono ʻē aʻe, hiki i nā ʻāpana o ka puʻuwai ke hoʻohālike i ke kaʻina fibrotic i pane i ke kaumaha a me ka trauma.i loko o ka myofibroblasts.Ua loiloi mua ʻia kēia i loko o kēia ʻano ʻāpana puʻuwai.Pono e hoʻomaopopo ʻia e hiki ke hoʻololi ʻia nā ʻāpana CTCM ma o ka hoʻololi ʻana i ke kaomi / amplitude uila a me ka pinepine e hoʻohālikelike i nā kūlana he nui e like me tachycardia, bradycardia, a me ke kākoʻo circulatory mechanical (mechanical unloaded heart).Hoʻolilo kēia i ka ʻōnaehana i waena o ka hoʻāʻo ʻana i ka lāʻau.ʻO ka hiki o CTCM ke hoʻohālike i ka overexertion-induced cardiac hypertrophy i ke ala no ka hoʻāʻo ʻana i kēia ʻōnaehana no ka lapaʻau pilikino.I ka hopena, hōʻike ka haʻawina i kēia manawa he mea koʻikoʻi ka hoʻolōʻihi mechanical a me ka hoʻoulu ʻana i ka humoral no ka mālama ʻana i ka moʻomeheu o nā ʻāpana ʻiʻo cardiac.
ʻOiai ʻo ka ʻikepili i hōʻike ʻia ma ʻaneʻi e hōʻike ana he kahua hoʻohiki maikaʻi loa ʻo CTCM no ka hoʻohālikelike ʻana i ka myocardium paʻa, aia kekahi mau palena o kēia ʻano moʻomeheu.ʻO ka palena nui o ka moʻomeheu CTCM ʻo ia ka hoʻokau ʻana i nā koʻikoʻi mechanical ikaika i nā ʻāpana, kahi e pale ai i ka hiki ke nānā pono i nā ʻāpana ʻāpana cardiac i kēlā me kēia pōʻai.Eia kekahi, ma muli o ka liʻiliʻi liʻiliʻi o nā ʻāpana cardiac (7 mm), hiki ke loiloi i ka hana systolic ma waho o nā ʻōnaehana moʻomeheu me ka hoʻohana ʻana i nā mea ʻike mana kuʻuna.Ma ka manuscript o kēia manawa, ua lanakila mākou i kēia palena ma ka loiloi ʻana i ka volta optical ma ke ʻano he hōʻailona o ka hana contractile.Eia nō naʻe, e koi ʻia kēia palena i ka hana hou a hiki ke hoʻoponopono ʻia i ka wā e hiki mai ana ma ka hoʻokomo ʻana i nā ala no ka nānā ʻana i ka hana o nā ʻāpana puʻuwai i ka moʻomeheu, e like me ka hoʻohana ʻana i nā mea hoʻoheheʻe calcium a me nā mea uila.ʻO kekahi palena ʻē aʻe o CTCM ʻo ia ʻaʻole hoʻopunipuni ke kumu hana i ke kaumaha physiological (preload a afterload).I loko o CTCM, ua hoʻokomo ʻia ke kaomi ma nā ʻaoʻao ʻē aʻe e hana hou i ka 25% physiological stretch i ka diastole (full stretch) a me ka systole (lōʻihi o ka hoʻopaʻa ʻana i ka wā hoʻoulu uila) i loko o nā ʻiʻo nui loa.Pono e hoʻoneʻe ʻia kēia palena i nā hoʻolālā CTCM e hiki mai ana ma ke kaomi ʻana i ka ʻiʻo puʻuwai mai nā ʻaoʻao ʻelua a me ka hoʻopili ʻana i nā pilina pili puʻe-nui e kū nei i loko o nā keʻena o ka puʻuwai.
ʻO ka overstretch-induced remodeling i hōʻike ʻia ma kēia palapala i kaupalena ʻia i ka hoʻohālikelike ʻana i nā hōʻailona hypertrophic hyperstretch.No laila, hiki i kēia kŘkohu ke kōkua i ke aʻo ʻana i ka hōʻailona hypertrophic stretch-induced me ka ʻole o ka pono o nā mea hoʻohenehene a neural paha (ʻaʻole i loaʻa i kēia ʻōnaehana).Pono nā haʻawina hou aʻe e hoʻonui i ka nui o CTCM, no ka laʻana, ka hui pū ʻana me nā cell immune, circulating plasma humoral factor, a me ka innervation i ka wā e hui pū ai me nā cell neuronal e hoʻomaikaʻi i nā hiki ke hoʻohālikelike ʻia me ka CTCM.
