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लिक्विड बायोप्सी (LB) एक ऐसी अवधारणा है जो बायोमेडिकल क्षेत्र में तेजी से लोकप्रिय हो रही है। यह अवधारणा मुख्य रूप से परिसंचारी बाह्यकोशिकीय DNA (ccfDNA) के टुकड़ों का पता लगाने पर आधारित है, जो मुख्य रूप से विभिन्न ऊतकों में कोशिका मृत्यु के बाद छोटे टुकड़ों के रूप में जारी किए जाते हैं। इन टुकड़ों का एक छोटा हिस्सा विदेशी (विदेशी) ऊतकों या जीवों से उत्पन्न होता है। वर्तमान कार्य में, हमने इस अवधारणा को मसल्स पर लागू किया है, जो एक प्रहरी प्रजाति है जो अपनी उच्च समुद्री जल निस्पंदन क्षमता के लिए जानी जाती है। हम समुद्री तटीय पारिस्थितिकी प्रणालियों की जैव विविधता के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए विभिन्न स्रोतों से पर्यावरणीय DNA टुकड़ों को पकड़ने के लिए प्राकृतिक फ़िल्टर के रूप में कार्य करने के लिए मसल्स की क्षमता का उपयोग करते हैं। हमारे परिणाम दिखाते हैं कि मसल्स हेमोलिम्फ में DNA टुकड़े होते हैं जो आकार में बहुत भिन्न होते हैं, 1 से 5 kb तक। शॉटगन अनुक्रमण ने दिखाया कि बड़ी संख्या में DNA टुकड़े विदेशी माइक्रोबियल मूल के हैं। उनमें से, हमें बैक्टीरिया, आर्किया और वायरस से DNA टुकड़े मिले, जिनमें वायरस शामिल हैं जो तटीय समुद्री पारिस्थितिकी प्रणालियों में आमतौर पर पाए जाने वाले विभिन्न मेजबानों को संक्रमित करने के लिए जाने जाते हैं। निष्कर्ष में, हमारा अध्ययन दर्शाता है कि मसल्स पर लागू एलबी की अवधारणा समुद्री तटीय पारिस्थितिकी प्रणालियों में सूक्ष्मजीव विविधता के बारे में ज्ञान का एक समृद्ध लेकिन अभी तक अज्ञात स्रोत प्रस्तुत करती है।
समुद्री पारिस्थितिक तंत्र की जैव विविधता पर जलवायु परिवर्तन (सीसी) का प्रभाव अनुसंधान का एक तेजी से बढ़ता हुआ क्षेत्र है। ग्लोबल वार्मिंग न केवल महत्वपूर्ण शारीरिक तनावों का कारण बनती है, बल्कि समुद्री जीवों की तापीय स्थिरता की विकासवादी सीमाओं को भी धक्का देती है, जिससे कई प्रजातियों के आवास प्रभावित होते हैं, जिससे उन्हें अधिक अनुकूल स्थितियों की तलाश करने के लिए प्रेरित किया जाता है [1, 2]। मेटाजोअन की जैव विविधता को प्रभावित करने के अलावा, सीसी मेजबान-माइक्रोबियल इंटरैक्शन के नाजुक संतुलन को बाधित करता है। यह माइक्रोबियल डिस्बैक्टीरियोसिस समुद्री पारिस्थितिक तंत्र के लिए एक गंभीर खतरा पैदा करता है क्योंकि यह समुद्री जीवों को संक्रामक रोगजनकों के लिए अधिक संवेदनशील बनाता है [3, 4]। यह माना जाता है कि एसएस बड़े पैमाने पर मौतों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जो वैश्विक समुद्री पारिस्थितिक तंत्र के प्रबंधन के लिए एक गंभीर समस्या है [5, 6]। समुद्री पारिस्थितिक तंत्रों पर सीसी के प्रभावों की निगरानी के लिए व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं। आश्चर्य की बात नहीं है कि उनके स्वास्थ्य की निगरानी के लिए अपेक्षाकृत बड़ी संख्या में बायोमार्कर विकसित किए गए हैं, जो अक्सर एंजाइमेटिक गतिविधि या सेलुलर कार्यों जैसे सेल व्यवहार्यता और फागोसाइटिक गतिविधि [8] के आधार पर कार्यात्मक बायोमार्कर को शामिल करने वाले दो-स्तरीय दृष्टिकोण का उपयोग करते हैं। इन विधियों में विशिष्ट दबाव संकेतकों की एकाग्रता का माप भी शामिल है जो बड़ी मात्रा में समुद्री पानी के अवशोषण के बाद नरम ऊतकों में जमा होते हैं। हालांकि, बाइवेल्व्स की उच्च निस्पंदन क्षमता और अर्ध-खुली परिसंचरण प्रणाली, तरल बायोप्सी (एलबी) की अवधारणा का उपयोग करके नए हेमोलिम्फ बायोमार्कर विकसित करने का अवसर प्रदान करती है, जो रोगी प्रबंधन के लिए एक सरल और न्यूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण है। रक्त के नमूने [9, 10]। वास्तव में, मानव प्लाज्मा में परिसंचारी डीएनए की उपस्थिति 20वीं सदी के मध्य से ही ज्ञात है [11], लेकिन यह केवल हाल के वर्षों में है कि उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण विधियों के आगमन ने ccfDNA पर आधारित नैदानिक ​​निदान को जन्म दिया है। इन परिसंचारी डीएनए टुकड़ों की उपस्थिति आंशिक रूप से कोशिका मृत्यु के बाद जीनोमिक डीएनए (परमाणु और माइटोकॉन्ड्रियल) की निष्क्रिय रिहाई के कारण होती है। स्वस्थ व्यक्तियों में, सीसीएफडीएनए की सांद्रता सामान्यतः कम (<10 एनजी/एमएल) होती है, लेकिन विभिन्न विकृतियों से पीड़ित या तनावग्रस्त रोगियों में यह 5-10 गुना तक बढ़ सकती है, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक क्षति होती है। स्वस्थ व्यक्तियों में, सीसीएफडीएनए की सांद्रता सामान्यतः कम (<10 एनजी/एमएल) होती है, लेकिन विभिन्न विकृतियों से पीड़ित या तनावग्रस्त रोगियों में यह 5-10 गुना तक बढ़ सकती है, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक क्षति होती है। У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но 5-10 दिनों में एक वर्ष से अधिक समय तक भुगतान किया जा सकता है उत्पाद विवरण: स्वस्थ लोगों में, सीसीसीडीएनए की सांद्रता सामान्य रूप से कम (<10 एनजी/एमएल) होती है, लेकिन विभिन्न विकृतियों वाले या तनावग्रस्त रोगियों में यह 5-10 गुना तक बढ़ सकती है, जिससे ऊतक क्षति होती है।在健康个体中,ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损伤。， ccfdna 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者中 可 增加 5-10 倍 , 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤हाँКонцентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут 5-10 दिनों में एक वर्ष से कम समय में एक वर्ष से अधिक समय तक भुगतान किया जा सकता है стрессом, что приводит к повреждению тканей. स्वस्थ व्यक्तियों में सीसीएफडीएनए सांद्रता आमतौर पर कम (<10 एनजी/एमएल) होती है, लेकिन विभिन्न विकृति या तनाव वाले रोगियों में 5-10 गुना बढ़ सकती है, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक क्षति होती है।