कुछ LC समस्या निवारण विषय कभी भी पुराने नहीं होते, क्योंकि LC अभ्यास में समस्याएँ होती हैं, भले ही समय के साथ उपकरण प्रौद्योगिकी में सुधार हो रहा हो। ऐसे कई तरीके हैं जिनसे LC प्रणाली में समस्याएँ उत्पन्न हो सकती हैं और खराब शिखर आकार में समाप्त हो सकती हैं। जब शिखर आकार से संबंधित समस्याएँ उत्पन्न होती हैं, तो इन परिणामों के संभावित कारणों की एक छोटी सूची हमारे समस्या निवारण अनुभव को सरल बनाने में मदद करती है।
इस "एलसी समस्या निवारण" कॉलम को लिखना और हर महीने विषयों के बारे में सोचना मजेदार रहा है, क्योंकि कुछ विषय कभी भी शैली से बाहर नहीं जाते हैं। जबकि क्रोमैटोग्राफी अनुसंधान के क्षेत्र में कुछ विषय या विचार अप्रचलित हो जाते हैं क्योंकि वे नए और बेहतर विचारों से आगे निकल जाते हैं, समस्या निवारण के क्षेत्र में, इस पत्रिका (उस समय एलसी जर्नल) में पहला समस्या निवारण लेख प्रकाशित होने के बाद से कुछ विषय अभी भी प्रासंगिक हैं) 1983 में (1)। पिछले कुछ वर्षों में, मैंने लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (एलसी) को प्रभावित करने वाले समकालीन रुझानों पर कई एलसी समस्या निवारण अनुभागों पर ध्यान केंद्रित किया है (उदाहरण के लिए, अवधारण पर दबाव के प्रभाव की हमारी समझ की सापेक्ष तुलना [2] नई प्रगति) एलसी परिणामों की हमारी व्याख्या और आधुनिक एलसी उपकरणों के साथ समस्या निवारण कैसे करें हम उपयोग कर रहे हैं। इस श्रृंखला का मुख्य विषय कई प्रयोगशालाओं में लटके LCGC के प्रसिद्ध "LC समस्या निवारण गाइड" वॉल चार्ट (4) के लिए अत्यधिक प्रासंगिक है। इस श्रृंखला के तीसरे भाग के लिए, मैंने चोटी के आकार या चोटी की विशेषताओं से संबंधित मुद्दों पर ध्यान केंद्रित करना चुना। अविश्वसनीय रूप से, दीवार चार्ट खराब चोटी के आकार के 44 विभिन्न संभावित कारणों को सूचीबद्ध करता है! हम इन सभी मुद्दों पर एक लेख में विस्तार से विचार नहीं कर सकते हैं, इसलिए विषय पर इस पहली किस्त में, मैं उन कुछ पर ध्यान केंद्रित करूंगा जिन्हें मैं अक्सर देखता हूं। मुझे उम्मीद है कि युवा और पुराने LC उपयोगकर्ता इस महत्वपूर्ण विषय पर कुछ उपयोगी टिप्स और अनुस्मारक पाएंगे।
मैं अपने आप को समस्या निवारण प्रश्नों का उत्तर "कुछ भी संभव है" के साथ देते हुए पाता हूँ। यह उत्तर उन अवलोकनों पर विचार करते समय आसान लग सकता है जिनकी व्याख्या करना कठिन है, लेकिन मुझे यह अक्सर उचित लगता है। खराब शिखर आकार के कई संभावित कारणों के साथ, समस्या क्या हो सकती है, इस पर विचार करते समय खुले दिमाग रखना महत्वपूर्ण है, और हमारे समस्या निवारण प्रयासों को शुरू करने के लिए संभावित कारणों को प्राथमिकता देने में सक्षम होना चाहिए, उन सबसे आम संभावनाओं पर ध्यान केंद्रित करना, यह बिंदु बहुत महत्वपूर्ण है।
