Nature.com पर आने के लिए धन्यवाद। आप जिस ब्राउज़र संस्करण का उपयोग कर रहे हैं उसमें सीएसएस के लिए सीमित समर्थन है। सर्वोत्तम अनुभव के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि आप एक अद्यतन ब्राउज़र का उपयोग करें (या इंटरनेट एक्सप्लोरर में संगतता मोड बंद कर दें)। इस बीच, निरंतर समर्थन सुनिश्चित करने के लिए, हम साइट को शैलियों और जावास्क्रिप्ट के बिना प्रदर्शित करेंगे।
मानव आंत मॉर्फोजेनेसिस 3डी एपिथेलियल माइक्रोआर्किटेक्चर और स्थानिक संगठन की क्रिप्ट-विलस विशेषताओं को स्थापित करता है। बाहरी माइक्रोबियल एंटीजन और उनके मेटाबोलाइट्स से बेसल क्रिप्ट में स्टेम सेल आला की रक्षा करके आंत होमियोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए इस अनूठी संरचना की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, आंतों के विल्ली और स्रावित बलगम आंतों के म्यूकोसल सतह पर एक सुरक्षात्मक बाधा के साथ कार्यात्मक रूप से विभेदित उपकला कोशिकाओं को प्रस्तुत करते हैं। इसलिए, 3डी एपिथेलियल संरचनाओं को फिर से बनाना महत्वपूर्ण है। इन विट्रो गट मॉडल के निर्माण के लिए। विशेष रूप से, ऑर्गेनिक मिमेटिक गट-ऑन-ए-चिप उन्नत शारीरिक कार्यों और बायोमैकेनिक्स के साथ आंतों के उपकला के सहज 3 डी मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित कर सकता है। यहां, हम एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप के साथ-साथ एक ट्रांसवेल एम्बेडेड हाइब्रिड चिप पर आंत में आंतों के मॉर्फोजेनेसिस को मजबूती से प्रेरित करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम पारंपरिक सेटिंग्स में डिवाइस निर्माण, काको -2 या आंतों के ऑर्गेनॉइड एपिथेलियल कोशिकाओं के संवर्धन के लिए विस्तृत तरीकों का वर्णन करते हैं। साथ ही एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म पर, 3डी मॉर्फोजेनेसिस को शामिल करना, और कई इमेजिंग तौर-तरीकों का उपयोग करके स्थापित 3डी एपिथेलिया का लक्षण वर्णन करना। यह प्रोटोकॉल 5 दिन के लिए बेसोलेटरल द्रव प्रवाह को नियंत्रित करके कार्यात्मक आंत माइक्रोआर्किटेक्चर के पुनर्जनन को प्राप्त करता है। हमारी इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस विधि शारीरिक रूप से प्रासंगिक कतरनी तनाव और यांत्रिक गति को नियोजित करती है और इसमें जटिल सेल इंजीनियरिंग या हेरफेर की आवश्यकता नहीं होती है, जो अन्य मौजूदा तकनीकों से बेहतर प्रदर्शन कर सकती है। हम कल्पना करते हैं कि हमारे प्रस्तावित प्रोटोकॉल का बायोमेडिकल अनुसंधान के लिए व्यापक प्रभाव हो सकता है। समुदाय, बायोमेडिकल, क्लिनिकल और फार्मास्युटिकल अनुप्रयोगों के लिए इन विट्रो में 3डी आंत्र उपकला परतों को पुनर्जीवित करने की एक विधि प्रदान करता है।
प्रयोगों से पता चलता है कि आंत-ऑन-ए-चिप1,2,3,4,5 या बाइलेयर माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों6,7 में संवर्धित आंतों के उपकला काको-2 कोशिकाएं अंतर्निहित तंत्र की स्पष्ट समझ के बिना इन विट्रो में सहज 3डी मॉर्फोजेनेसिस से गुजर सकती हैं। हमारे हालिया अध्ययन में, हमने पाया कि इन विट्रो में 3डी एपिथेलियल मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए कल्चर उपकरणों से बेसोलेटरल रूप से स्रावित मॉर्फोजेन प्रतिपक्षी को हटाना आवश्यक और पर्याप्त है, जिसे काको द्वारा प्रदर्शित किया गया है। -2 और रोगी-व्युत्पन्न आंतों के ऑर्गेनॉइड।उपकला कोशिकाओं को मान्य किया गया था। इस अध्ययन में, हमने विशेष रूप से एक शक्तिशाली Wnt प्रतिपक्षी, डिककोफ -1 (DKK-1) के सेल उत्पादन और एकाग्रता वितरण पर ध्यान केंद्रित किया, जो कि ट्रांसवेल आवेषण वाले आंत-ऑन-ए-चिप और संशोधित माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में शामिल है, जिसे "हाइब्रिड चिप" कहा जाता है। y-1) ऑन-चिप आंत मॉर्फोजेनेसिस को रोकता है या पूर्व-संरचित 3डी एपिथेलियल परत को बाधित करता है, यह सुझाव देता है कि संस्कृति के दौरान विरोधी तनाव इन विट्रो में आंतों के मॉर्फोजेनेसिस के लिए जिम्मेदार है। इसलिए, एपिथेलियल इंटरफ़ेस पर मजबूत मॉर्फोजेनेसिस प्राप्त करने के लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण सक्रिय फ्लशिंग द्वारा बेसोलेटरल डिब्बे में Wnt प्रतिपक्षी के स्तर को हटाना या न्यूनतम बनाए रखना है (उदाहरण के लिए, गट-ऑन-ए-चिप या हाइब्रिड-ऑन-ए- में) चिप प्लेटफ़ॉर्म) या प्रसार। बेसोलेटरल मीडिया (उदाहरण के लिए, ट्रांसवेल से कुओं में बड़े बेसोलेटरल जलाशयों में डाला जाता है)।
इस प्रोटोकॉल में, हम पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) आधारित झरझरा झिल्ली (चरण 6 ए, 7 ए, 8, 9) या ट्रांसवेल आवेषण के पॉलिएस्टर झिल्ली (चरण 6 बी, 7 बी, 8, 9) और प्रेरित 3 डी मॉर्फोजेनेसिस पर आंतों के उपकला कोशिकाओं को संस्कृति करने के लिए गट-ऑन-ए-चिप माइक्रोडिवाइस और ट्रांसवेल-इन्सर्टेबल हाइब्रिड चिप्स (चरण 1-5) बनाने के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान करते हैं। इन विट्रो (चरण 10) ronment.in vitro। 2डी एपिथेलियल मोनोलेयर से 3डी मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए, हमने माध्यम को संस्कृति के बेसोलेटरल डिब्बे में प्रवाहित करके दोनों सुसंस्कृत रूपों में मॉर्फोजेन प्रतिपक्षी को हटा दिया। अंत में, हम एक पुनर्योजी 3डी एपिथेलियल परत की उपयोगिता का प्रतिनिधित्व प्रदान करते हैं जिसका उपयोग मॉर्फोजेन-निर्भर उपकला विकास, अनुदैर्ध्य मेजबान-माइक्रोबायोम सह-संस्कृतियों, रोगज़नक़ संक्रमण, सूजन की चोट, उपकला को मॉडल करने के लिए किया जा सकता है। बैरियर डिसफंक्शन, और प्रोबायोटिक-आधारित थेरेपी उदाहरण.प्रभाव।
हमारा प्रोटोकॉल बुनियादी (उदाहरण के लिए, आंतों के म्यूकोसल जीवविज्ञान, स्टेम सेल जीवविज्ञान, और विकासात्मक जीवविज्ञान) और व्यावहारिक अनुसंधान (उदाहरण के लिए, प्रीक्लिनिकल ड्रग परीक्षण, रोग मॉडलिंग, ऊतक इंजीनियरिंग और गैस्ट्रोएंटरोलॉजी) में व्यापक प्रभाव वाले वैज्ञानिकों के लिए उपयोगी हो सकता है। इन विट्रो में आंतों के उपकला के 3 डी मोर्फोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए हमारे प्रोटोकॉल की पुनरुत्पादकता और मजबूती के कारण, हम कल्पना करते हैं कि हमारी तकनीकी रणनीति को सेल सिग्नलिंग की गतिशीलता का अध्ययन करने वाले दर्शकों तक प्रसारित किया जा सकता है। आंतों के विकास, पुनर्जनन या होमोस्टैसिस के दौरान। इसके अलावा, हमारा प्रोटोकॉल नोरोवायरस 8, सीवियर एक्यूट रेस्पिरेटरी सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (SARS-CoV-2), क्लोस्ट्रीडियम डिफिसाइल, साल्मोनेला टाइफिम्यूरियम 9 या विब्रियो कोलेरा जैसे विभिन्न संक्रामक एजेंटों के तहत संक्रमण से पूछताछ करने के लिए उपयोगी है।रोग विकृति विज्ञान और रोगजनन के दर्शक भी उपयोगी हैं। ऑन-चिप आंत माइक्रोफिजियोलॉजी प्रणाली का उपयोग अनुदैर्ध्य सह-संस्कृति 10 और बाद में मेजबान रक्षा, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) पथ 11 में रोगज़नक़ से संबंधित चोट की मरम्मत के मूल्यांकन की अनुमति दे सकता है। लीकी गट सिंड्रोम, सीलिएक रोग, क्रोहन रोग, अल्सरेटिव कोलाइटिस, पाउचिटिस, या चिड़चिड़ा आंत्र सिंड्रोम से जुड़े अन्य जीआई विकारों को 3 डी आंतों के उपकला परतों के साथ अनुकरण किया जा सकता है। रोगी की 3डी आंत उपकला परतों का उपयोग करके तैयार किए जाते हैं, इन रोगों में विलस शोष, क्रिप्ट छोटा होना, म्यूकोसल क्षति, या बिगड़ा हुआ उपकला बाधा शामिल है। बायोप्सी या स्टेम सेल-व्युत्पन्न आंतों के ऑर्गेनोइड12,13। रोग पर्यावरण की उच्च जटिलता को बेहतर ढंग से मॉडल करने के लिए, पाठक 3डी आंत्र विल्लस-क्रिप्ट माइक्रोआर्किटेक्चर वाले मॉडल में रोगी परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) जैसे रोग-संबंधित सेल प्रकारों को जोड़ने पर विचार कर सकते हैं।ऊतक-विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाएं, 5.