सीसीएफडीएनए टुकड़ों का आकार व्यापक रूप से भिन्न होता है, लेकिन आमतौर पर 150 से 200 बीपी तक होता है। [12]। स्व-व्युत्पन्न सीसीएफडीएनए का विश्लेषण, यानी सामान्य या रूपांतरित मेजबान कोशिकाओं से सीसीएफडीएनए, का उपयोग परमाणु और/या माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम में मौजूद आनुवंशिक और एपिजेनेटिक परिवर्तनों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, जिससे चिकित्सकों को विशिष्ट आणविक-लक्षित उपचारों का चयन करने में मदद मिलती है [13]। हालांकि, सीसीएफडीएनए विदेशी स्रोतों से प्राप्त किया जा सकता है जैसे गर्भावस्था के दौरान भ्रूण कोशिकाओं से या प्रत्यारोपित अंगों से सीसीएफडीएनए [14,15,16,17]। सीसीएफडीएनए एक संक्रामक एजेंट (विदेशी) के न्यूक्लिक एसिड की उपस्थिति का पता लगाने के लिए जानकारी का एक महत्वपूर्ण स्रोत भी है हाल के अध्ययनों से वास्तव में पता चला है कि मानव रक्त में जानकारी का एक समृद्ध स्रोत होता है जिसका उपयोग वायरल और बैक्टीरियल रोगजनकों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, और मानव प्लाज्मा में पाए जाने वाले ccfDNA का लगभग 1% विदेशी मूल का होता है [19]। ये अध्ययन प्रदर्शित करते हैं कि ccfDNA विश्लेषण का उपयोग करके किसी जीव के परिसंचारी माइक्रोबायोम की जैव विविधता का आकलन किया जा सकता है। हालाँकि, हाल ही तक, इस अवधारणा का उपयोग केवल मनुष्यों में और कुछ हद तक अन्य कशेरुकियों में किया जाता था [20, 21]।
वर्तमान पत्र में, हम औलाकोमाया अत्रा के सीसीएफडीएनए का विश्लेषण करने के लिए एलबी क्षमता का उपयोग करते हैं, जो आमतौर पर उप-अंटार्कटिक केर्गुएलन द्वीप समूह में पाई जाने वाली दक्षिणी प्रजाति है, जो एक बड़े पठार के ऊपर द्वीपों का एक समूह है जो 35 मिलियन साल पहले ज्वालामुखी विस्फोट से बना था। इन विट्रो प्रायोगिक प्रणाली का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि समुद्री जल में डीएनए टुकड़े जल्दी से मसल्स द्वारा उठाए जाते हैं और हीमोलिम्फ कम्पार्टमेंट में प्रवेश करते हैं। शॉटगन अनुक्रमण से पता चला है कि मसल्स हीमोलिम्फ सीसीएफडीएनए में अपने स्वयं के और गैर-स्वयं मूल के डीएनए टुकड़े होते हैं, जिसमें सहजीवी बैक्टीरिया और ठंडे ज्वालामुखीय समुद्री तटीय पारिस्थितिक तंत्रों के विशिष्ट बायोम से डीएनए टुकड़े शामिल हैं। निष्कर्ष में, हमारा अध्ययन दर्शाता है कि समुद्री पारिस्थितिकी तंत्र में समृद्ध जीनोमिक भंडार उत्पन्न करने के लिए एलबी अवधारणा को समुद्री अकशेरुकी जीवों पर सफलतापूर्वक लागू किया जा सकता है।
वयस्क (55-70 मिमी लंबे) मायटिलस प्लैटेंसिस (एम. प्लैटेंसिस) और औलाकोमा अत्रा (ए. अत्रा) को दिसंबर 2018 में पोर्ट-ऑ-फ्रांस (049°21.235 एस, 070°13.490 ई) के केर्गुएलन द्वीप के इंटरटाइडल चट्टानी तटों से एकत्र किया गया था। अन्य वयस्क नीले मसल्स (मायटिलस एसपीपी) को एक वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता (पीईआई मसल किंग इंक, प्रिंस एडवर्ड आइलैंड, कनाडा) से प्राप्त किया गया और एक तापमान नियंत्रित (4 डिग्री सेल्सियस) वातित टैंक में रखा गया जिसमें 10-20 लीटर 32‰ ​​कृत्रिम नमकीन पानी था। (कृत्रिम समुद्री नमक रीफ क्रिस्टल, इंस्टेंट ओशन, वर्जीनिया, यूएसए)।
इस कार्यक्रम के लिए एक मुफ्त ओपन एक्सेस प्रोटोकॉल ऑनलाइन उपलब्ध है (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1)। संक्षेप में, एलबी हेमोलिम्फ को अपहरणकर्ता की मांसपेशियों से एकत्र किया गया था जैसा कि वर्णित है [22]। हेमोलिम्फ को 3 मिनट के लिए 1200 × जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा स्पष्ट किया गया था, उपयोग करने तक सतह पर तैरनेवाला जम गया था (-20 डिग्री सेल्सियस)। सीएफडीएनए के अलगाव और शुद्धिकरण के लिए, नमूने (1.5-2.0 मिली) को पिघलाया गया और निर्माता के निर्देशों के अनुसार न्यूक्लियोस्नैप सीएफडीएनए किट (मैकहेरी-नेगल, बेथलेहन, पीए) का उपयोग करके संसाधित किया गया। सीसीएफडीएनए को आगे के विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था। कुछ प्रयोगों में, सीसीएफडीएनए को क्यूआईएएमपी डीएनए इन्वेस्टिगेटर किट (क्यूआईएजीईएन, टोरंटो, ओंटारियो, कनाडा) का उपयोग करके अलग और शुद्ध किया गया था। शुद्ध डीएनए को मानक पिकोग्रीन परख का उपयोग करके मात्राबद्ध किया गया। पृथक ccfDNA के खंड वितरण का विश्लेषण एक उच्च संवेदनशीलता डीएनए किट का उपयोग करके एजिलेंट 2100 बायोएनालाइज़र (एजिलेंट टेक्नोलॉजीज इंक, सांता क्लारा, सीए) का उपयोग करके केशिका वैद्युतकणसंचलन द्वारा किया गया था। निर्माता के निर्देशों के अनुसार ccfDNA नमूने के 1 µl का उपयोग करके परख की गई।
हेमोलिम्फ ccfDNA अंशों की अनुक्रमण के लिए, जीनोम क्यूबेक (मॉन्ट्रियल, क्यूबेक, कनाडा) ने इल्युमिना MiSeq PE75 किट के इल्युमिना DNA मिक्स किट का उपयोग करके शॉटगन लाइब्रेरी तैयार की। एक मानक एडाप्टर (BioO) का उपयोग किया गया था। रॉ डेटा फ़ाइलें NCBI अनुक्रम रीड आर्काइव (SRR8924808 और SRR8924809) से उपलब्ध हैं। बुनियादी रीडिंग गुणवत्ता का मूल्यांकन FastQC [23] का उपयोग करके किया गया था। ट्रिमोमैटिक [24] का उपयोग क्लिपिंग एडेप्टर और खराब गुणवत्ता वाले रीड के लिए किया गया है। जोड़े गए सिरों के साथ शॉटगन रीड को बेमेल से बचने के लिए 20 बीपी के न्यूनतम ओवरलैप के साथ लंबे सिंगल रीड में फ्लैश मर्ज किया गया था [25]। मर्ज किए गए रीड्स को एक बाइवेल्व एनसीबीआई टैक्सोनॉमी डेटाबेस (ई वैल्यू < 1e−3 और 90% होमोलॉजी) का उपयोग करके BLASTN के साथ एनोटेट किया गया था, और कम जटिलता वाले अनुक्रमों की मास्किंग DUST [26] का उपयोग करके की गई थी। मर्ज किए गए रीड्स को एक बाइवेल्व एनसीबीआई टैक्सोनॉमी डेटाबेस (ई वैल्यू < 1e−3 और 90% होमोलॉजी) का उपयोग करके BLASTN के साथ एनोटेट किया गया था, और कम जटिलता वाले अनुक्रमों की मास्किंग DUST [26] का उपयोग करके की गई थी। BLASTN और использованием के बारे में अधिक जानें базы данных таксономии двустворчатых моллюсков एनसीबीआई (значение e < 1e-3 और 90% гомологии), एक маскирование последовательностей низкой сложности धूल का एक बड़ा हिस्सा धूल [26] है। एनसीबीआई बाइवल्व टैक्सोनॉमी डेटाबेस (ई वैल्यू < 1e-3 और 90% होमोलॉजी) का उपयोग करके पूल किए गए रीड्स को BLASTN के साथ एनोटेट किया गया था, और DUST [26] का उपयोग करके कम जटिलता अनुक्रम मास्किंग का प्रदर्शन किया गया था।使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 धूल [26]进行 复杂度 序列的。。。。 