कुछ एलसी समस्या निवारण विषय कभी भी पुराने नहीं होते हैं, क्योंकि एलसी अभ्यास में समस्याएं हैं, भले ही समय के साथ उपकरण प्रौद्योगिकी में सुधार होता है। ऐसे कई तरीके हैं जिनसे एलसी सिस्टम में समस्याएं उत्पन्न हो सकती हैं और खराब शिखर आकार में समाप्त हो सकती हैं। जब शिखर आकार से संबंधित समस्याएं उत्पन्न होती हैं, तो इन परिणामों के संभावित कारणों की एक छोटी सूची हमारे समस्या निवारण अनुभव को सरल बनाने में मदद करती है।
इस "एलसी समस्या निवारण" कॉलम को लिखना और हर महीने विषयों के बारे में सोचना मजेदार रहा है, क्योंकि कुछ विषय कभी भी शैली से बाहर नहीं जाते हैं। जबकि क्रोमैटोग्राफी अनुसंधान के क्षेत्र में कुछ विषय या विचार अप्रचलित हो जाते हैं क्योंकि समस्या निवारण के क्षेत्र में उन्हें नए और बेहतर विचारों द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, क्योंकि इस पत्रिका (उस समय एलसी जर्नल) में पहला समस्या निवारण लेख 1983 में प्रकाशित हुआ था (क्योंकि कुछ विषय अभी भी प्रासंगिक हैं) 1983 में (1)। पिछले कुछ वर्षों में, मैंने कई एलसी पर ध्यान केंद्रित किया है। तरल क्रोमैटोग्राफी (एलसी) को प्रभावित करने वाले समकालीन रुझानों पर समस्या निवारण अनुभाग (उदाहरण के लिए, प्रतिधारण पर दबाव के प्रभाव की हमारी समझ की सापेक्ष तुलना [2] नई प्रगति) एलसी परिणामों की हमारी व्याख्या और आधुनिक एलसी उपकरणों के साथ समस्या निवारण कैसे करें। इस महीने की किस्त में, मैं अपनी श्रृंखला (3) जारी रख रहा हूं, जो दिसंबर 2021 में शुरू हुई थी, जो एलसी समस्या निवारण के कुछ "जीवन और मृत्यु" विषयों पर केंद्रित थी - ऐसे तत्व जो किसी भी समस्या निवारक के लिए आवश्यक हैं, चाहे उम्र कोई भी हो। हम जिस प्रणाली का उपयोग कर रहे हैं। इस श्रृंखला का मुख्य विषय कई प्रयोगशालाओं में लटके एलसीजीसी के प्रसिद्ध "एलसी समस्या निवारण गाइड" वॉल चार्ट (4) के लिए अत्यधिक प्रासंगिक है। इस श्रृंखला के तीसरे भाग के लिए, मैंने पीक आकार या पीक विशेषताओं से संबंधित मुद्दों पर ध्यान केंद्रित करना चुना। अविश्वसनीय रूप से, वॉल चार्ट खराब पीक आकार के 44 अलग-अलग संभावित कारणों को सूचीबद्ध करता है! हम इन सभी मुद्दों पर एक लेख में विस्तार से विचार नहीं कर सकते हैं, इसलिए विषय पर इस पहली किस्त में, मैं उनमें से कुछ पर ध्यान केंद्रित करूंगा जिन्हें मैं अक्सर देखता हूं। मैं आशा है कि युवा और वृद्ध एलसी उपयोगकर्ताओं को इस महत्वपूर्ण विषय पर कुछ उपयोगी सुझाव और अनुस्मारक मिलेंगे।