He ʻumikūmākolu puaʻa i hoʻohana ʻia ma kēia haʻawina.Ua hana ʻia nā kaʻina hana holoholona a pau e like me nā alakaʻi alakaʻi a ua ʻae ʻia e ke Kōmike mālama holoholona a me ka hoʻohana ʻana o ke Kulanui o Louisville Institutional Animal Care.Ua hoʻopaʻa ʻia ka ʻāʻī aortic a ua honi ʻia ka puʻuwai me 1 L o ka cardioplegia sterile (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH a hiki i 7.4); mālama ʻia nā naʻau i loko o ka wai hau anuanu a hiki i ka lawe ʻia ʻana i ke keʻena hau i ka manawa maʻamau <10 min. mālama ʻia nā naʻau i loko o ka wai hau anuanu a hiki i ka lawe ʻia ʻana i ke keʻena hau i ka manawa maʻamau <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимат <10нимат. Ua mālama ʻia nā naʻau i loko o ka wai hau anuanu a hiki i ka lawe ʻana i ka hale hana ma ka hau, ʻo ia ka mea maʻamau <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. E mālama i nā naʻau ma ka hau cardioplegia a hiki i ka lawe ʻana i ke keʻena hana ma ka hau, maʻamau <10 min.
Ua hoʻomohala ʻia ka polokalamu CTCM ma SolidWorks computer-aided design (CAD) lako polokalamu.ʻO nā keʻena moʻomeheu, nā mea hoʻokaʻawale a me nā keʻena ea i hana ʻia me ka ʻilika acrylic maʻemaʻe CNC.Hana ʻia ke apo hope 7mm anawaena me ka polyethylene kiʻekiʻe (HDPE) i waenakonu a loaʻa iā ia kahi o-ring groove e hoʻokomo i ke apo silicone i hoʻohana ʻia e sila i ka media ma lalo.Hoʻokaʻawale ʻia ke keʻena moʻomeheu mai ka pā kaʻawale.Ua ʻoki ʻia ka membrane silicone mai ka 0.02 ″ mānoanoa silicone sheet a he 35A ka paʻakikī.ʻO ka lalo a me luna silicone gaskets i ʻoki ʻia mai ka 1/16 ″ ʻāpana silicone mānoanoa a loaʻa ka paʻakikī o 50A.Hoʻohana ʻia nā wili kila kila 316L a me nā nati ʻēheu no ka hoʻopaʻa ʻana i ka poloka a hana i kahi sila paʻa ea.
Hoʻolālā ʻia kahi papa kaapuni paʻi paʻi ʻia (PCB) e hoʻohui pū me ka ʻōnaehana C-PACE-EM.Hoʻopili ʻia nā kumu hoʻohui mīkini swiss ma ka PCB i nā electrodes graphite e nā uea keleawe-plated keleawe a me nā wili keleawe 0-60 i hoʻopili ʻia i loko o nā electrodes.Hoʻokomo ʻia ka papa kaapuni paʻi i ka uhi o ka mīkini paʻi 3D.
Hoʻomalu ʻia ka mea CTCM e kahi programmable pneumatic actuator (PPD) e hana ana i ke kaomi ʻana o ke kahe e like me ka pōʻai cardiac.I ka piʻi ʻana o ke kaomi i loko o ke keʻena ea, hoʻonui ʻia ka membrane silicone maʻalahi i luna, e koi ana i ka waena ma lalo o ka pūnaewele kiko.E hohola ʻia ka ʻāpana o ka ʻili e kēia kipaku ʻana i ka wai, e hoʻohālikelike i ka hoʻonui ʻana o ka puʻuwai i ka wā diastole.I ka piko o ka hoʻomaha, ua hoʻohana ʻia ka hoʻoulu ʻana i ka uila ma o nā electrodes graphite, kahi i hoʻemi ai i ke kaomi i loko o ke keʻena ea a hoʻemi i nā ʻāpana kiko.Aia i loko o ka paipu he pahu hemostatic me kahi mea ʻike kaomi e ʻike ai i ke kaomi o ka ʻōnaehana ea.Hoʻohana ʻia ke kaomi i ʻike ʻia e ka mea ʻike kaomi i kahi ʻohi ʻikepili i pili i ka kamepiula.ʻAe kēia i ka nānā mau ʻana i ke kaomi i loko o ke keʻena kinoea.I ka loaʻa ʻana o ke kaomi o ke keʻena kiʻekiʻe (80 mmHg maʻamau, 140 mmHg OS), ua kauoha ʻia ka mea lawe ʻikepili e hoʻouna i kahi hōʻailona i ka ʻōnaehana C-PACE-EM e hana i kahi hōʻailona uila biphasic no 2 ms, i hoʻonohonoho ʻia i 4 V.
