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मानव आंत आकृति विज्ञान 3D उपकला माइक्रोआर्किटेक्चर और स्थानिक संगठन की क्रिप्ट-विलस विशेषताओं को स्थापित करता है। यह अनूठी संरचना बेसल क्रिप्ट में स्टेम सेल आला को बहिर्जात माइक्रोबियल एंटीजन और उनके मेटाबोलाइट्स से बचाकर आंत के होमियोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, आंत के विल्ली और स्रावित बलगम आंत की म्यूकोसल सतह पर एक सुरक्षात्मक अवरोध के साथ कार्यात्मक रूप से विभेदित उपकला कोशिकाओं को प्रस्तुत करते हैं। इसलिए, इन विट्रो आंत मॉडल के निर्माण के लिए 3D उपकला संरचनाओं को फिर से बनाना महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से, ऑर्गेनिक मिमिक गट-ऑन-ए-चिप बढ़ी हुई शारीरिक क्रियाओं और बायोमैकेनिक्स के साथ आंत के उपकला के स्वतःस्फूर्त 3D आकृति विज्ञान को प्रेरित कर सकता है। यहां, हम एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप के साथ-साथ ट्रांसवेल एम्बेडेड हाइब्रिड चिप पर आंत में आंतों के आकृति विज्ञान को मजबूती से प्रेरित करने के लिए एक पुनरुत्पादनीय प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफ़ॉर्म, 3D मॉर्फोजेनेसिस का प्रेरण, और कई इमेजिंग तौर-तरीकों का उपयोग करके स्थापित 3D उपकला का लक्षण वर्णन। यह प्रोटोकॉल 5 दिनों के लिए बेसोलैटरल द्रव प्रवाह को नियंत्रित करके कार्यात्मक आंत माइक्रोआर्किटेक्चर के पुनर्जनन को प्राप्त करता है। हमारी इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस विधि शारीरिक रूप से प्रासंगिक कतरनी तनाव और यांत्रिक गति को नियोजित करती है और इसमें जटिल सेल इंजीनियरिंग या हेरफेर की आवश्यकता नहीं होती है, जो अन्य मौजूदा तकनीकों से बेहतर प्रदर्शन कर सकती है। हम कल्पना करते हैं कि हमारे प्रस्तावित प्रोटोकॉल का बायोमेडिकल अनुसंधान समुदाय के लिए व्यापक प्रभाव हो सकता है, जो बायोमेडिकल, क्लिनिकल और फार्मास्युटिकल अनुप्रयोगों के लिए इन विट्रो में 3 डी आंत्र उपकला परतों को पुनर्जीवित करने की एक विधि प्रदान करता है।
प्रयोगों से पता चलता है कि आंत-ऑन-ए-चिप1,2,3,4,5 या द्विपरत माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों6,7 में संवर्धित आंत्र उपकला कैको-2 कोशिकाएं अंतर्निहित तंत्र की स्पष्ट समझ के बिना इन विट्रो में स्वतःस्फूर्त 3डी मॉर्फोजेनेसिस से गुजर सकती हैं। हमारे हाल के अध्ययन में, हमने पाया कि संस्कृति उपकरणों से बेसोलैटरल रूप से स्रावित मॉर्फोजेन प्रतिपक्षी को हटाना इन विट्रो में 3डी उपकला मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए आवश्यक और पर्याप्त है, जिसे कैको-2 और रोगी-व्युत्पन्न आंत्र ऑर्गेनोइड्स द्वारा प्रदर्शित किया गया है। उपकला कोशिकाओं को मान्य किया गया। इस अध्ययन में, हमने विशेष रूप से एक शक्तिशाली Wnt प्रतिपक्षी, डिककोफ-1 (DKK-1) के सेल उत्पादन और सांद्रता वितरण पर ध्यान केंद्रित किया, जो कि गट-ऑन-ए-चिप और संशोधित माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में ट्रांसवेल इंसर्ट होते हैं, जिन्हें "हाइब्रिड चिप" कहा जाता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि बहिर्जात Wnt प्रतिपक्षी (जैसे DKK-1, Wnt रिप्रेसर 1, स्रावित फ्रिज़ल्ड-संबंधित प्रोटीन 1, या सोगी-1) को ऑन-चिप आंत में जोड़ने से मॉर्फोजेनेसिस बाधित होता है या पूर्व-संरचित 3D उपकला परत बाधित होती है, यह सुझाव देते हुए कि संस्कृति के दौरान प्रतिपक्षी तनाव इन विट्रो में आंतों के मॉर्फोजेनेसिस के लिए जिम्मेदार है। इसलिए, उपकला इंटरफेस पर मजबूत मॉर्फोजेनेसिस को प्राप्त करने का एक व्यावहारिक तरीका सक्रिय फ्लशिंग (उदाहरण के लिए, गट-ऑन-ए-चिप या हाइब्रिड-ऑन-ए-चिप प्रसार .बेसोलैटरल मीडिया (उदाहरण के लिए, कुओं में बड़े बेसोलैटरल जलाशयों में ट्रांसवेल सम्मिलन से)।
इस प्रोटोकॉल में, हम पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस)-आधारित छिद्रपूर्ण झिल्ली (चरण 6ए, 7ए, 8, 9) या ट्रांसवेल इंसर्ट की पॉलिएस्टर झिल्ली (चरण 6बी, 7बी, 8, 9) पर आंत्र उपकला कोशिकाओं के संवर्धन के लिए गट-ऑन-ए-चिप माइक्रोडिवाइस और ट्रांसवेल-इंसर्टेबल हाइब्रिड चिप्स (चरण 1-5) बनाने की एक विस्तृत विधि प्रदान करते हैं और इन विट्रो में 3डी मॉर्फोजेनेसिस प्रेरित करते हैं (चरण 10)। हमने कई इमेजिंग तौर-तरीकों (चरण 11-24) को लागू करके ऊतक-विशिष्ट हिस्टोजेनेसिस और वंश-निर्भर सेलुलर भेदभाव के संकेत देने वाले सेलुलर और आणविक विशेषताओं की भी पहचान की। 2D उपकला मोनोलेयर्स से 3D मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए, हमने संस्कृति के बेसोलैटरल कम्पार्टमेंट में माध्यम को प्रवाहित करके दोनों सुसंस्कृत रूपों में मॉर्फोजेन प्रतिपक्षी को हटा दिया। अंत में, हम एक पुनर्योजी 3D उपकला परत की उपयोगिता का प्रतिनिधित्व प्रदान करते हैं जिसका उपयोग मॉर्फोजेन-निर्भर उपकला विकास, अनुदैर्ध्य मेजबान-माइक्रोबायोम सह-संस्कृतियों, रोगजनक संक्रमण, सूजन की चोट, उपकला बाधा शिथिलता और प्रोबायोटिक-आधारित उपचारों के उदाहरण के रूप में किया जा सकता है।
हमारा प्रोटोकॉल बुनियादी (उदाहरण के लिए, आंतों के म्यूकोसल जीव विज्ञान, स्टेम सेल जीव विज्ञान और विकासात्मक जीव विज्ञान) और अनुप्रयुक्त अनुसंधान (उदाहरण के लिए, प्रीक्लिनिकल दवा परीक्षण, रोग मॉडलिंग, ऊतक इंजीनियरिंग और गैस्ट्रोएंटरोलॉजी) के व्यापक प्रभाव वाले वैज्ञानिकों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोगी हो सकता है। आंतों के उपकला में 3डी मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए हमारे प्रोटोकॉल की पुनरुत्पादकता और मजबूती के कारण, हम कल्पना करते हैं कि हमारी तकनीकी रणनीति आंतों के विकास, पुनर्जनन या होमोस्टैसिस के दौरान सेल सिग्नलिंग की गतिशीलता का अध्ययन करने वाले दर्शकों तक प्रसारित की जा सकती है। इसके अलावा, हमारा प्रोटोकॉल विभिन्न संक्रामक एजेंटों जैसे नोरोवायरस 8, गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (SARS-CoV-2), क्लॉस्ट्रिडियम डिफिसाइल, साल्मोनेला टाइफीम्यूरियम 9 या विब्रियो कोलेरा के तहत संक्रमण की जांच के लिए उपयोगी है। रोग विकृति विज्ञान और रोगजनन के दर्शक भी उपयोगी हैं। ऑन-चिप आंत माइक्रोफिजियोलॉजी प्रणाली का उपयोग अनुदैर्ध्य सह-संस्कृति 10 और मेजबान रक्षा, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और जठरांत्र (जीआई) पथ 11 में रोगजनक से संबंधित चोट की मरम्मत के बाद के आकलन की अनुमति दे सकता है। लीकी आंत सिंड्रोम, सेलेक रोग, क्रोहन रोग, अल्सरेटिव कोलाइटिस, पाउचिटिस, या चिड़चिड़ा आंत्र सिंड्रोम से जुड़े अन्य जीआई विकारों को 3 डी आंतों के उपकला परतों का उपयोग करके तैयार किए जाने पर अनुकरण किया जा सकता है, इन रोगों में विलस एट्रोफी, क्रिप्ट शॉर्टनिंग, म्यूकोसल क्षति, या खराब उपकला बाधा शामिल हैं। बायोप्सी या स्टेम सेल-व्युत्पन्न आंतों के ऑर्गेनोइड्स ऊतक-विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाएं, 5.