चूंकि 3डी एपिथेलियल माइक्रोस्ट्रक्चर को सेक्शनिंग प्रक्रिया के बिना तय और विज़ुअलाइज़ किया जा सकता है, स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स और उच्च-रिज़ॉल्यूशन या सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग पर काम करने वाले दर्शकों को एपिथेलियल निचेस पर जीन और प्रोटीन के स्पोटियोटेम्पोरल गतिशीलता की हमारी मैपिंग में रुचि हो सकती है।प्रौद्योगिकी में रुचि। माइक्रोबियल या प्रतिरक्षा उत्तेजनाओं के प्रति प्रतिक्रिया। इसके अलावा, अनुदैर्ध्य मेजबान-माइक्रोबायोम क्रॉसस्टॉक 10, 14 जो आंत होमियोस्टैसिस का समन्वय करते हैं, विभिन्न माइक्रोबियल प्रजातियों, माइक्रोबियल समुदायों या फेकल माइक्रोबायोटा को सह-संवर्धित करके, विशेष रूप से आंत-ऑन-ए-चिप में, 3डी आंतों की म्यूकोसल परत में स्थापित किया जा सकता है।प्लेटफ़ॉर्म में। यह दृष्टिकोण म्यूकोसल इम्यूनोलॉजी, गैस्ट्रोएंटरोलॉजी, मानव माइक्रोबायोम, कल्चरोमिक्स और क्लिनिकल माइक्रोबायोलॉजी का अध्ययन करने वाले दर्शकों के लिए विशेष रूप से आकर्षक है, जो प्रयोगशाला में पहले से असंस्कृत आंत माइक्रोबायोटा की खेती करना चाहते हैं। यदि हमारे इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस प्रोटोकॉल को स्केलेबल कल्चर प्रारूपों में अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि 24, 96 या 384 अच्छी तरह से प्लेटों में मल्टीवेल इंसर्ट जो बेसोलेटरल डिब्बों को लगातार भरते हैं, तो प्रोटोकॉल को फार्मास्युटिकल, बायोमेड विकसित करने वालों के लिए भी प्रसारित किया जा सकता है। खाद्य उद्योग के लिए ical या उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग या सत्यापन प्लेटफ़ॉर्म। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, हमने हाल ही में 24-वेल प्लेट प्रारूप में स्केलेबल मल्टीप्लेक्स उच्च-थ्रूपुट मॉर्फोजेनेसिस प्रणाली की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है। इसके अलावा, कई ऑर्गन-ऑन-ए-चिप उत्पादों का व्यावसायीकरण किया गया है16,17,18। इसलिए, हमारी इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस पद्धति के सत्यापन को त्वरित किया जा सकता है और संभावित रूप से कई अनुसंधान प्रयोगशालाओं, उद्योग या सरकार और नियामक एजेंसियों द्वारा अपनाया जा सकता है। दवाओं या बायोथेराप्यूटिक्स का परीक्षण करने के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक स्तर पर इन विट्रो आंत मॉर्फोजेनेसिस के सेलुलर रिप्रोग्रामिंग को समझने के लिए, आंत मॉर्फोजेनेसिस प्रक्रिया की पुनरुत्पादकता का आकलन करने के लिए 3 डी आंत सरोगेट्स का उपयोग करके या कस्टम या वाणिज्यिक ऑर्गन-ऑन-ए-चिप मॉडल का उपयोग करके दवा उम्मीदवारों के अवशोषण और परिवहन का मूल्यांकन किया गया था।
आंतों के उपकला मॉर्फोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए सीमित संख्या में मानव-प्रासंगिक प्रयोगात्मक मॉडल का उपयोग किया गया है, मुख्य रूप से इन विट्रो में 3 डी मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए कार्यान्वयन योग्य प्रोटोकॉल की कमी के कारण। वास्तव में, आंत मॉर्फोजेनेसिस के बारे में वर्तमान ज्ञान जानवरों के अध्ययन (उदाहरण के लिए, जेब्राफिश 20, चूहों 21 या मुर्गियां 22) पर आधारित है। हालांकि, वे श्रम और लागत-गहन हैं, नैतिक रूप से संदिग्ध हो सकते हैं, और सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि ये मानव विकास प्रक्रियाओं को सटीक रूप से निर्धारित नहीं करते हैं। मॉडल भी बहु-तरफा स्केलेबल तरीके से परीक्षण करने की अपनी क्षमता में बहुत सीमित हैं। इसलिए, इन विट्रो में 3 डी ऊतक संरचनाओं को पुनर्जीवित करने के लिए हमारा प्रोटोकॉल विवो पशु मॉडल के साथ-साथ अन्य पारंपरिक स्थैतिक 2 डी सेल संस्कृति मॉडल में बेहतर प्रदर्शन करता है। जैसा कि पहले बताया गया है, 3 डी उपकला संरचनाओं का उपयोग करने से हमें विभिन्न म्यूकोसल या प्रतिरक्षा उत्तेजनाओं के जवाब में क्रिप्ट-विलस अक्ष में विभेदित कोशिकाओं के स्थानिक स्थानीयकरण की जांच करने की अनुमति मिलती है। 3 डी उपकला परतें यह अध्ययन करने के लिए एक स्थान प्रदान कर सकता है कि मेजबान कारकों (उदाहरण के लिए, आंतरिक बनाम बाहरी बलगम परतें, आईजीए और रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स का स्राव) के जवाब में माइक्रोबियल कोशिकाएं स्थानिक निचे और पारिस्थितिक विकास बनाने के लिए कैसे प्रतिस्पर्धा करती हैं। इसके अलावा, 3 डी उपकला आकृति विज्ञान हमें यह समझने की अनुमति दे सकता है कि आंत माइक्रोबायोटा अपने समुदायों को कैसे संरचना करता है और सहक्रियात्मक रूप से माइक्रोबियल मेटाबोलाइट्स (उदाहरण के लिए, शॉर्ट-चेन फैटी एसिड) का उत्पादन करता है जो बेसल क्रिप्ट में सेलुलर संगठन और स्टेम सेल निचे को आकार देता है। इन विशेषताओं को केवल तभी प्रदर्शित किया जा सकता है जब 3डी एपिथेलियल परतें इन विट्रो में स्थापित हो जाएं।
3डी आंत उपकला संरचनाएं बनाने की हमारी विधि के अलावा, कई इन विट्रो विधियां हैं। आंत्र ऑर्गेनॉइड कल्चर एक अत्याधुनिक ऊतक इंजीनियरिंग तकनीक है जो विशिष्ट मॉर्फोजेन स्थितियों23,24,25 के तहत आंतों की स्टेम कोशिकाओं की खेती पर आधारित है। हालांकि, परिवहन विश्लेषण या मेजबान-माइक्रोबायोम सह-संस्कृतियों के लिए 3डी ऑर्गेनॉइड मॉडल का उपयोग अक्सर चुनौतीपूर्ण होता है क्योंकि आंतों का लुमेन ऑर्गेनॉइड के भीतर संलग्न होता है और इसलिए, ल्यूमिनल घटकों का परिचय होता है। चूंकि माइक्रोबियल कोशिकाएं या बहिर्जात एंटीजन सीमित हैं।माइक्रोइंजेक्टर,26,27 का उपयोग करके ऑर्गेनॉइड लुमेन तक पहुंच में सुधार किया जा सकता है, लेकिन यह विधि आक्रामक और श्रम-केंद्रित है और इसे निष्पादित करने के लिए विशेष ज्ञान की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, स्थैतिक परिस्थितियों में हाइड्रोजेल मचानों में बनाए गए पारंपरिक ऑर्गेनॉइड संस्कृतियां विवो बायोमैकेनिक्स में सक्रिय रूप से प्रतिबिंबित नहीं होती हैं।
