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माइक्रोबियल परजीवियों के विकास में प्राकृतिक चयन के बीच एक प्रतिक्रिया शामिल होती है, जिससे परजीवियों में सुधार होता है, और आनुवंशिक बहाव होता है, जिसके कारण परजीवी जीन खो देते हैं और हानिकारक उत्परिवर्तन जमा करते हैं।यहां, यह समझने के लिए कि एकल मैक्रोमोलेक्यूल के पैमाने पर यह प्रतिक्रिया कैसे होती है, हम प्रकृति में सबसे छोटे जीनोम में से एक यूकेरियोटिक जीव एन्सेफैलिटोज़ून क्यूनिकुली के राइबोसोम की क्रायो-ईएम संरचना का वर्णन करते हैं।ई. कुनिकुली राइबोसोम में आरआरएनए की अत्यधिक कमी अभूतपूर्व संरचनात्मक परिवर्तनों के साथ होती है, जैसे कि पहले से अज्ञात जुड़े हुए आरआरएनए लिंकर्स और बिना उभार वाले आरआरएनए का विकास।इसके अलावा, ई. कुनिकुली राइबोसोम छोटे अणुओं को अपमानित आरआरएनए टुकड़ों और प्रोटीन की संरचनात्मक नकल के रूप में उपयोग करने की क्षमता विकसित करके आरआरएनए टुकड़ों और प्रोटीन के नुकसान से बच गया।कुल मिलाकर, हम दिखाते हैं कि आणविक संरचनाओं को लंबे समय से कम, पतित और दुर्बल उत्परिवर्तन के अधीन माना जाता है, जिसमें कई प्रतिपूरक तंत्र हैं जो अत्यधिक आणविक संकुचन के बावजूद उन्हें सक्रिय रखते हैं।
क्योंकि माइक्रोबियल परजीवियों के अधिकांश समूहों के पास अपने मेजबानों का शोषण करने के लिए अद्वितीय आणविक उपकरण होते हैं, हमें अक्सर परजीवियों के विभिन्न समूहों के लिए अलग-अलग उपचार विकसित करने पड़ते हैं।हालाँकि, नए सबूत बताते हैं कि परजीवी विकास के कुछ पहलू अभिसरण और काफी हद तक पूर्वानुमानित हैं, जो माइक्रोबियल परजीवियों3,4,5,6,7,8,9 में व्यापक चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए संभावित आधार का संकेत देते हैं।
पिछले कार्य ने माइक्रोबियल परजीवियों में एक सामान्य विकासवादी प्रवृत्ति की पहचान की है जिसे जीनोम कमी या जीनोम क्षय10,11,12,13 कहा जाता है।वर्तमान शोध से पता चलता है कि जब सूक्ष्मजीव अपनी स्वतंत्र जीवन शैली छोड़ देते हैं और इंट्रासेल्युलर परजीवी (या एंडोसिम्बियन्ट्स) बन जाते हैं, तो उनके जीनोम लाखों वर्षों में धीमी लेकिन आश्चर्यजनक कायापलट से गुजरते हैं।जीनोम क्षय के रूप में जानी जाने वाली प्रक्रिया में, माइक्रोबियल परजीवी हानिकारक उत्परिवर्तन जमा करते हैं जो पहले के कई महत्वपूर्ण जीनों को स्यूडोजेन में बदल देते हैं, जिससे क्रमिक जीन हानि और उत्परिवर्तन पतन 14,15 होता है।यह पतन निकटतम संबंधित मुक्त-जीवित प्रजातियों की तुलना में सबसे पुराने इंट्रासेल्युलर जीवों में 95% तक जीन को नष्ट कर सकता है।इस प्रकार, इंट्रासेल्युलर परजीवियों का विकास दो विरोधी ताकतों के बीच एक रस्साकशी है: डार्विनियन प्राकृतिक चयन, जिससे परजीवियों में सुधार होता है, और जीनोम का पतन होता है, जिससे परजीवी गुमनामी में चले जाते हैं।यह परजीवी इस रस्साकशी से कैसे उभरने और अपनी आणविक संरचना की गतिविधि को बनाए रखने में कामयाब रहा, यह स्पष्ट नहीं है।
यद्यपि जीनोम क्षय का तंत्र पूरी तरह से समझा नहीं गया है, ऐसा प्रतीत होता है कि यह मुख्य रूप से लगातार आनुवंशिक बहाव के कारण होता है।क्योंकि परजीवी छोटी, अलैंगिक और आनुवंशिक रूप से सीमित आबादी में रहते हैं, वे डीएनए प्रतिकृति के दौरान कभी-कभी होने वाले हानिकारक उत्परिवर्तन को प्रभावी ढंग से समाप्त नहीं कर सकते हैं।इससे हानिकारक उत्परिवर्तनों का अपरिवर्तनीय संचय होता है और परजीवी जीनोम में कमी आती है।परिणामस्वरूप, परजीवी न केवल उन जीनों को खो देता है जो अब इंट्रासेल्युलर वातावरण में उसके अस्तित्व के लिए आवश्यक नहीं हैं।यह परजीवी आबादी की छिटपुट हानिकारक उत्परिवर्तनों को प्रभावी ढंग से समाप्त करने में असमर्थता है जिसके कारण ये उत्परिवर्तन उनके सबसे महत्वपूर्ण जीन सहित पूरे जीनोम में जमा हो जाते हैं।
जीनोम कटौती के बारे में हमारी वर्तमान समझ पूरी तरह से जीनोम अनुक्रमों की तुलना पर आधारित है, जिसमें वास्तविक अणुओं में परिवर्तन पर कम ध्यान दिया जाता है जो हाउसकीपिंग कार्य करते हैं और संभावित दवा लक्ष्य के रूप में काम करते हैं।तुलनात्मक अध्ययनों से पता चला है कि हानिकारक इंट्रासेल्युलर माइक्रोबियल उत्परिवर्तन का बोझ प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड को मिसफॉल्ड और एकत्र करने के लिए प्रेरित करता है, जिससे वे अधिक चैपरोन पर निर्भर और गर्मी के प्रति अतिसंवेदनशील हो जाते हैं19,20,21,22,23।इसके अलावा, विभिन्न परजीवियों-स्वतंत्र विकास में कभी-कभी 2.5 बिलियन वर्षों का अंतर होता है-ने अपने प्रोटीन संश्लेषण5,6 और डीएनए मरम्मत तंत्र24 में गुणवत्ता नियंत्रण केंद्रों के समान नुकसान का अनुभव किया।हालाँकि, सेलुलर मैक्रोमोलेक्यूल्स के अन्य सभी गुणों पर इंट्रासेल्युलर जीवनशैली के प्रभाव के बारे में बहुत कम जानकारी है, जिसमें हानिकारक उत्परिवर्तन के बढ़ते बोझ के लिए आणविक अनुकूलन भी शामिल है।
इस कार्य में, इंट्रासेल्युलर सूक्ष्मजीवों के प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड के विकास को बेहतर ढंग से समझने के लिए, हमने इंट्रासेल्युलर परजीवी एन्सेफैलिटोज़ून क्यूनिकुली के राइबोसोम की संरचना निर्धारित की।ई. क्यूनिकुली एक कवक जैसा जीव है जो परजीवी माइक्रोस्पोरिडिया के समूह से संबंधित है जिसमें असामान्य रूप से छोटे यूकेरियोटिक जीनोम होते हैं और इसलिए जीनोम क्षय25,26,27,28,29,30 का अध्ययन करने के लिए मॉडल जीवों के रूप में उपयोग किया जाता है।हाल ही में, क्रायो-ईएम राइबोसोम संरचना माइक्रोस्पोरिडिया, पैरानोसेमा टिड्डे और वैरीमोर्फा नेकैट्रिक्स31,32 (~3.2 एमबी जीनोम) के मध्यम रूप से कम जीनोम के लिए निर्धारित की गई थी।इन संरचनाओं से पता चलता है कि आरआरएनए प्रवर्धन के कुछ नुकसान की भरपाई पड़ोसी राइबोसोमल प्रोटीन के बीच नए संपर्कों के विकास या नए एमएसएल131,32 राइबोसोमल प्रोटीन के अधिग्रहण से होती है।प्रजाति एन्सेफैलिटोज़ून (जीनोम ~ 2.5 मिलियन बीपी), अपने निकटतम रिश्तेदार ऑर्डोस्पोरा के साथ, यूकेरियोट्स में जीनोम कमी की अंतिम डिग्री का प्रदर्शन करते हैं - उनके पास 2000 से कम प्रोटीन-कोडिंग जीन हैं, और यह उम्मीद की जाती है कि उनके राइबोसोम न केवल आरआरएनए विस्तार टुकड़े (आरआरएनए टुकड़े जो बैक्टीरिया राइबोसोम से यूकेरियोटिक राइबोसोम को अलग करते हैं) से रहित हैं, उनमें होमोलो की कमी के कारण चार राइबोसोमल प्रोटीन भी हैं। ई. क्यूनिकुली जीनोम 26,27,28 में अनुमान।इसलिए, हमने निष्कर्ष निकाला कि ई. कुनिकुली राइबोसोम जीनोम क्षय के लिए आणविक अनुकूलन के लिए पहले से अज्ञात रणनीतियों को प्रकट कर सकता है।
