Nature.com पर आने के लिए धन्यवाद।आप जिस ब्राउज़र संस्करण का उपयोग कर रहे हैं उसमें सीमित सीएसएस समर्थन है।सर्वोत्तम अनुभव के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि आप एक अद्यतन ब्राउज़र का उपयोग करें (या इंटरनेट एक्सप्लोरर में संगतता मोड अक्षम करें)।इस बीच, निरंतर समर्थन सुनिश्चित करने के लिए, हम साइट को शैलियों और जावास्क्रिप्ट के बिना प्रस्तुत करेंगे।
लिक्विड बायोप्सी (एलबी) एक ऐसी अवधारणा है जो बायोमेडिकल क्षेत्र में तेजी से लोकप्रियता हासिल कर रही है।यह अवधारणा मुख्य रूप से परिसंचारी बाह्यकोशिकीय डीएनए (सीसीएफडीएनए) के टुकड़ों का पता लगाने पर आधारित है, जो मुख्य रूप से विभिन्न ऊतकों में कोशिका मृत्यु के बाद छोटे टुकड़ों के रूप में जारी होते हैं।इन टुकड़ों का एक छोटा सा हिस्सा विदेशी (विदेशी) ऊतकों या जीवों से उत्पन्न होता है।वर्तमान कार्य में, हमने इस अवधारणा को मसल्स पर लागू किया है, जो एक प्रहरी प्रजाति है जो अपनी उच्च समुद्री जल निस्पंदन क्षमता के लिए जानी जाती है।हम समुद्री तटीय पारिस्थितिक तंत्र की जैव विविधता के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए विभिन्न स्रोतों से पर्यावरणीय डीएनए अंशों को पकड़ने के लिए प्राकृतिक फिल्टर के रूप में कार्य करने के लिए मसल्स की क्षमता का उपयोग करते हैं।हमारे परिणाम बताते हैं कि मसल हेमोलिम्फ में डीएनए के टुकड़े होते हैं जो आकार में 1 से 5 केबी तक बहुत भिन्न होते हैं।शॉटगन अनुक्रमण से पता चला कि बड़ी संख्या में डीएनए टुकड़े विदेशी माइक्रोबियल मूल के हैं।उनमें से, हमें बैक्टीरिया, आर्किया और वायरस के डीएनए टुकड़े मिले, जिनमें ऐसे वायरस भी शामिल हैं जो आमतौर पर तटीय समुद्री पारिस्थितिक तंत्र में पाए जाने वाले विभिन्न प्रकार के मेजबानों को संक्रमित करने के लिए जाने जाते हैं।निष्कर्ष में, हमारा अध्ययन दर्शाता है कि मसल्स पर लागू एलबी की अवधारणा समुद्री तटीय पारिस्थितिक तंत्र में माइक्रोबियल विविधता के बारे में ज्ञान के एक समृद्ध लेकिन अभी तक अज्ञात स्रोत का प्रतिनिधित्व करती है।
समुद्री पारिस्थितिक तंत्र की जैव विविधता पर जलवायु परिवर्तन (सीसी) का प्रभाव अनुसंधान का तेजी से बढ़ता हुआ क्षेत्र है।ग्लोबल वार्मिंग न केवल महत्वपूर्ण शारीरिक तनाव का कारण बनती है, बल्कि समुद्री जीवों की तापीय स्थिरता की विकासवादी सीमाओं को भी बढ़ाती है, जिससे कई प्रजातियों के आवास प्रभावित होते हैं, जिससे उन्हें अधिक अनुकूल परिस्थितियों की खोज करने के लिए प्रेरित किया जाता है [1, 2]।मेटाज़ोअन्स की जैव विविधता को प्रभावित करने के अलावा, सीसी मेजबान-माइक्रोबियल इंटरैक्शन के नाजुक संतुलन को बाधित करता है।यह माइक्रोबियल डिस्बैक्टीरियोसिस समुद्री पारिस्थितिक तंत्र के लिए एक गंभीर खतरा पैदा करता है क्योंकि यह समुद्री जीवों को संक्रामक रोगजनकों के प्रति अधिक संवेदनशील बनाता है [3, 4]।ऐसा माना जाता है कि एसएस सामूहिक मौतों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जो वैश्विक समुद्री पारिस्थितिक तंत्र के प्रबंधन के लिए एक गंभीर समस्या है [5, 6]।कई समुद्री प्रजातियों के आर्थिक, पारिस्थितिक और पोषण संबंधी प्रभावों को देखते हुए यह एक महत्वपूर्ण मुद्दा है।यह ध्रुवीय क्षेत्रों में रहने वाले द्विजों के लिए विशेष रूप से सच है, जहां सीके के प्रभाव अधिक तत्काल और गंभीर हैं [6, 7]।वास्तव में, मायटिलस एसपीपी जैसे द्विकपाटी।समुद्री पारिस्थितिक तंत्र पर सीसी के प्रभावों की निगरानी के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।आश्चर्य की बात नहीं है, उनके स्वास्थ्य की निगरानी के लिए अपेक्षाकृत बड़ी संख्या में बायोमार्कर विकसित किए गए हैं, अक्सर दो-स्तरीय दृष्टिकोण का उपयोग किया जाता है जिसमें एंजाइमिक गतिविधि या सेल व्यवहार्यता और फागोसाइटिक गतिविधि जैसे सेलुलर कार्यों के आधार पर कार्यात्मक बायोमार्कर शामिल होते हैं [8]।इन विधियों में विशिष्ट दबाव संकेतकों की सांद्रता का माप भी शामिल है जो बड़ी मात्रा में समुद्री जल के अवशोषण के बाद नरम ऊतकों में जमा होते हैं।हालाँकि, बाइवाल्व्स की उच्च निस्पंदन क्षमता और अर्ध-खुली संचार प्रणाली तरल बायोप्सी (एलबी) की अवधारणा का उपयोग करके नए हेमोलिम्फ बायोमार्कर विकसित करने का अवसर प्रदान करती है, जो रोगी प्रबंधन के लिए एक सरल और न्यूनतम आक्रामक दृष्टिकोण है।रक्त के नमूने [9, 10]।यद्यपि मानव एलबी में कई प्रकार के परिसंचारी अणु पाए जा सकते हैं, यह अवधारणा मुख्य रूप से प्लाज्मा में परिसंचारी बाह्य डीएनए (सीसीएफडीएनए) टुकड़ों के डीएनए अनुक्रमण विश्लेषण पर आधारित है।वास्तव में, मानव प्लाज्मा में परिसंचारी डीएनए की उपस्थिति 20वीं सदी के मध्य से ज्ञात है [11], लेकिन हाल के वर्षों में ही उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण विधियों के आगमन से ccfDNA पर आधारित नैदानिक ​​​​निदान हुआ है।इन परिसंचारी डीएनए अंशों की उपस्थिति आंशिक रूप से कोशिका मृत्यु के बाद जीनोमिक डीएनए (परमाणु और माइटोकॉन्ड्रियल) की निष्क्रिय रिहाई के कारण होती है। स्वस्थ व्यक्तियों में, ccfDNA की सांद्रता आम तौर पर कम (<10 एनजी/एमएल) होती है, लेकिन विभिन्न विकृति से पीड़ित या तनाव के अधीन रोगियों में 5-10 गुना तक बढ़ सकती है, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक क्षति हो सकती है। स्वस्थ व्यक्तियों में, ccfDNA की सांद्रता आम तौर पर कम (<10 एनजी/एमएल) होती है, लेकिन विभिन्न विकृति से पीड़ित या तनाव के अधीन रोगियों में 5-10 गुना तक बढ़ सकती है, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक क्षति हो सकती है। У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может п 5-10 दिनों में एक वर्ष से अधिक समय तक वेतन वृद्धि जारी रहेगी тресу, приводящему к повреждению тканей. स्वस्थ लोगों में, cccDNA की सांद्रता आम तौर पर कम (<10 एनजी/एमएल) होती है, लेकिन विभिन्न विकृति वाले या तनावग्रस्त रोगियों में यह 5-10 गुना तक बढ़ सकती है जिससे ऊतक क्षति होती है।ccfDNA में 10 ng/mL, ccfDNA, 10 ng/mL, ccfDNA, 10 ng/mL, ccfDNA होता है। 5-10 वर्ष, एक वर्ष से अधिक समय तक भुगतान करना।， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中可 增加 5-10 倍 , 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть 5-10 दिनों में увеличены у пациентов с различными патологиями или стрессом, чт о приводит к повреждению тканей. स्वस्थ व्यक्तियों में सीसीएफडीएनए सांद्रता आमतौर पर कम (<10 एनजी/एमएल) होती है, लेकिन विभिन्न विकृति या तनाव वाले रोगियों में 5-10 गुना बढ़ सकती है, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक क्षति हो सकती है।सीसीएफडीएनए टुकड़ों का आकार व्यापक रूप से भिन्न होता है, लेकिन आमतौर पर 150 से 200 बीपी तक होता है।[12].स्व-व्युत्पन्न ccfDNA का विश्लेषण, अर्थात, सामान्य या रूपांतरित मेजबान कोशिकाओं से ccfDNA, का उपयोग परमाणु और/या माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम में मौजूद आनुवंशिक और एपिजेनेटिक परिवर्तनों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, जिससे चिकित्सकों को विशिष्ट आणविक-लक्षित उपचारों का चयन करने में मदद मिलती है [13]।