चूँकि 3D उपकला सूक्ष्म संरचना को बिना किसी सेक्शनिंग प्रक्रिया के तय और देखा जा सकता है, इसलिए स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स और उच्च-रिज़ॉल्यूशन या सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग पर काम करने वाले दर्शक उपकला के निशानों पर जीन और प्रोटीन की स्थानिक गतिशीलता के हमारे मानचित्रण में रुचि रख सकते हैं। प्रौद्योगिकी में रुचि। माइक्रोबियल या प्रतिरक्षा उत्तेजनाओं के प्रति प्रतिक्रिया। इसके अलावा, अनुदैर्ध्य मेजबान-माइक्रोबायोम क्रॉसटॉक 10, 14 जो आंत के होमियोस्टेसिस का समन्वय करते हैं, उन्हें विभिन्न माइक्रोबियल प्रजातियों, माइक्रोबियल समुदायों या फेकल माइक्रोबायोटा, विशेष रूप से गट-ऑन-ए-चिप में सह-संस्कृति द्वारा 3D आंत्र म्यूकोसल परत में स्थापित किया जा सकता है। मंच में। यह दृष्टिकोण विशेष रूप से म्यूकोसल इम्यूनोलॉजी, गैस्ट्रोएंटरोलॉजी, मानव माइक्रोबायोम, कल्चरोमिक्स और क्लिनिकल माइक्रोबायोलॉजी का अध्ययन करने वाले दर्शकों के लिए आकर्षक है, जो प्रयोगशाला में पहले से असंगठित आंत माइक्रोबायोटा की खेती करना चाहते हैं। यदि हमारे इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस प्रोटोकॉल को स्केलेबल कल्चर फॉर्मेट में अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि 24, 96 या 384 वेल प्लेटों में मल्टीवेल इंसर्ट जो लगातार बेसोलैटरल डिब्बों को फिर से भरते हैं, तो प्रोटोकॉल को उन लोगों तक भी प्रसारित किया जा सकता है जो फार्मास्युटिकल, बायोमेडिकल या खाद्य उद्योग के लिए उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग या सत्यापन प्लेटफॉर्म विकसित कर रहे हैं। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, हमने हाल ही में एक मल्टीप्लेक्स हाई-थ्रूपुट मॉर्फोजेनेसिस सिस्टम की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है जो 24-वेल प्लेट प्रारूप में स्केलेबल है। इसके अलावा, कई ऑर्गन-ऑन-ए-चिप उत्पादों का व्यावसायीकरण किया गया है दवाओं या जैव-चिकित्सा का परीक्षण करने के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक स्तर पर इन विट्रो आंत आकारिकी का पुनःप्रोग्रामिंग। दवा उम्मीदवारों के अवशोषण और परिवहन का मूल्यांकन 3 डी आंत सरोगेट्स का उपयोग करके या आंत आकारिकी प्रक्रिया की पुनरुत्पादकता का आकलन करने के लिए कस्टम या वाणिज्यिक ऑर्गन-ऑन-ए-चिप मॉडल का उपयोग करके किया गया था।
आंतों के उपकला आकारिकी का अध्ययन करने के लिए सीमित संख्या में मानव-प्रासंगिक प्रयोगात्मक मॉडल का उपयोग किया गया है, जिसका मुख्य कारण इन विट्रो में 3D आकारिकी को प्रेरित करने के लिए कार्यान्वयन योग्य प्रोटोकॉल की कमी है। वास्तव में, आंत आकारिकी के बारे में वर्तमान ज्ञान का अधिकांश भाग पशु अध्ययनों (जैसे, ज़ेब्राफ़िश20, चूहे21 या मुर्गियाँ22) पर आधारित है। हालाँकि, वे श्रम- और लागत-गहन हैं, नैतिक रूप से संदिग्ध हो सकते हैं, और सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि वे मानव विकास प्रक्रियाओं को सटीक रूप से निर्धारित नहीं करते हैं। ये मॉडल बहु-तरफ़ा स्केलेबल तरीके से परीक्षण किए जाने की उनकी क्षमता में भी बहुत सीमित हैं। इसलिए, इन विट्रो में 3D ऊतक संरचनाओं को पुनर्जीवित करने का हमारा प्रोटोकॉल इन विवो पशु मॉडल के साथ-साथ अन्य पारंपरिक स्थिर 2D सेल संस्कृति मॉडल से बेहतर प्रदर्शन करता है। सूक्ष्मजीवी कोशिकाएं मेज़बान कारकों (जैसे, आंतरिक बनाम बाहरी बलगम परतें, IgA और रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स का स्राव) की प्रतिक्रिया में स्थानिक जगहों और पारिस्थितिक विकास के लिए प्रतिस्पर्धा करती हैं। इसके अलावा, 3D उपकला आकारिकी हमें यह समझने की अनुमति दे सकती है कि आंत माइक्रोबायोटा अपने समुदायों को कैसे संरचित करता है और सूक्ष्मजीवी मेटाबोलाइट्स (जैसे, लघु-श्रृंखला फैटी एसिड) का सहक्रियात्मक रूप से उत्पादन करता है जो बेसल क्रिप्ट में सेलुलर संगठन और स्टेम सेल जगहों को आकार देते हैं। इन विशेषताओं को केवल तभी प्रदर्शित किया जा सकता है जब 3D उपकला परतें इन विट्रो में स्थापित की जाती हैं।
3D आंत्र उपकला संरचना बनाने की हमारी विधि के अलावा, कई इन विट्रो विधियाँ हैं। आंत्र ऑर्गेनोइड संस्कृति एक अत्याधुनिक ऊतक इंजीनियरिंग तकनीक है जो विशिष्ट मोर्फोजेन स्थितियों23,24,25 के तहत आंत्र स्टेम कोशिकाओं की खेती पर आधारित है। हालाँकि, परिवहन विश्लेषण या मेजबान-माइक्रोबायोम सह-संस्कृतियों के लिए 3D ऑर्गेनोइड मॉडल का उपयोग अक्सर चुनौतीपूर्ण होता है क्योंकि आंत का लुमेन ऑर्गेनोइड के भीतर संलग्न होता है और इसलिए, माइक्रोबियल कोशिकाओं या बहिर्जात प्रतिजनों जैसे ल्यूमिनल घटकों की शुरूआत सीमित होती है। माइक्रोइंजेक्टर,26,27 का उपयोग करके ऑर्गेनोइड लुमेन तक पहुँच में सुधार किया जा सकता है, लेकिन यह विधि आक्रामक और श्रम-गहन है और इसे निष्पादित करने के लिए विशेष ज्ञान की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, स्थिर स्थितियों के तहत हाइड्रोजेल मचानों में बनाए गए पारंपरिक ऑर्गेनोइड संस्कृतियाँ सक्रिय इन विवो बायोमैकेनिक्स को सटीक रूप से प्रतिबिंबित नहीं करती हैं।
कई शोध समूहों द्वारा नियोजित अन्य दृष्टिकोण जेल की सतह पर पृथक मानव आंत्र कोशिकाओं की खेती करके आंत उपकला संरचना की नकल करने के लिए पूर्व-संरचित 3D हाइड्रोजेल मचानों का उपयोग करते हैं। 3D-मुद्रित, माइक्रो-मिल्ड या लिथोग्राफिक रूप से निर्मित सांचों का उपयोग करके हाइड्रोजेल मचानों का निर्माण करें। यह विधि शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉर्फोजेन ग्रेडिएंट के साथ इन विट्रो में पृथक उपकला कोशिकाओं की स्व-संगठित व्यवस्था को दर्शाती है, मचान में स्ट्रोमल कोशिकाओं को शामिल करके एक उच्च पहलू अनुपात उपकला संरचना और स्ट्रोमा-उपकला क्रॉसटॉक की स्थापना करती है। हालाँकि, पूर्व-संरचित मचानों की प्रकृति स्वतःस्फूर्त मोर्फोजेनेटिक प्रक्रिया के प्रदर्शन को रोक सकती है। ये मॉडल गतिशील ल्यूमिनल या अंतरालीय प्रवाह भी प्रदान नहीं करते हैं, जिसमें द्रव कतरनी तनाव की कमी होती है जो आंतों की कोशिकाओं को रूप-निर्माण से गुजरने और शारीरिक कार्य प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। एक अन्य हालिया अध्ययन में माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफ़ॉर्म में हाइड्रोजेल मचानों का उपयोग किया गया और लेजर-एचिंग तकनीकों का उपयोग करके आंतों की उपकला संरचनाओं को पैटर्न किया गया। माउस आंतों के ऑर्गेनोइड्स आंतों की नलिका संबंधी संरचनाएं बनाने के लिए नक्काशीदार पैटर्न का अनुसरण करें, और माइक्रोफ्लुइडिक्स मॉड्यूल का उपयोग करके इंट्राल्यूमिनल द्रव प्रवाह को पुनरावृत्ति किया जा सकता है। हालाँकि, यह मॉडल न तो स्वतःस्फूर्त मोर्फोजेनेटिक प्रक्रियाओं को प्रदर्शित करता है और न ही इसमें आंत की मैकेनोबायोलॉजिकल गतिविधियाँ शामिल हैं। उसी समूह की 3D प्रिंटिंग तकनीक स्वतःस्फूर्त मोर्फोजेनेटिक प्रक्रियाओं के साथ लघु आंत ट्यूब बनाने में सक्षम थीं। ट्यूब के भीतर विभिन्न आंत खंडों के जटिल निर्माण के बावजूद, इस मॉडल में ल्यूमिनल द्रव प्रवाह और यांत्रिक विरूपण का भी अभाव है। इसके अतिरिक्त, मॉडल की संचालन क्षमता सीमित हो सकती है, विशेष रूप से बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया पूरी होने के बाद, जो प्रयोगात्मक स्थितियों या सेल-टू-सेल इंटरैक्शन को परेशान कर सकती है। इसके बजाय, हमारा प्रस्तावित प्रोटोकॉल स्वतःस्फूर्त आंत मॉर्फोजेनेसिस, शारीरिक रूप से प्रासंगिक कतरनी तनाव, बायोमैकेनिक्स जो आंत की गतिशीलता की नकल करते हैं, स्वतंत्र शीर्षस्थ और बेसोलैटरल डिब्बों की पहुँच, और मॉड्यूलरिटी के जटिल जैविक सूक्ष्म वातावरण का पुनः निर्माण प्रदान करता है। इसलिए, हमारा इन विट्रो 3D मॉर्फोजेनेसिस प्रोटोकॉल मौजूदा तरीकों की चुनौतियों पर काबू पाने के लिए एक पूरक दृष्टिकोण प्रदान कर सकता है।
हमारा प्रोटोकॉल पूरी तरह से 3D उपकला आकारिकी पर केंद्रित है, जिसमें संस्कृति में केवल उपकला कोशिकाएं हैं और आसपास की कोई अन्य प्रकार की कोशिकाएं जैसे कि मेसेनकाइमल कोशिकाएं, एंडोथेलियल कोशिकाएं और प्रतिरक्षा कोशिकाएं नहीं हैं। जैसा कि पहले वर्णित किया गया है, हमारे प्रोटोकॉल का मूल पेश किए गए माध्यम के बेसोलैटरल पक्ष में स्रावित मॉर्फोजेन अवरोधकों को हटाकर उपकला आकारिकी को प्रेरित करना है। जबकि हमारे गट-ऑन-ए-चिप और हाइब्रिड-ऑन-ए-चिप की मजबूत मॉड्यूलरिटी हमें लहरदार 3D उपकला परत को फिर से बनाने की अनुमति देती है, अतिरिक्त जैविक जटिलताएं जैसे कि उपकला-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन33,34, एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) जमा 35 और, हमारे मॉडल में, क्रिप्ट-विलस विशेषताएं जो बेसल क्रिप्ट में स्टेम सेल निचेस को व्यक्त करती हैं, पर आगे विचार किया जाना बाकी है। विवो35,37,38. हमारे मॉडल में मेसेनकाइमल कोशिकाओं को शामिल करने से मोर्फोजेनेटिक प्रक्रिया और कोशिका संलग्नता दक्षता में वृद्धि हुई। एंडोथेलियल परत (यानी, केशिकाएं या लसीका) आंत के सूक्ष्म वातावरण में आणविक परिवहन39 और प्रतिरक्षा कोशिका भर्ती40 को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। इसके अलावा, ऊतक मॉडल के बीच जुड़ने वाले संवहनी घटक एक शर्त हैं जब ऊतक मॉडल को बहु-अंग इंटरैक्शन को प्रदर्शित करने के लिए डिज़ाइन किया जाता है। इसलिए, एंडोथेलियल कोशिकाओं को अंग-स्तरीय रिज़ॉल्यूशन के साथ अधिक सटीक शारीरिक विशेषताओं को मॉडल करने के लिए शामिल करने की आवश्यकता हो सकती है। रोगी-व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाएं आंत की बीमारी की नकल करने के संदर्भ में जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, एंटीजन प्रस्तुति, जन्मजात अनुकूली प्रतिरक्षा क्रॉसटॉक और ऊतक-विशिष्ट प्रतिरक्षा को प्रदर्शित करने के लिए भी आवश्यक हैं।
हाइब्रिड चिप्स का उपयोग गट-ऑन-ए-चिप की तुलना में अधिक सीधा है क्योंकि डिवाइस सेटअप सरल है और ट्रांसवेल इंसर्ट का उपयोग गट एपिथेलियम के स्केलेबल कल्चर के लिए अनुमति देता है। हालांकि, पॉलिएस्टर झिल्ली के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ट्रांसवेल इंसर्ट लचीले नहीं हैं और पेरिस्टाल्टिक जैसी गतिविधियों का अनुकरण नहीं कर सकते हैं। इसके अलावा, हाइब्रिड चिप में रखे गए ट्रांसवेल इंसर्ट का शीर्ष कम्पार्टमेंट शीर्ष पर किसी कतरनी तनाव के बिना स्थिर रहा। स्पष्ट रूप से, शीर्ष कम्पार्टमेंट में स्थैतिक गुण हाइब्रिड चिप्स में दीर्घकालिक बैक्टीरियल सह-संस्कृति को शायद ही कभी सक्षम करते हैं। हालांकि हम हाइब्रिड चिप्स का उपयोग करते समय ट्रांसवेल इंसर्ट में 3 डी मॉर्फोजेनेसिस को मजबूती से प्रेरित कर सकते हैं,
गट-ऑन-ए-चिप और हाइब्रिड-ऑन-ए-चिप संस्कृतियों में मानव क्रिप्ट-विलस अक्ष के पूर्ण पैमाने पर पुनर्निर्माण पूरी तरह से स्थापित नहीं हुए हैं।
इमेजिंग के दृष्टिकोण से, 3D माइक्रोआर्किटेक्चर की इन-सीटू सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग चिप पर आंत तक सीमित हो सकती है, क्योंकि ऑब्जेक्टिव लेंस से उपकला परत तक आवश्यक कार्य दूरी कुछ मिलीमीटर के क्रम की होती है। इस समस्या को दूर करने के लिए, एक दूरस्थ ऑब्जेक्टिव की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, PDMS की उच्च लोच के कारण इमेजिंग नमूना तैयार करने के लिए पतले खंड बनाना चुनौतीपूर्ण है। इसके अलावा, चूंकि चिप पर आंत के परत-दर-परत माइक्रोफैब्रिकेशन में प्रत्येक परत के बीच स्थायी आसंजन शामिल होता है, इसलिए उपकला परत की सतह संरचना की जांच करने के लिए ऊपरी परत को खोलना या हटाना बेहद चुनौतीपूर्ण होता है। उदाहरण के लिए, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) का उपयोग करके।
पीडीएमएस की हाइड्रोफोबिसिटी हाइड्रोफोबिक छोटे अणुओं से निपटने वाले माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित अध्ययनों में एक सीमित कारक रही है, क्योंकि पीडीएमएस ऐसे हाइड्रोफोबिक अणुओं को अविशिष्ट रूप से सोख सकता है। अन्य बहुलक सामग्रियों के साथ पीडीएमएस के विकल्पों पर विचार किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, हाइड्रोफोबिक अणुओं के अवशोषण को कम करने के लिए पीडीएमएस के सतह संशोधन (उदाहरण के लिए, लिपोफिलिक सामग्रियों 42 या पॉली (एथिलीन ग्लाइकॉल) 43 के साथ कोटिंग) पर विचार किया जा सकता है।
अंत में, हमारी विधि को उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग या "एक आकार-फिट-सभी" उपयोगकर्ता-अनुकूल प्रयोगात्मक प्लेटफ़ॉर्म प्रदान करने के संदर्भ में अच्छी तरह से चित्रित नहीं किया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल में प्रत्येक माइक्रोडिवाइस के लिए एक सिरिंज पंप की आवश्यकता होती है, जो CO2 इनक्यूबेटर में जगह लेता है और बड़े पैमाने पर प्रयोगों को रोकता है। इस सीमा को अभिनव संस्कृति प्रारूपों (जैसे, 24-वेल, 96-वेल, या 384-वेल छिद्रपूर्ण सम्मिलन जो निरंतर पुनःपूर्ति और बेसोलैटरल मीडिया को हटाने की अनुमति देते हैं) की मापनीयता से काफी हद तक सुधारा जा सकता है।
मानव आंत्र उपकला की 3D आकृतिजनन को इन विट्रो में प्रेरित करने के लिए, हमने एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप आंत उपकरण का इस्तेमाल किया जिसमें दो समानांतर सूक्ष्म चैनल और उनके बीच एक लोचदार छिद्रपूर्ण झिल्ली थी ताकि लुमेन-केशिका इंटरफेस बनाया जा सके। हम एक एकल-चैनल माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण (एक हाइब्रिड चिप) के उपयोग को भी प्रदर्शित करते हैं जो ट्रांसवेल सम्मिलन पर विकसित ध्रुवीकृत उपकला परतों के नीचे निरंतर बेसोलैटरल प्रवाह प्रदान करता है। दोनों प्लेटफार्मों में, बेसोलैटरल कम्पार्टमेंट से मॉर्फोजेन प्रतिपक्षी को हटाने के लिए प्रवाह के दिशात्मक हेरफेर को लागू करके विभिन्न मानव आंत उपकला कोशिकाओं के आकृतिजनन का प्रदर्शन किया जा सकता है। संपूर्ण प्रयोगात्मक प्रक्रिया (चित्र 1) में पांच भाग शामिल हैं: (i) आंत चिप या ट्रांसवेल सम्मिलन योग्य हाइब्रिड चिप का माइक्रोफेब्रिकेशन (चरण 1-5; बॉक्स 2-5), (iii) आंतों के चिप्स या हाइब्रिड चिप्स पर आंतों के उपकला कोशिकाओं की संस्कृति (चरण 6-9), (iv) इन विट्रो में 3 डी मॉर्फोजेनेसिस का प्रेरण (चरण 10) और (v) 3 डी उपकला माइक्रोस्ट्रक्चर (चरण 11-24) को चिह्नित करने के लिए। अंत में, एक उपयुक्त नियंत्रण समूह (नीचे आगे चर्चा की गई) को स्थानिक, लौकिक, सशर्त या प्रक्रियात्मक नियंत्रणों के साथ उपकला मॉर्फोजेनेसिस की तुलना करके इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस की प्रभावशीलता को मान्य करने के लिए डिज़ाइन किया गया था।
हमने दो अलग-अलग संवर्धन प्लेटफॉर्म का उपयोग किया: सीधे चैनल या गैर-रैखिक घुमावदार चैनल वाले गट-ऑन-ए-चिप, या माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में ट्रांसवेल (टीडब्लू) सम्मिलित वाले हाइब्रिड चिप्स, जिन्हें बॉक्स 1 में वर्णित अनुसार निर्मित किया गया था, और चरण 1 -5। "डिवाइस निर्माण" एकल चिप या हाइब्रिड चिप बनाने में मुख्य चरणों को दर्शाता है। "मानव आंतों के उपकला कोशिकाओं की संस्कृति" इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए सेल स्रोत (Caco-2 या मानव आंतों के ऑर्गेनोइड) और संवर्धन प्रक्रिया की व्याख्या करती है। "इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस" समग्र चरणों को दर्शाता है जिसमें Caco-2 या ऑर्गेनोइड-व्युत्पन्न उपकला कोशिकाओं को आंतों की चिप पर या हाइब्रिड चिप के ट्रांसवेल सम्मिलित पर संवर्धित किया जाता है मेजबान-माइक्रोबायोम पारिस्थितिकी तंत्र, और रोग मॉडलिंग। "कोशिका विभेदन" में इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां, आंत चिप पर उत्पन्न 3D Caco-2 उपकला परत में व्यक्त नाभिक, एफ-एक्टिन और MUC2 दिखाती हैं। MUC2 सिग्नलिंग गॉब्लेट कोशिकाओं और म्यूकोसल सतहों से स्रावित बलगम में मौजूद होता है। गट फिजियोलॉजी में फ्लोरोसेंट छवियां फ्लोरोसेंट गेहूं रोगाणु एग्लूटीनिन का उपयोग करके सियालिक एसिड और एन-एसिटाइलग्लुकोसामिन अवशेषों के लिए धुंधला होने से उत्पन्न बलगम दिखाती हैं। "होस्ट-माइक्रोब सह-संस्कृतियों" में दो ओवरलैपिंग छवियां एक चिप पर आंत में प्रतिनिधि मेजबान-माइक्रोबायोम सह-संस्कृतियों को दिखाती हैं। इसके बाद एफ-एक्टिन (लाल) और नाभिका (नीला) के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस अभिरंजन किया जाता है। रोग मॉडलिंग, जीवाणु प्रतिजनों (जैसे, लिपोपॉलीसेकेराइड, एलपीएस) और प्रतिरक्षा कोशिकाओं (जैसे, पीबीएमसी; हरा) के साथ शारीरिक चुनौती के तहत आंत की सूजन के चिप्स में स्वस्थ बनाम लीकी आंत को दर्शाती है। 3डी उपकला परत स्थापित करने के लिए कैको-2 कोशिकाओं को संवर्धित किया गया। स्केल बार, 50 µm। नीचे की पंक्ति में छवियां: "कोशिकाओं का विभेदन" संदर्भ 2 से अनुमति के साथ अनुकूलित। ऑक्सफोर्ड यूनिवर्सिटी प्रेस; संदर्भ 5 से अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत। एनएएस; "होस्ट-माइक्रोब सह-संस्कृति" संदर्भ 3 से अनुमति के साथ अनुकूलित। एनएएस; "रोग मॉडलिंग" संदर्भ 5 से अनुमति के साथ अनुकूलित। एनएएस।
दोनों गट-ऑन-चिप और हाइब्रिड चिप्स को पीडीएमएस प्रतिकृतियों का उपयोग करके तैयार किया गया था, जिन्हें सॉफ्ट लिथोग्राफी1,44 द्वारा सिलिकॉन मोल्ड्स से निकाला गया था और एसयू-8 के साथ पैटर्न किया गया था। प्रत्येक चिप में माइक्रोचैनल्स का डिज़ाइन हाइड्रोडायनामिक्स जैसे कि कतरनी तनाव और हाइड्रोडायनामिक दबाव1,4,12 पर विचार करके निर्धारित किया जाता है। मूल गट-ऑन-ए-चिप डिज़ाइन (विस्तारित डेटा छवि 1 ए), जिसमें दो समानांतर सीधे माइक्रोचैनल शामिल थे, एक जटिल गट-ऑन-ए-चिप (विस्तारित डेटा छवि 1 बी) में विकसित हुआ है जिसमें बढ़ी हुई द्रव निवास अवधि, गैर-रेखीय प्रवाह पैटर्न और संवर्धित कोशिकाओं के बहुअक्षीय विरूपण को प्रेरित करने के लिए घुमावदार माइक्रोचैनल्स की एक जोड़ी शामिल है (छवि 2 ए-एफ) मूल गट-चिप की तुलना में उपकला वृद्धि की समान डिग्री, चाहे संवर्धित कोशिका प्रकार कुछ भी हो। इसलिए, 3D मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए, रैखिक और जटिल ऑन-चिप आंत डिजाइन विनिमेय हैं। SU-8 पैटर्न के साथ सिलिकॉन मोल्ड्स पर ठीक किए गए PDMS प्रतिकृतियों ने डिमोल्डिंग के बाद नकारात्मक विशेषताएं प्रदान कीं (चित्र 2a)। चिप पर आंत का निर्माण करने के लिए, तैयार ऊपरी PDMS परत को क्रमिक रूप से एक छिद्रपूर्ण PDMS फिल्म से जोड़ा गया और फिर एक कोरोना ट्रीटर का उपयोग करके अपरिवर्तनीय बंधन द्वारा निचली PDMS परत के साथ संरेखित किया गया (चित्र 2b-f)। हाइब्रिड चिप्स का निर्माण करने के लिए, ठीक किए गए PDMS प्रतिकृतियों को ग्लास स्लाइड्स से जोड़ा गया ताकि एकल-चैनल माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण बनाए जा सकें आंत्र उपकला का 3D आकारिकी (चित्र 2जी)।
ए, एसयू-8 पैटर्न वाले सिलिकॉन मोल्ड से पीडीएमएस भागों की तैयारी का योजनाबद्ध चित्रण। बिना पकाए गए पीडीएमएस घोल को सिलिकॉन मोल्ड (बाएं) पर डाला गया, 60 डिग्री सेल्सियस (मध्य) पर सुखाया गया और डिमोल्ड किया गया (दाएं)। डिमोल्ड किए गए पीडीएमएस को टुकड़ों में काटा गया और आगे के उपयोग के लिए साफ किया गया। बी, पीडीएमएस की ऊपरी परत तैयार करने के लिए इस्तेमाल किए गए सिलिकॉन मोल्ड की तस्वीर। सी, पीडीएमएस छिद्रपूर्ण झिल्ली बनाने के लिए इस्तेमाल किए गए सिलिकॉन मोल्ड की तस्वीर। डी, ऊपरी और निचले पीडीएमएस घटकों और इकट्ठे ऑन-चिप आंत्र डिवाइस की तस्वीरों की एक श्रृंखला। ई, ऊपरी, झिल्ली और निचले पीडीएमएस घटकों के संरेखण का योजनाबद्ध। प्रत्येक परत को प्लाज्मा या कोरोना उपचार द्वारा अपरिवर्तनीय रूप से जोड़ा जाता है। एफ, सुपरइम्पोज़्ड कॉन्वॉल्यूटेड माइक्रोचैनल और वैक्यूम चैंबर के साथ गढ़े गए गट-ऑन-ए-चिप डिवाइस का योजनाबद्ध। जी, माइक्रोफ्लुइडिक सेल कल्चर के लिए गट-ऑन-ए-चिप की स्थापना। सिलिकॉन ट्यूब के साथ इकट्ठे किए गए गढ़े हुए गट ऑन ए चिप और सिरिंज को कवरस्लिप पर रखा गया था। चिप डिवाइस को प्रसंस्करण के लिए 150 मिमी पेट्री डिश के ढक्कन पर रखा गया था। बाइंडर का उपयोग सिलिकॉन ट्यूब को बंद करने के लिए किया जाता है। हाइब्रिड चिप्स का उपयोग करके हाइब्रिड चिप निर्माण और 3 डी मॉर्फोजेनेसिस के दृश्य स्नैपशॉट। आंतों के उपकला कोशिकाओं के 2 डी मोनोलेयर को संस्कृति करने के लिए स्वतंत्र रूप से तैयार किए गए ट्रांसवेल इंसर्ट को आंतों के 3 डी मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए हाइब्रिड चिप में डाला गया था। माध्यम को ट्रांसवेल इंसर्ट पर स्थापित सेल परत के नीचे माइक्रोचैनल के माध्यम से छिड़का जाता है। स्केल बार, 1 सेमी। संदर्भ से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित। 4. एल्सेवियर।
इस प्रोटोकॉल में, Caco-2 सेल लाइन और आंतों के ऑर्गेनोइड्स को उपकला स्रोतों (चित्रा 3 ए) के रूप में इस्तेमाल किया गया था। दोनों प्रकार की कोशिकाओं को स्वतंत्र रूप से संवर्धित किया गया था (बॉक्स 2 और बॉक्स 5) और ऑन-चिप आंत या ट्रांसवेल इंसर्ट के ईसीएम-लेपित माइक्रोचैनल को सीड करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। जब कोशिकाएं संलयित होती हैं (फ्लास्क में 95% से अधिक कवरेज), टी-फ्लास्क में नियमित रूप से संवर्धित Caco-2 कोशिकाओं (मार्ग 10 और 50 के बीच) को ट्रिप्सिनाइजेशन द्रव (बॉक्स 2) द्वारा विघटित कोशिका निलंबन तैयार करने के लिए काटा जाता है। आंतों की बायोप्सी या सर्जिकल रिसेक्शन से मानव आंतों के ऑर्गेनोइड्स को संरचनात्मक सूक्ष्म वातावरण का समर्थन करने के लिए 24-वेल प्लेटों में मैट्रिजेल स्कैफोल्ड डोम में संवर्धित किया गया था। µm व्यास का होता है। पूरी तरह से विकसित ऑर्गेनोइड्स को एक चिप पर आंत या ट्रांसवेल इंसर्ट पर बीजारोपण के लिए एकल कोशिकाओं में काटा और विघटित किया जाता है (बॉक्स 5)। जैसा कि हमने पहले बताया है, इसे रोग के प्रकार 12,13 (जैसे अल्सरेटिव कोलाइटिस, क्रोहन रोग, कोलोरेक्टल कैंसर, या सामान्य दाता), घाव की जगह (जैसे, घाव बनाम गैर-घाव क्षेत्र) और पथ में गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्थान (जैसे, डुओडेनम, जेजुनम, इलियम, सीकम, कोलन या मलाशय) के अनुसार विभेदित किया जा सकता है। हम बॉक्स 5 में कोलोनिक ऑर्गेनोइड्स (कोलोइड्स) की खेती के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जिसमें आमतौर पर छोटी आंतों के ऑर्गेनोइड्स की तुलना में मॉर्फोजेन्स की उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है।
ए, आंत चिप में आंत आकृति विज्ञान के प्रेरण के लिए कार्यप्रवाह। इस प्रोटोकॉल में 3D आकृति विज्ञान को प्रदर्शित करने के लिए कैको-2 मानव आंत्र उपकला और आंत्र ऑर्गेनोइड का उपयोग किया जाता है। अलग किए गए उपकला कोशिकाओं को तैयार किए गए आंत-पर-चिप डिवाइस (चिप तैयारी) में बोया गया था। एक बार जब कोशिकाओं को बोया जाता है (बीज लगाया जाता है) और दिन 0 (डी0) पर पीडीएमएस छिद्रपूर्ण झिल्ली से जोड़ा जाता है, तो शीर्षस्थ (एपी) प्रवाह शुरू होता है और पहले 2 दिनों (प्रवाह, एपी, डी0-डी2) के लिए बनाए रखा जाता है। जब एक पूर्ण 2D मोनोलेयर बनता है, तो चक्रीय स्ट्रेचिंग गतियों (खिंचाव, प्रवाह, एपी और बीएल) के साथ बेसोलैटरल (बीएल) प्रवाह भी शुरू होता है µm)। चार योजनाबद्ध आरेख जो आंत के आकारिकी के संगत कैस्केड को दर्शाते हैं (ऊपर दाएं)। योजनाबद्ध में धराशायी तीर द्रव प्रवाह की दिशा को दर्शाते हैं।b, स्थापित 3D Caco-2 उपकला (बाएं) की सतह टोपोलॉजी को दर्शाने वाली SEM छवि। आवर्धित क्षेत्र (सफेद धराशायी बॉक्स) को उजागर करने वाला इनसेट 3D Caco-2 परत (दाएं) पर पुनर्जीवित माइक्रोविली को दर्शाता है।c, स्थापित Caco-2 3D, क्लॉडिन (ZO-1, लाल) और निरंतर ब्रश बॉर्डर झिल्ली का क्षैतिज ललाट दृश्य, जिस पर F-एक्टिन (हरा) और नाभिक (नीला) लेबल हैं। आंतों के चिप्स पर उपकला कोशिकाओं का इम्यूनोफ्लोरेसेंस कॉन्फोकल दृश्य। 13.इनसेट (ऊपरी दायाँ) प्रदान की गई छवि का उच्च आवर्धन दिखाता है।ई, 7वें दिन लिए गए स्लाइस पर आंत में स्थापित ऑर्गेनोइड 3डी उपकला का डीआईसी फोटोमाइक्रोग्राफ।एफ, स्टेम कोशिकाओं (एलजीआर5; मैजेंटा), गॉब्लेट कोशिकाओं (एमयूसी2; हरा), एफ-एक्टिन (ग्रे) और नाभिक (सियान) के मार्करों को दिखाने वाली ओवरलेड इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां, क्रमशः 3 दिनों के लिए आंत के चिप्स पर विकसित हुईं (बाएं) और उपकला परत पर 13-दिवसीय (मध्य) ऑर्गेनोइड्स।विस्तारित डेटा चित्र 3 भी देखें, जो MUC2 सिग्नलिंग के बिना LGR5 सिग्नलिंग को उजागर करता है।संस्कृति के 13वें दिन सेलमास्क डाई (दाएं) के साथ प्लाज्मा झिल्ली को रंगने से एक चिप पर आंत में स्थापित 3डी ऑर्गेनोइड उपकला की उपकला सूक्ष्म संरचना (दाएं) को दिखाने वाली प्रतिदीप्ति छवियां।स्केल बार 50 माइक्रोन है जब तक कि अन्यथा न कहा जाए।बी संदर्भ से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित।2. ऑक्सफोर्ड यूनिवर्सिटी प्रेस; c संदर्भ से अनुमति के साथ अनुकूलित.2. ऑक्सफोर्ड यूनिवर्सिटी प्रेस; e और f संदर्भ से अनुमति के साथ अनुकूलित.12 क्रिएटिव कॉमन्स लाइसेंस CC BY 4.0 के तहत.
चिप पर आंत में, सफल ईसीएम कोटिंग के लिए पीडीएमएस छिद्रपूर्ण झिल्ली की हाइड्रोफोबिक सतह को संशोधित करना आवश्यक है। इस प्रोटोकॉल में, हम पीडीएमएस झिल्ली की हाइड्रोफोबिसिटी को संशोधित करने के लिए दो अलग-अलग तरीकों को लागू करते हैं। कैको -2 कोशिकाओं की खेती के लिए, यूवी / ओजोन उपचार द्वारा सतह सक्रियण अकेले पीडीएमएस सतह की हाइड्रोफोबिसिटी को कम करने, ईसीएम को कोट करने और कैको -2 कोशिकाओं को पीडीएमएस झिल्ली से जोड़ने के लिए पर्याप्त था। हालांकि, ऑर्गेनोइड उपकला की माइक्रोफ्लुइडिक संस्कृति को पीडीएमएस माइक्रोचैनल में क्रमिक रूप से पॉलीइथाइलीनमाइन (पीईआई) और ग्लूटाराल्डिहाइड को लागू करके ईसीएम प्रोटीन के कुशल जमाव को प्राप्त करने के लिए रासायनिक-आधारित सतह कार्यात्मककरण की आवश्यकता होती है। सतह के संशोधन के बाद, ईसीएम प्रोटीन को कार्यात्मक पीडीएमएस सतह को कवर करने के लिए जमा किया गया स्थैतिक स्थितियों को बनाए रखता है। सतह सक्रियण और ईसीएम कोटिंग के लिए यह अनुकूलित विधि पीडीएमएस सतह पर 3 डी मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए ऑर्गेनोइड उपकला के जुड़ाव को सक्षम बनाती है।
ट्रांसवेल संवर्धन में कोशिका बीजारोपण से पहले ईसीएम कोटिंग की भी आवश्यकता होती है; हालांकि, ट्रांसवेल संवर्धन में छिद्रयुक्त आवेषण की सतह को सक्रिय करने के लिए जटिल पूर्व उपचार चरणों की आवश्यकता नहीं होती है। ट्रांसवेल आवेषण पर कैको-2 कोशिकाओं को विकसित करने के लिए, छिद्रयुक्त आवेषण पर ईसीएम कोटिंग विघटित कैको-2 कोशिकाओं (<1 घंटा) के जुड़ाव और तंग जंक्शन अवरोध गठन (<1-2 दिन) को तेज करती है। ट्रांसवेल आवेषण पर ऑर्गेनोइड्स को संवर्धित करने के लिए, पृथक ऑर्गेनोइड्स को ईसीएम-लेपित आवेषण पर बोया जाता है, झिल्ली सतह (<3 घंटे) से जोड़ा जाता है और तब तक बनाए रखा जाता है जब तक ऑर्गेनोइड अवरोध अखंडता के साथ एक पूर्ण मोनोलेयर नहीं बनाते हैं। ट्रांसवेल संवर्धन हाइब्रिड चिप्स के उपयोग के बिना 24-वेल प्लेटों में किया जाता है।
इन विट्रो 3डी मॉर्फोजेनेसिस की शुरुआत स्थापित उपकला परत के बेसोलैटरल पहलू में द्रव प्रवाह को लागू करके की जा सकती है। चिप पर आंत में, उपकला मॉर्फोजेनेसिस तब शुरू हुआ जब माध्यम को ऊपरी और निचले माइक्रोचैनल में छिड़का गया (चित्र 3 ए)। जैसा कि पहले वर्णित किया गया है, दिशात्मक स्रावित मॉर्फोजेन अवरोधकों को लगातार हटाने के लिए अवर (बेसोलैटरल) कम्पार्टमेंट में द्रव प्रवाह को पेश करना महत्वपूर्ण है। छिद्रपूर्ण झिल्ली पर बंधी कोशिकाओं को पर्याप्त पोषक तत्व और सीरम प्रदान करने और ल्यूमिनल कतरनी तनाव उत्पन्न करने के लिए, हम आम तौर पर चिप पर आंत में दोहरा प्रवाह लागू करते हैं। हाइब्रिड चिप्स में, उपकला मोनोलेयर्स युक्त ट्रांसवेल इंसर्ट को हाइब्रिड चिप्स में डाला गया