मैं अपने आप को "कुछ भी संभव है" के साथ समस्या निवारण प्रश्नों का तेजी से उत्तर देता हुआ पाता हूं। उन टिप्पणियों पर विचार करते समय यह प्रतिक्रिया आसान लग सकती है जिनकी व्याख्या करना मुश्किल है, लेकिन मुझे यह अक्सर उचित लगता है। खराब शिखर आकार के कई संभावित कारणों के साथ, समस्या क्या हो सकती है, इस पर विचार करते समय खुले दिमाग रखना महत्वपूर्ण है, और हमारे समस्या निवारण प्रयासों को शुरू करने के लिए संभावित कारणों को प्राथमिकता देने में सक्षम होना, उन सबसे सामान्य संभावनाओं पर ध्यान केंद्रित करना, यह बिंदु बहुत महत्वपूर्ण है। संभव है।
किसी भी समस्या निवारण अभ्यास में एक महत्वपूर्ण कदम - लेकिन मुझे लगता है कि इसे कम आंका गया है - यह पहचानना है कि एक समस्या है जिसे हल करने की आवश्यकता है। यह पहचानने का मतलब है कि उपकरण के साथ जो होता है वह हमारी अपेक्षाओं से भिन्न होता है, जो सिद्धांत, अनुभवजन्य ज्ञान और अनुभव (5) द्वारा आकार दिया जाता है। यहां संदर्भित "चोटी का आकार" वास्तव में न केवल चोटी के आकार (सममित, असममित, चिकनी, शराबी, अग्रणी धार, पूंछ, आदि) को संदर्भित करता है, बल्कि इसे भी संदर्भित करता है। चौड़ाई। वास्तविक शिखर आकार के लिए हमारी अपेक्षाएँ सरल हैं। सिद्धांत (6) पाठ्यपुस्तक की अपेक्षा का अच्छी तरह से समर्थन करता है कि, ज्यादातर मामलों में, क्रोमैटोग्राफ़िक चोटियाँ सममित होनी चाहिए और गॉसियन वितरण के आकार के अनुरूप होनी चाहिए, जैसा कि चित्र 1 ए में दिखाया गया है। हम शिखर की चौड़ाई से क्या उम्मीद करते हैं यह एक अधिक जटिल मुद्दा है, और हम भविष्य के लेख में इस विषय पर चर्चा करेंगे। चित्र 1 में अन्य शिखर आकृतियाँ कुछ अन्य संभावनाएँ दिखाती हैं जिन्हें देखा जा सकता है - दूसरे शब्दों में, कुछ तरीके जिनसे चीजें गलत हो सकती हैं। शेष में इस किस्त में, हम उन स्थितियों के कुछ विशिष्ट उदाहरणों पर चर्चा करने में समय व्यतीत करेंगे जो इन आकार प्रकारों को जन्म दे सकती हैं।
कभी-कभी क्रोमैटोग्राम में चोटियों को बिल्कुल भी नहीं देखा जाता है, जहां उन्हें स्पष्ट होने की उम्मीद होती है। उपरोक्त दीवार चार्ट इंगित करता है कि एक चोटी की अनुपस्थिति (यह मानते हुए कि नमूने में वास्तव में एक एकाग्रता में लक्ष्य विश्लेषण शामिल है जो डिटेक्टर प्रतिक्रिया को शोर के ऊपर देखने के लिए पर्याप्त बनाना चाहिए) आमतौर पर कुछ उपकरण समस्या या गलत मोबाइल चरण स्थितियों (यदि बिल्कुल देखा जाता है) से संबंधित है।शिखर, आमतौर पर बहुत "कमजोर")। इस श्रेणी में संभावित समस्याओं और समाधानों की एक छोटी सूची तालिका I में पाई जा सकती है।
जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, ध्यान देने और इसे ठीक करने का प्रयास करने से पहले पीक चौड़ीकरण को कितना सहन किया जाना चाहिए यह एक जटिल विषय है जिस पर मैं भविष्य के लेख में चर्चा करूंगा। मेरा अनुभव है कि महत्वपूर्ण पीक चौड़ीकरण अक्सर पीक आकार में एक महत्वपूर्ण बदलाव के साथ होता है, और पीक टेलिंग प्री-पीक या स्प्लिटिंग की तुलना में अधिक आम है। हालांकि, नाममात्र सममित चोटियां भी चौड़ी हो जाती हैं, जो कुछ अलग कारणों से हो सकती हैं:
