उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा पेप्टाइड्स और प्रोटीन के पृथक्करण के लिए मिश्रित-मोड स्थिर चरणों की तैयारी

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मैक्रोपोरस कणों को प्राप्त करने के लिए कुछ संशोधनों के साथ झरझरा सिलिका कणों को सोल-जेल विधि द्वारा तैयार किया गया था। इन कणों को एन-फेनिलमेलिमाइड-मिथाइलविनाइलिसोसायनेट (पीएमआई) और स्टाइरीन के साथ प्रतिवर्ती अतिरिक्त विखंडन श्रृंखला स्थानांतरण (आरएएफटी) पोलीमराइजेशन द्वारा पॉलीस्टाइनिन (पीएमपी) स्थिर चरण के एन-फेनिलमेलिमाइड इंटरकलेशन तैयार करने के लिए तैयार किया गया था। संकीर्ण-बोर स्टेनलेस स्टील कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) ) को घोल पैकिंग द्वारा पैक किया गया था। पांच पेप्टाइड्स (ग्लाइ-टायर, ग्लाइ-लेउ-टायर, ग्लाइ-ग्लाइ-टायर-आर्ग, टायर-इले-ग्लाइ-सेर-आर्ग, ल्यूसीन एनकेफेलिन) क्रोमैटोग्राफिक प्रदर्शन) और मानव सीरम एल्ब्यूमिन (एचएएस) के ट्रिप्सिन पाचन से युक्त पेप्टाइड मिश्रण के पीएमपी कॉलम पृथक्करण का मूल्यांकन किया गया। इष्टतम रेफरेंस स्थितियों के तहत, पेप्टाइड मिश्रण की सैद्धांतिक प्लेट गिनती 280,000 प्लेट/वर्ग मीटर तक है। वाणिज्यिक एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम के साथ विकसित कॉलम के पृथक्करण प्रदर्शन की तुलना करने पर, यह देखा गया कि पृथक्करण दक्षता और रिज़ॉल्यूशन के मामले में पीएमपी कॉलम का पृथक्करण प्रदर्शन वाणिज्यिक कॉलम से बेहतर था।
हाल के वर्षों में, बायोफार्मास्युटिकल उद्योग बाजार हिस्सेदारी में पर्याप्त वृद्धि के साथ एक विस्तारित वैश्विक बाजार बन गया है। बायोफार्मास्युटिकल उद्योग 1,2,3 की विस्फोटक वृद्धि के साथ, पेप्टाइड्स और प्रोटीन का विश्लेषण अत्यधिक वांछित है। लक्ष्य पेप्टाइड के अलावा, पेप्टाइड संश्लेषण के दौरान कई अशुद्धियाँ उत्पन्न होती हैं, इस प्रकार वांछित शुद्धता के पेप्टाइड्स प्राप्त करने के लिए क्रोमैटोग्राफिक शुद्धिकरण की आवश्यकता होती है। शरीर के तरल पदार्थ, ऊतकों और कोशिकाओं में प्रोटीन का विश्लेषण और लक्षण वर्णन एक बेहद चुनौतीपूर्ण कार्य है। एक ही नमूने में संभावित रूप से पता लगाने योग्य प्रजातियों की संख्या। हालांकि मास स्पेक्ट्रोमेट्री पेप्टाइड और प्रोटीन अनुक्रमण के लिए एक प्रभावी उपकरण है, अगर ऐसे नमूनों को एक पास में मास स्पेक्ट्रोमीटर में इंजेक्ट किया जाता है, तो पृथक्करण आदर्श नहीं होगा। एमएस विश्लेषण से पहले तरल क्रोमैटोग्राफी (एलसी) पृथक्करण को लागू करके इस समस्या को कम किया जा सकता है, जो एक निश्चित समय में मास स्पेक्ट्रोमीटर में प्रवेश करने वाले विश्लेषकों की संख्या को कम कर देगा। इसके अलावा, तरल चरण पृथक्करण के दौरान, विश्लेषकों को संकीर्ण क्षेत्रों में केंद्रित किया जा सकता है। , जिससे इन विश्लेषणों को केंद्रित किया जा सके और एमएस पहचान संवेदनशीलता में सुधार किया जा सके। तरल क्रोमैटोग्राफी (एलसी) पिछले दशक में काफी उन्नत हुई है और प्रोटिओमिक विश्लेषण7,8,9,10 में एक लोकप्रिय तकनीक बन गई है।
उलट-चरण तरल क्रोमैटोग्राफी (आरपी-एलसी) का उपयोग व्यापक रूप से स्थिर चरण11,12,13 के रूप में ऑक्टाडेसिल-संशोधित सिलिका (ओडीएस) का उपयोग करके पेप्टाइड मिश्रण के शुद्धिकरण और पृथक्करण के लिए किया जाता है। हालांकि, आरपी स्थिर चरण अपनी जटिल संरचना और एम्फीफिलिक प्रकृति 14,15 के कारण पेप्टाइड्स और प्रोटीन का संतोषजनक पृथक्करण प्रदान नहीं करते हैं। इसलिए, ध्रुवीय के साथ पेप्टाइड्स और प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से डिजाइन किए गए स्थिर चरणों की आवश्यकता होती है। मिश्रित-मोड क्रोमैटोग्राफी, जो मल्टीमॉडल इंटरैक्शन प्रदान करती है, पेप्टाइड्स, प्रोटीन और अन्य जटिल मिश्रणों को अलग करने के लिए आरपी-एलसी का विकल्प हो सकती है। कई मिश्रित-मोड स्थिर चरण तैयार किए गए हैं, और इन चरणों के साथ पैक किए गए कॉलम का उपयोग पेप्टाइड और प्रोटीन पृथक्करण के लिए किया गया है17,18,19,20,21। मिश्रित-मोड स्टेशन एरी चरण (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, ध्रुवीय अंतःक्षेपण/RPLC) ध्रुवीय और गैर-ध्रुवीय दोनों समूहों की उपस्थिति के कारण पेप्टाइड और प्रोटीन पृथक्करण के लिए उपयुक्त हैं। और स्थिर चरण.