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एंगुस्टिफोलियस ल्यूपिन (NLL, ल्यूपिनस एंगुस्टिफोलियस एल.) एक फलीदार पौधा है जिसका उपयोग खाद्य उत्पादन और मृदा सुधार के लिए किया जाता है। फसल के रूप में NLL के वैश्विक विस्तार ने कई रोगजनक कवकों को आकर्षित किया है, जिसमें ल्यूपिन एन्थ्रेक्नोज भी शामिल है, जो विनाशकारी एन्थ्रेक्नोज रोग का कारण बनता है। दो एलील, लैनर1 और एनमैन, जो बढ़ी हुई प्रतिरोधक क्षमता प्रदान करते हैं, का उपयोग NLL प्रजनन में किया गया है, लेकिन अंतर्निहित आणविक तंत्र अज्ञात हैं। इस अध्ययन में, लैनर1 और एनमैन मार्करों का उपयोग यूरोपीय NLL नमूनों की स्क्रीनिंग के लिए किया गया था। नियंत्रित वातावरण में वैक्सीन के परीक्षण ने दोनों प्रतिरोधी दाताओं की प्रभावकारिता की पुष्टि की। प्रतिनिधि प्रतिरोधी और अतिसंवेदनशील लाइनों पर विभेदक जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग की गई। एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध जीन ऑन्कोलॉजी शब्दों "GO:0006952 रक्षा प्रतिक्रिया", "GO:0055114 रेडॉक्स प्रक्रिया", और "GO:0015979 प्रकाश संश्लेषण" की अधिक अभिव्यक्ति से जुड़ा था। इसके अलावा, Lanr1(83A:476) लाइन ने टीकाकरण के बाद तेजी से महत्वपूर्ण ट्रांसक्रिप्टोम रीप्रोग्रामिंग दिखाई, जबकि अन्य लाइनों ने इस प्रतिक्रिया में लगभग 42 घंटे की देरी दिखाई। रक्षा प्रतिक्रियाएँ TIR-NBS, CC-NBS-LRR और NBS-LRR जीन, रोगजनन में शामिल 10 प्रोटीन, लिपिड ट्रांसफर प्रोटीन, एंडोग्लूकन-1,3-β-ग्लूकोसिडेस, ग्लाइसिन-समृद्ध सेल दीवार प्रोटीन और ऑक्सीजन के प्रतिक्रियाशील पथ से जीन से जुड़ी हैं। 83A:476 की शुरुआती प्रतिक्रियाएँ, जिसमें प्रकाश संश्लेषण से जुड़े जीनों का सावधानीपूर्वक दमन शामिल है, कवक जीव विज्ञान के वनस्पति विकास चरण के दौरान सफल सुरक्षा के साथ मेल खाती हैं, जो यह सुझाव देती हैं कि एक प्रभावक प्रतिरक्षा को ट्रिगर करता है। मैंडेलोप प्रतिक्रिया धीमी हो जाती है, जैसा कि समग्र क्षैतिज खिंचाव होता है।
संकीर्ण-पत्ती वाला ल्यूपिन (NLL, ल्यूपिनस एंगुस्टिफोलियस एल.) पश्चिमी भूमध्यसागरीय क्षेत्र में उत्पन्न होने वाला एक उच्च प्रोटीन वाला अनाज है1,2। वर्तमान में इसे पशुओं और मनुष्यों के लिए खाद्य फसल के रूप में उगाया जाता है। सहजीवी नाइट्रोजन फिक्सिंग बैक्टीरिया द्वारा नाइट्रोजन फिक्सेशन और मिट्टी की संरचना में समग्र सुधार के कारण इसे फसल चक्र प्रणालियों में हरी खाद भी माना जाता है। पिछली शताब्दी में NLL का पालतूकरण तेजी से हुआ है और यह अभी भी उच्च प्रजनन दबाव3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 के अधीन है। NLL की व्यापक खेती के साथ, रोगजनक कवक के उत्तराधिकार ने नए कृषि क्षेत्रों का विकास किया और नई फसल-विनाशकारी बीमारियों का कारण बना। ल्यूपिन किसानों और प्रजनकों के लिए सबसे उल्लेखनीय बात एन्थ्रेक्नोज की उपस्थिति थी, जो रोगजनक कवक, कोलेटोट्रीकम ल्यूपिनी (बोंडार) निरेनबर्ग, फेइलर और हेगेडोर्न13 के कारण होती थी। ल्यूपिन किसानों और प्रजनकों के लिए सबसे उल्लेखनीय बात एन्थ्रेक्नोज की उपस्थिति थी, जो रोगजनक कवक, कोलेटोट्रीकम ल्यूपिनी (बोंडार) निरेनबर्ग, फेइलर और हेगेडोर्न13 के कारण होती थी। Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным грибком कोलेटोट्राइकम ल्यूपिनी (बॉन्डार) निरेनबर्ग, फ़िलर और हेगडोर्न13. ल्यूपिन किसानों और प्रजनकों के लिए सबसे उल्लेखनीय बात रोगजनक कवक कोलेटोट्रीकम ल्यूपिनी (बोंडार) निरेनबर्ग, फेइलर और हेगेडोर्न13 के कारण एन्थ्रेक्नोज का उद्भव था।अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए, कोलेटोट्राइकम ल्यूपिनी के बारे में अधिक जानकारी प्राप्त करें। (बॉन्डर) निरेनबर्ग, फीलर और हेजडोर्न13 वर्ष।अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए, कोलेटोट्राइकम ल्यूपिनी के बारे में अधिक जानकारी प्राप्त करें। (बोंडर)嵵बालों वाला。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (बोंदर) निरेनबर्ग, फीलर और हेजडोर्न13. ल्यूपिन किसानों और प्रजनकों के लिए सबसे अधिक चौंकाने वाली बात रोगजनक कवक कोलेटोट्रीकम ल्यूपिनी (बोंडार) निरेनबर्ग, फेइलर और हेगेडोर्न13 के कारण होने वाला एन्थ्रेक्नोज का उभरना है।इस बीमारी की सबसे पहली रिपोर्ट ब्राजील और संयुक्त राज्य अमेरिका से आई थी, जिसमें विशिष्ट लक्षण क्रमशः 1912 और 1929 में दिखाई दिए थे। हालाँकि, लगभग 30 वर्षों के बाद, रोगज़नक़ को कोलेटोट्रीकम ग्लोओस्पोरियोइड्स (पेन्ज़) पेन्ज़ नाम दिया गया। & Sacc., टेलोमोर्फ ग्लोमेरेला सिंगुलता (स्टोनमैन) स्पाउल्ड. & Sacc., टेलोमोर्फ ग्लोमेरेला सिंगुलता (स्टोनमैन) स्पाउल्ड. और सैक., टेलेमोमोरोप ग्लोमेरेला सिंगुलाटा (स्टोनमैन) स्पाउल्ड। & Sacc., ग्लोमेरेला सिंगुलता (स्टोनमैन) स्पाउल्ड का टेलोमॉर्फ। और Sacc., मैं एक विशेषज्ञ के रूप में काम करता हूं ग्लोमेरेला सिंगुलाटा (स्टोनमैन) स्पाउल्ड。 और Sacc., मैं एक विशेषज्ञ के रूप में काम करता हूं ग्लोमेरेला सिंगुलाटा (स्टोनमैन) स्पाउल्ड。 और सैक., ग्लोमेरेला सिंगुलाटा (स्टोनमैन) स्पाउल्ड और सेलेनापोलोमोग्राफ़ी। & सैक., ग्लोमेरेला सिंगुलता (स्टोनमैन) स्पाउल्ड इन टार्गेटेड मॉर्फोलॉजी। & एच. श्रेनक,. और एच. श्रेनक, .और एच. श्रेनक. और एच. 施伦克,。 और एच. 施伦克,。और एच. श्लेनक, .20वीं सदी के मध्य में किए गए प्रारंभिक रोग फेनोटाइपिंग ने एनएलएल और पीले ल्यूपिन (एल. ल्यूटस एल.) के प्रवेश में कुछ प्रतिरोध दिखाया, लेकिन परीक्षण किए गए सभी सफेद ल्यूपिन (एल. एल्बस एल.) प्रवेश अत्यधिक संवेदनशील थे15,16। अध्ययनों से पता चला है कि एन्थ्रेक्नोज का विकास बढ़ी हुई वर्षा (वायु आर्द्रता) और तापमान (12-28 डिग्री सेल्सियस की सीमा में) से जुड़ा हुआ है, जिससे उच्च तापमान पर प्रतिरोध का उल्लंघन होता है17, 18। वास्तव में, कोनिडिया के अंकुरित होने और बीमारी शुरू होने के लिए आवश्यक समय, उच्च आर्द्रता की स्थिति में 12 डिग्री सेल्सियस (16 घंटे) की तुलना में 24 डिग्री सेल्सियस (4 घंटे) पर चार गुना कम था19। इस प्रकार, चल रही वैश्विक गर्मी ने एन्थ्रेक्नोज के प्रसार को बढ़ावा दिया है। हालांकि, फ्रांस (1982) और यूक्रेन (1983) में इस बीमारी को आसन्न खतरे के अग्रदूत के रूप में देखा गया था, लेकिन उस समय ल्यूपिन उद्योग द्वारा इसे स्पष्ट रूप से अनदेखा कर दिया गया था20,21। कुछ वर्षों बाद, यह विनाशकारी बीमारी पूरी दुनिया में फैल गई और ऑस्ट्रेलिया, पोलैंड और जर्मनी जैसे प्रमुख ल्यूपिन उत्पादक देशों को भी प्रभावित किया22,23,24। 1990 के दशक के मध्य में एन्थ्रेक्नोज के प्रकोप के बाद, व्यापक जांच के परिणामस्वरूप NLL19 नमूनों में कई प्रतिरोधी दाताओं की पहचान हुई। एन्थ्रेक्नोज के लिए NLL प्रतिरोध को विभिन्न जर्मप्लाज्म स्रोतों में पाए जाने वाले दो अलग-अलग प्रमुख एलील द्वारा नियंत्रित किया जाता है: कल्टीवेटर तंजिल और वोंगा में लैनर1 और कल्टीवेटर में अनमैन। मांडले 25, 26। ये एलील आणविक मार्करों को पूरक करते हैं जो प्रजनन कार्यक्रमों में प्रतिरोधी जर्मप्लाज्म के चयन का समर्थन करते हैं25,26,27,28,29,30। प्रतिरोधी प्रजनन रेखा 83A:476 जिसमें Lanr1 एलील है, को अतिसंवेदनशील जंगली रेखा P27255 के साथ क्रॉस किया गया ताकि एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध के लिए अलग करने वाली RIL आबादी प्राप्त की जा सके, जिससे गुणसूत्र NLL-1131, 32, 33 को Lanr1 लोकस असाइन करना संभव हो गया। एन्थ्रेक्नोज के लिए प्रतिरोधी लोकी से लिंकेज मैप मार्करों को जीनोमिक फ्रेमवर्क के साथ संरेखित करने पर, NLL ने एक ही गुणसूत्र (NLL-11) पर सभी तीन एलील के स्थान का खुलासा किया, लेकिन अलग-अलग स्थितियों में29,34,35। हालांकि, RIL की कम संख्या और मार्करों और संबंधित एलील के बीच बड़ी आनुवंशिक दूरी के कारण, उनके अंतर्निहित जीन के बारे में कोई विश्वसनीय निष्कर्ष नहीं निकाला जा सकता है। दूसरी ओर, ल्यूपिन में रिवर्स जेनेटिक्स का उपयोग उनकी बहुत कम पुनर्जनन क्षमता के कारण मुश्किल है, जो आनुवंशिक हेरफेर को बोझिल बनाता है37।
83A:476 (Lanr1) और मैंडेलप (AnMan) जैसे समयुग्मीय अवस्था में वांछित एलील ले जाने वाले पालतू जर्मप्लाज्म के विकास ने जंगली आबादी में एलील के विरोधी संयोजनों की उपस्थिति के सामने एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध का अध्ययन करने का द्वार खोल दिया है। आणविक तंत्र की संभावनाएँ। विशिष्ट जीनोटाइप द्वारा उत्पन्न रक्षा प्रतिक्रियाओं की तुलना करें। इस अध्ययन ने C. ल्यूपिनी टीकाकरण के लिए NLL की प्रारंभिक ट्रांसक्रिप्टोम प्रतिक्रिया का मूल्यांकन किया। सबसे पहले, 215 लाइनों वाले एक यूरोपीय NLL जर्मप्लाज्म पैनल को आणविक मार्करों का उपयोग करके जांचा गया जो Lanr1 और AnMan एलील को चिह्नित करते हैं। फिर नियंत्रित परिस्थितियों में, आणविक मार्करों के लिए पहले से चयनित 50 NLL लाइनों पर एन्थ्रेक्नोज फेनोटाइपिंग की गई। इन प्रयोगों के आधार पर, एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध और लैनर1/एनमैन एलीलिक संरचना में भिन्न चार लाइनों को दो पूरक तरीकों का उपयोग करके विभेदक रक्षा जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग के लिए चुना गया: उच्च-थ्रूपुट आरएनए अनुक्रमण और वास्तविक समय पीसीआर परिमाणीकरण।
मार्कर Lanr1 (Anseq3 और Anseq4) और AnMan (Anseq4) और AnMan (AnManM1) के साथ NLL जर्मप्लाज्म (N = 215) के एक सेट की स्क्रीनिंग से पता चला कि केवल एक लाइन (95726, सलामांका-बी के पास) सभी मार्करों के लिए "प्रतिरोध" एलील को बढ़ाती है, जबकि "'संवेदनशील' एलील्स की उपस्थिति" ने 158 (~ 73.5%) लाइनों में सभी मार्करों के अनुपात को पाया। तेरह लाइनों ने Lanr1 मार्कर के दो "प्रतिरोधी" एलील का उत्पादन किया, और 8 लाइनों ने Lanr1 के "प्रतिरोधी" एलील का उत्पादन किया। मार्कर। AnMan मार्कर का "प्रतिरोध" एलील (पूरक तालिका S1)। दो लाइनें Anseq3 मार्कर के लिए विषमयुग्मी थीं और एक AnManM1 मार्कर के लिए विषमयुग्मी थी। 42 लाइनों (19.5%) में Anseq3 और Anseq4 एलील के विपरीत चरण थे, जो इन दो लोकी के बीच पुनर्संयोजन की उच्च आवृत्ति को दर्शाता है। नियंत्रित स्थितियों (पूरक तालिका S2) के तहत एन्थ्रेक्नोज फेनोटाइप ने परीक्षण किए गए जीनोटाइप के प्रतिरोध में परिवर्तनशीलता का खुलासा किया, जो एन्थ्रेक्नोज की गंभीरता में परिलक्षित हुआ। औसत स्कोर में अंतर 1.8 (मध्यम रूप से प्रतिरोधी) से 6.9 (संवेदनशील) तक था और पौधे के वजन में अंतर 0.62 (संवेदनशील) से 4.45 ग्राम (प्रतिरोधी) तक था। प्रयोग की दो प्रतिकृतियों में देखे गए मानों (रोग गंभीरता स्कोर के लिए 0.51, P = 0.00017 और पौधे के वजन के लिए 0.61, P < 0.0001) के साथ-साथ इन दो मापदंडों (- 0.59 और - 0.77, P < 0.0001) के बीच एक महत्वपूर्ण सहसंबंध था। प्रयोग की दो प्रतिकृतियों में देखे गए मानों (रोग गंभीरता स्कोर के लिए 0.51, P = 0.00017 और पौधे के वजन के लिए 0.61, P < 0.0001) के साथ-साथ इन दो मापदंडों (- 0.59 और - 0.77, P < 0.0001) के बीच एक महत्वपूर्ण सहसंबंध था। Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). प्रयोग के दो पुनरावृत्तियों में देखे गए मानों (रोग गंभीरता स्कोर के लिए 0.51, पी = 0.00017 और पौधे के वजन के लिए 0.61, पी < 0.0001) के बीच एक महत्वपूर्ण सहसंबंध पाया गया, साथ ही इन दो मापदंडों के बीच (- 0.59 और -0.77, पी < 0.0001) 0.0001)।0.51，पी = 0.00017，植物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P < 0.0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为0.51, पी = 0.00017, अधिकतम 0.61, पी <0.0001 0.59 और– 0.59 और- 0.59 और- 0.77，पी < 0.0001)。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 और масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, पी <0,0001. डुप्लिकेट में देखे गए मानों (रोग गंभीरता स्कोर 0.51, पी = 0.00017 और पौधे का वजन 0.61, पी < 0.0001) और इन दो मापदंडों (-0.59 और -0 .0001) 0.77, पी <0.0001 के बीच एक महत्वपूर्ण सहसंबंध था। ).संवेदनशील पौधों में दिखने वाले विशिष्ट लक्षणों में तने का मुड़ना और मुड़ना शामिल है जो "चरवाहे के धनुष" जैसी संरचना जैसा दिखता है, इसके बाद नारंगी/गुलाबी स्पोरोजोइट्स के साथ अंडाकार घाव होते हैं (पूरक चित्र 1)। Lanr1 (83A:476 और तंजिल) और AnMan (मंडेलप) जीन ले जाने वाले ऑस्ट्रेलियाई परिग्रहण मध्यम रूप से प्रतिरोधी हैं, 0.0331 और 0.0036)। कुछ लाइनें जो "प्रतिरोधी" Lanr1 और/या AnMan एलील भी ले जाती हैं, उनमें रोग के लक्षण दिखाई देते हैं।
दिलचस्प बात यह है कि कुछ एनएलएल लाइनों में किसी भी "प्रतिरोधी" मार्कर एलील की कमी के कारण एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध का उच्च स्तर (लैनआर1 या एनमैन जीनोटाइप के लिए तुलनीय या उससे अधिक) सामने आया, जैसे कि बोरेगिन (दोनों मापदंडों के लिए पी मूल्य < 0.0001), बोजार (स्कोर के लिए पी मूल्य < 0.0001 और पौधे के वजन के लिए 0.001) और जनसंख्या बी-549/79बी (स्कोर के लिए पी मूल्य < 0.0001 और वजन के लिए गैर-महत्वपूर्ण)। दिलचस्प बात यह है कि कुछ एनएलएल लाइनों में किसी भी "प्रतिरोधी" मार्कर एलील की कमी के कारण एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध का उच्च स्तर (लैनआर1 या एनमैन जीनोटाइप के लिए तुलनीय या उससे अधिक) सामने आया, जैसे कि बोरेगिन (दोनों मापदंडों के लिए पी मूल्य < 0.0001), बोजार (स्कोर के लिए पी मूल्य < 0.0001 और पौधे के वजन के लिए 0.001) और जनसंख्या बी-549/79बी (स्कोर के लिए पी मूल्य < 0.0001 और वजन के लिए गैर-महत्वपूर्ण)। अन्य, यह एनएलएल का एक छोटा सा टुकड़ा है, जो कि "резистентного" है маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P <0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). दिलचस्प बात यह है कि कई एनएलएल वंशावलियों में किसी भी 'प्रतिरोधी' मार्कर एलील का अभाव था, जो एन्थ्रेक्नोज के प्रति उच्च स्तर का प्रतिरोध दर्शाती थी (लैनआर1 या एनमैन जीनोटाइप के लिए तुलनीय या उससे अधिक), जैसे कि बोरेगिन (दोनों मापदंडों के लिए पी मान < 0.0001), बोजार (मूल्यांकन के लिए पी मान < 0.0001 और पौधे के भार के लिए 0.001) और जनसंख्या बी-549/79बी (मूल्यांकन के लिए पी मान < 0.0001 और भार के लिए महत्वपूर्ण नहीं)।अधिक पढ़ें或AnMan 基因型相当或更高）,例如Boregine（两个参数的P 值<0.0001）,Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值<0.0001，重量不显着）。 यह दिलचस्प है कि कुछ एनएलएल प्रणालियाँ जिनमें कोई "एंटीजेनिक" मार्कर नहीं होते हैं, उच्च क्षैतिज प्रतिरोध (लैनआर1 या एनमैन जीन के समतुल्य या उच्चतर) दिखाती हैं, जैसे बोरेगिन (दोनों पैरामीटर पी < 0.0001), बोजार (पी मान < 0.0001, पौधे का वजन 0.001) और स्ट्रेन बी-549/79बी (पी मान < 0.0001, वजन महत्वपूर्ण नहीं)। अन्यथा, यह एनएलएल नहीं है, मुझे नहीं पता कि क्या हुआ алелей «резистентности», показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 या AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), बोजर (значение P <0,0001, масса растения 0,001) और и популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). दिलचस्प बात यह है कि कुछ एनएलएल वंशक्रमों में किसी भी 'प्रतिरोध' मार्कर एलील का अभाव था, जिनमें एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध का उच्च स्तर देखा गया (लैनआर1 या एनमैन जीनोटाइप के बराबर या उससे अधिक), जैसे कि बोरेगिन (दोनों मापदंडों के लिए पी मान <0.0001), बोजार (पी-मान <0.0001, पौधे का भार 0.001) और जनसंख्या बी-549/79बी (पी-मान <0.0001, भार महत्वपूर्ण नहीं)।यह घटना प्रतिरोध के एक नए आनुवंशिक स्रोत की संभावना का सुझाव देती है, जो मार्कर जीनोटाइप और बीमारी फेनोटाइप (पी मान ~ 0.42 से ~ 0.98 तक) के बीच सहसंबंध की देखी गई कमी को स्पष्ट करती है। इस प्रकार, कोलमोगोरोव-स्मिरनोव परीक्षण ने दिखाया कि एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध पर डेटा स्कोर (पी-मान 0.25 और 0.11) और पौधे के द्रव्यमान (पी-मान 0.47 और 0.55) के लिए लगभग सामान्य रूप से वितरित किया गया था, जो सुझाव देता है कि मैं परिकल्पना करता हूं कि लैनर 1 और एनमैन की तुलना में अधिक एलील शामिल हैं।
एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध स्क्रीनिंग के परिणामों के आधार पर, ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण के लिए 4 लाइनों का चयन किया गया: 83A:476, बोरेगिन, मैंडेलप और जनसंख्या 22660। इन लाइनों को टीकाकरण प्रयोगों में एंथ्रेक्स प्रतिरोध के लिए आरएनए अनुक्रमण द्वारा फिर से परखा गया, बशर्ते कि वे पिछले परीक्षण के समान ही हों। स्कोर मान इस प्रकार थे: बोरेगिन (1.71 ± 1.39), 83A: 476 (2.09 ± 1.38), मैंडेलप (3.82 ± 1.42) और जनसंख्या 22660 (6.11 ± 1.29)।
इल्युमिना नोवासेक 6000 प्रोटोकॉल ने प्रति सैंपल औसतन 40.5 एमरीड जोड़े (29.7 से 54.4 एमरीड) हासिल किए (पूरक तालिका S3)। संदर्भ अनुक्रम में संरेखण स्कोर 75.5% से 88.6% तक था। जैविक प्रतिकृतियों के बीच प्रयोगात्मक वेरिएंट के बीच रीड काउंट डेटा का औसत सहसंबंध 0.812 से 0.997 (औसत 0.959) तक था। विश्लेषण किये गये 35,170 जीनों में से 2917 में कोई अभिव्यक्ति नहीं पायी गयी, तथा अन्य 4785 जीन नगण्य स्तर पर अभिव्यक्त हुए (आधार माध्य < 5)। विश्लेषण किये गये 35,170 जीनों में से 2917 में कोई अभिव्यक्ति नहीं पायी गयी, तथा अन्य 4785 जीन नगण्य स्तर पर अभिव्यक्त हुए (आधार माध्य < 5)। Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). विश्लेषण किये गये 35,170 जीनों में से 2917 में कोई अभिव्यक्ति नहीं देखी गयी, तथा शेष 4785 जीन नगण्य स्तर पर अभिव्यक्त हुए (आधार माध्य <5)।35,170 से अधिक लोग, 2917 से अधिक लोग, 4785 से अधिक लोग个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35,170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5). विश्लेषित 35,170 जीनों में से 2917 अभिव्यक्त नहीं थे तथा शेष 4785 जीनों की अभिव्यक्ति नगण्य थी (आधार माध्य <5)।इस प्रकार, प्रयोग के दौरान अभिव्यक्त माने जाने वाले जीनों की संख्या (आधार माध्य ≥ 5) 27,468 (78.1%) थी (पूरक तालिका S4)।
पहले समय बिंदु से, सभी एनएलएल लाइनों ने ट्रांसक्रिप्टोम को फिर से प्रोग्रामिंग करके सी. ल्यूपिनी (स्ट्रेन कोल-08) के टीकाकरण का जवाब दिया (तालिका 1), हालांकि, लाइनों के बीच महत्वपूर्ण अंतर देखे गए। इस प्रकार, प्रतिरोध रेखा 83A:476 (Lanr1 जीन को ले जाने वाली) ने पहले समय बिंदु (6 hpi) पर अन्य समय बिंदुओं की तुलना में अलग-थलग अप- और डाउन-जीनों की संख्या में 31-69 गुना वृद्धि के साथ महत्वपूर्ण ट्रांसक्रिप्टोम रीप्रोग्रामिंग दिखाई। इसके अलावा, यह शिखर अल्पकालिक था, क्योंकि केवल कुछ जीनों की अभिव्यक्ति दूसरे समय बिंदु (12 hpi) पर महत्वपूर्ण रूप से बदली रही। दिलचस्प बात यह है कि बोरेगिन, जिसने ग्राफ्ट परीक्षण में प्रतिरोध का एक उच्च स्तर भी दिखाया मैन्डेलुप और जनसंख्या 22660 दोनों ने अंतिम समय बिंदु (48 l/s) पर DEG शिखर दर्शाया, जो रक्षा प्रतिक्रियाओं में सापेक्षिक विलम्ब को दर्शाता है।
क्योंकि 83A:476 ने अन्य सभी लाइनों की तुलना में 6 HPI पर C. ल्यूपिनी के जवाब में बड़े पैमाने पर ट्रांसक्रिप्टोम रीप्रोग्रामिंग की, इस समय बिंदु पर देखे गए DEGs का ~91% वंश-विशिष्ट था (चित्र 1)। हालाँकि, अध्ययन लाइनों के बीच शुरुआती प्रतिक्रियाओं में कुछ ओवरलैप था, क्योंकि बोरेगिन, मैंडेलप और जनसंख्या 22660 में क्रमशः 68.5%, 50.9% और 52.6% DEG, कुछ समय में 83A:476 में पाए गए लोगों के साथ ओवरलैप थे। हालाँकि, ये DEGs वर्तमान में 83A:476 का उपयोग करके पता लगाए गए सभी DEGs का केवल एक छोटा सा अंश (0.97-1.70%) थे। इसके अलावा, इस समय सभी वंशों से 11 डीईजी सुसंगत थे (पूरक तालिकाएं एस4-एस6), जिनमें पादप रक्षा प्रतिक्रियाओं के सामान्य घटक शामिल हैं: लिपिड स्थानांतरण प्रोटीन (टैंजिलजी_32225), एंडोग्लूकन-1,3-β-ग्लूकोसाइड एंजाइम (टैंजिलजी_23384), दो तनाव-प्रेरित प्रोटीन जैसे एसएएम22 (टैंजिलजी_31528 और टैंजिलजी_31531), मूल लेटेक्स प्रोटीन (टैंजिलजी_32352), और दो ग्लाइसिन-समृद्ध संरचनात्मक कोशिका भित्ति प्रोटीन (टैंजिलजी_19701 और टैंजिलजी_19702)। 24 एचपीआई (कुल 16-38% डीईजी) पर 83ए:476 और बोरेगिन के बीच तथा 48 एचपीआई (कुल 14-20% डीईजी) पर मैंडेलप और पॉपुलेशन 22660 के बीच ट्रांसक्रिप्टोम प्रतिक्रियाओं में अपेक्षाकृत उच्च ओवरलैप भी था।
वेन आरेख संकीर्ण-लीव्ड ल्यूपिन (NLL) लाइनों में भिन्न रूप से व्यक्त जीन (DEG) की संख्या को दर्शाता है, जिन्हें कोलेटोट्रीकम ल्यूपिनी (विएरजेनिस, पोलैंड, 1999 में ल्यूपिन के खेतों से प्राप्त स्ट्रेन Col-08) के साथ टीका लगाया गया था। विश्लेषण की गई NLL लाइनें थीं: 83A:476 (प्रतिरोधी, Lanr1 एलील ले जाने वाली), बोरगिन (प्रतिरोधी, आनुवंशिक पृष्ठभूमि अज्ञात), मैंडेलप (मध्यम रूप से प्रतिरोधी, AnMan एलील ले जाने वाली) और जनसंख्या 22660 (बहुत संवेदनशील)। संक्षिप्त नाम hpi का अर्थ है टीकाकरण के बाद के घंटे। ग्राफ को सरल बनाने के लिए शून्य मान हटा दिए गए हैं।
6 hpi पर ओवरएक्सप्रेस्ड जीन के सेट का विश्लेषण कैनोनिकल R जीन डोमेन (सप्लीमेंट्री टेबल S7) की मौजूदगी के लिए किया गया था। इस अध्ययन ने केवल 83A:476 पर NBS-LRR डोमेन वाले क्लासिक रोग प्रतिरोधक जीन के ट्रांसक्रिप्टोम प्रेरण का खुलासा किया। इस सेट में एक TIR-NBS-LRR जीन (tanjilg_05042), पाँच CC-NBS-LRR जीन (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, और tanjilg_16162), और चार NBS-LR, Tanjilg_16162), और चार NBS-LRRE (tanjilg_16162) और साथ ही चार NBS-Lrr (tanjilg_16162) और चार NBS-LRR (TANJILG_16162) शामिल थे। इन सभी जीनों में संरक्षित अनुक्रमों में व्यवस्थित कैनोनिकल डोमेन हैं। एनबीएस-एलआरआर डोमेन जीन के अलावा, कई आरएलएल किनेसेस 6 एचपीआई पर सक्रिय किए गए, अर्थात् बोरेगिन (टैंजिलजी_19877) में एक, मंडेलप में दो (टैंजिलजी_07141 और टैंजिलजी_19877) और जनसंख्या 22660 (टैंजिलजी_09014 और टैंजिलजी_10361) में और 83ए 27:476 में दो।
सी. ल्यूपिनी (स्ट्रेन कोल-08) के साथ टीकाकरण की प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित अभिव्यक्ति वाले जीनों को जीन ऑन्टोलॉजी (जीओ) संवर्धन विश्लेषण (पूरक तालिका एस8) के अधीन किया गया। सबसे अधिक बार दर्शाया गया जैविक प्रक्रिया शब्द "GO:0006952 रक्षा प्रतिक्रिया" था, जो 16 में से 6 (समय × रेखा) संयोजनों में उच्च महत्व (पी मान < 0.001) के साथ दिखाई दिया (चित्र 2)। सबसे अधिक बार दर्शाया गया जैविक प्रक्रिया शब्द "GO:0006952 रक्षा प्रतिक्रिया" था, जो 16 में से 6 (समय × रेखा) संयोजनों में उच्च महत्व (पी मान < 0.001) के साथ दिखाई दिया (चित्र 2)। नया क्या है процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся в 6 वर्ष 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). सबसे अधिक बार दर्शाया गया जैविक प्रक्रिया शब्द 'GO:0006952 रक्षा प्रतिक्रिया' था, जो 16 में से 6 (समय x वंशावली) संयोजनों में उच्च महत्व (P मान < 0.001) के साथ दिखाई दिया (चित्र 2)।最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性(P 值< 0.001）（图2）). सबसे अधिक प्रतिनिधि जैविक प्रक्रिया शब्द "जीओ: 0006952 रक्षा प्रतिक्रिया" है, जो 16 (रक्षा प्रतिक्रिया × 线) संयोजनों में से 6 में दिखाई देता है, उच्च महत्व (पी मूल्य < 0.001) (图2) के साथ। नया क्या है "GO: 0006952 डिफेंस रिस्पांस", 6 से 16 सितंबर तक पोस्ट किया गया (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). सबसे अधिक बार प्रदर्शित जैविक प्रक्रिया शब्द 'GO:0006952 डिफेंस रिस्पांस' था, जो 16 में से 6 संयोजनों (समय x रेखा) में उच्च महत्त्व (P मान < 0.001) के साथ दिखाई दिया (चित्र 2)।यह शब्द 83A: 476 और बोरेगिन (6 और 24 hpi) में दो समय बिंदुओं पर और मंडेलप और पॉपुलेशन 22660 (क्रमशः 12 और 6 hpi) में एक समय बिंदु पर अधिक प्रतिनिधित्व किया गया था। यह एक अपेक्षित परिणाम है, जो प्रतिरोधी लाइनों की एंटीफंगल प्रतिक्रिया को उजागर करता है। इसके अलावा, 83A:476 ने "GO:0055114 रेडॉक्स प्रक्रिया" शब्द द्वारा दर्शाए गए ऑक्सीडेटिव बर्स्ट से संबंधित जीन को तेजी से प्रेरित करके सी. ल्यूपिनी पर प्रतिक्रिया व्यक्त की, जो एक विशिष्ट रक्षा प्रतिक्रिया को दर्शाता है, जबकि बोरेगिन ने 'GO' शब्द से संबंधित विशिष्ट रक्षा प्रतिक्रियाओं का खुलासा किया। :0006950 तनाव प्रतिक्रिया"। जनसंख्या 22660 ने द्वितीयक मेटाबोलाइट्स को शामिल करते हुए क्षैतिज प्रतिरोध प्रतिक्रिया को सक्रिय किया, जिसमें "जीओ:0016104 ट्राइटरपीन जैवसंश्लेषण की प्रक्रिया" और "जीओ:0006722 ट्राइटरपीन चयापचय की प्रक्रिया" (दोनों शब्द जीन के एक ही सेट से संबंधित हैं) की अत्यधिक संख्या पर प्रकाश डाला गया, जीओ शब्द संवर्धन विश्लेषण के परिणामों को ध्यान में रखते हुए, मैंडेलप प्रतिक्रिया स्थिरता बोरेगिन और जनसंख्या 22660 के बीच थी। इसके अलावा, प्रारंभिक प्रतिक्रिया 83ए:476 (6 एचपीआई) और विलंबित प्रतिक्रिया मैंडेलप और जनसंख्या 22660 में शब्द जीओ:0015979 'प्रकाश संश्लेषण' और अन्य संबंधित जैविक प्रक्रियाएं शामिल हैं।
एंथ्रेक्स ल्यूपिन (1999 में पोलैंड के विएरजेनिस में ल्यूपिन के खेतों से प्राप्त कोल-08 स्ट्रेन) के साथ टीका लगाए गए संकीर्ण-लीव्ड ल्यूपिन (एनएलएल) के ट्रांसक्रिप्टोम प्रतिक्रियाओं के दौरान भिन्न रूप से व्यक्त जीन के एनोटेशन में चयनित बायोप्रोसेस जीन ऑन्टोलॉजी शब्द बहुत अधिक अतिरंजित हैं। विश्लेषण की गई एनएलएल लाइनें ये थीं: 83ए:476 (प्रतिरोधी, होमोज़ीगस लैनर1 एलील को ले जाने वाली), बोरेगिन (प्रतिरोधी, अज्ञात आनुवंशिक पृष्ठभूमि), मैंडेलप (मध्यम रूप से प्रतिरोधी, होमोज़ीगस एनमैन एलील को ले जाने वाली) और जनसंख्या 22660 (संवेदनशील)।
क्योंकि इस अध्ययन का उद्देश्य एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध में योगदान देने वाले जीन की पहचान करना था, इसलिए GO “GO: 0006952 रक्षात्मक प्रतिक्रियाएँ” और “GO: 0055114 रेडॉक्स प्रक्रियाएँ” शब्दों को सौंपे गए जीन का विश्लेषण कट-ऑफ के साथ किया गया क्योंकि बेसलाइन का मतलब कम से कम एक लाइन के साथ ≥ 30 था। × समय में बिंदु लॉग2 (गुना परिवर्तन) के सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण मूल्यों को मिलाकर। इन मानदंडों को पूरा करने वाले जीन की संख्या GO:0006952 के लिए 65 और GO:0055114 के लिए 524 थी।
83A:476 ने GO:0006952 शब्द से एनोटेट किए गए दो DEG शिखरों का खुलासा किया, पहला 6 जीन प्रति इंच (64 जीन, ऊपर और नीचे विनियमन) और दूसरा 24 जीन प्रति इंच (15 जीन, केवल ऊपर विनियमन) पर। बोरेगिन ने यह भी दिखाया कि GO:0006952 एक ही समय बिंदु पर चरम पर था, लेकिन कम DEG (11 और 8) और अधिमान्य सक्रियण के साथ। मैंडेलूप ने 12 और 48 HPI पर GO:0006952 के दो शिखर दिखाए, दोनों में 12 जीन थे (पहला सक्रिय करने वाले जीन के साथ, और दूसरा केवल दमनकारी जीन के साथ), जबकि 6 HPI (13 जीन) पर 22660 आबादी में वृद्धि शिखर की अधिक प्रबलता थी। विनियमन। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इन चोटियों में GO:0006952 DEG का 96.4% में एक ही प्रकार की प्रतिक्रिया (ऊपर या नीचे) थी, जो शामिल जीनों की संख्या में अंतर के बावजूद रक्षा प्रतिक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण ओवरलैप का संकेत देता है। GO:0006952 शब्द से संबंधित अनुक्रमों का सबसे बड़ा समूह भुखमरी तनाव-संबंधित संदेश प्रोटीन 22 (SAM22-जैसा) को एन्कोड करता है, जो कि वर्ग 10 रोगजनन-संबंधित प्रोटीन (PR-10) प्रोटीन क्लैड और कोर प्रोटीन लेटेक्स से संबंधित है। समान (एमएलपी-जैसा) प्रोटीन) प्रोटीन (चित्र 3)। दोनों समूह अभिव्यक्ति की प्रकृति और प्रतिक्रिया की दिशा में भिन्न थे। SAM22-जैसे प्रोटीन को एन्कोड करने वाले जीन ने शुरुआती समय बिंदुओं (6 या 12 hpi) पर सुसंगत और महत्वपूर्ण प्रेरण दिखाया और आम तौर पर प्रयोग के अंत में अनुत्तरदायी थे (48 hpi), 83A:476 और मैंडेलप 48 hp/in पर, लगभग सभी अन्य डेटा बिंदु अनुत्तरदायी थे। इसके अलावा, SAM22-जैसे प्रोटीन जीन की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में अंतर ने एन्थ्रेक्नोज़ प्रतिरोध में देखी गई परिवर्तनशीलता का अनुसरण किया, क्योंकि अधिक प्रतिरोधी लाइनों में अधिक संवेदनशील जीन की तुलना में इन जीनों को महत्वपूर्ण रूप से प्रेरित करने वाले अधिक समय बिंदु थे। एक अन्य LlR18A/B-जैसे PR-10 जीन ने SAM22-जैसे प्रोटीन जीन के समान अभिव्यक्ति पैटर्न दिखाया।
जैविक प्रक्रिया शब्द "GO:0006952 रक्षा प्रतिक्रिया" के मुख्य घटकों और Lanr1 और AnMan एलील के उम्मीदवार जीनों के अभिव्यक्ति पैटर्न की पहचान की गई। लॉग2 स्केल एक ही समय बिंदु पर टीका लगाए गए (कोलेटोट्रीकम ल्यूपिनी, स्ट्रेन कोल-08, ल्यूपिन के खेतों से प्राप्त, विझेनिका, पोलैंड, 1999) और नियंत्रण (शैम-इनोक्युलेटेड) पौधों के बीच लॉग2 मान (गुना परिवर्तन) का प्रतिनिधित्व करता है। निम्नलिखित संकीर्ण पत्ती ल्यूपिन लाइनों का विश्लेषण किया गया: 83A:476 (प्रतिरोधी, समरूप Lanr1 एलील ले जाने वाला), बोरेगिन (प्रतिरोधी, आनुवंशिक पृष्ठभूमि अज्ञात), मैंडेलप (मध्यम प्रतिरोधी, समरूप AnMan एलील ले जाने वाला), और जनसंख्या 22660 (संवेदनशील)।
इसके अलावा, RNA-seq उम्मीदवार जीन Lanr1 (TanjilG_05042) और AnMan (TanjilG_12861) की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल का मूल्यांकन किया गया (चित्र 3)। TanjilG_05042 जीन ने 83A:476 पर केवल पहले समय बिंदु (6 hpi) पर एक महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया (सक्रियण) दिखाई, जबकि TanjilG_12861 केवल दो समय बिंदुओं पर मैंडेलूप में महत्वपूर्ण था: 6 hpi (डाउन रेगुलेशन) और 24 hpi (6 hpi)। समायोज्य))।
GO:0055114 "रेडॉक्स प्रक्रिया" शब्द में सबसे अधिक अभिव्यक्त जीन साइटोक्रोम P450 प्रोटीन और पेरोक्सीडेज (चित्र 4) को एनकोड करने वाले जीन थे। 6 HPI पर 83A:476 से अलग किए गए नमूनों के लिए, अधिकतम या न्यूनतम लॉग2 (गुना परिवर्तन) मान (86.6% जीन के लिए) आम तौर पर टीका लगाए गए और नियंत्रण पौधों के बीच देखे गए, जो टीका लगाए गए सेक्स के लिए इस जीनोटाइप की उच्च प्रतिक्रिया को उजागर करता है। 83A:476 ने 6 hpi (503 जीन) पर सबसे महत्वपूर्ण GO:0055114 DEG दिखाया, जबकि 48 hpi पर बाकी लाइनें (बोरेगिन, 31 जीन; मैंडेलप, 85 जीन; और पॉपुलेशन 22660, 78 जीन))। GO:0055114 परिवार के अधिकांश जीन में, टीकाकरण (सक्रियण और अवरोध) के लिए दो प्रकार की प्रतिक्रियाएँ देखी गईं। दिलचस्प बात यह है कि 48 एचपी पर मैंडेलूप में जीओ: 0055114 शब्द के लिए पहचाने गए डीईजी में से 97.6% तक ये अवलोकन बताते हैं कि, काफी छोटे पैमाने (यानी, उत्परिवर्तित रेडॉक्स जीन की संख्या, 85 बनाम 503) के बावजूद, एंथ्रेक्नोज के लिए मैंडेलूप की विलंबित ट्रांसक्रिप्टोम प्रतिक्रियाओं का पैटर्न 83ए: 476 की शुरुआती प्रतिक्रिया के समान है। बोरेगिन और जनसंख्या 22660 में, यह अभिसरण क्रमशः 51.6% और 75.6% कम है।
जैविक प्रक्रिया "GO:0055114 रेडॉक्स प्रक्रिया" शब्द के मुख्य घटकों की अभिव्यक्ति के पैटर्न का पता चला। लॉग2 स्केल टीका लगाए गए (कोलेटोट्रीकम ल्यूपिनी, स्ट्रेन कोल-08, ल्यूपिन के खेतों से प्राप्त, विझेनिका, पोलैंड, 1999) और एक ही समय बिंदु पर नियंत्रण (शैम-इनोक्युलेटेड) पौधों के बीच लॉग2 मान (गुना परिवर्तन) का प्रतिनिधित्व करता है। निम्नलिखित संकीर्ण पत्ती ल्यूपिन लाइनों का विश्लेषण किया गया: 83A:476 (प्रतिरोधी, समरूप लैनर1 एलील ले जाने वाला), बोरेगिन (प्रतिरोधी, आनुवंशिक पृष्ठभूमि अज्ञात), मैंडेलप (मध्यम प्रतिरोधी, समरूप एनमैन एलील ले जाने वाला), और जनसंख्या 22660 (संवेदनशील)।
83A:476 सी. ल्यूपिनी (स्ट्रेन कोल-08) के साथ टीकाकरण के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रतिक्रियाओं में GO:0015979 शब्द "प्रकाश संश्लेषण" और अन्य संबंधित जैविक प्रक्रियाओं (चित्र 5) के लिए जिम्मेदार जीनों की समन्वित मौनता भी शामिल थी। इस GO:0015979 DEG सेट में 105 जीन शामिल थे जो 83A:476 पर 6 hpi पर महत्वपूर्ण रूप से दमित थे। इस उपसमूह में, 37 जीन 48 HPI पर मैंडेलप में और 22660 आबादी में एक ही समय बिंदु पर 35 जीन भी डाउनरेगुलेट किए गए थे, जिसमें दोनों जीनोटाइप के लिए सामान्य 19 DEG शामिल थे। GO:0015979 शब्द से संबंधित कोई भी DEG किसी भी संयोजन (लाइन x समय) में महत्वपूर्ण रूप से सक्रिय नहीं था।
जैविक प्रक्रिया "GO:0015979 प्रकाश संश्लेषण" शब्द के मुख्य घटकों की अभिव्यक्ति के पैटर्न का पता चला। लॉग2 स्केल टीका लगाए गए (कोलेटोट्रीकम ल्यूपिनी, स्ट्रेन कोल-08, ल्यूपिन के खेतों से प्राप्त, विझेनिका, पोलैंड, 1999) और एक ही समय बिंदु पर नियंत्रण (शैम-इनोक्युलेटेड) पौधों के बीच लॉग2 मान (गुना परिवर्तन) का प्रतिनिधित्व करता है। निम्नलिखित संकीर्ण पत्ती ल्यूपिन लाइनों का विश्लेषण किया गया: 83A:476 (प्रतिरोधी, समरूप Lanr1 एलील ले जाने वाला), बोरेगिन (प्रतिरोधी, आनुवंशिक पृष्ठभूमि अज्ञात), मैंडेलप (मध्यम प्रतिरोधी, समरूप AnMan एलील ले जाने वाला), और जनसंख्या 22660 (संवेदनशील)।
विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण के परिणामों के आधार पर और संभवतः रोगजनक कवक के खिलाफ रक्षा प्रतिक्रियाओं में शामिल, सात जीनों के इस सेट को वास्तविक समय पीसीआर (पूरक तालिका एस 9) द्वारा अभिव्यक्ति प्रोफाइल की मात्रा का निर्धारण करने के लिए चुना गया था।
संभावित प्रोटीन जीन TanjilG_10657 को नियंत्रण (नकल) पौधों (पूरक तालिका S10, S11) की तुलना में सभी अध्ययन की गई लाइनों और समय बिंदुओं में महत्वपूर्ण रूप से प्रेरित किया गया था। इसके अलावा, TanjilG_10657 की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल ने सभी लाइनों के लिए प्रयोग के दौरान एक बढ़ती प्रवृत्ति दिखाई। जनसंख्या 22660 ने 114 गुना सक्रियण के साथ टीकाकरण के लिए TanjilG_10657 की उच्चतम संवेदनशीलता और 24 HPI पर उच्चतम सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर (4.4 ± 0.4) दिखाया (चित्र 6a)। PR10 LlR18A प्रोटीन जीन TanjilG_27015 ने भी सभी लाइनों और समय बिंदुओं पर सक्रियण दिखाया, जिसमें अधिकांश डेटा बिंदुओं पर सांख्यिकीय महत्व था (चित्र 6b)। टैनजिलजी_10657 के समान, टैनजिलजी_27015 का उच्चतम सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर 22660 टीकाकृत आबादी में 24 एचपीआई (19.5 ± 2.4) पर देखा गया। एसिड एंडोचिटिनेज जीन टैनजिलजी_04706 सभी लाइनों में और सभी समय बिंदुओं पर बोरेगिन 6 एचपीआई (चित्र 6सी) को छोड़कर महत्वपूर्ण रूप से अपग्रेड किया गया था। यह 83ए:476 पर पहले समय बिंदु (6 एचपीआई) पर दृढ़ता से प्रेरित हुआ (10.5 गुना) और अन्य लाइनों में मामूली रूप से बढ़ा (6.6-7.5 गुना)। प्रयोग के दौरान, टैनजिलजी_04706 की अभिव्यक्ति 83ए:476 और बोरेगिन में समान स्तर पर रही, जबकि मैंडेलप और जनसंख्या 22660 में यह काफी बढ़ गई, जो अपेक्षाकृत उच्च मूल्यों (क्रमशः 5.9 ± 1.5 और 6.2 ± 1.5) तक पहुंच गई। एंडोग्लुकन-1,3-β-ग्लूकोसिडेस-जैसे जीन टैनजिलजी_23384 ने जनसंख्या 22660 (चित्र 6डी) को छोड़कर सभी लाइनों में पहले दो समय बिंदुओं (6 और 12 एचपीआई) पर उच्च सक्रियण दिखाया। टैनजिलजी_23384 के उच्चतम सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर दूसरे समय बिंदु (12 एचपीआई) पर मैंडेलप (2.7 ± 0.3) और 83ए:476 (1.5 ± 0.1) में देखे गए। 24 एचपीआई पर, टैनजिलजी_23384 अभिव्यक्ति सभी अध्ययन की गई लाइनों में अपेक्षाकृत कम थी (0.04 ± 0.009 से 0.44 ± 0.12 तक)।
मात्रात्मक पीसीआर द्वारा चयनित जीन (एजी) की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल का पता चला। संख्या 6, 12 और 24 टीकाकरण के बाद के घंटों को दर्शाती हैं। LanDExH7 और LanTUB6 जीन का उपयोग सामान्यीकरण के लिए किया गया था और LanTUB6 का उपयोग अंतर-श्रृंखला अंशांकन के लिए किया गया था। त्रुटि बार तीन जैविक प्रतिकृतियों के आधार पर मानक विचलन को दर्शाते हैं, जिनमें से प्रत्येक तीन तकनीकी प्रतिकृतियों का औसत है। टीका लगाए गए (कोलेटोट्रीकम ल्यूपिनी, स्ट्रेन कोल-08, 1999 में विएरजेनिका, पोलैंड में ल्यूपिन क्षेत्र से प्राप्त) और नियंत्रण (नकली टीका लगाए गए) पौधों के बीच अभिव्यक्ति के स्तर में अंतर का सांख्यिकीय महत्व डेटा बिंदुओं के ऊपर चिह्नित किया गया है (* पी मूल्य < 0.05, ** पी मूल्य ≤ 0.01, *** पी मूल्य ≤ 0.001)। टीका लगाए गए (कोलेटोट्रीकम ल्यूपिनी, स्ट्रेन कोल-08, 1999 में विएरजेनिका, पोलैंड में ल्यूपिन क्षेत्र से प्राप्त) और नियंत्रण (नकली टीका लगाए गए) पौधों के बीच अभिव्यक्ति के स्तर में अंतर का सांख्यिकीय महत्व डेटा बिंदुओं के ऊपर चिह्नित किया गया है (* पी मूल्य < 0.05, ** पी मूल्य ≤ 0.01, *** पी मूल्य ≤ 0.001)। Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (कोलेटोट्रिचम ल्यूपिनी, штамм Col-08, получен в 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) और контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). टीकाकृत (कोलेटोट्रीकम ल्यूपिनी, स्ट्रेन कोल-08, 1999 में विएरजेनिस, पोलैंड में ल्यूपिन क्षेत्र से प्राप्त) और नियंत्रण (शम-टीकाकृत) पौधों के बीच अभिव्यक्ति के स्तर में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर डेटा बिंदुओं के ऊपर नोट किए गए हैं (*P मान < 0.05, **P-मान ≤ 0.01, ***P-मान ≤ 0.001)।接种（कोलेटोट्राइकम ल्यूपिनी, कर्नल-08, 1999, विएरज़ेनिका की तस्वीरें ）और पढ़ें 0.05, **पी 值≤ 0.01, ***पी 值≤ 0.001)。अधिक पढ़ें之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001)。 युरोप में Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (कोलेटोट्राइकम ल्यूपिनी, штамм Col-08, полученный с полей люпина в वैरायटी, Польша, 1999 में। отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***पी-значение ≤ 0,001). टीका लगाए गए (कोलेटोट्रीकम ल्यूपिनी, स्ट्रेन कोल-08, 1999 में पोलैंड के वेरजेनिस में ल्यूपिन के खेतों से प्राप्त) और नियंत्रण (शम-टीका लगाए गए) पौधों के बीच अभिव्यक्ति के स्तर में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर डेटा बिंदुओं के ऊपर नोट किए गए हैं (*P मान < 0.05, **P-मान ≤ 0.01, ***P-मान ≤ 0.001)।विश्लेषण की गई एनएलएल लाइनें थीं: 83ए:476 (प्रतिरोधी, समयुग्मीय लैनर1 एलील को ले जाने वाली), मैंडेलप (मध्यम प्रतिरोधी, समयुग्मीय एएनमैन एलील को ले जाने वाली), बोरेगिन (प्रतिरोधी, अज्ञात आनुवंशिक पृष्ठभूमि) और जनसंख्या 22660 (संवेदनशील)।
Lanr1 लोकस पर उम्मीदवार जीन TanjilG_05042 ने RNA-seq अध्ययनों से प्राप्त प्रोफाइल से एक स्पष्ट रूप से अलग अभिव्यक्ति पैटर्न दिखाया (चित्र 6e)। इस जीन की महत्वपूर्ण सक्रियता मैंडेलप और 22660 आबादी (क्रमशः 39.7 और 11.7 गुना तक) में देखी गई, जिसके परिणामस्वरूप अपेक्षाकृत उच्च अभिव्यक्ति स्तर (क्रमशः 1.4 ± 0.14 और 7.2 ± 1.3 तक) प्राप्त हुए। 83A:476 ने TanjilG_05042 जीन (3.8 गुना तक) के कुछ अपरेगुलेशन का भी खुलासा किया, हालांकि, प्राप्त सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर (0.044 ± 0.002) मैंडेलप और 22660 आबादी में देखे गए लोगों की तुलना में 30 गुना से भी अधिक कम थे। क्यूपीसीआर द्वारा विश्लेषण से मॉक-टीकाकृत (नियंत्रण) वेरिएंट में जीनोटाइप के बीच अभिव्यक्ति के स्तर में महत्वपूर्ण अंतर दिखाई दिया, जो आबादी 22660 और 83ए:476 के बीच 58 गुना अंतर तक पहुंच गया, साथ ही आबादी 22660 और 22660 के बीच भी अंतर था। बोरेगिन और मंडलुप के बीच दो गुना अंतर हासिल किया गया।
एनमैन लोकस पर उम्मीदवार जीन, तंजिलजी_12861, 83ए:476 और मैंडेलप में टीकाकरण के जवाब में सक्रिय हुआ, 22660 आबादी में तटस्थ था, और बोरेगिन में डाउनरेगुलेट किया गया (चित्र 6f)। तंजिलजी_12861 जीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति टीका लगाए गए 83ए:476 (0.14±0.01) में सबसे अधिक थी। 17.4 kDa वर्ग I हीट शॉक प्रोटीन जीन तंजिलजी_05080 HSP17.4 ने सभी अध्ययन किए गए उपभेदों और समय बिंदुओं में कम सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर दिखाए (चित्र 6g)। उच्चतम मान 22660 आबादी में 24 HPI पर देखा गया (0.14 ± 0.02, टीकाकरण की प्रतिक्रिया में आठ गुना वृद्धि)।
जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल की तुलना (चित्र 7) ने टैनजिलजी_10657 और चार अन्य जीनों के बीच उच्च सहसंबंध का खुलासा किया: टैनजिलजी_27015 (आर = 0.89), टैनजिलजी_05080 (आर = 0.85), टैनजिलजी_05042 (आर = 0.80), और टैनजिलजी_04706 (आर = 0.79)। ऐसे परिणाम रक्षा प्रतिक्रियाओं के दौरान इन जीनों के सह-विनियमन का संकेत दे सकते हैं। टैनजिलजी_12861 और टैनजिलजी_23384 जीन ने अन्य जीनों की तुलना में कम पियर्सन सहसंबंध गुणांक मानों (क्रमशः 0.08 से 0.43 और -0.19 से 0.28 तक) के साथ अलग-अलग अभिव्यक्ति प्रोफाइल दिखाए।
मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल के बीच सहसंबंधों का पता लगाया गया। निम्नलिखित संकीर्ण पत्ती ल्यूपिन लाइनों का विश्लेषण किया गया: 83A:476 (प्रतिरोधी, समरूपी Lanr1 एलील ले जाने वाला), मंडेलप (मध्यम प्रतिरोधी, समरूपी AnMan एलील ले जाने वाला), बोरगिन (प्रतिरोधी, आनुवंशिक पृष्ठभूमि अज्ञात), और जनसंख्या 22660 (संवेदनशील)। तीन समय बिंदुओं की गणना की गई (टीकाकरण के 6, 12 और 24 घंटे बाद), जिसमें टीका लगाए गए (कोलेटोट्रीकम ल्यूपिनी, स्ट्रेन कोल-08, 1999 में पोलैंड के विएरजेनिस में ल्यूपिन के खेतों से प्राप्त) और नियंत्रण (शम-टीकाकरण) पौधे शामिल हैं। पैमाना पियर्सन सहसंबंध गुणांक का मान दर्शाता है।
6 हॉर्सपावर प्रति इंच पर प्राप्त आंकड़ों के आधार पर, टीका लगाए गए और नियंत्रण पौधों की तुलना करके पहचाने गए 9981 डीईजी पर डब्ल्यूजीसीएनए का प्रदर्शन किया गया ताकि शुरुआती रक्षा प्रतिक्रियाओं पर ध्यान केंद्रित किया जा सके (पूरक तालिका एस12)। जीनोटाइप और प्रायोगिक वेरिएंट के बीच सहसंबंधित (सकारात्मक या नकारात्मक) अभिव्यक्ति प्रोफाइल वाले बाईस जीन मॉड्यूल (क्लस्टर) पाए गए। औसतन, जीन अभिव्यक्ति का स्तर 83A:476 > मैंडेलप > बोरेगिन > जनसंख्या 22660 के क्रम में घट रहा था (हालांकि, दोनों प्रकारों में, यह प्रवृत्ति नियंत्रण पौधों में अधिक मजबूत थी)। औसतन, जीन अभिव्यक्ति का स्तर 83A:476 > मैंडेलप > बोरेगिन > जनसंख्या 22660 के क्रम में घट रहा था (हालांकि, दोनों प्रकारों में, यह प्रवृत्ति नियंत्रण पौधों में अधिक मजबूत थी)। В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > मांडेलप > बोरगिन > जनसंख्या 22660 (в обоих вариантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). औसतन, जीन अभिव्यक्ति के स्तर में कमी इस प्रकार आई: 83A:476 > मैंडेलप > बोरेगिन > जनसंख्या 22660 (हालांकि, दोनों प्रकारों में, यह प्रवृत्ति नियंत्रण पौधों में अधिक मजबूत थी)।平均而言,基因表达水平按83A:476 > मांडेलप > बोरगिन > जनसंख्या 22660的顺序下降（然而,在两种变体中,这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 , 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> बोरगिन> जनसंख्या 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 , 这 种在 और अधिक पढ़ें В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > मंडेलुप > बोरगिन > जनसंख्या 22660 (एक अन्य प्रश्न के उत्तर में आपको एक प्रश्न पूछना होगा) दौड़). औसतन, श्रृंखला 83A:476 > मैंडेलप > बोरेगिन > जनसंख्या 22660 में जीन अभिव्यक्ति के स्तर में कमी आई (हालांकि, दोनों प्रकारों में, यह प्रवृत्ति नियंत्रण पौधों में अधिक मजबूत थी)।टीकाकरण के परिणामस्वरूप जीन अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई, विशेष रूप से मॉड्यूल 18, 19, 14, 6 और 1 (प्रभाव के अवरोही क्रम में), नकारात्मक विनियमन (जैसे मॉड्यूल 9 और 20) या तटस्थ प्रभावों के साथ (जैसे मॉड्यूल 11, 22, 8 और 13)। GO टर्म संवर्धन विश्लेषण (पूरक तालिका S13) ने अधिकतम सक्रियण के साथ टीका लगाए गए मॉड्यूल (18) के लिए "GO: 0006952 सुरक्षात्मक प्रतिक्रियाएँ" प्रकट कीं, जिसमें qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 और TanjilG_27015) द्वारा विश्लेषण किए गए जीन शामिल हैं, साथ ही कई टीका लगाए गए सबसे अधिक दबाए गए प्रकाश संश्लेषण मॉड्यूल (9) भी शामिल हैं। मॉड्यूल 18 कंसंट्रेटर (चित्र 8) की पहचान तांजिलजी_26536 जीन के रूप में की गई जो PR-10-जैसे LlR18B प्रोटीन को एनकोड करता है, और मॉड्यूल 9 कंसंट्रेटर की पहचान फोटोसिस्टम II PsbQ प्रोटीन को एनकोड करने वाले तांजिलजी_28955 जीन के रूप में की गई। एक उम्मीदवार एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध जीन Lanr1, तांजिलजी_05042, मॉड्यूल 22 (चित्र 9) में पाया गया और यह "GO:0044260 सेलुलर मैक्रोमॉलेक्यूलर मेटाबोलिक प्रक्रियाओं" और "GO:0006355 ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन, डीएनए टेम्प्लेटिंग" शब्दों से जुड़ा हुआ है जो तांजिलजी_01212 हब को ले जाता है। जीन हीट स्ट्रेस ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर A-4a (HSFA4a) को एनकोड करता है।
ओवररिप्रेजेंटेड बायोलॉजिकल प्रोसेस टर्म्स "GO: 0006952 डिफेंस रिस्पॉन्स" वाले मॉड्यूल के जीन सह-अभिव्यक्ति का भारित नेटवर्क विश्लेषण। qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 और TanjilG_27015) द्वारा विश्लेषित चार जीनों को उजागर करने के लिए लिगेशन को सरल बनाया गया।
एक मॉड्यूल के जीन सह-अभिव्यक्ति का भारित नेटवर्क विश्लेषण जिसमें एक अति-प्रतिनिधित्वित जैविक प्रक्रिया शब्द "GO: 0006355: ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन, DNA टेम्प्लेटिंग" और एक उम्मीदवार एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध जीन Lanr1 TanjilG_05042 को ले जाना शामिल है। TanjilG_05042 जीन और केंद्रीय TanjilG_01212 जीन को अलग करने के लिए बंधन को सरल बनाया गया था।
ऑस्ट्रेलिया में एकत्रित एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध जांच से पता चला कि आरंभिक रिलीज की गई अधिकांश किस्में अतिसंवेदनशील थीं; काल्या, कोरोमुप और मंडेलप को मध्यम रूप से प्रतिरोधी बताया गया है, जबकि वोंगा, तंजिल और 83A:476 को अत्यधिक प्रतिरोधी बताया गया है26,27,31. में एक ही प्रतिरोध एलील था, जिसे लैनआर1 नामित किया गया था, और कोरोमुप और मंडेलप में एक अलग एलील था, जिसे एनमैन10, 26, 39 नामित किया गया था, जबकि काल्या ने एक अलग एलील पारित किया था। , लैनआर2. जर्मनी में एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध के लिए जांच के परिणामस्वरूप एक प्रतिरोधी रेखा Bo7212 की पहचान हुई, जिसमें लैनआर1 के अलावा एक अन्य उम्मीदवार एलील था, जिसे लैनआरबो36 नामित किया गया था।
हमारे अध्ययन से पता चला कि परीक्षण किए गए जर्मप्लाज्म में Lanr1 एलील की आवृत्ति बहुत कम (लगभग 6%) है। यह अवलोकन Anseq3 और Anseq4 मार्करों का उपयोग करके पूर्वी यूरोपीय जर्मप्लाज्म की स्क्रीनिंग के परिणामों के अनुरूप है, जिसने दिखाया कि Lanr1 एलील केवल दो बेलारूसी लाइनों में मौजूद है। इससे पता चलता है कि Lanr1 एलील का अभी तक स्थानीय प्रजनन कार्यक्रमों द्वारा व्यापक रूप से उपयोग नहीं किया गया है, ऑस्ट्रेलिया के विपरीत, जहाँ यह मार्कर-सहायता प्राप्त प्रजनन के लिए प्रमुख एलील में से एक है। यह ऑस्ट्रेलियाई रिपोर्ट की तुलना में यूरोपीय क्षेत्र की स्थितियों में Lanr1 एलील द्वारा प्रदान किए गए प्रतिरोध के निम्न स्तर के कारण हो सकता है। इसके अलावा, ऑस्ट्रेलिया में उच्च वर्षा वाले क्षेत्रों में एन्थ्रेक्नोज के अध्ययनों से पता चला है कि Lanr1 एलील द्वारा मध्यस्थता की गई प्रतिरोध प्रतिक्रियाएँ मौसम की स्थितियों में प्रभावी नहीं हो सकती हैं जो रोगज़नक़ के विकास और तेज़ विकास के लिए अनुकूल हैं19,42। वास्तव में, वर्तमान अध्ययन में, Lanr1 एलील ले जाने वाले जीनोटाइप में एन्थ्रेक्नोज के कुछ लक्षण भी देखे गए, जो यह सुझाव देते हैं कि C. ल्यूपिनी के विकास के लिए इष्टतम स्थितियों में प्रतिरोध गायब हो सकता है। इसके अलावा, Anseq3 और Anseq4 मार्करों की उपस्थिति की झूठी सकारात्मक व्याख्याएं, जो Lanr1 लोकस से लगभग 1 cM दूर हैं, संभव हैं 28,30,43।
हमारे अध्ययन से पता चला है कि 83A:476, जो Lanr1 एलील को ले जाता है, ने पहले विश्लेषित समय बिंदु (6 hpi) पर बड़े पैमाने पर ट्रांसक्रिप्टोम रीप्रोग्रामिंग के साथ C. ल्यूपिनी इनोक्यूलेशन का जवाब दिया, जबकि Mandelup में, AnMan एलील को ले जाने पर, ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रतिक्रियाएं बहुत बाद में देखी गईं। (24 से 48 hp तक)। रक्षा प्रतिक्रियाओं में ये अस्थायी बदलाव रोग के लक्षणों में अंतर के साथ जुड़े हुए हैं, जो प्रतिरोध के लिए एक सफल प्रतिक्रिया के लिए प्रारंभिक रोगज़नक़ पहचान के महत्व को उजागर करते हैं। पौधे के ऊतकों को संक्रमित करने के लिए, एंथ्रेक्स बीजाणुओं को मेजबान सतह पर कई विकासात्मक चरणों से गुजरना पड़ता है, जिसमें अंकुरण, कोशिका विभाजन और एप्रेसोरियम का निर्माण शामिल है इस प्रकार, मटर के अर्क में सी. ग्लोओस्पोरियोइड्स के बीजाणुओं ने ऊष्मायन के 75-90 मिनट बाद नाभिक का पहला विभाजन, 90-120 मिनट के बाद रोगाणु नली का निर्माण और 4 घंटे 45 के बाद दमन दिखाया। आम सी. ग्लोओस्पोरियोइड्स ने ऊष्मायन के 3 घंटे बाद 40% से अधिक कोनिडियल अंकुरण और 4 घंटे बाद लगभग 20% एप्रेसर का निर्माण दिखाया। सी. ग्लोओस्पोरियोइड्स के विषाणु-संबंधी CAP20 जीन ने 4 घंटे 46 मिनट के बाद CAP20 प्रोटीन की उच्च सांद्रता के साथ एवोकैडो सतह मोम में 3.5 घंटे के ऊष्मायन के बाद एपिफाइट बनाने वाले कोनिडिया में ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि दिखाई। इसी तरह, सी. ट्राइफोलि पत्ती के ऊतकों के अध्ययनों से पता चला है कि सी. एक्यूटेटम से टीका लगाए गए स्ट्रॉबेरी में 8 एचपीआई पर पहला दमन होता है, जबकि सी. कोकोड्स से टीका लगाए गए टमाटरों में 4 एचपीआई पर पहला दमन होता है48,49। यह काफी हद तक कोलेटोट्रीकम एसपीपी की संक्रामक प्रक्रिया के समय के पैमाने के अनुरूप है। 83ए:476 के प्रति तीव्र रक्षा प्रतिक्रियाएं इस रेखा में पादप प्रतिरोध और प्रभावक-ट्रिगर प्रतिरक्षा (ईटीआई) जीन की भागीदारी का सुझाव देती हैं, जबकि मैंडेलप की विलंबित प्रतिक्रियाएं सूक्ष्म-संबंधित आणविक पैटर्न-ट्रिगर प्रतिरक्षा (एमटीआई) परिकल्पना 50 का समर्थन करती हैं। 83ए:476 और मैंडेलप के प्रति शुरुआती प्रतिक्रियाएं। विलंबित प्रतिक्रिया में ऊपर या नीचे विनियमित जीन के बीच आंशिक ओवरलैप भी इस अवधारणा का समर्थन करता है
अति-प्रतिनिधित्व शब्द जीन ऑन्टोलॉजी GO:0006952 "डिफेंस रिस्पॉन्स" से जुड़े ज़्यादातर जीन तनाव-प्रेरित उपवास संदेश 22 प्रोटीन (SAM22 के समान) के 11 समरूप हैं और सात प्रमुख लेटेक्स प्रोटीन-लाइक (MLPs) हैं। -जैसे प्रोटीन 31, 34, 43 और 423 ने अनुक्रम समानता दिखाई। SAM22-जैसे जीनों ने महत्वपूर्ण सक्रियण दिखाया जो लंबे समय तक चला, जिससे एन्थ्रेक्नोज़ प्रतिरोध के स्तर में वृद्धि देखी गई (83A:476 और बोरेगिन)। हालांकि, MLP-जैसे जीन केवल उम्मीदवार प्रतिरोध एलील (83A:476/Lanr1 6 hpi पर और मैंडेलप/AnMan 24 hpi पर) ले जाने वाली पंक्तियों में ही कम विनियमित हुए। डायपोर्थेटॉक्सिका टीकाकरण के लिए एनएलएल प्रतिरोध के हमारे पिछले अध्ययन में भी ऐसे SAM22-जैसे जीनों की समन्वित सक्रियता पाई गई थी, जो यह सुझाव देता है कि वे रक्षा प्रतिक्रिया के क्षैतिज घटकों में शामिल हैं। यह निष्कर्ष सैलिसिलिक एसिड, फंगल इंड्यूसर या हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ चोट या उपचार के लिए SAM22-जैसे जीनों की सकारात्मक प्रतिक्रिया की रिपोर्टों द्वारा भी समर्थित है।
एमएलपी-जैसे जीन कई पौधों की प्रजातियों में बैक्टीरिया, वायरल और रोगजनक फंगल संक्रमण सहित विभिन्न अजैविक और जैविक तनावों के प्रति प्रतिक्रिया करते पाए गए हैं55। पौधों और रोगजनकों के बीच कुछ अंतःक्रियाओं के प्रति प्रतिक्रिया की दिशाएँ बहुत तेज़ी से बढ़ने (यानी, वर्टिसिलियम डाहलिया के साथ कपास के संक्रमण के दौरान) से लेकर काफ़ी हद तक कम होने (यानी, अल्टरनेरिया एसपीपी के साथ सेब के पेड़ के संक्रमण के बाद) तक होती हैं56,57। एवोकैडो के एफ. नाइजर संक्रमण के प्रति बचाव के दौरान और सेब के पेड़ बोट्रियोस्फ़ेरिया बेरेन्गेरियाना एफ. सीएन. पिरिकोला और अल्टरनेरिया अल्टरनेटा के संक्रमण के दौरान एमएलपी-जैसे 423 जीन का महत्वपूर्ण डाउनरेगुलेशन देखा गया है जो सेब के पैथोटाइप हैं58,59। इसके अलावा, एमएलपी-जैसे 423 जीन को अधिक व्यक्त करने वाले सेब के कैली में प्रतिरोध-संबंधित जीन की अभिव्यक्ति कम थी और वे फंगल संक्रमण के प्रति अधिक संवेदनशील थे59। फ्यूजेरियम ऑक्सीस्पोरम एफ के बाद, एमएलपी-जैसे 423 जीन को प्रतिरोधी आम बीन जर्मप्लाज्म में भी दबा दिया गया था। सीएन। बीन संक्रमण 60।
हमारे आरएनए-सीक अध्ययन में पहचाने गए पीआर-10 परिवार के अन्य सदस्य एलएलआर18ए और एलएलआर18बी जीन थे जो अपरेग्यूलेशन की प्रतिक्रिया में थे, साथ ही लिपिड ट्रांसफर प्रोटीन डीआईआर1 के लिए अपरेगुलेटेड (1 जीन) या डाउनरेगुलेटेड (3 जीन) जीन भी थे। इसके अलावा, डब्ल्यूजीसीएनए इस मॉड्यूल में एक हब के रूप में एलएलआर18बी जीन पर प्रकाश डालता है, जो टीकाकरण के लिए अतिसंवेदनशील है और कई सुरक्षात्मक प्रतिक्रिया जीन वहन करता है। एलएलआर18ए और एलएलआर18बी जीन पीले ल्यूपिन के पत्तों में रोगजनक बैक्टीरिया की प्रतिक्रिया में प्रेरित हुए, साथ ही डी. टॉक्सिका टीकाकरण के बाद एनएलएल तनों में भी, जबकि इन जीनों के चावल समरूप, आरएसओएसपीआर10, संभवतः जैस्मोनिक एसिड सिग्नलिंग मार्ग में शामिल एक फंगल संक्रमण द्वारा तेजी से प्रेरित हुआ सुरक्षात्मक प्रतिक्रियाओं के विकास के साथ, DIR1 प्रोटीन को संक्रमण के केंद्र से फ्लोएम के माध्यम से दूर के अंगों में SAR प्रेरित करने के लिए ले जाया जाता है। दिलचस्प बात यह है कि TanjilG_02313 DIR1 जीन को पहली बार लाइन 84A:476 और जनसंख्या 22660 में महत्वपूर्ण रूप से प्रेरित किया गया था, लेकिन एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध केवल लाइन 84A:476 में सफलतापूर्वक विकसित हुआ। यह NLL में DIR1 जीन के कुछ उप-कार्यात्मककरण का संकेत दे सकता है, क्योंकि शेष तीन समरूपों ने केवल 83A:476 लाइन में 6 hpi पर टीकाकरण का जवाब दिया, और यह प्रतिक्रिया नीचे की ओर निर्देशित थी।
हमारे अध्ययन में, "GO:0055114 रेडॉक्स प्रक्रिया" नामक जैविक प्रक्रिया से संबंधित सबसे आम घटक साइटोक्रोम P450 प्रोटीन, पेरोक्सीडेज, लिनोलिक एसिड 9S-/13S-लिपोक्सीजेनेस और 1-एमिनोसाइक्लोप्रोपेन-1-कार्बोक्सिलिक एसिड ऑक्सीडेज थे। इसके अलावा, हमारा WGCNA HSFA4a समरूप को Lanr1 प्रतिरोध जीन उम्मीदवार TanjilG_05042 जैसे मॉड्यूल ले जाने वाले हब के रूप में परिभाषित करता है। HSFA4a पौधों में परमाणु प्रतिलेखन के रेडॉक्स-निर्भर विनियमन का एक घटक है।
साइटोक्रोम P450 प्रोटीन ऑक्सीडोरेडक्टेस हैं जो प्राथमिक और द्वितीयक चयापचय में एनएडीपीएच और/या O2 पर निर्भर हाइड्रॉक्सिलेशन प्रतिक्रियाओं को उत्प्रेरित करते हैं, जिसमें ज़ेनोबायोटिक्स के साथ-साथ हार्मोन, फैटी एसिड, स्टेरोल्स, कोशिका भित्ति घटक, बायोपॉलिमर और सुरक्षात्मक यौगिकों के जैवसंश्लेषण का चयापचय शामिल है 69। हमारे एक अध्ययन में, बड़ी संख्या में परिवर्तित होमोलॉग्स (37) और विशिष्ट जीनों के बीच प्रतिक्रिया पैटर्न में अंतर के कारण पादप साइटोक्रोम P450 कार्य में परिवर्तनशीलता -10.6 लॉग2 (गुना परिवर्तन) से घटकर 5.7 हो गई, जो ऊपर की ओर संशोधन को दर्शाती है। इतने बड़े प्रोटीन सुपरफैमिली में एनएलएल जीन के कथित जैविक कार्य को स्पष्ट करने के लिए केवल आरएनए-सीक्वेंस डेटा का उपयोग करना
क्लास III पेरोक्सीडेस बहुक्रियाशील पादप एंजाइम हैं जो पौधों की वृद्धि और विकास के दौरान चयापचय प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में शामिल होते हैं, साथ ही साथ लवणता, सूखा, उच्च प्रकाश तीव्रता और रोगजनक हमले जैसे पर्यावरणीय तनावों की प्रतिक्रिया में भी शामिल होते हैं72. पेरोक्सीडेस एंथ्रेसिस के साथ कई पौधों की प्रजातियों की परस्पर क्रिया में शामिल होते हैं, जिनमें स्टाइलोसेन्थेस ह्यूमिलिस और सी. ग्लोओस्पोरियोइड्स, लेंस क्यूलिनरिस और सी. ट्रंकैटम, फेजोलस वल्गेरिस और सी. लिंडेमुथिएनम, क्यूकुमिस सैटिवस और सी. लैगेनेरियम73,74,75,76 शामिल हैं. प्रतिक्रिया बहुत तेज़ होती है, कभी-कभी 4 एचपीआई पर भी, इससे पहले कि कवक पौधे के ऊतकों में प्रवेश करे73. पेरोक्सीडेस जीन ने डी. टॉक्सिका एनएलएल टीकाकरण पर भी प्रतिक्रिया दी. ऑक्सीडेटिव बर्स्ट को विनियमित करने या ऑक्सीडेटिव तनाव को खत्म करने के अपने विशिष्ट कार्यों के अलावा, पेरोक्सीडेस लिग्निफिकेशन, सबयूनिट या विशिष्ट यौगिकों के क्रॉस-लिंकिंग के दौरान सेल वॉल सुदृढीकरण के आधार पर भौतिक अवरोधों का निर्माण करके रोगजनक विकास में हस्तक्षेप कर सकते हैं। इस कार्य को सिलिको में टैनजिलजी_03329 जीन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है जो एक संभावित लिग्निन-फॉर्मिंग एनियन पेरोक्सीडेस को एन्कोड करता है जो हमारे अध्ययन में 83A:476 प्रतिरोधी लाइन में 6 एचपीआई पर काफी हद तक अपग्रेड किया गया था, लेकिन अन्य उपभेदों और समय बिंदुओं में नहीं जो प्रतिक्रिया नहीं करते थे।
लिनोलेइक एसिड का 9S-/13S-लिपोक्सीजिनेज लिपिड जैवसंश्लेषण के ऑक्सीडेटिव मार्ग में पहला कदम है78। इस मार्ग के उत्पादों में पौधों की रक्षा में कई कार्य होते हैं, जिसमें कॉलोज़ और पेक्टिन जमा के गठन के माध्यम से कोशिका भित्ति को मजबूत करना और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन के माध्यम से ऑक्सीडेटिव तनाव का विनियमन शामिल है79,80,81,82,83। वर्तमान अध्ययन में, सभी उपभेदों में लिनोलेइक एसिड 9S-/13S-लिपोक्सीजिनेज की अभिव्यक्ति बदल गई थी, लेकिन अतिसंवेदनशील आबादी 22660 में, अलग-अलग समय बिंदुओं पर अपरेगुलेशन प्रबल था, जबकि प्रतिरोधी लैनर1 और एनमैन एलील ले जाने वाले उपभेदों में, यह इन जीनोटाइप के बीच सुरक्षात्मक एंथ्रेक्स प्रतिक्रियाओं में ऑक्सीलिपिन परत के विविधीकरण पर जोर देता है।
ल्यूपिन के साथ टीका लगाए जाने पर 1-एमिनोसाइक्लोप्रोपेन-1-कार्बोक्सिलेट ऑक्सीडेज (ACO) समरूप काफी हद तक बढ़ा (9 जीन) या घटा (2 जीन) हुआ। दो अपवादों के साथ, ये सभी प्रतिक्रियाएँ 6 hp पर हुईं। 83A:476 पर। ACO प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता वाली एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया एथिलीन उत्पादन में दर-सीमित करने वाला चरण है और इसलिए इसे अत्यधिक विनियमित किया जाता है84। एथिलीन एक पादप हार्मोन है जो पौधे के विकास और अजैविक और जैविक तनाव स्थितियों के प्रति प्रतिक्रिया को विनियमित करने में विभिन्न भूमिकाएँ निभाता है। ACO प्रतिलेखन का प्रेरण और एथिलीन सिग्नलिंग मार्ग का सक्रियण प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों और फाइटोएलेक्सिन के उत्पादन को विनियमित करके हेमीबायोट्रोफिक कवक ओराइज़े ओराइज़े के प्रति चावल के प्रतिरोध को बढ़ाने में शामिल है। इस अध्ययन में रिपोर्ट की गई 83A:476 लाइन में ACO समरूपों के एक महत्वपूर्ण उत्थान की पृष्ठभूमि के खिलाफ, एम। ओराइज़े और सी। ल्यूपिनी 88,89 के बीच पाई गई एक बहुत ही समान पत्ती संक्रमण प्रक्रिया, आणविक मार्गों में एक केंद्रीय संकेत चरण एनएलएल एन्थ्रेक्नोज एथिलीन के लिए प्रतिरोध प्रदान करने की संभावना को बदल देती है।
वर्तमान अध्ययन में, 83A:476 में 6 hpi पर और मंडेलोप और 22660 जनसंख्या में 48 hpi पर प्रकाश संश्लेषण से जुड़े कई जीनों का बड़े पैमाने पर दमन देखा गया। इन परिवर्तनों की सीमा और प्रगति स्तर के समानुपातिक है। इस प्रयोग में एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध देखा गया। हाल ही में, रोगजनक बैक्टीरिया और कवक सहित पौधे-रोगज़नक़ इंटरैक्शन के कई मॉडलों में प्रकाश संश्लेषण से संबंधित प्रतिलेखों के मजबूत और शुरुआती दमन की सूचना मिली है। संक्रमण के जवाब में प्रकाश संश्लेषण से जुड़े जीनों का जल्दबाजी (कुछ इंटरैक्शन में 2 HPI से) और वैश्विक दमन प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की तैनाती और एलर्जी प्रतिक्रियाओं की मध्यस्थता करने के लिए सैलिसिलिक एसिड मार्ग के साथ उनकी बातचीत के आधार पर पौधे की प्रतिरक्षा को ट्रिगर कर सकता है 90,94।
निष्कर्ष में, सबसे अधिक प्रतिरोधी वंश (83A:476) के लिए प्रस्तावित रक्षा प्रतिक्रिया तंत्र में आर जीन (संभवतः TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) द्वारा तेजी से रोगजनक पहचान और एलर्जी प्रतिक्रिया-मध्यस्थ सैलिसिलिक एसिड और एथिलीन सिग्नलिंग शामिल है, इसके बाद लंबी दूरी की SAR की स्थापना होती है। कार्रवाई DIR-1 प्रोटीन द्वारा समर्थित है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सी. ल्यूपिनी संक्रमण के लिए बायोट्रॉफ़िक अवधि बहुत कम (लगभग 2 दिन) है, जिसके बाद नेक्रोटिक वृद्धि95 होती है। इन चरणों के बीच संक्रमण नेक्रोसिस और एथिलीन-प्रेरित प्रोटीन की अभिव्यक्ति से जुड़ा हो सकता है जो मेजबान पौधों में अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाओं के लिए ट्रिगर के रूप में कार्य करते हैं। इसलिए, बायोट्रॉफ़िक चरण में सी. ल्यूपिनी को सफलतापूर्वक पकड़ने के लिए समय खिड़की बहुत संकीर्ण है। 83A:476 में 6 hpi पर देखी गई रेडॉक्स और प्रकाश संश्लेषण से जुड़े जीनों की पुनर्प्रोग्रामिंग फंगल हाइफ़े की प्रगति के अनुरूप है और बायोट्रॉफ़िक चरण में एक सफल सुरक्षात्मक प्रतिक्रिया के विकास की शुरुआत करती है। मैंडेलप और 22660 आबादी की ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रतिक्रियाएँ नेक्रोटिक वृद्धि में बदलने से पहले कवक को पकड़ने के लिए बहुत विलंबित हो सकती हैं, हालाँकि, मैंडेलप 22660 आबादी की तुलना में अधिक प्रभावी हो सकता है क्योंकि PR-10 प्रोटीन का अपेक्षाकृत तेज़ विनियमन क्षैतिज प्रतिरोध को बढ़ावा देता है।
कैनोनिकल आर जीन द्वारा संचालित ईटीआई, एन्थ्रेक्नोज के लिए बीन प्रतिरोध के लिए एक सामान्य तंत्र प्रतीत होता है। इस प्रकार, मॉडल लेग्यूम मेडिकागो ट्रंकैटुला में, एन्थ्रेक्नोज के लिए प्रतिरोध RCT1 जीन द्वारा प्रदान किया जाता है, जो TIR-NBS-LRR97 प्लांट आर जीन वर्ग का सदस्य है। यह जीन अतिसंवेदनशील पौधों में स्थानांतरित होने पर अल्फाल्फा में व्यापक स्पेक्ट्रम एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध भी प्रदान करता है। आम बीन (पी. वल्गेरिस) में, आज तक दो दर्जन से अधिक एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध जीन की पहचान की गई है। इनमें से कुछ जीन ऐसे क्षेत्रों में पाए जाते हैं जहाँ कोई भी कैनोनिकल आर जीन नहीं होता है, हालाँकि कई अन्य NBS-LRR जीन क्लस्टर ले जाने वाले गुणसूत्रों के किनारों पर स्थित होते हैं, जिसमें TIR-NBS-LRRs99 शामिल हैं। जीनोम-वाइड SSR अध्ययन ने आम बीन में एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध के साथ NBS-LRR जीन के जुड़ाव की भी पुष्टि की। श्वेत ल्यूपिन 101 में प्रमुख एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध स्थान वाले जीनोमिक क्षेत्र में भी विहित आर जीन पाया गया।
हमारा काम दिखाता है कि पौधे के संक्रमण के शुरुआती चरण में सक्रिय एक तत्काल प्रतिरोध प्रतिक्रिया (अधिमानतः 12 hpi से बाद में नहीं), रोगजनक कवक कोलेलोट्रिकम ल्यूपिनी के कारण होने वाले एन्थ्रेक्नोज से संकीर्ण-पत्ती वाले ल्यूपिन को प्रभावी रूप से बचाती है। उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण का उपयोग करते हुए, हमने Lanr1 और AnMan प्रतिरोध जीन द्वारा मध्यस्थता वाले NLL पौधों में एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध जीन की विभेदक अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल का प्रदर्शन किया। सफल बचाव में पौधे के रोगज़नक़ के साथ पहले संपर्क के कुछ घंटों के भीतर रेडॉक्स, प्रकाश संश्लेषण और रोगजनन में शामिल प्रोटीन के लिए जीन को सावधानीपूर्वक डिज़ाइन करना शामिल है। इसी तरह की सुरक्षात्मक प्रतिक्रियाएँ, लेकिन समय में देरी से, पौधों को बीमारियों से बचाने में बहुत कम प्रभावी होती हैं। Lanr1 जीन द्वारा मध्यस्थता वाला एंथ्रेक्स प्रतिरोध R जीन (प्रभावक-ट्रिगर प्रतिरक्षा) की विशिष्ट तीव्र प्रतिक्रिया जैसा दिखता है, जबकि AnMan जीन सबसे अधिक संभावना एक क्षैतिज प्रतिक्रिया (सूक्ष्म जीव-संबंधित आणविक पैटर्न द्वारा ट्रिगर की गई प्रतिरक्षा) प्रदान करता है, जो स्थिरता का एक मध्यम स्तर प्रदान करता है।
एन्थ्रेक्नोज मार्करों की जांच के लिए इस्तेमाल की गई 215 एनएलएल लाइनों में 74 कल्टीवेटर, क्रॉसिंग या ब्रीडिंग से प्राप्त 60 लाइनें, 5 म्यूटेंट और 76 जंगली या मूल जर्मप्लाज्म शामिल थे। ये लाइनें 17 देशों से आईं, जिनमें मुख्य रूप से पोलैंड (58), स्पेन (47), जर्मनी (27), ऑस्ट्रेलिया (26), रूस (19), बेलारूस (7), इटली (5) और अन्य लाइनें शामिल थीं। 10 देशों से। सेट में संदर्भ प्रतिरोधी लाइनें भी शामिल हैं: 83A:476, तंजिल, वोंगा लैनर1 एलील ले जा रहा है, और मंडेलप अनमैन एलील ले जा रहा है। ये लाइनें पॉज़्नान प्लांट ब्रीडिंग लिमिटेड, वियाट्रोवो, पोलैंड (पूरक तालिका S1) द्वारा बनाए गए यूरोपीय ल्यूपिन जेनेटिक रिसोर्स डेटाबेस से प्राप्त की गई थीं।
पौधों को नियंत्रित स्थितियों (फोटोपीरियड 16 घंटे, दिन में तापमान 25 डिग्री सेल्सियस और रात में 18 डिग्री सेल्सियस) के तहत उगाया गया था। दो जैविक प्रतिकृतियों का विश्लेषण किया गया। प्रोटोकॉल के अनुसार DNeasy प्लांट मिनी किट (क्यूगेन, हिल्डेन, जर्मनी) का उपयोग करके तीन सप्ताह पुरानी पत्तियों से डीएनए अलग किया गया था। पृथक डीएनए की गुणवत्ता और एकाग्रता का आकलन स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक तरीकों (नैनोड्रॉप 2000; थर्मो फिशर साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, यूएसए) द्वारा किया गया था। एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध जीन AnMan (सीवी. मैंडेलप से व्युत्पन्न) को चिह्नित करने वाले AnManM1 मार्कर और जीन Lanr1 (सीवी. तंजिल से व्युत्पन्न) को चिह्नित करने वाले मार्कर Anseq3 और Anseq4 का विश्लेषण 11,26,28 किया गया। प्रतिरोधी एलील के लिए होमोज़ायगोट्स को “1″, संवेदनशील – को “0″, और हेटेरोज़ायगोट्स को – 0.5 के रूप में स्कोर किया गया।
मार्कर AnManM1, AnSeq3 और AnSeq4 के लिए स्क्रीनिंग के परिणामों और अंतिम अनुवर्ती प्रयोगों के लिए बीजों की उपलब्धता के आधार पर, एन्थ्रेक्नोज प्रतिरोध फेनोटाइपिंग के लिए 50 NLL लाइनों का चयन किया गया। विश्लेषण 14 घंटे की फोटोपीरियड के साथ एक कंप्यूटर नियंत्रित ग्रीनहाउस में डुप्लिकेट में किया गया था, जिसमें दिन के दौरान 22 डिग्री सेल्सियस और रात में 19 डिग्री सेल्सियस का तापमान था। बीज को बोने से पहले खुरच दिया जाता है (एक तेज ब्लेड के साथ भ्रूण के विपरीत तरफ बीज कोट को काट दिया जाता है) ताकि बीज कोट के बहुत कठोर होने के कारण बीज की निष्क्रियता को रोका जा सके और एक समान अंकुरण सुनिश्चित किया जा सके। पौधों को बाँझ मिट्टी (TS-1 REC 085 मीडियम बेसिक, क्लासमैन-डिलमैन पोल्स्का, वारसॉ, पोलैंड) के साथ गमलों (11 × 11 × 21 सेमी) में उगाया गया था। टीकाकरण को कोलेट्रोट्रीकम ल्यूपिनी कोल-08 स्ट्रेन से किया गया, जिसे 1999 में वेरझेनित्सा, ग्रेटर पोलैंड (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E) के एक खेत में उगाए गए संकरी पत्ती वाले ल्यूपिन पौधों के तनों से उगाया गया था। एक क्षेत्र प्राप्त करें। बीजाणुजनन को प्रेरित करने के लिए आइसोलेट्स को 21 दिनों के लिए काली रोशनी में 20° C पर SNA माध्यम में संवर्धित किया गया था। बुवाई के चार सप्ताह बाद, जब पौधे 4-6 पत्ती के चरण में पहुंच गए थे, तो 0.5 x 106 कोनिडिया प्रति मिली की सांद्रता पर कोनिडिया के निलंबन के साथ छिड़काव करके टीकाकरण किया गया था। टीकाकरण के बाद, कोनिडिया के अंकुरण और संक्रमण प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए पौधों को लगभग 98% आर्द्रता और 25°C के तापमान पर 24 घंटे के लिए अंधेरे में रखा गया था। फिर पौधों को 14 घंटे के फोटोपीरियड में 22°C दिन/19°C रात और 70% आर्द्रता पर उगाया गया। रोग स्कोर टीकाकरण के 22 दिन बाद बनाया गया और तने और पत्तियों पर नेक्रोटिक घावों की उपस्थिति या अनुपस्थिति के आधार पर 0 (प्रतिरक्षा) से 9 (बहुत संवेदनशील) तक था। इसके अलावा, स्कोरिंग के बाद, पौधों का वजन मापा गया। मार्कर जीनोटाइप और रोग फेनोटाइप के बीच संबंधों की गणना बिंदु दो-अनुक्रम सहसंबंधों (एंथ्रेक्नोज प्रतिरोध फेनोटाइप के विश्लेषण के लिए लाइनों के सेट में विषमयुग्मी मार्करों की अनुपस्थिति) के रूप में की गई थी।