इनमें से प्रत्येक मुद्दे पर समस्या निवारण एलसी के पिछले अंकों में विस्तार से चर्चा की गई है, और इन विषयों में रुचि रखने वाले पाठक इन मुद्दों के मूल कारणों और संभावित समाधानों के बारे में जानकारी के लिए इन पिछले लेखों का संदर्भ ले सकते हैं।अधिक जानकारी।
पीक टेलिंग, पीक फ्रंटिंग और स्प्लिटिंग सभी रासायनिक या भौतिक घटनाओं के कारण हो सकते हैं, और इन समस्याओं के संभावित समाधानों की सूची व्यापक रूप से भिन्न होती है, यह इस पर निर्भर करता है कि हम रासायनिक या भौतिक समस्या से निपट रहे हैं या नहीं। अक्सर, क्रोमैटोग्राम में विभिन्न चोटियों की तुलना करके, आप महत्वपूर्ण सुराग पा सकते हैं कि कौन सा दोषी है। यदि क्रोमैटोग्राम में सभी चोटियां समान आकार प्रदर्शित करती हैं, तो इसका कारण संभवतः भौतिक नहीं है। यदि केवल एक या कुछ चोटियां प्रभावित होती हैं, लेकिन बाकी ठीक दिखती हैं, तो इसका कारण सबसे अधिक संभावना रासायनिक है .
पीक टेलिंग के रासायनिक कारण यहां संक्षेप में चर्चा करने के लिए बहुत जटिल हैं। इच्छुक पाठक को अधिक गहन चर्चा (10) के लिए "एलसी समस्या निवारण" के हालिया अंक में भेजा जाता है। हालांकि, कोशिश करने की एक आसान बात यह है कि इंजेक्ट किए गए विश्लेषण के द्रव्यमान को कम करें और देखें कि क्या पीक आकार में सुधार होता है। यदि ऐसा है, तो यह एक अच्छा संकेत है कि समस्या "मास ओवरलोड" है। इस मामले में, विधि को छोटे विश्लेषण द्रव्यमान को इंजेक्ट करने तक सीमित किया जाना चाहिए, या क्रोमैटोग्राफिक स्थितियों को बदला जाना चाहिए ताकि बड़े द्रव्यमान को इंजेक्ट करके भी अच्छे शिखर आकार प्राप्त किए जा सकते हैं।
पीक टेलिंग के कई संभावित भौतिक कारण भी हैं। संभावनाओं की विस्तृत चर्चा में रुचि रखने वाले पाठकों को "एलसी ट्रबलशूटिंग" (11) के एक और हालिया अंक का संदर्भ दिया गया है। पीक टेलिंग के अधिक सामान्य भौतिक कारणों में से एक इंजेक्टर और डिटेक्टर (12) के बीच एक बिंदु पर खराब कनेक्शन है। कुछ सप्ताह पहले मेरी प्रयोगशाला में प्राप्त चित्र 1 डी में एक चरम उदाहरण दिखाया गया है। इस मामले में, हमने एक नए इंजेक्शन वाल्व के साथ एक प्रणाली बनाई है जिसका हमने पहले उपयोग नहीं किया था, और एक फेर्रू के साथ एक छोटी मात्रा इंजेक्शन लूप स्थापित किया था। एक स्टेनलेस स्टील केशिका पर ढाला गया था। कुछ प्रारंभिक समस्या निवारण प्रयोगों के बाद, हमने महसूस किया कि इंजेक्शन वाल्व स्टेटर में पोर्ट की गहराई हमारी आदत से कहीं अधिक गहरी थी, जिसके परिणामस्वरूप पोर्ट के निचले हिस्से में एक बड़ी मृत मात्रा हो गई। इंजेक्शन लूप को किसी अन्य ट्यूब से बदलकर इस समस्या को आसानी से हल किया जा सकता है, हम बंदरगाह के निचले भाग में मृत मात्रा को खत्म करने के लिए फेरूल को उचित स्थिति में समायोजित कर सकते हैं।