हमारी क्रायो-ईएम संरचना सबसे छोटे यूकेरियोटिक साइटोप्लाज्मिक राइबोसोम का प्रतिनिधित्व करती है और यह अंतर्दृष्टि प्रदान करती है कि जीनोम कमी की अंतिम डिग्री कोशिका के अभिन्न अंग आणविक मशीनरी की संरचना, संयोजन और विकास को कैसे प्रभावित करती है।हमने पाया कि ई. कुनिकुली राइबोसोम आरएनए फोल्डिंग और राइबोसोम असेंबली के कई व्यापक रूप से संरक्षित सिद्धांतों का उल्लंघन करता है, और एक नए, पहले से अज्ञात राइबोसोमल प्रोटीन की खोज की।काफी अप्रत्याशित रूप से, हम दिखाते हैं कि माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम ने छोटे अणुओं को बांधने की क्षमता विकसित की है, और परिकल्पना की है कि आरआरएनए और प्रोटीन में कटाव विकासवादी नवाचारों को ट्रिगर करता है जो अंततः राइबोसोम पर उपयोगी गुण प्रदान कर सकता है।
इंट्रासेल्युलर जीवों में प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड के विकास के बारे में हमारी समझ को बेहतर बनाने के लिए, हमने उनके राइबोसोम को शुद्ध करने और इन राइबोसोम की संरचना निर्धारित करने के लिए संक्रमित स्तनधारी कोशिकाओं की संस्कृतियों से ई. क्यूनिकुली बीजाणुओं को अलग करने का निर्णय लिया।बड़ी संख्या में परजीवी माइक्रोस्पोरिडिया प्राप्त करना कठिन है क्योंकि माइक्रोस्पोरिडिया को पोषक माध्यम में संवर्धित नहीं किया जा सकता है।इसके बजाय, वे केवल मेजबान कोशिका के अंदर ही बढ़ते और प्रजनन करते हैं।इसलिए, राइबोसोम शुद्धि के लिए ई. क्यूनिकुली बायोमास प्राप्त करने के लिए, हमने स्तनधारी किडनी सेल लाइन आरके13 को ई. क्यूनिकुली बीजाणुओं से संक्रमित किया और ई. क्यूनिकुली को बढ़ने और गुणा करने की अनुमति देने के लिए कई हफ्तों तक इन संक्रमित कोशिकाओं को संवर्धित किया।लगभग आधे वर्ग मीटर के एक संक्रमित सेल मोनोलेयर का उपयोग करके, हम लगभग 300 मिलीग्राम माइक्रोस्पोरिडिया बीजाणुओं को शुद्ध करने और राइबोसोम को अलग करने के लिए उनका उपयोग करने में सक्षम थे।फिर हमने कांच के मोतियों के साथ शुद्ध बीजाणुओं को विघटित किया और लाइसेट्स के चरणबद्ध पॉलीथीन ग्लाइकोल अंशांकन का उपयोग करके कच्चे राइबोसोम को अलग किया।इससे हमें संरचनात्मक विश्लेषण के लिए लगभग 300 माइक्रोग्राम कच्चे ई. कुनिकुली राइबोसोम प्राप्त करने की अनुमति मिली।
फिर हमने परिणामी राइबोसोम नमूनों का उपयोग करके क्रायो-ईएम छवियां एकत्र कीं और बड़े राइबोसोमल सबयूनिट, छोटे सबयूनिट हेड और छोटे सबयूनिट के अनुरूप मास्क का उपयोग करके इन छवियों को संसाधित किया।इस प्रक्रिया के दौरान, हमने लगभग 108,000 राइबोसोमल कणों की छवियां एकत्र कीं और 2.7 Å (पूरक आंकड़े 1-3) के रिज़ॉल्यूशन के साथ क्रायो-ईएम छवियों की गणना की।इसके बाद हमने ई. क्यूनिकुली राइबोसोम से जुड़े आरआरएनए, राइबोसोमल प्रोटीन और हाइबरनेशन फैक्टर एमडीएफ1 को मॉडल करने के लिए क्रायोईएम छवियों का उपयोग किया (चित्र 1 ए, बी)।
हाइबरनेशन कारक एमडीएफ1 (पीडीबी आईडी 7क्यूईपी) के साथ जटिल ई. कुनिकुली राइबोसोम की एक संरचना।बी ई. कुनिकुली राइबोसोम से जुड़े हाइबरनेशन कारक एमडीएफ1 का मानचित्र।सी माध्यमिक संरचना मानचित्र माइक्रोस्पोरिडियन प्रजातियों में पुनर्प्राप्त आरआरएनए की तुलना ज्ञात राइबोसोमल संरचनाओं से करता है।पैनल प्रवर्धित आरआरएनए टुकड़े (ईएस) और राइबोसोम सक्रिय साइटों का स्थान दिखाते हैं, जिसमें डिकोडिंग साइट (डीसी), सार्सिनिसिन लूप (एसआरएल), और पेप्टिडाइल ट्रांसफरेज़ सेंटर (पीटीसी) शामिल हैं।डी. ई. क्यूनिकुली राइबोसोम के पेप्टिडाइल ट्रांसफ़ेज़ केंद्र के अनुरूप इलेक्ट्रॉन घनत्व से पता चलता है कि इस उत्प्रेरक साइट की संरचना ई. क्यूनिकुली परजीवी और एच. सेपियंस सहित इसके मेजबानों में समान है।ई, एफ डिकोडिंग केंद्र (ई) के संबंधित इलेक्ट्रॉन घनत्व और डिकोडिंग केंद्र (एफ) की योजनाबद्ध संरचना से संकेत मिलता है कि ई. क्यूनिकुली में कई अन्य यूकेरियोट्स में ए 1491 (ई. कोली नंबरिंग) के बजाय अवशेष यू1491 हैं।यह परिवर्तन बताता है कि ई. क्यूनिकुली इस सक्रिय साइट को लक्षित करने वाले एंटीबायोटिक दवाओं के प्रति संवेदनशील हो सकता है।
वी. नेकैट्रिक्स और पी. टिड्डे राइबोसोम की पहले से स्थापित संरचनाओं के विपरीत (दोनों संरचनाएं एक ही माइक्रोस्पोरिडिया परिवार नोसेमेटिडे का प्रतिनिधित्व करती हैं और एक दूसरे के समान हैं), 31,32 ई. कुनिकुली राइबोसोम आरआरएनए और प्रोटीन विखंडन की कई प्रक्रियाओं से गुजरते हैं।आगे विकृतीकरण (पूरक आंकड़े 4-6)।आरआरएनए में, सबसे महत्वपूर्ण परिवर्तनों में प्रवर्धित 25एस आरआरएनए खंड ईएस12एल का पूर्ण नुकसान और एच39, एच41 और एच18 हेलिकॉप्टरों का आंशिक अध:पतन शामिल है (चित्र 1सी, अनुपूरक चित्र 4)।राइबोसोमल प्रोटीनों में, सबसे महत्वपूर्ण परिवर्तनों में eS30 प्रोटीन का पूर्ण नुकसान और eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17, और eS7 प्रोटीन का छोटा होना शामिल है (पूरक आंकड़े 4, 5)।
इस प्रकार, एन्सेफैलोटोज़ून/ऑर्डोस्पोरा प्रजातियों के जीनोम की अत्यधिक कमी उनकी राइबोसोम संरचना में परिलक्षित होती है: ई. कुनिकुली राइबोसोम संरचनात्मक लक्षण वर्णन के अधीन यूकेरियोटिक साइटोप्लाज्मिक राइबोसोम में प्रोटीन सामग्री के सबसे नाटकीय नुकसान का अनुभव करते हैं, और उनके पास वे आरआरएनए और प्रोटीन टुकड़े भी नहीं होते हैं जो न केवल यूकेरियोट्स में, बल्कि जीवन के तीन डोमेन में भी व्यापक रूप से संरक्षित हैं।ई. क्यूनिकुली राइबोसोम की संरचना इन परिवर्तनों के लिए पहला आणविक मॉडल प्रदान करती है और विकासवादी घटनाओं को प्रकट करती है जिन्हें तुलनात्मक जीनोमिक्स और इंट्रासेल्युलर बायोमोलेक्युलर संरचना (पूरक चित्र 7) के अध्ययन दोनों द्वारा अनदेखा किया गया है।नीचे, हम इनमें से प्रत्येक घटना का उनके संभावित विकासवादी मूल और राइबोसोम फ़ंक्शन पर उनके संभावित प्रभाव के साथ वर्णन करते हैं।
