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रक्त-मस्तिष्क अवरोध और रक्त-मस्तिष्क अवरोध जैव-चिकित्सीय एजेंटों को केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में अपने लक्ष्य तक पहुंचने से रोकते हैं, जिससे तंत्रिका संबंधी रोगों के प्रभावी उपचार में बाधा आती है।विवो में नवीन मस्तिष्क ट्रांसपोर्टरों की खोज करने के लिए, हमने एक टी7 फेज पेप्टाइड लाइब्रेरी की शुरुआत की और चूहों के एक कैनुलेटेड सचेत बड़े पूल मॉडल का उपयोग करके रक्त और मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) को क्रमिक रूप से एकत्र किया।चयन के चार दौर के बाद सीएसएफ में विशिष्ट फेज क्लोनों को अत्यधिक समृद्ध किया गया।व्यक्तिगत उम्मीदवार पेप्टाइड्स के परीक्षण से सीएसएफ में 1000 गुना से अधिक संवर्धन का पता चला।मस्तिष्क में पेप्टाइड-मध्यस्थता वितरण की जैव सक्रियता की पुष्टि पहचाने गए उपन्यास पारगमन पेप्टाइड से जुड़े BACE1 पेप्टाइड अवरोधक का उपयोग करके मस्तिष्कमेरु द्रव में अमाइलॉइड-बीटा के स्तर में 40% की कमी से की गई थी।इन परिणामों से पता चलता है कि विवो फ़ेज़ चयन विधियों द्वारा पहचाने गए पेप्टाइड्स चिकित्सीय प्रभाव के साथ मस्तिष्क में मैक्रोमोलेक्यूल्स की प्रणालीगत डिलीवरी के लिए उपयोगी वाहन हो सकते हैं।
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) लक्षित थेरेपी अनुसंधान ने बड़े पैमाने पर अनुकूलित दवाओं और एजेंटों की पहचान करने पर ध्यान केंद्रित किया है जो सीएनएस-लक्षित गुणों को प्रदर्शित करते हैं, मस्तिष्क में सक्रिय दवा वितरण को संचालित करने वाले तंत्र की खोज पर कम प्रयास किए गए हैं।यह अब बदलना शुरू हो रहा है क्योंकि दवा वितरण, विशेष रूप से बड़े अणु, आधुनिक तंत्रिका विज्ञान दवा विकास का एक अभिन्न अंग है।केंद्रीय तंत्रिका तंत्र का वातावरण सेरेब्रोवास्कुलर बैरियर सिस्टम द्वारा अच्छी तरह से संरक्षित है, जिसमें रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) और रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीसीबीबी)1 शामिल है, जिससे मस्तिष्क1,2 तक दवाएं पहुंचाना चुनौतीपूर्ण हो जाता है।यह अनुमान लगाया गया है कि लगभग सभी बड़े अणु वाली दवाएं और 98% से अधिक छोटे अणु वाली दवाएं मस्तिष्क से समाप्त हो जाती हैं3।इसीलिए नए मस्तिष्क परिवहन प्रणालियों की पहचान करना बहुत महत्वपूर्ण है जो सीएनएस 4,5 को चिकित्सीय दवाओं की कुशल और विशिष्ट डिलीवरी प्रदान करते हैं।हालाँकि, बीबीबी और बीसीएसएफबी भी दवा वितरण के लिए एक उत्कृष्ट अवसर प्रस्तुत करते हैं क्योंकि वे अपने व्यापक वाहिका के माध्यम से मस्तिष्क की सभी संरचनाओं में प्रवेश करते हैं।इस प्रकार, मस्तिष्क तक डिलीवरी के गैर-आक्रामक तरीकों का उपयोग करने के वर्तमान प्रयास काफी हद तक अंतर्जात बीबीबी 6 रिसेप्टर का उपयोग करके रिसेप्टर-मध्यस्थता परिवहन (पीएमटी) के तंत्र पर आधारित हैं।ट्रांसफ़रिन रिसेप्टर पाथवे7,8 का उपयोग करके हाल की प्रमुख प्रगति के बावजूद, बेहतर गुणों के साथ नई डिलीवरी प्रणालियों के और विकास की आवश्यकता है।इस उद्देश्य के लिए, हमारा लक्ष्य सीएसएफ परिवहन में मध्यस्थता करने में सक्षम पेप्टाइड्स की पहचान करना था, क्योंकि सिद्धांत रूप में उनका उपयोग सीएनएस में मैक्रोमोलेक्यूल्स पहुंचाने या नए रिसेप्टर मार्ग खोलने के लिए किया जा सकता था।विशेष रूप से, सेरेब्रोवास्कुलर सिस्टम (बीबीबी और बीएससीएफबी) के विशिष्ट रिसेप्टर्स और ट्रांसपोर्टर बायोथेराप्यूटिक दवाओं के सक्रिय और विशिष्ट वितरण के लिए संभावित लक्ष्य के रूप में काम कर सकते हैं।सेरेब्रोस्पाइनल द्रव (CSF) कोरॉइड प्लेक्सस (CS) का एक स्रावी उत्पाद है और यह सबराचोनोइड स्पेस और वेंट्रिकुलर स्पेस4 के माध्यम से मस्तिष्क के अंतरालीय द्रव के सीधे संपर्क में है।हाल ही में यह दिखाया गया है कि सबराचोनोइड सेरेब्रोस्पाइनल द्रव मस्तिष्क के इंटरस्टिटियम में अत्यधिक फैल जाता है।हम इस सबराचोनोइड इनफ्लो पथ का उपयोग करके या सीधे बीबीबी के माध्यम से पैरेन्काइमल स्थान तक पहुंचने की उम्मीद करते हैं।इसे प्राप्त करने के लिए, हमने विवो फ़ेज़ चयन रणनीति में एक मजबूत कार्यान्वित किया जो आदर्श रूप से इन दो अलग-अलग मार्गों से परिवहन किए गए पेप्टाइड्स की पहचान करता है।
अब हम उच्चतम लाइब्रेरी विविधता के साथ प्रारंभिक चयन राउंड की निगरानी के लिए उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण (एचटीएस) के साथ सीएसएफ नमूने के साथ विवो फेज डिस्प्ले स्क्रीनिंग विधि में अनुक्रमिक का वर्णन करते हैं।रक्त संदूषण से बचने के लिए स्थायी रूप से प्रत्यारोपित बड़े सिस्टर्ना (सीएम) कैनुला के साथ जागरूक चूहों पर स्क्रीनिंग की गई।महत्वपूर्ण बात यह है कि यह दृष्टिकोण मस्तिष्क-लक्ष्यीकरण और सेरेब्रोवास्कुलर बाधा के पार परिवहन गतिविधि वाले पेप्टाइड्स दोनों का चयन करता है।हमने उनके छोटे आकार (~60 एनएम)10 के कारण टी7 फेज का उपयोग किया और सुझाव दिया कि वे पुटिकाओं के परिवहन के लिए उपयुक्त हैं जो एंडोथेलियल और/या एपिथेलियल-मेडुला बाधा के ट्रांससेलुलर क्रॉसिंग की अनुमति देते हैं।पैनिंग के चार राउंड के बाद, विवो सीएसएफ संवर्धन और सेरेब्रल माइक्रोवेसल एसोसिएशन में मजबूत प्रदर्शन करते हुए फेज आबादी को अलग कर दिया गया।महत्वपूर्ण रूप से, हम यह प्रदर्शित करके अपने निष्कर्षों की पुष्टि करने में सक्षम थे कि पसंदीदा और रासायनिक रूप से संश्लेषित सर्वोत्तम उम्मीदवार पेप्टाइड्स प्रोटीन कार्गो को मस्तिष्कमेरु द्रव में ले जाने में सक्षम हैं।सबसे पहले, CNS के फार्माकोडायनामिक प्रभावों को BACE1 पेप्टाइड के अवरोधक के साथ एक प्रमुख पारगमन पेप्टाइड के संयोजन से स्थापित किया गया था।यह प्रदर्शित करने के अलावा कि विवो कार्यात्मक स्क्रीनिंग रणनीतियाँ उपन्यास मस्तिष्क परिवहन पेप्टाइड्स को प्रभावी प्रोटीन कार्गो वाहक के रूप में पहचान सकती हैं, हम उम्मीद करते हैं कि उपन्यास मस्तिष्क परिवहन मार्गों की पहचान करने में समान कार्यात्मक चयन दृष्टिकोण भी महत्वपूर्ण हो जाएंगे।
प्लाक बनाने वाली इकाइयों (पीएफयू) के आधार पर, फेज पैकेजिंग चरण के बाद, लगभग 109 की विविधता के साथ यादृच्छिक 12-मेर रैखिक टी 7 फेज पेप्टाइड्स की एक लाइब्रेरी डिजाइन और बनाई गई थी (सामग्री और तरीके देखें)।यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि हमने विवो पैनिंग से पहले इस लाइब्रेरी का सावधानीपूर्वक विश्लेषण किया था।संशोधित प्राइमरों का उपयोग करके फेज लाइब्रेरी नमूनों के पीसीआर प्रवर्धन ने एम्प्लिकॉन उत्पन्न किए जो सीधे एचटीएस (पूरक छवि 1 ए) पर लागू होते थे।ए) एचटीएस11 अनुक्रमण त्रुटियों, बी) प्राइमरों की गुणवत्ता पर प्रभाव (एनएनके)1-12, और सी) स्टैंडबाय लाइब्रेरी में वाइल्ड-टाइप (डब्ल्यूटी) फेज (कंकाल आवेषण) की उपस्थिति के कारण, केवल सत्यापित अनुक्रम जानकारी (पूरक छवि 1 बी) निकालने के लिए एक अनुक्रम फ़िल्टरिंग प्रक्रिया लागू की गई थी।ये फ़िल्टर चरण सभी HTS अनुक्रमण लाइब्रेरीज़ पर लागू होते हैं।मानक पुस्तकालय के लिए, कुल 233,868 रीड प्राप्त किए गए, जिनमें से 39% ने फ़िल्टर मानदंड पारित किया और बाद के राउंड के लिए लाइब्रेरी विश्लेषण और चयन के लिए उपयोग किया गया (पूरक चित्र 1सी-ई)।रीड्स मुख्य रूप से 36 न्यूक्लियोटाइड्स (पूरक छवि 1 सी) पर शिखर के साथ लंबाई में 3 बेस जोड़े के गुणक थे, जो लाइब्रेरी डिजाइन (एनएनके) 1-12 की पुष्टि करते हैं।विशेष रूप से, लगभग 11% लाइब्रेरी सदस्यों में 12-आयामी वाइल्ड-टाइप (डब्ल्यूटी) बैकबोन PAGISRELVDKL सम्मिलित था, और लगभग आधे अनुक्रमों (49%) में सम्मिलन या विलोपन शामिल थे।लाइब्रेरी लाइब्रेरी के एचटीएस ने लाइब्रेरी में पेप्टाइड्स की उच्च विविधता की पुष्टि की: 81% से अधिक पेप्टाइड अनुक्रम केवल एक बार पाए गए और केवल 1.5% ≥4 प्रतियों में पाए गए (पूरक छवि 2 ए)।प्रदर्शनों की सूची में सभी 12 पदों पर अमीनो एसिड (एए) की आवृत्तियों को पतित एनकेके प्रदर्शनों की सूची (पूरक छवि 2 बी) द्वारा उत्पन्न कोडन की संख्या के लिए अपेक्षित आवृत्तियों के साथ अच्छी तरह से सहसंबद्ध किया गया है।इन आवेषणों द्वारा एन्कोड किए गए एए अवशेषों की देखी गई आवृत्ति गणना की गई आवृत्ति (आर = 0.893) (पूरक छवि 2सी) के साथ अच्छी तरह से सहसंबद्ध है।इंजेक्शन के लिए फेज लाइब्रेरी की तैयारी में एंडोटॉक्सिन के प्रवर्धन और निष्कासन के चरण शामिल हैं।इसे पहले संभावित रूप से फ़ेज़ लाइब्रेरीज़12,13 की विविधता को कम करने के लिए दिखाया गया है।इसलिए, हमने एक प्लेट-एम्प्लीफाइड फेज लाइब्रेरी को अनुक्रमित किया जिसमें एंडोटॉक्सिन को हटा दिया गया था और एए की आवृत्ति का अनुमान लगाने के लिए इसकी तुलना मूल लाइब्रेरी से की गई थी।मूल पूल और प्रवर्धित और शुद्ध पूल (अनुपूरक चित्र 2डी) के बीच एक मजबूत सहसंबंध (आर = 0.995) देखा गया, जो दर्शाता है कि टी7 फेज का उपयोग करके प्लेटों पर प्रवर्धित क्लोनों के बीच प्रतिस्पर्धा बड़े पूर्वाग्रह का कारण नहीं बनी।यह तुलना प्रत्येक पुस्तकालय में ट्रिपेप्टाइड रूपांकनों की आवृत्ति पर आधारित है, क्योंकि पुस्तकालयों की विविधता (~109) को एचटीएस के साथ भी पूरी तरह से कैप्चर नहीं किया जा सकता है।प्रत्येक स्थिति में एए के आवृत्ति विश्लेषण से दर्ज किए गए प्रदर्शनों की सूची के अंतिम तीन पदों में एक छोटी स्थिति-निर्भर पूर्वाग्रह का पता चला (पूरक छवि 2e)।निष्कर्ष में, हमने निष्कर्ष निकाला कि पुस्तकालय की गुणवत्ता और विविधता स्वीकार्य थी और चयन के कई दौरों के बीच फेज पुस्तकालयों के प्रवर्धन और तैयारी के कारण विविधता में केवल मामूली बदलाव देखे गए थे।