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽BLASTN और использованием के बारे में अधिक जानें таксономической базы данных двустворчатых моллюсков एनसीबीआई (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой धूल के ढेर पर धूल जमा करें [26]। पूल किए गए रीड्स को NCBI बाइवल्व टैक्सोनोमिक डेटाबेस (ई वैल्यू <1e-3 और 90% होमोलॉजी) का उपयोग करके BLASTN के साथ एनोटेट किया गया था, और DUST [26] का उपयोग करके कम जटिलता अनुक्रम मास्किंग का प्रदर्शन किया गया था।रीड्स को दो समूहों में विभाजित किया गया: बाइवाल्व अनुक्रमों से संबंधित (यहां स्व-रीड कहा जाता है) और असंबंधित (गैर-स्व-रीड)। दो समूहों को अलग-अलग MEGAHIT का उपयोग करके कंटिग्स [27] उत्पन्न करने के लिए इकट्ठा किया गया था। इस बीच, एलियन माइक्रोबायोम रीड्स के टैक्सोनोमिक वितरण को क्रैकन 2 [28] का उपयोग करके वर्गीकृत किया गया और गैलेक्सी [29, 30] पर क्रोना पाई चार्ट द्वारा ग्राफ़िक रूप से दर्शाया गया। हमारे प्रारंभिक प्रयोगों से इष्टतम किमर्स को किमर्स-59 निर्धारित किया गया था। अंतिम एनोटेशन के लिए BLASTN (बाइवेल्व NCBI डेटाबेस, e मान < 1e−10 और 60% होमोलॉजी) के साथ संरेखण द्वारा स्व कंटिग्स की पहचान की गई। अंतिम एनोटेशन के लिए BLASTN (बाइवेल्व NCBI डेटाबेस, e मान < 1e−10 और 60% होमोलॉजी) के साथ संरेखण द्वारा स्व कंटिग्स की पहचान की गई। इस लेख को पढ़ें сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсковNCBI, значение e <1e-10 और 60%) की कुल राशि एक वर्ष से अधिक है। अंतिम एनोटेशन के लिए BLASTN (NCBI बाइवल्व डेटाबेस, e मान <1e-10 और 60% होमोलॉजी) के साथ मिलान करके स्व-कॉन्टिग्स की पहचान की गई।BLASTN के लिए आवेदन करें (NCBI के लिए आवेदन पत्र देखें, e 值< 1e-10 和60% अधिक पढ़ेंBLASTN के लिए आवेदन करें (NCBI के लिए आवेदन पत्र देखें, e 值< 1e-10 和60% पिछले वर्ष की तुलना में एक वर्ष से अधिक समय तक ऋण प्राप्त करना BLASTN (NCBI для база данных база данных база данных для) पर एक नया भुगतान प्राप्त हुआ двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). इसके बाद BLASTN (NCBI बाइवेल्व डाटाबेस, e मान <1e-10 और 60% होमोलॉजी) के साथ मिलान करके अंतिम एनोटेशन के लिए सेल्फ-कॉन्टिग्स की पहचान की गई। समानांतर में, नॉनसेल्फ ग्रुप कंटिग्स को BLASTN (nt NCBI डेटाबेस, e मान < 1e−10 और 60% होमोलॉजी) के साथ एनोटेट किया गया था। समानांतर में, नॉनसेल्फ ग्रुप कंटिग्स को BLASTN (nt NCBI डेटाबेस, e मान < 1e−10 और 60% होमोलॉजी) के साथ एनोटेट किया गया था। अधिक पढ़ें помощью BLASTN (база данных ntNCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). समानांतर में, विदेशी समूह कंटिग्स को BLASTN (NT NCBI डेटाबेस, e मान <1e-10 और 60% होमोलॉजी) के साथ एनोटेट किया गया था।अधिक पढ़ेंअधिक पढ़ें अधिक पढ़ें анотированы с помощью BLASTN (база данных ntNCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). समानांतर में, गैर-स्व समूह कंटिग्स को BLASTN (एनटी एनसीबीआई डेटाबेस, ई मूल्य <1e-10 और 60% होमोलॉजी) के साथ एनोटेट किया गया था। BLASTX को nr और RefSeq प्रोटीन NCBI डेटाबेस (e मान < 1e−10 और 60% समरूपता) का उपयोग करके नॉनसेल्फ कंटिग्स पर भी आयोजित किया गया था। BLASTX को nr और RefSeq प्रोटीन NCBI डेटाबेस (e मान < 1e−10 और 60% समरूपता) का उपयोग करके नॉनसेल्फ कंटिग्स पर भी आयोजित किया गया था। BLASTX ने यूरोपियन यूनियन को एक नया समर्थन दिया है баз данных белка nr и RefSeq NCPI (значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX को nr और RefSeq NCBI प्रोटीन डेटाबेस (e मान < 1e-10 और 60% समरूपता) का उपयोग करके गैर-स्वयं कंटिग्स पर भी किया गया था।एनआर और रेफसेक के बारे में एनसीबीआई को ब्लास्टएक्स के बारे में अधिक जानकारी है < 1e-10 और 60% की छूट।एनआर और रेफसेक के बारे में एनसीबीआई को ब्लास्टएक्स के बारे में अधिक जानकारी है < 1e-10 और 60% की छूट। BLASTX ने एक मोबाइल फोन को एक दूसरे से जोड़ा है баз данных белка nr и RefSeq NCPI (значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX को nr और RefSeq NCBI प्रोटीन डेटाबेस (e मान <1e-10 और 60% समरूपता) का उपयोग करके गैर-स्वयं कंटिग्स पर भी किया गया था।गैर-स्व-कॉन्टिग्स के BLASTN और BLASTX पूल अंतिम कॉन्टिग्स का प्रतिनिधित्व करते हैं (पूरक फ़ाइल देखें)।
पीसीआर के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले प्राइमर्स तालिका एस1 में सूचीबद्ध हैं। सीसीएफडीएनए लक्ष्य जीन को बढ़ाने के लिए टैक डीएनए पॉलीमरेज़ (बायो बेसिक कनाडा, मार्खम, ओएन) का इस्तेमाल किया गया था। निम्नलिखित प्रतिक्रिया स्थितियों का उपयोग किया गया: 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण, 1 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए एनीलिंग तापमान निर्धारित करना, 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार, 35 चक्र, और अंत में 10 मिनट के भीतर 72 डिग्री सेल्सियस। पीसीआर उत्पादों को 95 वी पर SYBRTM सुरक्षित डीएनए जेल दाग (इंविट्रोजन, बर्लिंगटन, ओएन, कनाडा) युक्त एगरोज़ जैल (1.5%) में वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किया गया।
मसल्स (मायटिलस एसपीपी) को 500 मिली ऑक्सीजनयुक्त समुद्री जल (32 पीएसयू) में 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए अनुकूलित किया गया। मानव गैलेक्टिन-7 सीडीएनए अनुक्रम (एनसीबीआई एक्सेसेशन नंबर L07769) को एन्कोड करने वाले इंसर्ट वाले प्लास्मिड डीएनए को 190 μg/μl की अंतिम सांद्रता पर शीशी में जोड़ा गया था। डीएनए के बिना समान परिस्थितियों में इनक्यूबेट किए गए मसल्स नियंत्रण थे। तीसरे नियंत्रण टैंक में मसल्स के बिना डीएनए था। समुद्री जल में डीएनए की गुणवत्ता की निगरानी करने के लिए, संकेतित समय पर प्रत्येक टैंक से समुद्री जल के नमूने (20 μl; तीन पुनरावृत्तियाँ) लिए गए। प्लास्मिड डीएनए ट्रेसेबिलिटी के लिए, संकेतित समय पर एलबी मसल्स की कटाई की गई और qPCR और ddPCR द्वारा उनका विश्लेषण किया गया। समुद्री जल में नमक की उच्च मात्रा के कारण, सभी पीसीआर परख से पहले एलिक्वॉट्स को पीसीआर गुणवत्ता वाले पानी (1:10) में पतला किया गया था।
डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडीपीसीआर) बायोरैड क्यूएक्स200 प्रोटोकॉल (मिसिसॉगा, ओंटारियो, कनाडा) का उपयोग करके किया गया था। इष्टतम तापमान निर्धारित करने के लिए तापमान प्रोफ़ाइल का उपयोग करें (तालिका S1)। QX200 ड्रॉप जनरेटर (बायोरैड) का उपयोग करके बूंदें उत्पन्न की गईं। डीडीपीसीआर निम्न प्रकार से किया गया: 5 मिनट के लिए 95°C, 30 सेकंड के लिए 95°C के 50 चक्र और 1 मिनट के लिए दिया गया एनीलिंग तापमान और 30 सेकंड के लिए 72°C, 5 मिनट के लिए 4°C और 5 मिनट के भीतर 90°C। बूंदों की संख्या और सकारात्मक प्रतिक्रियाओं (प्रतियों की संख्या/µl) को QX200 ड्रॉप रीडर (बायोरैड) का उपयोग करके मापा गया। 10,000 से कम बूंदों वाले नमूनों को अस्वीकार कर दिया गया। हर बार डीडीपीसीआर चलाने पर पैटर्न नियंत्रण नहीं किया गया।
रोटर-जीन® 3000 (कॉर्बेट रिसर्च, सिडनी, ऑस्ट्रेलिया) और LGALS7 विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करके qPCR का प्रदर्शन किया गया। सभी मात्रात्मक PCRs क्वांटिफास्ट SYBR ग्रीन PCR किट (QIAGEN) का उपयोग करके 20 µl में किए गए। qPCR की शुरुआत 95°C पर 15 मिनट के इनक्यूबेशन से हुई, उसके बाद 95°C पर 10 सेकंड के लिए 40 चक्र और 60°C पर 60 सेकंड के लिए एक डेटा संग्रह के साथ किया गया। 5 सेकंड के लिए 95°C, 60 सेकंड के लिए 65°C और qPCR के अंत में 97°C पर क्रमिक मापों का उपयोग करके पिघलने वाले वक्र उत्पन्न किए गए। नियंत्रण नमूनों को छोड़कर प्रत्येक qPCR को तीन प्रतियों में किया गया।
चूंकि मसल्स अपनी उच्च निस्पंदन दर के लिए जाने जाते हैं, इसलिए हमने सबसे पहले जांच की कि क्या वे समुद्री जल में मौजूद डीएनए अंशों को फ़िल्टर और बनाए रख सकते हैं। हम इस बात में भी रुचि रखते थे कि क्या ये अंश उनके अर्ध-खुले लसीका तंत्र में जमा होते हैं। हमने नीले मसल टैंक में जोड़े गए घुलनशील डीएनए अंशों के भाग्य का पता लगाकर प्रयोगात्मक रूप से इस मुद्दे को हल किया। डीएनए अंशों की ट्रैकिंग को सुविधाजनक बनाने के लिए, हमने मानव गैलेक्टिन-7 जीन युक्त विदेशी (स्वयं नहीं) प्लास्मिड डीएनए का उपयोग किया। ddPCR समुद्री जल और मसल्स में प्लास्मिड डीएनए अंशों का पता लगाता है। हमारे परिणाम बताते हैं कि यदि मसल्स की अनुपस्थिति में समुद्री जल में डीएनए अंशों की मात्रा समय के साथ (7 दिनों तक) अपेक्षाकृत स्थिर रही, तो मसल्स की उपस्थिति में यह स्तर 8 घंटे के भीतर लगभग पूरी तरह से गायब हो गया (चित्र 1a,b)। बहिर्जात डीएनए के अंशों को इंट्रावाल्वुलर द्रव और हेमोलिम्फ (चित्र 1c) में 15 मिनट के भीतर आसानी से पता लगाया गया। इन अंशों को एक्सपोज़र के 4 घंटे बाद तक भी पता लगाया जा सकता है। डीएनए टुकड़ों के संबंध में यह फ़िल्टरिंग गतिविधि बैक्टीरिया और शैवाल की फ़िल्टरिंग गतिविधि के बराबर है [31]। इन परिणामों से पता चलता है कि मसल्स अपने द्रव डिब्बों में विदेशी डीएनए को फ़िल्टर और जमा कर सकते हैं।
समुद्री जल में प्लाज्मिड डीएनए की सापेक्ष सांद्रता, मसल्स की उपस्थिति (ए) या अनुपस्थिति (बी) में, डीडीपीसीआर द्वारा मापी गई। ए में, परिणाम प्रतिशत के रूप में व्यक्त किए जाते हैं, जिसमें बक्सों की सीमाएँ 75वें और 25वें प्रतिशतक को दर्शाती हैं। फिट किया गया लघुगणक वक्र लाल रंग में दिखाया गया है, और ग्रे रंग में छायांकित क्षेत्र 95% विश्वास अंतराल को दर्शाता है। बी में, लाल रेखा माध्य को दर्शाती है और नीली रेखा सांद्रता के लिए 95% विश्वास अंतराल को दर्शाती है। सी प्लाज्मिड डीएनए के जुड़ने के बाद अलग-अलग समय पर मसल्स के हीमोलिम्फ और वाल्वुलर द्रव में प्लाज्मिड डीएनए का संचय। परिणाम पूर्ण प्रतियों के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं, जिनका पता/एमएल (±एसई) लगाया जाता है।
इसके बाद, हमने केर्गुएलन द्वीप समूह, सीमित मानवजनित प्रभाव वाले द्वीपों के एक दूरस्थ समूह, पर मसल्स बेड से एकत्रित मसल्स में ccfDNA की उत्पत्ति की जांच की। इस उद्देश्य के लिए, मसल्स हेमोलिम्फ से सीसीएफडीएनए को अलग किया गया और सामान्य रूप से मानव सीसीसीडीएनए को शुद्ध करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधियों द्वारा शुद्ध किया गया [32, 33]। हमने पाया कि मसल्स में औसत हेमोलिम्फ सीसीएफडीएनए सांद्रता कम माइक्रोग्राम प्रति एमएल हेमोलिम्फ श्रेणी में है (तालिका एस2, पूरक सूचना देखें)। सांद्रता की यह श्रेणी स्वस्थ लोगों (कम नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर) की तुलना में बहुत बड़ी है, लेकिन दुर्लभ मामलों में, कैंसर रोगियों में, सीसीएफडीएनए का स्तर कई माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर तक पहुंच सकता है [34, 5000 बीपी तक (चित्र 2)। सिलिका-आधारित क्यूआईएएमपी इन्वेस्टिगेटर किट का उपयोग करके समान परिणाम प्राप्त किए गए थे, जो कि फोरेंसिक विज्ञान में आमतौर पर सीसीएफडीएनए [36] सहित कम सांद्रता वाले डीएनए नमूनों से जीनोमिक डीएनए को तेजी से अलग करने और शुद्ध करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधि है।
मसल्स हेमोलिम्फ का प्रतिनिधि ccfDNA इलेक्ट्रोफोरेग्राम। न्यूक्लियोस्नैप प्लाज़्मा किट (ऊपर) और QIAamp DNA इन्वेस्टिगेटर किट से निकाला गया। मसल्स में हेमोलिम्फ ccfDNA सांद्रता (±SE) के वितरण को दर्शाने वाला B वायलिन प्लॉट। काली और लाल रेखाएँ क्रमशः माध्यिका और प्रथम और तृतीय चतुर्थक को दर्शाती हैं।
मनुष्यों और प्राइमेट्स में लगभग 1% ccfDNA का एक विदेशी स्रोत होता है [21, 37]। बाइवाल्व्स की अर्ध-खुली परिसंचरण प्रणाली, माइक्रोबियल-समृद्ध समुद्री जल और मसल्स ccfDNA के आकार वितरण को देखते हुए, हमने अनुमान लगाया कि मसल्स हेमोलिम्फ ccfDNA में माइक्रोबियल डीएनए का एक समृद्ध और विविध पूल हो सकता है। इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, हमने केर्गुएलन द्वीप से एकत्र किए गए औलाकोमा अत्रा नमूनों से हेमोलिम्फ ccfDNA को अनुक्रमित किया, जिससे 10 मिलियन से अधिक रीड प्राप्त हुए, जिनमें से 97.6% गुणवत्ता नियंत्रण में सफल रहे। फिर रीडिंग को BLASTN और NCBI बाइवाल्व डेटाबेस (चित्र S1, पूरक सूचना) का उपयोग करके स्व और गैर-स्व स्रोतों के अनुसार वर्गीकृत किया गया।