हमने तब पाया कि, बड़े आरआरएनए ट्रंकेशन के अलावा, ई. क्यूनिकुली राइबोसोम में उनके सक्रिय स्थलों में से एक पर आरआरएनए भिन्नताएं होती हैं।यद्यपि ई. कुनिकुली राइबोसोम के पेप्टिडाइल ट्रांसफ़ेज़ केंद्र की संरचना अन्य यूकेरियोटिक राइबोसोम (छवि 1डी) के समान है, लेकिन न्यूक्लियोटाइड 1491 (ई. कोली नंबरिंग, छवि 1ई, एफ) पर अनुक्रम भिन्नता के कारण डिकोडिंग केंद्र भिन्न होता है।यह अवलोकन महत्वपूर्ण है क्योंकि यूकेरियोटिक राइबोसोम की डिकोडिंग साइट में बैक्टीरिया-प्रकार के अवशेष A1408 और G1491 की तुलना में आमतौर पर अवशेष G1408 और A1491 होते हैं।यह भिन्नता राइबोसोमल एंटीबायोटिक दवाओं के अमीनोग्लाइकोसाइड परिवार और डिकोडिंग साइट को लक्षित करने वाले अन्य छोटे अणुओं के प्रति बैक्टीरिया और यूकेरियोटिक राइबोसोम की विभिन्न संवेदनशीलता को रेखांकित करती है।ई. क्यूनिकुली राइबोसोम की डिकोडिंग साइट पर, अवशेष A1491 को U1491 के साथ बदल दिया गया था, जो संभावित रूप से इस सक्रिय साइट को लक्षित करने वाले छोटे अणुओं के लिए एक अद्वितीय बाइंडिंग इंटरफ़ेस बना रहा था।वही A14901 वैरिएंट अन्य माइक्रोस्पोरिडिया जैसे पी. टिड्डे और वी. नेकैट्रिक्स में भी मौजूद है, जिससे पता चलता है कि यह माइक्रोस्पोरिडिया प्रजातियों (छवि 1 एफ) के बीच व्यापक है।
क्योंकि हमारे ई. क्यूनिकुली राइबोसोम नमूने चयापचय रूप से निष्क्रिय बीजाणुओं से अलग किए गए थे, हमने तनाव या भुखमरी की स्थिति के तहत पहले वर्णित राइबोसोम बाइंडिंग के लिए ई. क्यूनिकुली के क्रायो-ईएम मानचित्र का परीक्षण किया।हाइबरनेशन कारक 31,32,36,37, 38। हमने हाइबरनेटिंग राइबोसोम की पहले से स्थापित संरचना का ई. कुनिकुली राइबोसोम के क्रायो-ईएम मानचित्र के साथ मिलान किया।डॉकिंग के लिए, एस. सेरेविसिया राइबोसोम को हाइबरनेशन फैक्टर Stm138 के साथ कॉम्प्लेक्स में, टिड्डी राइबोसोम को Lso232 फैक्टर के साथ कॉम्प्लेक्स में, और वी. नेकैट्रिक्स राइबोसोम को Mdf1 और Mdf231 कारकों के साथ कॉम्प्लेक्स में इस्तेमाल किया गया था।उसी समय, हमने बाकी कारक Mdf1 के अनुरूप क्रायो-ईएम घनत्व पाया।वी. नेकैट्रिक्स राइबोसोम से बंधने वाले एमडीएफ1 के समान, एमडीएफ1 भी ई. कुनिकुली राइबोसोम से बंधता है, जहां यह राइबोसोम की ई साइट को अवरुद्ध करता है, संभवतः राइबोसोम को उपलब्ध कराने में मदद करता है जब परजीवी बीजाणु शरीर के निष्क्रिय होने पर चयापचय रूप से निष्क्रिय हो जाते हैं (चित्रा 2)।).
एमडीएफ1 राइबोसोम की ई साइट को अवरुद्ध करता है, जो परजीवी बीजाणुओं के चयापचय रूप से निष्क्रिय होने पर राइबोसोम को निष्क्रिय करने में मदद करता प्रतीत होता है।ई. कुनिकुली राइबोसोम की संरचना में, हमने पाया कि एमडीएफ1 एल1 राइबोसोम स्टेम के साथ एक पूर्व अज्ञात संपर्क बनाता है, राइबोसोम का वह हिस्सा जो प्रोटीन संश्लेषण के दौरान राइबोसोम से डीएसाइलेटेड टीआरएनए की रिहाई की सुविधा प्रदान करता है।इन संपर्कों से पता चलता है कि एमडीएफ1 डीएसिटिलेटेड टीआरएनए के समान तंत्र का उपयोग करके राइबोसोम से अलग हो जाता है, जिससे यह संभावित स्पष्टीकरण मिलता है कि राइबोसोम प्रोटीन संश्लेषण को पुनः सक्रिय करने के लिए एमडीएफ1 को कैसे हटाता है।
हालाँकि, हमारी संरचना में Mdf1 और L1 राइबोसोम लेग (राइबोसोम का वह भाग जो प्रोटीन संश्लेषण के दौरान राइबोसोम से डिएसिलेटेड tRNA को छोड़ने में मदद करता है) के बीच एक अज्ञात संपर्क का पता चला।विशेष रूप से, एमडीएफ1 डीएसाइलेटेड टीआरएनए अणु के कोहनी खंड के समान संपर्कों का उपयोग करता है (चित्र 2)।इस पूर्व अज्ञात आणविक मॉडलिंग से पता चला है कि एमडीएफ1 डीएसिटिलेटेड टीआरएनए के समान तंत्र का उपयोग करके राइबोसोम से अलग हो जाता है, जो बताता है कि राइबोसोम प्रोटीन संश्लेषण को पुन: सक्रिय करने के लिए इस हाइबरनेशन कारक को कैसे हटाता है।
आरआरएनए मॉडल का निर्माण करते समय, हमने पाया कि ई. कुनिकुली राइबोसोम में असामान्य रूप से मुड़े हुए आरआरएनए टुकड़े हैं, जिन्हें हम फ्यूज्ड आरआरएनए कहते हैं (चित्र 3)।राइबोसोम में जो जीवन के तीन डोमेन को फैलाते हैं, आरआरएनए संरचनाओं में बदल जाता है जिसमें अधिकांश आरआरएनए आधार या तो बेस जोड़ी बनाते हैं और एक दूसरे के साथ जुड़ते हैं या राइबोसोमल प्रोटीन 38,39,40 के साथ बातचीत करते हैं।हालाँकि, ई. कुनिकुली राइबोसोम में, आरआरएनए अपने कुछ हेलिकॉप्टरों को खुले हुए आरआरएनए क्षेत्रों में परिवर्तित करके इस तह सिद्धांत का उल्लंघन करते प्रतीत होते हैं।
एस. सेरेविसिया, वी. नेकैट्रिक्स, और ई. क्यूनिकुली में एच18 25एस आरआरएनए हेलिक्स की संरचना।आमतौर पर, तीन जीवन डोमेन में फैले राइबोसोम में, यह लिंकर एक आरएनए हेलिक्स में कुंडलित होता है जिसमें 24 से 34 अवशेष होते हैं।इसके विपरीत, माइक्रोस्पोरिडिया में, यह आरआरएनए लिंकर धीरे-धीरे केवल 12 अवशेषों वाले दो एकल-फंसे यूरिडीन-समृद्ध लिंकर्स में कम हो जाता है।इनमें से अधिकांश अवशेष विलायकों के संपर्क में आते हैं।चित्र से पता चलता है कि परजीवी माइक्रोस्पोरिडिया आरआरएनए फोल्डिंग के सामान्य सिद्धांतों का उल्लंघन करता प्रतीत होता है, जहां आरआरएनए आधार आमतौर पर अन्य आधारों से जुड़े होते हैं या आरआरएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन में शामिल होते हैं।माइक्रोस्पोरिडिया में, कुछ आरआरएनए टुकड़े एक प्रतिकूल मोड़ लेते हैं, जिसमें पूर्व आरआरएनए हेलिक्स एक एकल-फंसे हुए टुकड़े में लगभग एक सीधी रेखा में लम्बा हो जाता है।इन असामान्य क्षेत्रों की उपस्थिति माइक्रोस्पोरिडिया आरआरएनए को न्यूनतम संख्या में आरएनए आधारों का उपयोग करके दूर के आरआरएनए टुकड़ों को बांधने की अनुमति देती है।