कई अनुसंधान समूहों द्वारा नियोजित अन्य दृष्टिकोणों को जेल की सतह पर पृथक मानव आंतों की कोशिकाओं को संवर्धित करके आंत उपकला संरचना की नकल करने के लिए prestructured 3d हाइड्रोजेल मचानों का उपयोग किया जाता है। उच्च पहलू अनुपात उपकला संरचना और स्ट्रोमा-एपिथेलियल क्रॉसस्टॉक को मचान में स्ट्रोमल कोशिकाओं को शामिल करके। हालांकि, प्रीस्ट्रक्चर किए गए स्कैफोल्ड्स की प्रकृति स्वतःस्फूर्त मोर्फोजेनेटिक प्रक्रिया के प्रदर्शन को रोक सकती है। लेजर-एचिंग तकनीक का उपयोग करके टोलुइडिक प्लेटफॉर्म और पैटर्न वाली आंतों के उपकला संरचनाओं। सहज मोरफोजेनेटिक प्रक्रियाओं के साथ लघु आंत ट्यूब। ट्यूब के भीतर अलग-अलग आंत सेगमेंट के जटिल निर्माण के बारे में, इस मॉडल में ल्यूमिनल द्रव प्रवाह और यांत्रिक विरूपण का भी अभाव है। आईसीएस जो आंत की गतिशीलता, स्वतंत्र एपिकल और बेसोललेटरल डिब्बों की पहुंच, और मॉड्यूलरिटी के जटिल जैविक माइक्रोएन्वायरमेंट के पुन: निर्माण की नकल करते हैं। इसके अलावा, हमारे इन विट्रो 3 डी मॉर्फोजेनेसिस प्रोटोकॉल मौजूदा तरीकों की चुनौतियों को दूर करने के लिए एक पूरक दृष्टिकोण प्रदान कर सकते हैं।
हमारा प्रोटोकॉल पूरी तरह से 3डी एपिथेलियल मॉर्फोजेनेसिस पर केंद्रित है, जिसमें संस्कृति में केवल एपिथेलियल कोशिकाएं हैं और आसपास की अन्य प्रकार की कोशिकाएं जैसे मेसेनकाइमल कोशिकाएं, एंडोथेलियल कोशिकाएं और प्रतिरक्षा कोशिकाएं नहीं हैं। जैसा कि पहले बताया गया है, हमारे प्रोटोकॉल का मूल पेश किए गए माध्यम के बेसोलेटरल पक्ष में स्रावित मॉर्फोजेन अवरोधकों को हटाकर एपिथेलियल मॉर्फोजेनेसिस को शामिल करना है। जबकि हमारे आंत-ऑन-ए-चिप और हाइब्रिड-ऑन-ए-चिप की मजबूत मॉड्यूलरिटी हमें अनुमति देती है। लहरदार 3डी एपिथेलियल परत को फिर से बनाने के लिए, अतिरिक्त जैविक जटिलताओं जैसे कि एपिथेलियल-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन33,34, बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) जमाव 35 और, हमारे मॉडल में, क्रिप्ट-विलस विशेषताएं जो बेसल क्रिप्ट में स्टेम सेल निचेस को व्यक्त करती हैं, पर आगे विचार किया जाना बाकी है। मेसेनचाइम में स्ट्रोमल कोशिकाएं (उदाहरण के लिए, फ़ाइब्रोब्लास्ट) ईसीएम प्रोटीन के उत्पादन और आंतों के मॉर्फोजेनेसिस के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। विवो35,37,38। हमारे मॉडल में मेसेनकाइमल कोशिकाओं को शामिल करने से मॉर्फोजेनेटिक प्रक्रिया और सेल अटैचमेंट दक्षता में वृद्धि हुई है। एंडोथेलियल परत (यानी, केशिकाएं या लसीका) आंत सूक्ष्म वातावरण में आणविक परिवहन और प्रतिरक्षा सेल भर्ती40 को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। इसके अलावा, ऊतक मॉडल के बीच जुड़े जा सकने वाले वास्कुलचर घटक एक पूर्व शर्त हैं जब ऊतक मॉडल बहु-अंग इंटरैक्शन को प्रदर्शित करने के लिए डिज़ाइन किए जाते हैं। इसलिए, एंडोथेलियल कोशिकाएं अंग-स्तरीय रिज़ॉल्यूशन के साथ अधिक सटीक शारीरिक विशेषताओं को मॉडल करने के लिए शामिल करने की आवश्यकता हो सकती है। आंतों की बीमारी की नकल के संदर्भ में जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, एंटीजन प्रस्तुति, जन्मजात अनुकूली प्रतिरक्षा क्रॉसस्टॉक और ऊतक-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रदर्शित करने के लिए रोगी-व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाएं भी आवश्यक हैं।
हाइब्रिड चिप्स का उपयोग गट-ऑन-ए-चिप की तुलना में अधिक सीधा है क्योंकि डिवाइस सेटअप सरल है और ट्रांसवेल इंसर्ट का उपयोग आंत एपिथेलियम की स्केलेबल संस्कृति की अनुमति देता है। हालांकि, पॉलिएस्टर झिल्ली के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ट्रांसवेल इंसर्ट लोचदार नहीं होते हैं और पेरिस्टाल्टिक जैसी गतिविधियों का अनुकरण नहीं कर सकते हैं। इसके अलावा, हाइब्रिड चिप में रखे गए ट्रांसवेल इंसर्ट का एपिकल कम्पार्टमेंट एपिकल पक्ष पर कोई कतरनी तनाव के बिना स्थिर रहता है। स्पष्ट रूप से, स्थैतिक गुण एपिकल कम्पार्टमेंट शायद ही कभी हाइब्रिड चिप्स में दीर्घकालिक जीवाणु सह-संस्कृति को सक्षम बनाता है। जबकि हम हाइब्रिड चिप्स का उपयोग करते समय ट्रांसवेल आवेषण में 3 डी मॉर्फोजेनेसिस को मजबूती से प्रेरित कर सकते हैं, शारीरिक रूप से प्रासंगिक बायोमैकेनिक्स और एपिकल द्रव प्रवाह की कमी संभावित अनुप्रयोगों के लिए हाइब्रिड चिप प्लेटफार्मों की व्यवहार्यता को सीमित कर सकती है।
गट-ऑन-ए-चिप और हाइब्रिड-ऑन-ए-चिप संस्कृतियों में मानव क्रिप्ट-विलस अक्ष के पूर्ण पैमाने पर पुनर्निर्माण पूरी तरह से स्थापित नहीं किए गए हैं। चूंकि मॉर्फोजेनेसिस एक उपकला मोनोलेयर से शुरू होता है, 3 डी माइक्रोआर्किटेक्चर जरूरी नहीं कि विवो में क्रिप्ट को रूपात्मक समानता प्रदान करते हैं। हालांकि हमने माइक्रोइंजीनियर्ड 3 डी एपिथेलियम, क्रिप्ट और विलस क्षेत्रों में बेसल क्रिप्ट डोमेन के पास बढ़ती सेल आबादी की विशेषता बताई है। स्पष्ट रूप से सीमांकित नहीं किया गया था। हालांकि चिप पर ऊंचे ऊपरी चैनल से माइक्रोइंजीनियर्ड एपिथेलियम की ऊंचाई बढ़ जाती है, अधिकतम ऊंचाई अभी भी ~300-400 µm तक सीमित है। छोटी और बड़ी आंतों में मानव आंतों के क्रिप्ट की वास्तविक गहराई क्रमशः ~135 µm और ~400 µm है, और छोटी आंत के विल्ली की ऊंचाई ~600 µm41 है।
एक इमेजिंग दृष्टिकोण से, 3डी माइक्रोआर्किटेक्चर की सीटू सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग एक चिप पर आंत तक सीमित हो सकती है, क्योंकि ऑब्जेक्टिव लेंस से उपकला परत तक आवश्यक कार्य दूरी कुछ मिलीमीटर के क्रम पर होती है। प्रत्येक परत के बीच आसंजन, उपकला परत की सतह संरचना की जांच करने के लिए ऊपरी परत को खोलना या हटाना बेहद चुनौतीपूर्ण है। उदाहरण के लिए, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एसईएम) का उपयोग करके।