Ua loaʻa nā ʻāpana puʻuwai a ua hana ʻia nā kūlana moʻomeheu i loko o nā luawai 6 penei: E hoʻololi i nā puʻuwai i ʻohi ʻia mai ka moku hoʻoili i kahi pā i loaʻa ke anu (4° C.) cardioplegia.Ua hoʻokaʻawale ʻia ka ventricle hema me kahi ʻāpana sterile a ʻokiʻoki i nā ʻāpana o 1-2 cm3.Ua hoʻopili ʻia kēia mau poloka ʻiʻo i nā kākoʻo ʻiʻo me ka hoʻopili ʻana i ka ʻiʻo a waiho ʻia i loko o kahi ʻauʻau ʻauʻau microtome vibrating i loaʻa ka hopena o Tyrode a hoʻomau i ka oxygenated (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), 6 mM KCl (0.407 m), 6 mM KCl (0.407 m) PES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M solution), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M solution), a hiki i 1 L ddH2O).Ua hoʻonohonoho ʻia ka microtome vibrating e ʻoki i nā ʻāpana mānoanoa 300 µm ma ke alapine o 80 Hz, kahi amplitude vibration ākea o 2 mm, a me ka wikiwiki mua o 0.03 mm/s.Ua hoʻopuni ʻia ka ʻauʻau ʻauʻau e ka hau no ka hoʻomaʻamaʻa ʻana o ka hopena a mālama ʻia ka mahana ma 4 ° C.E hoʻololi i nā ʻāpana ʻiʻo mai ka ʻauʻau microtome i kahi ʻauʻau incubation i loaʻa i ka wai hoʻoheheʻe Tyrode hoʻomau i ka hau a loaʻa nā ʻāpana nui no ka pā moʻomeheu hoʻokahi.No nā moʻomeheu transwell, ua hoʻopili ʻia nā ʻāpana kiko i nā kākoʻo polyurethane ākea 6 mm ākea a waiho ʻia i loko o 6 ml o ka medium optimized (199 medium, 1x ITS supplement, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline a me 2X antibiotic-antifungal).Hoʻohana ʻia ka hoʻoulu uila (10 V, frequency 1.2 Hz) i nā ʻāpana kiko ma o ka C-Pace.No nā kūlana TD, ua hoʻohui ʻia ʻo T3 a me Dex hou ma 100 nM a me 1 μM i kēlā me kēia loli.Hoʻopiha ʻia ka medium me ka oxygen ma mua o ka hoʻololi ʻana i 3 mau manawa i ka lā.Hoʻoulu ʻia nā ʻāpana ʻāpana i loko o kahi incubator ma 37 ° C a me 5% CO2.
No nā moʻomeheu CTCM, ua kau ʻia nā ʻāpana kiko ma luna o kahi mīkini paʻi 3D i hana ʻia i loko o kahi pā Petri i loaʻa ka hopena o Tyrode i hoʻololi ʻia.Hoʻolālā ʻia ka hāmeʻa e hoʻonui i ka nui o ka ʻāpana o ka puʻuwai e 25% o ka wahi o ke apo kākoʻo.Hana ʻia kēia i ʻole e kikoo nā ʻāpana o ka puʻuwai ma hope o ka neʻe ʻana mai ka hopena o Tyrode i ka waena a i ka wā diastole.Me ka hoʻohana ʻana i ke kāpili histoacrylic, ua hoʻopaʻa ʻia nā ʻāpana 300 µm mānoanoa ma ke apo kākoʻo 7 mm ke anawaena.Ma hope o ka hoʻopili ʻana i nā ʻāpana ʻiʻo i ke apo kākoʻo, e ʻoki i nā ʻāpana kikoo keu a hoʻihoʻi i nā ʻāpana kiko i hoʻopili ʻia i loko o ka ʻauʻau o Tyrode solution ma ka hau (4°C) a hiki i ka hoʻomākaukau ʻana i nā ʻāpana nui no ka mea hoʻokahi.ʻAʻole pono ka nui o ka manawa hana no nā mea hana a pau ma mua o 2 mau hola.Ma hope o ka hoʻopili ʻia ʻana o 6 mau ʻāpana kiko i ko lākou mau apo kākoʻo, ua ʻākoakoa ʻia ka mea CTCM.Hoʻopiha mua ʻia ka keʻena moʻomeheu CTCM me 21 ml pre-oxygenated medium.E hoʻoneʻe i nā ʻāpana kiko i ke keʻena moʻomeheu a wehe pono i nā ʻōpū ea me ka pipette.A laila alakaʻi ʻia ka ʻāpana kiko i loko o ka lua a kaomi mālie i kahi.ʻO ka hope, kau i ka pāpale electrode ma luna o ka mea hana a hoʻololi i ka mea hana i ka incubator.A laila hoʻohui i ka CTCM i ka paipu ea a me ka ʻōnaehana C-PACE-EM.Wehe ka pneumatic actuator a wehe ka valve ea i ka CTCM.Ua hoʻonohonoho ʻia ka ʻōnaehana C-PACE-EM e hāʻawi i ka 4 V ma 1.2 Hz i ka wā biphasic pacing no 2 ms.Ua hoʻololi ʻia ka medium i ʻelua manawa i ka lā a ua hoʻololi ʻia nā electrodes i hoʻokahi manawa i ka lā e pale i ka hōʻiliʻili ʻana o ka graphite ma nā electrodes.Inā pono, hiki ke hoʻoneʻe ʻia nā ʻāpana ʻiʻo mai ko lākou mau pūnāwai moʻomeheu e kipaku aku i nā ʻōpū ea i hāʻule ma lalo o lākou.No nā kūlana lapaʻau MT, ua hoʻohui hou ʻia ʻo T3/Dex me kēlā me kēia hoʻololi waena me 100 nM T3 a me 1 μM Dex.Hoʻoulu ʻia nā mea CTCM i loko o kahi incubator ma 37 ° C a me 5% CO2.