इस विकासवादी संक्रमण का सबसे उल्लेखनीय उदाहरण H18 25S rRNA हेलिक्स (चित्र 3) में देखा जा सकता है।ई. कोली से लेकर मनुष्यों तक की प्रजातियों में, इस आरआरएनए हेलिक्स के आधार में 24-32 न्यूक्लियोटाइड होते हैं, जो थोड़ा अनियमित हेलिक्स बनाते हैं।वी. नेकैट्रिक्स और पी. टिड्डे,31,32 से पहले पहचानी गई राइबोसोमल संरचनाओं में एच18 हेलिक्स के आधार आंशिक रूप से अनकुंडलित हैं, लेकिन न्यूक्लियोटाइड आधार युग्मन संरक्षित है।हालाँकि, ई. क्यूनिकुली में यह आरआरएनए टुकड़ा सबसे छोटा लिंकर 228UUUGU232 और 301UUUUUUUUU307 बन जाता है।विशिष्ट आरआरएनए टुकड़ों के विपरीत, ये यूरिडीन-समृद्ध लिंकर्स राइबोसोमल प्रोटीन के साथ कुंडलित नहीं होते हैं या व्यापक संपर्क नहीं बनाते हैं।इसके बजाय, वे विलायक-खुली और पूरी तरह से खुली संरचनाओं को अपनाते हैं जिसमें आरआरएनए स्ट्रैंड लगभग सीधे विस्तारित होते हैं।यह विस्तारित संरचना बताती है कि कैसे ई. क्यूनिकुली एच16 और एच18 आरआरएनए हेलिकॉप्टरों के बीच 33 Å के अंतर को भरने के लिए केवल 12 आरएनए आधारों का उपयोग करता है, जबकि अन्य प्रजातियों को अंतर को भरने के लिए कम से कम दोगुने आरआरएनए आधारों की आवश्यकता होती है।
इस प्रकार, हम प्रदर्शित कर सकते हैं कि, ऊर्जावान रूप से प्रतिकूल तह के माध्यम से, परजीवी माइक्रोस्पोरिडिया ने उन आरआरएनए खंडों को भी अनुबंधित करने की रणनीति विकसित की है जो जीवन के तीन डोमेन में प्रजातियों में व्यापक रूप से संरक्षित रहते हैं।जाहिरा तौर पर, आरआरएनए हेलिकॉप्टरों को छोटे पॉली-यू लिंकर्स में बदलने वाले उत्परिवर्तन को जमा करके, ई. कुनिकुली असामान्य आरआरएनए टुकड़े बना सकता है जिसमें डिस्टल आरआरएनए टुकड़ों के बंधाव के लिए जितना संभव हो उतना कम न्यूक्लियोटाइड होते हैं।इससे यह समझाने में मदद मिलती है कि कैसे माइक्रोस्पोरिडिया ने अपनी संरचनात्मक और कार्यात्मक अखंडता को खोए बिना अपनी मूल आणविक संरचना में नाटकीय कमी हासिल की।
ई. क्यूनिकुली आरआरएनए की एक और असामान्य विशेषता बिना गाढ़ेपन के आरआरएनए की उपस्थिति है (चित्र 4)।उभार आधार जोड़े के बिना न्यूक्लियोटाइड होते हैं जो आरएनए हेलिक्स में छिपने के बजाय बाहर मुड़ जाते हैं।अधिकांश आरआरएनए प्रोट्रूशियंस आणविक चिपकने वाले के रूप में कार्य करते हैं, जो आसन्न राइबोसोमल प्रोटीन या अन्य आरआरएनए टुकड़ों को बांधने में मदद करते हैं।कुछ उभार टिका के रूप में कार्य करते हैं, जिससे आरआरएनए हेलिक्स को उत्पादक प्रोटीन संश्लेषण 41 के लिए इष्टतम ढंग से मोड़ने और मोड़ने की अनुमति मिलती है।
एक आरआरएनए फलाव (एस. सेरेविसिया नंबरिंग) ई. क्यूनिकुली राइबोसोम संरचना से अनुपस्थित है, लेकिन अधिकांश अन्य यूकेरियोट्स बी ई. कोली, एस. सेरेविसिया, एच. सेपियन्स, और ई. क्यूनिकुली आंतरिक राइबोसोम में मौजूद है।परजीवियों में कई प्राचीन, अत्यधिक संरक्षित आरआरएनए उभारों का अभाव है।ये गाढ़ेपन राइबोसोम संरचना को स्थिर करते हैं;इसलिए, माइक्रोस्पोरिडिया में उनकी अनुपस्थिति माइक्रोस्पोरिडिया परजीवियों में आरआरएनए फोल्डिंग की कम स्थिरता का संकेत देती है।पी तनों (बैक्टीरिया में एल7/एल12 तने) के साथ तुलना से पता चलता है कि आरआरएनए धक्कों का नुकसान कभी-कभी खोए हुए धक्कों के बगल में नए धक्कों की उपस्थिति के साथ मेल खाता है।23S/28S rRNA में H42 हेलिक्स में एक प्राचीन उभार (सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया में U1206) है, जो जीवन के तीन क्षेत्रों में इसकी सुरक्षा के कारण कम से कम 3.5 बिलियन वर्ष पुराना होने का अनुमान है।माइक्रोस्पोरिडिया में, यह उभार समाप्त हो जाता है।हालाँकि, खोए हुए उभार के बगल में एक नया उभार दिखाई दिया (ई. कुनिकुली में A1306)।
आश्चर्यजनक रूप से, हमने पाया कि ई. क्यूनिकुली राइबोसोम में अन्य प्रजातियों में पाए जाने वाले अधिकांश आरआरएनए उभारों की कमी है, जिसमें अन्य यूकेरियोट्स में संरक्षित 30 से अधिक उभार शामिल हैं (चित्र 4 ए)।यह हानि राइबोसोमल सबयूनिट्स और आसन्न आरआरएनए हेलिकॉप्टरों के बीच कई संपर्कों को समाप्त कर देती है, कभी-कभी राइबोसोम के भीतर बड़ी खोखली रिक्तियां बना देती है, जिससे ई. कुनिकुली राइबोसोम अधिक पारंपरिक राइबोसोम (छवि 4 बी) की तुलना में अधिक छिद्रपूर्ण हो जाता है।विशेष रूप से, हमने पाया कि इनमें से अधिकांश उभार पहले से पहचाने गए वी. नेकैट्रिक्स और पी. टिड्डे राइबोसोम संरचनाओं में भी खो गए थे, जिन्हें पिछले संरचनात्मक विश्लेषणों द्वारा नजरअंदाज कर दिया गया था।
कभी-कभी आरआरएनए उभारों के नष्ट होने के साथ-साथ खोए हुए उभारों के बगल में नए उभारों का विकास भी होता है।उदाहरण के लिए, राइबोसोमल पी-स्टेम में एक U1208 उभार होता है (सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया में) जो ई. कोली से मनुष्यों तक जीवित रहा और इसलिए यह 3.5 बिलियन वर्ष पुराना होने का अनुमान है।प्रोटीन संश्लेषण के दौरान, यह उभार पी स्टेम को खुली और बंद संरचनाओं के बीच जाने में मदद करता है ताकि राइबोसोम अनुवाद कारकों को भर्ती कर सके और उन्हें सक्रिय साइट पर पहुंचा सके।ई. कुनिकुली राइबोसोम में, यह गाढ़ापन अनुपस्थित है;हालाँकि, केवल तीन आधार जोड़े में स्थित एक नया गाढ़ापन (जी883) पी स्टेम के इष्टतम लचीलेपन की बहाली में योगदान कर सकता है (चित्र 4सी)।
उभार के बिना आरआरएनए पर हमारा डेटा बताता है कि आरआरएनए न्यूनीकरण राइबोसोम की सतह पर आरआरएनए तत्वों के नुकसान तक ही सीमित नहीं है, बल्कि इसमें राइबोसोम नाभिक भी शामिल हो सकता है, जिससे एक परजीवी-विशिष्ट आणविक दोष पैदा हो सकता है जिसका वर्णन मुक्त-जीवित कोशिकाओं में नहीं किया गया है।जीवित प्रजातियाँ देखी जाती हैं।
कैनोनिकल राइबोसोमल प्रोटीन और आरआरएनए के मॉडलिंग के बाद, हमने पाया कि पारंपरिक राइबोसोमल घटक क्रायो-ईएम छवि के तीन भागों की व्याख्या नहीं कर सकते हैं।इनमें से दो टुकड़े आकार में छोटे अणु हैं (चित्र 5, अनुपूरक चित्र 8)।पहला खंड राइबोसोमल प्रोटीन यूएल15 और ईएल18 के बीच उस स्थिति में सैंडविच होता है जो आमतौर पर ईएल18 के सी-टर्मिनस द्वारा कब्जा कर लिया जाता है, जिसे ई. कुनिकुली में छोटा कर दिया जाता है।यद्यपि हम इस अणु की पहचान निर्धारित नहीं कर सकते हैं, लेकिन इस घनत्व द्वीप के आकार और आकार को स्पर्मिडीन अणुओं की उपस्थिति से अच्छी तरह से समझाया गया है।राइबोसोम के साथ इसका बंधन यूएल15 प्रोटीन (एएसपी51 और आरजी56) में माइक्रोस्पोरिडिया-विशिष्ट उत्परिवर्तन द्वारा स्थिर होता है, जो इस छोटे अणु के लिए राइबोसोम की आत्मीयता को बढ़ाता प्रतीत होता है, क्योंकि वे यूएल15 को छोटे अणु को राइबोसोमल संरचना में लपेटने की अनुमति देते हैं।अनुपूरक चित्र 2)।8, अतिरिक्त डेटा 1, 2).