बीबीबी और/या बीसीएसएफबी (चित्र 1ए-बी) के माध्यम से अंतःशिरा में इंजेक्ट किए गए टी7 फेज की पहचान की सुविधा के लिए सचेत चूहों के सीएम में एक प्रवेशनी को शल्य चिकित्सा द्वारा प्रत्यारोपित करके सीरियल सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ का नमूना लिया जा सकता है।हमने विवो चयन के पहले तीन राउंड में दो स्वतंत्र चयन हथियारों (हाथ ए और बी) का उपयोग किया (छवि 1 सी)।हमने चयन के पहले तीन दौरों में पेश की गई फ़ेज़ की कुल मात्रा को कम करके चयन की कठोरता को धीरे-धीरे बढ़ाया।पैनिंग के चौथे दौर के लिए, हमने शाखाओं ए और बी से नमूनों को जोड़ा और तीन अतिरिक्त स्वतंत्र चयन किए।इस मॉडल में टी7 फेज कणों के इन विवो गुणों का अध्ययन करने के लिए, वाइल्ड-टाइप फेज (पीएजीआईएसआरईएलवीडीकेएल मास्टर इंसर्ट) को पूंछ नस के माध्यम से चूहों में इंजेक्ट किया गया था।अलग-अलग समय बिंदुओं पर मस्तिष्कमेरु द्रव और रक्त से फेज की पुनर्प्राप्ति से पता चला कि अपेक्षाकृत छोटे टी 7 इकोसाहेड्रल फेज में रक्त डिब्बे से तेजी से प्रारंभिक निकासी चरण था (पूरक चित्र 3)।प्रशासित टाइटर्स और चूहों के रक्त की मात्रा के आधार पर, हमने गणना की कि केवल लगभग 1% वजन।प्रशासित खुराक से फेज अंतःशिरा इंजेक्शन के 10 मिनट बाद रक्त में पाया गया।इस प्रारंभिक तीव्र गिरावट के बाद, 27.7 मिनट के आधे जीवन के साथ धीमी प्राथमिक निकासी मापी गई।महत्वपूर्ण बात यह है कि सीएसएफ डिब्बे से केवल बहुत कम फेज प्राप्त किए गए थे, जो सीएसएफ डिब्बे में जंगली-प्रकार के फेज प्रवास के लिए कम पृष्ठभूमि का संकेत देता है (पूरक चित्र 3)।औसतन, संपूर्ण नमूना अवधि (0-250 मिनट) के दौरान रक्त में टी7 फेज के केवल 1 x 10-3% टाइटर्स और मस्तिष्कमेरु द्रव में प्रारंभिक रूप से संक्रमित फेज के 4 x 10-8% का पता लगाया गया था।विशेष रूप से, मस्तिष्कमेरु द्रव में जंगली-प्रकार के फ़ेज़ का आधा जीवन (25.7 मिनट) रक्त में देखे गए के समान था।इन आंकड़ों से पता चलता है कि सीएसएफ डिब्बे को रक्त से अलग करने वाली बाधा सीएम-कैन्युलेटेड चूहों में बरकरार है, जिससे फेज पुस्तकालयों के विवो चयन में उन क्लोनों की पहचान करने की अनुमति मिलती है जो रक्त से सीएसएफ डिब्बे में आसानी से पहुंचाए जाते हैं।
(ए) एक बड़े पूल से मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) के पुन: नमूने के लिए एक विधि स्थापित करना।(बी) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) बाधा के सेलुलर स्थान और रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) और रक्त-मस्तिष्क बाधा को पार करने वाले पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए उपयोग की जाने वाली चयन रणनीति को दर्शाने वाला आरेख।(सी) विवो फेज डिस्प्ले स्क्रीनिंग फ़्लोचार्ट में।चयन के प्रत्येक दौर में, फ़ेज (तीरों के अंदर पशु पहचानकर्ता) को अंतःशिरा में इंजेक्ट किया गया था।चयन के चौथे दौर तक दो स्वतंत्र वैकल्पिक शाखाएँ (ए, बी) अलग-अलग रखी जाती हैं।चयन राउंड 3 और 4 के लिए, सीएसएफ से निकाले गए प्रत्येक फेज क्लोन को मैन्युअल रूप से अनुक्रमित किया गया था।(डी) टी7 पेप्टाइड लाइब्रेरी (2 x 1012 फेज/जानवर) के अंतःशिरा इंजेक्शन के बाद दो कैनुलेटेड चूहों में चयन के पहले दौर के दौरान रक्त (लाल घेरे) और मस्तिष्कमेरु द्रव (हरा त्रिकोण) से अलग किए गए फेज की गतिकी।नीले वर्ग रक्त में फ़ेज़ की औसत प्रारंभिक सांद्रता को दर्शाते हैं, जिसकी गणना कुल रक्त मात्रा को ध्यान में रखते हुए, इंजेक्ट किए गए फ़ेज़ की मात्रा से की जाती है।काले वर्ग रक्त फ़ेज़ सांद्रता से निकाली गई y रेखा के प्रतिच्छेदन बिंदु को दर्शाते हैं।(ई,एफ) पेप्टाइड में पाए जाने वाले सभी संभावित ओवरलैपिंग ट्रिपेप्टाइड रूपांकनों की सापेक्ष आवृत्ति और वितरण प्रस्तुत करें।1000 रीडिंग में पाए गए रूपांकनों की संख्या दर्शाई गई है।महत्वपूर्ण रूप से (पी <0.001) समृद्ध रूपांकनों को लाल बिंदुओं से चिह्नित किया गया है।(ई) जानवरों #1.1 और #1.2 से रक्त-व्युत्पन्न फ़ेज के साथ इंजेक्शन लाइब्रेरी के ट्रिपेप्टाइड मोटिफ की सापेक्ष आवृत्ति की तुलना करते हुए सहसंबंध स्कैटरप्लॉट।(एफ) रक्त और मस्तिष्कमेरु द्रव में पृथक पशु फेज ट्रिपेप्टाइड रूपांकनों #1.1 और #1.2 की सापेक्ष आवृत्तियों की तुलना करते हुए सहसंबंध स्कैटरप्लॉट।(जी, एच) दोनों जानवरों में विवो चयन के एक दौर के बाद रक्त (जी) बनाम इंजेक्शन पुस्तकालयों और सीएसएफ (एच) बनाम रक्त में समृद्ध फेज का अनुक्रम आईडी प्रतिनिधित्व।एक-अक्षर कोड का आकार इंगित करता है कि उस स्थान पर अमीनो एसिड कितनी बार होता है।हरा = ध्रुवीय, बैंगनी = तटस्थ, नीला = क्षारीय, लाल = अम्लीय और काला = हाइड्रोफोबिक अमीनो एसिड।चित्र 1ए, बी को एडुआर्ड उरीच द्वारा डिजाइन और निर्मित किया गया था।
हमने एक फेज पेप्टाइड लाइब्रेरी को दो सीएम उपकरण चूहों (क्लेड ए और बी) में इंजेक्ट किया और मस्तिष्कमेरु द्रव और रक्त से फेज को अलग किया (चित्रा 1 डी)।जंगली प्रकार के फ़ेज की तुलना में लाइब्रेरी की प्रारंभिक तीव्र निकासी कम स्पष्ट थी।दोनों जानवरों में इंजेक्शन लाइब्रेरी का औसत आधा जीवन रक्त में 24.8 मिनट, जंगली-प्रकार के फ़ेज़ के समान, और सीएसएफ में 38.5 मिनट था।प्रत्येक जानवर के रक्त और मस्तिष्कमेरु द्रव फेज के नमूनों को एचटीएस के अधीन किया गया और सभी पहचाने गए पेप्टाइड्स का लघु ट्रिपेप्टाइड मोटिफ की उपस्थिति के लिए विश्लेषण किया गया।ट्रिपेप्टाइड रूपांकनों को इसलिए चुना गया क्योंकि वे संरचना निर्माण और पेप्टाइड-प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए न्यूनतम आधार प्रदान करते हैं।हमने इंजेक्टेड फ़ेज़ लाइब्रेरी और दोनों जानवरों के रक्त से निकाले गए क्लोनों के बीच रूपांकनों के वितरण में एक अच्छा सहसंबंध पाया (चित्र 1e)।आंकड़ों से संकेत मिलता है कि पुस्तकालय की संरचना केवल रक्त डिब्बे में मामूली रूप से समृद्ध है।वेबलॉगो16 सॉफ़्टवेयर के अनुकूलन का उपयोग करके प्रत्येक स्थिति में अमीनो एसिड आवृत्तियों और सर्वसम्मति अनुक्रमों का आगे विश्लेषण किया गया।दिलचस्प बात यह है कि हमने रक्त ग्लाइसीन अवशेषों में एक मजबूत संवर्धन पाया (चित्र 1जी)।जब रक्त की तुलना सीएसएफ से चुने गए क्लोनों से की गई, तो मजबूत चयन और रूपांकनों के कुछ अचयन को देखा गया (छवि 1 एफ), और कुछ अमीनो एसिड 12-सदस्यीय (छवि 1 एच) में पूर्व निर्धारित स्थानों पर अधिमानतः मौजूद थे।विशेष रूप से, अलग-अलग जानवरों के मस्तिष्कमेरु द्रव में काफी अंतर था, जबकि दोनों जानवरों में रक्त ग्लाइसिन संवर्धन देखा गया था (पूरक चित्र 4 ए-जे)।जानवरों के मस्तिष्कमेरु द्रव #1.1 और #1.2 में अनुक्रम डेटा के कड़े फ़िल्टरिंग के बाद, कुल 964 और 420 अद्वितीय 12-मेर पेप्टाइड्स प्राप्त किए गए (पूरक चित्र 1डी-ई)।पृथक फ़ेज़ क्लोनों को प्रवर्धित किया गया और विवो चयन के दूसरे दौर के अधीन किया गया।चयन के दूसरे दौर से निकाले गए फेज को प्रत्येक जानवर में एचटीएस के अधीन किया गया था और सभी पहचाने गए पेप्टाइड्स को ट्रिपेप्टाइड मोटिफ्स (छवि 2 ए, बी, ईएफ) की घटना का विश्लेषण करने के लिए एक मोटिफ पहचान कार्यक्रम में इनपुट के रूप में उपयोग किया गया था।सीएसएफ से प्राप्त फेज के पहले चक्र की तुलना में, हमने शाखाओं ए और बी में सीएसएफ में कई रूपांकनों के आगे चयन और अचयन को देखा (चित्र 2)।यह निर्धारित करने के लिए एक नेटवर्क पहचान एल्गोरिदम लागू किया गया था कि क्या वे सुसंगत अनुक्रम के विभिन्न पैटर्न का प्रतिनिधित्व करते हैं।वैकल्पिक क्लैड ए (चित्र 2सी, डी) और क्लैड बी (चित्र 2जी, एच) में सीएसएफ द्वारा पुनर्प्राप्त 12-आयामी अनुक्रमों के बीच एक स्पष्ट समानता देखी गई।प्रत्येक शाखा में पूल किए गए विश्लेषण से 12-मेर पेप्टाइड्स (पूरक छवि 5 सी, डी) के लिए अलग-अलग चयन प्रोफाइल का पता चला और चयन के पहले दौर की तुलना में चयन के दूसरे दौर के बाद पूल किए गए क्लोनों के लिए समय के साथ सीएसएफ / रक्त अनुमापांक अनुपात में वृद्धि हुई (पूरक छवि 5 ई)।).