हालाँकि, ccfDNA को विदेशी स्रोतों से प्राप्त किया जा सकता है जैसे गर्भावस्था के दौरान भ्रूण की कोशिकाओं से या प्रत्यारोपित अंगों से ccfDNA [14,15,16,17]।सीसीएफडीएनए एक संक्रामक एजेंट (विदेशी) के न्यूक्लिक एसिड की उपस्थिति का पता लगाने के लिए जानकारी का एक महत्वपूर्ण स्रोत है, जो संक्रमित ऊतकों की आक्रामक बायोप्सी से बचने, रक्त संस्कृतियों द्वारा पहचाने नहीं गए व्यापक संक्रमणों का गैर-आक्रामक पता लगाने की अनुमति देता है [18]।हाल के अध्ययनों से वास्तव में पता चला है कि मानव रक्त में जानकारी का एक समृद्ध स्रोत होता है जिसका उपयोग वायरल और बैक्टीरियल रोगजनकों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, और मानव प्लाज्मा में पाए जाने वाले ccfDNA का लगभग 1% विदेशी मूल का है [19]।ये अध्ययन दर्शाते हैं कि किसी जीव के परिसंचारी माइक्रोबायोम की जैव विविधता का आकलन ccfDNA विश्लेषण का उपयोग करके किया जा सकता है।हालाँकि, हाल तक, इस अवधारणा का उपयोग विशेष रूप से मनुष्यों में और कुछ हद तक अन्य कशेरुकियों में किया जाता था [20, 21]।
वर्तमान पेपर में, हम औलाकोम्या अत्रा के ccfDNA का विश्लेषण करने के लिए एलबी क्षमता का उपयोग करते हैं, एक दक्षिणी प्रजाति जो आमतौर पर उपअंटार्कटिक किर्गुएलन द्वीप समूह में पाई जाती है, जो 35 मिलियन वर्ष पहले बने एक बड़े पठार के ऊपर द्वीपों का एक समूह है।ज्वालामुखी का विस्फोट।इन विट्रो प्रायोगिक प्रणाली का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि समुद्री जल में डीएनए के टुकड़े तेजी से मसल्स द्वारा उठाए जाते हैं और हेमोलिम्फ डिब्बे में प्रवेश करते हैं।शॉटगन अनुक्रमण से पता चला है कि मसल हेमोलिम्फ ccfDNA में अपने स्वयं के और गैर-स्वयं मूल के डीएनए टुकड़े शामिल हैं, जिसमें सहजीवी बैक्टीरिया और ठंडे ज्वालामुखीय समुद्री तटीय पारिस्थितिक तंत्र के विशिष्ट बायोम से डीएनए टुकड़े शामिल हैं।हेमोलिम्फ ccfDNA में विभिन्न होस्ट रेंज वाले वायरस से प्राप्त वायरल अनुक्रम भी शामिल हैं।हमें बोनी मछली, समुद्री एनीमोन, शैवाल और कीड़े जैसे बहुकोशिकीय जानवरों के डीएनए टुकड़े भी मिले।निष्कर्ष में, हमारा अध्ययन दर्शाता है कि समुद्री पारिस्थितिक तंत्र में एक समृद्ध जीनोमिक प्रदर्शनों की सूची उत्पन्न करने के लिए एलबी अवधारणा को समुद्री अकशेरुकी जीवों पर सफलतापूर्वक लागू किया जा सकता है।
वयस्क (55-70 मिमी लंबे) मायटिलस प्लैटेंसिस (एम. प्लैटेंसिस) और औलाकोमिया अत्रा (ए. अत्रा) को पोर्ट-औ-फ़्रांस (049°21.235 दक्षिण, 070°13.490 पूर्व) के अंतर्ज्वारीय चट्टानी तटों से एकत्र किया गया था।दिसंबर 2018 में केर्गुएलन द्वीप समूह। अन्य वयस्क ब्लू मसल्स (मायटिलस एसपीपी) को एक वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता (पीईआई मसल किंग इंक, प्रिंस एडवर्ड आइलैंड, कनाडा) से प्राप्त किया गया था और तापमान नियंत्रित (4°C) वातित टैंक में रखा गया था जिसमें 10-20 लीटर 32‰ ​​कृत्रिम नमकीन पानी था।(कृत्रिम समुद्री नमक रीफ क्रिस्टल, इंस्टेंट ओशन, वर्जीनिया, यूएसए)।प्रत्येक प्रयोग के लिए, अलग-अलग गोले की लंबाई और वजन मापा गया।
इस कार्यक्रम के लिए एक निःशुल्क ओपन एक्सेस प्रोटोकॉल ऑनलाइन उपलब्ध है (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1)।संक्षेप में, एलबी हेमोलिम्फ को अपहरणकर्ता की मांसपेशियों से एकत्र किया गया था जैसा कि वर्णित है [22]।हेमोलिम्फ को 3 मिनट के लिए 1200×g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा स्पष्ट किया गया था, सतह पर तैरनेवाला उपयोग होने तक जमे हुए (-20 डिग्री सेल्सियस) था।सीएफडीएनए के अलगाव और शुद्धिकरण के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार नमूनों (1.5-2.0 मिली) को न्यूक्लियो स्नैप सीएफडीएनए किट (माचेरी-नागेल, बेथलेहेन, पीए) का उपयोग करके पिघलाया और संसाधित किया गया।ccfDNA को अगले विश्लेषण तक -80°C पर संग्रहीत किया गया था।कुछ प्रयोगों में, ccfDNA को QIAamp DNA इन्वेस्टिगेटर किट (QIAGEN, टोरंटो, ओंटारियो, कनाडा) का उपयोग करके अलग और शुद्ध किया गया था।मानक पिकोग्रीन परख का उपयोग करके शुद्ध डीएनए की मात्रा निर्धारित की गई थी।पृथक ccfDNA के टुकड़े वितरण का विश्लेषण उच्च संवेदनशीलता डीएनए किट का उपयोग करके एगिलेंट 2100 बायोएनालाइजर (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज इंक, सांता क्लारा, सीए) का उपयोग करके केशिका वैद्युतकणसंचलन द्वारा किया गया था।निर्माता के निर्देशों के अनुसार ccfDNA नमूने के 1 μl का उपयोग करके परख की गई थी।
हेमोलिम्फ ccfDNA अंशों के अनुक्रमण के लिए, जीनोम क्यूबेक (मॉन्ट्रियल, क्यूबेक, कनाडा) ने इलुमिना MiSeq PE75 किट के इलुमिना डीएनए मिक्स किट का उपयोग करके शॉटगन लाइब्रेरी तैयार की।एक मानक एडॉप्टर (BioO) का उपयोग किया गया था।रॉ डेटा फ़ाइलें एनसीबीआई सीक्वेंस रीड आर्काइव (एसआरआर8924808 और एसआरआर8924809) से उपलब्ध हैं।फास्टक्यूसी [23] का उपयोग करके बुनियादी पढ़ने की गुणवत्ता का मूल्यांकन किया गया था।ट्रिमोमैटिक [24] का उपयोग क्लिपिंग एडेप्टर और खराब गुणवत्ता वाले रीडिंग के लिए किया गया है।युग्मित सिरों के साथ शॉटगन रीड्स को बेमेल से बचने के लिए 20 बीपी के न्यूनतम ओवरलैप के साथ फ्लैश को लंबे सिंगल रीड्स में विलय कर दिया गया था [25]। मर्ज किए गए रीड्स को एक द्विवार्षिक एनसीबीआई टैक्सोनॉमी डेटाबेस (ई वैल्यू <1e−3 और 90% होमोलॉजी) का उपयोग करके BLASTN के साथ एनोटेट किया गया था, और DUST [26] का उपयोग करके कम-जटिलता अनुक्रमों की मास्किंग की गई थी। मर्ज किए गए रीड्स को एक द्विवार्षिक एनसीबीआई टैक्सोनॉमी डेटाबेस (ई वैल्यू <1e−3 और 90% होमोलॉजी) का उपयोग करके BLASTN के साथ एनोटेट किया गया था, और DUST [26] का उपयोग करके कम-जटिलता अनुक्रमों की मास्किंग की गई थी। BLASTN की एक और पोस्ट के बारे में जानकारी प्राप्त करें зы данных таксономии двустворчатых моллюсков एनसीबीआई (значение e < 1e-3 и 90% гомологии ), एक और अधिक पढ़ें धूल का कण [26]। एनसीबीआई बाइवाल्व टैक्सोनॉमी डेटाबेस (ई वैल्यू <1e-3 और 90% होमोलॉजी) का उपयोग करके BLASTN के साथ पूल किए गए रीड्स को एनोटेट किया गया था, और DUST [26] का उपयोग करके कम जटिलता अनुक्रम मास्किंग किया गया था।使用双壳类注释合并的读数，并使用DUST [26] 进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 धूल [26] 进行复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩载掩蔽 掩蔽BLASTN की एक और पोस्ट के बारे में जानकारी प्राप्त करें एनसीबीआई (значение e <1e-3 и 90% гомо логии), а маскирование последовательностей сложности было выполнено с использованием धूल [26]। एनसीबीआई बाइवेल्व टैक्सोनोमिक डेटाबेस (ई वैल्यू <1e-3 और 90% होमोलॉजी) का उपयोग करके BLASTN के साथ पूल किए गए रीड्स को एनोटेट किया गया था, और DUST [26] का उपयोग करके कम जटिलता अनुक्रम मास्किंग किया गया था।