क्रायो-ईएम इमेजिंग ई. कुनिकुली राइबोसोम से बंधे राइबोज के बाहर न्यूक्लियोटाइड की उपस्थिति दिखाती है।ई. कुनिकुली राइबोसोम में, यह न्यूक्लियोटाइड अधिकांश अन्य यूकेरियोटिक राइबोसोम में 25S rRNA A3186 न्यूक्लियोटाइड (सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया नंबरिंग) के समान स्थान रखता है।बी ई. कुनिकुली की राइबोसोमल संरचना में, यह न्यूक्लियोटाइड राइबोसोमल प्रोटीन यूएल9 और ईएल20 के बीच स्थित होता है, जिससे दोनों प्रोटीनों के बीच संपर्क स्थिर हो जाता है।माइक्रोस्पोरिडिया प्रजातियों के बीच सीडी ईएल20 अनुक्रम संरक्षण विश्लेषण।माइक्रोस्पोरिडिया प्रजाति (सी) के फाइलोजेनेटिक पेड़ और ईएल20 प्रोटीन (डी) के एकाधिक अनुक्रम संरेखण से पता चलता है कि न्यूक्लियोटाइड-बाध्यकारी अवशेष एफ170 और के172 एस लोफी के अपवाद के साथ, प्रारंभिक शाखा वाले माइक्रोस्पोरिडिया के अपवाद के साथ, सबसे विशिष्ट माइक्रोस्पोरिडिया में संरक्षित हैं, जिसने ईएस39एल आरआरएनए विस्तार को बरकरार रखा है।ई यह आंकड़ा दर्शाता है कि न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग अवशेष F170 और K172 केवल अत्यधिक कम किए गए माइक्रोस्पोरिडिया जीनोम के eL20 में मौजूद हैं, लेकिन अन्य यूकेरियोट्स में नहीं।कुल मिलाकर, इन आंकड़ों से पता चलता है कि माइक्रोस्पोरिडियन राइबोसोम ने एक न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग साइट विकसित की है जो एएमपी अणुओं को बांधती है और राइबोसोमल संरचना में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को स्थिर करने के लिए उनका उपयोग करती है।माइक्रोस्पोरिडिया में इस बाध्यकारी साइट का उच्च संरक्षण और अन्य यूकेरियोट्स में इसकी अनुपस्थिति से पता चलता है कि यह साइट माइक्रोस्पोरिडिया के लिए एक चयनात्मक अस्तित्व लाभ प्रदान कर सकती है।इस प्रकार, माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम में न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग पॉकेट एक विकृत विशेषता या आरआरएनए गिरावट का अंतिम रूप प्रतीत नहीं होता है, जैसा कि पहले बताया गया है, बल्कि एक उपयोगी विकासवादी नवाचार है जो माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम को सीधे छोटे अणुओं को बांधने की अनुमति देता है, उन्हें आणविक बिल्डिंग ब्लॉक के रूप में उपयोग करता है।राइबोसोम के लिए बिल्डिंग ब्लॉक.यह खोज माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम को एकमात्र राइबोसोम बनाती है जो अपने संरचनात्मक निर्माण खंड के रूप में एकल न्यूक्लियोटाइड का उपयोग करने के लिए जाना जाता है।एफ न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग से प्राप्त काल्पनिक विकासवादी मार्ग।
दूसरा कम आणविक भार घनत्व राइबोसोमल प्रोटीन यूएल9 और ईएल30 (चित्र 5ए) के बीच इंटरफेस पर स्थित है।इस इंटरफ़ेस को पहले Saccharomyces cerevisiae राइबोसोम की संरचना में rRNA A3186 (ES39L rRNA एक्सटेंशन का हिस्सा)38 के 25S न्यूक्लियोटाइड के लिए एक बाध्यकारी साइट के रूप में वर्णित किया गया था।यह दिखाया गया कि पतित पी. ​​टिड्डे ES39L राइबोसोम में, यह इंटरफ़ेस एक अज्ञात एकल न्यूक्लियोटाइड 31 को बांधता है, और यह माना जाता है कि यह न्यूक्लियोटाइड आरआरएनए का एक कम अंतिम रूप है, जिसमें आरआरएनए की लंबाई ~ 130-230 आधार है।ES39L एक एकल न्यूक्लियोटाइड 32.43 में कम हो जाता है।हमारी क्रायो-ईएम छवियां इस विचार का समर्थन करती हैं कि घनत्व को न्यूक्लियोटाइड द्वारा समझाया जा सकता है।हालाँकि, हमारी संरचना के उच्च रिज़ॉल्यूशन से पता चला कि यह न्यूक्लियोटाइड एक एक्स्ट्राराइबोसोमल अणु है, संभवतः एएमपी (छवि 5 ए, बी)।
फिर हमने पूछा कि क्या न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग साइट ई. कुनिकुली राइबोसोम में दिखाई देती है या क्या यह पहले से मौजूद थी।चूंकि न्यूक्लियोटाइड बंधन मुख्य रूप से eL30 राइबोसोमल प्रोटीन में Phe170 और Lys172 अवशेषों द्वारा मध्यस्थ होता है, इसलिए हमने 4396 प्रतिनिधि यूकेरियोट्स में इन अवशेषों के संरक्षण का आकलन किया।जैसा कि ऊपर uL15 के मामले में, हमने पाया कि Phe170 और Lys172 अवशेष केवल विशिष्ट माइक्रोस्पोरिडिया में अत्यधिक संरक्षित हैं, लेकिन अन्य यूकेरियोट्स में अनुपस्थित हैं, जिनमें एटिपिकल माइक्रोस्पोरिडिया मिटोस्पोरिडियम और एम्फिम्बलिस शामिल हैं, जिसमें ES39L rRNA टुकड़ा कम नहीं हुआ है 44, 45, 46 (छवि 5 सी)।-इ)।
कुल मिलाकर, ये डेटा इस विचार का समर्थन करते हैं कि ई. क्यूनिकुली और संभवतः अन्य कैनोनिकल माइक्रोस्पोरिडिया ने आरआरएनए और प्रोटीन के स्तर में गिरावट की भरपाई के लिए राइबोसोम संरचना में बड़ी संख्या में छोटे मेटाबोलाइट्स को कुशलतापूर्वक पकड़ने की क्षमता विकसित की है।ऐसा करने में, उन्होंने राइबोसोम के बाहर न्यूक्लियोटाइड को बांधने की एक अनूठी क्षमता विकसित की है, जिससे पता चलता है कि परजीवी आणविक संरचनाएं प्रचुर मात्रा में छोटे मेटाबोलाइट्स को पकड़कर और उन्हें अपमानित आरएनए और प्रोटीन टुकड़ों की संरचनात्मक नकल के रूप में उपयोग करके क्षतिपूर्ति करती हैं।.
