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सोल-जेल विधि द्वारा कुछ संशोधनों के साथ छिद्रयुक्त सिलिका कण तैयार किए गए, ताकि चौड़े-छिद्र वाले कण प्राप्त किए जा सकें। इन कणों को एन-फेनिलमेलेमाइड-मिथाइलविनाइल आइसोसाइनेट (पीएमआई) और स्टाइरीन के साथ रिवर्स चेन ट्रांसफर-फ्रैगमेंटेशन (आरएएफटी) पॉलीमराइजेशन के माध्यम से व्युत्पन्न किया गया, ताकि एन-फेनिलमेलेमाइड इंटरकैलेटेड पॉलियामाइड का उत्पादन किया जा सके। स्टाइरीन (पीएमपी) स्थिर चरण। संकीर्ण बोर स्टेनलेस स्टील कॉलम (100 × 1.8 मिमी आंतरिक व्यास) को एक घोल पैकिंग के साथ पैक किया गया था। पांच पेप्टाइड्स (ग्लाइ-टायर, ग्लाइ-ल्यू-टायर, ग्लाइ-ग्लाइ-टायर-आर्ग, टायर-आइल-ग्लाइ-सेर-आर्ग, ल्यू एमिनो एसिड एनकेफैलिन) और मानव सीरम एल्ब्यूमिन (एचएएस) के ट्रिप्टिक हाइड्रोलाइज़ेट से युक्त सिंथेटिक पेप्टाइड्स के मिश्रण को अलग करने के लिए पीएमपी कॉलम के क्रोमैटोग्राफिक प्रदर्शन का मूल्यांकन किया गया था। इष्टतम निक्षालन स्थितियों के तहत, पेप्टाइड्स के मिश्रण वाली प्लेटों की सैद्धांतिक संख्या 280,000 प्लेट/वर्ग मीटर तक पहुंच गई। विकसित कॉलम के पृथक्करण प्रदर्शन की तुलना वाणिज्यिक एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम से करने पर, यह देखा गया कि पृथक्करण दक्षता और संकल्प के मामले में पीएमपी कॉलम की पृथक्करण दक्षता वाणिज्यिक कॉलम से बेहतर थी।
बायोफार्मास्युटिकल उद्योग हाल के वर्षों में बाजार हिस्सेदारी में उल्लेखनीय वृद्धि के साथ एक विस्तारित वैश्विक बाजार बन गया है। बायोफार्मास्युटिकल उद्योग1,2,3 के विस्फोटक विकास के साथ पेप्टाइड और प्रोटीन विश्लेषण की बहुत आवश्यकता है। लक्ष्य पेप्टाइड के अलावा, पेप्टाइड संश्लेषण के दौरान विभिन्न अशुद्धियाँ बनती हैं, इसलिए पेप्टाइड की वांछित शुद्धता प्राप्त करने के लिए क्रोमैटोग्राफ़िक शुद्धिकरण की आवश्यकता होती है। शरीर के तरल पदार्थ, ऊतकों और कोशिकाओं में प्रोटीन का विश्लेषण और लक्षण वर्णन एक अत्यंत चुनौतीपूर्ण कार्य है क्योंकि एक ही नमूने में बड़ी संख्या में संभावित रूप से पता लगाने योग्य प्रजातियाँ मौजूद होती हैं। हालाँकि मास स्पेक्ट्रोमेट्री पेप्टाइड्स और प्रोटीन को अनुक्रमित करने के लिए एक प्रभावी उपकरण है, अगर ऐसे नमूनों को सीधे मास स्पेक्ट्रोमीटर में डाला जाता है, तो पृथक्करण असंतोषजनक होगा। एमएस विश्लेषण से पहले लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (एलसी) करके इस समस्या को हल किया जा सकता है, जो एक निश्चित समय पर मास स्पेक्ट्रोमीटर में प्रवेश करने वाले विश्लेषकों की मात्रा को कम कर देगा4,5,6। इसके अलावा, विश्लेषक तरल चरण पृथक्करण के दौरान एक संकीर्ण क्षेत्र में केंद्रित हो सकते हैं, जिससे इन विश्लेषकों का संकेन्द्रण होता है और एमएस पहचान की संवेदनशीलता बढ़ जाती है। तरल क्रोमैटोग्राफी (एलसी) पिछले दशक में काफी उन्नत हुई है और प्रोटिओमिक विश्लेषण7,8,9,10 के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली विधि बन गई है।