रीड्स को दो समूहों में विभाजित किया गया था: द्विवार्षिक अनुक्रमों से संबंधित (यहां सेल्फ-रीड्स कहा जाता है) और असंबंधित (गैर-सेल्फ-रीड्स)।कंटिग्स उत्पन्न करने के लिए मेगाहिट का उपयोग करके दो समूहों को अलग से इकट्ठा किया गया था [27]।इस बीच, एलियन माइक्रोबायोम रीड्स के टैक्सोनोमिक वितरण को क्रैकेन2 [28] का उपयोग करके वर्गीकृत किया गया था और गैलेक्सी [29, 30] पर क्रोना पाई चार्ट द्वारा ग्राफिक रूप से दर्शाया गया था।हमारे प्रारंभिक प्रयोगों से इष्टतम किलोमीटर किलोमीटर-59 निर्धारित किया गया था। अंतिम एनोटेशन के लिए BLASTN (बाइवाल्व एनसीबीआई डेटाबेस, ई वैल्यू <1e−10 और 60% होमोलॉजी) के साथ संरेखण द्वारा स्व-संकोचों की पहचान की गई। अंतिम एनोटेशन के लिए BLASTN (बाइवाल्व एनसीबीआई डेटाबेस, ई वैल्यू <1e−10 और 60% होमोलॉजी) के साथ संरेखण द्वारा स्व-संकोचों की पहचान की गई। Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCPI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. अंतिम एनोटेशन के लिए BLASTN (NCBI बाइवाल्व डेटाबेस, ई वैल्यू <1e-10 और 60% होमोलॉजी) के साथ मिलान करके सेल्फ-कंटिग्स की पहचान की गई।ब्लास्टन (ब्लास्टन) के बारे में एनसीबीआई (एनसीबीआई) और < 1ई-10 और 60% के बारे में जानकारी प्राप्त करें।最终注释。BLASTN के लिए आवेदन करें (NCBI के लिए आवेदन पत्र देखें, e 值< 1e-10 和60% पिछले वर्ष की तुलना में एक वर्ष से अधिक समय तक ऋण प्राप्त किया जा सकता है। BLASTN (NCBI данных для двустворчатых моллюсков, के बारे में जानकारी) значение e <1e-10 и гомология 60%). फिर BLASTN (NCBI बाइवाल्व डेटाबेस, ई वैल्यू <1e-10 और 60% होमोलॉजी) के साथ मिलान करके अंतिम एनोटेशन के लिए सेल्फ-कॉन्टिग की पहचान की गई। समानांतर में, गैर-समूह समूह को BLASTN (एनटी एनसीबीआई डेटाबेस, ई मान <1e−10 और 60% होमोलॉजी) के साथ एनोटेट किया गया था। समानांतर में, गैर-समूह समूह को BLASTN (एनटी एनसीबीआई डेटाबेस, ई मान <1e−10 और 60% होमोलॉजी) के साथ एनोटेट किया गया था। Паралельно чужеродные групповые контиги аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt एनसीबीआई, значение e <1e-10 и гомология 60%)। समानांतर में, विदेशी समूह के प्रतियोगियों को BLASTN (एनटी एनसीबीआई डेटाबेस, ई मान <1e-10 और 60% होमोलॉजी) के साथ एनोटेट किया गया था।अधिक पढ़ेंअधिक पढ़ें अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए, कोई अन्य समस्या नहीं है। BLASTN के बारे में अधिक जानकारी (एनसीबीआई, значение e <1e-10 и гомология 60%)। समानांतर में, गैर-स्व-समूह समूहों को BLASTN (एनटी एनसीबीआई डेटाबेस, ई मान <1e-10 और 60% समरूपता) के साथ एनोटेट किया गया था। BLASTX को nr और RefSeq प्रोटीन एनसीबीआई डेटाबेस (e मान <1e−10 और 60% होमोलॉजी) का उपयोग करके नॉनसेल्फ कॉन्टिग्स पर भी आयोजित किया गया था। BLASTX को nr और RefSeq प्रोटीन एनसीबीआई डेटाबेस (e मान <1e−10 और 60% होमोलॉजी) का उपयोग करके नॉनसेल्फ कॉन्टिग्स पर भी आयोजित किया गया था। BLASTX ने एक लैपटॉप को एक दूसरे से जोड़ा है और पढ़ें बीएलएएसएक्स को एनआर और रेफसेक एनसीबीआई प्रोटीन डेटाबेस (ई वैल्यू <1e-10 और 60% होमोलॉजी) का उपयोग करके गैर-स्वयं संक्रामक पर भी प्रदर्शन किया गया था।एनआर और रेफसेक के बारे में एनसीबीआई को ब्लास्टएक्स के बारे में अधिक जानकारी है < 1e-10 और 60% की छूट।एनआर और रेफसेक के बारे में एनसीबीआई को ब्लास्टएक्स के बारे में अधिक जानकारी है < 1e-10 और 60% की छूट। BLASTX ने एक नया मोबाइल फोन खरीदा है нных белка nr и RefSeq एनसीबीआई (значение e <1e-10 и гомология 60%). बीएलएएसएक्स को एनआर और रेफसेक एनसीबीआई प्रोटीन डेटाबेस (ई वैल्यू <1e-10 और 60% होमोलॉजी) का उपयोग करके गैर-स्वयं संक्रामक पर भी प्रदर्शन किया गया था।गैर-स्वयं-कन्टिग्स के BLASTN और BLASTX पूल अंतिम कॉन्टिग्स का प्रतिनिधित्व करते हैं (पूरक फ़ाइल देखें)।
पीसीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर तालिका एस1 में सूचीबद्ध हैं।Taq DNA पोलीमरेज़ (बायो बेसिक कनाडा, मार्खम, ON) का उपयोग ccfDNA लक्ष्य जीन को बढ़ाने के लिए किया गया था।निम्नलिखित प्रतिक्रिया स्थितियों का उपयोग किया गया: 3 मिनट के लिए 95°C पर विकृतीकरण, 1 मिनट के लिए 95°C, 1 मिनट के लिए एनीलिंग तापमान सेट करें, 1 मिनट के लिए 72°C पर बढ़ाव, 35 चक्र, और अंत में 10 मिनट के भीतर 72°C।.पीसीआर उत्पादों को 95 वी पर एसवाईबीआरटीएम सेफ डीएनए जेल स्टेन (इन्विट्रोजन, बर्लिंगटन, ओएन, कनाडा) युक्त एगरोज़ जैल (1.5%) में इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग किया गया था।
मसल्स (मायटिलस एसपीपी) को 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 500 मिलीलीटर ऑक्सीजन युक्त समुद्री जल (32 पीएसयू) में अनुकूलित किया गया था।मानव गैलेक्टिन-7 सीडीएनए अनुक्रम (एनसीबीआई परिग्रहण संख्या L07769) को एन्कोड करने वाला एक इंसर्ट युक्त प्लास्मिड डीएनए को 190 μg/μl की अंतिम सांद्रता पर शीशी में जोड़ा गया था।डीएनए को शामिल किए बिना समान परिस्थितियों में ऊष्मायन किए गए मसल्स पर नियंत्रण था।तीसरे नियंत्रण टैंक में बिना मसल्स वाला डीएनए था।समुद्री जल में डीएनए की गुणवत्ता की निगरानी के लिए, संकेतित समय पर प्रत्येक टैंक से समुद्री जल के नमूने (20 μl; तीन दोहराव) लिए गए।प्लास्मिड डीएनए ट्रैसेबिलिटी के लिए, एलबी मसल्स को संकेतित समय पर काटा गया और क्यूपीसीआर और डीडीपीसीआर द्वारा विश्लेषण किया गया।समुद्री जल में नमक की मात्रा अधिक होने के कारण, सभी पीसीआर परखों से पहले एलिकोट्स को पीसीआर गुणवत्ता वाले पानी (1:10) में पतला किया गया था।
डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडीपीसीआर) बायोरैड QX200 प्रोटोकॉल (मिसिसॉगा, ओंटारियो, कनाडा) का उपयोग करके किया गया था।इष्टतम तापमान (तालिका S1) निर्धारित करने के लिए तापमान प्रोफ़ाइल का उपयोग करें।QX200 ड्रॉप जनरेटर (बायोरैड) का उपयोग करके बूंदें उत्पन्न की गईं।डीडीपीसीआर को निम्नानुसार किया गया: 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 50 चक्र और 1 मिनट के लिए दिए गए एनीलिंग तापमान और 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 5 मिनट के भीतर 90 डिग्री सेल्सियस।बूंदों की संख्या और सकारात्मक प्रतिक्रियाओं (प्रतियों/μl की संख्या) को QX200 ड्रॉप रीडर (बायोरैड) का उपयोग करके मापा गया था।10,000 से कम बूंदों वाले नमूने खारिज कर दिए गए।हर बार डीडीपीसीआर चलाने पर पैटर्न नियंत्रण नहीं किया गया।
क्यूपीसीआर को रोटर-जीन® 3000 (कॉर्बेट रिसर्च, सिडनी, ऑस्ट्रेलिया) और LGALS7 विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया था।क्वांटिफ़ास्ट SYBR ग्रीन पीसीआर किट (QIAGEN) का उपयोग करके 20 μl में सभी मात्रात्मक पीसीआर का प्रदर्शन किया गया।क्यूपीसीआर को 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के ऊष्मायन के साथ शुरू किया गया था, इसके बाद एक डेटा संग्रह के साथ 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेकंड के लिए 40 चक्र और 60 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था।5 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 60 एस के लिए 65 डिग्री सेल्सियस और क्यूपीसीआर के अंत में 97 डिग्री सेल्सियस पर क्रमिक माप का उपयोग करके पिघलने वाले वक्र उत्पन्न किए गए थे।नियंत्रण नमूनों को छोड़कर, प्रत्येक क्यूपीसीआर तीन प्रतियों में किया गया था।