हमारे क्रायो-ईएम मानचित्र का तीसरा अनसिम्युलेटेड हिस्सा, बड़े राइबोसोमल सबयूनिट में पाया गया।हमारे मानचित्र का अपेक्षाकृत उच्च रिज़ॉल्यूशन (2.6 Å) बताता है कि यह घनत्व बड़े साइड चेन अवशेषों के अद्वितीय संयोजन वाले प्रोटीन से संबंधित है, जिसने हमें इस घनत्व को पहले से अज्ञात राइबोसोमल प्रोटीन के रूप में पहचानने की अनुमति दी है जिसे हमने एमएसएल 2 (माइक्रोस्पोरिडिया- विशिष्ट प्रोटीन एल 2) नाम दिया था (तरीके, चित्र 6)।हमारी होमोलॉजी खोज से पता चला है कि msL2 जीनस एन्सेफेलिटर और ओरोस्पोरिडियम के माइक्रोस्पोरिडिया क्लैड में संरक्षित है, लेकिन अन्य माइक्रोस्पोरिडिया सहित अन्य प्रजातियों में अनुपस्थित है।राइबोसोमल संरचना में, msL2 विस्तारित ES31L rRNA के नुकसान से बने अंतराल पर रहता है।इस शून्य में, msL2 rRNA फोल्डिंग को स्थिर करने में मदद करता है और ES31L के नुकसान की भरपाई कर सकता है (चित्र 6)।
ई. क्यूनिकुली राइबोसोम में पाए जाने वाले माइक्रोस्पोरिडिया-विशिष्ट राइबोसोमल प्रोटीन एमएसएल2 का एक इलेक्ट्रॉन घनत्व और मॉडल।बी अधिकांश यूकेरियोटिक राइबोसोम, जिसमें सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया के 80S राइबोसोम भी शामिल हैं, अधिकांश माइक्रोस्पोरिडियन प्रजातियों में ES19L rRNA प्रवर्धन खो गया है।वी. नेकैट्रिक्स माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम की पहले से स्थापित संरचना से पता चलता है कि इन परजीवियों में ES19L के नुकसान की भरपाई नए msL1 राइबोसोमल प्रोटीन के विकास से होती है।इस अध्ययन में, हमने पाया कि ई. कुनिकुली राइबोसोम ने ES19L के नुकसान के स्पष्ट मुआवजे के रूप में एक अतिरिक्त राइबोसोमल आरएनए नकल प्रोटीन भी विकसित किया है।हालाँकि, msL2 (वर्तमान में काल्पनिक ECU06_1135 प्रोटीन के रूप में एनोटेट किया गया है) और msL1 की संरचनात्मक और विकासवादी उत्पत्ति अलग-अलग है।सी विकासात्मक रूप से असंबंधित एमएसएल 1 और एमएसएल 2 राइबोसोमल प्रोटीन की पीढ़ी की इस खोज से पता चलता है कि यदि राइबोसोम अपने आरआरएनए में हानिकारक उत्परिवर्तन जमा करते हैं, तो वे निकट से संबंधित प्रजातियों के एक छोटे उपसमूह में भी संरचनागत विविधता के अभूतपूर्व स्तर प्राप्त कर सकते हैं।यह खोज माइटोकॉन्ड्रियल राइबोसोम की उत्पत्ति और विकास को स्पष्ट करने में मदद कर सकती है, जो कि प्रजातियों में प्रोटीन संरचना में अत्यधिक कम आरआरएनए और असामान्य परिवर्तनशीलता के लिए जाना जाता है।
फिर हमने msL2 प्रोटीन की तुलना पहले वर्णित msL1 प्रोटीन से की, जो वी. नेकैट्रिक्स राइबोसोम में पाया जाने वाला एकमात्र ज्ञात माइक्रोस्पोरिडिया-विशिष्ट राइबोसोमल प्रोटीन है।हम परीक्षण करना चाहते थे कि क्या msL1 और msL2 विकासात्मक रूप से संबंधित हैं।हमारे विश्लेषण से पता चला है कि एमएसएल1 और एमएसएल2 राइबोसोमल संरचना में एक ही गुहा में रहते हैं, लेकिन उनकी प्राथमिक और तृतीयक संरचनाएं अलग-अलग होती हैं, जो उनकी स्वतंत्र विकासवादी उत्पत्ति को इंगित करता है (चित्र 6)।इस प्रकार, एमएसएल2 की हमारी खोज इस बात का सबूत देती है कि कॉम्पैक्ट यूकेरियोटिक प्रजातियों के समूह आरआरएनए टुकड़ों के नुकसान की भरपाई के लिए स्वतंत्र रूप से संरचनात्मक रूप से अलग राइबोसोमल प्रोटीन विकसित कर सकते हैं।यह खोज उल्लेखनीय है कि अधिकांश साइटोप्लाज्मिक यूकेरियोटिक राइबोसोम में एक अपरिवर्तनीय प्रोटीन होता है, जिसमें 81 राइबोसोमल प्रोटीन का एक ही परिवार शामिल है।विस्तारित आरआरएनए खंडों के नुकसान के जवाब में माइक्रोस्पोरिडिया के विभिन्न समूहों में एमएसएल 1 और एमएसएल 2 की उपस्थिति से पता चलता है कि परजीवी की आणविक वास्तुकला का क्षरण परजीवियों को प्रतिपूरक उत्परिवर्तन की तलाश करने का कारण बनता है, जो अंततः विभिन्न परजीवी आबादी में उनके अधिग्रहण का कारण बन सकता है।संरचनाएँ।
अंत में, जब हमारा मॉडल पूरा हो गया, तो हमने ई. कुनिकुली राइबोसोम की संरचना की तुलना जीनोम अनुक्रम से अनुमानित संरचना से की।ई. क्यूनिकुली जीनोम से उनके समरूपों की स्पष्ट अनुपस्थिति के कारण ईएल14, ईएल38, ईएल41 और ईएस30 सहित कई राइबोसोमल प्रोटीन को पहले ई. क्यूनिकुली जीनोम से गायब माना जाता था।अधिकांश अन्य अत्यधिक कम इंट्रासेल्युलर परजीवियों और एंडोसिम्बियोन्ट्स में भी कई राइबोसोमल प्रोटीन के नुकसान की भविष्यवाणी की गई है।उदाहरण के लिए, हालांकि अधिकांश मुक्त-जीवित बैक्टीरिया में 54 राइबोसोमल प्रोटीन का एक ही परिवार होता है, इनमें से केवल 11 प्रोटीन परिवारों में मेजबान-प्रतिबंधित बैक्टीरिया के प्रत्येक विश्लेषण किए गए जीनोम में पता लगाने योग्य होमोलॉग होते हैं।इस धारणा के समर्थन में, प्रयोगात्मक रूप से वी. नेकैट्रिक्स और पी. टिड्डे माइक्रोस्पोरिडिया में राइबोसोमल प्रोटीन का नुकसान देखा गया है, जिनमें ईएल38 और ईएल4131,32 प्रोटीन की कमी है।
हालाँकि, हमारी संरचनाएँ दर्शाती हैं कि केवल eL38, eL41, और eS30 ही वास्तव में E. क्यूनिकुली राइबोसोम में नष्ट होते हैं।ईएल14 प्रोटीन को संरक्षित किया गया था और हमारी संरचना से पता चला कि यह प्रोटीन होमोलॉजी खोज में क्यों नहीं पाया जा सका (चित्र 7)।ई. क्यूनिकुली राइबोसोम में, rRNA-प्रवर्धित ES39L के क्षरण के कारण अधिकांश eL14 बाइंडिंग साइट नष्ट हो जाती है।ईएस39एल की अनुपस्थिति में, ईएल14 ने अपनी अधिकांश माध्यमिक संरचना खो दी, और ई. क्यूनिकुली और एस. सेरेविसिया में ईएल14 अनुक्रम का केवल 18% समान था।यह खराब अनुक्रम संरक्षण उल्लेखनीय है क्योंकि यहां तक ​​कि सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया और होमो सेपियन्स-जीव जो 1.5 अरब साल अलग विकसित हुए हैं-ईएल14 में समान अवशेषों का 51% से अधिक हिस्सा साझा करते हैं।संरक्षण की यह असामान्य हानि बताती है कि क्यों ई. कुनिकुली ईएल14 को वर्तमान में अनुमानित एम970_061160 प्रोटीन के रूप में एनोटेट किया गया है, न कि ईएल1427 राइबोसोमल प्रोटीन के रूप में।
और माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम ने ES39L rRNA एक्सटेंशन खो दिया, जिसने eL14 राइबोसोमल प्रोटीन बाइंडिंग साइट को आंशिक रूप से समाप्त कर दिया।ES39L की अनुपस्थिति में, eL14 माइक्रोस्पोर प्रोटीन माध्यमिक संरचना के नुकसान से गुजरता है, जिसमें पूर्व rRNA-बाइंडिंग α-हेलिक्स न्यूनतम लंबाई के लूप में बदल जाता है।बी एकाधिक अनुक्रम संरेखण से पता चलता है कि ईएल14 प्रोटीन यूकेरियोटिक प्रजातियों (खमीर और मानव समजातों के बीच 57% अनुक्रम पहचान) में अत्यधिक संरक्षित है, लेकिन माइक्रोस्पोरिडिया में खराब रूप से संरक्षित और भिन्न है (जिसमें 24% से अधिक अवशेष ईएल14 समजात के समान नहीं हैं)।एस. सेरेविसिया या एच. सेपियंस से)।यह खराब अनुक्रम संरक्षण और माध्यमिक संरचना परिवर्तनशीलता बताती है कि ई. क्यूनिकुली में ईएल14 होमोलॉग कभी क्यों नहीं पाया गया और क्यों यह प्रोटीन ई. क्यूनिकुली में खो गया माना जाता है।इसके विपरीत, ई. कुनिकुली ईएल14 को पहले एक अनुमानित M970_061160 प्रोटीन के रूप में एनोटेट किया गया था।इस अवलोकन से पता चलता है कि माइक्रोस्पोरिडिया जीनोम विविधता को वर्तमान में कम करके आंका गया है: वर्तमान में माइक्रोस्पोरिडिया में खोए हुए कुछ जीन वास्तव में संरक्षित हैं, यद्यपि अत्यधिक विभेदित रूपों में;इसके बजाय, कुछ लोगों को कृमि-विशिष्ट प्रोटीन (उदाहरण के लिए, काल्पनिक प्रोटीन M970_061160) के लिए माइक्रोस्पोरिडिया जीन के लिए कोड करने के लिए सोचा जाता है, जो वास्तव में अन्य यूकेरियोट्स में पाए जाने वाले बहुत विविध प्रोटीन के लिए कोड होते हैं।
इस खोज से पता चलता है कि आरआरएनए विकृतीकरण से आसन्न राइबोसोमल प्रोटीन में अनुक्रम संरक्षण का नाटकीय नुकसान हो सकता है, जिससे ये प्रोटीन होमोलॉजी खोजों के लिए अवांछनीय हो जाते हैं।इस प्रकार, हम छोटे जीनोम वाले जीवों में आणविक क्षरण की वास्तविक डिग्री को अधिक महत्व दे सकते हैं, क्योंकि कुछ प्रोटीन जिन्हें खोया हुआ माना जाता है वे वास्तव में बने रहते हैं, यद्यपि अत्यधिक परिवर्तित रूपों में।
अत्यधिक जीनोम कटौती की स्थितियों में परजीवी अपनी आणविक मशीनों के कार्य को कैसे बनाए रख सकते हैं?हमारा अध्ययन सबसे छोटे यूकेरियोटिक जीनोम वाले जीव ई. क्यूनिकुली की जटिल आणविक संरचना (राइबोसोम) का वर्णन करके इस प्रश्न का उत्तर देता है।
यह लगभग दो दशकों से ज्ञात है कि माइक्रोबियल परजीवियों में प्रोटीन और आरएनए अणु अक्सर मुक्त-जीवित प्रजातियों में उनके समजात अणुओं से भिन्न होते हैं क्योंकि उनमें गुणवत्ता नियंत्रण केंद्रों की कमी होती है, वे मुक्त-जीवित रोगाणुओं में अपने आकार के 50% तक कम हो जाते हैं, आदि।कई दुर्बल करने वाले उत्परिवर्तन जो तह और कार्य को ख़राब करते हैं।उदाहरण के लिए, कई इंट्रासेल्युलर परजीवियों और एंडोसिम्बियन्ट्स सहित छोटे जीनोम जीवों के राइबोसोम में मुक्त-जीवित प्रजातियों 27, 29, 30, 49 की तुलना में कई राइबोसोमल प्रोटीन और एक तिहाई आरआरएनए न्यूक्लियोटाइड की कमी होने की उम्मीद है। हालांकि, जिस तरह से ये अणु परजीवी में कार्य करते हैं वह काफी हद तक एक रहस्य बना हुआ है, जिसका अध्ययन मुख्य रूप से तुलनात्मक जीनोमिक्स के माध्यम से किया गया है।
हमारे अध्ययन से पता चलता है कि मैक्रोमोलेक्यूल्स की संरचना विकास के कई पहलुओं को प्रकट कर सकती है जिन्हें इंट्रासेल्युलर परजीवियों और अन्य मेजबान-प्रतिबंधित जीवों के पारंपरिक तुलनात्मक जीनोमिक अध्ययन से निकालना मुश्किल है (पूरक चित्र 7)।उदाहरण के लिए, ईएल14 प्रोटीन के उदाहरण से पता चलता है कि हम परजीवी प्रजातियों में आणविक तंत्र के क्षरण की वास्तविक डिग्री का अनुमान लगा सकते हैं।अब माना जाता है कि एन्सेफैलिटिक परजीवियों में सैकड़ों माइक्रोस्पोरिडिया-विशिष्ट जीन होते हैं।हालाँकि, हमारे परिणाम बताते हैं कि इनमें से कुछ प्रतीत होने वाले विशिष्ट जीन वास्तव में जीन के बहुत भिन्न प्रकार हैं जो अन्य यूकेरियोट्स में आम हैं।इसके अलावा, एमएसएल2 प्रोटीन का उदाहरण दिखाता है कि हम नए राइबोसोमल प्रोटीन को कैसे नजरअंदाज करते हैं और परजीवी आणविक मशीनों की सामग्री को कम आंकते हैं।छोटे अणुओं का उदाहरण दिखाता है कि हम परजीवी आणविक संरचनाओं में सबसे सरल नवाचारों को कैसे नजरअंदाज कर सकते हैं जो उन्हें नई जैविक गतिविधि दे सकते हैं।
कुल मिलाकर, ये परिणाम मेजबान-प्रतिबंधित जीवों की आणविक संरचनाओं और मुक्त-जीवित जीवों में उनके समकक्षों के बीच अंतर के बारे में हमारी समझ में सुधार करते हैं।हम दिखाते हैं कि आणविक मशीनें, जिनके बारे में लंबे समय से माना जाता था कि वे कम हो गई हैं, ख़राब हो गई हैं और विभिन्न दुर्बल उत्परिवर्तनों के अधीन हैं, इसके बजाय व्यवस्थित रूप से अनदेखी की गई असामान्य संरचनात्मक विशेषताओं का एक सेट है।
दूसरी ओर, गैर-भारी आरआरएनए टुकड़े और जुड़े हुए टुकड़े जो हमें ई. क्यूनिकुली के राइबोसोम में मिले, सुझाव देते हैं कि जीनोम कटौती बुनियादी आणविक मशीनरी के उन हिस्सों को भी बदल सकती है जो जीवन के तीन डोमेन में संरक्षित हैं - लगभग 3.5 अरब वर्षों के बाद।प्रजातियों का स्वतंत्र विकास.
ई. कुनिकुली राइबोसोम में उभार रहित और जुड़े हुए आरआरएनए टुकड़े एंडोसिम्बायोटिक बैक्टीरिया में आरएनए अणुओं के पिछले अध्ययनों के प्रकाश में विशेष रुचि रखते हैं।उदाहरण के लिए, एफिड एंडोसिम्बियन्ट बुचनेरा एफिडिकोला में, आरआरएनए और टीआरएनए अणुओं में ए+टी संरचना पूर्वाग्रह और गैर-विहित आधार जोड़े20,50 के उच्च अनुपात के कारण तापमान-संवेदनशील संरचनाएं दिखाई गई हैं।आरएनए में ये परिवर्तन, साथ ही प्रोटीन अणुओं में परिवर्तन, अब भागीदारों पर एंडोसिम्बियोन्ट्स की अत्यधिक निर्भरता और गर्मी 21, 23 को स्थानांतरित करने में एंडोसिम्बियोन्ट्स की अक्षमता के लिए जिम्मेदार माना जाता है।यद्यपि परजीवी माइक्रोस्पोरिडिया आरआरएनए में संरचनात्मक रूप से अलग-अलग परिवर्तन होते हैं, इन परिवर्तनों की प्रकृति से पता चलता है कि कम थर्मल स्थिरता और चैपरोन प्रोटीन पर उच्च निर्भरता कम जीनोम वाले जीवों में आरएनए अणुओं की सामान्य विशेषताएं हो सकती हैं।
दूसरी ओर, हमारी संरचनाएं दर्शाती हैं कि परजीवी माइक्रोस्पोरिडिया ने व्यापक रूप से संरक्षित आरआरएनए और प्रोटीन टुकड़ों का विरोध करने की एक अनूठी क्षमता विकसित की है, जिससे प्रचुर मात्रा में और आसानी से उपलब्ध छोटे मेटाबोलाइट्स को पतित आरआरएनए और प्रोटीन टुकड़ों की संरचनात्मक नकल के रूप में उपयोग करने की क्षमता विकसित हुई है।आणविक संरचना का क्षरण।.यह राय इस तथ्य से समर्थित है कि छोटे अणु जो ई. कुनिकुली के आरआरएनए और राइबोसोम में प्रोटीन के टुकड़ों के नुकसान की भरपाई करते हैं, यूएल15 और ईएल30 प्रोटीन में माइक्रोस्पोरिडिया-विशिष्ट अवशेषों से जुड़ते हैं।इससे पता चलता है कि छोटे अणुओं को राइबोसोम से बांधना सकारात्मक चयन का एक उत्पाद हो सकता है, जिसमें राइबोसोमल प्रोटीन में माइक्रोस्पोरिडिया-विशिष्ट उत्परिवर्तन को छोटे अणुओं के लिए राइबोसोम की आत्मीयता को बढ़ाने की उनकी क्षमता के लिए चुना गया है, जिससे अधिक कुशल राइबोसोमल जीव हो सकते हैं।यह खोज माइक्रोबियल परजीवियों की आणविक संरचना में एक स्मार्ट नवाचार का खुलासा करती है और हमें इस बात की बेहतर समझ देती है कि कैसे परजीवी आणविक संरचनाएं रिडक्टिव विकास के बावजूद अपने कार्य को बनाए रखती हैं।
फिलहाल इन छोटे अणुओं की पहचान अस्पष्ट बनी हुई है।यह स्पष्ट नहीं है कि राइबोसोमल संरचना में इन छोटे अणुओं की उपस्थिति माइक्रोस्पोरिडिया प्रजातियों के बीच भिन्न क्यों होती है।विशेष रूप से, यह स्पष्ट नहीं है कि वी. नेकाट्रिक्स के ईएल20 और के172 प्रोटीन में एफ170 अवशेषों की उपस्थिति के बावजूद, ई. क्यूनिकुली और पी. टिड्डे के राइबोसोम में न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग क्यों देखी जाती है, और वी. नेकाट्रिक्स के राइबोसोम में नहीं।यह विलोपन अवशेष 43 यूएल6 (न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग पॉकेट के निकट स्थित) के कारण हो सकता है, जो वी. नेकैट्रिक्स में टायरोसिन है और ई. क्यूनिकुली और पी. टिड्डे में थ्रेओनीन नहीं है।Tyr43 की भारी सुगंधित साइड चेन स्टेरिक ओवरलैप के कारण न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग में हस्तक्षेप कर सकती है।वैकल्पिक रूप से, स्पष्ट न्यूक्लियोटाइड विलोपन क्रायो-ईएम इमेजिंग के कम रिज़ॉल्यूशन के कारण हो सकता है, जो वी. नेकैट्रिक्स राइबोसोमल टुकड़ों के मॉडलिंग में बाधा डालता है।
दूसरी ओर, हमारा काम बताता है कि जीनोम क्षय की प्रक्रिया एक आविष्कारशील शक्ति हो सकती है।विशेष रूप से, ई. कुनिकुली राइबोसोम की संरचना से पता चलता है कि माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम में आरआरएनए और प्रोटीन के टुकड़ों का नुकसान विकासवादी दबाव बनाता है जो राइबोसोम संरचना में परिवर्तन को बढ़ावा देता है।ये वेरिएंट राइबोसोम की सक्रिय साइट से बहुत दूर होते हैं और इष्टतम राइबोसोम असेंबली को बनाए रखने (या बहाल करने) में मदद करते प्रतीत होते हैं जो अन्यथा कम आरआरएनए द्वारा बाधित हो जाते।इससे पता चलता है कि माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम का एक प्रमुख नवाचार जीन बहाव को बफर करने की आवश्यकता के रूप में विकसित हुआ है।
शायद इसे न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग द्वारा सबसे अच्छी तरह से चित्रित किया गया है, जो अब तक अन्य जीवों में कभी नहीं देखा गया है।तथ्य यह है कि न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग अवशेष विशिष्ट माइक्रोस्पोरिडिया में मौजूद हैं, लेकिन अन्य यूकेरियोट्स में नहीं, यह बताता है कि न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग साइटें गायब होने की प्रतीक्षा कर रहे अवशेष नहीं हैं, या आरआरएनए के लिए व्यक्तिगत न्यूक्लियोटाइड के रूप में बहाल होने वाली अंतिम साइट नहीं हैं।इसके बजाय, यह साइट एक उपयोगी सुविधा की तरह लगती है जो सकारात्मक चयन के कई दौरों में विकसित हो सकती थी।न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग साइटें प्राकृतिक चयन का उप-उत्पाद हो सकती हैं: एक बार ES39L के क्षरण के बाद, माइक्रोस्पोरिडिया को ES39L की अनुपस्थिति में इष्टतम राइबोसोम जैवजनन को बहाल करने के लिए मुआवजे की मांग करने के लिए मजबूर होना पड़ता है।चूँकि यह न्यूक्लियोटाइड ES39L में A3186 न्यूक्लियोटाइड के आणविक संपर्कों की नकल कर सकता है, न्यूक्लियोटाइड अणु राइबोसोम का एक बिल्डिंग ब्लॉक बन जाता है, जिसके बंधन को eL30 अनुक्रम के उत्परिवर्तन द्वारा और बेहतर बनाया जाता है।
इंट्रासेल्युलर परजीवियों के आणविक विकास के संबंध में, हमारे अध्ययन से पता चलता है कि डार्विनियन प्राकृतिक चयन और जीनोम क्षय के आनुवंशिक बहाव की ताकतें समानांतर में काम नहीं करती हैं, बल्कि दोलन करती हैं।सबसे पहले, आनुवंशिक बहाव जैव अणुओं की महत्वपूर्ण विशेषताओं को समाप्त कर देता है, जिससे क्षतिपूर्ति की अत्यधिक आवश्यकता होती है।केवल जब परजीवी डार्विनियन प्राकृतिक चयन के माध्यम से इस आवश्यकता को पूरा करते हैं, तो उनके मैक्रोमोलेक्यूल्स को अपने सबसे प्रभावशाली और नवीन गुणों को विकसित करने का मौका मिलेगा।महत्वपूर्ण रूप से, ई. कुनिकुली राइबोसोम में न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग साइटों के विकास से पता चलता है कि आणविक विकास का यह हानि-से-लाभ पैटर्न न केवल हानिकारक उत्परिवर्तन को कम करता है, बल्कि कभी-कभी परजीवी मैक्रोमोलेक्यूल्स पर पूरी तरह से नए कार्य प्रदान करता है।
यह विचार सीवेल राइट के गतिमान संतुलन सिद्धांत के अनुरूप है, जिसमें कहा गया है कि प्राकृतिक चयन की एक सख्त प्रणाली जीवों की नवप्रवर्तन की क्षमता को सीमित कर देती है।हालाँकि, यदि आनुवंशिक बहाव प्राकृतिक चयन को बाधित करता है, तो ये बदलाव ऐसे परिवर्तन उत्पन्न कर सकते हैं जो स्वयं अनुकूली (या हानिकारक भी) नहीं हैं, लेकिन आगे के परिवर्तनों को जन्म देते हैं जो उच्च फिटनेस या नई जैविक गतिविधि प्रदान करते हैं।हमारा ढांचा यह दर्शाते हुए इस विचार का समर्थन करता है कि एक ही प्रकार का उत्परिवर्तन जो बायोमोलेक्यूल की तह और कार्य को कम करता है, इसके सुधार के लिए मुख्य ट्रिगर प्रतीत होता है।जीत-जीत विकासवादी मॉडल के अनुरूप, हमारे अध्ययन से पता चलता है कि जीनोम क्षय, जिसे पारंपरिक रूप से एक अपक्षयी प्रक्रिया के रूप में देखा जाता है, नवाचार का एक प्रमुख चालक भी है, कभी-कभी और शायद अक्सर मैक्रोमोलेक्यूल्स को नई परजीवी गतिविधियों को प्राप्त करने की अनुमति भी देता है।उनका उपयोग कर सकते हैं.