मनुष्यों में, परमाणु और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए दोनों को रक्तप्रवाह में छोड़ा जा सकता है [38]। हालांकि, वर्तमान अध्ययन में, मसल्स के परमाणु जीनोमिक डीएनए का विस्तार से वर्णन करना संभव नहीं था, यह देखते हुए कि ए. अत्रा जीनोम को अनुक्रमित या वर्णित नहीं किया गया है। हालांकि, हम बाइवेल्व लाइब्रेरी (चित्र एस2, अनुपूरक सूचना) का उपयोग करके अपने स्वयं के मूल के कई सीसीएफडीएनए टुकड़ों की पहचान करने में सक्षम थे। हमने उन ए. अत्रा जीनों के निर्देशित पीसीआर प्रवर्धन द्वारा अपने स्वयं के मूल के डीएनए टुकड़ों की उपस्थिति की भी पुष्टि की, जिन्हें अनुक्रमित किया गया था (चित्र 3)। इसी तरह, यह देखते हुए कि ए. अत्रा का माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम सार्वजनिक डेटाबेस में उपलब्ध है, ए. अत्रा के हेमोलिम्फ में माइटोकॉन्ड्रियल सीसीएफडीएनए टुकड़ों की उपस्थिति का सबूत मिल सकता है
ए. अत्रा (लाल बिंदु - स्टॉक संख्या: SRX5705969) और एम. प्लैटेंसिस (नीले बिंदु - स्टॉक संख्या: SRX5705968) के हीमोलिम्फ में विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल जीन मौजूद थे, जिन्हें पीसीआर द्वारा प्रवर्धित किया गया। चित्र ब्रेटन एट अल., 2011 बी से अनुकूलित किया गया है। ए. अत्रा से हीमोलिम्फ सुपरनैटेंट का प्रवर्धन एफटीए पेपर पर संग्रहीत किया गया। पीसीआर मिश्रण युक्त पीसीआर ट्यूब में सीधे जोड़ने के लिए 3 मिमी पंच का उपयोग करें।
समुद्री जल में प्रचुर मात्रा में सूक्ष्मजीव सामग्री को देखते हुए, हमने शुरू में हीमोलिम्फ में सूक्ष्मजीवी डीएनए अनुक्रमों के लक्षण वर्णन पर ध्यान केंद्रित किया। ऐसा करने के लिए, हम दो अलग-अलग रणनीतियों का उपयोग करते हैं। पहली रणनीति में क्रैकेन2 का उपयोग किया गया, जो एक एल्गोरिथम-आधारित अनुक्रम वर्गीकरण कार्यक्रम है जो BLAST और अन्य उपकरणों की तुलना में सटीकता के साथ सूक्ष्मजीवी अनुक्रमों की पहचान कर सकता है [28]। 6719 से अधिक रीड्स बैक्टीरियल उत्पत्ति के पाए गए, जबकि 124 और 64 क्रमशः आर्किया और वायरस से थे (चित्र 4)। सबसे प्रचुर मात्रा में बैक्टीरिया के डीएनए टुकड़े फ़िरमिक्यूट्स (46%), प्रोटियोबैक्टीरिया (27%), और बैक्टेरॉइडेट्स (17%) थे (चित्र 4 ए)। यह वितरण समुद्री नीले मसल माइक्रोबायोम के पिछले अध्ययनों के अनुरूप है [39, 40]। डीडीपीसीआर विधि ने ए. अत्रा हेमोलिम्फ (चित्र 4सी) [41] के सीसीएफडीएनए में विब्रियो डीएनए टुकड़ों की उपस्थिति की पुष्टि की। सीसीएफडीएनए की जीवाणु उत्पत्ति के बारे में अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए, एक अतिरिक्त दृष्टिकोण अपनाया गया (चित्र एस2, पूरक जानकारी)। इस मामले में, ओवरलैप किए गए रीड्स को युग्मित-अंत रीड्स के रूप में इकट्ठा किया गया था और उन्हें BLASTN और 1e−3 के e मान और >90% समरूपता के साथ कटऑफ का उपयोग करके स्व (द्विवार्षिक) या गैर-स्वयं मूल के रूप में वर्गीकृत किया गया था। इस मामले में, ओवरलैप किए गए रीड्स को युग्मित-अंत रीड्स के रूप में इकट्ठा किया गया था और उन्हें BLASTN और 1e−3 के e मान और >90% समरूपता के साथ कटऑफ का उपयोग करके स्व (द्विवार्षिक) या गैर-स्वयं मूल के रूप में वर्गीकृत किया गया था। этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) और पढ़ें BLASTN और значения e 1e-3 और отсечения с гомологией> 90%। इस मामले में, ओवरलैपिंग रीड्स को युग्मित-अंत रीड्स के रूप में एकत्र किया गया था और उन्हें BLASTN और 1e-3 के e मान और >90% समरूपता के साथ कटऑफ का उपयोग करके मूल (द्विवाल्व) या गैर-मूल के रूप में वर्गीकृत किया गया था।90% से अधिक लाभ प्राप्त करने के लिए, BLASTN से 1e-3 प्राप्त करने के लिए>90% मेरे पास एक अच्छा विकल्प नहीं है (मैं एक अच्छा विकल्प चुन सकता हूं)।एक बार जब आप ब्लास्ट करना शुरू कर देते हैं, तो आप 1e-3 को बंद कर देते हैं।值和>90% 同源性 的分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственные (двустворчатые) моллюски) или несобственные по по по поисхождению с использованием ब्लास्टन और 1ई-3 की अधिकतम कीमत> 90%। इस मामले में, ओवरलैपिंग रीड्स को युग्मित-अंत रीड्स के रूप में एकत्र किया गया था और ई BLASTN और 1e-3 मानों और एक होमोलॉजी थ्रेशोल्ड> 90% का उपयोग करके स्वयं (बाइवाल्व) या गैर-मूल के रूप में वर्गीकृत किया गया था।चूंकि ए. अत्रा जीनोम को अभी तक अनुक्रमित नहीं किया गया है, इसलिए हमने मेगाहिट नेक्स्ट जेनरेशन सीक्वेंसिंग (एनजीएस) असेंबलर की डे नोवो असेंबली रणनीति का उपयोग किया। कुल 147,188 कंटिग्स को मूल के आश्रित (द्विवाल्व) के रूप में पहचाना गया है। इन कंटिग्स को फिर BLASTN और BLASTX का उपयोग करके 1e-10 के ई-वैल्यू के साथ विस्फोटित किया गया। इस रणनीति ने हमें ए. अत्रा ccfDNA में मौजूद 482 गैर-द्विवाल्व टुकड़ों की पहचान करने की अनुमति दी। इनमें से आधे से अधिक (57%) डीएनए टुकड़े बैक्टीरिया से प्राप्त किए गए थे, मुख्य रूप से गिल सिम्बियन्ट्स से, जिसमें सल्फ़ोट्रोफ़िक सिम्बियन्ट्स शामिल हैं, और गिल सिम्बियन्ट्स सोलेमिया वेलम (चित्र 5) से।
प्रकार स्तर पर सापेक्ष प्रचुरता। बी दो मुख्य संघों (फ़र्मिक्यूट्स और प्रोटिओबैक्टीरिया) की माइक्रोबियल विविधता। डीडीपीसीआर का प्रतिनिधि प्रवर्धन सी विब्रियो एसपीपी। ए तीन एट्रा हेमोलिम्फ में 16 एस आरआरएनए जीन (नीला) के टुकड़े।
कुल 482 एकत्रित कंटिग्स का विश्लेषण किया गया। मेटाजेनोमिक कंटिग्स एनोटेशन (प्रोकैरियोट्स और यूकेरियोट्स) के टैक्सोनोमिक वितरण की सामान्य प्रोफ़ाइल। B BLASTN और BLASTX द्वारा पहचाने गए बैक्टीरिया डीएनए टुकड़ों का विस्तृत वितरण।
क्रैकेन2 विश्लेषण से यह भी पता चला है कि मसल ccfDNA में आर्कियल डीएनए टुकड़े शामिल हैं, जिसमें यूरियार्कियोटा (65%), क्रेनर्कियोटा (24%), और थौरमार्चियोटा (11%) के डीएनए टुकड़े शामिल हैं (चित्र 6 ए)। यूरियार्कियोटा और क्रेनर्कियोटा से प्राप्त डीएनए टुकड़ों की उपस्थिति, जो पहले कैलिफ़ोर्नियाई मसल्स के माइक्रोबियल समुदाय में पाए गए थे, आश्चर्य के रूप में नहीं आनी चाहिए [42]। हालांकि यूरियार्कियोटा अक्सर चरम स्थितियों से जुड़ा होता है, अब यह माना जाता है कि यूरियार्कियोटा और क्रेनर्कियोटा दोनों समुद्री क्रायोजेनिक वातावरण में सबसे आम प्रोकैरियोट्स में से हैं [43, 44]। मसल्स में मीथेनोजेनिक सूक्ष्मजीवों की उपस्थिति आश्चर्यजनक नहीं है, केर्गुएलन पठार [45] पर नीचे के रिसाव से व्यापक मीथेन लीक की हाल की रिपोर्टों और केर्गुएलन द्वीप समूह के तट पर देखे गए संभावित माइक्रोबियल मीथेन उत्पादन को देखते हुए [46]।