No ka loaʻa ʻana o nā trajectories o nā ʻāpana puʻuwai, ua kūkulu ʻia kahi ʻōnaehana kamera kūikawā.Ua hoʻohana ʻia kahi pahupaʻikiʻi SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Iapana) me kahi lens macro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA).Hana ʻia ka nānā ʻana ma ka lumi wela ma hope o ka hoʻololi ʻana i ka ʻano me ka mea hou.Hoʻonoho ʻia ka pahupaʻikiʻi ma kahi kihi 51° a hoʻopaʻa ʻia ke wikiō ma 30 mau kiʻi i kēlā me kēia kekona.ʻO ka mua, ua hoʻohana ʻia ka polokalamu open source (MUSCLEMOTION43) me Image-J e helu i ka neʻe ʻana o nā ʻāpana puʻuwai.Ua hana ʻia ka mask me ka hoʻohana ʻana iā MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) e wehewehe i nā wahi hoihoi no ka paʻi ʻana i nā ʻāpana puʻuwai e pale aku i ka walaʻau.Hoʻopili ʻia nā masks māhele lima i nā kiʻi āpau i ke kaʻina kiʻi a laila hāʻawi ʻia i ka plug-in MUSCLEMOTION.Hoʻohana ka Muscle Motion i ka awelika ikaika o nā pika i kēlā me kēia kiʻi e helu i kona neʻe e pili ana i ke kiʻi kuhikuhi.Hoʻopaʻa ʻia ka ʻikepili, kānana a hoʻohana ʻia e helu i ka manawa pōʻaiapili a nānā i ke kiko kiko i ka wā o ka pōʻai cardiac.Ua hoʻopaʻa ʻia ka wikiō i hoʻopaʻa ʻia ma hope o ka hoʻohana ʻana i kahi kānana kikohoʻe zero-phase.No ka helu ʻana i ka kiko kiko (peak-to-peak), ua hana ʻia ka nānā ʻana o ka piko-i-peak e ʻike ai ma waena o nā piko a me nā pā i ka hōʻailona i hoʻopaʻa ʻia.Eia kekahi, hana ʻia ka detrending me ka hoʻohana ʻana i ka polynomial kauoha 6 e hoʻopau i ka drift hōʻailona.Ua hoʻomohala ʻia ka code program ma MATLAB e hoʻoholo i ka neʻe ʻana o ke kino honua, ka manawa pōʻai, ka manawa hoʻomaha, a me ka manawa hoʻopaʻa (Supplementary Program Code 44).
No ka kānana kānana, me ka hoʻohana ʻana i nā wikiō like i hana ʻia no ka loiloi mechanical stretch, ua ʻimi mua mākou i ʻelua kiʻi e hōʻike ana i nā piko o ka neʻe (nā wahi kiʻekiʻe (luna) a haʻahaʻa (lalo) o ka neʻe) e like me ka polokalamu MUSCLEMOTION.A laila hoʻokaʻawale mākou i nā ʻāpana ʻāpana a hoʻopili i kahi ʻano o ka shading algorithm i ka ʻāpana ʻāpana (Supplementary Fig. 2a).A laila, māhele ʻia ka ʻiʻo ʻāpana i ʻumi lalo, a ua helu ʻia ke koʻikoʻi ma kēlā me kēia ʻili me ka hoʻohana ʻana i ka hoohalike penei: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, kahi ʻo Sup a me Sdown nā mamao o ke ʻano mai ka malu o luna a me lalo o ka lole, kēlā me kēia (Fig.2b).