किसी भी समस्या निवारण अभ्यास में एक महत्वपूर्ण कदम - लेकिन मुझे लगता है कि इसे कम आंका गया है - यह पहचानना है कि एक समस्या है जिसे हल करने की आवश्यकता है। यह पहचानना कि एक समस्या है, अक्सर इसका मतलब है कि उपकरण के साथ जो होता है वह हमारी अपेक्षाओं से अलग है, जो सिद्धांत, अनुभवजन्य ज्ञान और अनुभव (5) द्वारा आकार लेते हैं। यहाँ संदर्भित "शिखर आकार" वास्तव में न केवल शिखर के आकार (सममित, विषम, चिकना, शराबी, अग्रणी किनारा, पूंछ, आदि) को संदर्भित करता है, बल्कि चौड़ाई को भी संदर्भित करता है। वास्तविक शिखर आकार के लिए हमारी अपेक्षाएँ सरल हैं। सिद्धांत (6) पाठ्यपुस्तक की अपेक्षा का अच्छी तरह से समर्थन करता है कि, ज्यादातर मामलों में, क्रोमैटोग्राफिक चोटियाँ सममित होनी चाहिए और गॉसियन वितरण के आकार के अनुरूप होनी चाहिए, जैसा कि चित्र 1a में दिखाया गया है। हम शिखर की चौड़ाई से क्या उम्मीद करते हैं यह एक अधिक जटिल मुद्दा है, और हम इस विषय पर भविष्य के लेख में चर्चा करेंगे। चित्र 1 में अन्य शिखर आकार कुछ अन्य संभावनाओं को दिखाते हैं जिन्हें देखा जा सकता है - दूसरे शब्दों में, कुछ तरीके जिनसे चीजें गलत हो सकती हैं। इस किस्त के शेष भाग में, हम खर्च करेंगे आइए हम उन स्थितियों के कुछ विशिष्ट उदाहरणों पर चर्चा करें जो इन आकार प्रकारों को जन्म दे सकती हैं।
कभी-कभी क्रोमैटोग्राम में चोटियाँ बिल्कुल भी नहीं देखी जाती हैं जहाँ से उन्हें निकाला जाना अपेक्षित होता है। उपरोक्त दीवार चार्ट यह दर्शाता है कि चोटी की अनुपस्थिति (यह मानते हुए कि नमूने में वास्तव में एक सांद्रता में लक्ष्य विश्लेषक होता है जो डिटेक्टर प्रतिक्रिया को शोर के ऊपर इसे देखने के लिए पर्याप्त बनाना चाहिए) आमतौर पर कुछ उपकरण की समस्या या गलत मोबाइल चरण की स्थिति (यदि बिल्कुल भी देखी जाती है) से संबंधित होती है। चोटियाँ, आमतौर पर बहुत "कमज़ोर")। इस श्रेणी में संभावित समस्याओं और समाधानों की एक छोटी सूची तालिका I में पाई जा सकती है।
जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, यह प्रश्न कि ध्यान देने और इसे ठीक करने का प्रयास करने से पहले कितना शिखर चौड़ीकरण सहन किया जाना चाहिए, एक जटिल विषय है जिस पर मैं भविष्य के लेख में चर्चा करूंगा। मेरा अनुभव है कि महत्वपूर्ण शिखर चौड़ीकरण अक्सर शिखर आकार में एक महत्वपूर्ण परिवर्तन के साथ होता है, और शिखर टेलिंग पूर्व-शिखर या विभाजन की तुलना में अधिक सामान्य है। हालांकि, नाममात्र सममित शिखर भी चौड़े होते हैं, जो कुछ अलग कारणों से हो सकते हैं:
इनमें से प्रत्येक मुद्दे पर समस्या निवारण LC के पिछले अंकों में विस्तार से चर्चा की गई है, और इन विषयों में रुचि रखने वाले पाठक इन मुद्दों के मूल कारणों और संभावित समाधानों के बारे में जानकारी के लिए इन पिछले लेखों को देख सकते हैं। अधिक जानकारी।
शिखर टेलिंग, शिखर फ्रंटिंग और विभाजन सभी रासायनिक या भौतिक घटनाओं के कारण हो सकते हैं, और इन समस्याओं के संभावित समाधानों की सूची व्यापक रूप से भिन्न होती है, जो इस बात पर निर्भर करती है कि हम रासायनिक या भौतिक समस्या से निपट रहे हैं। अक्सर, क्रोमैटोग्राम में विभिन्न चोटियों की तुलना करके, आप इस बारे में महत्वपूर्ण सुराग पा सकते हैं कि कौन दोषी है। यदि क्रोमैटोग्राम में सभी चोटियां समान आकार प्रदर्शित करती हैं, तो इसका कारण संभवतः भौतिक नहीं है। यदि केवल एक या कुछ चोटियां प्रभावित होती हैं, लेकिन बाकी ठीक दिखती हैं, तो इसका कारण संभवतः रासायनिक है।