चित्र 1e में दिखाए गए पीक फ्रंट भौतिक या रासायनिक समस्याओं के कारण भी हो सकते हैं। अग्रणी किनारे का एक सामान्य भौतिक कारण यह है कि स्तंभ का कण बिस्तर अच्छी तरह से पैक नहीं किया गया है, या कि कण समय के साथ पुनर्गठित हो गए हैं। इस भौतिक घटना के कारण पीक टेलिंग के साथ, इसे ठीक करने का सबसे अच्छा तरीका कॉलम को प्रतिस्थापित करना और जारी रखना है। मूल रूप से, रासायनिक उत्पत्ति के साथ अग्रणी किनारे के शिखर आकार अक्सर "गैर-रैखिक" अवधारण स्थितियों से उत्पन्न होते हैं। आदर्श (रैखिक) स्थितियों के तहत, एना की मात्रा स्थिर चरण द्वारा बनाए रखा गया लाइट (इसलिए, अवधारण कारक) स्तंभ में विश्लेषक की एकाग्रता से रैखिक रूप से संबंधित है। क्रोमैटोग्राफिक रूप से, इसका मतलब है कि जैसे-जैसे स्तंभ में इंजेक्ट किए गए विश्लेषण का द्रव्यमान बढ़ता है, शिखर लंबा हो जाता है, लेकिन व्यापक नहीं। यह संबंध तब टूट जाता है जब अवधारण व्यवहार गैर-रैखिक होता है, और चोटियां न केवल लंबी हो जाती हैं, बल्कि अधिक द्रव्यमान इंजेक्ट होने पर चौड़ी भी हो जाती हैं। इसके अलावा, गैर-रैखिक आकार क्रोमैटोग्राफिक चोटियों के आकार को निर्धारित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप अग्रणी या अनुगामी किनारे। बड़े पैमाने पर अधिभार के साथ जो पीक टेलिंग (10) का कारण बनता है, नॉनलाइनियर रिटेंशन के कारण होने वाली पीक लीडिंग का भी इंजेक्शन विश्लेषण द्रव्यमान को कम करके निदान किया जा सकता है। यदि पीक आकार में सुधार होता है, तो विधि को संशोधित किया जाना चाहिए ताकि इंजेक्शन की गुणवत्ता से अधिक न हो जो अग्रणी बढ़त का कारण बनती है, या इस व्यवहार को कम करने के लिए क्रोमैटोग्राफिक स्थितियों को बदला जाना चाहिए।
कभी-कभी हम देखते हैं कि एक "विभाजित" शिखर प्रतीत होता है, जैसा कि चित्र 1f में दिखाया गया है। इस समस्या को हल करने में पहला कदम यह निर्धारित करना है कि क्या शिखर का आकार आंशिक सह-संक्षेपण (यानी, दो अलग-अलग लेकिन बारीकी से eluting यौगिकों की उपस्थिति) के कारण है। यदि वास्तव में दो अलग-अलग विश्लेषक एक साथ मिलकर eluting हैं, तो यह उनके संकल्प में सुधार करने का मामला है (उदाहरण के लिए, चयनात्मकता, प्रतिधारण या प्लेट गिनती में वृद्धि करके), और स्पष्ट "विभाजित" शिखर शारीरिक प्रदर्शन से संबंधित हैं, इसका भौतिक प्रदर्शन से कोई लेना-देना नहीं है। कॉलम ही। अक्सर, इस निर्णय का सबसे महत्वपूर्ण सुराग यह है कि क्या क्रोमैटोग्राम में सभी शिखर विभाजित आकार प्रदर्शित करते हैं, या सिर्फ एक या दो। यदि यह सिर्फ एक या दो है, तो यह संभवतः एक सह-उत्थान मुद्दा है;यदि सभी शिखर विभाजित हैं, तो संभवतः यह एक भौतिक समस्या है, संभवतः स्तंभ से ही संबंधित है।