चूंकि मसल्स अपनी उच्च निस्पंदन दर के लिए जाने जाते हैं, इसलिए हमने पहले जांच की कि क्या वे समुद्री जल में मौजूद डीएनए अंशों को फ़िल्टर और बनाए रख सकते हैं।हमें इस बात में भी दिलचस्पी थी कि क्या ये टुकड़े उनके अर्ध-खुले लसीका तंत्र में जमा होते हैं।हमने ब्लू मसल टैंक में जोड़े गए घुलनशील डीएनए अंशों के भाग्य का पता लगाकर प्रयोगात्मक रूप से इस मुद्दे को हल किया।डीएनए अंशों की ट्रैकिंग की सुविधा के लिए, हमने मानव गैलेक्टिन-7 जीन युक्त विदेशी (स्वयं नहीं) प्लास्मिड डीएनए का उपयोग किया।डीडीपीसीआर समुद्री जल और मसल्स में प्लास्मिड डीएनए अंशों का पता लगाता है।हमारे परिणाम बताते हैं कि यदि सीपियों की अनुपस्थिति में समुद्र के पानी में डीएनए टुकड़ों की मात्रा समय के साथ (7 दिनों तक) अपेक्षाकृत स्थिर रहती है, तो सीपियों की उपस्थिति में यह स्तर 8 घंटों के भीतर लगभग पूरी तरह से गायब हो जाता है (चित्र 1 ए, बी)।अंतर्गर्भाशयी द्रव और हेमोलिम्फ में 15 मिनट के भीतर बहिर्जात डीएनए के टुकड़ों का आसानी से पता लगाया गया (चित्र 1 सी)।एक्सपोज़र के 4 घंटे बाद तक भी इन टुकड़ों का पता लगाया जा सकता है।डीएनए अंशों के संबंध में यह फ़िल्टरिंग गतिविधि बैक्टीरिया और शैवाल की फ़िल्टरिंग गतिविधि के बराबर है [31]।इन परिणामों से पता चलता है कि मसल्स अपने द्रव डिब्बों में विदेशी डीएनए को फ़िल्टर और जमा कर सकते हैं।
समुद्री जल में मसल्स की उपस्थिति (ए) या अनुपस्थिति (बी) में प्लास्मिड डीएनए की सापेक्ष सांद्रता, डीडीपीसीआर द्वारा मापी जाती है।ए में, परिणाम प्रतिशत के रूप में व्यक्त किए जाते हैं, जिसमें बक्से की सीमाएं 75वें और 25वें प्रतिशतक का प्रतिनिधित्व करती हैं।फिट किए गए लॉगरिदमिक वक्र को लाल रंग में दिखाया गया है, और ग्रे रंग में छायांकित क्षेत्र 95% विश्वास अंतराल का प्रतिनिधित्व करता है।बी में, लाल रेखा माध्य का प्रतिनिधित्व करती है और नीली रेखा एकाग्रता के लिए 95% विश्वास अंतराल का प्रतिनिधित्व करती है।सी प्लास्मिड डीएनए के जुड़ने के बाद अलग-अलग समय पर मसल्स के हेमोलिम्फ और वाल्वुलर तरल पदार्थ में प्लास्मिड डीएनए का संचय।परिणाम खोजी गई पूर्ण प्रतियों/एमएल (±एसई) के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं।
इसके बाद, हमने सीमित मानवजनित प्रभाव वाले द्वीपों के एक दूरस्थ समूह, केर्गुएलन द्वीप समूह पर मसल्स बेड से एकत्र किए गए मसल्स में ccfDNA की उत्पत्ति की जांच की।इस प्रयोजन के लिए, मसल्स हेमोलिम्फ्स से सीसीसीडीएनए को अलग किया गया और मानव सीसीसीडीएनए को शुद्ध करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली विधियों द्वारा शुद्ध किया गया [32, 33]।हमने पाया कि मसल्स में औसत हेमोलिम्फ सीसीएफडीएनए सांद्रता कम माइक्रोग्राम प्रति एमएल हेमोलिम्फ रेंज में है (तालिका एस2, अनुपूरक सूचना देखें)।सांद्रता की यह सीमा स्वस्थ लोगों (प्रति मिलीलीटर कम नैनोग्राम) की तुलना में बहुत बड़ी है, लेकिन दुर्लभ मामलों में, कैंसर रोगियों में, सीसीएफडीएनए का स्तर कई माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर तक पहुंच सकता है [34, 35]।हेमोलिम्फ सीसीएफडीएनए के आकार वितरण के विश्लेषण से पता चला कि ये टुकड़े 1000 बीपी से 1000 बीपी तक के आकार में काफी भिन्न होते हैं।5000 बीपी तक (चित्र 2)।इसी तरह के परिणाम सिलिका-आधारित QIAamp जांचकर्ता किट का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे, जो आमतौर पर ccfDNA [36] सहित कम सांद्रता वाले डीएनए नमूनों से जीनोमिक डीएनए को तेजी से अलग करने और शुद्ध करने के लिए फोरेंसिक विज्ञान में उपयोग की जाने वाली एक विधि है।
मसल हेमोलिम्फ का प्रतिनिधि सीसीएफडीएनए इलेक्ट्रोफोरग्राम।NucleoSnap प्लाज्मा किट (शीर्ष) और QIAamp डीएनए अन्वेषक किट के साथ निकाला गया।बी वायलिन प्लॉट मसल्स में हेमोलिम्फ ccfDNA सांद्रता (±SE) के वितरण को दर्शाता है।काली और लाल रेखाएँ क्रमशः मध्यिका और पहले और तीसरे चतुर्थक का प्रतिनिधित्व करती हैं।
मनुष्यों और प्राइमेट्स में लगभग 1% ccfDNA का एक विदेशी स्रोत है [21, 37]।बाइवाल्व्स की अर्ध-खुली परिसंचरण प्रणाली, माइक्रोबियल-समृद्ध समुद्री जल और मसल्स सीसीसीएफडीएनए के आकार वितरण को देखते हुए, हमने अनुमान लगाया कि मसल्स हेमोलिम्फ सीसीसीएफडीएनए में माइक्रोबियल डीएनए का एक समृद्ध और विविध पूल हो सकता है।इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, हमने केर्गुएलन द्वीप समूह से एकत्र किए गए औलाकोमिया अत्रा नमूनों से हेमोलिम्फ ccfDNA को अनुक्रमित किया, जिससे 10 मिलियन से अधिक रीड प्राप्त हुए, जिनमें से 97.6% गुणवत्ता नियंत्रण में उत्तीर्ण हुए।रीडिंग को तब BLASTN और एनसीबीआई बाइवाल्व डेटाबेस (छवि S1, अनुपूरक सूचना) का उपयोग करके स्वयं और गैर-स्वयं स्रोतों के अनुसार वर्गीकृत किया गया था।
मनुष्यों में, परमाणु और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए दोनों को रक्तप्रवाह में छोड़ा जा सकता है [38]।हालाँकि, वर्तमान अध्ययन में, मसल्स के परमाणु जीनोमिक डीएनए का विस्तार से वर्णन करना संभव नहीं था, यह देखते हुए कि ए. एट्रा जीनोम को अनुक्रमित या वर्णित नहीं किया गया है।हालाँकि, हम बाइवेल्व लाइब्रेरी (चित्र। S2, अनुपूरक सूचना) का उपयोग करके अपने स्वयं के मूल के कई ccfDNA टुकड़ों की पहचान करने में सक्षम थे।हमने उन ए. एट्रा जीनों के निर्देशित पीसीआर प्रवर्धन द्वारा अपने स्वयं के मूल के डीएनए टुकड़ों की उपस्थिति की भी पुष्टि की, जिन्हें अनुक्रमित किया गया था (चित्र 3)।इसी प्रकार, यह देखते हुए कि ए. अत्रा का माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम सार्वजनिक डेटाबेस में उपलब्ध है, कोई ए. अत्रा के हेमोलिम्फ में माइटोकॉन्ड्रियल सीसीएफडीएनए अंशों की उपस्थिति के प्रमाण पा सकता है।माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए अंशों की उपस्थिति की पुष्टि पीसीआर प्रवर्धन (चित्र 3) द्वारा की गई थी।
पीसीआर द्वारा प्रवर्धित ए. अत्रा (लाल बिंदु - स्टॉक संख्या: SRX5705969) और एम. प्लैटेंसिस (नीले बिंदु - स्टॉक संख्या: SRX5705968) के हेमोलिम्फ में विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल जीन मौजूद थे।ब्रेटन एट अल से अनुकूलित चित्र, 2011 बी ए. एट्रा से हेमोलिम्फ सतह पर तैरनेवाला का प्रवर्धन एफटीए पेपर पर संग्रहीत।पीसीआर मिश्रण युक्त पीसीआर ट्यूब में सीधे जोड़ने के लिए 3 मिमी पंच का उपयोग करें।