पीक टेलिंग के रासायनिक कारण इतने जटिल हैं कि यहां संक्षेप में चर्चा करना संभव नहीं है। इच्छुक पाठक अधिक गहन चर्चा के लिए "एलसी समस्या निवारण" के हालिया अंक को संदर्भित करते हैं (10)। हालांकि, एक आसान तरीका यह है कि इंजेक्ट किए गए विश्लेषक के द्रव्यमान को कम किया जाए और देखें कि क्या शिखर आकार में सुधार होता है। यदि ऐसा है, तो यह एक अच्छा संकेत है कि समस्या "द्रव्यमान अधिभार" है। इस मामले में, विधि को छोटे विश्लेषक द्रव्यमानों को इंजेक्ट करने तक सीमित किया जाना चाहिए, या क्रोमैटोग्राफिक स्थितियों को बदलना होगा ताकि बड़े द्रव्यमानों को इंजेक्ट करने पर भी अच्छे शिखर आकार प्राप्त किए जा सकें।
पीक टेलिंग के कई संभावित भौतिक कारण भी हैं। संभावनाओं की विस्तृत चर्चा में रुचि रखने वाले पाठकों को "एलसी समस्या निवारण" (11) के एक अन्य हालिया अंक का संदर्भ दिया जाता है। पीक टेलिंग के अधिक सामान्य भौतिक कारणों में से एक इंजेक्टर और डिटेक्टर (12) के बीच एक बिंदु पर खराब कनेक्शन है। एक चरम उदाहरण चित्र 1 डी में दिखाया गया है, जो कुछ हफ्ते पहले मेरी प्रयोगशाला में प्राप्त हुआ था। इस मामले में, हमने एक नए इंजेक्शन वाल्व के साथ एक सिस्टम बनाया, जिसे हमने पहले इस्तेमाल नहीं किया था, और एक छोटे वॉल्यूम इंजेक्शन लूप को एक फेरूल के साथ स्थापित किया था जिसे स्टेनलेस स्टील केशिका पर ढाला गया था। कुछ शुरुआती समस्या निवारण प्रयोगों के बाद, हमने महसूस किया कि इंजेक्शन वाल्व स्टेटर में पोर्ट की गहराई जितनी हम इस्तेमाल कर रहे थे, उससे कहीं अधिक गहरी थी
चित्र 1e में दिखाए गए शिखर मोर्चे भी भौतिक या रासायनिक समस्याओं के कारण हो सकते हैं। अग्रणी किनारे का एक सामान्य भौतिक कारण यह है कि स्तंभ का कण बिस्तर अच्छी तरह से पैक नहीं है, या यह कि कणों ने समय के साथ पुनर्गठित किया है। इस भौतिक घटना के कारण शिखर टेलिंग के साथ, इसे ठीक करने का सबसे अच्छा तरीका स्तंभ को बदलना और चलते रहना है। मौलिक रूप से, रासायनिक उत्पत्ति वाले अग्रणी किनारे के शिखर आकार अक्सर "गैर-रैखिक" अवधारण स्थितियों से उत्पन्न होते हैं। आदर्श (रैखिक) स्थितियों के तहत, स्थिर चरण (इसलिए, अवधारण कारक) द्वारा बनाए गए विश्लेषक की मात्रा स्तंभ में विश्लेषक की एकाग्रता से रैखिक रूप से संबंधित होती है। क्रोमैटोग्राफिक रूप से, इसका मतलब है कि जैसे-जैसे स्तंभ में इंजेक्ट किए गए विश्लेषक का द्रव्यमान बढ़ता है, शिखर लंबा होता जाता है, लेकिन चौड़ा नहीं होता। यह संबंध तब टूट जाता है जब अवधारण व्यवहार गैर-रैखिक होता है, और चोटियाँ न केवल लंबी होती हैं, बल्कि अधिक द्रव्यमान इंजेक्ट होने पर चौड़ी भी होती हैं। इसके अलावा, गैर-रैखिक आकार क्रोमैटोग्राफिक चोटियों के आकार को निर्धारित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप अग्रणी या अनुगामी होते हैं किनारों। द्रव्यमान अधिभार के साथ जो पीक टेलिंग (10) का कारण बनता है, गैर-रेखीय प्रतिधारण के कारण होने वाले पीक लीडिंग का भी इंजेक्ट किए गए विश्लेषक द्रव्यमान को कम करके निदान किया जा सकता है। यदि पीक आकार में सुधार होता है, तो विधि को इंजेक्शन की गुणवत्ता से अधिक नहीं होने के लिए संशोधित किया जाना चाहिए जो अग्रणी किनारे का कारण बनता है, या इस व्यवहार को कम करने के लिए क्रोमैटोग्राफिक स्थितियों को बदलना होगा।