मल्टीमॉडल इंटरैक्शन 29, 30, 31, 32। हाल ही में, झांग एट अल।30 ने एक डोडेसिल-टर्मिनेटेड पॉलीमाइन स्थिर चरण तैयार किया और हाइड्रोकार्बन, एंटीडिप्रेसेंट्स, फ्लेवोनोइड्स, न्यूक्लियोसाइड्स, एस्ट्रोजेन और कई अन्य एनालिटिक्स को सफलतापूर्वक अलग कर दिया। ध्रुवीय इंटरकेलेटर में ध्रुवीय और गैर-ध्रुवीय दोनों समूह होते हैं, इसलिए इसका उपयोग पेप्टाइड्स और प्रोटीन को अलग करने के लिए किया जा सकता है जिनमें हाइड्रोफोबिक और हाइड्रोफिलिक दोनों प्रकार के गुण होते हैं। ध्रुवीय-एम्बेडेड कॉलम (उदाहरण के लिए, एमाइड-एम्बेडेड सी 18 कॉलम) वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध हैं व्यापार नाम एसेन्टिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम, लेकिन इन कॉलमों का उपयोग केवल एमाइन 33 के विश्लेषण के लिए किया जाता है।
वर्तमान अध्ययन में, एचएसए के पेप्टाइड्स और ट्रिप्सिन डाइजेस्ट को अलग करने के लिए एक ध्रुवीय-एम्बेडेड स्थिर चरण (एन-फेनिलमेलीमाइड-एम्बेडेड पॉलीस्टीरिन) तैयार किया गया था और मूल्यांकन किया गया था। स्थिर चरण निम्नलिखित रणनीति का उपयोग करके तैयार किया गया था। तैयारी प्रोटोकॉल में कुछ संशोधनों के साथ हमारे पिछले प्रकाशन में दी गई प्रक्रिया के अनुसार छिद्रित सिलिका कण तैयार किए गए थे। सिलिका कणों को तैयार करने के लिए यूरिया, पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी), टीएमओएस, जल एसिटिक एसिड का अनुपात समायोजित किया गया था बड़े छिद्र आकार के साथ। दूसरा, एक नया लिगैंड, फेनिलमेलीमाइड-मिथाइल विनाइल आइसोसाइनेट, संश्लेषित किया गया था और एक ध्रुवीय एम्बेडेड स्थिर चरण तैयार करने के लिए सिलिका कणों को व्युत्पन्न करने के लिए उपयोग किया गया था। परिणामी स्थिर चरण को अनुकूलित पैकिंग योजना का उपयोग करके स्टेनलेस स्टील कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) में पैक किया गया था। कॉलम पैकिंग को यांत्रिक कंपन के साथ सहायता प्रदान की जाती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कॉलम के भीतर एक सजातीय बिस्तर बनता है। पेप्टाइड मिश्रण के पैक किए गए कॉलम पृथक्करण का मूल्यांकन करें पाँच पेप्टाइड्स से मिलकर;(ग्लाइ-टायर, ग्लाइ-लेउ-टायर, ग्लाइ-ग्लाइ-टायर-आर्ग, टायर-इले-ग्लाइ-सेर-आर्ग, ल्यूसीन एनकेफेलिन) और मानव सीरम एल्ब्यूमिन (एचएएस) का ट्रिप्सिन डाइजेस्ट। एचएसए के पेप्टाइड मिश्रण और ट्रिप्सिन डाइजेस्ट को अच्छे रिज़ॉल्यूशन और दक्षता के साथ अलग होते देखा गया। पीएमपी कॉलम के पृथक्करण प्रदर्शन की तुलना एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम से की गई थी। पेप्टाइड्स और दोनों पीएमपी कॉलम पर प्रोटीन को अच्छी तरह से हल किया हुआ और कुशल पाया गया, जो एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम से अधिक कुशल था।
पीईजी (पॉलीइथाइलीन ग्लाइकोल), यूरिया, एसिटिक एसिड, ट्राइमेथॉक्सी ऑर्थोसिलिकेट (टीएमओएस), ट्राइमिथाइल क्लोरोसिलेन (टीएमसीएस), ट्रिप्सिन, ह्यूमन सीरम एल्ब्यूमिन (एचएसए), अमोनियम क्लोराइड, यूरिया, हेक्सेन मिथाइलडिसिलाज़ेन (एचएमडीएस), मेथैक्रिलॉयल क्लोराइड (एमसी), स्टाइरीन, 4-हाइड्रॉक्सी-टेम्पो, बेंज़ोयल पेरोक्साइड (बीपीओ), एचपीएलसी ग्रेड एसीट ओनिट्राइल (एसीएन), मेथनॉल, 2-प्रोपेनॉल और एसीटोन सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से खरीदा गया।
यूरिया (8 ग्राम), पॉलीइथाइलीन ग्लाइकोल (8 ग्राम) और 8 एमएल 0.01 एन एसिटिक एसिड के मिश्रण को 10 मिनट तक हिलाया गया, और फिर बर्फ-ठंडी परिस्थितियों में 24 एमएल टीएमओएस मिलाया गया। प्रतिक्रिया मिश्रण को 6 घंटे के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया गया और फिर स्टेनलेस स्टील आटोक्लेव में 8 घंटे के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया गया। पानी डाला गया और शेष सामग्री को 70 डिग्री सेल्सियस पर सुखाया गया। 12 घंटे। सूखे नरम द्रव्यमान को ओवन में चिकना किया गया और 12 घंटों के लिए 550 डिग्री सेल्सियस पर कैलक्लाइंड किया गया। कण आकार, छिद्र आकार और सतह क्षेत्र में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता की जांच करने के लिए तीन बैच तैयार किए गए और विशेषता दी गई।
पूर्व-संश्लेषित लिगैंड फेनिलमेलिमाइड-मिथाइलविनाइलिसोसायनेट (पीसीएमपी) के साथ सिलिका कणों की सतह को संशोधित करके और उसके बाद स्टाइरीन के साथ रेडियल पोलीमराइजेशन द्वारा, एक ध्रुवीय समूह युक्त यौगिक तैयार किया गया था।समुच्चय और पॉलीस्टाइनिन श्रृंखलाओं के लिए स्थिर चरण। तैयारी प्रक्रिया नीचे वर्णित है।
एन-फेनिलमेलिमाइड (200 मिलीग्राम) और मिथाइल विनाइल आइसोसाइनेट (100 मिलीग्राम) को सूखे टोल्यूनि में घोल दिया गया था, और फेनिलमेलिमाइड-मिथाइल विनाइल आइसोसाइनेट कोपोलिमर (पीएमसीपी) तैयार करने के लिए प्रतिक्रिया फ्लास्क में 0.1 एमएल 2,2′-एज़ोइसोब्यूटिरोनिट्राइल (एआईबीएन) जोड़ा गया था। मिश्रण को 3 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया गया, फ़िल्टर किया गया और 40 डिग्री पर ओवन में सुखाया गया। 3 घंटे के लिए सी.
सूखे सिलिका कणों (2 ग्राम) को सूखे टोल्यूनि (100 एमएल) में फैलाया गया, 10 मिनट के लिए 500 एमएल गोल तल वाले फ्लास्क में हिलाया और सोनिकेट किया गया। पीएमसीपी (10 मिलीग्राम) को टोल्यूनि में घोल दिया गया और ड्रॉपिंग फ़नल के माध्यम से प्रतिक्रिया फ्लास्क में बूंद-बूंद करके जोड़ा गया। मिश्रण को 8 घंटे के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर रिफ्लक्स किया गया, फ़िल्टर किया गया और एसीटोन से धोया गया और 3 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सुखाया गया। पीएमसीपी-बंधित सिलिका कण (100 ग्राम) को टोल्यूनि (200 मिलीलीटर) में भंग कर दिया गया था और 4-हाइड्रॉक्सी-टेम्पो (2 एमएल) को उत्प्रेरक के रूप में 100 μL डिब्यूटिल्टिन डाइलौरेट की उपस्थिति में जोड़ा गया था। मिश्रण को 50 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे के लिए हिलाया गया, फ़िल्टर किया गया और 3 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर सुखाया गया।
स्टाइरीन (1 एमएल), बेंज़ॉयल पेरोक्साइड बीपीओ (0.5 एमएल), और टीईएमपीओ-पीएमसीपी-संलग्न सिलिका कण (1.5 ग्राम) को टोल्यूनि में फैलाया गया और नाइट्रोजन के साथ शुद्ध किया गया। स्टाइरीन का पोलीमराइजेशन 12 घंटे के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर किया गया। परिणामी उत्पाद को मेथनॉल से धोया गया और रात भर 60 डिग्री सेल्सियस पर सुखाया गया। समग्र प्रतिक्रिया योजना चित्र 1 में दिखाई गई है।
10-3 टोर से कम का अवशिष्ट दबाव प्राप्त करने के लिए नमूनों को 1 घंटे के लिए 393 K पर विघटित किया गया था। P/P0 = 0.99 के सापेक्ष दबाव पर अधिशोषित N2 की मात्रा का उपयोग कुल छिद्र मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया था। नंगे और लिगैंड-बंधित सिलिका कणों की आकृति विज्ञान की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (हिताची हाई टेक्नोलॉजीज, टोक्यो, जापान) के साथ जांच की गई थी। सूखे नमूने (नंगे सिलिका और लिगैंड-बॉन) डेड सिलिका कण) को चिपकने वाले कार्बन टेप का उपयोग करके एक एल्यूमीनियम स्तंभ पर रखा गया था। Q150T स्पटर कोटर का उपयोग करके नमूनों पर सोना चढ़ाया गया था, और नमूनों पर 5 एनएम एयू परत जमा की गई थी। यह कम वोल्टेज का उपयोग करके प्रक्रिया दक्षता में सुधार करता है और महीन दाने, ठंडा स्पटरिंग प्रदान करता है। मौलिक विश्लेषण के लिए एक थर्मो इलेक्ट्रॉन (वॉलथम, एमए, यूएसए) फ्लैश EA1112 मौलिक विश्लेषक का उपयोग किया गया था। एक मालवर्न (वॉस्टरशायर, यूके) मास्टरसाइज़र 200 कण आकार वितरण प्राप्त करने के लिए 0 कण आकार विश्लेषक का उपयोग किया गया था। नग्न सिलिका कण और लिगैंड-बंधित सिलिका कण (5 मिलीग्राम प्रत्येक) को 5 एमएल आइसोप्रोपेनॉल में फैलाया गया, 10 मिनट के लिए सोनिकेट किया गया, 5 मिनट के लिए भंवर में रखा गया, और मास्टरसाइज़र के ऑप्टिकल बेंच पर रखा गया। थर्मोग्रैविमेट्रिक विश्लेषण 30 से 800 डिग्री सेल्सियस के तापमान रेंज पर 5 डिग्री सेल्सियस प्रति मिनट की दर से किया गया था।
आयामों (100 × 1.8 मिमी आईडी) के ग्लास-लाइन वाले स्टेनलेस स्टील नैरो-बोर कॉलम को रेफ में उपयोग की गई समान प्रक्रिया को लागू करते हुए, स्लरी पैकिंग विधि का उपयोग करके पैक किया गया था।31. एक स्टेनलेस स्टील कॉलम (ग्लास-लाइन, 100 × 1.8 मिमी आईडी) एक आउटलेट फिटिंग के साथ जिसमें 1 माइक्रोन फ्रिट होता है, एक स्लरी पैकर (ऑलटेक डियरफील्ड, आईएल, यूएसए) से जुड़ा होता है। 1.2 एमएल मेथनॉल में 150 मिलीग्राम स्थिर चरण को निलंबित करके एक स्थिर चरण घोल तैयार करें और इसे भंडारण कॉलम में भेजें। मेथनॉल का उपयोग स्लरी विलायक के साथ-साथ प्रोपेल के रूप में भी किया गया था सॉल्वेंट डालना। 10 मिनट के लिए 100 एमपी, 15 मिनट के लिए 80 एमपी और 30 मिनट के लिए 60 एमपी का दबाव डालकर कॉलम को क्रमिक रूप से भरें। पैकिंग के दौरान, कॉलम की एक समान पैकिंग सुनिश्चित करने के लिए दो जीसी कॉलम शेकर्स (ऑलटेक, डियरफील्ड, आईएल, यूएसए) के साथ यांत्रिक कंपन लागू किया गया था। स्लरी पैकर को बंद करें और कॉलम के भीतर किसी भी क्षति को रोकने के लिए धीरे-धीरे दबाव छोड़ें। स्लरी पैकिंग यूनिट से कॉलम को डिस्कनेक्ट करें और कनेक्ट करें इसके प्रदर्शन की जांच करने के लिए इनलेट और एलसी सिस्टम में एक और फिटिंग।
एक एलसी पंप (10एडी शिमदज़ु, जापान), इंजेक्टर (वाल्को (यूएसए) सी14 डब्लू.05) 50एनएल इंजेक्शन लूप, मेम्ब्रेन डीगैसर (शिमदज़ु डीजीयू-14ए), यूवी-विज़ केशिका विंडो के साथ विशेष μLC डिवाइस डिटेक्टर (यूवी-2075) और ग्लास-लाइन वाले माइक्रोकॉलम का निर्माण किया गया था। अतिरिक्त कॉलम बैंड चौड़ीकरण के प्रभाव को कम करने के लिए बहुत संकीर्ण और छोटी कनेक्टिंग टयूबिंग का उपयोग करें। पैकेजिंग के बाद, कैपिल एरीज़ (50 μm आईडी 365 और रिड्यूसिंग यूनियन केशिकाएं (50 μm) को रिड्यूसिंग यूनियन के 1/16″ आउटलेट पर स्थापित किया गया था। मल्टीक्रो 2000 सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा संग्रह और क्रोमैटोग्राफ़िक प्रसंस्करण किया गया था। 254 एनएम एनालिटिक्स पर निगरानी यूवी अवशोषण के लिए परीक्षण की गई थी। क्रोमैटोग्राफ़िक डेटा का विश्लेषण ओरिजिनप्रो8 (नॉर्थम्प्टन, एमए) द्वारा किया गया था।
मानव सीरम से एल्ब्यूमिन, लियोफिलिज्ड पाउडर, ≥ 96% (एगरोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन) 3 मिलीग्राम को ट्रिप्सिन (1.5 मिलीग्राम), 4.0 एम यूरिया (1 एमएल), और 0.2 एम अमोनियम बाइकार्बोनेट (1 एमएल) के साथ मिलाया गया। घोल को 10 मिनट तक हिलाया गया और 6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखा गया, फिर 0.1% टीएफए के 1 एमएल से बुझाया गया। घोल को फ़िल्टर करें और स्टोर करें 4°C से नीचे.
पेप्टाइड मिश्रण और एचएसए ट्रिप्सिन डाइजेस्ट के पृथक्करण का पीएमपी कॉलम पर अलग से मूल्यांकन किया गया था। पीएमपी कॉलम द्वारा एचएसए के पेप्टाइड मिश्रण और ट्रिप्सिन डाइजेस्ट के पृथक्करण की जांच करें और परिणामों की तुलना एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम से करें। सैद्धांतिक प्लेट संख्या की गणना निम्नानुसार की जाती है:
नंगे सिलिका कणों और लिगैंड-बंधित सिलिका कणों की SEM छवियां चित्र में दिखाई गई हैं।2 .नंगे सिलिका कणों (ए, बी) की एसईएम छवियां दिखाती हैं कि, हमारे पिछले अध्ययनों के विपरीत, ये कण गोलाकार होते हैं जिनमें कण लम्बे होते हैं या अनियमित समरूपता होती है। लिगैंड-बंधित सिलिका कणों (सी, डी) की सतह नंगे सिलिका कणों की तुलना में चिकनी होती है, जो सिलिका कणों की सतह पर पॉलीस्टीरिन श्रृंखलाओं की कोटिंग के कारण हो सकती है।
नंगे सिलिका कणों (ए, बी) और लिगैंड-बॉन्ड सिलिका कणों (सी, डी) की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवियों को स्कैन करना।
नंगे सिलिका कणों और लिगैंड-बंधित सिलिका कणों के कण आकार वितरण को चित्र 3 (ए) में दिखाया गया है। आयतन-आधारित कण आकार वितरण वक्रों से पता चला है कि रासायनिक संशोधन (छवि 3 ए) के बाद सिलिका कणों का आकार बढ़ गया है। वर्तमान अध्ययन और पिछले अध्ययन से सिलिका कणों के कण आकार वितरण डेटा की तुलना तालिका 1 (ए) में की गई है। पीएमपी का आयतन-आधारित कण आकार, डी (0.5), हमारे पिछले अध्ययन की तुलना में 3.36 माइक्रोन है। 3.05 μm (पॉलीस्टाइन-बाउंड सिलिका कण) 34 के विज्ञापन (0.5) मान के साथ। प्रतिक्रिया मिश्रण में पीईजी, यूरिया, टीएमओएस और एसिटिक एसिड के अलग-अलग अनुपात के कारण इस बैच में हमारे पिछले अध्ययन की तुलना में एक संकीर्ण कण आकार वितरण था। पीएमपी चरण का कण आकार हमारे द्वारा पहले अध्ययन किए गए पॉलीस्टाइन-बाउंड सिलिका कण चरण की तुलना में थोड़ा बड़ा है। इसका मतलब है कि स्टाइरीन के साथ सिलिका कणों की सतह कार्यात्मकता सिलिका सतह पर केवल पॉलीस्टायरीन परत (0.97 µm) जमा हुई, जबकि पीएमपी चरण में परत की मोटाई 1.38 µm थी।
कण आकार वितरण (ए) और नंगे सिलिका कणों और लिगैंड-बाउंड सिलिका कणों का छिद्र आकार वितरण (बी)।
वर्तमान अध्ययन के सिलिका कणों का छिद्र आकार, छिद्र मात्रा और सतह क्षेत्र तालिका 1 (बी) में दिया गया है। नंगे सिलिका कणों और लिगैंड-बंधित सिलिका कणों के PSD प्रोफाइल चित्र 3 (बी) में दिखाए गए हैं। परिणाम हमारे पिछले अध्ययन के बराबर हैं। नंगे और लिगैंड-बाउंड सिलिका कणों के छिद्र आकार क्रमशः 310 और 241 हैं, जो इंगित करता है कि रासायनिक संशोधन के बाद छिद्र का आकार 69 तक घट जाता है, जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है। (बी), और वक्र का परिवर्तन चित्र 3 (बी) में दिखाया गया है। इसी तरह, रासायनिक संशोधन के बाद सिलिका कणों की छिद्र मात्रा 0.67 से घटकर 0.58 सेमी 3/जी हो गई। वर्तमान में अध्ययन किए गए सिलिका कणों का विशिष्ट सतह क्षेत्र 116 एम 2/जी है, जो हमारे पिछले अध्ययन (124 एम 2/जी) के बराबर है। जैसा कि तालिका 1 (बी) में दिखाया गया है, सिलिका कणों का सतह क्षेत्र (एम 2/जी) भी कम हो गया है रासायनिक संशोधन के बाद 116 m2/g से 105 m2/g तक।
स्थिर चरण के मौलिक विश्लेषण के परिणाम तालिका 2 में दिखाए गए हैं। वर्तमान स्थिर चरण की कार्बन लोडिंग 6.35% है, जो हमारे पिछले अध्ययन की कार्बन लोडिंग से कम है (पॉलीस्टाइरीन बंधुआ सिलिका कण, क्रमशः 7.93%35 और 10.21%) 42. वर्तमान स्थिर चरण की कार्बन लोडिंग कम है, क्योंकि वर्तमान एसपी की तैयारी में, स्टाइरीन के अलावा, कुछ ध्रुवीय लिगैंड जैसे फेनिलमेलिमाइड-मिथाइलविनाइलिसोसायनेट (पीसीएमपी) और 4-हाइड्रॉक्सी-टीईएमपीओ का उपयोग किया गया था। वर्तमान स्थिर चरण का नाइट्रोजन भार प्रतिशत 2.21% है, जबकि पिछले अध्ययनों में नाइट्रोजन का वजन क्रमशः 0.1735 और 0.85% था। इसका मतलब है कि फेनिलमेलिमाइड के कारण वर्तमान स्थिर चरण में नाइट्रोजन का वजन% अधिक है। इसी तरह, उत्पादों (4) और (5) की कार्बन लोडिंग 2 थी। क्रमशः 7% और 2.9%, जबकि अंतिम उत्पाद (6) की कार्बन लोडिंग 6.35% थी, जैसा कि तालिका 2 में दिखाया गया है। वजन घटाने की जांच पीएमपी स्थिर चरण के साथ की गई थी, और टीजीए वक्र चित्र 4 में दिखाया गया है। टीजीए वक्र 8.6% वजन घटाने को दर्शाता है, जो कार्बन लोडिंग (6.35%) के साथ अच्छे समझौते में है क्योंकि लिगैंड में न केवल सी बल्कि एन, ओ और एच भी होते हैं।
फेनिलमेलिमाइड-मिथाइलविनाइलिसोसायनेट लिगैंड को सिलिका कणों के सतही संशोधन के लिए चुना गया था क्योंकि इसमें ध्रुवीय फेनिलमेलिमाइड समूह और विनाइलआइसोसाइनेट समूह होते हैं। विनाइल आइसोसाइनेट समूह जीवित कट्टरपंथी पोलीमराइजेशन द्वारा स्टाइरीन के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं। दूसरा कारण एक ऐसे समूह को सम्मिलित करना है जिसमें विश्लेषक के साथ मध्यम बातचीत होती है और विश्लेषक और स्थिर चरण के बीच कोई मजबूत इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन नहीं होता है, क्योंकि फेनिलमेलिमाइड मोएटिटी में कोई आभासी चार्ज नहीं होता है। सामान्य पीएच पर। स्थिर चरण की ध्रुवता को स्टाइरीन की इष्टतम मात्रा और फ्री रेडिकल पोलीमराइजेशन के प्रतिक्रिया समय द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। प्रतिक्रिया का अंतिम चरण (फ्री-रेडिकल पोलीमराइजेशन) महत्वपूर्ण है और स्थिर चरण की ध्रुवीयता को बदल सकता है। इन स्थिर चरणों की कार्बन लोडिंग की जांच करने के लिए मौलिक विश्लेषण किया गया था। यह देखा गया कि स्टाइरीन की मात्रा और प्रतिक्रिया समय बढ़ने से स्थिर चरण की कार्बन लोडिंग में वृद्धि हुई और इसके विपरीत। स्टाइरीन की विभिन्न सांद्रता के साथ तैयार किए गए एसपी आपके पास अलग-अलग कार्बन लोडिंग हैं। फिर से, इन स्थिर चरणों को स्टेनलेस स्टील कॉलम में लोड करें और उनके क्रोमैटोग्राफिक प्रदर्शन (चयनात्मकता, रिज़ॉल्यूशन, एन मान इत्यादि) की जांच करें। इन प्रयोगों के आधार पर, नियंत्रित ध्रुवता और अच्छे विश्लेषण प्रतिधारण को सुनिश्चित करने के लिए पीएमपी स्थिर चरण तैयार करने के लिए एक अनुकूलित फॉर्मूलेशन का चयन किया गया था।
मोबाइल चरण का उपयोग करके पीएमपी कॉलम का उपयोग करके पांच पेप्टाइड मिश्रण (ग्लाइ-टायर, ग्लाइ-लेउ-टायर, ग्लाइ-ग्लाइ-टायर-आर्ग, टायर-इले-ग्लाइ-सेर-आर्ग, ल्यूसीन एनकेफेलिन) का भी मूल्यांकन किया गया;80 μL/मिनट की प्रवाह दर पर 60/40 (v/v) एसीटोनिट्राइल/पानी (0.1% TFA)। इष्टतम निक्षालन स्थितियों के तहत, सैद्धांतिक प्लेट संख्या (एन) प्रति कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) 20,000 ± 100 (200,000 प्लेट/एम²) है। तालिका 3 तीन पीएमपी कॉलम और क्रोमेटो के लिए एन मान देती है ग्राम चित्र 5ए में दिखाए गए हैं। उच्च प्रवाह दर (700 μL/मिनट) पर पीएमपी कॉलम पर तेजी से विश्लेषण, एक मिनट के भीतर पांच पेप्टाइड्स उत्सर्जित हुए, एन मान बहुत अच्छे थे, 13,500 ± 330 प्रति कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी), 135,000 प्लेट्स/एम (चित्र 5बी) के अनुरूप। तीन समान आकार के कॉलम (100 × 1.8 मिमी) आईडी) को प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता की जांच करने के लिए पीएमपी स्थिर चरण के तीन अलग-अलग लॉट के साथ पैक किया गया था। प्रत्येक कॉलम के लिए विश्लेषणात्मक एकाग्रता को प्रत्येक कॉलम पर समान परीक्षण मिश्रण को अलग करने के लिए इष्टतम रेफरेंस स्थितियों और सैद्धांतिक प्लेटों एन और अवधारण समय की संख्या का उपयोग करके दर्ज किया गया था। पीएमपी कॉलम के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता डेटा तालिका 4 में दिखाया गया है। पीएमपी कॉलम की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता बहुत कम% आरएसडी मानों के साथ अच्छी तरह से सहसंबद्ध है, जैसा कि तालिका 3 में दिखाया गया है।
पीएमपी कॉलम (बी) और एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम (ए) पर पेप्टाइड मिश्रण का पृथक्करण;मोबाइल चरण 60/40 एसीएन/एच2ओ (टीएफए 0.1%), पीएमपी कॉलम आयाम (100 × 1.8 मिमी आईडी);विश्लेषणात्मक यौगिकों का निक्षालन क्रम: 1 (ग्लाइ-टायर), 2 (ग्लाइ-ल्यू-टायर), 3 (ग्लाइ-ग्लाइ-टायर-आर्ग), 4 (टायर-इले-ग्लाइ-सेर-आर्ग) और 5 (ल्यूसीन) एसिड एनकेफेलिन))।
उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी में मानव सीरम एल्ब्यूमिन के ट्राइप्टिक डाइजेस्ट को अलग करने के लिए एक पीएमपी कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) का मूल्यांकन किया गया था। चित्र 6 में क्रोमैटोग्राम से पता चलता है कि नमूना अच्छी तरह से अलग हो गया है और रिज़ॉल्यूशन बहुत अच्छा है। एचएसए डाइजेस्ट का विश्लेषण 100 µL/मिनट की प्रवाह दर, मोबाइल चरण 70/30 एसीटोनिट्राइल/पानी और 0.1% टीएफए का उपयोग करके किया गया था। जैसा कि क्रोमैटोग्राम (चित्रा) में दिखाया गया है 6), एचएसए पाचन को 17 पेप्टाइड्स के अनुरूप 17 चोटियों में विभाजित किया गया है। एचएसए पाचन में प्रत्येक चोटी की पृथक्करण दक्षता की गणना की गई और मान तालिका 5 में दिए गए हैं।
एचएसए (100 × 1.8 मिमी आईडी) का एक ट्राइप्टिक डाइजेस्ट एक पीएमपी कॉलम पर अलग किया गया था;प्रवाह दर (100 µL/मिनट), मोबाइल चरण 60/40 एसीटोनिट्राइल/पानी 0.1% टीएफए के साथ।
जहां L स्तंभ की लंबाई है, η मोबाइल चरण की चिपचिपाहट है, ΔP स्तंभ का पिछला दबाव है, और u मोबाइल चरण का रैखिक वेग है। PMP स्तंभ की पारगम्यता 2.5 × 10-14 m2 थी, प्रवाह दर 25 μL/मिनट थी, और 60/40 v/v ACN/पानी का उपयोग किया गया था। PMP स्तंभ की पारगम्यता (100 × 1.8 मिमी आईडी) समान थी हमारे पिछले अध्ययन संदर्भ 34 के अनुसार। सतही रूप से छिद्रित कणों से भरे स्तंभ की पारगम्यता है: 1.3 माइक्रोन कणों के लिए 1.7 × 10-15, 1.7 माइक्रोन कणों के लिए 3.1 × 10-15, 2.6 माइक्रोन कणों के लिए 5.2 × 10-15 और 2.5 × 10-14 एम2, 5 माइक्रोन कणों के लिए 43। ई, पीएमपी चरण की पारगम्यता 5 माइक्रोन कोर-शेल कणों के समान है।
जहां Wx क्लोरोफॉर्म से भरे कॉलम का वजन है, Wy मेथनॉल से भरे कॉलम का वजन है, और ρ विलायक का घनत्व है। मेथनॉल का घनत्व (ρ = 0.7866) और क्लोरोफॉर्म (ρ = 1.484)। सिलिका पार्टिकल्स-सी 18 कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) 34 और सी 18-यूरिया कॉलम 3 की कुल सरंध्रता 1 जिसका हमने पहले अध्ययन किया था वह क्रमशः 0.63 और 0.55 थे। इसका मतलब है कि यूरिया लिगैंड की उपस्थिति स्थिर चरण की पारगम्यता को कम कर देती है। दूसरी ओर, पीएमपी कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) की कुल सरंध्रता 0.60 है। पीएमपी कॉलम की पारगम्यता सी18-बंधित सिलिका कणों से भरे कॉलम की तुलना में कम है क्योंकि सी18-प्रकार के स्थिर चरणों में सी18 लिगैंड सिलिका कणों से रैखिक श्रृंखलाओं के रूप में जुड़े होते हैं, जबकि पॉलीस्टाइनिन-प्रकार के स्थिर चरणों में, इसके चारों ओर एक अपेक्षाकृत मोटी बहुलक परत बनती है। एक विशिष्ट प्रयोग में, स्तंभ सरंध्रता की गणना इस प्रकार की जाती है:
चित्र 7ए,बी समान रेफरेंस शर्तों (यानी, 60/40 एसीएन/एच2ओ और 0.1% टीएफए) का उपयोग करके पीएमपी कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) और एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) दिखाते हैं।) वैन डीम्टर प्लॉट का।चयनित पेप्टाइड मिश्रण (ग्लाइ-टायर, ग्लाइ-लेउ-टायर, ग्लाइ-ग्लाइ-टायर-आर्ग, टायर-इले-ग्लाइ-सेर-आर्ग, ल्यूसीन एनकेफेलिन) 20 μL/में तैयार किए गए थे। दोनों स्तंभों के लिए न्यूनतम प्रवाह दर 800 μL/मिनट है। पीएमपी कॉलम और As के लिए इष्टतम प्रवाह दर (80 μL/मिनट) पर न्यूनतम HETP मान सेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम क्रमशः 2.6 माइक्रोमीटर और 3.9 माइक्रोमीटर थे। एचईटीपी मान इंगित करते हैं कि पीएमपी कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) की पृथक्करण दक्षता व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) से काफी बेहतर है। चित्र 7 (ए) में वैन डेम्टर प्लॉट से पता चलता है कि बढ़ते प्रवाह के साथ एन मान में कमी महत्वपूर्ण नहीं है। हमारा पिछला अध्ययन। एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम की तुलना में पीएमपी कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) की उच्च पृथक्करण दक्षता वर्तमान कार्य34 में प्रयुक्त कण आकार, आकार और जटिल कॉलम पैकिंग प्रक्रियाओं में सुधार पर आधारित है।
(ए) वैन डीमीटर प्लॉट (एचईटीपी बनाम मोबाइल चरण रैखिक वेग) 0.1% टीएफए के साथ 60/40 एसीएन/एच2ओ में एक पीएमपी कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) का उपयोग करके प्राप्त किया गया। एफए.
उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी में सिंथेटिक पेप्टाइड मिश्रण और मानव सीरम एल्ब्यूमिन (एचएएस) के ट्रिप्सिन डाइजेस्ट को अलग करने के लिए एक ध्रुवीय-एम्बेडेड पॉलीस्टीरिन स्थिर चरण तैयार किया गया था और मूल्यांकन किया गया था। पेप्टाइड मिश्रण के लिए पीएमपी कॉलम का क्रोमैटोग्राफिक प्रदर्शन पृथक्करण दक्षता और संकल्प में उत्कृष्ट है। पीएमपी कॉलम का बेहतर पृथक्करण प्रदर्शन कई कारणों से है, जैसे कि कण आकार और सिलिका कणों के छिद्र आकार, स्थिर चरण के नियंत्रित संश्लेषण, और जटिल कॉलम पैकिंग। उच्च पृथक्करण दक्षता के अलावा, उच्च प्रवाह दर पर कम कॉलम बैक दबाव इस स्थिर चरण का एक और फायदा है। पीएमपी कॉलम अच्छी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता प्रदर्शित करते हैं और विभिन्न प्रोटीनों के पेप्टाइड मिश्रण और ट्रिप्सिन पाचन के विश्लेषण के लिए उपयोग किए जा सकते हैं। हम प्राकृतिक उत्पादों, औषधीय पौधों से बायोएक्टिव यौगिकों और तरल क्रोमैटोग्राफी में फंगल अर्क को अलग करने के लिए इस कॉलम का उपयोग करने का इरादा रखते हैं। भविष्य में, पीएमपी कॉलम का मूल्यांकन प्रोटीन और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के पृथक्करण के लिए भी किया जाएगा।
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पोस्ट करने का समय: जून-05-2022