Hoʻopaʻa ʻia nā ʻāpana puʻuwai i 4% paraformaldehyde no 48 mau hola.Ua hoʻomaʻemaʻe ʻia nā ʻiʻo paʻa i ka 10% a me 20% sucrose no 1 h, a laila ma 30% sucrose i ka pō.Hoʻokomo ʻia nā ʻāpana i loko o ka pūhui wela ʻoki maikaʻi loa (OCT compound) a maloʻo mālie i loko o kahi ʻauʻau hau isopentane/ maloʻo.E mālama i nā poloka hoʻokomo OCT ma -80 °C a hiki i ka wā e kaʻawale ai.Ua hoʻomākaukau ʻia nā paheʻe e like me nā ʻāpana me ka mānoanoa o 8 μm.
No ka wehe ʻana i ka OCT mai nā ʻāpana puʻuwai, e hoʻomehana i nā kiʻi paheʻe ma kahi poloka wela ma 95 °C no 5 min.E hoʻohui i ka 1 ml PBS i kēlā me kēia paheʻe a hoʻomoʻa no 30 mau minuke i ka mahana o ka lumi, a laila e hoʻopili i nā ʻāpana ma ka hoʻonohonoho ʻana i ka 0.1% Triton-X i PBS no 15 mau minuke ma ke ana wela.No ka pale ʻana i nā antibodies kikoʻī ʻole mai ka hoʻopaʻa ʻana i ka hāpana, e hoʻohui i 1 ml o 3% BSA solution i nā paheʻe a hoʻomoʻa no 1 hola ma ka lumi wela.Wehe ʻia ka BSA a holoi ʻia nā paheʻe me ka PBS.E kaha i kēlā me kēia hāpana me kahi penikala.ʻO nā antibodies mua (diluted 1:200 i ka 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) a me troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) ua hoʻohui ʻia ma luna o 90 mau minuke, a laila hoʻohui ʻia nā antibodies kiʻekiʻe 1 (%208) i nā ʻiole kiʻekiʻe (208 B) ʻO Thermo Scientific; #A16079), kūʻē i ka rabbit Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) no kahi 90 mau minuke holoi ʻia 3 mau manawa me PBS No ka hoʻokaʻawale ʻana i ka pale ʻana mai ka hope, ua hoʻohana mākou i ka antibody lua ma ke ʻano he mana. ʻO ka hope, ua hoʻohui ʻia ka ʻili nuklea DAPI a ua hoʻokomo ʻia nā mea hoʻoheheʻe vectator (a hoʻokomo ʻia nā mea hoʻoheheʻe ʻo DAPI i loko o kahi pale poli. hoʻonui) a me ka microscope Keyence me ka hoʻonui 40x.
Ua hoʻohana ʻia ʻo WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ma 5 μg/ml ma PBS no ka hoʻopaʻa ʻana o WGA a hoʻohana ʻia i nā ʻāpana paʻa no 30 mau minuke i ka lumi wela.A laila holoi ʻia nā paheʻe me ka PBS a ua hoʻohui ʻia ka ʻeleʻele Sudan i kēlā me kēia paheʻe a hoʻokomo ʻia no 30 mau minuke.Ua holoi ʻia nā paheʻe me ka PBS a ua hoʻohui ʻia ka vectashield embedding medium.Ua ʻike ʻia nā kiʻi kiʻi ma kahi microscope Keyence ma ka hoʻonui 40x.
Ua wehe ʻia ʻo OCT mai nā laʻana e like me ka mea i hōʻike ʻia ma luna.Ma hope o ka wehe ʻana i ka OCT, e hoʻokomo i nā paheʻe i loko o ka solution a Bouin i ka pō.Holoi ʻia nā paheʻe me ka wai i hoʻomaʻemaʻe ʻia no 1 hola a laila waiho ʻia i loko o kahi solution Bibrich aloe acid fuchsin no 10 mau minuke.A laila holoi ʻia nā paheʻe me ka wai hoʻoheheʻe ʻia a waiho ʻia i loko o kahi hopena o 5% phosphomolybdenum / 5% phosphotungstic acid no 10 mau minuke.Me ka holoi ʻole ʻana, e hoʻololi pololei i nā paheʻe i loko o ka solution polū aniline no 15 mau minuke.A laila holoi ʻia nā paheʻe me ka wai i hoʻoheheʻe ʻia a waiho ʻia i loko o kahi solution 1% acetic acid no 2 mau minuke.Hoʻomaloʻo ʻia nā paheʻe i 200 N ethanol a hoʻololi ʻia i xylene.ʻIke ʻia nā kiʻi paheʻe me ka microscope Keyence me kahi pahuhopu 10x.Ua helu ʻia ka pākēneka ʻāpana fibrosis me ka polokalamu Keyence Analyzer.