फिर हमारा ध्यान डीएनए वायरस से रीडिंग पर गया। हमारी सर्वोत्तम जानकारी के अनुसार, यह मसल्स में वायरस सामग्री का पहला ऑफ-टारगेट अध्ययन है। जैसी कि उम्मीद थी, हमें बैक्टीरियोफेज (कौडोविरेल्स) के डीएनए टुकड़े मिले (चित्र 6 बी)। हालांकि, सबसे आम वायरल डीएनए न्यूक्लियोसाइटोवायरस के एक संघ से आता है, जिसे न्यूक्लियर साइटोप्लाज्मिक लार्ज डीएनए वायरस (एनसीएलडीवी) के रूप में भी जाना जाता है, जिसमें किसी भी वायरस का सबसे बड़ा जीनोम होता है। इस संघ के भीतर, अधिकांश डीएनए अनुक्रम मिमिमिडोविरिडे (58%) और पॉक्सविरिडे (21%) परिवारों से संबंधित हैं, जिनके प्राकृतिक मेजबानों में कशेरुक और आर्थ्रोपोड शामिल हैं, जबकि इन डीएनए अनुक्रमों का एक छोटा हिस्सा ज्ञात वायरोलॉजिकल शैवाल से संबंधित है दिलचस्प बात यह है कि हेमोलिम्फ ccfDNA अनुक्रमण द्वारा निर्धारित वायरस से संक्रमित ज्ञात मेजबानों की सीमा अपेक्षाकृत बड़ी थी (चित्र S3, अनुपूरक सूचना)। इसमें बैकुलोविरिडे और इरिडोविरिडे जैसे कीटों को संक्रमित करने वाले वायरस के साथ-साथ अमीबा, शैवाल और कशेरुकियों को संक्रमित करने वाले वायरस भी शामिल हैं। हमें पिथोवायरस साइबेरिकम जीनोम से मेल खाते अनुक्रम भी मिले। पिटोवायरस (जिसे "ज़ॉम्बी वायरस" के रूप में भी जाना जाता है) को सबसे पहले साइबेरिया में 30,000 साल पुराने पर्माफ्रॉस्ट से अलग किया गया था [47]। इस प्रकार, हमारे परिणाम पिछली रिपोर्टों के अनुरूप हैं जो दिखाते हैं कि इन वायरस की सभी आधुनिक प्रजातियाँ विलुप्त नहीं हुई हैं [48] और ये वायरस दूरस्थ उप-आर्कटिक समुद्री पारिस्थितिकी प्रणालियों में मौजूद हो सकते हैं।
अंत में, हमने यह देखने के लिए परीक्षण किया कि क्या हम अन्य बहुकोशिकीय जानवरों से डीएनए के टुकड़े पा सकते हैं। एनटी, एनआर और रेफसेक लाइब्रेरी (जीनोमिक और प्रोटीन) के साथ BLASTN और BLASTX द्वारा कुल 482 विदेशी कंटिग्स की पहचान की गई। हमारे परिणाम बताते हैं कि बहुकोशिकीय जानवरों के ccfDNA के विदेशी टुकड़ों में हड्डियों के डीएनए की प्रधानता है (चित्र 5)। कीटों और अन्य प्रजातियों के डीएनए के टुकड़े भी पाए गए हैं। डीएनए के टुकड़ों का एक अपेक्षाकृत बड़ा हिस्सा पहचाना नहीं जा सका है, संभवतः स्थलीय प्रजातियों की तुलना में जीनोमिक डेटाबेस में बड़ी संख्या में समुद्री प्रजातियों के कम प्रतिनिधित्व के कारण [49]।
वर्तमान शोधपत्र में, हम एलबी अवधारणा को मसल्स पर लागू करते हैं, यह तर्क देते हुए कि हेमोलिम्फ सीसीएफडीएनए शॉट अनुक्रमण समुद्री तटीय पारिस्थितिकी प्रणालियों की संरचना में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। विशेष रूप से, हमने पाया कि 1) मसल्स हेमोलिम्फ में अपेक्षाकृत बड़े (~ 1-5 केबी) परिसंचारी डीएनए टुकड़ों की अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता (माइक्रोग्राम स्तर) होती है; 2) ये डीएनए टुकड़े स्वतंत्र और गैर-स्वतंत्र दोनों होते हैं 3) इन डीएनए टुकड़ों के विदेशी स्रोतों में, हमें बैक्टीरिया, आर्कियल और वायरल डीएनए, साथ ही साथ अन्य बहुकोशिकीय जानवरों के डीएनए मिले; 4) हेमोलिम्फ में इन विदेशी सीसीएफडीएनए टुकड़ों का संचय तेजी से होता है और मसल्स की आंतरिक फ़िल्टरिंग गतिविधि में योगदान देता है। निष्कर्ष में, हमारा अध्ययन दर्शाता है कि एलबी की अवधारणा, जिसे अब तक मुख्य रूप से बायोमेडिसिन के क्षेत्र में लागू किया गया है, ज्ञान के एक समृद्ध लेकिन अनदेखे स्रोत को एनकोड करती है जिसका उपयोग सेंटीनेल प्रजातियों और उनके पर्यावरण के बीच बातचीत को बेहतर ढंग से समझने के लिए किया जा सकता है।
प्राइमेट्स के अलावा, चूहों, कुत्तों, बिल्लियों और घोड़ों सहित स्तनधारियों में ccfDNA अलगाव की सूचना मिली है [50, 51, 52]। हालांकि, हमारे ज्ञान के अनुसार, हमारा अध्ययन एक खुले परिसंचरण तंत्र के साथ समुद्री प्रजातियों में ccfDNA का पता लगाने और अनुक्रमण की रिपोर्ट करने वाला पहला है। मसल्स की यह शारीरिक विशेषता और फ़िल्टरिंग क्षमता, कम से कम आंशिक रूप से, अन्य प्रजातियों की तुलना में परिसंचारी डीएनए टुकड़ों के विभिन्न आकार की विशेषताओं की व्याख्या कर सकती है। मनुष्यों में, रक्त में घूमने वाले अधिकांश डीएनए टुकड़े 150 से 200 बीपी के आकार के छोटे टुकड़े होते हैं, जिनका अधिकतम शिखर 167 बीपी होता है [34, 53]। डीएनए टुकड़ों का एक छोटा लेकिन महत्वपूर्ण हिस्सा 300 से 500 बीपी के बीच आकार का होता है इस आकार वितरण का कारण यह है कि प्लाज्मा में सीसीएफडीएनए का मुख्य स्रोत कोशिका मृत्यु के परिणामस्वरूप होता है, या तो कोशिका मृत्यु के कारण या स्वस्थ व्यक्तियों में परिसंचारी हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के परिगलन के कारण या कैंसर के रोगियों में ट्यूमर कोशिकाओं के एपोप्टोसिस के कारण (जिसे परिसंचारी ट्यूमर डीएनए के रूप में जाना जाता है)। , सीटीडीएनए)। हेमोलिम्फ सीसीएफडीएनए का आकार वितरण जो हमने मसल्स में पाया वह 1000 से 5000 बीपी तक था, यह दर्शाता है कि मसल सीसीएफडीएनए का एक अलग मूल है। यह एक तार्किक परिकल्पना है, क्योंकि मसल्स में एक अर्ध-खुली संवहनी प्रणाली होती है और वे समुद्री जलीय वातावरण में रहते हैं जिसमें माइक्रोबियल जीनोमिक डीएनए की उच्च सांद्रता होती है। वास्तव में, बहिर्जात डीएनए का उपयोग करने वाले हमारे प्रयोगशाला प्रयोगों से पता चला है कि मसल्स समुद्री जल में डीएनए के टुकड़े जमा करते हैं कोशिकाओं (प्रोकैरियोटिक और यूकेरियोटिक दोनों) की दुर्लभता को देखते हुए, इंट्रावाल्वुलर डिब्बों के उपयोग से स्व-स्रोतों के साथ-साथ विदेशी स्रोतों से ccfDNA की मात्रा कम हो जाएगी। बाइवाल्व जन्मजात प्रतिरक्षा और परिसंचारी फागोसाइट्स की बड़ी संख्या के महत्व को ध्यान में रखते हुए, हमने आगे यह अनुमान लगाया कि विदेशी ccfDNA भी परिसंचारी फागोसाइट्स में समृद्ध है जो सूक्ष्मजीवों और/या सेलुलर मलबे के अंतर्ग्रहण पर विदेशी डीएनए जमा करते हैं। कुल मिलाकर, हमारे परिणाम दिखाते हैं कि बाइवाल्व हेमोलिम्फ ccfDNA आणविक जानकारी का एक अनूठा भंडार है और एक प्रहरी प्रजाति के रूप में उनकी स्थिति को मजबूत करता है।
हमारे डेटा से संकेत मिलता है कि बैक्टीरिया से प्राप्त हेमोलिम्फ सीसीएफडीएनए टुकड़ों की अनुक्रमण और विश्लेषण मेजबान बैक्टीरिया वनस्पतियों और आसपास के समुद्री पारिस्थितिकी तंत्र में मौजूद बैक्टीरिया के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है। शॉट अनुक्रमण तकनीकों ने सहभोजी बैक्टीरिया ए. अत्रा गिल के अनुक्रमों का खुलासा किया है जो कि पारंपरिक 16एस आरआरएनए पहचान विधियों का उपयोग करने पर छूट जाते, आंशिक रूप से संदर्भ पुस्तकालय पूर्वाग्रह के कारण। वास्तव में, केर्गुएलन में एक ही मसल परत में एम. प्लैटेंसिस से एकत्र किए गए हमारे एलबी डेटा के उपयोग से पता चला कि गिल से जुड़े बैक्टीरिया सहजीवियों की संरचना दोनों मसल प्रजातियों के लिए समान थी (चित्र एस4, पूरक सूचना)। दो आनुवंशिक रूप से भिन्न मसल्स की यह समानता केर्गुएलन के ठंडे, सल्फरयुक्त और ज्वालामुखी जमावों में बैक्टीरिया समुदायों की संरचना को दर्शा सकती है [55, 56, 57, 58]। बायोटर्बेटेड तटीय क्षेत्रों [59] जैसे पोर्ट-ऑ-फ़्रांस के तट से मसल्स की कटाई करते समय सल्फर-घटाने वाले सूक्ष्मजीवों के उच्च स्तर का अच्छी तरह से वर्णन किया गया है। एक और संभावना यह है कि सहभोजी मसल फ्लोरा क्षैतिज संचरण से प्रभावित हो सकता है [60, 61]। समुद्री पर्यावरण, समुद्र तल की सतह और मसल्स में सहजीवी बैक्टीरिया की संरचना के बीच संबंध निर्धारित करने के लिए और अधिक शोध की आवश्यकता है। ये अध्ययन वर्तमान में चल रहे हैं।
हेमोलिम्फ ccfDNA की लंबाई और सांद्रता, इसके शुद्धिकरण में आसानी और तेजी से शॉटगन अनुक्रमण की अनुमति देने के लिए उच्च गुणवत्ता समुद्री तटीय पारिस्थितिकी प्रणालियों में जैव विविधता का आकलन करने के लिए मसल ccfDNA का उपयोग करने के कई लाभों में से कुछ हैं। यह दृष्टिकोण किसी दिए गए पारिस्थितिकी तंत्र में वायरल समुदायों (वायरोम्स) को चिह्नित करने के लिए विशेष रूप से प्रभावी है [62, 63]। बैक्टीरिया, आर्किया और यूकेरियोट्स के विपरीत, वायरल जीनोम में 16S अनुक्रम जैसे फ़ायलोजेनेटिक रूप से संरक्षित जीन नहीं होते हैं। हमारे परिणाम संकेत देते हैं कि मसल्स जैसी संकेतक प्रजातियों से तरल बायोप्सी का उपयोग अपेक्षाकृत बड़ी संख्या में ccfDNA वायरस टुकड़ों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो आमतौर पर तटीय समुद्री पारिस्थितिकी प्रणालियों में रहने वाले मेजबानों को संक्रमित करने के लिए जाने जाते हैं जब हमने केर्गुएलन में एक ही मसल परत में एकत्रित नीले मसल्स (एम. प्लैटेंसिस) के हेमोलिम्फ ccfDNA वायरोम की जांच की, तो एक समान वितरण पाया गया (तालिका S2, अनुपूरक सूचना)। ccfDNA की शॉटगन अनुक्रमण वास्तव में मनुष्यों या अन्य प्रजातियों के वायरोम के अध्ययन में गति प्राप्त करने वाला एक नया दृष्टिकोण है [21, 37, 64]। यह दृष्टिकोण विशेष रूप से डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए वायरस का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है, क्योंकि सभी डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए वायरस में कोई भी जीन संरक्षित नहीं है, जो बाल्टीमोर में वायरस के सबसे विविध और व्यापक वर्ग का प्रतिनिधित्व करता है [65]। हालाँकि इनमें से अधिकांश वायरस अवर्गीकृत हैं और इसमें वायरल दुनिया के पूरी तरह से अज्ञात हिस्से के वायरस शामिल हो सकते हैं [66], हमने पाया कि मसल्स ए. अत्रा और एम. प्लैटेंसिस के वायरोम और होस्ट रेंज दो प्रजातियों के बीच आते हैं। इसी तरह (चित्र S3 देखें, अतिरिक्त जानकारी)। यह समानता आश्चर्यजनक नहीं है, क्योंकि यह पर्यावरण में मौजूद डीएनए के अवशोषण में चयनात्मकता की कमी को दर्शा सकती है। आरएनए वायरोम की विशेषता निर्धारित करने के लिए वर्तमान में शुद्ध आरएनए का उपयोग करते हुए भविष्य के अध्ययन की आवश्यकता है।
हमारे अध्ययन में, हमने कोवार्स्की और सहकर्मियों [37] के काम से अनुकूलित एक बहुत ही कठोर पाइपलाइन का इस्तेमाल किया, जिन्होंने मूल सीसीएफडीएनए के संयोजन से पहले और बाद में पूल किए गए रीड्स और कंटिग्स के दो-चरणीय विलोपन का इस्तेमाल किया, जिसके परिणामस्वरूप अनमैप्ड रीड्स का उच्च अनुपात हुआ। इसलिए, हम इस बात से इंकार नहीं कर सकते कि इनमें से कुछ अनमैप्ड रीड्स का अभी भी अपना मूल हो सकता है, मुख्य रूप से क्योंकि हमारे पास इस मसल प्रजाति के लिए संदर्भ जीनोम नहीं है। हमने इस पाइपलाइन का उपयोग इसलिए भी किया क्योंकि हम स्व और गैर-स्व रीड्स के बीच के भ्रम और इल्लुमिना मिसेक पीई75 द्वारा उत्पन्न रीड लंबाई के बारे में चिंतित थे। अधिकांश अनचार्टेड रीडिंग का एक अन्य कारण यह है कि अधिकांश समुद्री सूक्ष्मजीव, विशेष रूप से केर्गुएलन जैसे दूरदराज के क्षेत्रों में, एनोटेट नहीं किए गए हैं भविष्य के अध्ययनों के लिए, हमारे परिणामों को देखते हुए कि हेमोलिम्फ ccfDNA में मनुष्यों और/या स्तनधारियों की तुलना में लंबी रीड्स हैं, हम लंबे ccfDNA टुकड़ों के लिए अधिक उपयुक्त अनुक्रमण प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करने की सलाह देते हैं। यह अभ्यास गहन विश्लेषण के लिए अधिक संकेतों की पहचान करना बहुत आसान बना देगा। वर्तमान में अनुपलब्ध पूर्ण ए. अत्रा परमाणु जीनोम अनुक्रम प्राप्त करना भी स्व और गैर-स्व स्रोतों से ccfDNA के भेदभाव को बहुत सुविधाजनक बनाएगा। यह देखते हुए कि हमारे शोध ने मसल्स पर लिक्विड बायोप्सी की अवधारणा को लागू करने की संभावना पर ध्यान केंद्रित किया है, हम आशा करते हैं कि जैसे-जैसे इस अवधारणा का भविष्य के शोध में उपयोग किया जाएगा, मसल्स की माइक्रोबियल विविधता का अध्ययन करने के लिए इस पद्धति की क्षमता को बढ़ाने के लिए नए उपकरण और पाइपलाइन विकसित की जाएंगी। समुद्री पारिस्थितिकी तंत्र।