विवो कार्यात्मक फ़ेज़ डिस्प्ले चयन के लगातार दो दौरों द्वारा मस्तिष्कमेरु द्रव में रूपांकनों और पेप्टाइड्स का संवर्धन।
प्रत्येक जानवर (जानवर #1.1 और #1.2) के पहले दौर से बरामद किए गए सभी मस्तिष्कमेरु द्रव फेज को एकत्र किया गया, प्रवर्धित किया गया, एचटी-अनुक्रमित किया गया और एक साथ पुन: इंजेक्ट किया गया (2 x 1010 फेज/जानवर) 2 एसएम कैनुलेटेड चूहों (#1.1 → #)।2.1 और 2.2, 1.2 → 2.3 और 2.4)।(ए, बी, ई, एफ) पहले और दूसरे चयन दौर में सभी सीएसएफ-व्युत्पन्न चरणों के ट्रिपेप्टाइड रूपांकनों की सापेक्ष आवृत्ति की तुलना करने वाले सहसंबंध स्कैटरप्लॉट।दोनों ओरिएंटेशन में पेप्टाइड्स में पाए जाने वाले सभी संभावित ओवरलैपिंग ट्राइपेप्टाइड्स का प्रतिनिधित्व करने वाले रूपांकनों की सापेक्ष आवृत्ति और वितरण।1000 रीडिंग में पाए गए रूपांकनों की संख्या दर्शाई गई है।तुलनात्मक पुस्तकालयों में से किसी एक में महत्वपूर्ण रूप से (पी <0.001) चयनित या बाहर किए गए रूपांकनों को लाल बिंदुओं के साथ हाइलाइट किया गया है।(सी, डी, जी, एच) विवो चयन के राउंड 2 और 1 के आधार पर सभी सीएसएफ-समृद्ध 12 अमीनो एसिड लंबे अनुक्रमों का अनुक्रम लोगो प्रतिनिधित्व।एक-अक्षर कोड का आकार इंगित करता है कि उस स्थान पर अमीनो एसिड कितनी बार होता है।लोगो का प्रतिनिधित्व करने के लिए, दो चयन दौरों के बीच अलग-अलग जानवरों से निकाले गए सीएसएफ अनुक्रमों की आवृत्ति की तुलना की जाती है और दूसरे दौर में समृद्ध अनुक्रम दिखाए जाते हैं: (सी) #1.1-#2.1 (डी) #1.1-#2.2 (जी) #1.2-#2.3 और (एच) #1.2-#2.4।(सी, डी) जानवरों में किसी दिए गए स्थान पर सबसे समृद्ध अमीनो एसिड नहीं।2.1 और नं.जानवरों में 2.2 या (जी, एच) नहीं।2.3 और नहीं.2.4 रंग में दिखाए गए हैं।हरा = ध्रुवीय, बैंगनी = तटस्थ, नीला = क्षारीय, लाल = अम्लीय और काला = हाइड्रोफोबिक अमीनो एसिड।
चयन के तीसरे दौर के बाद, हमने दो जानवरों से अलग किए गए 332 सीएसएफ-पुनर्निर्मित फेज क्लोनों से 124 अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रम (# 3.1 और # 3.2) की पहचान की (पूरक छवि 6 ए)।अनुक्रम LGSVS (18.7%) में उच्चतम सापेक्ष अनुपात था, इसके बाद वाइल्ड-टाइप इंसर्ट PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), और SARGSWREIVSLS (2.2%) थे।अंतिम चौथे दौर में, हमने तीन अलग-अलग जानवरों से दो स्वतंत्र रूप से चयनित शाखाओं को एकत्रित किया (चित्र 1सी)।सीएसएफ से बरामद किए गए 925 अनुक्रमित फेज क्लोनों में से, चौथे दौर में हमें 64 अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रम (पूरक चित्र 6बी) मिले, जिनके बीच जंगली-प्रकार के फेज का सापेक्ष अनुपात गिरकर 0.8% हो गया।चौथे दौर में सबसे आम सीएसएफ क्लोन थे LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) और RLSSVDSDLSGC (3, 2%)।%)).एनएनके लाइब्रेरी डिज़ाइन के लिए पतित कोडन का उपयोग करते समय चयनित पेप्टाइड्स की लंबाई सीमा लाइब्रेरी प्राइमरों में न्यूक्लियोटाइड सम्मिलन/हटाने या समय से पहले रुकने वाले कोडन के कारण होती है।समयपूर्व स्टॉप कोडन छोटे पेप्टाइड्स उत्पन्न करते हैं और चुने जाते हैं क्योंकि उनमें अनुकूल एए मोटिफ होता है।सिंथेटिक पुस्तकालयों के प्राइमरों में सम्मिलन/हटाने से लंबे पेप्टाइड्स का परिणाम हो सकता है।यह डिज़ाइन किए गए स्टॉप कोडन को फ्रेम के बाहर रखता है और इसे तब तक पढ़ता है जब तक कि एक नया स्टॉप कोडन डाउनस्ट्रीम में दिखाई न दे।सामान्य तौर पर, हमने नमूना आउटपुट डेटा के साथ इनपुट डेटा की तुलना करके सभी चार चयन राउंड के लिए संवर्धन कारकों की गणना की।स्क्रीनिंग के पहले दौर के लिए, हमने गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि संदर्भ के रूप में वाइल्ड-टाइप फ़ेज़ टाइटर्स का उपयोग किया।दिलचस्प बात यह है कि पहले सीएसएफ चक्र में नकारात्मक फेज चयन बहुत मजबूत था, लेकिन रक्त में नहीं (छवि 3 ए), जो सीएसएफ डिब्बे में पेप्टाइड लाइब्रेरी के अधिकांश सदस्यों के निष्क्रिय प्रसार की कम संभावना के कारण हो सकता है या सापेक्ष फेज बैक्टीरियोफेज की तुलना में रक्तप्रवाह से अधिक कुशलता से बनाए रखा या हटाया जाता है।हालाँकि, पैनिंग के दूसरे दौर में, दोनों समूहों में सीएसएफ में फेज का मजबूत चयन देखा गया, जिससे पता चलता है कि पिछले दौर में सीएसएफ को बढ़ावा देने वाले पेप्टाइड्स प्रदर्शित करने वाले फेज में समृद्ध किया गया था (छवि 3 ए)।फिर, महत्वपूर्ण रक्त संवर्धन के बिना।इसके अलावा तीसरे और चौथे दौर में, फेज क्लोनों को सीएसएफ में काफी समृद्ध किया गया।चयन के पिछले दो दौरों के बीच प्रत्येक अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रम की सापेक्ष आवृत्ति की तुलना करने पर, हमने पाया कि चयन के चौथे दौर में अनुक्रम और भी अधिक समृद्ध थे (चित्र 3बी)।दोनों पेप्टाइड ओरिएंटेशन का उपयोग करके सभी 64 अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रमों से कुल 931 ट्रिपेप्टाइड रूपांकनों को निकाला गया।चौथे दौर में सबसे समृद्ध रूपांकनों की इंजेक्शन लाइब्रेरी (कट-ऑफ: 10% संवर्धन) (पूरक चित्र 6 सी) की तुलना में सभी दौरों में उनके संवर्धन प्रोफाइल के लिए अधिक बारीकी से जांच की गई।चयन के सामान्य पैटर्न से पता चला कि अध्ययन किए गए अधिकांश उद्देश्य दोनों चयन शाखाओं के पिछले सभी दौरों में समृद्ध हुए थे।हालाँकि, कुछ रूपांकनों (जैसे एसजीएल, वीएसजी, एलजीएस जीएसवी) मुख्य रूप से वैकल्पिक क्लैड ए से थे, जबकि अन्य (जैसे एफजीडब्ल्यू, आरटीएन, डब्लूजीएफ, एनटीआर) वैकल्पिक क्लैड बी में समृद्ध थे।
सीएसएफ-समृद्ध फेज-प्रदर्शित पेप्टाइड्स और स्ट्रेप्टाविडिन पेलोड से संयुग्मित बायोटिनाइलेटेड लीडर पेप्टाइड्स के सीएसएफ परिवहन का सत्यापन।
(ए) इंजेक्शन (इनपुट = I) फेज (पीएफयू) टाइटर्स और निर्धारित सीएसएफ फेज टाइटर्स (आउटपुट = ओ) के आधार पर सभी चार राउंड (आर1-आर4) में संवर्धन अनुपात की गणना की गई।पिछले तीन राउंड (आर2-आर4) के लिए संवर्धन कारकों की गणना वजन डेटा के साथ पिछले राउंड और पहले राउंड (आर1) की तुलना करके की गई थी।खुली पट्टियाँ मस्तिष्कमेरु द्रव हैं, छायांकित पट्टियाँ प्लाज्मा हैं।(***p<0.001, छात्र के टी-टेस्ट पर आधारित)।(बी) सबसे प्रचुर फेज पेप्टाइड्स की सूची, चयन के राउंड 4 के बाद सीएसएफ में एकत्र किए गए सभी फेजों के उनके सापेक्ष अनुपात के अनुसार क्रमबद्ध।छह सबसे आम फ़ेज़ क्लोनों को चयन के राउंड 3 और 4 (इनसेट्स) के बीच रंग, क्रमांकित और उनके संवर्धन कारकों में हाइलाइट किया गया है।(सी,डी) राउंड 4 से छह सबसे समृद्ध फेज क्लोन, खाली फेज और पैरेंटल फेज पेप्टाइड लाइब्रेरी का सीएसएफ नमूना मॉडल में व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण किया गया था।संकेतित समय बिंदुओं पर सीएसएफ और रक्त के नमूने एकत्र किए गए।(सी) 6 उम्मीदवार फेज क्लोन (2 x 1010 फेज/जानवर), खाली फेज (#1779) (2 x 1010 फेज/जानवर) और स्टॉक फेज पेप्टाइड लाइब्रेरी (2 x 1012 फेज/जानवर) की समान मात्रा में कम से कम 3 सेमी का इंजेक्शन कैनुलेटेड जानवर को पूंछ की नस के माध्यम से अलग से दिया जाता है।समय के साथ प्रत्येक इंजेक्ट किए गए फेज क्लोन और फेज पेप्टाइड लाइब्रेरी के सीएसएफ फार्माकोकाइनेटिक्स को दिखाया गया है।(डी) नमूना समय के दौरान सभी बरामद फेज/एमएल के लिए औसत सीएसएफ/रक्त अनुपात दिखाता है।(ई) चार सिंथेटिक लीडर पेप्टाइड्स और एक स्क्रैम्बल कंट्रोल को बायोटिन के साथ उनके एन-टर्मिनस (टेट्रामर डिस्प्ले) के माध्यम से स्ट्रेप्टाविडिन से जोड़ा गया था, जिसके बाद इंजेक्शन (टेल वेन IV, 10 मिलीग्राम स्ट्रेप्टाविडिन / किग्रा) किया गया था।कम से कम तीन इंटुबैटेड चूहे (एन = 3)।).सीएसएफ नमूने संकेतित समय बिंदुओं पर एकत्र किए गए थे और स्ट्रेप्टाविडिन सांद्रता को सीएसएफ एंटी-स्ट्रेप्टाविडिन एलिसा (एनडी = पता नहीं चला) द्वारा मापा गया था।(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, एनोवा परीक्षण पर आधारित)।(एफ) चयन के चौथे दौर से अन्य चयनित फेज पेप्टाइड क्लोन के साथ सबसे समृद्ध फेज पेप्टाइड क्लोन #2002 (बैंगनी) के अमीनो एसिड अनुक्रम की तुलना।समान और समान अमीनो एसिड टुकड़े रंग-कोडित होते हैं।