पीडीएमएस की हाइड्रोफोबिसिटी हाइड्रोफोबिक छोटे अणुओं से निपटने वाले माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित अध्ययनों में एक सीमित कारक रही है, क्योंकि पीडीएमएस ऐसे हाइड्रोफोबिक अणुओं को गैर-विशिष्ट रूप से सोख सकता है। पीडीएमएस के विकल्पों पर अन्य पॉलिमरिक सामग्रियों के साथ विचार किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, पीडीएमएस की सतह संशोधन (उदाहरण के लिए, लिपोफिलिक सामग्री 42 या पॉली (एथिलीन ग्लाइकॉल) 43 के साथ कोटिंग) को हाइड्रोफोबिक अणुओं के सोखना को कम करने के लिए माना जा सकता है।
अंत में, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग या "एक आकार-सभी के लिए फिट" उपयोगकर्ता-अनुकूल प्रयोगात्मक मंच प्रदान करने के मामले में हमारी विधि अच्छी तरह से चित्रित नहीं की गई है। वर्तमान प्रोटोकॉल में प्रति माइक्रोडिवाइस एक सिरिंज पंप की आवश्यकता होती है, जो सीओ 2 इनक्यूबेटर में जगह लेती है और बड़े पैमाने पर प्रयोगों को रोकती है। इस सीमा को अभिनव संस्कृति प्रारूपों की स्केलेबिलिटी (उदाहरण के लिए, 24-वेल, 96-वेल, या 384-वेल छिद्रपूर्ण आवेषण जो बीए की निरंतर पुनःपूर्ति और हटाने की अनुमति देती है) द्वारा काफी सुधार किया जा सकता है। सोलैटरल मीडिया)।
इन विट्रो में मानव आंतों के उपकला के 3 डी मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए, हमने एक लुमेन-केशिका इंटरफ़ेस बनाने के लिए दो समानांतर माइक्रोचैनल और बीच में एक लोचदार छिद्रपूर्ण झिल्ली वाले एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप आंतों के उपकरण का उपयोग किया। हम एक एकल-चैनल माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस (एक हाइब्रिड चिप) का उपयोग भी प्रदर्शित करते हैं जो ट्रांसवेल आवेषण पर विकसित ध्रुवीकृत उपकला परतों के नीचे निरंतर बेसोलेटरल प्रवाह प्रदान करता है। दोनों प्लेटफार्मों में, विभिन्न मानव आंतों के उपकला कोशिकाओं के मॉर्फोजेनेसिस को लागू करके प्रदर्शित किया जा सकता है। बेसोलेटरल कम्पार्टमेंट से मॉर्फोजेन प्रतिपक्षी को हटाने के लिए प्रवाह का दिशात्मक हेरफेर। संपूर्ण प्रायोगिक प्रक्रिया (चित्रा 1) में पांच भाग होते हैं: (i) आंत चिप या ट्रांसवेल डालने योग्य हाइब्रिड चिप का माइक्रोफैब्रिकेशन (चरण 1-5; बॉक्स 1), (ii) आंतों के उपकला कोशिकाओं (काको -2 कोशिकाओं) या मानव आंतों के ऑर्गेनोइड की तैयारी;बक्से 2-5), (iii) आंतों के चिप्स या हाइब्रिड चिप्स पर आंतों के उपकला कोशिकाओं की संस्कृति (चरण 6-9), (iv) 3डी उपकला माइक्रोस्ट्रक्चर (चरण 11-24) को चिह्नित करने के लिए इन विट्रो में 3डी मॉर्फोजेनेसिस को शामिल करना (चरण 11-24)। स्थानिक, लौकिक, सशर्त, या प्रक्रियात्मक नियंत्रण की उत्पत्ति।
हमने दो अलग-अलग कल्चर प्लेटफार्मों का उपयोग किया: सीधे चैनलों या नॉनलाइनर कन्वॉल्यूटेड चैनलों के साथ गट-ऑन-ए-चिप, या माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में ट्रांसवेल (टीडब्ल्यू) युक्त हाइब्रिड चिप्स, जैसा कि बॉक्स 1 और चरण 1 -5 में वर्णित है। "डिवाइस फैब्रिकेशन" एकल चिप या हाइब्रिड चिप बनाने में मुख्य चरण दिखाता है। "मानव आंत्र उपकला कोशिकाओं की संस्कृति" इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सेल स्रोत (कैको -2 या मानव आंतों के ऑर्गेनोइड) और संस्कृति प्रक्रिया की व्याख्या करता है। "इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस" समग्र चरणों को दर्शाता है जिसमें कैको -2 या ऑर्गेनॉइड-व्युत्पन्न उपकला कोशिकाओं को आंतों की चिप पर या हाइब्रिड चिप के ट्रांसवेल आवेषण पर संवर्धित किया जाता है, इसके बाद 3 डी मॉर्फोजेनेसिस को शामिल किया जाता है और एक विशिष्ट उपकला संरचना का निर्माण किया जाता है। प्रोग्राम चरण संख्या या बॉक्स संख्या प्रत्येक तीर के नीचे प्रदर्शित होती है। एप्लिकेशन उदाहरण प्रदान करता है कि स्थापित आंतों के उपकला परतों का उपयोग कैसे किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, कोशिका विभेदन लक्षण वर्णन, आंत शरीर क्रिया विज्ञान अध्ययन, मेजबान की स्थापना में- माइक्रोबायोम पारिस्थितिक तंत्र, और रोग मॉडलिंग। "सेल भेदभाव" में इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां नाभिक, एफ-एक्टिन और एमयूसी 2 दिखाती हैं जो आंत चिप पर उत्पन्न 3 डी काको -2 उपकला परत में व्यक्त होती हैं। एमयूसी 2 सिग्नलिंग गॉब्लेट कोशिकाओं और म्यूकोसल सतहों से स्रावित बलगम में मौजूद है। आंत फिजियोलॉजी में फ्लोरोसेंट छवियां फ्लोरोसेंट का उपयोग करके सियालिक एसिड और एन-एसिटाइलग्लुकोसामाइन अवशेषों के लिए धुंधला होने से उत्पन्न बलगम दिखाती हैं। गेहूं के रोगाणु एग्लूटीनिन। "होस्ट-माइक्रोब सह-संस्कृति" में दो अतिव्यापी छवियां एक चिप पर आंत में प्रतिनिधि मेजबान-माइक्रोबायोम सह-संस्कृतियों को दिखाती हैं। बायां पैनल माइक्रोइंजीनियर्ड 3डी काको-2 उपकला कोशिकाओं के साथ हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) को व्यक्त करने वाले ई. कोली की सह-संस्कृति को दर्शाता है। दायां पैनल 3डी काको-2 उपकला कोशिकाओं के साथ सह-संवर्धित जीएफपी ई. कोली के स्थानीयकरण को दर्शाता है, इसके बाद इम्यूनो एफ-एक्टिन (लाल) और नाभिक (नीला) के साथ प्रतिदीप्ति धुंधलापन। रोग मॉडलिंग बैक्टीरियल एंटीजन (उदाहरण के लिए, लिपोपॉलीसेकेराइड, एलपीएस) और प्रतिरक्षा कोशिकाओं (उदाहरण के लिए, पीबीएमसी) के साथ शारीरिक चुनौती के तहत आंत सूजन चिप्स में स्वस्थ बनाम लीकी आंत को दर्शाता है;हरा).कैको-2 कोशिकाओं को 3डी उपकला परत स्थापित करने के लिए संवर्धित किया गया था। स्केल बार, 50 µm। निचली पंक्ति में छवियाँ: "कोशिकाओं का विभेदन" संदर्भ से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया।2.ऑक्सफोर्ड यूनिवरसिटि प्रेस;Ref.5 की अनुमति से पुन: प्रस्तुत।एनएएस;"होस्ट-माइक्रोब सह-संस्कृति" संदर्भ 3 की अनुमति से अनुकूलित।एनएएस;"रोग मॉडलिंग" संदर्भ से अनुमति के साथ अनुकूलित।5।एनएएस.