समुद्री जल में प्रचुर मात्रा में माइक्रोबियल सामग्री को देखते हुए, हमने शुरू में हेमोलिम्फ में माइक्रोबियल डीएनए अनुक्रमों के लक्षण वर्णन पर ध्यान केंद्रित किया।ऐसा करने के लिए, हम दो अलग-अलग रणनीतियों का उपयोग करते हैं।पहली रणनीति में क्रैकेन2 का उपयोग किया गया, जो एक एल्गोरिदम-आधारित अनुक्रम वर्गीकरण कार्यक्रम है जो BLAST और अन्य उपकरणों की तुलना में सटीकता के साथ माइक्रोबियल अनुक्रमों की पहचान कर सकता है [28]।6719 से अधिक रीड बैक्टीरिया मूल के थे, जबकि 124 और 64 क्रमशः आर्किया और वायरस से थे (चित्र 4)।सबसे प्रचुर मात्रा में जीवाणु डीएनए टुकड़े फर्मिक्यूट्स (46%), प्रोटीओबैक्टीरिया (27%), और बैक्टीरियाइडेट्स (17%) थे (चित्र 4ए)।यह वितरण समुद्री ब्लू मसल माइक्रोबायोम [39, 40] के पिछले अध्ययनों के अनुरूप है।गैमप्रोटोबैक्टीरिया प्रोटीनोबैक्टीरिया (44%) का मुख्य वर्ग था, जिसमें कई वाइब्रियोनेल्स (चित्र 4बी) शामिल थे।डीडीपीसीआर विधि ने ए. एट्रा हेमोलिम्फ (चित्र 4सी) [41] के ccfDNA में विब्रियो डीएनए अंशों की उपस्थिति की पुष्टि की।ccfDNA की जीवाणु उत्पत्ति के बारे में अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए, एक अतिरिक्त दृष्टिकोण अपनाया गया (चित्र S2, अनुपूरक सूचना)। इस मामले में, ओवरलैप किए गए रीड्स को पेयर-एंड रीड्स के रूप में इकट्ठा किया गया था और उन्हें BLASTN का उपयोग करके स्वयं (द्विवाल्व) या गैर-स्वयं मूल के रूप में वर्गीकृत किया गया था और 1e−3 का ई मान और >90% होमोलॉजी के साथ कटऑफ था। इस मामले में, ओवरलैप किए गए रीड्स को पेयर-एंड रीड्स के रूप में इकट्ठा किया गया था और उन्हें BLASTN का उपयोग करके स्वयं (द्विवाल्व) या गैर-स्वयं मूल के रूप में वर्गीकृत किया गया था और 1e−3 का ई मान और >90% होमोलॉजी के साथ कटऑफ था। этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парным и концами и были классифицированы как собственные (двустворчатые моллюс को) BLASTN और 1e-3 और отсеч использованием или чужие по происхождению с использованием ения с гомологией> 90%. इस मामले में, ओवरलैपिंग रीड्स को युग्मित-एंडेड रीड्स के रूप में एकत्र किया गया था और उन्हें BLASTN और 1e-3 के ई मान और >90% होमोलॉजी के साथ कटऑफ का उपयोग करके मूल (द्विवाल्व) या गैर-मूल के रूप में वर्गीकृत किया गया था।90% से अधिक लाभ प्राप्त करने के लिए BLASTN और 1e-3 की आवश्यकता होती है।值分类为自身（双壳类）或非自身来源。यदि आप ब्लास्टन से संपर्क करना चाहते हैं, तो ब्लास्टन से 1e-3 प्राप्त करें। > 90% से अधिक लोगों ने इसे स्वीकार नहीं किया है। этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парным концами и классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) ил और अधिक पढ़ें рога гомологии> 90%. इस मामले में, ओवरलैपिंग रीड्स को युग्मित-एंडेड रीड्स के रूप में एकत्र किया गया था और ई BLASTN और 1e-3 मानों और एक होमोलॉजी थ्रेशोल्ड> 90% का उपयोग करके स्वयं (द्विवाल्व) या गैर-मूल के रूप में वर्गीकृत किया गया था।चूंकि ए. एट्रा जीनोम को अभी तक अनुक्रमित नहीं किया गया है, इसलिए हमने मेगाहिट नेक्स्ट जेनरेशन सीक्वेंसिंग (एनजीएस) असेंबलर की डे नोवो असेंबली रणनीति का उपयोग किया।कुल 147,188 कंटिग्स की पहचान उत्पत्ति के आश्रित (द्विवाल्व) के रूप में की गई है।फिर इन कंटिग्स को BLASTN और BLASTX का उपयोग करके 1e-10 के ई-वैल्यू के साथ विस्फोटित किया गया।इस रणनीति ने हमें A. atra ccfDNA में मौजूद 482 गैर-द्विवाल्व अंशों की पहचान करने की अनुमति दी।इनमें से आधे से अधिक (57%) डीएनए टुकड़े बैक्टीरिया से प्राप्त किए गए थे, मुख्य रूप से गिल सिम्बियन्ट्स से, जिसमें सल्फोट्रोफिक सिम्बियन्ट्स और गिल सिम्बियन्ट्स सोलेम्या वेलम (चित्र 5) शामिल थे।
प्रकार के स्तर पर सापेक्ष बहुतायत.बी दो मुख्य फ़ाइला (फ़र्मिक्यूट्स और प्रोटीओबैक्टीरिया) की माइक्रोबियल विविधता।डीडीपीसीआर सी विब्रियो एसपीपी का प्रतिनिधि प्रवर्धन।A. तीन एट्रा हेमोलिम्फ में 16S rRNA जीन (नीला) के टुकड़े।
कुल 482 एकत्रित कंटिग्स का विश्लेषण किया गया।मेटागेनोमिक कॉन्टिग एनोटेशन (प्रोकैरियोट्स और यूकेरियोट्स) के वर्गीकरण वितरण की सामान्य प्रोफ़ाइल।BBLASTN और BLASTX द्वारा पहचाने गए जीवाणु डीएनए अंशों का विस्तृत वितरण।
क्रैकन2 विश्लेषण से यह भी पता चला कि मसल सीसीसीएफडीएनए में आर्कियल डीएनए टुकड़े शामिल थे, जिसमें यूरीआर्कियोटा (65%), क्रैनार्चियोटा (24%), और थौरमार्चियोटा (11%) (चित्र 6ए) के डीएनए टुकड़े शामिल थे।पहले कैलिफ़ोर्नियाई मसल्स के माइक्रोबियल समुदाय में पाए जाने वाले यूरीआर्कियोटा और क्रैनार्कियोटा से प्राप्त डीएनए टुकड़ों की उपस्थिति को आश्चर्य नहीं होना चाहिए [42]।हालाँकि यूरीआर्कियोटा अक्सर चरम स्थितियों से जुड़ा होता है, अब यह माना जाता है कि यूरीआर्कियोटा और क्रैनार्चियोटा दोनों समुद्री क्रायोजेनिक वातावरण में सबसे आम प्रोकैरियोट्स में से हैं [43, 44]।केर्गुएलन पठार [45] पर निचले रिसाव से व्यापक मीथेन रिसाव की हालिया रिपोर्ट और केर्गुएलन द्वीप समूह के तट पर देखे गए संभावित माइक्रोबियल मीथेन उत्पादन को देखते हुए, मसल्स में मीथेनोजेनिक सूक्ष्मजीवों की उपस्थिति आश्चर्यजनक नहीं है।
फिर हमारा ध्यान डीएनए वायरस की रीडिंग पर चला गया।हमारी सर्वोत्तम जानकारी के अनुसार, यह मसल्स की वायरस सामग्री का पहला ऑफ-टारगेट अध्ययन है।जैसा कि अपेक्षित था, हमें बैक्टीरियोफेज (कौडोविरालेस) के डीएनए टुकड़े मिले (चित्र 6बी)।हालाँकि, सबसे आम वायरल डीएनए न्यूक्लियोसाइटोवायरस के एक समूह से आता है, जिसे न्यूक्लियर साइटोप्लाज्मिक लार्ज डीएनए वायरस (एनसीएलडीवी) के रूप में भी जाना जाता है, जिसमें किसी भी वायरस का सबसे बड़ा जीनोम होता है।इस फ़ाइलम के भीतर, अधिकांश डीएनए अनुक्रम मिमिमिडोविरिडे (58%) और पॉक्सविरिडे (21%) परिवारों से संबंधित हैं, जिनके प्राकृतिक मेजबानों में कशेरुक और आर्थ्रोपोड शामिल हैं, जबकि इन डीएनए अनुक्रमों का एक छोटा हिस्सा ज्ञात वायरोलॉजिकल शैवाल से संबंधित है।समुद्री यूकेरियोटिक शैवाल को संक्रमित करता है।अनुक्रम पेंडोरा वायरस से भी प्राप्त किए गए थे, जो किसी भी ज्ञात वायरल जेनेरा के सबसे बड़े जीनोम आकार वाला विशाल वायरस है।दिलचस्प बात यह है कि हेमोलिम्फ सीसीएफडीएनए अनुक्रमण द्वारा निर्धारित वायरस से संक्रमित होने वाले मेजबानों की सीमा अपेक्षाकृत बड़ी थी (चित्रा एस 3, अनुपूरक सूचना)।इसमें ऐसे वायरस शामिल हैं जो बैकुलोविरिडे और इरिडोविरिडे जैसे कीड़ों को संक्रमित करते हैं, साथ ही ऐसे वायरस भी शामिल हैं जो अमीबा, शैवाल और कशेरुकियों को संक्रमित करते हैं।हमें पिथोवायरस साइबेरिकम जीनोम से मेल खाते अनुक्रम भी मिले।पिटोवायरस (जिन्हें "ज़ोंबी वायरस" भी कहा जाता है) को सबसे पहले साइबेरिया में 30,000 साल पुराने पर्माफ्रॉस्ट से अलग किया गया था [47]।इस प्रकार, हमारे परिणाम पिछली रिपोर्टों के अनुरूप हैं जो दर्शाती हैं कि इन वायरस की सभी आधुनिक प्रजातियाँ विलुप्त नहीं हैं [48] और ये वायरस दूरस्थ उपनगरीय समुद्री पारिस्थितिक तंत्र में मौजूद हो सकते हैं।