चौथे दौर (छवि 3 बी) में सभी समृद्ध चरणों में से, सीएसएफ नमूना मॉडल में आगे के व्यक्तिगत विश्लेषण के लिए छह उम्मीदवार क्लोनों का चयन किया गया था।छह उम्मीदवार फेज, खाली फेज (कोई सम्मिलित नहीं) और प्रोफेज पेप्टाइड पुस्तकालयों की समान मात्रा को तीन कैनुलेटेड सीएम जानवरों में इंजेक्ट किया गया था, और फार्माकोकाइनेटिक्स सीएसएफ (छवि 3 सी) और रक्त (पूरक छवि 7) परख में निर्धारित किए गए थे।परीक्षण किए गए सभी फ़ेज़ क्लोनों ने सीएसएफ डिब्बे को खाली नियंत्रण फ़ेज़ (#1779) की तुलना में 10-1000 गुना अधिक स्तर पर लक्षित किया।उदाहरण के लिए, क्लोन #2020 और #2077 में नियंत्रण फ़ेज़ की तुलना में लगभग 1000 गुना अधिक सीएसएफ टाइटर्स थे।प्रत्येक चयनित पेप्टाइड का फार्माकोकाइनेटिक प्रोफ़ाइल अलग है, लेकिन उन सभी में उच्च सीएसएफ होमिंग क्षमता है।हमने क्लोन #1903 और #2011 के लिए समय के साथ लगातार कमी देखी, जबकि क्लोन #2077, #2002 और #2009 के लिए पहले 10 मिनट के दौरान वृद्धि सक्रिय परिवहन का संकेत दे सकती है लेकिन इसे सत्यापित करने की आवश्यकता है।क्लोन #2020, #2002, और #2077 उच्च स्तर पर स्थिर हो गए, जबकि क्लोन #2009 की सीएसएफ सांद्रता प्रारंभिक वृद्धि के बाद धीरे-धीरे कम हो गई।फिर हमने प्रत्येक सीएसएफ उम्मीदवार की सापेक्ष आवृत्ति की तुलना उसके रक्त सांद्रता (चित्र 3डी) से की।सभी नमूना समयों पर प्रत्येक सीएसएफ उम्मीदवार के रक्त अनुमापांक के साथ उसके औसत अनुमापांक के सहसंबंध से पता चला कि छह में से तीन उम्मीदवारों के रक्त सीएसएफ में काफी वृद्धि हुई थी।दिलचस्प बात यह है कि क्लोन #2077 ने उच्च रक्त स्थिरता दिखाई (पूरक चित्र 7)।यह पुष्टि करने के लिए कि पेप्टाइड्स स्वयं सीएसएफ डिब्बे में फेज कणों के अलावा अन्य कार्गो को सक्रिय रूप से परिवहन करने में सक्षम हैं, हमने एन-टर्मिनस पर बायोटिन के साथ व्युत्पन्न चार लीडर पेप्टाइड्स को संश्लेषित किया, जहां पेप्टाइड्स फेज कण से जुड़ते हैं।बायोटिनाइलेटेड पेप्टाइड्स (नंबर 2002, 2009, 2020 और 2077) को स्ट्रेप्टाविडिन (एसए) के साथ संयुग्मित किया गया ताकि कुछ हद तक फेज ज्यामिति की नकल करते हुए मल्टीमेरिक फॉर्म प्राप्त किया जा सके।इस प्रारूप ने हमें कार्गो-परिवहन प्रोटीन पेप्टाइड्स के रूप में रक्त और मस्तिष्कमेरु द्रव में एसए एक्सपोज़र को मापने की भी अनुमति दी।महत्वपूर्ण रूप से, फ़ेज़ डेटा को अक्सर पुन: प्रस्तुत किया जा सकता है जब सिंथेटिक पेप्टाइड्स को इस एसए-संयुग्मित प्रारूप (छवि 3e) में प्रशासित किया गया था।तले हुए पेप्टाइड्स का प्रारंभिक एक्सपोज़र कम था और 48 घंटों के भीतर ज्ञानी स्तर के साथ सीएसएफ क्लीयरेंस तेज़ था।सीएसएफ अंतरिक्ष में इन पेप्टाइड फेज क्लोनों के वितरण मार्गों के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए, हमने विवो में अंतःशिरा इंजेक्शन के 1 घंटे बाद सीधे फेज कणों का पता लगाने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) का उपयोग करके व्यक्तिगत फेज पेप्टाइड हिट के स्थानीयकरण का विश्लेषण किया।विशेष रूप से, क्लोन #2002, #2077, और #2009 का पता मस्तिष्क केशिकाओं में मजबूत धुंधलापन द्वारा लगाया जा सकता है, जबकि नियंत्रण फ़ेज़ (#1779) और क्लोन #2020 का पता नहीं लगाया गया (पूरक चित्र 8)।इससे पता चलता है कि ये पेप्टाइड्स बीबीबी को पार करके मस्तिष्क पर प्रभाव में योगदान करते हैं।इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए और विस्तृत विश्लेषण की आवश्यकता है, क्योंकि बीएससीएफबी मार्ग भी शामिल हो सकता है।अन्य चयनित पेप्टाइड्स के साथ सबसे समृद्ध क्लोन (#2002) के अमीनो एसिड अनुक्रम की तुलना करते समय, यह नोट किया गया कि उनमें से कुछ में समान अमीनो एसिड एक्सटेंशन हैं, जो एक समान परिवहन तंत्र (छवि 3 एफ) का संकेत दे सकते हैं।
अपनी अनूठी प्लाज्मा प्रोफ़ाइल और समय के साथ सीएसएफ में उल्लेखनीय वृद्धि के कारण, फेज डिस्प्ले क्लोन #2077 को 48 घंटे की लंबी अवधि में आगे खोजा गया और निरंतर एसए स्तरों (छवि 4 ए) के साथ सीएसएफ में देखी गई तेजी से वृद्धि को पुन: उत्पन्न करने में सक्षम था।अन्य पहचाने गए फ़ेज़ क्लोनों के संबंध में, #2077 ने मस्तिष्क केशिकाओं के लिए दृढ़ता से दाग लगाया और उच्च रिज़ॉल्यूशन पर देखे जाने पर केशिका मार्कर लेक्टिन के साथ महत्वपूर्ण कोलोकलाइज़ेशन दिखाया और संभवतः पैरेन्काइमल स्थान में कुछ धुंधला हो गया (चित्र 4 बी)।यह जांचने के लिए कि क्या सीएनएस में पेप्टाइड-मध्यस्थता वाले औषधीय प्रभाव प्राप्त किए जा सकते हैं, हमने एक प्रयोग किया जिसमें i) #2077 ट्रांजिट पेप्टाइड और ii) BACE1 अवरोधक पेप्टाइड के बायोटिनाइलेटेड संस्करण दो अलग-अलग अनुपात में SA के साथ मिश्रित किए गए थे।एक संयोजन के लिए हमने केवल BACE1 पेप्टाइड अवरोधक का उपयोग किया और दूसरे के लिए हमने BACE1 पेप्टाइड अवरोधक और #2077 पेप्टाइड के 1:3 अनुपात का उपयोग किया।दोनों नमूनों को अंतःशिरा रूप से प्रशासित किया गया और समय के साथ बीटा-एमिलॉयड पेप्टाइड 40 (एबेटा40) के रक्त और मस्तिष्कमेरु द्रव स्तर को मापा गया।Abeta40 को CSF में मापा गया क्योंकि यह मस्तिष्क पैरेन्काइमा में BACE1 निषेध को दर्शाता है।जैसा कि अपेक्षित था, दोनों कॉम्प्लेक्स ने एबेटा40 के रक्त स्तर को काफी कम कर दिया (चित्र 4सी, डी)।हालाँकि, केवल पेप्टाइड संख्या के मिश्रण वाले नमूने।2077 और एसए से संयुग्मित बीएसीई1 पेप्टाइड के एक अवरोधक के कारण मस्तिष्कमेरु द्रव में एबेटा40 में उल्लेखनीय कमी आई (चित्र 4सी)।डेटा से पता चलता है कि पेप्टाइड नं.2077 60 केडीए एसए प्रोटीन को सीएनएस में ले जाने में सक्षम है और बीएसीई1 पेप्टाइड के एसए-संयुग्मित अवरोधकों के साथ औषधीय प्रभाव भी उत्पन्न करता है।
(ए) टी7 फेज का क्लोनल इंजेक्शन (2 × 10 फेज/पशु) सीएसएफ पेप्टाइड #2077 (आरएलएसएसवीडीएसडीएलएसजीसी) के दीर्घकालिक फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइल और कम से कम तीन सीएम-इंटुबेटेड चूहों में अनइंजेक्टेड कंट्रोल फेज (#1779) दिखाता है।(बी) फेज-इंजेक्टेड चूहों (2 × 10 10 फेज/जानवर) में प्रतिनिधि कॉर्टिकल माइक्रोवेसल्स की कन्फोकल सूक्ष्म छवि, पेप्टाइड #2077 और वाहिकाओं (लेक्टिन) के प्रतिस्पर्धीकरण को दर्शाती है।इन फ़ेज़ क्लोनों को 3 चूहों को दिया गया और छिड़काव से पहले 1 घंटे तक प्रसारित करने की अनुमति दी गई।दिमागों को विभाजित किया गया और टी7 फेज कैप्सिड के खिलाफ पॉलीक्लोनल एफआईटीसी-लेबल एंटीबॉडी से दाग दिया गया।छिड़काव और उसके बाद निर्धारण से दस मिनट पहले, DyLight594-लेबल लेक्टिन को अंतःशिरा में प्रशासित किया गया था।फ्लोरोसेंट छवियां केशिकाओं और पेरिवास्कुलर मस्तिष्क ऊतक के लुमेन में माइक्रोवेसल्स और फेज (हरा) के ल्यूमिनल पक्ष के लेक्टिन धुंधला (लाल) दिखा रही हैं।स्केल बार 10 µm से मेल खाता है।(सी, डी) बायोटिनाइलेटेड बीएसीई1 निरोधात्मक पेप्टाइड अकेले या बायोटिनाइलेटेड ट्रांजिट पेप्टाइड #2077 के संयोजन में स्ट्रेप्टाविडिन के साथ जोड़ा गया था, जिसके बाद कम से कम तीन कैनुलेटेड सीएम चूहों (10 मिलीग्राम स्ट्रेप्टाविडिन/किग्रा) का अंतःशिरा इंजेक्शन लगाया गया था।Aβ40 में BACE1 पेप्टाइड अवरोधक-मध्यस्थता कमी को संकेतित समय बिंदुओं पर रक्त (लाल) और मस्तिष्कमेरु द्रव (नारंगी) में Aβ1-40 एलिसा द्वारा मापा गया था।बेहतर स्पष्टता के लिए, ग्राफ़ पर 100% के पैमाने पर एक बिंदीदार रेखा खींची जाती है।(सी) 3:1 के अनुपात में ट्रांजिट पेप्टाइड #2077 और बीएसीई1 निरोधात्मक पेप्टाइड से संयुग्मित स्ट्रेप्टाविडिन से उपचारित चूहों में रक्त (लाल त्रिकोण) और मस्तिष्कमेरु द्रव (नारंगी त्रिकोण) में एβ40 में प्रतिशत कमी।(डी) केवल बीएसीई1 निरोधात्मक पेप्टाइड के साथ स्ट्रेप्टाविडिन से उपचारित चूहों के रक्त एβ40 (लाल घेरे) और मस्तिष्कमेरु द्रव (नारंगी घेरे) में प्रतिशत में कमी।नियंत्रण में Aβ सांद्रता 420 pg/ml (मानक विचलन = 101 pg/ml) थी।