दोनों गट-ऑन-चिप और हाइब्रिड चिप्स को पीडीएमएस प्रतिकृतियों का उपयोग करके निर्मित किया गया था, जिन्हें नरम लिथोग्राफी 1,44 द्वारा सिलिकॉन मोल्ड से ध्वस्त किया गया था और एसयू -8 के साथ पैटर्न किया गया था। प्रत्येक चिप में माइक्रोचैनल का डिज़ाइन कतरनी तनाव और हाइड्रोडायनामिक दबाव 1,4,12 जैसे हाइड्रोडायनामिक्स पर विचार करके निर्धारित किया जाता है। मूल गट-ऑन-ए-चिप डिज़ाइन (विस्तारित डेटा छवि 1 ए), जिसमें दो जुड़े हुए समानांतर सीधे माइक्रोचैनल शामिल हैं, एक जटिल गट-ऑन-ए-चिप (विस्तारित डेटा छवि 1 बी) में विकसित हुआ जिसमें बढ़े हुए द्रव निवास समय, गैर-रेखीय प्रवाह पैटर्न और सुसंस्कृत कोशिकाओं के बहुअक्षीय विरूपण को प्रेरित करने के लिए घुमावदार माइक्रोचैनल की एक जोड़ी शामिल है (छवि 2 ए-एफ) 12. जब अधिक जटिल आंत बायोमैकेनिक्स को फिर से बनाने की आवश्यकता होती है, तो जटिल गट-ऑन-ए-चिप्स को चुना जा सकता है। हमने दिखाया है कि जटिल गट-चिप भी 3 डी मॉर्फ को दृढ़ता से प्रेरित करता है। सुसंस्कृत कोशिका प्रकार की परवाह किए बिना, मूल गट-चिप की तुलना में उपकला वृद्धि की समान डिग्री के साथ एक समान समय सीमा में उत्पत्ति। इसलिए, 3 डी मोर्फोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए, रैखिक और जटिल ऑन-चिप आंत डिजाइन विनिमेय हैं। एसयू -8 पैटर्न के साथ सिलिकॉन मोल्ड्स पर ठीक किए गए पीडीएमएस प्रतिकृतियां डिमोल्डिंग के बाद नकारात्मक विशेषताएं प्रदान करती हैं (चित्र)।2ए)। एक चिप पर आंत बनाने के लिए, तैयार ऊपरी पीडीएमएस परत को क्रमिक रूप से एक छिद्रपूर्ण पीडीएमएस फिल्म से जोड़ा गया था और फिर एक कोरोना ट्रीटर (छवि 2 बी-एफ) का उपयोग करके अपरिवर्तनीय बॉन्डिंग द्वारा निचली पीडीएमएस परत के साथ संरेखित किया गया था। हाइब्रिड चिप्स बनाने के लिए, एकल-चैनल माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस बनाने के लिए ठीक किए गए पीडीएमएस प्रतिकृतियों को ग्लास स्लाइड से जोड़ा गया था जो ट्रांसवेल आवेषण (छवि 2 एच और विस्तारित डेटा छवि 2) को समायोजित कर सकते थे। .बॉन्डिंग प्रक्रिया पीडीएमएस प्रतिकृति और ग्लास की सतहों को ऑक्सीजन प्लाज्मा या कोरोना उपचार के साथ इलाज करके की जाती है। सिलिकॉन ट्यूब से जुड़े माइक्रोफैब्रिकेटेड डिवाइस की नसबंदी के बाद, डिवाइस सेटअप आंतों के उपकला (चित्रा 2 जी) के 3 डी मॉर्फोजेनेसिस करने के लिए तैयार था।
ए, एसयू-8 पैटर्न वाले सिलिकॉन मोल्ड्स से पीडीएमएस भागों की तैयारी का योजनाबद्ध चित्रण। बिना इलाज किए गए पीडीएमएस समाधान को सिलिकॉन मोल्ड (बाएं) पर डाला गया था, 60 डिग्री सेल्सियस (मध्य) पर ठीक किया गया और डीमोल्ड किया गया (दाएं)। डीमोल्ड किए गए पीडीएमएस को टुकड़ों में काट दिया गया और आगे के उपयोग के लिए साफ किया गया। बी, पीडीएमएस ऊपरी परत तैयार करने के लिए इस्तेमाल किए गए सिलिकॉन मोल्ड की तस्वीर। सी, पीडीएमएस बनाने के लिए इस्तेमाल किए गए सिलिकॉन मोल्ड की तस्वीर झरझरा झिल्ली.डी, ऊपरी और निचले पीडीएमएस घटकों और इकट्ठे ऑन-चिप आंतों के उपकरण की तस्वीरों की एक श्रृंखला। ई, ऊपरी, झिल्ली और निचले पीडीएमएस घटकों के संरेखण का योजनाबद्ध। प्रत्येक परत अपरिवर्तनीय रूप से प्लाज्मा या कोरोना उपचार द्वारा बंधी हुई है। एफ, सुपरइम्पोज्ड कन्वॉल्यूटेड माइक्रोचैनल्स और वैक्यूम चैंबर्स के साथ निर्मित गट-ऑन-ए-चिप डिवाइस का योजनाबद्ध। जी, माइक्रोफ्लुइडिक सेल संस्कृति के लिए गट-ऑन-ए-चिप का सेटअप। एक सिलिकॉन ट्यूब और सिरिंज के साथ इकट्ठे चिप पर निर्मित आंत को एक कवरस्लिप पर रखा गया था। चिप डिवाइस को प्रसंस्करण के लिए 150 मिमी पेट्री डिश के ढक्कन पर रखा गया था। बाइंडर का उपयोग सिलिकॉन ट्यूब को बंद करने के लिए किया जाता है। हाइब्रिड चिप्स का उपयोग करके हाइब्रिड चिप निर्माण और 3 डी मॉर्फोजेनेसिस के दृश्य स्नैपशॉट। आंतों के उपकला कोशिकाओं के 2 डी मोनोलेयर्स को कल्चर करने के लिए स्वतंत्र रूप से तैयार किए गए ट्रांसवेल आवेषण को आंतों के 3 डी मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए हाइब्रिड चिप में डाला गया था। माध्यम को माइक्रो के माध्यम से सुगंधित किया जाता है ट्रांसवेल इंसर्ट पर स्थापित सेल परत के नीचे चैनल। स्केल बार, 1 सेमी.एच संदर्भ से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित।4।एल्सेवियर।
इस प्रोटोकॉल में, काको-2 सेल लाइन और आंतों के ऑर्गेनॉइड का उपयोग उपकला स्रोतों (छवि 3 ए) के रूप में किया गया था। दोनों प्रकार की कोशिकाओं को स्वतंत्र रूप से संवर्धित किया गया था (बॉक्स 2 और बॉक्स 5) और ऑन-चिप आंत या ट्रांसवेल आवेषण के ईसीएम-लेपित माइक्रोचैनल को बीज देने के लिए उपयोग किया जाता था। जब कोशिकाएं संगम होती हैं (फ्लास्क में> 95% कवरेज), नियमित रूप से टी-फ्लास्क में काको -2 कोशिकाओं (मार्ग 10 और 50 के बीच) को संवर्धित किया जाता है। ट्रिप्सिनाइजेशन द्रव (बॉक्स 2) द्वारा पृथक कोशिका निलंबन तैयार करने के लिए कटाई की गई। आंतों की बायोप्सी या सर्जिकल रिसेक्शन से मानव आंतों के ऑर्गेनोइड को संरचनात्मक सूक्ष्म वातावरण का समर्थन करने के लिए 24-अच्छी तरह से प्लेटों में मैट्रिगेल मचान गुंबदों में संवर्धित किया गया था। बॉक्स 3 में वर्णित आवश्यक मॉर्फोगेंस (जैसे Wnt, आर-स्पोंडिन और नोगिन) और विकास कारकों से युक्त मध्यम को हर दूसरे दिन पूरक किया गया था जब तक कि ऑर्गेनोइड ~ 500 माइक्रोन तक नहीं बढ़ गए। व्यास। पूरी तरह से विकसित ऑर्गेनॉइड को काटा जाता है और एक चिप (बॉक्स 5) पर आंत या ट्रांसवेल इंसर्ट पर बीजारोपण के लिए एकल कोशिकाओं में अलग किया जाता है। जैसा कि हमने पहले बताया है, इसे रोग प्रकार 12,13 (जैसे अल्सरेटिव कोलाइटिस, क्रोहन रोग, कोलोरेक्टल कैंसर, या सामान्य दाता), घाव स्थल (जैसे, घाव बनाम गैर-घाव वाला क्षेत्र) और पथ में जठरांत्र स्थान (जैसे, ग्रहणी, जेजुनम, इलियम, सेकुम, कोलन) के अनुसार विभेदित किया जा सकता है। , या मलाशय)। हम कोलोनिक ऑर्गेनॉइड (कोलोइड) के संवर्धन के लिए बॉक्स 5 में एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जिसके लिए आमतौर पर छोटी आंतों के ऑर्गेनॉइड की तुलना में मॉर्फोजेन की उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है।