माइक्रोइंजीनियर्ड 3डी उपकला परतों की रूपात्मक विशेषताओं का विश्लेषण विभिन्न इमेजिंग तौर-तरीकों को लागू करके किया जा सकता है, जिसमें फेज कॉन्ट्रास्ट माइक्रोस्कोपी, डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कॉन्ट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी, एसईएम, या इम्यूनोफ्लोरेसेंस कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (आंकड़े 3 और 4) शामिल हैं। 3डी उपकला परतों के आकार और फलाव की निगरानी के लिए कल्चर के दौरान किसी भी समय फेज कॉन्ट्रास्ट या डीआईसी इमेजिंग आसानी से की जा सकती है। पीडीएमएस और पॉलिएस्टर फिल्मों की ऑप्टिकल पारदर्शिता के कारण, गट-ऑन-ए-चिप और हाइब्रिड चिप प्लेटफॉर्म दोनों डिवाइस को अलग करने या अलग करने की आवश्यकता के बिना वास्तविक समय में इन सीटू इमेजिंग प्रदान कर सकते हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग करते समय (आंकड़े 1, 3सी, एफ और 4बी, सी), कोशिकाओं को आम तौर पर 4% (wt/vol) पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ स्थिर किया जाता सेल प्रकार के आधार पर, अलग-अलग फिक्सेटिव, परमेबिलाइज़र और ब्लॉकिंग एजेंट का इस्तेमाल किया जा सकता है। वंश-निर्भर सेल या क्षेत्र मार्करों को लक्षित करने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल चिप पर सीटू में स्थिर कोशिकाओं को हाइलाइट करने के लिए किया जाता है, इसके बाद द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ काउंटरस्टेन डाई या तो न्यूक्लियस (उदाहरण के लिए, 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलीन) इंडोल, डीएपीआई) या एफ-एक्टिन (उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंटली लेबल वाले फालोइडिन) को लक्षित करती है। म्यूकस उत्पादन (चित्र 1, "सेल भेदभाव" और "आंत शरीर क्रिया विज्ञान"), माइक्रोबियल कोशिकाओं के यादृच्छिक उपनिवेशण (चित्र 1, "मेजबान-सूक्ष्मजीव सह-संस्कृति"), प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती (चित्र 1, परत, जैसा कि संदर्भ में वर्णित है। जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है, 3D उपकला आकारिकी के साथ-साथ शीर्षस्थ ब्रश बॉर्डर पर माइक्रोविली को SEM (चित्र 3b) द्वारा देखा जा सकता है। विभेदन मार्करों की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन मात्रात्मक PCR5 या एकल-कोशिका RNA अनुक्रमण द्वारा किया जा सकता है। इस मामले में, आंत के चिप्स या हाइब्रिड चिप्स में विकसित उपकला कोशिकाओं की 3D परतों को ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा काटा जाता है और फिर आणविक या आनुवंशिक विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है।
ए, हाइब्रिड चिप में आंतों के आकारिकी को प्रेरित करने के लिए कार्यप्रवाह। हाइब्रिड चिप प्लेटफ़ॉर्म में 3D आकारिकी को प्रदर्शित करने के लिए इस प्रोटोकॉल में Caco-2 और आंतों के ऑर्गेनोइड का उपयोग किया जाता है। अलग-अलग उपकला कोशिकाओं को तैयार ट्रांसवेल इंसर्ट (TW तैयारी; नीचे चित्र देखें) में बोया गया था। एक बार जब कोशिकाओं को बोया गया (बीज लगाया गया) और ट्रांसवेल इंसर्ट में पॉलिएस्टर झिल्लियों से जोड़ा गया, तो सभी कोशिकाओं को स्थैतिक स्थितियों (TW संस्कृति) के तहत संवर्धित किया गया। 7 दिनों के बाद, उपकला कोशिकाओं के 2D मोनोलेयर वाले एक एकल ट्रांसवेल इंसर्ट को एक हाइब्रिड चिप में एकीकृत किया गया ताकि एक बेसोलैटरल फ्लो (फ्लो, BL) शुरू किया जा सके, जिससे अंततः 3D उपकला परत (रूपिकी) का निर्माण हुआ। विभिन्न Z स्थितियों (ऊपरी, मध्य और निचला; दाईं ओर योजनाबद्ध और संबंधित बिंदीदार रेखाएं देखें) पर लिए गए टॉप-डाउन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी दृश्यों के साथ ऑर्गेनोइड उपकला कोशिकाओं के 3D मॉर्फोजेनेसिस ने स्पष्ट रूपात्मक विशेषताएं दिखाईं। एफ-एक्टिन (सियान), न्यूक्लियस (ग्रे)। सी, स्थिर ट्रांसवेल (TW; सफेद धराशायी बॉक्स के भीतर इनसेट) बनाम हाइब्रिड चिप (सबसे बड़ा पूर्ण शॉट) में संवर्धित ऑर्गेनोइड-व्युत्पन्न उपकला कोशिकाओं के फ्लोरोसेंस कॉन्फोकल माइक्रोग्राफ़ (3D कोणीय दृश्य) क्रमशः 2D बनाम 3D आकृति विज्ञान की तुलना करते हैं। 2D वर्टिकल क्रॉस-कट दृश्यों की एक जोड़ी (ऊपरी दाएं कोने में इनसेट; "XZ") 2D और 3D विशेषताएं भी दिखाती हैं। स्केल बार, 100 µm। सी संदर्भ से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित। 4. एल्सेवियर।
नियंत्रण को पारंपरिक स्थैतिक संवर्धन स्थितियों के तहत दो-आयामी मोनोलेयर्स में समान कोशिकाओं (Caco-2 या आंत्र ऑर्गेनोइड उपकला कोशिकाओं) को संवर्धित करके तैयार किया जा सकता है। उल्लेखनीय रूप से, सूक्ष्म चैनलों की सीमित मात्रा क्षमता (यानी मूल आंत-चिप डिजाइन पर शीर्ष चैनल में ~ 4 µL) के कारण पोषक तत्वों की कमी हो सकती है। इसलिए, बेसोलैटरल प्रवाह के आवेदन से पहले और बाद में उपकला आकृति विज्ञान की तुलना भी की जा सकती है।
सॉफ्ट लिथोग्राफी प्रक्रिया को स्वच्छ कमरे में किया जाना चाहिए। चिप पर प्रत्येक परत (ऊपरी और निचली परतें और झिल्ली) और हाइब्रिड चिप्स के लिए, अलग-अलग फोटोमास्क का उपयोग किया गया और अलग-अलग सिलिकॉन वेफर्स पर तैयार किया गया क्योंकि माइक्रोचैनल की ऊंचाई अलग-अलग थी। चिप पर आंत के ऊपरी और निचले माइक्रोचैनल की लक्ष्य ऊंचाई क्रमशः 500 µm और 200 µm है। हाइब्रिड चिप की चैनल लक्ष्य ऊंचाई 200 µm है।
एसीटोन वाली डिश में 3 इंच का सिलिकॉन वेफर रखें। 30 सेकंड के लिए प्लेट को धीरे से घुमाएं, फिर वेफर को हवा में सुखाएं। वेफर को IPA वाली प्लेट में स्थानांतरित करें, फिर प्लेट को साफ करने के लिए 30 सेकंड तक घुमाएं।
सिलिकॉन वेफर सतह से कार्बनिक अवशेषों को अधिकतम रूप से हटाने के लिए वैकल्पिक रूप से पिरान्हा घोल (हाइड्रोजन पेरोक्साइड और सांद्र सल्फ्यूरिक एसिड का मिश्रण, 1:3 (वॉल्यूम/वॉल्यूम)) का उपयोग किया जा सकता है।
पिरान्हा घोल अत्यधिक संक्षारक है और गर्मी उत्पन्न करता है। अतिरिक्त सुरक्षा सावधानियाँ आवश्यक हैं। अपशिष्ट निपटान के लिए, घोल को ठंडा होने दें और एक साफ, सूखे अपशिष्ट कंटेनर में स्थानांतरित करें। द्वितीयक कंटेनरों का उपयोग करें और अपशिष्ट कंटेनरों को ठीक से लेबल करें। अधिक विस्तृत प्रक्रियाओं के लिए कृपया सुविधा के सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करें।
वेफर्स को 200 °C गर्म प्लेट पर 10 मिनट तक रखकर निर्जलित करें। निर्जलीकरण के बाद, वेफर को ठंडा करने के लिए हवा में पांच बार हिलाया गया।
साफ किए गए सिलिकॉन वेफर के केंद्र पर लगभग 10 ग्राम फोटोरेसिस्ट SU-8 2100 डालें। वेफर पर फोटोरेसिस्ट को समान रूप से फैलाने के लिए चिमटी का उपयोग करें। फोटोरेसिस्ट को कम चिपचिपा बनाने और फैलाने में आसान बनाने के लिए कभी-कभी वेफर को 65°C गर्म प्लेट पर रखें। वेफर को सीधे गर्म प्लेट पर न रखें।
स्पिन कोटिंग चलाने से SU-8 को वेफर पर समान रूप से वितरित किया गया। SU-8 के आने वाले घुमाव को 5-10 सेकंड के लिए 100 आरपीएम/एस के त्वरण पर 500 आरपीएम पर प्रसारित करने के लिए प्रोग्राम करें। 1,500 आरपीएम पर 200 µm मोटाई पैटर्निंग के लिए मुख्य स्पिन सेट करें, या 1,200 आरपीएम पर 300 आरपीएम/एस 30 सेकंड के त्वरण पर सेट 250 µm मोटाई (चिप पर आंत की ऊपरी परत के लिए 500 µm ऊंचाई बनाते हुए; नीचे "महत्वपूर्ण कदम" देखें) प्राप्त करें।
मुख्य स्पिन गति को सिलिकॉन वेफर पर SU-8 पैटर्न की लक्ष्य मोटाई के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।
चिप पर आंत की ऊपरी परत के लिए 500 µm ऊंचाई के SU-8 पैटर्न बनाने के लिए, इस बॉक्स के स्पिन कोटिंग और सॉफ्ट बेक चरण (चरण 7 और 8) क्रमिक रूप से दोहराए गए (चरण 9 देखें) जिससे 250 µm की दो परतें बनाई जा सकें। SU-8 की एक मोटी परत, जिसे इस बॉक्स के चरण 12 में UV एक्सपोजर द्वारा स्तरित और जोड़ा जा सकता है, जिससे 500 µm ऊंची एक परत बनती है।
SU-8 लेपित वेफर्स को गर्म प्लेट पर 65 °C पर 5 मिनट के लिए सावधानीपूर्वक रखकर नरम रूप से बेक करें, फिर सेटिंग को 95 °C पर स्विच करें और अतिरिक्त 40 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
ऊपरी माइक्रोचैनल में SU-8 पैटर्न की 500 μm ऊंचाई प्राप्त करने के लिए, दो 250 μm मोटी SU-8 परतें उत्पन्न करने के लिए चरण 7 और 8 को दोहराएं।
यूवी मास्क एलाइनर का उपयोग करके, वेफर के एक्सपोजर समय की गणना करने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार लैंप परीक्षण करें। (एक्सपोजर समय, एमएस) = (एक्सपोजर खुराक, एमजे/सेमी2)/(लैंप पावर, एमडब्ल्यू/सेमी2)।
एक्सपोज़र समय निर्धारित करने के बाद, फोटोमास्क को UV मास्क एलाइनर के मास्क होल्डर पर रखें और फोटोमास्क को SU-8 लेपित वेफर पर रखें।
यूवी फैलाव को कम करने के लिए फोटोमास्क की मुद्रित सतह को सिलिकॉन वेफर के SU-8 लेपित पक्ष पर सीधे रखें।
SU-8 लेपित वेफर और फोटोमास्क को पूर्व निर्धारित एक्सपोजर समय के लिए 260 mJ/cm2 UV प्रकाश में लंबवत रूप से उजागर करें (इस बॉक्स का चरण 10 देखें)।
यूवी एक्सपोजर के बाद, एसयू-8-लेपित सिलिकॉन वेफर्स को 200 माइक्रोन की ऊंचाई के साथ पैटर्न बनाने के लिए प्रत्येक गर्म प्लेट पर 65 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट और 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए बेक किया गया। 500 माइक्रोन की ऊंचाई के साथ पैटर्न बनाने के लिए 95 डिग्री सेल्सियस से 30 मिनट तक बेक करने के बाद का समय बढ़ाएं।
डेवलपर को कांच की डिश में डाला जाता है, और पके हुए वेफर को डिश में रखा जाता है। SU-8 डेवलपर की मात्रा कांच की प्लेट के आकार के आधार पर भिन्न हो सकती है। पूरी तरह से अप्रकाशित SU-8 को हटाने के लिए पर्याप्त SU-8 डेवलपर का उपयोग करना सुनिश्चित करें। उदाहरण के लिए, 1 लीटर क्षमता वाले 150 मिमी व्यास वाले कांच के डिश का उपयोग करते समय, ~300 एमएल SU-8 डेवलपर का उपयोग करें। कभी-कभी हल्के घुमाव के साथ 25 मिनट के लिए मोल्ड को विकसित करें।
विकसित मोल्ड को लगभग 10 एमएल ताजा डेवलपर से धो लें, तत्पश्चात पिपेट का उपयोग करके घोल का छिड़काव करके IPA का प्रयोग करें।
वेफर को प्लाज्मा क्लीनर में रखें और 1.5 मिनट के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा (वायुमंडलीय गैस, लक्ष्य दबाव 1 × 10−5 टॉर, शक्ति 125 W) के संपर्क में रखें।
वेफर को एक वैक्यूम डेसीकेटर में रखें, जिसके अंदर एक ग्लास स्लाइड हो। वेफर और स्लाइड को एक साथ रखा जा सकता है। यदि वैक्यूम डेसीकेटर को एक प्लेट द्वारा कई परतों में विभाजित किया जाता है, तो स्लाइड को निचले कक्ष में और वेफर को ऊपरी कक्ष में रखें। एक ग्लास स्लाइड पर ट्राइक्लोरो (1H, 1H, 2H, 2H-परफ्लुओरोऑक्टाइल) सिलेन घोल के 100 μL डालें और सिलेनाइजेशन के लिए वैक्यूम लागू करें।
37°C जल स्नान में जमे हुए Caco-2 कोशिकाओं की एक शीशी को पिघलाएं, फिर पिघली हुई कोशिकाओं को 37°C पूर्व-गर्म Caco-2 माध्यम के 15 mL युक्त T75 फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
Caco-2 कोशिकाओं को ~90% संलयन पर पारित करने के लिए, पहले Caco-2 माध्यम, PBS, और 0.25% ट्रिप्सिन / 1 mM EDTA को 37°C जल स्नान में गर्म करें।
वैक्यूम एस्पिरेशन द्वारा माध्यम को एस्पिरेट करें। वैक्यूम एस्पिरेशन को दोहराकर और ताजा पीबीएस डालकर कोशिकाओं को 5 एमएल गर्म पीबीएस से दो बार धोएं।