स्तंभ के भौतिक गुणों से संबंधित स्प्लिट चोटियां आमतौर पर आंशिक रूप से अवरुद्ध इनलेट या आउटलेट फ्रिट्स, या कॉलम में कणों के पुनर्गठन के कारण होती हैं, जिससे कॉलम चैनल गठन के कुछ क्षेत्रों में मोबाइल चरण को मोबाइल चरण की तुलना में तेज़ी से प्रवाह करने की इजाजत मिलती है। अन्य क्षेत्रों में (11)। आंशिक रूप से अवरुद्ध फ्रिट को कभी-कभी कॉलम के माध्यम से प्रवाह को उलट कर साफ़ किया जा सकता है;हालाँकि, मेरे अनुभव में, यह आम तौर पर दीर्घकालिक समाधान के बजाय अल्पकालिक होता है। आधुनिक स्तंभों के साथ यह अक्सर घातक होता है यदि कण स्तंभ के भीतर पुनः संयोजित हो जाते हैं। इस बिंदु पर, स्तंभ को बदलना और जारी रखना सबसे अच्छा है।
चित्र 1जी में शिखर, मेरी अपनी प्रयोगशाला में हाल के उदाहरण से भी, आमतौर पर इंगित करता है कि सिग्नल इतना ऊंचा है कि यह प्रतिक्रिया सीमा के उच्च अंत तक पहुंच गया है। ऑप्टिकल अवशोषक डिटेक्टरों (इस मामले में यूवी-विज़) के लिए, जब विश्लेषक एकाग्रता बहुत अधिक होती है, तो विश्लेषक डिटेक्टर प्रवाह सेल से गुजरने वाले अधिकांश प्रकाश को अवशोषित करता है, जिससे पता लगाने के लिए बहुत कम रोशनी बचती है। इन स्थितियों के तहत, फोटोडेटेक्टर से विद्युत संकेत शोर के विभिन्न स्रोतों, जैसे आवारा प्रकाश और "डार्क करंट" से काफी प्रभावित होता है। ”, जिससे सिग्नल दिखने में बहुत “अस्पष्ट” हो जाता है और विश्लेषणात्मक एकाग्रता से स्वतंत्र हो जाता है।जब ऐसा होता है, तो समस्या को अक्सर विश्लेषक के इंजेक्शन की मात्रा को कम करके आसानी से हल किया जा सकता है - इंजेक्शन की मात्रा को कम करना, नमूने को पतला करना, या दोनों।
क्रोमैटोग्राफी स्कूल में, हम नमूने में विश्लेषण एकाग्रता के संकेतक के रूप में डिटेक्टर सिग्नल (यानी, क्रोमैटोग्राम में वाई-अक्ष) का उपयोग करते हैं। इसलिए शून्य से नीचे सिग्नल के साथ क्रोमैटोग्राम देखना अजीब लगता है, क्योंकि सरल व्याख्या यह है कि यह एक नकारात्मक विश्लेषण एकाग्रता को इंगित करता है - जो निश्चित रूप से शारीरिक रूप से संभव नहीं है। मेरे अनुभव में, ऑप्टिकल अवशोषक डिटेक्टरों (उदाहरण के लिए, यूवी-विज़) का उपयोग करते समय नकारात्मक चोटियां अक्सर देखी जाती हैं।