एक गैर-इनवेसिव क्लिनिकल बायोमार्कर के रूप में, ccfDNA के ऊंचे मानव प्लाज्मा स्तर विभिन्न बीमारियों, ऊतक क्षति और तनाव की स्थिति [67,68,69] से जुड़े हैं। यह वृद्धि ऊतक क्षति के बाद अपने स्वयं के मूल के डीएनए टुकड़ों की रिहाई से जुड़ी है। हमने तीव्र ताप तनाव का उपयोग करके इस मुद्दे को संबोधित किया, जिसमें मसल्स को थोड़े समय के लिए 30 डिग्री सेल्सियस के तापमान के संपर्क में लाया गया था। हमने तीन स्वतंत्र प्रयोगों में तीन अलग-अलग प्रकार के मसल्स पर यह विश्लेषण किया। हालांकि, हमें तीव्र ताप तनाव के बाद ccfDNA के स्तर में कोई बदलाव नहीं मिला (चित्र S5 देखें, अतिरिक्त जानकारी)। यह खोज, कम से कम आंशिक रूप से, इस तथ्य की व्याख्या कर सकती है कि मसल्स में एक अर्ध-खुला परिसंचरण तंत्र होता है और उनकी उच्च फ़िल्टरिंग गतिविधि के कारण बड़ी मात्रा में विदेशी डीएनए जमा होते हैं।
आज तक, जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों में जैव विविधता के डीएनए विश्लेषण ने मुख्य रूप से पर्यावरणीय डीएनए (ईडीएनए) मेटाबारकोडिंग पर ध्यान केंद्रित किया है। हालांकि, यह विधि आमतौर पर जैव विविधता विश्लेषण में सीमित होती है जब प्राइमर का उपयोग किया जाता है। शॉटगन अनुक्रमण का उपयोग पीसीआर की सीमाओं और प्राइमर सेट के पक्षपाती चयन को दरकिनार करता है। इस प्रकार, एक अर्थ में, हमारी विधि हाल ही में उपयोग की जाने वाली उच्च-थ्रूपुट ईडीएनए शॉटगन अनुक्रमण विधि के करीब है, जो सीधे खंडित डीएनए को अनुक्रमित करने और लगभग सभी जीवों का विश्लेषण करने में सक्षम है [72, 73]। हालांकि, कई बुनियादी मुद्दे हैं जो एलबी को मानक ईडीएनए विधियों से अलग करते हैं। बेशक, ईडीएनए और एलबी के बीच मुख्य अंतर प्राकृतिक फ़िल्टर होस्ट का उपयोग है। ईडीएनए का अध्ययन करने के लिए एक प्राकृतिक फ़िल्टर के रूप में स्पंज और बाइवल्व (ड्रेसेना एसपीपी) जैसी समुद्री प्रजातियों के उपयोग की सूचना मिली है [74, 75]। हालांकि, ड्रेसेना के अध्ययन में ऊतक बायोप्सी का उपयोग किया गया था जिसमें से डीएनए निकाला गया था। एलबी से सीसीएफडीएनए के विश्लेषण के लिए ऊतक बायोप्सी, ईडीएनए या ऊतक बायोप्सी से जुड़े विशेष और कभी-कभी महंगे उपकरण और लॉजिस्टिक्स की आवश्यकता नहीं होती है। वास्तव में, हमने हाल ही में बताया कि एलबी से सीसीएफडीएनए को कोल्ड चेन बनाए रखे बिना एफटीए समर्थन के साथ संग्रहीत और विश्लेषण किया जा सकता है, जो दूरदराज के क्षेत्रों में अनुसंधान के लिए एक बड़ी चुनौती है [76]। तरल बायोप्सी से सीसीएफडीएनए का निष्कर्षण भी सरल है और शॉटगन अनुक्रमण और पीसीआर विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाला डीएनए प्रदान करता है। ईडीएनए विश्लेषण से जुड़ी कुछ तकनीकी सीमाओं को देखते हुए यह एक बड़ा लाभ है [77]। नमूनाकरण विधि की सरलता और कम लागत भी दीर्घकालिक निगरानी कार्यक्रमों के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है। यद्यपि मेजबान-व्युत्पन्न डीएनए टुकड़ों की उपस्थिति को ईडीएनए की तुलना में विधि की एक सीमा के रूप में देखा जा सकता है, ईडीएनए की तुलना में इस तरह के मूल सीसीएफडीएनए के होने से जुड़ी लागत स्वास्थ्य अध्ययनों के लिए उपलब्ध जानकारी की विशाल मात्रा के लिए एक साथ समझने योग्य है। ऑफसेट होस्ट। इसमें मेजबान मेजबान के जीनोम में एकीकृत वायरल अनुक्रमों की उपस्थिति शामिल है। यह विशेष रूप से मसल्स के लिए महत्वपूर्ण है, बाइवल्व्स में क्षैतिज रूप से प्रसारित ल्यूकेमिक रेट्रोवायरस की उपस्थिति को देखते हुए [80, 81]। ईडीएनए पर एलबी का एक और लाभ यह है कि यह हेमोलिम्फ में परिसंचारी रक्त कोशिकाओं की फागोसाइटिक गतिविधि का फायदा उठाता है, जो सूक्ष्मजीवों (और उनके जीनोम) को घेर लेता है। फागोसाइटोसिस बाइवल्व्स में रक्त कोशिकाओं का मुख्य कार्य है [83, 84]। इस प्रकार, मसल्स के पोषण, आर्थिक और पर्यावरणीय प्रभावों को देखते हुए मसल्स ccfDNA विश्लेषण एक दिलचस्प रास्ता है। मनुष्यों से एकत्रित एलबी के विश्लेषण के समान, यह विधि भी बाहरी पदार्थों की प्रतिक्रिया में मेजबान डीएनए में आनुवंशिक और एपिजेनेटिक परिवर्तनों को मापने की संभावना को खोलती है। उदाहरण के लिए, नैनोपोर अनुक्रमण का उपयोग करके मूल ccfDNA में जीनोम-वाइड मिथाइलेशन विश्लेषण करने के लिए तीसरी पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीकों की परिकल्पना की जा सकती है। इस प्रक्रिया को इस तथ्य से सुगम बनाया जाना चाहिए कि मसल्स ccfDNA टुकड़ों की लंबाई आदर्श रूप से लॉन्ग-रीड अनुक्रमण प्लेटफ़ॉर्म के साथ संगत है जो रासायनिक परिवर्तनों की आवश्यकता के बिना एकल अनुक्रमण रन से जीनोम-वाइड डीएनए मिथाइलेशन विश्लेषण की अनुमति देता है।85,86] यह एक दिलचस्प संभावना है, क्योंकि यह दिखाया गया है कि डीएनए मिथाइलेशन पैटर्न पर्यावरणीय तनाव की प्रतिक्रिया को दर्शाते हैं और कई पीढ़ियों तक बने रहते हैं। इसलिए, यह जलवायु परिवर्तन या प्रदूषकों के संपर्क में आने के बाद प्रतिक्रिया को नियंत्रित करने वाले अंतर्निहित तंत्रों में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है [87]। हालांकि, एलबी का उपयोग सीमाओं के बिना नहीं है। कहने की जरूरत नहीं है, इसके लिए पारिस्थितिकी तंत्र में संकेतक प्रजातियों की उपस्थिति की आवश्यकता होती है। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, किसी दिए गए पारिस्थितिकी तंत्र की जैव विविधता का आकलन करने के लिए एलबी का उपयोग करने के लिए एक कठोर जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन की भी आवश्यकता होती है जो स्रोत से डीएनए टुकड़ों की उपस्थिति को ध्यान में रखती है। एक अन्य प्रमुख समस्या समुद्री प्रजातियों के लिए संदर्भ जीनोम की उपलब्धता है। यह आशा की जाती है कि समुद्री स्तनपायी जीनोम परियोजना और हाल ही में स्थापित फिश10के परियोजना [88] जैसी पहल भविष्य में इस तरह के विश्लेषण को सुविधाजनक बनाएगी। समुद्री फिल्टर-फीडिंग जीवों के लिए एलबी अवधारणा का अनुप्रयोग अनुक्रमण तकनीक में नवीनतम प्रगति के साथ भी संगत है, जिससे यह पर्यावरणीय तनाव के जवाब में समुद्री आवासों के स्वास्थ्य के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करने के लिए मल्टी-ओम बायोमार्कर के विकास के लिए उपयुक्त है।
जीनोम अनुक्रमण डेटा को एनसीबीआई अनुक्रम रीड आर्काइव https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 में बायोप्रोजेक्ट्स SRR8924808 के अंतर्गत जमा किया गया है।
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