कभी-कभी हम एक "विभाजित" शिखर जैसा कुछ देखते हैं, जैसा कि चित्र 1f में दिखाया गया है। इस समस्या को सुलझाने में पहला कदम यह निर्धारित करना है कि क्या शिखर का आकार आंशिक सह-निस्तारण (यानी, दो अलग-अलग लेकिन निकट से निस्तारित यौगिकों की उपस्थिति) के कारण है। यदि वास्तव में दो अलग-अलग विश्लेषक एक साथ निस्तारित हो रहे हैं, तो यह उनके रिज़ॉल्यूशन को बेहतर बनाने का मामला है (उदाहरण के लिए, चयनात्मकता, अवधारण या प्लेट काउंट को बढ़ाकर), और स्पष्ट "विभाजित" शिखर भौतिक प्रदर्शन से संबंधित हैं, जिसका कॉलम से कोई लेना-देना नहीं है। अक्सर, इस निर्णय के लिए सबसे महत्वपूर्ण सुराग यह होता है कि क्या क्रोमैटोग्राम में सभी शिखर विभाजित आकार प्रदर्शित करते हैं, या सिर्फ एक या दो। यदि यह सिर्फ एक या दो हैं, तो यह शायद सह-निस्तारण का मुद्दा है; यदि सभी शिखर विभाजित हैं, तो यह शायद एक भौतिक मुद्दा है, जो सबसे अधिक संभावना कॉलम से संबंधित है।
स्तंभ के भौतिक गुणों से संबंधित विभाजित चोटियां आमतौर पर आंशिक रूप से अवरुद्ध इनलेट या आउटलेट फ्रिट्स, या स्तंभ में कणों के पुनर्गठन के कारण होती हैं, जिससे मोबाइल चरण स्तंभ चैनल गठन के कुछ क्षेत्रों में मोबाइल चरण की तुलना में तेजी से प्रवाहित होता है। अन्य क्षेत्रों में (11)। आंशिक रूप से अवरुद्ध फ्रिट को कभी-कभी स्तंभ के माध्यम से प्रवाह को उलट कर साफ किया जा सकता है; हालांकि, मेरे अनुभव में, यह आमतौर पर दीर्घकालिक समाधान के बजाय अल्पकालिक होता है। आधुनिक स्तंभों के साथ यह अक्सर घातक होता है यदि कण स्तंभ के भीतर पुनर्संयोजित होते हैं। इस बिंदु पर, स्तंभ को बदलना और जारी रखना सबसे अच्छा है।
चित्र 1g में शिखर, जो मेरी अपनी प्रयोगशाला में हाल ही में लिए गए एक उदाहरण से भी है, आमतौर पर यह दर्शाता है कि संकेत इतना अधिक है कि यह प्रतिक्रिया सीमा के उच्च अंत तक पहुँच गया है। ऑप्टिकल अवशोषण डिटेक्टरों (इस मामले में UV-vis) के लिए, जब विश्लेषक सांद्रता बहुत अधिक होती है, तो विश्लेषक डिटेक्टर प्रवाह सेल से गुजरने वाले अधिकांश प्रकाश को अवशोषित कर लेता है, जिससे पता लगाने के लिए बहुत कम प्रकाश बचता है। इन स्थितियों के तहत, फोटोडिटेक्टर से विद्युत संकेत शोर के विभिन्न स्रोतों, जैसे भटकने वाली रोशनी और "डार्क करंट" से बहुत अधिक प्रभावित होता है, जिससे संकेत दिखने में बहुत "धुंधला" हो जाता है और विश्लेषक सांद्रता से स्वतंत्र हो जाता है। जब ऐसा होता है, तो समस्या को अक्सर विश्लेषक के इंजेक्शन की मात्रा को कम करके आसानी से हल किया जा सकता है - इंजेक्शन की मात्रा को कम करके, नमूने को पतला करके, या दोनों।
क्रोमैटोग्राफी स्कूल में, हम डिटेक्टर सिग्नल (यानी, क्रोमैटोग्राम में y-अक्ष) का उपयोग नमूने में विश्लेषक सांद्रता के संकेतक के रूप में करते हैं। इसलिए शून्य से नीचे के सिग्नल के साथ क्रोमैटोग्राम को देखना अजीब लगता है, क्योंकि सरल व्याख्या यह है कि यह एक नकारात्मक विश्लेषक सांद्रता को इंगित करता है - जो निश्चित रूप से शारीरिक रूप से संभव नहीं है। मेरे अनुभव में, ऑप्टिकल अवशोषण डिटेक्टरों (जैसे, यूवी-विज़) का उपयोग करते समय नकारात्मक चोटियां सबसे अधिक बार देखी जाती हैं।