ए, आंत चिप में आंत मॉर्फोजेनेसिस को शामिल करने के लिए वर्कफ़्लो। 3 डी मॉर्फोजेनेसिस को प्रदर्शित करने के लिए इस प्रोटोकॉल में काको -2 मानव आंतों के उपकला और आंतों के ऑर्गेनोइड का उपयोग किया जाता है। पृथक उपकला कोशिकाओं को तैयार आंत-ऑन-ए-चिप डिवाइस (चिप तैयारी) में डाला गया था। एक बार कोशिकाओं को बीजित (बीज) किया जाता है और दिन 0 (डी 0) पर पीडीएमएस छिद्रपूर्ण झिल्ली से जोड़ा जाता है, एपिकल (एपी) प्रवाह शुरू किया जाता है और पहले के लिए बनाए रखा जाता है। 2 दिन (प्रवाह, एपी, डी0-डी2)। जब पूर्ण 2डी मोनोलेयर बनता है तो चक्रीय खिंचाव गति (खिंचाव, प्रवाह, एपी और बीएल) के साथ बेसोलेटरल (बीएल) प्रवाह भी शुरू हो जाता है। माइक्रोफ्लुइडिक कल्चर (मॉर्फोजेनेसिस, डी5) के 5 दिनों के बाद आंतों का 3डी मॉर्फोजेनेसिस अनायास होता है। चरण विपरीत छवियां प्रत्येक प्रयोगात्मक चरण या समय बिंदु (बार ग्राफ, 100 माइक्रोन) पर काको -2 कोशिकाओं की प्रतिनिधि आकृति विज्ञान दिखाती हैं। आंत मोर्फोजेनेसिस (ऊपर दाएं) के संबंधित कैस्केड को दर्शाने वाले चार योजनाबद्ध आरेख। योजनाबद्ध में धराशायी तीर द्रव प्रवाह की दिशा का प्रतिनिधित्व करते हैं। बी, एसईएम छवि स्थापित 3 डी काको -2 एपिथेलियम (बाएं) की सतह टोपोलॉजी दिखाती है। आवर्धित क्षेत्र (सफेद धराशायी बॉक्स) को उजागर करने वाला इनसेट 3 डी काको -2 परत (दाएं) पर पुनर्जीवित माइक्रोविली दिखाता है। सी, स्थापित सीए का क्षैतिज ललाट दृश्य सह-2 3डी, क्लॉडिन (जेडओ-1, लाल) और एफ-एक्टिन (हरा) और नाभिक (नीला) लेबल वाली निरंतर ब्रश सीमा झिल्ली, आंतों के चिप्स पर उपकला कोशिकाओं का इम्यूनोफ्लोरेसेंस कन्फोकल दृश्य। मध्य योजनाबद्ध की ओर इशारा करने वाले तीर प्रत्येक कन्फोकल दृश्य के लिए फोकल विमान के स्थान को इंगित करते हैं। डी, 3, 7, 9 दिनों में चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त चिप पर संवर्धित ऑर्गेनोइड में रूपात्मक परिवर्तनों का समय पाठ्यक्रम , 11, और 13. इनसेट (शीर्ष दाएं) प्रदान की गई छवि के उच्च आवर्धन को दर्शाता है। उदाहरण के लिए, दिन 7.f पर लिए गए स्लाइस पर आंत में स्थापित ऑर्गेनॉइड 3 डी एपिथेलियम का डीआईसी फोटोमाइक्रोग्राफ, स्टेम कोशिकाओं के लिए मार्कर दिखाने वाली ओवरलैड इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां (LGR5;मजेंटा), गॉब्लेट कोशिकाएं (एमयूसी2; हरा), एफ-एक्टिन (ग्रे) और नाभिक (सियान) क्रमशः 3 दिनों के लिए आंत के चिप्स पर विकसित हुए (बाएं) और उपकला परत पर 13-दिवसीय (मध्य) ऑर्गेनॉइड। विस्तारित डेटा चित्र 3 भी देखें, जो एमयूसी2 सिग्नलिंग के बिना एलजीआर5 सिग्नलिंग पर प्रकाश डालता है। प्रतिदीप्ति छवियां आंत में स्थापित 3डी ऑर्गेनॉइड एपिथेलियम के उपकला माइक्रोस्ट्रक्चर (दाएं) को दिखाती हैं। कल्चर के 13वें दिन सेलमास्क डाई (दाएं) के साथ प्लाज्मा झिल्ली को दागकर एक चिप। स्केल बार 50 μm है जब तक कि अन्यथा न कहा गया हो। बी संदर्भ से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित। 2।ऑक्सफोर्ड यूनिवरसिटि प्रेस;c Reference.2 की अनुमति से अनुकूलित।ऑक्सफोर्ड यूनिवरसिटि प्रेस;ई और एफ को संदर्भ द्वारा अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। 12 क्रिएटिव कॉमन्स लाइसेंस सीसी बाय 4.0 के तहत।
एक चिप पर आंत में, सफल ईसीएम कोटिंग के लिए पीडीएमएस झरझरा झिल्ली की हाइड्रोफोबिक सतह को संशोधित करना आवश्यक है। इस प्रोटोकॉल में, हम पीडीएमएस झिल्ली की हाइड्रोफोबिसिटी को संशोधित करने के लिए दो अलग-अलग तरीकों को लागू करते हैं। काको -2 कोशिकाओं की खेती के लिए, अकेले यूवी / ओजोन उपचार द्वारा सतह सक्रियण पीडीएमएस सतह की हाइड्रोफोबिसिटी को कम करने, ईसीएम को कोट करने और पीडीएमएस झिल्ली में काको -2 कोशिकाओं को संलग्न करने के लिए पर्याप्त था। हालांकि, ऑर्गेनॉइड एपिथेल की माइक्रोफ्लुइडिक संस्कृति ium को PDMS माइक्रोचैनल में क्रमिक रूप से पॉलीइथाइलीनमाइन (PEI) और ग्लूटाराल्डिहाइड लगाने से ECM प्रोटीन के कुशल जमाव को प्राप्त करने के लिए रासायनिक-आधारित सतह क्रियाशीलता की आवश्यकता होती है। सतह संशोधन के बाद, ECM प्रोटीन को क्रियाशील PDMS सतह को कवर करने के लिए जमा किया गया और फिर पृथक ऑर्गेनॉइड एपिथेलियम में पेश किया गया। कोशिकाओं को संलग्न करने के बाद, माइक्रोफ्लुइडिक सेल संस्कृति केवल माध्यम को ऊपरी माइक्रोचैनल में छिड़कने से शुरू होती है जब तक कि कोशिकाएं एक पूर्ण मोनोलेयर नहीं बन जाती हैं, जबकि निचला माइक्रोचैनल बनाए रखता है। स्थिर स्थितियाँ। सतह सक्रियण और ईसीएम कोटिंग के लिए यह अनुकूलित विधि पीडीएमएस सतह पर 3डी मोर्फोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए ऑर्गेनॉइड एपिथेलियम के लगाव को सक्षम बनाती है।
ट्रांसवेल संस्कृतियों को भी सेल सीडिंग से पहले ईसीएम कोटिंग की आवश्यकता होती है;हालाँकि, ट्रांसवेल संस्कृतियों को झरझरा आवेषण की सतह को सक्रिय करने के लिए जटिल पूर्व-उपचार चरणों की आवश्यकता नहीं होती है। ट्रांसवेल आवेषण पर काको -2 कोशिकाओं को बढ़ाने के लिए, झरझरा आवेषण पर ईसीएम कोटिंग अलग-अलग काको -2 कोशिकाओं (<1 घंटा) और तंग जंक्शन बाधा गठन (<1-2 दिन) के लगाव को तेज करती है। ट्रांसवेल आवेषण पर कल्चर ऑर्गेनोइड के लिए, पृथक ऑर्गेनोइड को ईसीएम-लेपित आवेषण पर रखा जाता है, झिल्ली की सतह से जोड़ा जाता है (<3 घंटे) और तब तक बनाए रखा जाता है जब तक कि ऑर्गेनोइड एक पूर्ण मोनो नहीं बन जाता है। बाधा अखंडता के साथ परत। ट्रांसवेल संस्कृतियों को हाइब्रिड चिप्स के उपयोग के बिना 24-वेल प्लेटों में किया जाता है।
इन विट्रो 3डी मॉर्फोजेनेसिस को एक स्थापित एपिथेलियल परत के बेसोलेटरल पहलू पर द्रव प्रवाह लागू करके शुरू किया जा सकता है। एक चिप पर आंत में, एपिथेलियल मॉर्फोजेनेसिस तब शुरू हुआ जब माध्यम को ऊपरी और निचले माइक्रोचैनल (छवि 3 ए) में छिड़का गया था। जैसा कि पहले बताया गया है, दिशात्मक स्रावित मॉर्फोजेन अवरोधकों को लगातार हटाने के लिए अवर (बेसोलेटरल) डिब्बे में द्रव प्रवाह शुरू करना महत्वपूर्ण है। छिद्रपूर्ण झिल्ली पर बंधी कोशिकाओं को पर्याप्त पोषक तत्व और सीरम प्रदान करने और ल्यूमिन उत्पन्न करने के लिए अल कतरनी तनाव, हम आम तौर पर एक चिप पर आंत में दोहरे प्रवाह को लागू करते हैं। हाइब्रिड चिप्स में, एपिथेलियल मोनोलेयर्स वाले ट्रांसवेल इंसर्ट को हाइब्रिड चिप्स में डाला गया था। फिर, माध्यम को माइक्रोचैनल के माध्यम से छिद्रपूर्ण ट्रांसवेल इंसर्ट के बेसोलेटरल पक्ष के तहत लागू किया गया था। दोनों संस्कृति प्लेटफार्मों में बेसोलेटरल प्रवाह की शुरुआत के 3-5 दिनों के बाद आंतों की मोर्फोजेनेसिस हुई।