ʻO CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), helu helu V13154, e like me ka protocol o ka mea hana me kekahi mau hoʻololi.ʻO ka mea kūikawā, ua hoʻohana ʻia kahi punch ʻokiʻoki me ke anawaena o 6 mm e hōʻoia i ka nui o ka ʻiʻo like ʻole i ka wā o ka loiloi MTT.Hoʻopili ʻia nā ʻupena i loko o nā pūnāwai o kahi pā punawai 12 i loaʻa ka substrate MTT e like me ke kaʻina hana a ka mea hana.Hoʻomoʻa ʻia nā ʻāpana ma 37 ° C. no 3 mau hola a hoʻololi ka ʻiʻo ola i ka substrate MTT e hana i kahi pūhui formazan poni.E hoʻololi i ka solution MTT me 1 ml DMSO a hoʻomoʻa ma 37 °C no 15 mau minuke e unuhi i ka formazan poni mai nā ʻāpana puʻuwai.Ua hoʻoheheʻe ʻia nā laʻana i ka 1:10 ma DMSO i nā papa lalo 96-maikaʻi a me ka ikaika o ka kala poni i ana ʻia ma 570 nm me ka hoʻohana ʻana i kahi mea heluhelu Cytation plate (BioTek).Ua maʻamau ka heluhelu ʻana i ke kaumaha o kēlā me kēia ʻāpana o ka puʻuwai.
Ua pani ʻia ka media ʻāpana puʻuwai me ka media i loaʻa ka 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) no ka hoʻohana ʻana i ka glucose e like me ka mea i wehewehe mua ʻia.Ma hope o 4 mau hola o ka hoʻoulu ʻana, e hoʻohui i 100 µl o ka medium i kahi paipu microcentrifuge hāmama me 100 µl o 0.2 N HCl.A laila ua hoʻokomo ʻia ka paipu i loko o kahi paipu scintillation i loaʻa iā 500 μl o dH2O e hoʻoheheʻe [3H]2O no 72 mau hola ma 37°C.A laila e wehe i ka paipu microcentrifuge mai ka paipu scintillation a hoʻohui i 10 ml o ka wai scintillation.Hoʻohana ʻia nā helu Scintillation me ka Tri-Carb 2900TR liquid scintillation analyzer (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).A laila ua helu ʻia ka hoʻohana ʻana i ka glucose me ka noʻonoʻo ʻana i ka hana kikoʻī [5-3H]-glucose, ke kaulike ʻole a me ka hope, ka hoʻoheheʻe ʻana o [5-3H]-i ka glucose i hōʻailona ʻole ʻia, a me ka pono counter scintillation.Hoʻonohonoho ʻia ka ʻikepili i ka nui o nā ʻāpana o ka puʻuwai.
Ma hope o ka homogenization o nā kiko ma Trizol, ua hoʻokaʻawale ʻia ʻo RNA mai nā ʻāpana puʻuwai me ka hoʻohana ʻana i ka Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 e like me ka protocol o ka mea hana.Ua hana ʻia ka hoʻomākaukau ʻana o ka waihona waihona RNAsec, sequencing a me ka nānā ʻana i ka ʻikepili penei:
Ua hoʻohana ʻia ʻo 1 μg o RNA no kēlā me kēia laʻana i mea hoʻomaka no ka hoʻomākaukau ʻana i ka waihona RNA.Hana ʻia nā hale waihona puke me ka NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit no Illumina (NEB, USA) ma muli o nā ʻōlelo aʻoaʻo a ka mea hana, a ua hoʻohui ʻia nā code index i nā kaʻina hana no kēlā me kēia laʻana.I ka pōkole, ua hoʻomaʻemaʻe ʻia ka mRNA mai ka huina RNA me ka hoʻohana ʻana i nā peʻa magnetic i hoʻopili ʻia me nā poly-T oligonucleotides.Lawe ʻia ka ʻāpana me ka hoʻohana ʻana i nā cations divalent i ka wela kiʻekiʻe ma NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).Hoʻopili ʻia ka cDNA strand mua me ka hoʻohana ʻana i nā primer hexamer random a me M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-).Hoʻopili ʻia ke kaula cDNA ʻelua me ka DNA polymerase I a me RNase H. Hoʻololi ʻia nā koena overhangs i nā hopena blunt e ka hana exonuclease/polymerase.Ma hope o ka adenylation o ka hopena 3′ o ka ʻāpana DNA, ua hoʻopili ʻia kahi NEBNext Adapter me kahi ʻano lauoho lauoho e hoʻomākaukau ai no ka hybridization.No ke koho ʻana i nā ʻāpana cDNA o ka lōʻihi makemake ʻia 150-200 bp.ua hoʻomaʻemaʻe ʻia nā ʻāpana waihona me ka ʻōnaehana AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA).A laila, ua hoʻohana ʻia ʻo 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) me ka cDNA i koho nui ʻia me kahi mea hoʻopili no 15 mau minuke ma 37 ° C a laila no 5 mau minuke ma 95 ° C ma mua o PCR.A laila ua hana ʻia ka PCR me ka hoʻohana ʻana i ka Phusion High-Fidelity DNA polymerase, nā kumu mua PCR āpau, a me nā kumu mua Index (X).ʻO ka hope, ua hoʻomaʻemaʻe ʻia nā huahana PCR (pūnaewele AMPure XP) a nānā ʻia ka maikaʻi o ka waihona ma kahi ʻōnaehana Agilent Bioanalyzer 2100.Ua hoʻonohonoho ʻia ka waihona cDNA me ka hoʻohana ʻana i kahi sequencer Novaseq.Ua hoʻololi ʻia nā faila kiʻi makaʻu mai Illumina i nā heluhelu maka me ka hoʻohana ʻana i ka CASAVA Base Calling.Mālama ʻia ka ʻikepili maka ma nā faila FASTQ(fq) i loaʻa nā kaʻina heluhelu a me nā ʻano kumu kūpono.Koho i ka HISAT2 e hoʻohālikelike i ka helu helu ʻana i kānana me ka Sscrofa11.1 reference genome.Ma ka laulā, kākoʻo ʻo HISAT2 i nā genomes o kēlā me kēia nui, me nā genomes ʻoi aku ka nui ma mua o 4 biliona kumu, a ua hoʻonohonoho ʻia nā waiwai paʻamau no ka hapa nui.Hiki ke hoʻolikelike ʻia ka heluhelu ʻana mai ka ʻikepili RNA Seq me ka hoʻohana ʻana iā HISAT2, ka ʻōnaehana wikiwiki loa i loaʻa i kēia manawa, me ka pololei a ʻoi aku ka maikaʻi ma mua o nā ʻano hana ʻē aʻe.
Hōʻike pololei ka nui o nā transcripts i ke kiʻekiʻe o ka hōʻike gene.ʻIke ʻia nā pae hōʻike Gene e ka nui o nā transcripts (sequencing count) pili me ka genome a i ʻole exons.Hoʻohālikelike ka helu o nā heluhelu i nā pae hōʻike gene, ka lōʻihi o ka gene, a me ka hohonu o ke kaʻina.Ua helu ʻia ʻo FPKM (nā ʻāpana no kēlā me kēia kaukani kumu pālua o ka transcript i hoʻopaʻa ʻia i kēlā me kēia miliona base pairs) a ua hoʻoholo ʻia nā waiwai P o ka ʻōlelo ʻokoʻa me ka hoʻohana ʻana i ka pā DESeq2.A laila, helu mākou i ka helu ʻike wahaheʻe (FDR) no kēlā me kēia waiwai P me ka hoʻohana ʻana i ka Benjamini-Hochberg method9 e pili ana i ka hana R i kūkulu ʻia "p.adjust".
Ua hoʻololi ʻia ʻo RNA i hoʻokaʻawale ʻia mai nā ʻāpana puʻuwai i cDNA ma kahi ʻano o 200 ng / μl me ka hoʻohana ʻana i ka SuperScript IV Vilo Master mix mai Thermo (Thermo, cat. No. 11756050).Ua hana 'ia ka Quantitative RT-PCR me ka Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well transparent reaction plate (Thermo, cat. No. 4483319) a me ka microamp optical adhesive (Thermo, cat. No. 4311971).ʻO ka hui ʻana he 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer a me 3.5 µl H2O i hui ʻia i kēlā me kēia luawai.Ua holo ʻia nā pōʻai qPCR maʻamau a ua ana ʻia nā waiwai CT me ka Applied Biosystems Quantstudio 5 mea hana PCR manawa maoli (384-well module; huahana # A28135).Ua kūʻai ʻia nā primer Taqman mai Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss09_1008_m1) ), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) ua hoʻohālikelike ʻia nā genes mālama ʻana a pau o ka hale mālama ʻo CT.