बायोमेडिकल अनुसंधान17 के कई क्षेत्रों में फ़ेज़ डिस्प्ले को सफलतापूर्वक लागू किया गया है।इस पद्धति का उपयोग विवो संवहनी विविधता अध्ययन18,19 के साथ-साथ मस्तिष्क वाहिकाओं20,21,22,23,24,25,26 को लक्षित करने वाले अध्ययनों के लिए किया गया है।इस अध्ययन में, हमने इस चयन पद्धति के अनुप्रयोग को न केवल मस्तिष्क वाहिकाओं को लक्षित करने वाले पेप्टाइड्स की प्रत्यक्ष पहचान तक बढ़ाया, बल्कि रक्त-मस्तिष्क बाधा को पार करने के लिए सक्रिय परिवहन गुणों वाले उम्मीदवारों की खोज तक भी बढ़ाया।अब हम सीएम इंटुबैटेड चूहों में इन विवो चयन प्रक्रिया के विकास का वर्णन करते हैं और सीएसएफ होमिंग गुणों के साथ पेप्टाइड्स की पहचान करने की इसकी क्षमता का प्रदर्शन करते हैं।12-मेर यादृच्छिक पेप्टाइड्स की लाइब्रेरी प्रदर्शित करने वाले टी7 फ़ेज़ का उपयोग करके, हम यह प्रदर्शित करने में सक्षम थे कि टी7 फ़ेज़ रक्त-मस्तिष्क बाधा के अनुकूल होने के लिए काफी छोटा (लगभग 60 एनएम व्यास)10 है, जिससे सीधे रक्त-मस्तिष्क बाधा या कोरॉइड प्लेक्सस को पार किया जा सकता है।हमने देखा कि कैनुलेटेड सीएम चूहों से सीएसएफ कटाई विवो कार्यात्मक स्क्रीनिंग विधि में एक अच्छी तरह से नियंत्रित थी, और निकाला गया फेज न केवल वास्कुलचर से जुड़ा था बल्कि रक्त-मस्तिष्क बाधा के पार एक ट्रांसपोर्टर के रूप में भी कार्य करता था।इसके अलावा, एक साथ रक्त एकत्र करके और सीएसएफ और रक्त-व्युत्पन्न फेज पर एचटीएस लागू करके, हमने पुष्टि की कि सीएसएफ की हमारी पसंद चयन के दौर के बीच विस्तार के लिए रक्त संवर्धन या फिटनेस से प्रभावित नहीं थी।हालाँकि, रक्त कंपार्टमेंट चयन प्रक्रिया का हिस्सा है, क्योंकि सीएसएफ कंपार्टमेंट तक पहुंचने में सक्षम फेज को मस्तिष्क में खुद को समृद्ध करने के लिए लंबे समय तक रक्तप्रवाह में जीवित रहना और प्रसारित होना चाहिए।कच्चे एचटीएस डेटा से विश्वसनीय अनुक्रम जानकारी निकालने के लिए, हमने विश्लेषण वर्कफ़्लो में प्लेटफ़ॉर्म-विशिष्ट अनुक्रमण त्रुटियों के लिए अनुकूलित फ़िल्टर लागू किए।स्क्रीनिंग विधि में गतिज मापदंडों को शामिल करके, हमने रक्त 24, 27, 28 में जंगली-प्रकार के टी7 फेज (टी½ ~ 28 मिनट) के तेजी से फार्माकोकाइनेटिक्स की पुष्टि की और मस्तिष्कमेरु द्रव (टी½ ~ 26 मिनट) प्रति मिनट में उनका आधा जीवन भी निर्धारित किया।रक्त और सीएसएफ में समान फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइल के बावजूद, सीएसएफ में फेज की रक्त सांद्रता का केवल 0.001% ही पाया जा सका, जो रक्त-मस्तिष्क बाधा में जंगली-प्रकार टी 7 फेज की कम पृष्ठभूमि गतिशीलता का संकेत देता है।यह कार्य विवो पैनिंग रणनीतियों का उपयोग करते समय चयन के पहले दौर के महत्व पर प्रकाश डालता है, विशेष रूप से फेज सिस्टम के लिए जो परिसंचरण से तेजी से साफ़ हो जाते हैं, क्योंकि कुछ क्लोन सीएनएस डिब्बे तक पहुंचने में सक्षम होते हैं।इस प्रकार, पहले दौर में, पुस्तकालय विविधता में कमी बहुत बड़ी थी, क्योंकि अंततः इस सख्त सीएसएफ मॉडल में केवल सीमित संख्या में क्लोन एकत्र किए गए थे।विवो पैनिंग रणनीति में कई चयन चरण शामिल थे जैसे सीएसएफ डिब्बे में सक्रिय संचय, रक्त डिब्बे में क्लोन अस्तित्व, और पहले 10 मिनट के भीतर रक्त से टी 7 फेज क्लोन को तेजी से हटाना (छवि 1 डी और अनुपूरक छवि 4 एम)।).इस प्रकार, पहले दौर के बाद, सीएसएफ में विभिन्न फेज क्लोनों की पहचान की गई, हालांकि अलग-अलग जानवरों के लिए एक ही प्रारंभिक पूल का उपयोग किया गया था।इससे पता चलता है कि बड़ी संख्या में पुस्तकालय सदस्यों वाले स्रोत पुस्तकालयों के लिए कई सख्त चयन चरणों के परिणामस्वरूप विविधता में महत्वपूर्ण कमी आती है।इसलिए, यादृच्छिक घटनाएं प्रारंभिक चयन प्रक्रिया का एक अभिन्न अंग बन जाएंगी, जो परिणाम को बहुत प्रभावित करेंगी।यह संभावना है कि मूल पुस्तकालय के कई क्लोनों में सीएसएफ संवर्धन प्रवृत्ति बहुत समान थी।हालाँकि, समान प्रायोगिक स्थितियों के तहत भी, प्रारंभिक पूल में प्रत्येक विशेष क्लोन की छोटी संख्या के कारण चयन परिणाम भिन्न हो सकते हैं।
सीएसएफ में समृद्ध रूपांकन रक्त में मौजूद रूपांकनों से भिन्न होते हैं।दिलचस्प बात यह है कि हमने अलग-अलग जानवरों के रक्त में ग्लाइसीन-समृद्ध पेप्टाइड्स की ओर पहला बदलाव देखा।(चित्र 1जी, अनुपूरक चित्र 4ई, 4एफ)।ग्लाइसिन पेप्टाइड्स युक्त फ़ेज़ अधिक स्थिर हो सकता है और परिसंचरण से बाहर होने की संभावना कम हो सकती है।हालाँकि, इन ग्लाइसीन-समृद्ध पेप्टाइड्स को मस्तिष्कमेरु द्रव के नमूनों में नहीं पाया गया, जिससे पता चलता है कि क्यूरेटेड लाइब्रेरी दो अलग-अलग चयन चरणों से गुज़री: एक रक्त में और दूसरे को मस्तिष्कमेरु द्रव में जमा होने की अनुमति दी गई।चयन के चौथे दौर से प्राप्त सीएसएफ-समृद्ध क्लोनों का बड़े पैमाने पर परीक्षण किया गया है।व्यक्तिगत रूप से परीक्षण किए गए लगभग सभी क्लोनों में रिक्त नियंत्रण फ़ेज़ की तुलना में सीएसएफ में समृद्ध होने की पुष्टि की गई थी।एक पेप्टाइड हिट (#2077) की अधिक विस्तार से जांच की गई।इसने अन्य हिट्स (चित्रा 3 डी और पूरक चित्रा 7) की तुलना में लंबा प्लाज्मा आधा जीवन दिखाया, और दिलचस्प बात यह है कि इस पेप्टाइड में सी-टर्मिनस पर एक सिस्टीन अवशेष था।हाल ही में यह दिखाया गया है कि पेप्टाइड्स में सिस्टीन को शामिल करने से एल्ब्यूमिन 29 से जुड़कर उनके फार्माकोकाइनेटिक गुणों में सुधार हो सकता है।यह वर्तमान में पेप्टाइड #2077 के लिए अज्ञात है और इसके लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है।कुछ पेप्टाइड्स ने सीएसएफ संवर्धन (डेटा नहीं दिखाया गया) में वैलेंस-निर्भरता दिखाई, जो टी7 कैप्सिड की प्रदर्शित सतह ज्यामिति से संबंधित हो सकती है।हमने जिस T7 प्रणाली का उपयोग किया, उसने प्रति फेज कण में प्रत्येक पेप्टाइड की 5-15 प्रतियां दिखाईं।आईएचसी को चूहों के सेरेब्रल कॉर्टेक्स में अंतःशिरा में इंजेक्ट किए गए कैंडिडेट लीड फेज क्लोन पर किया गया था (पूरक चित्र 8)।डेटा से पता चला कि कम से कम तीन क्लोन (नंबर 2002, नंबर 2009 और नंबर 2077) ने बीबीबी के साथ बातचीत की।यह निर्धारित किया जाना बाकी है कि क्या इस बीबीबी इंटरैक्शन के परिणामस्वरूप सीएसएफ का संचय होता है या इन क्लोनों का सीधे बीसीएसएफबी में स्थानांतरण होता है।महत्वपूर्ण रूप से, हम दिखाते हैं कि चयनित पेप्टाइड्स संश्लेषित होने और प्रोटीन कार्गो से बंधे होने पर अपनी सीएसएफ परिवहन क्षमता बनाए रखते हैं।एन-टर्मिनल बायोटिनाइलेटेड पेप्टाइड्स को एसए से बांधना अनिवार्य रूप से रक्त और मस्तिष्कमेरु द्रव में उनके संबंधित फेज क्लोन के साथ प्राप्त परिणामों को दोहराता है (चित्र 3ई)।अंत में, हम दिखाते हैं कि लेड पेप्टाइड #2077 एसए से संयुग्मित बीएसीई1 के बायोटिनाइलेटेड पेप्टाइड अवरोधक की मस्तिष्क क्रिया को बढ़ावा देने में सक्षम है, जिससे सीएसएफ में एबेटा40 के स्तर को काफी कम करके सीएनएस में स्पष्ट फार्माकोडायनामिक प्रभाव पैदा होता है (चित्र 4)।हम सभी हिट्स की पेप्टाइड अनुक्रम होमोलॉजी खोज करके डेटाबेस में किसी भी होमोलॉग की पहचान करने में असमर्थ थे।यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि टी7 लाइब्रेरी का आकार लगभग 109 है, जबकि 12-मेर्स के लिए सैद्धांतिक लाइब्रेरी का आकार 4 x 1015 है। इसलिए, हमने 12-मेर पेप्टाइड लाइब्रेरी के विविधता स्थान का केवल एक छोटा सा अंश चुना है, जिसका मतलब यह हो सकता है कि इन पहचाने गए हिट्स के आसन्न अनुक्रम स्थान का मूल्यांकन करके अधिक अनुकूलित पेप्टाइड्स की पहचान की जा सकती है।काल्पनिक रूप से, जिन कारणों से हमें इन पेप्टाइड्स का कोई प्राकृतिक समरूप नहीं मिला है, उनमें से एक मस्तिष्क में कुछ पेप्टाइड रूपांकनों के अनियंत्रित प्रवेश को रोकने के लिए विकास के दौरान अचयन हो सकता है।
कुल मिलाकर, हमारे परिणाम विवो में सेरेब्रोवास्कुलर बाधा के परिवहन प्रणालियों को अधिक विस्तार से पहचानने और चिह्नित करने के लिए भविष्य के काम के लिए एक आधार प्रदान करते हैं।इस पद्धति का मूल सेटअप एक कार्यात्मक चयन रणनीति पर आधारित है जो न केवल सेरेब्रल वैस्कुलर बाइंडिंग गुणों वाले क्लोनों की पहचान करता है, बल्कि इसमें एक महत्वपूर्ण चरण भी शामिल है जिसमें सफल क्लोनों में सीएनएस डिब्बे में विवो में जैविक बाधाओं को पार करने की आंतरिक गतिविधि होती है।इन पेप्टाइड्स के परिवहन के तंत्र और मस्तिष्क क्षेत्र के लिए विशिष्ट माइक्रोवैस्कुलचर से जुड़ने के लिए उनकी प्राथमिकता को स्पष्ट करना है।इससे बीबीबी और रिसेप्टर्स के परिवहन के लिए नए मार्गों की खोज हो सकती है।हम उम्मीद करते हैं कि पहचाने गए पेप्टाइड्स सीधे सेरेब्रोवास्कुलर रिसेप्टर्स या बीबीबी या बीसीएसएफबी के माध्यम से परिवहन किए गए परिसंचारी लिगैंड से जुड़ सकते हैं।इस कार्य में खोजे गए सीएसएफ परिवहन गतिविधि वाले पेप्टाइड वैक्टर की आगे जांच की जाएगी।हम वर्तमान में बीबीबी और/या बीसीएसएफबी को पार करने की उनकी क्षमता के लिए इन पेप्टाइड्स की मस्तिष्क विशिष्टता की जांच कर रहे हैं।ये नए पेप्टाइड्स नए रिसेप्टर्स या मार्गों की संभावित खोज और मस्तिष्क तक बायोलॉजिक्स जैसे मैक्रोमोलेक्यूल्स की डिलीवरी के लिए नए अत्यधिक कुशल प्लेटफार्मों के विकास के लिए बेहद मूल्यवान उपकरण होंगे।
पहले वर्णित विधि के संशोधन का उपयोग करके बड़े सिस्टर्न (सीएम) को कैन्युलेट करें।एनेस्थेटाइज्ड विस्टार चूहों (200-350 ग्राम) को एक स्टीरियोटैक्सिक उपकरण पर रखा गया था और खोपड़ी को उजागर करने के लिए मुंडा और सड़न रोकनेवाला रूप से तैयार खोपड़ी पर एक मध्य चीरा लगाया गया था।ऊपरी सैश के क्षेत्र में दो छेद ड्रिल करें और छेद में फिक्सिंग स्क्रू को जकड़ें।सीएम में स्टेनलेस स्टील प्रवेशनी के स्टीरियोटैक्टिक मार्गदर्शन के लिए पार्श्व पश्चकपाल शिखा में एक अतिरिक्त छेद ड्रिल किया गया था।प्रवेशनी के चारों ओर डेंटल सीमेंट लगाएं और स्क्रू से सुरक्षित करें।फोटो-क्योरिंग और सीमेंट सख्त करने के बाद, त्वचा के घाव को 4/0 सुपरमिड सिवनी से बंद कर दिया गया।प्रवेशनी के उचित स्थान की पुष्टि मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) के सहज रिसाव से होती है।चूहे को स्टीरियोटैक्सिक उपकरण से हटा दें, उचित पोस्टऑपरेटिव देखभाल और दर्द प्रबंधन प्राप्त करें, और इसे कम से कम एक सप्ताह तक ठीक होने दें जब तक कि मस्तिष्कमेरु द्रव में रक्त के लक्षण दिखाई न दें।विस्टार चूहे (Crl:WI/Han) चार्ल्स नदी (फ्रांस) से प्राप्त किए गए थे।सभी चूहों को विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त परिस्थितियों में रखा गया था।सभी पशु प्रयोगों को स्विट्जरलैंड के बेसल शहर के पशु चिकित्सा कार्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था, और पशु लाइसेंस संख्या 2474 (मस्तिष्कमेरु द्रव और चूहे के मस्तिष्क में चिकित्सीय उम्मीदवारों के स्तर को मापकर सक्रिय मस्तिष्क परिवहन का आकलन) के अनुसार किया गया था।
हाथ में सीएम कैनुला लेकर चूहे को धीरे से सचेत रखें।प्रवेशनी से धतूरा निकालें और स्वचालित रूप से बहने वाले मस्तिष्कमेरु द्रव के 10 μl एकत्र करें।चूँकि अंततः प्रवेशनी की सहनशीलता से समझौता किया गया था, इस अध्ययन में रक्त संदूषण या मलिनकिरण का कोई सबूत नहीं होने के साथ केवल स्पष्ट मस्तिष्कमेरु द्रव के नमूने शामिल किए गए थे।समानांतर में, लगभग 10-20 μl रक्त को पूंछ की नोक पर एक छोटे चीरे से हेपरिन (सिग्मा-एल्ड्रिच) के साथ ट्यूबों में लिया गया था।टी7 फ़ेज़ के अंतःशिरा इंजेक्शन के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर सीएसएफ और रक्त एकत्र किया गया।प्रत्येक सीएसएफ नमूना एकत्र करने से पहले लगभग 5-10 μl तरल पदार्थ निकाल दिया गया था, जो कैथेटर की मृत मात्रा से मेल खाता है।
T7Select सिस्टम मैनुअल में वर्णित T7Select 10-3b वेक्टर का उपयोग करके पुस्तकालय तैयार किए गए थे (Novagen, Rosberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996)।संक्षेप में, एक यादृच्छिक 12-मेर डीएनए सम्मिलन को निम्नलिखित प्रारूप में संश्लेषित किया गया था:
एनएनके कोडन का उपयोग इंसर्ट में डबल स्टॉप कोडन और अमीनो एसिड ओवरएक्प्रेशन से बचने के लिए किया गया था।एन प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड का मैन्युअल रूप से मिश्रित इक्वोमोलर अनुपात है, और के एडेनिन और साइटोसिन न्यूक्लियोटाइड का मैन्युअल रूप से मिश्रित इक्वोमोलर अनुपात है।एकल फंसे हुए क्षेत्रों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए क्लेनो बफर (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स) में डीएनटीपी (नोवाजेन) और क्लेनो एंजाइम (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स) के साथ आगे ऊष्मायन द्वारा डबल स्ट्रैंडेड डीएनए में परिवर्तित किया गया था।प्रतिक्रिया के बाद, डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए को EtOH वर्षा द्वारा पुनर्प्राप्त किया गया था।परिणामी डीएनए को प्रतिबंध एंजाइम इकोआरआई और हिंदIII (दोनों रोश से) के साथ पचाया गया था।क्लीव्ड और शुद्ध (क्यूआईएक्विक, क्यूजेन) इंसर्ट (टी4 लिगेज, न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स) को 10बी कैप्सिड जीन के अमीनो एसिड 348 के बाद प्री-क्लीव्ड टी7 वेक्टर में इन-फ्रेम में लिगेट किया गया था।इन विट्रो पैकेजिंग से पहले 18 घंटे के लिए लिगेशन प्रतिक्रियाओं को 16 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था।इन विट्रो में फेज पैकेजिंग T7Select 10-3b क्लोनिंग किट (नोवाजेन) के साथ दिए गए निर्देशों के अनुसार की गई थी और एस्चेरिचिया कोली (बीएलटी5615, नोवाजेन) का उपयोग करके पैकेजिंग समाधान को एक बार लिसीस में बढ़ाया गया था।लाइसेट्स को ग्लिसरॉल के स्टॉक समाधान के रूप में -80 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज, टाइट्रेट और जमे हुए किया गया था।
मालिकाना 454/रोश-एम्प्लिकॉन फ़्यूज़न प्राइमरों का उपयोग करके शोरबा या प्लेट में फ़ैज़ चर क्षेत्रों का प्रत्यक्ष पीसीआर प्रवर्धन।फॉरवर्ड फ़्यूज़न प्राइमर में वेरिएबल क्षेत्र (एनएनके) 12 (टेम्पलेट-विशिष्ट), जीएस एफएलएक्स टाइटेनियम एडाप्टर ए, और एक चार-बेस लाइब्रेरी कुंजी अनुक्रम (टीसीएजी) (पूरक चित्रा 1 ए) को फ़्लैंक करने वाले अनुक्रम शामिल हैं:
रिवर्स फ़्यूज़न प्राइमर में कैप्चर मोतियों से जुड़ा बायोटिन और इमल्शन पीसीआर के दौरान क्लोनल प्रवर्धन के लिए आवश्यक जीएस एफएलएक्स टाइटेनियम एडाप्टर बी भी शामिल है:
फिर एम्पलीकॉन्स को 454 जीएस-एफएलएक्स टाइटेनियम प्रोटोकॉल के अनुसार 454/रोश पायरोसेक्वेंसिंग के अधीन किया गया।मैनुअल सेंगर अनुक्रमण (एप्लाइड बायोसिस्टम्स हिताची 3730 एक्सएल डीएनए विश्लेषक) के लिए, टी7 फेज डीएनए को पीसीआर द्वारा प्रवर्धित किया गया और निम्नलिखित प्राइमर जोड़े के साथ अनुक्रमित किया गया:
रोश फास्ट स्टार्ट डीएनए पॉलीमरेज़ किट (निर्माता के निर्देशों के अनुसार) का उपयोग करके अलग-अलग प्लाक के इंसर्ट को पीसीआर प्रवर्धन के अधीन किया गया था।एक हॉट स्टार्ट (95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट) और 35 बूस्ट चक्र (95 डिग्री सेल्सियस पर 50 सेकंड, 50 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट और 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट) करें।
पुस्तकालयों से फेज, जंगली प्रकार के फेज, सीएसएफ और रक्त से बचाए गए फेज, या व्यक्तिगत क्लोन को एस्चेरिचिया कोली बीएल 5615 में टीबी शोरबा (सिग्मा एल्ड्रिच) में या 500 सेमी 2 डिश (थर्मो साइंटिफिक) में 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए बढ़ाया गया था।प्लेटों को ट्रिस-ईडीटीए बफर (फ्लूका एनालिटिकल) से धोकर या बाँझ पिपेट युक्तियों के साथ पट्टिकाओं को इकट्ठा करके प्लेटों से फेज निकाला गया।फेज को पॉलीथीन ग्लाइकॉल (पीईजी 8000) अवक्षेपण (पेमरेगा) के एक दौर के साथ संस्कृति सतह पर तैरनेवाला या निष्कर्षण बफर से अलग किया गया और ट्रिस-ईडीटीए बफर में फिर से निलंबित कर दिया गया।
प्रवर्धित फेज को अंतःशिरा (IV) इंजेक्शन (500 μl/पशु) से पहले एंडोटॉक्सिन रिमूवल बीड्स (मिल्टनी बायोटेक) का उपयोग करके एंडोटॉक्सिन हटाने के 2-3 राउंड के अधीन किया गया था।पहले दौर में, 2×1012 फ़ेज़ पेश किए गए थे;दूसरे में, 2×1010 फ़ेज़;तीसरे और चौथे चयन दौर में, प्रति पशु 2×109 फ़ेज।सीएसएफ में फेज सामग्री और संकेतित समय बिंदुओं पर एकत्र किए गए रक्त के नमूनों को निर्माता के निर्देशों (T7Select सिस्टम मैनुअल) के अनुसार प्लाक गिनती द्वारा निर्धारित किया गया था।फेज का चयन पूंछ की नस में शुद्ध पुस्तकालयों के अंतःशिरा इंजेक्शन द्वारा या पिछले चयन दौर से सीएसएफ से निकाले गए फेज के पुन: इंजेक्शन द्वारा किया गया था, और बाद की कटाई क्रमशः 10 मिनट, 30 मिनट, 60 मिनट, 90 मिनट, 120 मिनट, 180 मिनट और 240 मिनट में सीएसएफ और रक्त के नमूनों में की गई थी।इन विवो पैनिंग के कुल चार राउंड आयोजित किए गए, जिसमें चयन के पहले तीन राउंड के दौरान दो चयनित शाखाओं को अलग-अलग संग्रहीत किया गया और उनका विश्लेषण किया गया।चयन के पहले दो राउंड से सीएसएफ से निकाले गए सभी फेज इंसर्ट को 454/रोश पायरोसेक्वेंसिंग के अधीन किया गया था, जबकि चयन के अंतिम दो राउंड से सीएसएफ से निकाले गए सभी क्लोनों को मैन्युअल रूप से अनुक्रमित किया गया था।चयन के पहले दौर के सभी रक्त चरणों को भी 454/रोश पायरोसेक्वेंसिंग के अधीन किया गया था।फेज क्लोन के इंजेक्शन के लिए, चयनित फेज को ई. कोली (बीएल5615) में 500 सेमी2 प्लेटों पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए प्रवर्धित किया गया था।व्यक्तिगत रूप से चयनित और मैन्युअल रूप से अनुक्रमित क्लोनों को टीबी माध्यम में प्रचारित किया गया।फेज निष्कर्षण, शुद्धिकरण और एंडोटॉक्सिन को हटाने के बाद (जैसा कि ऊपर वर्णित है), 300 μl में 2×1010 फेज/जानवर को एक पूंछ नस में अंतःशिरा में इंजेक्ट किया गया था।
अनुक्रम डेटा का प्रीप्रोसेसिंग और गुणात्मक फ़िल्टरिंग।रॉ 454/रोश डेटा को विक्रेता सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके बाइनरी मानक स्ट्रीम मैप प्रारूप (एसएफएफ) से पियर्सन मानव पठनीय प्रारूप (फास्टा) में परिवर्तित किया गया था।जैसा कि नीचे बताया गया है, न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम की आगे की प्रक्रिया मालिकाना सी प्रोग्राम और स्क्रिप्ट (अप्रकाशित सॉफ़्टवेयर पैकेज) का उपयोग करके की गई थी।प्राथमिक डेटा के विश्लेषण में सख्त मल्टी-स्टेज फ़िल्टरिंग प्रक्रियाएँ शामिल हैं।उन रीड्स को फ़िल्टर करने के लिए जिनमें वैध 12mer सम्मिलित डीएनए अनुक्रम शामिल नहीं था, वैश्विक नीडलमैन-वुन्श परीक्षण का उपयोग करके रीड्स को क्रमिक रूप से स्टार्ट लेबल (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), स्टॉप लेबल (TAAGCTTGCGGCCGCGCACTCGAGTA) और बैकग्राउंड इंसर्ट (CCCTGCAGGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) के साथ संरेखित किया गया था।संरेखण प्रति संरेखण31 तक 2 विसंगतियों की अनुमति देता है।इसलिए, बिना स्टार्ट और स्टॉप टैग वाले रीड्स और बैकग्राउंड इंसर्ट वाले रीड्स, यानी, बेमेल की अनुमत संख्या से अधिक संरेखण, लाइब्रेरी से हटा दिए गए थे।शेष रीड्स के लिए, एन-मेर डीएनए अनुक्रम जो प्रारंभ चिह्न से शुरू होता है और स्टॉप मार्क से पहले समाप्त होता है, मूल रीड अनुक्रम से हटा दिया गया था और आगे संसाधित किया गया था (इसके बाद इसे "सम्मिलित करें" के रूप में संदर्भित किया गया था)।इंसर्ट के अनुवाद के बाद, प्राइमर के 5′ सिरे पर पहले स्टॉप कोडन के बाद का हिस्सा इंसर्ट से हटा दिया जाता है।इसके अलावा, प्राइमर के 3′ सिरे पर अधूरे कोडन की ओर ले जाने वाले न्यूक्लियोटाइड को भी हटा दिया गया।केवल पृष्ठभूमि अनुक्रमों वाले आवेषणों को बाहर करने के लिए, अमीनो एसिड पैटर्न "पीएजी" से शुरू होने वाले अनुवादित आवेषण भी हटा दिए गए थे।3 अमीनो एसिड से कम की पोस्ट-ट्रांसलेशनल लंबाई वाले पेप्टाइड्स को लाइब्रेरी से हटा दिया गया था।अंत में, इंसर्ट पूल में अतिरेक को हटा दें और प्रत्येक अद्वितीय इंसर्ट की आवृत्ति निर्धारित करें।इस विश्लेषण के परिणामों में न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों (आवेषण) और उनकी (पढ़ें) आवृत्तियों (पूरक आंकड़े 1 सी और 2) की एक सूची शामिल थी।
अनुक्रम समानता के आधार पर समूह एन-मेर डीएनए सम्मिलन: 454/रोश-विशिष्ट अनुक्रमण त्रुटियों (जैसे अनुक्रमण होमोपोलिमर एक्सटेंशन के साथ समस्याएं) को खत्म करने और कम महत्वपूर्ण अतिरेक को हटाने के लिए, पहले से फ़िल्टर किए गए एन-मेर डीएनए अनुक्रम सम्मिलन (आवेषण) को समानता के आधार पर क्रमबद्ध किया जाता है।निम्नानुसार परिभाषित पुनरावृत्त एल्गोरिदम का उपयोग करके सम्मिलन (2 गैर-मिलान आधारों तक की अनुमति है): सम्मिलन को पहले उनकी आवृत्ति (उच्चतम से निम्नतम) के आधार पर क्रमबद्ध किया जाता है, और यदि वे समान हैं, तो लंबाई के आधार पर उनके द्वितीयक क्रम द्वारा (सबसे लंबे से सबसे छोटे))।इस प्रकार, सबसे लगातार और सबसे लंबे सम्मिलन पहले "समूह" को परिभाषित करते हैं।समूह आवृत्ति को कुंजी आवृत्ति पर सेट किया गया है।फिर, क्रमबद्ध सूची में शेष प्रत्येक प्रविष्टि को जोड़ीदार नीडलमैन-वुन्श संरेखण द्वारा समूह में जोड़ने का प्रयास किया गया।यदि किसी संरेखण में बेमेल, सम्मिलन, या विलोपन की संख्या 2 की सीमा से अधिक नहीं है, तो समूह में एक सम्मिलन जोड़ा जाता है, और समग्र समूह आवृत्ति इस बात से बढ़ जाती है कि सम्मिलन कितनी बार जोड़ा गया था।किसी समूह में जोड़े गए इंसर्ट को प्रयुक्त के रूप में चिह्नित किया जाता है और आगे की प्रक्रिया से बाहर रखा जाता है।यदि सम्मिलन अनुक्रम को पहले से मौजूद समूह में नहीं जोड़ा जा सकता है, तो सम्मिलन अनुक्रम का उपयोग उचित सम्मिलन आवृत्ति के साथ एक नया समूह बनाने के लिए किया जाता है और उपयोग के रूप में चिह्नित किया जाता है।पुनरावृत्ति तब समाप्त होती है जब प्रत्येक सम्मिलन अनुक्रम का उपयोग या तो एक नया समूह बनाने के लिए किया जाता है या पहले से मौजूद समूह में शामिल किया जा सकता है।आख़िरकार, न्यूक्लियोटाइड से युक्त समूहीकृत आवेषण अंततः पेप्टाइड अनुक्रमों (पेप्टाइड लाइब्रेरीज़) में अनुवादित होते हैं।इस विश्लेषण का परिणाम सम्मिलन और उनकी संगत आवृत्तियों का एक सेट है जो लगातार पढ़ने की संख्या बनाता है (पूरक चित्र 2)।