इस मामले में, एक नकारात्मक शिखर का मतलब केवल यह है कि स्तंभ से निकलने वाले अणु शिखर से तुरंत पहले और बाद में मोबाइल चरण की तुलना में कम प्रकाश को अवशोषित करते हैं। यह, उदाहरण के लिए, अपेक्षाकृत कम पता लगाने वाले तरंग दैर्ध्य (<230 एनएम) और मोबाइल चरण योजक का उपयोग करते समय हो सकता है जो इन तरंग दैर्ध्य पर अधिकांश प्रकाश को अवशोषित करते हैं। इस तरह के योजक मोबाइल चरण विलायक घटक जैसे मेथनॉल या बफर घटक जैसे एसीटेट या फॉर्मेट हो सकते हैं। कोई वास्तव में एक अंशांकन वक्र तैयार करने और सटीक मात्रात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए नकारात्मक चोटियों का उपयोग कर सकता है, इसलिए उन्हें प्रति से बचने का कोई मौलिक कारण नहीं है (इस विधि को कभी-कभी "अप्रत्यक्ष यूवी पता लगाने" के रूप में जाना जाता है) (13)। हालांकि, अगर हम वास्तव में नकारात्मक चोटियों से पूरी तरह बचना चाहते हैं, तो अवशोषण का पता लगाने के मामले में, सबसे अच्छा समाधान एक अलग पता लगाने वाली तरंग दैर्ध्य का उपयोग करना
नकारात्मक शिखर अपवर्तक सूचकांक (आरआई) जांच का उपयोग करते समय भी दिखाई दे सकते हैं, जब नमूने में विश्लेषक के अलावा अन्य घटकों का अपवर्तक सूचकांक, जैसे विलायक मैट्रिक्स, मोबाइल चरण के अपवर्तक सूचकांक से भिन्न होता है। यह यूवी-विज़ जांच के साथ भी होता है, लेकिन यह प्रभाव आरआई जांच के सापेक्ष क्षीण हो जाता है। दोनों मामलों में, नमूना मैट्रिक्स की संरचना को मोबाइल चरण के साथ अधिक निकटता से मिलान करके नकारात्मक शिखर को कम किया जा सकता है।
LC समस्या निवारण के मूल विषय पर भाग तीन में, मैंने उन स्थितियों पर चर्चा की, जिनमें देखा गया शिखर आकार अपेक्षित या सामान्य शिखर आकार से भिन्न होता है। ऐसी समस्याओं का प्रभावी समस्या निवारण अपेक्षित शिखर आकृतियों (सिद्धांत या मौजूदा तरीकों के साथ पिछले अनुभव के आधार पर) के ज्ञान से शुरू होता है, इसलिए इन अपेक्षाओं से विचलन स्पष्ट है। शिखर आकार की समस्याओं के कई अलग-अलग संभावित कारण हैं (बहुत चौड़ा, टेलिंग, अग्रणी किनारा, आदि)। इस किस्त में, मैं कुछ ऐसे कारणों पर विस्तार से चर्चा करता हूँ जो मुझे सबसे अधिक बार दिखाई देते हैं। इन विवरणों को जानना समस्या निवारण शुरू करने के लिए एक अच्छी जगह प्रदान करता है, लेकिन सभी संभावनाओं को नहीं पकड़ता है। कारणों और समाधानों की अधिक गहन सूची में रुचि रखने वाले पाठक LCGC "LC समस्या निवारण गाइड" वॉल चार्ट का संदर्भ ले सकते हैं।
(4) एलसीजीसी “एलसी समस्या निवारण गाइड” दीवार चार्ट.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021)।
(6) ए. फेलिंगर, क्रोमैटोग्राफी में डेटा विश्लेषण और सिग्नल प्रोसेसिंग (एल्सेवियर, न्यूयॉर्क, एनवाई, 1998), पृ. 43-96.
(8) वहाब एम.एफ., दासगुप्ता पी.के., कादजो ए.एफ. और आर्मस्ट्रांग डी.डब्ल्यू., एनाल.चिम.जर्नल.रेव. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.