Ua loiloi ʻia ka hoʻokuʻu ʻana o ka media o NT-ProBNP me ka hoʻohana ʻana i ka kit NT-ProBNP (puaʻa) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) e like me ka protocol o ka mea hana.ʻO ka pōkole, ua hoʻohui ʻia he 250 µl o kēlā me kēia laʻana a me ka maʻamau i ʻelua i kēlā me kēia luawai.Ma hope koke o ka hoʻohui ʻana i ka hāpana, e hoʻohui i 50 µl o Assay Reagent A i kēlā me kēia pūnāwai.E lulu mālie i ka pā a hoʻopaʻa me ka sealant.A laila hoʻokomo ʻia nā papa ma 37 ° C no 1 hola.A laila e hoʻomoʻi i ka hopena a holoi i nā pūnāwai 4 manawa me 350 µl o 1X solution holoi, e hoʻomoʻa i ka wai holoi no 1-2 mau minuke i kēlā me kēia manawa.A laila e hoʻohui i 100 µl o Assay Reagent B i kēlā me kēia pūnāwai a hoʻopaʻa ʻia me ka sealant pā.Hoʻoluliluli mālie ʻia ka papa ma 37 ° C no 30 mau minuke.E hoʻomoʻi i ka wai hoʻonā a holoi i nā pūnāwai 5 manawa me 350 µl o ka wai holoi holoi 1X.E hoʻohui i 90 µl o ka substrate solution i kēlā me kēia pūnāwai a hoʻopaʻa i ka pā.Hoʻopili i ka pā ma 37 ° C no 10-20 mau minuke.E hoʻohui i 50 µl Stop Solution i kēlā me kēia pūnāwai.Ua ana koke ʻia ka pā me ka Cytation (BioTek) plate reader i hoʻonohonoho ʻia ma 450 nm.
Ua hana ʻia nā kānana mana e koho i ka nui o ka hui e hāʻawi i ka mana> 80% e ʻike i kahi 10% hoʻololi piha i ka pākuʻi me ka 5% Type I error rate. Ua hana ʻia nā kānana mana e koho i ka nui o ka hui e hāʻawi i ka mana> 80% e ʻike i kahi 10% hoʻololi piha i ka pākuʻi me ka 5% Type I error rate. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% раметра с 5% частотой ошибок типа I. Hana ʻia ka nānā ʻana i ka mana no ke koho ʻana i ka nui o ka hui e hāʻawi ai i ka mana> 80% e ʻike ai i ka 10% hoʻololi ʻokoʻa piha me ka 5% Type I error rate.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I小田金。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I小田金。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнарузлегениа я параметров и 5% частоты ошибок типа I. Ua hana ʻia kahi loiloi mana no ke koho ʻana i ka nui o ka hui e hāʻawi i ka mana> 80% e ʻike ai i ka 10% hoʻololi hoʻololi pono a me 5% ʻano helu hapa I.Ua koho wale ʻia nā ʻāpana kiko ma mua o ka hoʻokolohua.He makapō nā hōʻike a pau a ua unuhi ʻia nā laʻana ma hope o ke kālailai ʻia ʻana o nā ʻikepili āpau.Ua hoʻohana ʻia ka polokalamu GraphPad Prism (San Diego, CA) e hana i nā ʻikepili helu āpau. No nā helu helu a pau, ua manaʻo nui ʻia nā p-waiwai ma nā waiwai <0.05. No nā helu helu āpau, ua manaʻo nui ʻia nā p-values ​​i nā waiwai <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. No nā helu helu āpau, ua manaʻo nui ʻia nā p-values ​​i nā waiwai <0.05.对于所有统计数据，p 值在会<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在会<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. No nā helu helu āpau, ua manaʻo nui ʻia nā p-values ​​i nā waiwai <0.05.Ua hana ʻia ka hoʻāʻo-t a ka Haumāna huelo ʻelua ma ka ʻikepili me nā hoʻohālikelike 2 wale nō.Ua hoʻohana ʻia ʻo ANOVA hoʻokahi ala a ʻelua ala paha e hoʻoholo ai i ke koʻikoʻi ma waena o nā hui lehulehu.I ka hana ʻana i nā hoʻāʻo post hoc, ua hoʻohana ʻia ka hoʻoponopono ʻana a Tukey i ka helu no nā hoʻohālikelike lehulehu.Loaʻa i ka ʻikepili RNAsec nā manaʻo helu helu kūikawā i ka helu ʻana i ka FDR a me ka p.adjust e like me ka mea i wehewehe ʻia ma ka ʻāpana Methods.
No ka ʻike hou aku e pili ana i ka hoʻolālā haʻawina, e ʻike i ka abstract Nature Research Report i pili i kēia ʻatikala.