इस मामले में, एक नकारात्मक शिखर का सीधा सा मतलब है कि स्तंभ से निकलने वाले अणु शिखर के तुरंत पहले और बाद में मोबाइल चरण की तुलना में कम प्रकाश को अवशोषित करते हैं। यह हो सकता है, उदाहरण के लिए, जब अपेक्षाकृत कम पहचान तरंग दैर्ध्य (<230 एनएम) और मोबाइल चरण एडिटिव्स का उपयोग किया जाता है जो इन तरंग दैर्ध्य पर अधिकांश प्रकाश को अवशोषित करते हैं। ऐसे एडिटिव्स मेथनॉल जैसे मोबाइल चरण विलायक घटक या एसीटेट या फॉर्मेट जैसे बफर घटक हो सकते हैं। कोई वास्तव में अंशांकन वक्र तैयार करने और सटीक मात्रात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए नकारात्मक चोटियों का उपयोग कर सकता है, इसलिए उनसे बचने का कोई मौलिक कारण नहीं है (इस विधि को कभी-कभी "अप्रत्यक्ष यूवी डिटेक्शन" के रूप में जाना जाता है) (13)। हालांकि, अगर हम वास्तव में नकारात्मक चोटियों से पूरी तरह बचना चाहते हैं, तो अवशोषण का पता लगाने के मामले में, सबसे अच्छा समाधान एक अलग डिटेक्शन तरंग दैर्ध्य का उपयोग करना है ताकि विश्लेषक मोबाइल चरण से अधिक अवशोषित कर सके, या मोबाइल चरण की संरचना को बदल सके ताकि वे विश्लेषकों की तुलना में कम प्रकाश को अवशोषित करें।
अपवर्तक सूचकांक (आरआई) का पता लगाने का उपयोग करते समय नकारात्मक चोटियां भी दिखाई दे सकती हैं, जब नमूने में विश्लेषण के अलावा अन्य घटकों का अपवर्तक सूचकांक, जैसे कि विलायक मैट्रिक्स, मोबाइल चरण के अपवर्तक सूचकांक से भिन्न होता है। यह यूवी-विज़ पहचान के साथ भी होता है, लेकिन यह प्रभाव आरआई पहचान के सापेक्ष क्षीण हो जाता है। दोनों ही मामलों में, नमूना मैट्रिक्स की संरचना को मोबाइल चरण के साथ अधिक निकटता से मिलान करके नकारात्मक चोटियों को कम किया जा सकता है।
एलसी समस्या निवारण के मूल विषय पर भाग तीन में, मैंने उन स्थितियों पर चर्चा की जिनमें देखी गई चोटी का आकार अपेक्षित या सामान्य चोटी के आकार से भिन्न होता है। ऐसी समस्याओं का प्रभावी समस्या निवारण अपेक्षित चोटी के आकार (मौजूदा तरीकों के साथ सिद्धांत या पूर्व अनुभव के आधार पर) के ज्ञान से शुरू होता है, इसलिए इन अपेक्षाओं से विचलन स्पष्ट हैं। चोटी के आकार की समस्याओं के कई अलग-अलग संभावित कारण होते हैं (बहुत व्यापक, पूंछ, अग्रणी बढ़त, आदि)। इस किस्त में, मैं उन कुछ कारणों पर विस्तार से चर्चा करता हूं जो मैं अक्सर देखता हूं। इन विवरणों को जानने से एक अच्छी जगह मिलती है समस्या निवारण शुरू करें, लेकिन सभी संभावनाओं पर कब्जा नहीं करता है। कारणों और समाधानों की अधिक गहन सूची में रुचि रखने वाले पाठक एलसीजीसी "एलसी समस्या निवारण गाइड" वॉल चार्ट का उल्लेख कर सकते हैं।
(4) एलसीजीसी "एलसी समस्या निवारण गाइड" वॉल चार्ट। https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021)।
(6) ए. फेलिंगर, क्रोमैटोग्राफी में डेटा विश्लेषण और सिग्नल प्रोसेसिंग (एल्सेवियर, न्यूयॉर्क, एनवाई, 1998), पीपी. 43-96।
(8) वहाब एमएफ, दासगुप्ता पीके, कडजो एएफ और आर्मस्ट्रांग डीडब्ल्यू, एनल.चिम.जर्नल.रेव।907, 31-44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.