अंत में, हमने यह देखने के लिए परीक्षण किया कि क्या हम अन्य बहुकोशिकीय जानवरों के डीएनए टुकड़े पा सकते हैं।BLASTN और BLASTX द्वारा nt, nr और RefSeq लाइब्रेरीज़ (जीनोमिक और प्रोटीन) के साथ कुल 482 विदेशी संक्रामकों की पहचान की गई।हमारे परिणाम बताते हैं कि बहुकोशिकीय जानवरों के ccfDNA के विदेशी टुकड़ों में हड्डी की हड्डियों का डीएनए प्रमुख होता है (चित्र 5)।कीड़ों और अन्य प्रजातियों के डीएनए टुकड़े भी पाए गए हैं।डीएनए टुकड़ों के अपेक्षाकृत बड़े हिस्से की पहचान नहीं की गई है, संभवतः स्थलीय प्रजातियों की तुलना में जीनोमिक डेटाबेस में बड़ी संख्या में समुद्री प्रजातियों के कम प्रतिनिधित्व के कारण [49]।
वर्तमान पेपर में, हम एलबी अवधारणा को मसल्स पर लागू करते हैं, यह तर्क देते हुए कि हेमोलिम्फ सीसीएफडीएनए शॉट अनुक्रमण समुद्री तटीय पारिस्थितिक तंत्र की संरचना में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।विशेष रूप से, हमने पाया कि 1) मसल हेमोलिम्फ में अपेक्षाकृत बड़े (~1-5 केबी) परिसंचारी डीएनए टुकड़ों की अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता (माइक्रोग्राम स्तर) होती है;2) ये डीएनए टुकड़े स्वतंत्र और गैर-स्वतंत्र दोनों हैं 3) इन डीएनए टुकड़ों के विदेशी स्रोतों में, हमें बैक्टीरिया, आर्कियल और वायरल डीएनए, साथ ही अन्य बहुकोशिकीय जानवरों के डीएनए मिले;4) हेमोलिम्फ में इन विदेशी ccfDNA अंशों का संचय तेजी से होता है और मसल्स की आंतरिक फ़िल्टरिंग गतिविधि में योगदान देता है।निष्कर्ष में, हमारा अध्ययन दर्शाता है कि एलबी की अवधारणा, जिसे अब तक मुख्य रूप से बायोमेडिसिन के क्षेत्र में लागू किया गया है, ज्ञान के एक समृद्ध लेकिन अज्ञात स्रोत को कूटबद्ध करती है जिसका उपयोग प्रहरी प्रजातियों और उनके पर्यावरण के बीच बातचीत को बेहतर ढंग से समझने के लिए किया जा सकता है।
प्राइमेट्स के अलावा, चूहों, कुत्तों, बिल्लियों और घोड़ों सहित स्तनधारियों में ccfDNA अलगाव की सूचना मिली है [50, 51, 52]।हालाँकि, हमारी जानकारी के अनुसार, हमारा अध्ययन एक खुली परिसंचरण प्रणाली के साथ समुद्री प्रजातियों में ccfDNA का पता लगाने और अनुक्रमण की रिपोर्ट करने वाला पहला है।मसल्स की यह संरचनात्मक विशेषता और फ़िल्टरिंग क्षमता, कम से कम आंशिक रूप से, अन्य प्रजातियों की तुलना में परिसंचारी डीएनए टुकड़ों की विभिन्न आकार की विशेषताओं को समझा सकती है।मनुष्यों में, रक्त में घूमने वाले अधिकांश डीएनए टुकड़े 150 से 200 बीपी के आकार के छोटे टुकड़े होते हैं।167 बीपी के अधिकतम शिखर के साथ [34,53]।डीएनए टुकड़ों का एक छोटा लेकिन महत्वपूर्ण हिस्सा 300 और 500 बीपी के आकार के बीच है, और लगभग 5% 900 बीपी से अधिक लंबे हैं।[54].इस आकार के वितरण का कारण यह है कि प्लाज्मा में ccfDNA का मुख्य स्रोत कोशिका मृत्यु के परिणामस्वरूप होता है, या तो कोशिका मृत्यु के कारण या स्वस्थ व्यक्तियों में परिसंचारी हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के परिगलन के कारण या कैंसर रोगियों में ट्यूमर कोशिकाओं के एपोप्टोसिस के कारण (जिसे परिसंचारी ट्यूमर डीएनए के रूप में जाना जाता है)।, सीटीडीएनए)।हेमोलिम्फ सीसीएफडीएनए का आकार वितरण जो हमने मसल्स में पाया, 1000 से 5000 बीपी तक था, यह सुझाव देता है कि मसल्स सीसीएफडीएनए की एक अलग उत्पत्ति है।यह एक तार्किक परिकल्पना है, क्योंकि मसल्स में अर्ध-खुली संवहनी प्रणाली होती है और वे माइक्रोबियल जीनोमिक डीएनए की उच्च सांद्रता वाले समुद्री जलीय वातावरण में रहते हैं।वास्तव में, बहिर्जात डीएनए का उपयोग करने वाले हमारे प्रयोगशाला प्रयोगों से पता चला है कि मसल्स समुद्री जल में डीएनए के टुकड़े जमा करते हैं, कम से कम कुछ घंटों के बाद सेलुलर अवशोषण और/या जारी और/या विभिन्न संगठनों में संग्रहीत होने के बाद वे नष्ट हो जाते हैं।कोशिकाओं (प्रोकैरियोटिक और यूकेरियोटिक दोनों) की दुर्लभता को देखते हुए, इंट्रावाल्वुलर डिब्बों के उपयोग से स्व-स्रोतों के साथ-साथ विदेशी स्रोतों से ccfDNA की मात्रा कम हो जाएगी।द्विवार्षिक जन्मजात प्रतिरक्षा के महत्व और परिसंचारी फागोसाइट्स की बड़ी संख्या को ध्यान में रखते हुए, हमने आगे अनुमान लगाया कि विदेशी सीसीएफडीएनए भी परिसंचारी फागोसाइट्स में समृद्ध है जो सूक्ष्मजीवों और/या सेलुलर मलबे के अंतर्ग्रहण पर विदेशी डीएनए जमा करते हैं।कुल मिलाकर, हमारे परिणाम बताते हैं कि बाइवेल्व हेमोलिम्फ सीसीएफडीएनए आणविक जानकारी का एक अद्वितीय भंडार है और एक प्रहरी प्रजाति के रूप में उनकी स्थिति को मजबूत करता है।
हमारा डेटा बताता है कि बैक्टीरिया-व्युत्पन्न हेमोलिम्फ ccfDNA टुकड़ों का अनुक्रमण और विश्लेषण मेजबान बैक्टीरिया वनस्पतियों और आसपास के समुद्री पारिस्थितिकी तंत्र में मौजूद बैक्टीरिया के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है।शॉट अनुक्रमण तकनीकों से कमेंसल बैक्टीरिया ए. एट्रा गिल के अनुक्रमों का पता चला है जो कि संदर्भ पुस्तकालय पूर्वाग्रह के कारण पारंपरिक 16एस आरआरएनए पहचान विधियों का उपयोग करने पर छूट गए होते।वास्तव में, केर्गुएलन में एक ही मसल परत में एम. प्लैटेंसिस से एकत्र किए गए एलबी डेटा के हमारे उपयोग से पता चला कि गिल से जुड़े जीवाणु सहजीवन की संरचना दोनों मसल प्रजातियों (छवि एस 4, अनुपूरक सूचना) के लिए समान थी।आनुवंशिक रूप से भिन्न दो मसल्स की यह समानता केर्गुएलन के ठंडे, सल्फ्यूरस और ज्वालामुखीय भंडारों में जीवाणु समुदायों की संरचना को दर्शा सकती है [55, 56, 57, 58]।पोर्ट-ऑ-फ्रांस के तट जैसे बायोटर्बेटेड तटीय क्षेत्रों [59] से मसल्स की कटाई करते समय सल्फर-कम करने वाले सूक्ष्मजीवों के उच्च स्तर का अच्छी तरह से वर्णन किया गया है।एक और संभावना यह है कि कमेंसल मसल्स वनस्पतियां क्षैतिज संचरण से प्रभावित हो सकती हैं [60, 61]।समुद्री पर्यावरण, समुद्र तल की सतह और मसल्स में सहजीवी बैक्टीरिया की संरचना के बीच संबंध निर्धारित करने के लिए अधिक शोध की आवश्यकता है।ये अध्ययन वर्तमान में चल रहे हैं।
हेमोलिम्फ सीसीएफडीएनए की लंबाई और एकाग्रता, इसकी शुद्धि में आसानी, और तेजी से शॉटगन अनुक्रमण की अनुमति देने के लिए उच्च गुणवत्ता, समुद्री तटीय पारिस्थितिक तंत्र में जैव विविधता का आकलन करने के लिए मसल्स सीसीएफडीएनए का उपयोग करने के कई फायदों में से कुछ हैं।यह दृष्टिकोण किसी दिए गए पारिस्थितिकी तंत्र में वायरल समुदायों (वाइरोम्स) को चिह्नित करने के लिए विशेष रूप से प्रभावी है [62, 63]।बैक्टीरिया, आर्किया और यूकेरियोट्स के विपरीत, वायरल जीनोम में 16S अनुक्रम जैसे फ़ाइलोजेनेटिक रूप से संरक्षित जीन नहीं होते हैं।हमारे परिणाम दर्शाते हैं कि मसल्स जैसी सूचक प्रजातियों से तरल बायोप्सी का उपयोग अपेक्षाकृत बड़ी संख्या में सीसीएफडीएनए वायरस के टुकड़ों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो आमतौर पर तटीय समुद्री पारिस्थितिक तंत्र में रहने वाले मेजबानों को संक्रमित करने के लिए जाने जाते हैं।इसमें प्रोटोजोआ, आर्थ्रोपोड, कीड़े, पौधों और जीवाणु वायरस (उदाहरण के लिए, बैक्टीरियोफेज) को संक्रमित करने के लिए जाने जाने वाले वायरस शामिल हैं।एक समान वितरण तब पाया गया जब हमने केर्गुएलन में एक ही मसल परत में एकत्रित नीले मसल्स (एम. प्लैटेंसिस) के हेमोलिम्फ सीसीएफडीएनए विरोम की जांच की (तालिका एस2, अनुपूरक सूचना)।सीसीएफडीएनए का शॉटगन अनुक्रमण वास्तव में मनुष्यों या अन्य प्रजातियों के वायरोम के अध्ययन में गति प्राप्त करने वाला एक नया दृष्टिकोण है [21, 37, 64]।यह दृष्टिकोण विशेष रूप से डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए वायरस का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है, क्योंकि सभी डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए वायरस के बीच एक भी जीन संरक्षित नहीं है, जो बाल्टीमोर में वायरस के सबसे विविध और व्यापक वर्ग का प्रतिनिधित्व करता है [65]।हालाँकि इनमें से अधिकांश वायरस अवर्गीकृत हैं और उनमें वायरल दुनिया के पूरी तरह से अज्ञात हिस्से से वायरस शामिल हो सकते हैं [66], हमने पाया कि मसल्स ए. अत्रा और एम. प्लैटेंसिस के वाइरोम्स और होस्ट रेंज दो प्रजातियों के बीच आते हैं।इसी प्रकार (चित्र S3, अतिरिक्त जानकारी देखें)।यह समानता आश्चर्यजनक नहीं है, क्योंकि यह पर्यावरण में मौजूद डीएनए के अवशोषण में चयनात्मकता की कमी को दर्शा सकती है।आरएनए विरोम को चिह्नित करने के लिए शुद्ध आरएनए का उपयोग करके भविष्य के अध्ययन की वर्तमान में आवश्यकता है।
हमारे अध्ययन में, हमने कोवार्स्की और उनके सहयोगियों [37] के काम से अनुकूलित एक बहुत ही कठोर पाइपलाइन का उपयोग किया, जिन्होंने देशी ccfDNA की असेंबली से पहले और बाद में पूल किए गए रीड्स और कॉनटिग्स को दो-चरणीय विलोपन का उपयोग किया, जिसके परिणामस्वरूप अनमैप्ड रीड्स का उच्च अनुपात प्राप्त हुआ।इसलिए, हम इस बात से इंकार नहीं कर सकते हैं कि इनमें से कुछ अनमैप्ड रीड्स का अभी भी अपना मूल हो सकता है, मुख्यतः क्योंकि हमारे पास इस मसल प्रजाति के लिए कोई संदर्भ जीनोम नहीं है।हमने इस पाइपलाइन का भी उपयोग किया क्योंकि हम स्वयं और गैर-स्वयं रीड के बीच के चिमेरों और इलुमिना MiSeq PE75 द्वारा उत्पन्न रीड लंबाई के बारे में चिंतित थे।अधिकांश अज्ञात रीडिंग का एक अन्य कारण यह है कि अधिकांश समुद्री रोगाणुओं, विशेष रूप से केर्गुएलन जैसे दूरदराज के क्षेत्रों में, की व्याख्या नहीं की गई है।हमने मानव ccfDNA के समान ccfDNA टुकड़े की लंबाई मानकर इलुमिना MiSeq PE75 का उपयोग किया।भविष्य के अध्ययनों के लिए, हमारे परिणामों से पता चलता है कि हेमोलिम्फ सीसीएफडीएनए मनुष्यों और/या स्तनधारियों की तुलना में अधिक लंबा है, हम लंबे सीसीएफडीएनए टुकड़ों के लिए अधिक उपयुक्त अनुक्रमण मंच का उपयोग करने की सलाह देते हैं।इस अभ्यास से गहन विश्लेषण के लिए अधिक संकेतों की पहचान करना बहुत आसान हो जाएगा।वर्तमान में अनुपलब्ध पूर्ण ए. एट्रा परमाणु जीनोम अनुक्रम प्राप्त करने से स्वयं और गैर-स्व स्रोतों से सीसीएफडीएनए के भेदभाव में काफी सुविधा होगी।यह देखते हुए कि हमारे शोध ने मसल्स पर तरल बायोप्सी की अवधारणा को लागू करने की संभावना पर ध्यान केंद्रित किया है, हमें उम्मीद है कि चूंकि इस अवधारणा का उपयोग भविष्य के अनुसंधान में किया जाएगा, इसलिए मसल्स की माइक्रोबियल विविधता का अध्ययन करने के लिए इस पद्धति की क्षमता को बढ़ाने के लिए नए उपकरण और पाइपलाइन विकसित किए जाएंगे।समुद्री पारिस्थितिकी तंत्र.
एक गैर-आक्रामक क्लिनिकल बायोमार्कर के रूप में, ccfDNA का ऊंचा मानव प्लाज्मा स्तर विभिन्न बीमारियों, ऊतक क्षति और तनाव की स्थिति से जुड़ा हुआ है [67,68,69]।यह वृद्धि ऊतक क्षति के बाद अपने स्वयं के मूल के डीएनए टुकड़ों की रिहाई से जुड़ी है।हमने तीव्र गर्मी तनाव का उपयोग करके इस मुद्दे को संबोधित किया, जिसमें मसल्स को थोड़े समय के लिए 30 डिग्री सेल्सियस के तापमान के संपर्क में रखा गया था।हमने तीन स्वतंत्र प्रयोगों में तीन अलग-अलग प्रकार के मसल्स पर यह विश्लेषण किया।हालाँकि, हमें तीव्र ताप तनाव के बाद ccfDNA स्तर में कोई बदलाव नहीं मिला (चित्र S5, अतिरिक्त जानकारी देखें)।यह खोज, कम से कम आंशिक रूप से, इस तथ्य को स्पष्ट कर सकती है कि मसल्स में अर्ध-खुला परिसंचरण तंत्र होता है और उनकी उच्च फ़िल्टरिंग गतिविधि के कारण बड़ी मात्रा में विदेशी डीएनए जमा होता है।दूसरी ओर, कई अकशेरुकी जीवों की तरह, मसल्स, तनाव-प्रेरित ऊतक क्षति के प्रति अधिक प्रतिरोधी हो सकते हैं, जिससे उनके हेमोलिम्फ में सीसीएफडीएनए की रिहाई सीमित हो जाती है [70, 71]।
आज तक, जलीय पारिस्थितिक तंत्र में जैव विविधता के डीएनए विश्लेषण ने मुख्य रूप से पर्यावरणीय डीएनए (ईडीएनए) मेटाबार्कोडिंग पर ध्यान केंद्रित किया है।हालाँकि, जब प्राइमर का उपयोग किया जाता है तो यह विधि आमतौर पर जैव विविधता विश्लेषण में सीमित होती है।शॉटगन अनुक्रमण का उपयोग पीसीआर की सीमाओं और प्राइमर सेट के पक्षपातपूर्ण चयन को रोकता है।इस प्रकार, एक अर्थ में, हमारी विधि हाल ही में उपयोग की गई उच्च-थ्रूपुट ईडीएनए शॉटगन अनुक्रमण विधि के करीब है, जो सीधे खंडित डीएनए को अनुक्रमित करने और लगभग सभी जीवों का विश्लेषण करने में सक्षम है [72, 73]।हालाँकि, ऐसे कई बुनियादी मुद्दे हैं जो एलबी को मानक ईडीएनए तरीकों से अलग करते हैं।बेशक, ईडीएनए और एलबी के बीच मुख्य अंतर प्राकृतिक फिल्टर होस्ट का उपयोग है।ईडीएनए के अध्ययन के लिए प्राकृतिक फिल्टर के रूप में स्पंज और बाइवाल्व्स (ड्रेसेना एसपीपी) जैसी समुद्री प्रजातियों का उपयोग बताया गया है [74, 75]।हालाँकि, ड्रेइसेना के अध्ययन में ऊतक बायोप्सी का उपयोग किया गया जिससे डीएनए निकाला गया।एलबी से सीसीएफडीएनए के विश्लेषण के लिए ऊतक बायोप्सी, विशेष और कभी-कभी महंगे उपकरण और ईडीएनए या ऊतक बायोप्सी से जुड़े लॉजिस्टिक्स की आवश्यकता नहीं होती है।वास्तव में, हमने हाल ही में रिपोर्ट दी है कि एलबी से सीसीएफडीएनए को कोल्ड चेन बनाए रखे बिना एफटीए समर्थन के साथ संग्रहीत और विश्लेषण किया जा सकता है, जो दूरदराज के क्षेत्रों में अनुसंधान के लिए एक बड़ी चुनौती है [76]।तरल बायोप्सी से ccfDNA का निष्कर्षण भी सरल है और शॉटगन अनुक्रमण और पीसीआर विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाला डीएनए प्रदान करता है।ईडीएनए विश्लेषण से जुड़ी कुछ तकनीकी सीमाओं को देखते हुए यह एक बड़ा लाभ है [77]।नमूनाकरण विधि की सरलता और कम लागत भी दीर्घकालिक निगरानी कार्यक्रमों के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है।उनकी उच्च फ़िल्टरिंग क्षमता के अलावा, बाइवाल्व्स की एक और प्रसिद्ध विशेषता उनके बलगम की रासायनिक म्यूकोपॉलीसेकेराइड संरचना है, जो वायरस के अवशोषण को बढ़ावा देती है [78, 79]।यह किसी दिए गए जलीय पारिस्थितिकी तंत्र में जैव विविधता और जलवायु परिवर्तन के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए बाइवेल्व्स को एक आदर्श प्राकृतिक फ़िल्टर बनाता है।यद्यपि मेजबान-व्युत्पन्न डीएनए अंशों की उपस्थिति को ईडीएनए की तुलना में विधि की एक सीमा के रूप में देखा जा सकता है, लेकिन ईडीएनए की तुलना में ऐसे मूल सीसीएफडीएनए से जुड़ी लागत स्वास्थ्य अध्ययन के लिए उपलब्ध जानकारी की विशाल मात्रा के लिए एक साथ समझ में आती है।ऑफसेट होस्ट.इसमें मेजबान के जीनोम में एकीकृत वायरल अनुक्रमों की उपस्थिति शामिल है।यह मसल्स के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, बाइवाल्व्स में क्षैतिज रूप से प्रसारित ल्यूकेमिक रेट्रोवायरस की उपस्थिति को देखते हुए [80, 81]।ईडीएनए पर एलबी का एक अन्य लाभ यह है कि यह हेमोलिम्फ में रक्त कोशिकाओं को प्रसारित करने की फागोसाइटिक गतिविधि का फायदा उठाता है, जो सूक्ष्मजीवों (और उनके जीनोम) को घेरता है।फागोसाइटोसिस बाइवाल्व्स में रक्त कोशिकाओं का मुख्य कार्य है [82]।अंत में, विधि मसल्स की उच्च फ़िल्टरिंग क्षमता (समुद्री जल का औसत 1.5 लीटर/घंटा) और दो-दिवसीय परिसंचरण का लाभ उठाती है, जो समुद्री जल की विभिन्न परतों के मिश्रण को बढ़ाती है, जिससे विषम ईडीएनए को पकड़ने की अनुमति मिलती है।[83, 84]।इस प्रकार, मसल्स के पोषण, आर्थिक और पर्यावरणीय प्रभावों को देखते हुए मसल्स सीसीएफडीएनए विश्लेषण एक दिलचस्प तरीका है।मनुष्यों से एकत्र किए गए एलबी के विश्लेषण के समान, यह विधि बहिर्जात पदार्थों की प्रतिक्रिया में मेजबान डीएनए में आनुवंशिक और एपिजेनेटिक परिवर्तनों को मापने की संभावना भी खोलती है।उदाहरण के लिए, नैनोपोर अनुक्रमण का उपयोग करके देशी ccfDNA में जीनोम-वाइड मिथाइलेशन विश्लेषण करने के लिए तीसरी पीढ़ी की अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों की परिकल्पना की जा सकती है।इस प्रक्रिया को इस तथ्य से सुगम बनाया जाना चाहिए कि मसल सीसीएफडीएनए टुकड़ों की लंबाई लंबे समय से पढ़े जाने वाले अनुक्रमण प्लेटफार्मों के साथ आदर्श रूप से संगत है जो रासायनिक परिवर्तनों की आवश्यकता के बिना एकल अनुक्रमण से जीनोम-वाइड डीएनए मिथाइलेशन विश्लेषण की अनुमति देती है। 85,86] यह एक दिलचस्प संभावना है, क्योंकि यह दिखाया गया है कि डीएनए मिथाइलेशन पैटर्न पर्यावरणीय तनाव की प्रतिक्रिया को दर्शाते हैं और कई पीढ़ियों तक बने रहते हैं।इसलिए, यह जलवायु परिवर्तन या प्रदूषकों के संपर्क में आने के बाद प्रतिक्रिया को नियंत्रित करने वाले अंतर्निहित तंत्र में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है [87]।हालाँकि, LB का उपयोग सीमाओं से रहित नहीं है।कहने की जरूरत नहीं है, इसके लिए पारिस्थितिकी तंत्र में संकेतक प्रजातियों की उपस्थिति की आवश्यकता होती है।जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, किसी दिए गए पारिस्थितिकी तंत्र की जैव विविधता का आकलन करने के लिए एलबी का उपयोग करने के लिए एक कठोर जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन की भी आवश्यकता होती है जो स्रोत से डीएनए टुकड़ों की उपस्थिति को ध्यान में रखती है।एक अन्य बड़ी समस्या समुद्री प्रजातियों के लिए संदर्भ जीनोम की उपलब्धता है।आशा है कि समुद्री स्तनपायी जीनोम परियोजना और हाल ही में स्थापित फिश10k परियोजना [88] जैसी पहल भविष्य में इस तरह के विश्लेषण की सुविधा प्रदान करेगी।समुद्री फिल्टर-फीडिंग जीवों के लिए एलबी अवधारणा का अनुप्रयोग अनुक्रमण प्रौद्योगिकी में नवीनतम प्रगति के साथ भी संगत है, जो इसे पर्यावरणीय तनाव के जवाब में समुद्री आवासों के स्वास्थ्य के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करने के लिए मल्टी-ओम बायोमार्कर के विकास के लिए उपयुक्त बनाता है।
जीनोम अनुक्रमण डेटा को बायोप्रोजेक्ट्स SRR8924808 के तहत एनसीबीआई सीक्वेंस रीड आर्काइव https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 में जमा किया गया है।
ब्रिएर्ली एएस, किंग्सफोर्ड एमजे समुद्री जीवन और पारिस्थितिक तंत्र पर जलवायु परिवर्तन का प्रभाव।कोल जीवविज्ञान.2009;19: पी602-पी614।
गिस्सी ई, मानेया ई, माजारिस एडी, फ्रैशेट्टी एस, अल्म्पानिडोउ वी, बेविलाक्वा एस, एट अल।समुद्री पर्यावरण पर जलवायु परिवर्तन और अन्य स्थानीय तनावों के संयुक्त प्रभावों पर विचार करें।सामान्य वैज्ञानिक वातावरण.2021;755:142564।
कैरेला एफ, एंटुओफर्मो ई, फ़रीना एस, सलाती एफ, मंडास डी, प्राडो पी, एट अल।).मार्च के पहले का विज्ञान.2020;7:48.
सेरोंट एल, निकैस्त्रो सीआर, ज़ार्डी जीआई, गोबरविले ई. बार-बार होने वाली गर्मी के तनाव की स्थिति के तहत कम गर्मी सहनशीलता, ब्लू मसल्स की गर्मियों में उच्च मृत्यु दर की व्याख्या करती है।वैज्ञानिक रिपोर्ट 2019;9:17498.
फे एसबी, सीपिएल्स्की एएम, नुस्ले एस, सर्वेंट्स-योशिदा के, ह्वान जेएल, ह्यूबर ईआर, एट अल।पशुओं की मृत्यु की आवृत्ति, कारण और सीमा में हाल के परिवर्तन।प्रोक नेटल एकेड साइंस यूएसए।2015;112:1083-8.
स्कार्पा एफ, सन्ना डी, अज़ेना आई, मुगेट्टी डी, सेरुति एफ, होसैनी एस, एट अल।कई गैर-प्रजाति-विशिष्ट रोगजनकों के कारण पिन्ना नोबिलिस की बड़े पैमाने पर मृत्यु हो सकती है।ज़िंदगी।2020;10:238.
ब्रैडली एम, कॉउट्स एसजे, जेनकिंस ई, ओ'हारा टीएम।आर्कटिक जूनोटिक रोगों पर जलवायु परिवर्तन का संभावित प्रभाव।इंट जे सर्कम्पोलर स्वास्थ्य।2005;64:468-77.
बेयर जे., ग्रीन एनडब्ल्यू, ब्रूक्स एस., एलन आईजे, रुउस ए., गोमेज़ टी. एट अल।तटीय प्रदूषण निगरानी में सिग्नल जीव के रूप में ब्लू मसल्स (माइटिलस एडुलिस एसपीपी): एक समीक्षा।मार्च एनवायरन रेस 2017;130:338-65.
सिरावेग्ना जी, मार्सोनी एस, सिएना एस, बार्डेली ए. कैंसर के उपचार में तरल बायोप्सी का एकीकरण।नेट रेव क्लीन ओंकोल।2017;14:531-48.
वान जेसीएम, मैसी सी, गार्सिया-कोरबाचो जे, मौलीरे एफ, ब्रेंटन जेडी, कैल्डास सी, एट अल।तरल बायोप्सी परिपक्वता: ट्यूमर डीएनए को प्रसारित करने की अनुमति देता है।नेट रेव कैंसर.2017;17:223–38.
मंडेल पी., मेटाइस पी. मानव प्लाज्मा में न्यूक्लिक एसिड।सोक बायोल सहायक कंपनियों की बैठक का विवरण।1948;142:241-3.
ब्रोंखोर्स्ट ए.जे., उंगेरर डब्ल्यू, होल्डेनरीडर एस. कैंसर के उपचार के लिए आणविक मार्कर के रूप में कोशिका-मुक्त डीएनए की एक नई भूमिका।बायोमोलर विश्लेषण की मात्रा का निर्धारण।2019;17:100087.
इग्नाटियाडिस एम., स्लेज जीडब्ल्यू, जेफरी एसएस लिक्विड बायोप्सी क्लिनिक में प्रवेश करती है - कार्यान्वयन के मुद्दे और भविष्य की चुनौतियाँ।नेट रेव क्लिन ओंकोल।2021;18:297-312.
लो वाईएम, कॉर्बेटा एन., चेम्बरलेन पीएफ, राय डब्ल्यू., सार्जेंट आईएल, रेडमैन सीडब्ल्यू और अन्य।भ्रूण का डीएनए मातृ प्लाज्मा और सीरम में मौजूद होता है।लैंसेट.1997;350:485-7.
मुफ़र्रे एमएन, वोंग आरजे, शॉ जीएम, स्टीवेन्सन डीके, क्वेक एसआर गर्भावस्था के दौरान महिलाओं के रक्त में बाह्य कोशिकीय आरएनए का उपयोग करके गर्भावस्था के दौरान और इसकी जटिलताओं का अध्ययन करते हैं।डोपेडियाट्रिक्स।2020;8:605219।
ओलेरिच एम, शेरवुड के, केओन पी, शुट्ज़ ई, बेक जे, स्टेगबाउर जे, एट अल।तरल बायोप्सी: किडनी ग्राफ्ट में एलोजेनिक घावों का पता लगाने के लिए दाता कोशिका-मुक्त डीएनए का उपयोग किया जाता है।नेट रेव नेफ्रोल.2021;17:591-603.
जुआन एफसी, लो वाईएम प्रीनेटल डायग्नोस्टिक्स में नवाचार: मातृ प्लाज्मा जीनोम अनुक्रमण।अन्ना एम.डी.2016;67:419-32.
गु डब्ल्यू, डेंग एक्स, ली एम, सुकु वाईडी, अरेवलो एस, स्ट्राइके डी, एट अल।संक्रमित शारीरिक तरल पदार्थों की अगली पीढ़ी के मेटागेनोमिक अनुक्रमण के साथ तेजी से रोगज़नक़ का पता लगाना।नेट मेडिसिन.2021;27:115-24.