माइक्रोइंजीनियर्ड 3डी एपिथेलियल परतों की रूपात्मक विशेषताओं का विश्लेषण विभिन्न इमेजिंग तौर-तरीकों को लागू करके किया जा सकता है, जिसमें चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी, डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी, एसईएम, या इम्यूनोफ्लोरेसेंस कन्फोकल माइक्रोस्कोपी (आंकड़े 3 और 4) शामिल हैं। 3डी एपिथेलियल परतों के आकार और फलाव की निगरानी के लिए संस्कृति के दौरान किसी भी समय चरण कंट्रास्ट या डीआईसी इमेजिंग आसानी से की जा सकती है। पीडीएमएस और पॉलिएस्टर फिल्मों की ऑप्टिकल पारदर्शिता के कारण, दोनों गट-ऑन-ए-चिप और हाइब्रिड चिप प्लेटफ़ॉर्म डिवाइस के सेक्शनिंग या डिस्सेम्बली की आवश्यकता के बिना सीटू इमेजिंग में वास्तविक समय प्रदान कर सकते हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग (आंकड़े 1, 3 सी, एफ और 4 बी, सी) करते समय, कोशिकाओं को आम तौर पर 4% (डब्ल्यूटी / वॉल्यूम) पैराफॉर्मल्डिहाइड (पीएफए) के साथ तय किया जाता है, इसके बाद ट्राइटन एक्स -100 और 2% (डब्ल्यूटी / वॉल्यूम) ) बोवाइन सीरम एल्बमिन (बीएसए), क्रम में। कोशिका प्रकार पर समाप्त होने पर, अलग-अलग फिक्सेटिव, पारगम्याइज़र और अवरोधक एजेंटों का उपयोग किया जा सकता है। वंश-निर्भर सेल या क्षेत्र मार्करों को लक्षित करने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग चिप पर सीटू में स्थिर कोशिकाओं को हाइलाइट करने के लिए किया जाता है, इसके बाद द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ-साथ काउंटरस्टेन डाई या तो न्यूक्लियस (उदाहरण के लिए, 4 ', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलीन) इंडोल, डीएपीआई) या एफ-एक्टिन (उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट रूप से लेबल किया गया फालोइडिन) को लक्षित किया जाता है। बलगम उत्पादन का पता लगाने के लिए सीन-आधारित लाइव इमेजिंग भी सीटू में की जा सकती है (चित्र)।1, "सेल भेदभाव" और "आंत फिजियोलॉजी"), माइक्रोबियल कोशिकाओं का यादृच्छिक उपनिवेशीकरण (चित्र 1, "मेजबान-सूक्ष्मजीव सह-संस्कृति"), प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती (चित्र 1, 'रोग मॉडलिंग') या 3 डी उपकला आकृति विज्ञान (छवि 3 सी, एफ और 4 बी, सी) की रूपरेखा। जब निचली माइक्रोचैनल परत से ऊपरी परत को अलग करने के लिए चिप पर आंत को संशोधित किया जाता है, जैसा कि रेफरी में वर्णित है। जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है, 3डी उपकला आकृति विज्ञान के साथ-साथ एपिकल ब्रश बॉर्डर पर माइक्रोविली को एसईएम (छवि 3 बी) द्वारा देखा जा सकता है। विभेदन मार्करों की अभिव्यक्ति का आकलन मात्रात्मक पीसीआर 5 या एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण करके किया जा सकता है। इस मामले में, आंत चिप्स या हाइब्रिड चिप्स में विकसित उपकला कोशिकाओं की 3 डी परतों को ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा काटा जाता है और फिर आणविक या आनुवंशिक विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है।
ए, एक हाइब्रिड चिप में आंतों के मॉर्फोजेनेसिस को शामिल करने के लिए वर्कफ़्लो। हाइब्रिड चिप प्लेटफ़ॉर्म में 3 डी मॉर्फोजेनेसिस को प्रदर्शित करने के लिए इस प्रोटोकॉल में काको -2 और आंतों के ऑर्गेनोइड का उपयोग किया जाता है। अलग किए गए उपकला कोशिकाओं को तैयार ट्रांसवेल आवेषण (टीडब्ल्यू प्रीप; नीचे चित्र देखें) में बीजित किया गया था। एक बार कोशिकाओं को बीजित (बीज डाला गया) और ट्रांसवेल आवेषण में पॉलिएस्टर झिल्ली से जोड़ा गया था, सभी कोशिकाओं को स्थैतिक परिस्थितियों (टीडब्ल्यू संस्कृति) के तहत सुसंस्कृत किया गया था। 7 दिनों के बाद, एक एकल एपिथेलियल कोशिकाओं के 2डी मोनोलेयर युक्त ट्रांसवेल इंसर्ट को बेसोलेटरल फ्लो (फ्लो, बीएल) पेश करने के लिए एक हाइब्रिड चिप में एकीकृत किया गया था, जिससे अंततः 3डी एपिथेलियल परत (मॉर्फोजेनेसिस) का निर्माण हुआ। प्रत्येक प्रयोगात्मक चरण या समय बिंदु पर सामान्य दाता (सी 103 लाइन) आरोही कोलन से प्राप्त मानव अंग उपकला कोशिकाओं की रूपात्मक विशेषताओं को दर्शाने वाले चरण विपरीत माइक्रोग्राफ। ऊपरी परतों में योजनाबद्ध प्रत्येक चरण के लिए प्रयोगात्मक विन्यास को दर्शाते हैं। बी, हाइब्रिड चिप्स (बाएं योजनाबद्ध) विभिन्न Z पदों (ऊपरी, मध्य और निचले) पर ऊपर से नीचे कन्फोकल माइक्रोस्कोपी दृश्यों के साथ ऑर्गेनॉइड उपकला कोशिकाओं के 3 डी मॉर्फोजेनेसिस को जन्म दे सकता है;सही योजनाबद्ध और संगत बिंदीदार रेखाएँ देखें)।स्पष्ट रूपात्मक विशेषताओं को दिखाया। एफ-एक्टिन (सियान), न्यूक्लियस (ग्रे)। सी, स्थिर ट्रांसवेल (टीडब्ल्यू; सफेद धराशायी बॉक्स के भीतर इनसेट) बनाम हाइब्रिड चिप (सबसे बड़ा पूर्ण शॉट) में संवर्धित ऑर्गेनोइड-व्युत्पन्न उपकला कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति कन्फोकल माइक्रोग्राफ (3 डी कोणीय दृश्य), क्रमशः 2 डी बनाम 3 डी आकृति विज्ञान की तुलना करते हुए। 2 डी ऊर्ध्वाधर क्रॉस-कट दृश्यों की एक जोड़ी (ऊपरी दाएं कोने में इनसेट; "एक्सजेड") भी दिखाती है 2डी और 3डी विशेषताएं। स्केल बार, 100 µm.c संदर्भ से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित।4।एल्सेवियर।
पारंपरिक स्थैतिक संस्कृति स्थितियों के तहत समान कोशिकाओं (कैको -2 या आंतों के ऑर्गेनोइड उपकला कोशिकाओं) को दो-आयामी मोनोलेयर्स में संवर्धित करके नियंत्रण तैयार किया जा सकता है। विशेष रूप से, माइक्रोचैनल की सीमित मात्रा क्षमता (यानी मूल आंत-चिप डिजाइन पर शीर्ष चैनल में ~ 4 μL) के कारण पोषक तत्वों की कमी हो सकती है। इसलिए, बेसोलेटरल प्रवाह के आवेदन से पहले और बाद में उपकला आकृति विज्ञान की तुलना भी की जा सकती है।
नरम लिथोग्राफी प्रक्रिया को एक साफ कमरे में किया जाना चाहिए। चिप पर प्रत्येक परत (ऊपरी और निचली परतें और झिल्ली) और हाइब्रिड चिप्स के लिए, अलग-अलग फोटोमास्क का उपयोग किया गया था और अलग-अलग सिलिकॉन वेफर्स पर निर्मित किया गया था क्योंकि माइक्रोचैनल की ऊंचाई अलग-अलग थी। चिप पर आंत के ऊपरी और निचले माइक्रोचैनल की लक्ष्य ऊंचाई क्रमशः 500 µm और 200 µm है। हाइब्रिड चिप की चैनल लक्ष्य ऊंचाई 200 µm है एम.