रिवर्स-फ़ेज़ लिक्विड क्रोमैटोग्राफ़ी (RP-LC) का व्यापक रूप से स्थिर चरण11,12,13 के रूप में ऑक्टाडेसिल-संशोधित सिलिका (ODS) का उपयोग करके पेप्टाइड्स के मिश्रण को शुद्ध करने और अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है। हालाँकि, उनकी जटिल संरचना और उभयधर्मी प्रकृति के कारण,14,15 RP स्थिर चरण पेप्टाइड्स और प्रोटीन का संतोषजनक पृथक्करण प्रदान नहीं कर सकते हैं। इसलिए, ध्रुवीय और गैर-ध्रुवीय टुकड़ों वाले पेप्टाइड्स और प्रोटीन के विश्लेषण के लिए इन विश्लेषकों के साथ बातचीत करने और उन्हें बनाए रखने के लिए विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए स्थिर चरणों की आवश्यकता होती है16। मिश्रित क्रोमैटोग्राफ़ी, जो मल्टीमॉडल इंटरैक्शन प्रदान करती है, पेप्टाइड्स, प्रोटीन और अन्य जटिल मिश्रणों को अलग करने के लिए RP-LC का विकल्प हो सकती है। कई मिश्रित-प्रकार के स्थिर चरण तैयार किए गए और इन स्थिर चरणों से भरे स्तंभों का उपयोग पेप्टाइड्स और प्रोटीन17,18,19,20,21 को अलग करने के लिए किया गया। ध्रुवीय और गैर-ध्रुवीय समूहों की उपस्थिति के कारण, मिश्रित मोड स्थिर चरण (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, ध्रुवीय इंटरकैलेशन/RPLC) पेप्टाइड्स और प्रोटीन के पृथक्करण के लिए उपयुक्त हैं22,23,24,25,26,27,28। सहसंयोजक रूप से बंधित ध्रुवीय समूहों के साथ ध्रुवीय इंटरकैलेशन स्थिर चरण ध्रुवीय और गैर-ध्रुवीय विश्लेषकों के लिए अच्छी पृथक्करण क्षमताओं और अद्वितीय चयनात्मकता दिखाते हैं क्योंकि पृथक्करण विश्लेषक और स्थिर चरण के बीच बातचीत पर निर्भर करता है मल्टीमॉडल इंटरैक्शन 29,30,31,32। हाल ही में, झांग एट अल। 30 ने पॉलीमाइन के बेहेनिल-टर्मिनेटेड स्थिर चरण प्राप्त किए और हाइड्रोकार्बन, एंटीडिप्रेसेंट्स, फ्लेवोनोइड्स, न्यूक्लियोसाइड्स, एस्ट्रोजेन और कुछ अन्य विश्लेषकों को सफलतापूर्वक अलग किया ध्रुवीय इनलाइन कॉलम (जैसे, एमाइड इनलाइन के साथ C18 कॉलम) व्यापारिक नाम एसेन्टिस एक्सप्रेस RP-एमाइड कॉलम के अंतर्गत उपलब्ध हैं, लेकिन इन कॉलमों का उपयोग केवल अमीन 33 के विश्लेषण के लिए किया गया है।
वर्तमान अध्ययन में, एक ध्रुवीय एम्बेडिंग स्थिर चरण (एन-फेनिलमैलिमाइड, एम्बेडिंग पॉलीस्टाइनिन) तैयार किया गया और पेप्टाइड पृथक्करण और ट्रिप्टिक एचएसए दरार के लिए मूल्यांकन किया गया। स्थिर चरण तैयार करने के लिए निम्नलिखित रणनीति का उपयोग किया गया था। तैयारी योजनाओं 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39 में कुछ बदलावों के साथ, हमारे पिछले प्रकाशनों में वर्णित प्रक्रियाओं के अनुसार छिद्रपूर्ण सिलिका कण तैयार किए गए थे। बड़े छिद्र आकार वाले सिलिका कणों को प्राप्त करने के लिए यूरिया, पॉलीइथिलीन ग्लाइकॉल (पीईजी), टीएमओएस और जलीय-एसिटिक एसिड के अनुपात को समायोजित किया गया था। दूसरे, एक नए फेनिलमैलिमाइड-मिथाइलविनाइल आइसोसाइनेट लिगैंड को संश्लेषित किया गया और इसके व्युत्पन्न सिलिका कणों का उपयोग ध्रुवीय एम्बेडेड स्थिर चरणों को तैयार करने के लिए किया गया। प्राप्त स्थिर चरण को एक अनुकूलित पैकिंग योजना के अनुसार एक स्टेनलेस स्टील कॉलम (आंतरिक व्यास 100 × 1.8 मिमी) में पैक किया गया था। स्तंभ के भीतर एक समान परत सुनिश्चित करने के लिए स्तंभ की पैकिंग में यांत्रिक कंपन की सहायता ली जाती है। पैक किए गए स्तंभ का मूल्यांकन पांच पेप्टाइड्स (ग्लाइ-टायर, ग्लाइ-ल्यू-टायर, ग्लाइ-ग्लाइ-टायर-आर्ग, टायर-आइल-ग्लाइ-सेर-आर्ग, ल्यूसीन-एनकेफालिन पेप्टाइड) और मानव सीरम एल्ब्यूमिन (एचएसए) के ट्रिप्टिस हाइड्रोलिसेट्स से युक्त पेप्टाइड्स के मिश्रण के पृथक्करण के लिए किया गया था। यह देखा गया कि पेप्टाइड मिश्रण और एचएसए ट्रिप्टिस डाइजेस्ट अच्छे रिज़ॉल्यूशन और दक्षता के साथ अलग हो गए। पीएमपी कॉलम की पृथक्करण दक्षता की तुलना एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम से की गई।
पीईजी (पॉलीइथिलीन ग्लाइकॉल), यूरिया, एसिटिक एसिड, ट्राइमेथॉक्सीऑर्थोसिलिकेट (टीएमओएस), ट्राइमेथिलक्लोरोसिलेन (टीएमसीएस), ट्रिप्सिन, मानव सीरम एल्ब्यूमिन (एचएसए), अमोनियम क्लोराइड, यूरिया, हेक्सामेथिलमेथैक्रिलोइलडिसिलाज़ेन (एचएमडीएस), मेथैक्रिलोइल क्लोराइड (एमसी), स्टाइरीन, 4-हाइड्रॉक्सी-टेम्पो, बेंज़ॉयल पेरोक्साइड (बीपीओ), एचपीएलसी के लिए एसीटोनिट्राइल (एसीएन), मेथनॉल, 2-प्रोपेनॉल और एसीटोन। सिग्मा-एल्ड्रिच कंपनी (सेंट लुइस, मिसौरी, यूएसए)।
यूरिया (8 ग्राम), पॉलीइथिलीन ग्लाइकॉल (8 ग्राम) और 0.01 एन. एसिटिक एसिड के 8 मिलीलीटर के मिश्रण को 10 मिनट तक हिलाया गया और बर्फ के ठंडा होने के बाद इसमें 24 मिलीलीटर टीएमओएस मिलाया गया। प्रतिक्रिया मिश्रण को स्टेनलेस स्टील ऑटोक्लेव में 40 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे और फिर 120 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे तक गर्म किया गया। पानी को छान लिया गया और अवशेषों को 70 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे तक सुखाया गया। सूखे नरम ब्लॉकों को आसानी से पीस लिया गया और 550 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे तक ओवन में शांत किया गया। कण आकार, छिद्र आकार और सतह क्षेत्र की पुनरुत्पादकता का परीक्षण करने के लिए तीन बैच तैयार किए गए और उनकी विशेषताएँ निर्धारित की गईं।
पॉलीस्टाइरीन श्रृंखलाओं के लिए ध्रुवीय समूह और स्थिर चरण। तैयारी प्रक्रिया नीचे वर्णित है।
एन-फेनिलमैलेमाइड (200 मिलीग्राम) और मिथाइल विनाइल आइसोसाइनेट (100 मिलीग्राम) को निर्जल टोल्यूनि में घोला गया, और फिर फेनिलमैलेमाइड और मिथाइल विनाइल आइसोसाइनेट (पीएमसीपी) का एक सहबहुलक प्राप्त करने के लिए प्रतिक्रिया फ्लास्क में 2,2'-एज़ोइसोब्यूटिरोनिट्राइल (एआईबीएन) की 0.1 मिली मात्रा डाली गई। मिश्रण को 60°C पर 3 घंटे तक गर्म किया गया, छानकर 40°C पर 3 घंटे तक ओवन में सुखाया गया।
सूखे सिलिका कणों (2 ग्राम) को सूखे टोल्यूनि (100 मिली) में फैलाया गया, हिलाया गया और 500 मिली गोल तल वाले फ्लास्क में 10 मिनट के लिए ध्वनिकृत किया गया। PMCP (10 मिलीग्राम) को टोल्यूनि में घोला गया और एक एडिशन फनल के माध्यम से प्रतिक्रिया फ्लास्क में बूंद-बूंद करके डाला गया। मिश्रण को 100 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे के लिए रिफ्लक्स किया गया, फ़िल्टर किया गया, एसीटोन से धोया गया और 60 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए सुखाया गया। फिर, PMCP (100 ग्राम) से जुड़े सिलिका कणों को टोल्यूनि (200 मिली) में घोला गया और उत्प्रेरक के रूप में 100 μl डाइब्यूटिलटिन डाइलॉरेट की उपस्थिति में 4-हाइड्रॉक्सी-टेम्पो (2 मिली) मिलाया गया। मिश्रण को 50 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे के लिए हिलाया गया, फ़िल्टर किया गया और 50 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए सुखाया गया।
स्टाइरीन (1 मिली), बेंज़ोयल पेरोक्साइड बीपीओ (0.5 मिली) और टेम्पो-पीएमसीपी (1.5 ग्राम) से जुड़े सिलिका कणों को टोल्यूनि में फैलाया गया और नाइट्रोजन से शुद्ध किया गया। स्टाइरीन का बहुलकीकरण 100 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे तक किया गया। परिणामी उत्पाद को मेथनॉल से धोया गया और 60 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सुखाया गया। प्रतिक्रिया की सामान्य योजना चित्र एक में दिखाई गई है।
नमूनों को 393 K पर 1 घंटे तक गैस मुक्त किया गया जब तक कि 10–3 Torr से कम का अवशिष्ट दबाव प्राप्त नहीं हो गया। सापेक्ष दबाव P/P0 = 0.99 पर अवशोषित N2 की मात्रा का उपयोग कुल छिद्र मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया था। शुद्ध और लिगैंड-बाउंड सिलिका कणों की आकृति विज्ञान की जांच एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (हिताची हाई टेक्नोलॉजीज, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके की गई थी। सूखे नमूनों (शुद्ध सिलिका और लिगैंड-बाउंड सिलिका कण) को कार्बन टेप का उपयोग करके एल्यूमीनियम की छड़ों पर रखा गया था। Q150T स्पटरिंग डिवाइस का उपयोग करके नमूने पर सोना जमा किया गया था, और नमूने पर 5 एनएम मोटी Au परत जमा की गई थी। यह कम वोल्टेज प्रक्रिया की दक्षता में सुधार करता है और ठीक ठंडा छिड़काव प्रदान करता है। तत्व विश्लेषण थर्मो इलेक्ट्रॉन (वाल्थम, एमए, यूएसए) फ्लैश EA1112 तत्व संरचना विश्लेषक का उपयोग करके किया गया था। कण आकार वितरण प्राप्त करने के लिए मालवर्न कण आकार विश्लेषक (वॉर्सेस्टरशायर, यूके) मास्टरसाइज़र 2000 का उपयोग किया गया था। बिना लेपित सिलिका कणों और लिगैंड-बाउंड सिलिका कणों (प्रत्येक 5 मिलीग्राम) को 5 मिली आइसोप्रोपेनॉल में फैलाया गया, 10 मिनट के लिए सोनिकेट किया गया, 5 मिनट के लिए हिलाया गया, और मास्टरसाइज़र ऑप्टिकल बेंच पर रखा गया। थर्मोग्रैविमेट्रिक विश्लेषण 30 से 800 डिग्री सेल्सियस के तापमान रेंज में 5 डिग्री सेल्सियस प्रति मिनट की दर से किया जाता है।
आयाम (ID 100 × 1.8 मिमी) के साथ ग्लास फाइबर लाइन वाले संकीर्ण बोर स्टेनलेस स्टील कॉलम को संदर्भ 31 के समान प्रक्रिया का पालन करते हुए घोल भरने की विधि द्वारा पैक किया गया था। स्टेनलेस स्टील कॉलम (ग्लास लाइन वाला, ID 100 × 1 .8 मिमी) और 1 µm फ्राइट युक्त आउटलेट को एक घोल पैकेजिंग मशीन (ऑलटेक डियरफील्ड, IL, USA) से जोड़ा गया था। 1.2 मिली मेथनॉल में 150 मिलीग्राम स्थिर चरण को निलंबित करके और इसे एक जलाशय कॉलम में खिलाकर स्थिर चरण का निलंबन तैयार करें। मेथनॉल का उपयोग घोल विलायक और नियंत्रण विलायक के रूप में किया गया था। 10 मिनट के लिए 100 एमपी, 15 मिनट के लिए 80 एमपी और 30 मिनट के लिए 60 एमपी का दबाव अनुक्रम लागू करके कॉलम को पैक करें स्लरी पैकर को बंद करें और स्ट्रिंग को नुकसान से बचाने के लिए धीरे-धीरे दबाव छोड़ें। कॉलम को स्लरी नोजल से अलग कर दिया गया और एक अन्य फिटिंग को इनलेट से जोड़ा गया और इसके संचालन का परीक्षण करने के लिए LC सिस्टम से जोड़ा गया।
एक कस्टम एमएलसी का निर्माण एक एलसी पंप (10एडी शिमादज़ु, जापान), एक 50 एनएल इंजेक्शन लूप (वैल्को (यूएसए) सी14 डब्ल्यू.05) के साथ एक नमूना, एक झिल्ली डिगैसर (शिमादज़ु डीजीयू-14ए), और एक यूवी-वीआईएस केशिका विंडो का उपयोग करके किया गया था। डिटेक्टर डिवाइस (यूवी-2075) और इनेमल माइक्रोकॉलम। अतिरिक्त कॉलम विस्तार के प्रभाव को कम करने के लिए बहुत संकीर्ण और छोटी कनेक्टिंग ट्यूब का उपयोग करें। कॉलम भरने के बाद, 1/16″ कम करने वाले जंक्शन के आउटलेट पर एक केशिका (50 µm आईडी 365) स्थापित करें और कम करने वाले जंक्शन के एक केशिका (50 µm) स्थापित करें।
मानव सीरम एल्ब्यूमिन, लाइओफिलाइज़्ड पाउडर, ≥ 96% (एगरोज़ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस) 3 मिलीग्राम ट्रिप्सिन (1.5 मिलीग्राम), 4.0 एम यूरिया (1 मिली) और 0.2 एम अमोनियम बाइकार्बोनेट (1 मिली) के साथ मिलाया गया। घोल को 10 मिनट तक हिलाया गया और 6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखा गया, फिर 0.1% TFA के 1 मिली से बुझाया गया। घोल को छान लें और 4 डिग्री सेल्सियस से नीचे स्टोर करें।
PMP कॉलम पर पेप्टाइड्स और ट्रिप्टिक डाइजेस्ट HSA के मिश्रण के पृथक्करण का अलग से मूल्यांकन किया गया। PMP कॉलम द्वारा अलग किए गए पेप्टाइड्स और HSA के मिश्रण के ट्रिप्टिक हाइड्रोलिसिस की जाँच करें और परिणामों की तुलना एसेंटिस एक्सप्रेस RP-एमाइड कॉलम से करें। सैद्धांतिक प्लेटों की संख्या की गणना निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके की जाती है:
शुद्ध सिलिका कणों और लिगैंड से बंधे सिलिका कणों की SEM छवियाँ चित्र 2 में दिखाई गई हैं। शुद्ध सिलिका कणों (A, B) की SEM छवियाँ एक गोलाकार आकृति दिखाती हैं जिसमें कण लम्बे होते हैं या हमारे पिछले अध्ययनों की तुलना में अनियमित सममिति रखते हैं। लिगैंड (C, D) से बंधे सिलिका कणों की सतह शुद्ध सिलिका कणों की तुलना में अधिक चिकनी होती है, जो सिलिका कणों की सतह को कवर करने वाली पॉलीस्टाइनिन श्रृंखलाओं के कारण हो सकती है।
शुद्ध सिलिका कणों (ए, बी) और लिगैंड बद्ध सिलिका कणों (सी, डी) के स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ।
शुद्ध सिलिका कणों और लिगैंड-बाउंड सिलिका कणों का कण आकार वितरण चित्र 2.3(ए) में दिखाया गया है। वॉल्यूमेट्रिक कण आकार वितरण वक्रों से पता चला कि रासायनिक संशोधन के बाद सिलिका कण आकार में वृद्धि हुई (चित्र 3ए)। वर्तमान अध्ययन और पिछले अध्ययन के सिलिका कण आकार वितरण डेटा की तुलना तालिका 1(ए) में की गई है। पीएमपी का वॉल्यूमेट्रिक कण आकार d(0.5) 3.36 µm था, जबकि हमारे पिछले अध्ययन (पॉलीस्टाइरीन बॉन्डेड सिलिका कण)34 में ad(0.5) का मान 3.05 µm था। प्रतिक्रिया मिश्रण में पीईजी, यूरिया, टीएमओएस और एसिटिक एसिड के अनुपात में बदलाव के कारण, इस बैच का कण आकार वितरण हमारे पिछले अध्ययन की तुलना में संकीर्ण था। इसका मतलब यह है कि स्टाइरीन के साथ सिलिका कणों के सतह कार्यात्मककरण ने सिलिका सतह पर केवल एक पॉलीस्टाइरीन परत (0.97 µm) जमा की, जबकि PMP चरण में परत की मोटाई 1.38 µm थी।
शुद्ध सिलिका कणों और लिगैंड बद्ध सिलिका कणों का कण आकार वितरण (ए) और छिद्र आकार वितरण (बी)।
इस अध्ययन में उपयोग किए गए सिलिका कणों के छिद्र का आकार, छिद्र की मात्रा और सतह क्षेत्र तालिका 1 (बी) में दिखाए गए हैं। शुद्ध सिलिका कणों और लिगैंड-बाउंड सिलिका कणों के PSD प्रोफाइल को चित्र 3 (बी) में दिखाया गया है। परिणाम हमारे पिछले अध्ययन34 के साथ तुलनीय थे। शुद्ध और लिगैंड-बाउंड सिलिका कणों के छिद्र आकार क्रमशः 310 Å और 241 Å थे, जो दर्शाता है कि रासायनिक संशोधन के बाद, छिद्र आकार में 69 Å की कमी आई, जैसा कि तालिका 1 (बी) में दिखाया गया है, और शिफ्ट वक्र चित्र में दिखाया गया है। वर्तमान अध्ययन में सिलिका कणों का विशिष्ट सतह क्षेत्र 116 m2/g है, जो हमारे पिछले अध्ययन (124 m2/g) के बराबर है।
स्थिर चरण के तात्विक विश्लेषण के परिणाम तालिका 2 में प्रस्तुत किए गए हैं। वर्तमान स्थिर चरण की कार्बन सामग्री 6.35% है, जो हमारे पिछले अध्ययन (पॉलीस्टाइरीन से जुड़े सिलिका कण, क्रमशः 7.93%35 और 10.21%) की तुलना में कम है। 42. वर्तमान स्थिर चरण की कार्बन सामग्री नीचे है, क्योंकि एसपी की तैयारी में स्टाइरीन के अलावा फेनिलमैलेमाइड मिथाइल विनाइल आइसोसाइनेट (पीसीएमपी) और 4-हाइड्रॉक्सी-टेम्पो जैसे कुछ ध्रुवीय लिगैंड का उपयोग किया गया है। वर्तमान स्थिर चरण में नाइट्रोजन का भार प्रतिशत 2.21% है जबकि पिछले अध्ययनों में यह 0.1735 और 0.85% था42। इसका मतलब यह है कि वर्तमान स्थिर चरण में फेनिलमैलेमाइड के कारण नाइट्रोजन का भार प्रतिशत अधिक है। इसी तरह, उत्पाद (4) और (5) में क्रमशः 2.7% और 2.9% कार्बन सामग्री है, जबकि अंतिम उत्पाद (6) में 6.35% कार्बन सामग्री है, जैसा कि तालिका 2 में दिखाया गया है। वजन घटाने के लिए परीक्षण करने के लिए पीएमपी के स्थिर चरण पर थर्मोग्रैविमेट्रिक विश्लेषण (टीजीए) का उपयोग किया गया था, और टीजीए वक्र चित्रा 4 में दिखाया गया है। टीजीए वक्र 8.6% की वजन हानि दिखाता है, जो कार्बन सामग्री (6.35%) के साथ अच्छे समझौते में है, क्योंकि लिगैंड में न केवल सी, बल्कि एन, ओ और एच भी होते हैं।
सिलिका कणों की सतह को संशोधित करने के लिए लिगैंड फेनिलमेलीमाइड-मिथाइलविनाइल आइसोसाइनेट को इसके ध्रुवीय फेनिलमेलीमाइड और विनाइल आइसोसाइनेट समूहों के कारण चुना गया था। विनाइल आइसोसाइनेट समूह जीवित मूलक बहुलकीकरण द्वारा स्टाइरीन के साथ आगे प्रतिक्रिया कर सकते हैं। दूसरा कारण एक ऐसा समूह सम्मिलित करना है जिसमें विश्लेष्य के साथ मध्यम अंतःक्रियाएं हों और विश्लेष्य और स्थिर चरण के बीच कोई मजबूत इलेक्ट्रोस्टैटिक अंतःक्रियाएं न हों, क्योंकि फेनिलमेलीमाइड अंश में सामान्य pH पर कोई आभासी आवेश नहीं होता है। स्थिर चरण की ध्रुवीयता को स्टाइरीन की इष्टतम मात्रा और मुक्त मूलक बहुलकीकरण के प्रतिक्रिया समय द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। प्रतिक्रिया का अंतिम चरण (मुक्त मूलक बहुलकीकरण) महत्वपूर्ण है क्योंकि यह स्थिर चरण की ध्रुवीयता को बदलता है। इन स्थिर चरणों में कार्बन सामग्री की जांच करने के लिए तत्व विश्लेषण किया गया था। यह देखा गया है कि स्टाइरीन की मात्रा और प्रतिक्रिया समय में वृद्धि से स्थिर चरण की कार्बन सामग्री बढ़ जाती है और इसके विपरीत। स्टाइरीन की विभिन्न सांद्रताओं से तैयार किए गए एस.पी. में अलग-अलग कार्बन लोड होते हैं। इसी तरह, इन स्थिर चरणों को स्टेनलेस स्टील के स्तंभों पर रखा गया और उनकी क्रोमैटोग्राफिक विशेषताओं (चयनात्मकता, संकल्प, एन मूल्य, आदि) की जाँच की गई। इन प्रयोगों के आधार पर, नियंत्रित ध्रुवता और विश्लेषक की अच्छी अवधारण प्रदान करने के लिए PMP स्थिर चरण की तैयारी के लिए एक अनुकूलित संरचना का चयन किया गया।
मोबाइल चरण की क्षमता का उपयोग करके पेप्टाइड्स (ग्लाइ-टायर, ग्लाइ-ल्यू-टायर, ग्लाइ-ग्लाइ-टायर-आर्ग, टायर-आइल-ग्लाइ-सेर-आर्ग, ल्यूसीन-एनकेफालिन) के पांच मिश्रणों के विश्लेषण के लिए पीएमपी कॉलम का भी मूल्यांकन किया गया। 80 ​​µl/min की प्रवाह दर पर 60/40 (v/v) ACN/पानी (0.1% TFA)। इष्टतम निक्षालन स्थितियों (200,000 प्लेट/मी) के तहत, प्रति कॉलम (100 × 1.8 मिमी) सैद्धांतिक प्लेटों (एन) की संख्या 20,000 ± 100 है। तीन पीएमपी कॉलम के लिए एन मान तालिका 3 में दिखाए गए हैं और क्रोमैटोग्राम चित्र 5ए में दिखाए गए हैं। एक PMP कॉलम पर उच्च प्रवाह दर (700 µl/min) पर तेज़ विश्लेषण, एक मिनट के भीतर पांच पेप्टाइड्स का निस्तार, प्रति कॉलम 13,500 ± 330 का उत्कृष्ट N मान (100 x 1.8 मिमी व्यास), 135,000 प्लेट/मी के बराबर (चित्र 5B)। पुनरुत्पादकता का परीक्षण करने के लिए एक ही आकार के तीन कॉलम (आंतरिक व्यास 100 x 1.8 मिमी) को PMP स्थिर चरण के तीन अलग-अलग बैचों से भरा गया था। इष्टतम निक्षालन स्थितियों, सैद्धांतिक प्लेटों की संख्या N, और अवधारण समय का उपयोग करके प्रत्येक कॉलम पर समान परीक्षण मिश्रण को अलग करके प्रत्येक कॉलम के लिए विश्लेषक रिकॉर्ड किए गए थे। PMP कॉलम के लिए पुनरुत्पादकता डेटा तालिका 4 में दिखाए गए हैं
एक पीएमपी कॉलम (बी) और एक एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम (ए) पर पेप्टाइड मिश्रण का पृथक्करण, मोबाइल चरण 60/40 एसीएन/एच2ओ (टीएफए 0.1%), पीएमपी कॉलम आयाम (100 x 1.8 मिमी आईडी), विश्लेषण यौगिकों का निक्षालन क्रम: 1 (ग्लाइ-टायर), 2 (ग्लाइ-ल्यू-टायर), 3 (ग्लाइ-ग्लाइ-टायर-आर्ग), 4 (टायर-आइल-ग्लाइ-सेर-आर्ग) और 5 (ल्यूसिक एसिड एनकेफैलिन)।
HPLC द्वारा मानव सीरम एल्ब्यूमिन के ट्रिप्टिक हाइड्रोलाइज़ेट के पृथक्करण के लिए एक PMP कॉलम (आंतरिक व्यास 100 x 1.8 मिमी) का मूल्यांकन किया गया। चित्र 6 में क्रोमैटोग्राम दिखाता है कि नमूने बहुत अच्छे रिज़ॉल्यूशन के साथ अच्छी तरह से अलग हो गए हैं। HSA समाधानों का विश्लेषण 100 μl/min की प्रवाह दर, 70/30 एसिटोनिट्राइल/पानी के एक मोबाइल चरण और 0.1% TFA का उपयोग करके किया गया था। HSA के विभाजन को 17 चोटियों में विभाजित किया गया था, जैसा कि क्रोमैटोग्राम (चित्र 6) में दिखाया गया है, जो 17 पेप्टाइड्स के अनुरूप है। HSA हाइड्रोलाइज़ेट से अलग-अलग चोटियों की पृथक्करण क्षमता की गणना की गई और मान तालिका 5 में दिखाए गए हैं।
एचएसए ट्रिप्टिक हाइड्रोलाइज़ेट्स को पीएमपी कॉलम (आंतरिक व्यास 100 x 1.8 मिमी), प्रवाह दर (100 μl/मिनट), मोबाइल चरण 60/40 एसिटोनाइट्राइल/पानी, और 0.1% टीएफए पर अलग किया गया।
जहाँ L स्तंभ की लंबाई है, η मोबाइल चरण की चिपचिपाहट है, ΔP स्तंभ का बैक प्रेशर है, और u मोबाइल चरण का रैखिक वेग है। PMP स्तंभ की पारगम्यता 2.5 × 10–14 m2 थी, प्रवाह दर 25 µl/min थी, 60/40 v/v का उपयोग किया गया था। ACN/पानी। PMP स्तंभ (ID 100 × 1.8 मिमी) की पारगम्यता हमारे पिछले संदर्भ 34 अध्ययन के समान थी। सतही रूप से छिद्रपूर्ण कणों से भरे स्तंभ की पारगम्यता 1.7×10 .6 µm है, 5 µm कणों के लिए 2.5×10-14 m243। इसलिए, PMP चरण की पारगम्यता 5 µm के आकार वाले कोर-शेल कणों की पारगम्यता के समान है।
जहाँ Wx क्लोरोफॉर्म से भरे स्तंभ का द्रव्यमान है, Wy मेथनॉल से भरे स्तंभ का द्रव्यमान है, और ρ विलायक का घनत्व है। मेथनॉल (ρ = 0.7866) और क्लोरोफॉर्म (ρ = 1.484) का घनत्व। सिलिका-C18 कण स्तंभ (100 × 1.8 मिमी ID)34 और हमारे पहले अध्ययन किए गए C18-यूरिया31 स्तंभ की कुल छिद्रता क्रमशः 0.63 और 0.55 थी। इसका मतलब है कि यूरिया लिगैंड की उपस्थिति स्थिर चरण की पारगम्यता को कम करती है। दूसरी ओर, PMP स्तंभ (आंतरिक व्यास 100 × 1.8 मिमी) की कुल छिद्रता 0.60 है। PMP स्तंभ, C18 बद्ध सिलिका कणों से भरे स्तंभों की तुलना में कम पारगम्य होते हैं, क्योंकि C18 प्रकार के स्थिर चरणों में C18 लिगैंड सिलिका कणों से रैखिक श्रृंखलाओं में जुड़े होते हैं, जबकि पॉलीस्टाइरीन प्रकार के स्थिर चरणों में कणों के चारों ओर अपेक्षाकृत मोटा बहुलक बनता है। परत A. एक विशिष्ट प्रयोग में, स्तंभ छिद्रता की गणना निम्न प्रकार से की जाती है:
चित्र 7A, B में एक PMP कॉलम (id 100 x 1.8 mm) और एक एसेन्टिस एक्सप्रेस RP-एमाइड कॉलम (id 100 x 1.8 mm) के लिए वैन डीमटर प्लॉट दिखाए गए हैं, जो समान निक्षालन स्थितियों, 60/40 ACN/H2O और 0.1% TFA 20 µl/min से 800 µl/min दोनों कॉलम पर हैं। इष्टतम प्रवाह दर (80 µl/min) पर न्यूनतम HETP मान क्रमशः PMP कॉलम और एसेन्टिस एक्सप्रेस RP-एमाइड कॉलम के लिए 2.6 µm और 3.9 µm थे। HETP मान दर्शाते हैं कि PMP कॉलम (100 x 1.8 mm id) की पृथक्करण दक्षता व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एसेन्टिस एक्सप्रेस RP-एमाइड कॉलम (100 x 1.8 mm id) की तुलना में बहुत अधिक है। चित्र 7(ए) में वैन डीमटर ग्राफ दिखाता है कि हमारे पिछले अध्ययन की तुलना में प्रवाह बढ़ने के साथ एन मूल्य में कमी उल्लेखनीय रूप से अधिक नहीं है। एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम की तुलना में पीएमपी कॉलम (आईडी 100 × 1.8 मिमी) की उच्च पृथक्करण दक्षता बेहतर कण आकार और आकार और वर्तमान कार्य में उपयोग की जाने वाली परिष्कृत कॉलम पैकिंग प्रक्रिया पर आधारित है34।
(ए) वान डीम्टर प्लॉट (एचईटीपी बनाम मोबाइल चरण रैखिक वेग) एक पीएमपी कॉलम (आईडी 100 x 1.8 मिमी) पर 60/40 एसीएन/एच2ओ में 0.1% टीएफए के साथ प्राप्त किया गया। (बी) वान डीम्टर प्लॉट (एचईटीपी बनाम मोबाइल चरण रैखिक वेग) एक एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम (आईडी 100 x 1.8 मिमी) पर 60/40 एसीएन/एच2ओ में 0.1% टीएफए के साथ प्राप्त किया गया।
उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी में सिंथेटिक पेप्टाइड्स और मानव सीरम एल्ब्यूमिन (HSA) के ट्रिप्टिक हाइड्रोलाइज़ेट के मिश्रण के पृथक्करण के लिए इंटरकैलेटेड पॉलीस्टाइनिन का एक ध्रुवीय स्थिर चरण तैयार किया गया और उसका मूल्यांकन किया गया। पेप्टाइड मिश्रणों के लिए PMP स्तंभों का क्रोमैटोग्राफ़िक प्रदर्शन पृथक्करण दक्षता और संकल्प के संदर्भ में उत्कृष्ट है। PMP स्तंभों की बेहतर पृथक्करण दक्षता कई कारणों से है जैसे सिलिका कण आकार और छिद्र आकार, स्थिर चरणों का नियंत्रित संश्लेषण और जटिल स्तंभ पैकिंग सामग्री। उच्च पृथक्करण दक्षता के अलावा, इस स्थिर चरण का एक अन्य लाभ उच्च प्रवाह दरों पर कम स्तंभ बैक प्रेशर है। PMP स्तंभ अत्यधिक पुनरुत्पादनीय हैं और इनका उपयोग पेप्टाइड्स के मिश्रण और विभिन्न प्रोटीनों के ट्रिप्टिक पाचन का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। हम इस स्तंभ का उपयोग तरल क्रोमैटोग्राफी में प्राकृतिक उत्पादों, औषधीय पौधों के अर्क और मशरूम से जैव सक्रिय यौगिकों के पृथक्करण के लिए करना चाहते हैं। भविष्य में, प्रोटीन और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के पृथक्करण के लिए भी PMP स्तंभों का मूल्यांकन किया जाएगा।
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