मोटिफ़ जेनरेशन: अद्वितीय पेप्टाइड्स की एक सूची के आधार पर, एक पुस्तकालय बनाया गया था जिसमें सभी संभावित अमीनो एसिड पैटर्न (एए) शामिल थे जैसा कि नीचे दिखाया गया है।लंबाई 3 के प्रत्येक संभावित पैटर्न को पेप्टाइड से निकाला गया था और इसके व्युत्क्रम पैटर्न को सभी पैटर्न (ट्रिपेप्टाइड्स) वाले एक सामान्य रूपांकन पुस्तकालय के साथ जोड़ा गया था।अत्यधिक दोहराव वाले रूपांकनों के पुस्तकालयों को अनुक्रमित किया गया और अतिरेक को हटा दिया गया।फिर, मोटिफ लाइब्रेरी में प्रत्येक ट्रिपेप्टाइड के लिए, हमने कम्प्यूटेशनल टूल का उपयोग करके लाइब्रेरी में इसकी उपस्थिति की जाँच की।इस मामले में, पाए गए मोटिफ ट्रिपेप्टाइड वाले पेप्टाइड की आवृत्ति को जोड़ा जाता है और मोटिफ लाइब्रेरी ("मोटिफ्स की संख्या") में मोटिफ को सौंपा जाता है।मोटिफ जेनरेशन का परिणाम एक द्वि-आयामी सरणी है जिसमें ट्रिपेप्टाइड्स (मोटिफ्स) की सभी घटनाएं और उनके संबंधित मूल्य शामिल होते हैं, जो अनुक्रमण पढ़ने की संख्या होती है जिसके परिणामस्वरूप रीडिंग को फ़िल्टर, समूहीकृत और अनुवादित किया जाता है।मेट्रिक्स जैसा कि ऊपर विस्तार से बताया गया है।
मोटिफ्स और संबंधित स्कैटरप्लॉट्स की संख्या का सामान्यीकरण: प्रत्येक नमूने के लिए मोटिफ्स की संख्या का उपयोग करके सामान्यीकृत किया गया था
जहां ni विषय i को पढ़े जाने की संख्या है।इस प्रकार, vi नमूने में मोटिफ i युक्त रीड्स (या पेप्टाइड्स) की प्रतिशत आवृत्ति का प्रतिनिधित्व करता है।रूपांकनों की गैर-सामान्यीकृत संख्या के लिए पी-मूल्यों की गणना फिशर के सटीक परीक्षण का उपयोग करके की गई थी।उद्देश्यों की संख्या के सहसंबंधों के संबंध में, स्पीयरमैन के सहसंबंधों की गणना आर के साथ उद्देश्यों की सामान्यीकृत संख्या का उपयोग करके की गई थी।
पेप्टाइड लाइब्रेरी में प्रत्येक स्थिति में अमीनो एसिड की सामग्री की कल्पना करने के लिए, वेब लॉगोग्राम 32, 33 (http://weblogo. threeplusone.com) बनाए गए थे।सबसे पहले, 12-मेर पेप्टाइड की प्रत्येक स्थिति में अमीनो एसिड की सामग्री को 20×12 मैट्रिक्स में संग्रहित किया जाता है।फिर, प्रत्येक स्थिति में समान सापेक्ष अमीनो एसिड सामग्री वाले 1000 पेप्टाइड्स का एक सेट फास्टा-अनुक्रम प्रारूप में उत्पन्न होता है और वेब-लोगो 3 में इनपुट के रूप में प्रदान किया जाता है, जो प्रत्येक स्थिति में सापेक्ष अमीनो एसिड सामग्री का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व उत्पन्न करता है।किसी दिए गए पेप्टाइड लाइब्रेरी के लिए।बहुआयामी डेटासेट की कल्पना करने के लिए, आर (बायोसहीटमैप, एक अभी तक जारी होने वाला आर पैकेज) में आंतरिक रूप से विकसित टूल का उपयोग करके हीट मैप बनाए गए थे।हीट मैप में प्रस्तुत डेंड्रोग्राम की गणना यूक्लिडियन दूरी मीट्रिक के साथ वार्ड की पदानुक्रमित क्लस्टरिंग विधि का उपयोग करके की गई थी।मोटिफ स्कोरिंग डेटा के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, फिशर के सटीक परीक्षण का उपयोग करके असामान्य स्कोरिंग के लिए पी मान की गणना की गई थी।अन्य डेटासेट के लिए पी-वैल्यू की गणना छात्र के टी-टेस्ट या एनोवा का उपयोग करके आर में की गई थी।
चयनित फेज क्लोन और बिना सम्मिलित किए फेज को पूंछ नस (300 μl पीबीएस में 2 × 1010 फेज / जानवर) के माध्यम से अंतःशिरा में इंजेक्ट किया गया था।छिड़काव और बाद में निर्धारण से दस मिनट पहले, उन्हीं जानवरों को DyLight594-लेबल लेक्टिन (वेक्टर लेबोरेटरीज इंक, DL-1177) के 100 μl के साथ अंतःशिरा में इंजेक्ट किया गया था।फ़ेज़ इंजेक्शन के 60 मिनट बाद, चूहों के हृदय में 50 मिली पीबीएस और उसके बाद 50 मिली 4% पीएफए/पीबीएस डाला गया।मस्तिष्क के नमूनों को अतिरिक्त रूप से रात भर 4% पीएफए/पीबीएस में स्थिर किया गया और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 30% सुक्रोज में भिगोया गया।नमूनों को OCT मिश्रण में फ़्लैश करके जमा दिया जाता है।जमे हुए नमूनों का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण कमरे के तापमान पर 30 µm क्रायोसेक्शन पर किया गया, जिसे 1% बीएसए के साथ अवरुद्ध किया गया और 4 डिग्री सेल्सियस पर टी7 फेज (नोवस एनबी 600-376ए) के खिलाफ पॉलीक्लोनल एफआईटीसी-लेबल एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया।रात भर इनक्यूबेट करें.अंत में, अनुभागों को पीबीएस से 3 बार धोया गया और एक कन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोप (लेइका टीसीएस एसपी5) से जांच की गई।
98% की न्यूनतम शुद्धता वाले सभी पेप्टाइड्स को जेनस्क्रिप्ट यूएसए द्वारा संश्लेषित, बायोटिनाइलेटेड और लियोफिलाइज़्ड किया गया था।बायोटिन एन-टर्मिनस पर एक अतिरिक्त ट्रिपल ग्लाइसिन स्पेसर के माध्यम से बंधा हुआ है।मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके सभी पेप्टाइड्स की जाँच करें।
स्ट्रेप्टाविडिन (सिग्मा S0677) को बायोटिनाइलेटेड पेप्टाइड, बायोटिनाइलेटेड BACE1 निरोधात्मक पेप्टाइड के 5 गुना इक्विमोलर अतिरिक्त, या बायोटिनाइलेटेड BACE1 निरोधात्मक पेप्टाइड और BACE1 निरोधात्मक पेप्टाइड के संयोजन (3:1 अनुपात) के साथ 5-10% DMSO/पीबीएस में इनक्यूबेट किया गया था।इंजेक्शन से पहले कमरे के तापमान पर 1 घंटा।स्ट्रेप्टाविडिन-संयुग्मित पेप्टाइड्स को मस्तिष्क गुहा वाले चूहों की पूंछ नसों में से एक में 10 मिलीग्राम/किलोग्राम की खुराक पर अंतःशिरा में इंजेक्ट किया गया था।
स्ट्रेप्टाविडिन-पेप्टाइड कॉम्प्लेक्स की सांद्रता का आकलन एलिसा द्वारा किया गया था।ननक मैक्सिसॉर्प माइक्रोटिटर प्लेट्स (सिग्मा) को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 μg/ml माउस एंटी-स्ट्रेप्टाविडिन एंटीबॉडी (थर्मो, MA1-20011) के साथ लेपित किया गया।2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर ब्लॉक करने (अवरुद्ध बफर: 140 एनएम NaCL, 5 मिमी EDTA, 0.05% NP40, 0.25% जिलेटिन, 1% बीएसए) के बाद, प्लेट को 3 सेकंड के लिए 0.05% ट्वीन-20/पीबीएस (वॉश बफर) से धोएं, सीएसएफ और प्लाज्मा नमूनों को ब्लॉकिंग बफर (प्लाज्मा 1:10,000, सीएसएफ 1:115) के साथ पतला कुओं में जोड़ा गया था। ).फिर प्लेट को डिटेक्शन एंटीबॉडी (1 μg/ml, एंटी-स्ट्रेप्टाविडिन-HRP, नोवस NB120-7239) के साथ 4°C पर रात भर इनक्यूबेट किया गया।तीन धोने के चरणों के बाद, 20 मिनट तक टीएमबी सब्सट्रेट समाधान (रोश) में ऊष्मायन द्वारा स्ट्रेप्टाविडिन का पता लगाया गया था।1M H2SO4 के साथ रंग विकास को रोकने के बाद, 450 एनएम पर अवशोषण को मापें।
निर्माता के प्रोटोकॉल (वाको, 294-64701) के अनुसार स्ट्रेप्टाविडिन-पेप्टाइड-बीएसीई1 अवरोधक कॉम्प्लेक्स के कार्य का मूल्यांकन एβ(1-40) एलिसा द्वारा किया गया था।संक्षेप में, सीएसएफ नमूनों को मानक मंदक (1:23) में पतला किया गया और बीएनटी77 कैप्चर एंटीबॉडी के साथ लेपित 96-अच्छी प्लेटों में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ऊष्मायन किया गया।पांच धुलाई चरणों के बाद, एचआरपी-संयुग्मित BA27 एंटीबॉडी को जोड़ा गया और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया, इसके बाद पांच धुलाई चरण किए गए।कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए टीएमबी समाधान में ऊष्मायन द्वारा Aβ(1-40) का पता लगाया गया था।स्टॉप सॉल्यूशन के साथ रंग विकास को रोकने के बाद, 450 एनएम पर अवशोषण को मापें।Aβ(1-40) एलिसा से पहले प्लाज्मा नमूनों को ठोस चरण निष्कर्षण के अधीन किया गया था।प्लाज्मा को 96-वेल प्लेटों में 0.2% डीईए (सिग्मा) में जोड़ा गया और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखा गया।एसपीई प्लेटों (ओएसिस, 186000679) को पानी और 100% मेथनॉल से क्रमिक रूप से धोने के बाद, प्लाज्मा के नमूने एसपीई प्लेटों में जोड़े गए और सभी तरल हटा दिए गए।नमूनों को धोया गया (पहले 5% मेथनॉल से फिर 30% मेथनॉल से) और 2% NH4OH/90% मेथनॉल से निक्षालित किया गया।एलुएट को 55 डिग्री सेल्सियस पर 99 मिनट तक लगातार एन2 करंट पर सुखाने के बाद, नमूनों को मानक मंदक में कम किया गया और एβ(1-40) को ऊपर बताए अनुसार मापा गया।
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