एसीटोन के साथ एक डिश में 3 इंच का सिलिकॉन वेफर रखें। प्लेट को 30 सेकंड के लिए धीरे से घुमाएं, फिर वेफर को हवा में सुखाएं। वेफर को आईपीए के साथ एक प्लेट में स्थानांतरित करें, फिर प्लेट को साफ करने के लिए 30 सेकंड के लिए घुमाएं।
सिलिकॉन वेफर सतह से कार्बनिक अवशेषों को अधिकतम रूप से हटाने के लिए पिरान्हा समाधान (हाइड्रोजन पेरोक्साइड और केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड का मिश्रण, 1:3 (वॉल्यूम/वॉल्यूम)) का वैकल्पिक रूप से उपयोग किया जा सकता है।
पिरान्हा समाधान अत्यंत संक्षारक है और गर्मी उत्पन्न करता है। अतिरिक्त सुरक्षा सावधानियां आवश्यक हैं। अपशिष्ट निपटान के लिए, समाधान को ठंडा होने दें और एक साफ, सूखे अपशिष्ट कंटेनर में स्थानांतरित करें। द्वितीयक कंटेनरों का उपयोग करें और अपशिष्ट कंटेनरों को उचित रूप से लेबल करें। अधिक विस्तृत प्रक्रियाओं के लिए कृपया सुविधा के सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करें।
वेफर्स को 200 डिग्री सेल्सियस गर्म प्लेट पर 10 मिनट के लिए रखकर निर्जलित करें। निर्जलीकरण के बाद, वेफर को ठंडा करने के लिए हवा में पांच बार हिलाया गया।
साफ किए गए सिलिकॉन वेफर के केंद्र पर ~10 ग्राम फोटोरेसिस्ट एसयू-8 2100 डालें। फोटोरेसिस्ट को वेफर पर समान रूप से फैलाने के लिए चिमटी का उपयोग करें। फोटोरेसिस्ट को कम चिपचिपा और फैलाने में आसान बनाने के लिए कभी-कभी वेफर को 65 डिग्री सेल्सियस गर्म प्लेट पर रखें। वेफर को सीधे गर्म प्लेट पर न रखें।
एसयू-8 को स्पिन कोटिंग चलाकर वेफर पर समान रूप से वितरित किया गया था। 100 आरपीएम/एस के त्वरण पर 500 आरपीएम पर प्रसारित करने के लिए 5-10 एस के लिए एसयू-8 के आने वाले रोटेशन को प्रोग्राम करें। 1,500 आरपीएम पर 200 µm मोटाई पैटर्निंग के लिए मुख्य स्पिन सेट करें, या 250 µm मोटाई प्राप्त करें (चिप पर आंत की ऊपरी परत के लिए 500 µm ऊंचाई बनाते हुए); नीचे "महत्वपूर्ण कदम" देखें) 1,200 आरपीएम पर 300 आरपीएम/सेकेंड 30 सेकंड के त्वरण पर सेट करें।
मुख्य स्पिन गति को सिलिकॉन वेफर पर SU-8 पैटर्न की लक्ष्य मोटाई के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।
चिप पर आंत की ऊपरी परत के लिए 500 µm ऊंचाई के SU-8 पैटर्न बनाने के लिए, इस बॉक्स के स्पिन कोटिंग और सॉफ्ट बेक स्टेप्स (चरण 7 और 8) को क्रमिक रूप से दोहराया गया (चरण 9 देखें) ताकि 250 µm की दो परतें बनाई जा सकें। SU-8 की एक मोटी परत, जिसे इस बॉक्स के चरण 12 में UV एक्सपोज़र द्वारा स्तरित और जोड़ा जा सकता है, जिससे 500 µm ऊंची परत बनाई जा सकती है।
एसयू-8 लेपित वेफर्स को सावधानी से गर्म प्लेट पर 65 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए रखकर नरम बेक करें, फिर सेटिंग को 95 डिग्री सेल्सियस पर स्विच करें और अतिरिक्त 40 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
ऊपरी माइक्रोचैनल में SU-8 पैटर्न की 500 μm ऊंचाई प्राप्त करने के लिए, दो 250 μm मोटी SU-8 परतें उत्पन्न करने के लिए चरण 7 और 8 को दोहराएं।
यूवी मास्क एलाइनर का उपयोग करते हुए, वेफर के एक्सपोज़र समय की गणना करने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक लैंप परीक्षण करें। (एक्सपोज़र समय, एमएस) = (एक्सपोज़र खुराक, एमजे / सेमी 2) / (लैंप पावर, एमडब्ल्यू / सेमी 2)।
एक्सपोज़र समय निर्धारित करने के बाद, फोटोमास्क को यूवी मास्क एलाइनर के मास्क होल्डर पर रखें और फोटोमास्क को एसयू-8 लेपित वेफर पर रखें।
यूवी फैलाव को कम करने के लिए फोटोमास्क की मुद्रित सतह को सीधे सिलिकॉन वेफर के एसयू-8 लेपित किनारे पर रखें।
पूर्व निर्धारित एक्सपोज़र समय के लिए SU-8 लेपित वेफर और फोटोमास्क को 260 mJ/cm2 UV प्रकाश में लंबवत उजागर करें (इस बॉक्स का चरण 10 देखें)।
यूवी एक्सपोज़र के बाद, एसयू-8-लेपित सिलिकॉन वेफर्स को 200 माइक्रोन की ऊंचाई के साथ पैटर्न बनाने के लिए प्रत्येक गर्म प्लेट पर 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस और 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर बेक किया गया था। 500 माइक्रोन की ऊंचाई के साथ पैटर्न बनाने के लिए बेक करने के बाद के समय को 95 डिग्री सेल्सियस से 30 मिनट तक बढ़ाएं।
डेवलपर को एक ग्लास डिश में डाला जाता है, और बेक्ड वेफर को डिश में रखा जाता है। SU-8 डेवलपर की मात्रा ग्लास प्लेट के आकार के आधार पर भिन्न हो सकती है। अनएक्सपोज़्ड SU-8 को पूरी तरह से हटाने के लिए पर्याप्त SU-8 डेवलपर का उपयोग करना सुनिश्चित करें। उदाहरण के लिए, 1 L क्षमता के साथ 150 मिमी व्यास वाले ग्लास डिश का उपयोग करते समय, ~ 300 mL SU-8 डेवलपर का उपयोग करें। कभी-कभी हल्के घुमाव के साथ 25 मिनट के लिए मोल्ड को विकसित करें।
विकसित सांचे को ~10 एमएल ताजे डेवलपर से धोएं और उसके बाद आईपीए के साथ पिपेट का उपयोग करके घोल का छिड़काव करें।
वेफर को प्लाज्मा क्लीनर में रखें और 1.5 मिनट के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा (वायुमंडलीय गैस, लक्ष्य दबाव 1 × 10−5 टोर्र, शक्ति 125 डब्ल्यू) के संपर्क में रखें।
वेफर को एक वैक्यूम डिसीकेटर में एक ग्लास स्लाइड के साथ रखें। वेफर्स और स्लाइड्स को एक साथ रखा जा सकता है। यदि वैक्यूम डिसीकेटर को एक प्लेट द्वारा कई परतों में विभाजित किया गया है, तो स्लाइड्स को निचले कक्ष में और वेफर्स को ऊपरी कक्ष में रखें। एक ग्लास स्लाइड पर ट्राइक्लोरो (1H, 1H, 2H, 2H-पेरफ्लूरूक्टाइल) सिलेन समाधान के 100 μL डालें और सिलनाइजेशन के लिए वैक्यूम लगाएं।
जमी हुई Caco-2 कोशिकाओं की एक शीशी को 37°C पानी के स्नान में पिघलाएँ, फिर पिघली हुई कोशिकाओं को T75 फ्लास्क में स्थानांतरित करें जिसमें 15 mL 37°C पूर्व गर्म Caco-2 माध्यम हो।
Caco-2 कोशिकाओं को ~90% संगम पर पारित करने के लिए, पहले गर्म Caco-2 माध्यम, PBS, और 0.25% ट्रिप्सिन/1 mM EDTA को 37°C पानी के स्नान में डालें।
वैक्यूम एस्पिरेशन द्वारा माध्यम को एस्पिरेट करें। वैक्यूम एस्पिरेशन को दोहराकर और ताजा पीबीएस जोड़कर 5 एमएल गर्म पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं।