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एक विश्वसनीय इन विट्रो प्रणाली की आवश्यकता है जो दवा परीक्षण के लिए हृदय के शारीरिक वातावरण को सटीक रूप से पुन: पेश कर सके।मानव हृदय ऊतक संवर्धन प्रणालियों की सीमित उपलब्धता के कारण हृदय संबंधी दवाओं के प्रभावों की गलत व्याख्या हो गई है।यहां, हमने एक कार्डियक टिशू कल्चर मॉडल (सीटीसीएम) विकसित किया है जो इलेक्ट्रोमैकेनिकल रूप से हृदय के टुकड़ों को उत्तेजित करता है और हृदय चक्र के सिस्टोलिक और डायस्टोलिक चरणों के दौरान शारीरिक खिंचाव से गुजरता है।संस्कृति के 12 दिनों के बाद, इस दृष्टिकोण ने हृदय वर्गों की व्यवहार्यता में आंशिक रूप से सुधार किया, लेकिन उनकी संरचनात्मक अखंडता को पूरी तरह से संरक्षित नहीं किया।इसलिए, छोटे अणु की स्क्रीनिंग के बाद, हमने पाया कि हमारे माध्यम में 100 एनएम ट्राईआयोडोथायरोनिन (T3) और 1 μM डेक्सामेथासोन (डेक्स) जोड़ने से 12 दिनों तक वर्गों की सूक्ष्म संरचना बनी रही।टी3/डेक्स उपचार के संयोजन में, सीटीसीएम प्रणाली ने ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल, व्यवहार्यता, चयापचय गतिविधि और संरचनात्मक अखंडता को 12 दिनों तक ताजा हृदय ऊतक के समान स्तर पर बनाए रखा।इसके अलावा, संस्कृति में कार्डियक ऊतक का अत्यधिक खिंचाव हाइपरट्रॉफिक कार्डियक सिग्नलिंग को प्रेरित करता है, जो कार्डियक खिंचाव से प्रेरित हाइपरट्रॉफिक स्थितियों की नकल करने के लिए सीटीसीएम की क्षमता का प्रमाण प्रदान करता है।निष्कर्ष में, सीटीसीएम लंबे समय तक संस्कृति में हृदय के शरीर विज्ञान और पैथोफिज़ियोलॉजी को मॉडल कर सकता है, जिससे विश्वसनीय दवा स्क्रीनिंग सक्षम हो सकती है।
नैदानिक ​​​​अनुसंधान से पहले, विश्वसनीय इन विट्रो सिस्टम की आवश्यकता होती है जो मानव हृदय के शारीरिक वातावरण को सटीक रूप से पुन: पेश कर सके।ऐसी प्रणालियों को परिवर्तित यांत्रिक खिंचाव, हृदय गति और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों की नकल करनी चाहिए।मानव हृदय में दवाओं के प्रभाव को प्रतिबिंबित करने में सीमित विश्वसनीयता के साथ पशु मॉडल का उपयोग आमतौर पर कार्डियक फिजियोलॉजी के लिए एक स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म के रूप में किया जाता है।अंततः, आइडियल कार्डियक टिश्यू कल्चर एक्सपेरिमेंटल मॉडल (सीटीसीएम) एक ऐसा मॉडल है जो विभिन्न चिकित्सीय और औषधीय हस्तक्षेपों के लिए अत्यधिक संवेदनशील और विशिष्ट है, जो मानव हृदय के शरीर विज्ञान और पैथोफिजियोलॉजी को सटीक रूप से पुन: प्रस्तुत करता है।ऐसी प्रणाली की अनुपस्थिति हृदय विफलता4,5 के लिए नए उपचारों की खोज को सीमित करती है और बाजार से बाहर निकलने का एक प्रमुख कारण दवा कार्डियोटॉक्सिसिटी है।
पिछले एक दशक में, आठ गैर-हृदय संबंधी दवाओं को नैदानिक ​​उपयोग से हटा दिया गया है क्योंकि वे क्यूटी अंतराल को लम्बा खींचती हैं जिससे वेंट्रिकुलर अतालता और अचानक मृत्यु हो जाती है।इस प्रकार, हृदय संबंधी प्रभावकारिता और विषाक्तता का आकलन करने के लिए विश्वसनीय प्रीक्लिनिकल स्क्रीनिंग रणनीतियों की आवश्यकता बढ़ रही है।ड्रग स्क्रीनिंग और विषाक्तता परीक्षण में मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीएस-सीएम) का हालिया उपयोग इस समस्या का आंशिक समाधान प्रदान करता है।हालाँकि, hiPS-CMs की अपरिपक्व प्रकृति और हृदय ऊतक की बहुकोशिकीय जटिलता की कमी इस पद्धति की प्रमुख सीमाएँ हैं।हाल के अध्ययनों से पता चला है कि सहज संकुचन की शुरुआत के तुरंत बाद हृदय ऊतक हाइड्रोजेल बनाने और समय के साथ धीरे-धीरे विद्युत उत्तेजना बढ़ाने के लिए प्रारंभिक एचआईपीएस-सीएम का उपयोग करके इस सीमा को आंशिक रूप से दूर किया जा सकता है।हालाँकि, इन hiPS-CM सूक्ष्म ऊतकों में वयस्क मायोकार्डियम के परिपक्व इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और सिकुड़ा गुणों का अभाव है।इसके अलावा, मानव हृदय ऊतक की संरचना अधिक जटिल होती है, जिसमें एंडोथेलियल कोशिकाएं, न्यूरॉन्स और स्ट्रोमल फ़ाइब्रोब्लास्ट सहित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का एक विषम मिश्रण होता है, जो बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के विशिष्ट सेटों द्वारा परस्पर जुड़े होते हैं।वयस्क स्तनधारी हृदय में गैर-कार्डियोमायोसाइट आबादी11,12,13 की यह विविधता व्यक्तिगत कोशिका प्रकारों का उपयोग करके हृदय ऊतक के मॉडलिंग में एक प्रमुख बाधा है।ये प्रमुख सीमाएँ शारीरिक और रोग संबंधी स्थितियों के तहत अक्षुण्ण मायोकार्डियल ऊतक के संवर्धन के लिए विकासशील तरीकों के महत्व पर जोर देती हैं।
मानव हृदय के सुसंस्कृत पतले (300 µm) खंड अक्षुण्ण मानव मायोकार्डियम का एक आशाजनक मॉडल साबित हुए हैं।यह विधि मानव हृदय ऊतक के समान संपूर्ण 3डी बहुकोशिकीय प्रणाली तक पहुंच प्रदान करती है।हालाँकि, 2019 तक, सुसंस्कृत हृदय वर्गों का उपयोग लघु (24 घंटे) संस्कृति अस्तित्व द्वारा सीमित था।यह कई कारकों के कारण है, जिनमें भौतिक-यांत्रिक खिंचाव की कमी, वायु-तरल इंटरफ़ेस और सरल मीडिया का उपयोग शामिल है जो हृदय ऊतक की जरूरतों का समर्थन नहीं करते हैं।2019 में, कई शोध समूहों ने प्रदर्शित किया कि कार्डियक टिशू कल्चर सिस्टम में यांत्रिक कारकों को शामिल करने से संस्कृति जीवन का विस्तार हो सकता है, कार्डियक अभिव्यक्ति में सुधार हो सकता है और कार्डियक पैथोलॉजी की नकल की जा सकती है।दो शानदार अध्ययन 17 और 18 से पता चलता है कि एकअक्षीय यांत्रिक लोडिंग का संस्कृति के दौरान कार्डियक फेनोटाइप पर सकारात्मक प्रभाव पड़ता है।हालाँकि, इन अध्ययनों में हृदय चक्र के गतिशील त्रि-आयामी भौतिक-यांत्रिक लोडिंग का उपयोग नहीं किया गया था, क्योंकि हृदय अनुभागों को आइसोमेट्रिक तन्यता बल 17 या रैखिक ऑक्सोटोनिक लोडिंग 18 के साथ लोड किया गया था।ऊतक खिंचाव के इन तरीकों के परिणामस्वरूप कई हृदय जीनों का दमन हुआ या असामान्य खिंचाव प्रतिक्रियाओं से जुड़े जीनों की अत्यधिक अभिव्यक्ति हुई।विशेष रूप से, पिटौलिस एट अल।19 ने बल ट्रांसड्यूसर फीडबैक और तनाव ड्राइव का उपयोग करके कार्डियक चक्र पुनर्निर्माण के लिए एक गतिशील हार्ट स्लाइस कल्चर बाथ विकसित किया।यद्यपि यह प्रणाली अधिक सटीक इन विट्रो कार्डियक चक्र मॉडलिंग की अनुमति देती है, लेकिन विधि की जटिलता और कम थ्रूपुट इस प्रणाली के अनुप्रयोग को सीमित करती है।हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में 6 दिनों20,21 तक पोर्सिन और मानव हृदय ऊतक के वर्गों की व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए विद्युत उत्तेजना और एक अनुकूलित माध्यम का उपयोग करके एक सरलीकृत संस्कृति प्रणाली विकसित की है।
वर्तमान पांडुलिपि में, हम पोर्सिन हृदय के वर्गों का उपयोग करते हुए एक कार्डियक टिशू कल्चर मॉडल (सीटीसीएम) का वर्णन करते हैं जो हृदय चक्र के दौरान त्रि-आयामी कार्डियक फिजियोलॉजी और पैथोफिजियोलॉजिकल फैलाव को दोहराने के लिए हास्य संकेतों को शामिल करता है।यह सीटीसीएम एक लागत प्रभावी, मध्य-थ्रूपुट कार्डियक प्रणाली प्रदान करके प्री-क्लिनिकल दवा भविष्यवाणी की सटीकता को उस स्तर तक बढ़ा सकता है जिसे पहले कभी हासिल नहीं किया गया था, जो प्री-क्लिनिकल दवा परीक्षण के लिए स्तनधारी हृदय की फिजियोलॉजी/पैथोफिजियोलॉजी की नकल करता है।
हेमोडायनामिक मैकेनिकल सिग्नल इन विट्रो 22,23,24 में कार्डियोमायोसाइट फ़ंक्शन को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।वर्तमान पांडुलिपि में, हमने एक सीटीसीएम (चित्रा 1 ए) विकसित किया है जो शारीरिक आवृत्तियों (1.2 हर्ट्ज, 72 बीट प्रति मिनट) पर विद्युत और यांत्रिक दोनों उत्तेजनाओं को प्रेरित करके वयस्क हृदय वातावरण की नकल कर सकता है।डायस्टोल के दौरान अत्यधिक ऊतक खिंचाव से बचने के लिए, ऊतक के आकार को 25% तक बढ़ाने के लिए एक 3डी प्रिंटिंग डिवाइस का उपयोग किया गया था (चित्र 1बी)।सी-पेस प्रणाली द्वारा प्रेरित विद्युत पेसिंग को हृदय चक्र को पूरी तरह से पुन: उत्पन्न करने के लिए डेटा अधिग्रहण प्रणाली का उपयोग करके सिस्टोल से 100 एमएस पहले शुरू करने का समय दिया गया था।टिशू कल्चर प्रणाली ऊपरी कक्ष में हृदय के टुकड़ों के विस्तार के लिए एक लचीली सिलिकॉन झिल्ली को चक्रीय रूप से विस्तारित करने के लिए एक प्रोग्रामेबल न्यूमेटिक एक्ट्यूएटर (एलबी इंजीनियरिंग, जर्मनी) का उपयोग करती है।सिस्टम एक दबाव ट्रांसड्यूसर के माध्यम से बाहरी वायु रेखा से जुड़ा था, जिससे दबाव (± 1 मिमीएचजी) और समय (± 1 एमएस) (छवि 1 सी) को सटीक रूप से समायोजित करना संभव हो गया।
टिश्यू सेक्शन को डिवाइस के कल्चर चैंबर के अंदर नीले रंग में दिखाई गई 7 मिमी सपोर्ट रिंग से जोड़ें।संस्कृति कक्ष को एक पतली लचीली सिलिकॉन झिल्ली द्वारा वायु कक्ष से अलग किया जाता है।रिसाव को रोकने के लिए प्रत्येक कक्ष के बीच एक गैस्केट रखें।डिवाइस के ढक्कन में ग्रेफाइट इलेक्ट्रोड होते हैं जो विद्युत उत्तेजना प्रदान करते हैं।बी बड़े ऊतक उपकरण, गाइड रिंग और सपोर्ट रिंग का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।ऊतक अनुभाग (भूरा) को डिवाइस के बाहरी किनारे पर खांचे में गाइड रिंग के साथ बड़े आकार के डिवाइस पर रखा जाता है।गाइड का उपयोग करते हुए, कार्डियक ऊतक के अनुभाग पर ऊतक ऐक्रेलिक चिपकने वाले के साथ लेपित समर्थन रिंग को सावधानीपूर्वक रखें।सी प्रोग्रामेबल न्यूमेटिक एक्ट्यूएटर (पीपीडी) द्वारा नियंत्रित वायु कक्ष दबाव के एक फ़ंक्शन के रूप में विद्युत उत्तेजना के समय को दर्शाने वाला ग्राफ़।दबाव सेंसर का उपयोग करके विद्युत उत्तेजना को सिंक्रनाइज़ करने के लिए एक डेटा अधिग्रहण उपकरण का उपयोग किया गया था।जब कल्चर चैंबर में दबाव निर्धारित सीमा तक पहुंच जाता है, तो विद्युत उत्तेजना को ट्रिगर करने के लिए सी-पेस-ईएम को एक पल्स सिग्नल भेजा जाता है।डी इनक्यूबेटर शेल्फ पर रखे गए चार सीटीसीएम की छवि।चार उपकरण एक वायवीय सर्किट के माध्यम से एक पीपीडी से जुड़े होते हैं, और वायवीय सर्किट में दबाव की निगरानी के लिए दबाव सेंसर को हेमोस्टैटिक वाल्व में डाला जाता है।प्रत्येक उपकरण में छह ऊतक अनुभाग होते हैं।
एक एकल वायवीय एक्चुएटर का उपयोग करके, हम 4 सीटीसीएम उपकरणों को नियंत्रित करने में सक्षम थे, जिनमें से प्रत्येक 6 ऊतक अनुभाग (छवि 1 डी) पकड़ सकता था।सीटीसीएम में, वायु कक्ष में हवा का दबाव द्रव कक्ष में तुल्यकालिक दबाव में परिवर्तित हो जाता है और हृदय स्लाइस के शारीरिक विस्तार को प्रेरित करता है (चित्रा 2 ए और पूरक मूवी 1)।80 मिमी एचजी पर ऊतक खिंचाव का मूल्यांकन।कला।ऊतक वर्गों में 25% तक खिंचाव दिखाया गया (चित्र 2बी)।यह प्रतिशत खिंचाव सामान्य हृदय अनुभाग सिकुड़न17,19,25 के लिए 2.2-2.3 µm की शारीरिक सार्कोमियर लंबाई के अनुरूप दिखाया गया है।कस्टम कैमरा सेटिंग्स (पूरक चित्र 1) का उपयोग करके ऊतक आंदोलन का मूल्यांकन किया गया था।ऊतक गति का आयाम और वेग (चित्र 2सी, डी) हृदय चक्र के दौरान खिंचाव और सिस्टोल और डायस्टोल के दौरान समय के अनुरूप है (चित्र 2बी)।संकुचन और विश्राम के दौरान हृदय के ऊतकों का खिंचाव और वेग संस्कृति में 12 दिनों तक स्थिर रहा (चित्र 2एफ)।संस्कृति के दौरान सिकुड़न पर विद्युत उत्तेजना के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, हमने एक छायांकन एल्गोरिथ्म (पूरक छवि 2 ए, बी) का उपयोग करके सक्रिय विकृति का निर्धारण करने के लिए एक विधि विकसित की और विद्युत उत्तेजना के साथ और बिना विकृति के बीच अंतर करने में सक्षम थे।हृदय का वही भाग (चित्र 2f)।कट के गतिशील क्षेत्र (आर6-9) में, विद्युत उत्तेजना के दौरान वोल्टेज विद्युत उत्तेजना की अनुपस्थिति की तुलना में 20% अधिक था, जो सिकुड़ा कार्य में विद्युत उत्तेजना के योगदान को इंगित करता है।
वायु कक्ष दबाव, द्रव कक्ष दबाव, और ऊतक आंदोलन माप के प्रतिनिधि निशान पुष्टि करते हैं कि कक्ष दबाव द्रव कक्ष दबाव को बदलता है, जिससे ऊतक स्लाइस की एक समान गति होती है।बी प्रतिशत खिंचाव (नारंगी) के अनुरूप ऊतक वर्गों के प्रतिशत खिंचाव (नीला) के प्रतिनिधि निशान।सी कार्डियक स्लाइस की मापी गई गति गति की मापी गई गति के अनुरूप है।(डी) हृदय के एक टुकड़े में चक्रीय गति (नीली रेखा) और वेग (नारंगी बिंदीदार रेखा) के प्रतिनिधि प्रक्षेप पथ।ई चक्र समय की मात्रा (n = 19 स्लाइस प्रति समूह, विभिन्न सूअरों से), संकुचन समय (n = 19 स्लाइस प्रति समूह), विश्राम समय (n = 19 स्लाइस प्रति समूह, विभिन्न सूअरों से), ऊतक गति (n = 25)।स्लाइस)/विभिन्न सूअरों से समूह), शिखर सिस्टोलिक वेग (एन = 24(डी0), 25(डी12) स्लाइस/समूह विभिन्न सूअरों से) और शिखर विश्राम दर (एन=24(डी0), 25(डी12) स्लाइस/विभिन्न सूअरों से समूह)।टू-टेल्ड स्टूडेंट के टी-टेस्ट में किसी भी पैरामीटर में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा।एफ (लाल) और बिना (नीला) विद्युत उत्तेजना के ऊतक वर्गों के प्रतिनिधि तनाव विश्लेषण निशान, एक ही खंड से ऊतक वर्गों के दस क्षेत्रीय क्षेत्र।नीचे के पैनल विभिन्न वर्गों के दस क्षेत्रों में विद्युत उत्तेजना के साथ और उसके बिना ऊतक वर्गों में तनाव में प्रतिशत अंतर की मात्रा का ठहराव दिखाते हैं। (एन = विभिन्न सूअरों से 8 स्लाइस/समूह, दो-पूंछ वाला छात्र टी-परीक्षण किया जाता है; ****पी <0.0001, **पी <0.01, *पी <0.05)। (एन = विभिन्न सूअरों से 8 स्लाइस/समूह, दो-पूंछ वाला छात्र टी-परीक्षण किया जाता है; ****पी <0.0001, **पी <0.01, *पी <0.05)। (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (एन = विभिन्न सूअरों से 8 खंड/समूह, दो-पूंछ वाले छात्र का टी-परीक्षण; ****पी<0.0001, **पी<0.01, *पी<0.05)। (n = 8 片/组, 来自不同的猪, 进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 片/组, 来自不同的猪, 进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; **** पी <0,0001, **पी <0,01, *पी <0,05)। (एन = 8 खंड/समूह, विभिन्न सूअरों से, दो-पूंछ वाले छात्र का टी-परीक्षण; ****पी<0.0001, **पी<0.01, *पी<0.05)।त्रुटि पट्टियाँ माध्य ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं।
हमारे पिछले स्थिर बायोमिमेटिक हार्ट स्लाइस कल्चर सिस्टम [20, 21] में, हमने विद्युत उत्तेजना लागू करके और मध्यम संरचना को अनुकूलित करके 6 दिनों तक हार्ट स्लाइस की व्यवहार्यता, कार्य और संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखा।हालांकि, 10 दिनों के बाद इन आंकड़ों में तेजी से गिरावट आई।हम अपने पिछले स्थैतिक बायोमिमेटिक कल्चर सिस्टम 20, 21 नियंत्रण स्थितियों (Ctrl) में संवर्धित अनुभागों का उल्लेख करेंगे और हम एक साथ यांत्रिक और विद्युत उत्तेजना (CTCM) के तहत एमसी स्थितियों और संस्कृति के रूप में अपने पहले से अनुकूलित माध्यम का उपयोग करेंगे।बुलाया ।सबसे पहले, हमने निर्धारित किया कि विद्युत उत्तेजना के बिना यांत्रिक उत्तेजना 6 दिनों तक ऊतक व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए अपर्याप्त थी (पूरक छवि 3 ए, बी)।दिलचस्प बात यह है कि एसटीसीएम का उपयोग करके फिजियो-मैकेनिकल और इलेक्ट्रिकल उत्तेजना की शुरूआत के साथ, 12-दिवसीय हृदय खंडों की व्यवहार्यता एमएस स्थितियों के तहत ताजा हृदय खंडों के समान ही रही, लेकिन Ctrl स्थितियों के तहत नहीं, जैसा कि एमटीटी विश्लेषण (छवि 1) द्वारा दिखाया गया है।3ए).इससे पता चलता है कि यांत्रिक उत्तेजना और हृदय चक्र का अनुकरण हमारे पिछले स्थैतिक संस्कृति प्रणाली में रिपोर्ट की गई तुलना में ऊतक वर्गों को दोगुने समय तक व्यवहार्य बनाए रख सकता है।हालाँकि, कार्डियक ट्रोपोनिन टी और कॉनक्सिन 43 की इम्यूनोलेबलिंग द्वारा ऊतक वर्गों की संरचनात्मक अखंडता के आकलन से पता चला है कि उसी दिन नियंत्रण की तुलना में 12वें दिन एमसी ऊतकों में कॉनक्सिन 43 की अभिव्यक्ति काफी अधिक थी।हालाँकि, एक समान कॉन्क्सिन 43 अभिव्यक्ति और जेड-डिस्क गठन पूरी तरह से बनाए नहीं रखा गया था (छवि 3 बी)।हम ऊतक संरचनात्मक अखंडता26 को मापने के लिए एक कृत्रिम बुद्धिमत्ता (एआई) ढांचे का उपयोग करते हैं, स्थानीयकरण की ताकत के संदर्भ में दिल के टुकड़ों की संरचनात्मक अखंडता और प्रतिदीप्ति को स्वचालित रूप से मापने के लिए ट्रोपोनिन-टी और कॉनक्सिन स्टेनिंग43 पर आधारित एक छवि-आधारित गहन शिक्षण पाइपलाइन का उपयोग करते हैं।जैसा कि संदर्भ में वर्णित है, यह विधि स्वचालित और निष्पक्ष तरीके से कार्डियक ऊतक की संरचनात्मक अखंडता को विश्वसनीय रूप से मापने के लिए एक कन्वेन्शनल न्यूरल नेटवर्क (सीएनएन) और एक गहन शिक्षण ढांचे का उपयोग करती है।26. एमसी ऊतक ने स्थैतिक नियंत्रण अनुभागों की तुलना में दिन 0 में बेहतर संरचनात्मक समानता दिखाई।इसके अलावा, मैसन के ट्राइक्रोम स्टेनिंग से पता चला कि कल्चर के 12वें दिन की नियंत्रण स्थितियों की तुलना में एमएस स्थितियों के तहत फाइब्रोसिस का प्रतिशत काफी कम था (चित्र 3सी)।जबकि सीटीसीएम ने 12वें दिन हृदय ऊतक वर्गों की व्यवहार्यता को ताजा हृदय ऊतकों के समान स्तर तक बढ़ा दिया, लेकिन इससे हृदय वर्गों की संरचनात्मक अखंडता में उल्लेखनीय सुधार नहीं हुआ।
एक बार ग्राफ 12 दिनों के लिए ताजा हृदय स्लाइस (D0) या हृदय स्लाइस संस्कृति की एमटीटी व्यवहार्यता की मात्रा को स्थिर संस्कृति (D12 Ctrl) या CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) स्लाइस / समूह में विभिन्न सूअरों से दिखाता है, एक तरह से एनोवा परीक्षण किया जाता है; ####p <0.0001 D0 और **p की तुलना में <0.01 D12 Ctrl की तुलना में)। एक बार ग्राफ 12 दिनों के लिए ताजा हृदय स्लाइस (D0) या हृदय स्लाइस संस्कृति की एमटीटी व्यवहार्यता की मात्रा को स्थिर संस्कृति (D12 Ctrl) या CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) स्लाइस / समूह में विभिन्न सूअरों से दिखाता है, एक तरह से एनोवा परीक्षण किया जाता है; ####p <0.0001 D0 और ** की तुलना में p <0.01 D12 Ctrl की तुलना में)।हिस्टोग्राम या तो स्थैतिक संस्कृति (डी12 नियंत्रण) या सीटीसीएम (डी12 एमसी) (एन = 18 (डी0), 15 (डी12 नियंत्रण)) में 12 दिनों के लिए एमटीटी ताजा हृदय अनुभाग (डी0) या हृदय अनुभागों की संस्कृति की व्यवहार्यता की मात्रा का पता लगाता है। ), विभिन्न सूअरों से 12 (डी12 एमसी) अनुभाग/समूह, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण किया जाता है;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 D0 की तुलना में और **p < 0.01 D12 Ctrl की तुलना में)। एक नियंत्रण कक्ष कुंजी (D12 Ctrl) और CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) पूर्ण नियंत्रण कक्ष (D0) कुंजी संयोजन 12 एमटीटी की छवि देखें)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001 ，D12 Ctrl कुंजी,**p < 0.01)。 a कुंजी संयोजन नियंत्रण (D12 Ctrl) या CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) नियंत्रण कुंजी (D0) ，D12 (D) 12 एमसी) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)हिस्टोग्राम ताज़ा हृदय खंडों (D0) या स्थैतिक संवर्धन (D12 नियंत्रण) या CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 नियंत्रण)), 12 (D12 MC) खंडों/समूहों में विभिन्न सूअरों के समूह, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण में 12 दिनों के लिए एमटीटी व्यवहार्यता की मात्रा दर्शाता है;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 D0 की तुलना में, **p <0.01 D12 Ctrl की तुलना में)।बी ट्रोपोनिन-टी (हरा), कॉन्नेक्सिन 43 (लाल) और डीएपीआई (नीला) ताज़ा पृथक हृदय खंडों (डी0) या हृदय खंडों को 12 दिनों के लिए स्थिर परिस्थितियों (Ctrl) या सीटीसीएम स्थितियों (एमसी) के तहत संवर्धित किया गया) प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों (रिक्त पैमाने = 100 µm)। हृदय ऊतक संरचनात्मक अखंडता की कृत्रिम बुद्धिमत्ता मात्रा का ठहराव (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस / समूह प्रत्येक अलग-अलग सुअर से, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण किया जाता है; ####p <0.0001 D0 की तुलना में और ****p <0.0001 D12 Ctrl की तुलना में)। हृदय ऊतक संरचनात्मक अखंडता की कृत्रिम बुद्धिमत्ता मात्रा का ठहराव (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/समूह प्रत्येक अलग-अलग सूअरों से, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण किया जाता है; ####p <0.0001 D0 की तुलना में और ****p <0.0001 D12 Ctrl की तुलना में)। Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусс твенным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, пров одится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). कृत्रिम बुद्धिमत्ता द्वारा हृदय ऊतक की संरचनात्मक अखंडता की मात्रा का निर्धारण (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), विभिन्न सूअरों से 5 (D12 MC) अनुभाग/समूह, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण किया गया; ####p <0.0001 बनाम D0 और ****p <0.0001 के साथ D12 Ctrl की तुलना में)।人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/प्रत्येक अलग-अलग सुअर का समूह, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण;####p < 0.0001 与D0 相比，****p < 0.0001 से D12 Ctrl कुंजी）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/अलग-अलग सूअरों का समूह, एक तरफ़ा ANOVA परीक्षण;####p < 0.0001 与D0相比，****p < 0.0001 से D12 Ctrl कुंजी）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной цело стности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных с виней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 बनाम D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). कार्डियक ऊतक की संरचनात्मक अखंडता की मात्रा निर्धारित करने के लिए कृत्रिम बुद्धिमत्ता (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) खंड/अलग-अलग सूअरों का समूह, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण; ####p<0.0001 बनाम .D0 तुलना के लिए ****p <0.0001 D12 Ctrl की तुलना में)। सी मैसन के ट्राइक्रोम दाग (स्केल बेयर = 500 µm) से सने हृदय के टुकड़ों के लिए प्रतिनिधि छवियां (बाएं) और परिमाणीकरण (दाएं) (n = 10 स्लाइस/समूह प्रत्येक अलग-अलग सुअर से, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण किया जाता है; ####p <0.0001 D0 की तुलना में और ***p <0.001 D12 Ctrl की तुलना में)। सी मैसन के ट्राइक्रोम दाग (स्केल बेयर = 500 µm) से सने हृदय के टुकड़ों के लिए प्रतिनिधि छवियां (बाएं) और परिमाणीकरण (दाएं) (n = अलग-अलग सूअरों से प्रत्येक के 10 स्लाइस/समूह, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण किया जाता है; #### p <0.0001 D0 की तुलना में और ***p <0.001 D12 Ctrl की तुलना में)। c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) с резов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покры тия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонни й тест एनोवा; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). सी मैसन के ट्राइक्रोम दाग (अनकोटेड स्केल = 500 µm) (n = विभिन्न सूअरों से 10 खंड/समूह, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण किया गया; #### p < 0 .0001 D0 की तुलना में और *** p < 0.001 D12 Ctrl की तुलना में) से रंगे हृदय खंडों की प्रतिनिधि छवियां (बाएं) और परिमाणीकरण (दाएं)। सी मेसन को 500 µm (n = 10) की आवश्यकता होती है个切片/组,每组来自不同的猪,进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C 用 mason 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 = 500 µm） (n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0.0001 与D0 ठीक है,***p < 0.001, D12 Ctrl, कुंजी। c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) с резов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 м км) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью од нофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравн ению с D12 Ctrl). सी मैसन के ट्राइक्रोम दाग (रिक्त = 500 µm) (एन = 10 अनुभाग/समूह, प्रत्येक एक अलग सुअर से, विचरण के एक-तरफ़ा विश्लेषण द्वारा परीक्षण किया गया; ### # p <0.0001 D0 की तुलना में, ***p <0.001 D12 Ctrl की तुलना में) से सना हुआ हृदय खंडों की प्रतिनिधि छवियां (बाएं) और परिमाणीकरण (दाएं)।त्रुटि पट्टियाँ माध्य ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं।
हमने अनुमान लगाया कि संस्कृति माध्यम में छोटे अणुओं को जोड़कर, कार्डियोमायोसाइट अखंडता में सुधार किया जा सकता है और सीटीसीएम संस्कृति के दौरान फाइब्रोसिस विकास को कम किया जा सकता है।इसलिए हमने भ्रमित करने वाले कारकों की कम संख्या के कारण अपने स्थैतिक नियंत्रण संस्कृतियों20,21 का उपयोग करके छोटे अणुओं की जांच की।इस स्क्रीन के लिए डेक्सामेथासोन (डेक्स), ट्राईआयोडोथायरोनिन (T3), और SB431542 (SB) को चुना गया।इन छोटे अणुओं का उपयोग पहले hiPSC-CM संस्कृतियों में सार्कोमियर लंबाई, टी-ट्यूब्यूल और चालन वेग को बढ़ाकर कार्डियोमायोसाइट्स की परिपक्वता को प्रेरित करने के लिए किया गया है।इसके अलावा, डेक्स (एक ग्लुकोकोर्तिकोइद) और एसबी दोनों सूजन को दबाने के लिए जाने जाते हैं।इसलिए, हमने परीक्षण किया कि क्या इन छोटे अणुओं में से एक या संयोजन को शामिल करने से हृदय वर्गों की संरचनात्मक अखंडता में सुधार होगा।प्रारंभिक स्क्रीनिंग के लिए, प्रत्येक यौगिक की खुराक का चयन आमतौर पर सेल कल्चर मॉडल (1 μM Dex27, 100 nM T327, और 2.5 μM SB31) में उपयोग की जाने वाली सांद्रता के आधार पर किया गया था।संस्कृति के 12 दिनों के बाद, टी3 और डेक्स के संयोजन के परिणामस्वरूप इष्टतम कार्डियोमायोसाइट संरचनात्मक अखंडता और न्यूनतम रेशेदार रीमॉडलिंग हुई (पूरक आंकड़े 4 और 5)।इसके अलावा, टी3 और डेक्स की इन सांद्रताओं के दोगुने या दोगुने के उपयोग से सामान्य सांद्रता की तुलना में हानिकारक प्रभाव उत्पन्न हुए (पूरक चित्र 6ए,बी)।
प्रारंभिक स्क्रीनिंग के बाद, हमने 4 संस्कृति स्थितियों (चित्रा 4 ए) की आमने-सामने तुलना की: Ctrl: हमारे अनुकूलित माध्यम का उपयोग करके हमारे पहले वर्णित स्थैतिक संस्कृति में हृदय अनुभाग सुसंस्कृत;20.21 टीडी: टी3 और Ctrl एस ने बुधवार को डेक्स जोड़ा;एमसी: हमारे पहले से अनुकूलित माध्यम का उपयोग करके सीटीसीएम में हृदय अनुभागों को संवर्धित किया गया;और MT: T3 और Dex के साथ CTCM को माध्यम में जोड़ा गया।खेती के 12 दिनों के बाद, एमएस और एमटी ऊतकों की व्यवहार्यता एमटीटी परख (छवि 4 बी) द्वारा मूल्यांकन किए गए ताजा ऊतकों के समान ही रही।दिलचस्प बात यह है कि ट्रांसवेल कल्चर (टीडी) में टी3 और डेक्स को शामिल करने से Ctrl स्थितियों की तुलना में व्यवहार्यता में कोई महत्वपूर्ण सुधार नहीं हुआ, जो हृदय वर्गों की व्यवहार्यता को बनाए रखने में यांत्रिक उत्तेजना की महत्वपूर्ण भूमिका का संकेत देता है।
12 दिनों के लिए माध्यम पर यांत्रिक उत्तेजना और टी3/डेक्स अनुपूरण के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग की जाने वाली चार संस्कृति स्थितियों को दर्शाने वाला एक प्रायोगिक डिजाइन आरेख। बी बार ग्राफ ताजे दिल के स्लाइस (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD और D12 MT), 12 (D12 MC) स्लाइस/समूह की तुलना में सभी 4 कल्चर स्थितियों (Ctrl, TD, MC, और MT) में कल्चर के 12 दिन बाद व्यवहार्यता की मात्रा दर्शाता है, विभिन्न सूअरों से, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण किया जाता है; ####p < 0.0001, ### D0 की तुलना में p < 0.001 और D12 Ctrl की तुलना में **p < 0.01)। बी बार ग्राफ ताजे दिल के स्लाइस (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD और D12 MT), 12 (D12 MC) स्लाइस/समूह की तुलना में सभी 4 कल्चर स्थितियों (Ctrl, TD, MC, और MT) में कल्चर के 12 दिन बाद व्यवहार्यता की मात्रा दर्शाता है, विभिन्न सूअरों से, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण किया जाता है; ####p < 0.0001, ### D0 की तुलना में p < 0.001 और D12 ctrl की तुलना में **p < 0.01)। b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 1 2 दिनों के लिए культивирования во всех 4 условиях культивирования (контрол ь, टीडी, एमसी और एमटी) по сравнению со со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D1) 2 एमसी) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0 001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). बी बार ग्राफ ताजा हृदय अनुभागों (डी0) (एन = 18 (डी0), 15 (डी12 Ctrl, डी12 टीडी, और डी12 एमटी), 12 (डी12 एमसी) अनुभागों/समूहों की तुलना में सभी 4 संस्कृति स्थितियों (नियंत्रण, टीडी, एमसी और एमटी) में संस्कृति के 12 दिनों के बाद व्यवहार्यता की मात्रा को दर्शाता है, विभिन्न सूअरों से, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 बनाम D0 और **p <0.01 D12 Ctrl की तुलना में)। b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D1) 2 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001,###p < 0.001 与D0 相比,**p < 0. 01 与D12 控制）。बी 4 12 (डी12 एमसी) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных с виней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). बी हिस्टोग्राम ताजा हृदय वर्गों (डी0) (एन = 18 (डी0), 15 (डी12 Ctrl, डी12 टीडी और डी12 एमटी) की तुलना में सभी 4 संस्कृति स्थितियों (नियंत्रण, टीडी, एमसी और एमटी) को दर्शाता है, विभिन्न सूअरों से 12 (डी12 एमसी) अनुभाग/समूह, एक तरफा एनोवा परीक्षण; ####p<0.0001, ###p<0.001 बनाम D0, **p<0.01 बनाम नियंत्रण D12). सी बार ग्राफ ताजा हृदय स्लाइस (डी0) की तुलना में सभी 4 संस्कृति स्थितियों (सीटीआरएल, टीडी, एमसी और एमटी) में ग्लूकोज प्रवाह के 12 दिनों के बाद ग्लूकोज प्रवाह की मात्रा दिखाता है (विभिन्न सूअरों से एन = 6 स्लाइस / समूह, एक तरफा एनोवा परीक्षण किया जाता है; ###पी <0.001, डी0 की तुलना में और ***पी <0.001 डी12 Ctrl की तुलना में)। सी बार ग्राफ ताजा हृदय स्लाइस (डी0) की तुलना में सभी 4 संस्कृति स्थितियों (सीटीआरएल, टीडी, एमसी और एमटी) में ग्लूकोज प्रवाह के 12 दिनों के बाद ग्लूकोज प्रवाह की मात्रा दिखाता है (विभिन्न सूअरों से एन = 6 स्लाइस / समूह, एक तरफा एनोवा परीक्षण किया जाता है; ###पी <0.001, डी0 की तुलना में और ***पी <0.001 डी12 Ctrl की तुलना में)। c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 दिन ей после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, एमसी और एमटी) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разны х свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). सी हिस्टोग्राम ताजा हृदय वर्गों (डी0) की तुलना में सभी 4 संस्कृति स्थितियों (नियंत्रण, टीडी, एमसी और एमटी) के तहत संस्कृति के 12 दिनों के बाद ग्लूकोज प्रवाह की मात्रा का पता लगाता है (विभिन्न सूअरों से एन = 6 अनुभाग / समूह, एक तरफा एनोवा परीक्षण किया गया; ###पी <0.001 डी0 की तुलना में और ***पी <0.001 डी12 Ctrl की तुलना में)। c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12 天的葡萄糖通量定量(n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl कुंजी）。 C को डाउनलोड करने के लिए 4 क्लिक करें (Ctrl 、 td 、 mc और mt). 12 वर्ष की आयु में 12 वर्ष की आयु में （n = 6 片/组 , 来自 猪 , , , , , , , , , , , 猪 猪单向执行 ANOVA त्रुटि;###p < 0.001,与D0 त्रुटि,***p < 0.001, या D12 Ctrl कुंजी）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4 условий культивирования (контроль , टीडी, एमसी और एमटी) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от раз ных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). सी हिस्टोग्राम सभी 4 कल्चर स्थितियों (नियंत्रण, टीडी, एमसी, और एमटी) के लिए 12 दिनों के बाद ग्लूकोज प्रवाह की मात्रा को ताजा हृदय वर्गों (डी0) की तुलना में दिखा रहा है (एन = 6 अनुभाग / समूह, विभिन्न सूअरों से, एकतरफा एनोवा परीक्षण किए गए थे, डी0 की तुलना में ###पी <0.001, डी12 (नियंत्रण) की तुलना में ***पी <0.001)।डी दस क्षेत्रीय ऊतक अनुभाग बिंदुओं पर ताजा (नीला), दिन 12 एमसी (हरा), और दिन 12 एमटी (लाल) ऊतकों के तनाव विश्लेषण प्लॉट (एन = 4 स्लाइस/समूह, एक तरफा एनोवा परीक्षण; समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था)।ई ज्वालामुखी प्लॉट 10-12 दिनों के लिए स्थिर परिस्थितियों (Ctrl) या MT स्थितियों (MT) के तहत सुसंस्कृत हृदय वर्गों की तुलना में ताजा हृदय वर्गों (D0) में विभेदित रूप से व्यक्त जीन दिखा रहा है।एफ प्रत्येक संस्कृति की स्थिति के तहत हृदय वर्गों के लिए सरकोमेरे जीन का हीटमैप।त्रुटि पट्टियाँ माध्य ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं।
फैटी एसिड ऑक्सीकरण से ग्लाइकोलाइसिस पर स्विच पर मेटाबोलिक निर्भरता कार्डियोमायोसाइट डिडिफ़रेंशिएशन की एक पहचान है।अपरिपक्व कार्डियोमायोसाइट्स मुख्य रूप से एटीपी उत्पादन के लिए ग्लूकोज का उपयोग करते हैं और उनमें कुछ क्राइस्टे5,32 के साथ हाइपोप्लास्टिक माइटोकॉन्ड्रिया होते हैं।ग्लूकोज उपयोग विश्लेषण से पता चला कि एमसी और एमटी स्थितियों के तहत, ग्लूकोज का उपयोग दिन 0 ऊतकों (चित्र 4सी) के समान था।हालाँकि, ताजा ऊतक की तुलना में Ctrl नमूनों में ग्लूकोज के उपयोग में उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई।यह इंगित करता है कि सीटीसीएम और टी3/डेक्स का संयोजन ऊतक व्यवहार्यता को बढ़ाता है और 12-दिवसीय सुसंस्कृत हृदय वर्गों के चयापचय फेनोटाइप को संरक्षित करता है।इसके अलावा, तनाव विश्लेषण से पता चला कि तनाव का स्तर एमटी और एमएस स्थितियों के तहत 12 दिनों तक ताजा हृदय ऊतक के समान ही रहा (चित्र 4डी)।
कार्डियक स्लाइस ऊतक के वैश्विक ट्रांसक्रिप्शनल परिदृश्य पर सीटीसीएम और टी3/डेक्स के समग्र प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए, हमने सभी चार अलग-अलग संस्कृति स्थितियों (पूरक डेटा 1) से कार्डियक स्लाइस पर आरएनएसेक का प्रदर्शन किया।दिलचस्प बात यह है कि एमटी अनुभागों ने ताजा हृदय ऊतक के साथ उच्च ट्रांसक्रिप्शनल समानता दिखाई, जिसमें 13,642 जीनों में से केवल 16 को अलग-अलग व्यक्त किया गया।हालाँकि, जैसा कि हमने पहले दिखाया था, Ctrl स्लाइस ने संस्कृति में 10-12 दिनों के बाद 1229 विभेदित रूप से व्यक्त जीन प्रदर्शित किए (चित्र 4e)।इन आंकड़ों की पुष्टि हृदय और फ़ाइब्रोब्लास्ट जीन के क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा की गई (पूरक चित्र 7ए-सी)।दिलचस्प बात यह है कि Ctrl अनुभागों ने हृदय और कोशिका चक्र जीनों के डाउनरेगुलेशन और सूजन वाले जीन कार्यक्रमों की सक्रियता को दिखाया।इन आंकड़ों से पता चलता है कि डीडिफ़रेंशिएशन, जो सामान्य रूप से दीर्घकालिक संवर्धन के बाद होता है, एमटी स्थितियों के तहत पूरी तरह से क्षीण हो जाता है (पूरक छवि 8 ए, बी)।सरकोमेरे जीन के सावधानीपूर्वक अध्ययन से पता चला है कि केवल एमटी स्थितियों के तहत सरकोमेरे (छवि 4 एफ) और आयन चैनल (पूरक छवि 9) को एन्कोड करने वाले जीन संरक्षित हैं, जो उन्हें Ctrl, TD और MC स्थितियों के तहत दमन से बचाते हैं।ये आंकड़े दर्शाते हैं कि यांत्रिक और विनोदी उत्तेजना (टी3/डेक्स) के संयोजन के साथ, हृदय स्लाइस ट्रांस्क्रिप्टोम संस्कृति में 12 दिनों के बाद ताजा हृदय स्लाइस के समान रह सकता है।
ये ट्रांसक्रिप्शनल निष्कर्ष इस तथ्य से समर्थित हैं कि हृदय वर्गों में कार्डियोमायोसाइट्स की संरचनात्मक अखंडता एमटी स्थितियों के तहत 12 दिनों के लिए सबसे अच्छी तरह से संरक्षित है, जैसा कि बरकरार और स्थानीयकृत कंनेक्सिन 43 (छवि 5 ए) द्वारा दिखाया गया है।इसके अलावा, एमटी स्थितियों के तहत हृदय वर्गों में फाइब्रोसिस Ctrl की तुलना में काफी कम हो गया था और ताजा हृदय वर्गों के समान था (चित्र 5 बी)।ये डेटा दर्शाते हैं कि यांत्रिक उत्तेजना और टी3/डेक्स उपचार का संयोजन संस्कृति में हृदय वर्गों में हृदय संरचना को प्रभावी ढंग से संरक्षित करता है।
ट्रोपोनिन-टी (हरा), कॉनक्सिन 43 (लाल), और डीएपीआई (नीला) की ताजा पृथक हृदय खंडों (डी0) में प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां या सभी चार हृदय खंड संस्कृति स्थितियों (स्केल बार = 100 µm) में 12 दिनों के लिए सुसंस्कृत।). विभिन्न सूअरों से हृदय ऊतक संरचनात्मक अखंडता (n = 7 (D0 और D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC और D12 MT) स्लाइस / समूह की कृत्रिम बुद्धि मात्रा का ठहराव, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण किया जाता है; ####p < 0.0001 D0 की तुलना में और *p < 0.05, या ****p < 0.0001 D12 Ctrl की तुलना में)। विभिन्न सूअरों से हृदय ऊतक संरचनात्मक अखंडता (n = 7 (D0 और D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC और D12 MT) स्लाइस / समूह की कृत्रिम बुद्धि मात्रा का ठहराव, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण किया जाता है; #### p < 0.0001 D0 की तुलना में और *p < 0.05, या ****p < 0.0001 D12 Ctrl की तुलना में)। Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью и скусственного интеллекта (n = 7 (D0 और D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC और D12 MT) срезов/группу от разны х свиней, проведен однофакторный тест एनोवा; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 ил и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). विभिन्न सूअरों से कृत्रिम बुद्धिमत्ता (n = 7 (D0 और D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC और D12 MT) अनुभागों/समूह का उपयोग करके हृदय के ऊतकों की संरचनात्मक अखंडता की मात्रा का निर्धारण, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण किया गया; #### p < 0.0001 D0 की तुलना में और *p < 0.05 या ****p < 0.0001 D12 Ctrl की तुलना में)।10000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000D12Ctrl 5D12 D12 MC D12 MT ‍‍‍‍‍‍‍‍-एक बार फिर से 7 (n = 7 (d0 और d12 ctrl) (5) (d12 td , d12 mc और d12 mt) पर क्लिक करें।智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比， 或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण के साथ विभिन्न सूअरों (n = 7 (D0 और D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC और D12 MT) अनुभाग/समूह) में कृत्रिम बुद्धिमत्ता का उपयोग करके हृदय ऊतक की संरचनात्मक अखंडता की मात्रा का निर्धारण;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 D0 की तुलना में और *p < 0.05 या ****p < 0.0001 D12 Ctrl की तुलना में)। बी मैसन के ट्राइक्रोम दाग (स्केल बार = 500 µm) (एन = 10 (डी0, डी12 Ctrl, डी12 टीडी, और डी12 एमसी), 9 (डी12 एमटी) स्लाइस/समूह से विभिन्न सूअरों के दाग वाले दिल के टुकड़ों के लिए प्रतिनिधि छवियां और मात्रा का ठहराव, एक तरफा एनोवा परीक्षण किया जाता है; ####पी <0.0001 डी0 और ***पी <0.001, या **** की तुलना में p <0.0001 D12 Ctrl की तुलना में)। बी मैसन के ट्राइक्रोम दाग (स्केल बार = 500 µm) (एन = 10 (डी0, डी12 Ctrl, डी12 टीडी, और डी12 एमसी), 9 (डी12 एमटी) स्लाइस/समूह से विभिन्न सूअरों के दाग वाले दिल के टुकड़ों के लिए प्रतिनिधि छवियां और मात्रा का ठहराव, एक तरफा एनोवा परीक्षण किया जाता है; ####पी <0.0001 डी0 और ***पी <0.001, या **** की तुलना में p <0.0001 D12 Ctrl की तुलना में)। b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, о крашенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0) , D12 Ctrl, D12 TD और D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторон यह एनोवा नहीं है; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). बी मैसन के ट्राइक्रोम दाग (स्केल बार = 500 µm) (एन = 10 (डी0, डी12 Ctrl, डी12 टीडी और डी12 एमसी), 9 (डी12 एमटी) अनुभागों/समूह से विभिन्न सूअरों के दाग वाले हृदय वर्गों की प्रतिनिधि छवियां और मात्रा का ठहराव, एक तरफा एनोवा का प्रदर्शन; ####p < 0.0001 बनाम D0 और ***p < 0.001 या ****p < 0.00 01 बनाम D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比， p < 0.001, ********p < 0.0001, D12 Ctrl नियंत्रण）。 b 用 mason 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 c trl 、 d12 td और d12 mc切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组,进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，* **पी < 0.001，या****पी <0.0001 या डी12 Ctrl नियंत्रण）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, о крашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 ( D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). बी मैसन के ट्राइक्रोम (स्केल बार = 500 µm) (एन = 10 (डी0, डी12 Ctrl, डी12 टीडी और डी12 एमसी), 9 (डी12 एमटी) अनुभागों से विभिन्न सूअरों/समूह, एक एनोवा विधि से दागे गए हृदय वर्गों की प्रतिनिधि छवियां और मात्रा का ठहराव; ####पी <0.0001 की तुलना में डी0, ***पी <0.001 या ****पी <0.0001 की तुलना में से D12 Ctrl).त्रुटि पट्टियाँ माध्य ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं।
अंत में, हृदय ऊतक के खिंचाव को बढ़ाकर हृदय अतिवृद्धि की नकल करने की सीटीसीएम की क्षमता का आकलन किया गया।सीटीसीएम में, शिखर वायु कक्ष का दबाव 80 mmHg से बढ़कर 80 mmHg हो गया।कला।(सामान्य खिंचाव) 140 mmHg तक कला।(चित्र 6ए)।यह खिंचाव में 32% की वृद्धि के अनुरूप है (चित्र 6 बी), जिसे पहले हाइपरट्रॉफी में देखी गई सरकोमियर लंबाई प्राप्त करने के लिए हृदय वर्गों के लिए आवश्यक संबंधित प्रतिशत खिंचाव के रूप में दिखाया गया था।संकुचन और विश्राम के दौरान हृदय के ऊतकों का खिंचाव और वेग संस्कृति के छह दिनों के दौरान स्थिर रहा (चित्र 6सी)।एमटी स्थितियों से हृदय ऊतक को छह दिनों के लिए सामान्य खिंचाव (एमटी (सामान्य)) या ओवरस्ट्रेच स्थितियों (एमटी (ओएस)) के अधीन किया गया था।संस्कृति में पहले से ही चार दिनों के बाद, हाइपरट्रॉफिक बायोमार्कर एनटी-प्रोबीएनपी को एमटी (सामान्य) स्थितियों (छवि 7 ए) की तुलना में एमटी (ओएस) स्थितियों के तहत माध्यम में काफी ऊंचा किया गया था।इसके अलावा, संवर्धन के छह दिनों के बाद, एमटी (ओएस) (चित्र 7बी) में कोशिका का आकार एमटी हृदय (सामान्य) के वर्गों की तुलना में काफी बढ़ गया।इसके अलावा, एनएफएटीसी4 परमाणु स्थानांतरण अत्यधिक खिंचे हुए ऊतकों में काफी बढ़ गया था (चित्र 7सी)।ये परिणाम हाइपरडिटेंशन के बाद पैथोलॉजिकल रीमॉडलिंग के प्रगतिशील विकास को दर्शाते हैं और इस अवधारणा का समर्थन करते हैं कि सीटीसीएम डिवाइस का उपयोग खिंचाव-प्रेरित कार्डियक हाइपरट्रॉफी सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए एक मंच के रूप में किया जा सकता है।
वायु कक्ष दबाव, द्रव कक्ष दबाव, और ऊतक आंदोलन माप के प्रतिनिधि निशान पुष्टि करते हैं कि कक्ष दबाव द्रव कक्ष दबाव को बदलता है, जिससे ऊतक स्लाइस की एक समान गति होती है।बी सामान्य रूप से खिंचे हुए (नारंगी) और अत्यधिक खिंचे हुए (नीले) ऊतक वर्गों के लिए प्रतिनिधि खिंचाव प्रतिशत और खिंचाव दर वक्र।सी बार ग्राफ चक्र समय (n = 19 स्लाइस प्रति समूह, विभिन्न सूअरों से), संकुचन समय (n = 18-19 स्लाइस प्रति समूह, विभिन्न सूअरों से), विश्राम समय (n = 19 स्लाइस प्रति समूह, विभिन्न सूअरों से), ऊतक आंदोलन का आयाम (n = 14 स्लाइस / समूह, विभिन्न सूअरों से), शिखर सिस्टोलिक वेग (n = 14 स्लाइस / समूह, विभिन्न सूअरों से) और शिखर विश्राम दर (n = 14 (D0)) दिखा रहा है। 15 (डी6) ) अनुभाग/समूह) विभिन्न सूअरों से), दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट में किसी भी पैरामीटर में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा, यह दर्शाता है कि ये पैरामीटर ओवरवॉल्टेज के साथ संस्कृति के 6 दिनों के दौरान स्थिर रहे।त्रुटि पट्टियाँ माध्य ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं।
एमटी सामान्य खिंचाव (नॉर्म) या ओवरस्ट्रेचिंग (ओएस) स्थितियों (एन = 4 (डी 2 एमटी नॉर्म), 3 (डी 2 एमटीओएस, डी 4 एमटी नॉर्म, और डी 4 एमटीओएस) स्लाइस / समूह के तहत विभिन्न सूअरों से संवर्धित हृदय स्लाइस से संस्कृति मीडिया में एनटी-प्रोबीएनपी एकाग्रता का एक बार ग्राफ परिमाणीकरण, दो-तरफा एनोवा का प्रदर्शन किया जाता है; ** पी <0.01 सामान्य खिंचाव की तुलना में)। एमटी सामान्य खिंचाव (नॉर्म) या ओवरस्ट्रेचिंग (ओएस) स्थितियों (एन = 4 (डी 2 एमटीनॉर्म), 3 (डी 2 एमटीओएस, डी 4 एमटीनॉर्म, और डी 4 एमटीओएस) स्लाइस / समूह के तहत अलग-अलग सूअरों से संवर्धित हृदय स्लाइस से संस्कृति मीडिया में एनटी-प्रोबीएनपी एकाग्रता का एक बार ग्राफ परिमाणीकरण, दो-तरफा एनोवा का प्रदर्शन किया जाता है; ** पी <0.01 सामान्य खिंचाव की तुलना में)।सामान्य एमटी स्ट्रेच (मानदंड) या ओवरस्ट्रेच (ओएस) (एन = 4 (डी2 एमटीनॉर्म), 3 (डी2 एमटीओएस, डी4 एमटीनॉर्म, और डी4).एमटीओएस) की स्थितियों के तहत संवर्धित हृदय स्लाइस से संस्कृति माध्यम में एनटी-प्रोबीएनपी एकाग्रता का मात्रात्मक हिस्टोग्राम, विभिन्न सूअरों से स्लाइस / समूह, विचरण का दो-कारक विश्लेषण किया जाता है;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **पी <0.01 सामान्य खिंचाव की तुलना में)। MT-ProBNP मानक (नॉर्म) ऑपरेटिंग सिस्टम (OS) NT-ProBNP आउटपुट डेटा (OS) n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm और D4 MTOS） अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए फ़ोटो/फ़ॉलोग्राफ़िक्स देखें;**与正常拉伸相比，पी <0.01）。 एमटी सामान्य खिंचाव (नॉर्म) या ओवरस्ट्रेच (ओएस) स्थितियों (एन = 4 (डी 2 एमटी नॉर्म), 3 (डी 2 एमटीओएस, डी 4 एमटी नॉर्म और डी 4 एमटीओएस) के तहत अलग-अलग 猪的切片/组, 可以双向方方发发动 के तहत संवर्धित हृदय स्लाइस में एनटी-प्रोबीएनपी एकाग्रता की मात्रा ; **सामान्य स्ट्रेचिंग की तुलना में, पी <0.01)।सामान्य एमटी खिंचाव (मानक) या ओवरस्ट्रेच (ओएस) (एन = 4 (डी 2 एमटीनॉर्म), 3 (डी 2 एमटीओएस, डी 4 एमटीनॉर्म) और डी 4 एमटीओएस) स्लाइस / समूह की स्थितियों के तहत अलग-अलग सूअरों से सुसंस्कृत हृदय स्लाइस में एनटी-प्रोबीएनपी सांद्रता की हिस्टोग्राम मात्रा, विचरण का दो-तरफा विश्लेषण;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **पी <0.01 सामान्य खिंचाव की तुलना में)। बी ट्रोपोनिन-टी और डब्ल्यूजीए (बाएं) और सेल आकार मात्रा का ठहराव (दाएं) (एन = 330 (डी6 एमटीओएस), 369 (डी6 एमटीनॉर्म) कोशिकाओं/समूह से अलग-अलग सूअरों के 10 अलग-अलग स्लाइस से दागे गए हृदय स्लाइस के लिए प्रतिनिधि छवियां, दो-पूंछ वाले छात्र टी-परीक्षण किया जाता है; ****पी <0.0001 सामान्य खिंचाव की तुलना में)। बी ट्रोपोनिन-टी और डब्ल्यूजीए (बाएं) और सेल आकार मात्रा का ठहराव (दाएं) (एन = 330 (डी6 एमटीओएस), 369 (डी6 एमटीनॉर्म) कोशिकाओं/समूह से अलग-अलग सूअरों के 10 अलग-अलग स्लाइस से दागे गए हृदय स्लाइस के लिए प्रतिनिधि छवियां, दो-पूंछ वाले छात्र टी-परीक्षण किया जाता है; ****पी <0.0001 सामान्य खिंचाव की तुलना में)। b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) और количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводитс хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяж ением). बी ट्रोपोनिन-टी और एजेडपी (बाएं) और सेल आकार मात्रा निर्धारण (दाएं) (एन = 330 (डी6 एमटीओएस), 369 (डी6 एमटीनॉर्म) कोशिकाओं/समूह से अलग-अलग सूअरों के 10 अलग-अलग वर्गों से दागे गए हृदय वर्गों की प्रतिनिधि छवियां, दो-पूंछ वाले छात्र का टी-परीक्षण किया गया; ****पी <0.0001 सामान्य तनाव की तुलना में)। बी टी और डब्ल्यूजीए (डब्ल्यूजीए) और डी 6 एमटीओएस ），10 से अधिक की तस्वीरें 369(D6 MTNorm) से ली गई हैं / डाउनलोड की गई हैं ，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相उत्तर,****p < 0.0001）。 बी कैल्केरिन-टी और डब्लूजीए (बाएं) और सेल आकार (दाएं) (एन = 330 (डी6 एमटीओएस), 10 अलग-अलग स्लाइस से 369 (डी6 एमटीनॉर्म)) सेल्स/组，两方法有尾学生t परीक्षण；सामान्य स्ट्रेचिंग की तुलना में，****पी <0.0001) से सने दिल के टुकड़ों की प्रतिनिधि छवियां। b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) और количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние кри терий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). बी ट्रोपोनिन-टी और एजेडपी (बाएं) से रंगे हृदय वर्गों की प्रतिनिधि छवियां और विभिन्न सूअरों के 10 अलग-अलग वर्गों से सेल आकार (दाएं) (एन = 330 (डी 6 एमटीओएस), 369 (डी 6 एमटीनॉर्म) की मात्रा का ठहराव) कोशिकाएं / समूह, दो-पूंछ मानदंड छात्र का टी;****p <0.0001 सामान्य स्ट्रेन की तुलना में)। सी दिन 0 और दिन 6 एमटीओएस हृदय स्लाइस के लिए प्रतिनिधि छवियां ट्रोपोनिन-टी और एनएफएटीसी4 के लिए इम्यूनोलेबल की गईं और एनएफएटीसी4 के सीएम के नाभिक में स्थानांतरण की मात्रा का ठहराव (एन = 4 (डी0), 3 (डी6 एमटीओएस) स्लाइस/विभिन्न सूअरों से समूह, दो-पूंछ वाला छात्र टी-परीक्षण किया जाता है; *पी <0.05)। सी दिन 0 और दिन 6 एमटीओएस हृदय स्लाइस के लिए प्रतिनिधि छवियां ट्रोपोनिन-टी और एनएफएटीसी4 के लिए इम्यूनोलेबल की गईं और एनएफएटीसी4 के सीएम के नाभिक में स्थानांतरण की मात्रा का ठहराव (एन = 4 (डी0), 3 (डी6 एमटीओएस) स्लाइस/विभिन्न सूअरों से समूह, दो-पूंछ वाला छात्र टी-परीक्षण किया जाता है; *पी <0.05)। c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 दिन MTOS, иммуноме ченых для тропонина-Т और NFATC4, और количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняет ся двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). सी 0 और 6 दिनों के एमटीओएस पर हृदय वर्गों के लिए प्रतिनिधि छवियां, ट्रोपोनिन-टी और एनएफएटीसी4 के लिए इम्यूनोलेबल, और कैवर्नस कोशिकाओं के केंद्रक में एनएफएटीसी4 अनुवाद की मात्रा का निर्धारण (एन = 4 (डी0), 3 (डी6 एमटीओएस) स्लाइस/विभिन्न सूअरों से समूह) ने दो-पूंछ वाले छात्र का टी-परीक्षण किया;*पी <0.05). c 于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 MTOS 心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪एनएफएटीसी4 को सीएम की आवश्यकता होती है (एन = 4 (डी0)、3 (डी6 एमटीओएस) फोटो/प्रतिक्रिया, आउटपुट आउटपुट टी आउटपुट；*पी < 0.05)。 सी कैल्केनिन-टी और एनएफएटीसी4 इम्युनोलेबलिंग की प्रतिनिधि छवियां 0 से अधिक एमटीओएस हृदय स्लाइस, और विभिन्न एनएफएटीसी4 से एनएफएटीसी4, सीएम सेल न्यूक्लियस मात्रा (एन = 4 (डी0), 3 (डी 6 एमटीओएस) से संबंधित हैं।学生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов MTOS на 0 и 6 दिन день иммуном аркировки тропонином-Т и NFATC4 और количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий тьюд ента; *p < 0,05). सी ट्रोपोनिन-टी और एनएफएटीसी4 इम्यूनोलेबलिंग के लिए दिन 0 और 6 पर एमटीओएस हृदय स्लाइस की प्रतिनिधि छवियां और विभिन्न सूअरों से सीएम के नाभिक में एनएफएटीसी4 अनुवाद की मात्रा का ठहराव (एन = 4 (डी0), 3 (डी6 एमटीओएस) स्लाइस/समूह, दो-पूंछ वाले टी-मानदंड छात्र; * पी <0.05)।त्रुटि पट्टियाँ माध्य ± मानक विचलन दर्शाती हैं।
ट्रांसलेशनल कार्डियोवस्कुलर अनुसंधान के लिए सेलुलर मॉडल की आवश्यकता होती है जो हृदय वातावरण को सटीक रूप से पुन: पेश करता है।इस अध्ययन में, एक सीटीसीएम उपकरण विकसित किया गया और इसकी विशेषता बताई गई जो हृदय के अति पतले हिस्सों को उत्तेजित कर सकता है।सीटीसीएम प्रणाली में शारीरिक रूप से सिंक्रनाइज़ इलेक्ट्रोमैकेनिकल उत्तेजना और टी3 और डेक्स द्रव संवर्धन शामिल है।जब पोर्सिन हृदय खंडों को इन कारकों के संपर्क में लाया गया, तो उनकी व्यवहार्यता, संरचनात्मक अखंडता, चयापचय गतिविधि और ट्रांसक्रिप्शनल अभिव्यक्ति संस्कृति के 12 दिनों के बाद ताजा हृदय ऊतक के समान ही रही।इसके अलावा, हृदय के ऊतकों का अत्यधिक खिंचाव हाइपरएक्सटेंशन के कारण हृदय की अतिवृद्धि का कारण बन सकता है।कुल मिलाकर, ये परिणाम सामान्य कार्डियक फेनोटाइप को बनाए रखने में शारीरिक संस्कृति स्थितियों की महत्वपूर्ण भूमिका का समर्थन करते हैं और दवा स्क्रीनिंग के लिए एक मंच प्रदान करते हैं।
कई कारक कार्डियोमायोसाइट्स के कामकाज और अस्तित्व के लिए एक इष्टतम वातावरण बनाने में योगदान करते हैं।इनमें से सबसे स्पष्ट कारक (1) अंतरकोशिकीय अंतःक्रिया, (2) इलेक्ट्रोमैकेनिकल उत्तेजना, (3) हास्य कारक, और (4) चयापचय सब्सट्रेट से संबंधित हैं।फिजियोलॉजिकल सेल-टू-सेल इंटरैक्शन के लिए एक बाह्य मैट्रिक्स द्वारा समर्थित कई सेल प्रकारों के जटिल त्रि-आयामी नेटवर्क की आवश्यकता होती है।इस तरह के जटिल सेलुलर इंटरैक्शन को अलग-अलग प्रकार की कोशिकाओं के सह-संस्कृति द्वारा इन विट्रो में पुनर्निर्माण करना मुश्किल है, लेकिन हृदय वर्गों की ऑर्गेनोटाइपिक प्रकृति का उपयोग करके इसे आसानी से प्राप्त किया जा सकता है।
कार्डियक फेनोटाइप33,34,35 को बनाए रखने के लिए कार्डियोमायोसाइट्स का यांत्रिक खिंचाव और विद्युत उत्तेजना महत्वपूर्ण है।जबकि हाईपीएससी-सीएम कंडीशनिंग और परिपक्वता के लिए यांत्रिक उत्तेजना का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, कई सुरुचिपूर्ण अध्ययनों ने हाल ही में यूनिएक्सियल लोडिंग का उपयोग करके संस्कृति में दिल के स्लाइस की यांत्रिक उत्तेजना का प्रयास किया है।इन अध्ययनों से पता चलता है कि 2डी एकअक्षीय यांत्रिक लोडिंग का संस्कृति के दौरान हृदय के फेनोटाइप पर सकारात्मक प्रभाव पड़ता है।इन अध्ययनों में, हृदय के हिस्सों को या तो आइसोमेट्रिक तन्यता बल17, रैखिक ऑक्सोटोनिक लोडिंग18 से लोड किया गया था, या बल ट्रांसड्यूसर फीडबैक और तनाव ड्राइव का उपयोग करके हृदय चक्र को फिर से बनाया गया था।हालाँकि, ये विधियाँ पर्यावरणीय अनुकूलन के बिना एकअक्षीय ऊतक खिंचाव का उपयोग करती हैं, जिसके परिणामस्वरूप कई हृदय जीनों का दमन होता है या असामान्य खिंचाव प्रतिक्रियाओं से जुड़े जीनों की अत्यधिक अभिव्यक्ति होती है।यहां वर्णित सीटीसीएम एक 3डी इलेक्ट्रोमैकेनिकल उत्तेजना प्रदान करता है जो चक्र समय और शारीरिक खिंचाव (25% खिंचाव, 40% सिस्टोल, 60% डायस्टोल और 72 बीट प्रति मिनट) के संदर्भ में प्राकृतिक हृदय चक्र की नकल करता है।यद्यपि यह त्रि-आयामी यांत्रिक उत्तेजना अकेले ऊतक अखंडता को बनाए रखने के लिए पर्याप्त नहीं है, ऊतक व्यवहार्यता, कार्य और अखंडता को पर्याप्त रूप से बनाए रखने के लिए T3/Dex का उपयोग करके हास्य और यांत्रिक उत्तेजना के संयोजन की आवश्यकता होती है।
वयस्क हृदय फेनोटाइप को संशोधित करने में हास्य कारक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।इसे HiPS-CM अध्ययनों में उजागर किया गया था जिसमें कोशिका परिपक्वता में तेजी लाने के लिए T3 और Dex को कल्चर मीडिया में जोड़ा गया था।टी3 कोशिका झिल्ली36 में अमीनो एसिड, शर्करा और कैल्शियम के परिवहन को प्रभावित कर सकता है।इसके अलावा, T3 MHC-α अभिव्यक्ति और MHC-β डाउनरेगुलेशन को बढ़ावा देता है, भ्रूण सीएम में धीमी ट्विच मायोफिब्रिल्स की तुलना में परिपक्व कार्डियोमायोसाइट्स में फास्ट ट्विच मायोफिब्रिल्स के गठन को बढ़ावा देता है।हाइपोथायराइड रोगियों में टी3 की कमी के परिणामस्वरूप मायोफाइब्रिलर बैंड का नुकसान होता है और टोन विकास की दर कम हो जाती है।डेक्स ग्लुकोकोर्तिकोइद रिसेप्टर्स पर कार्य करता है और पृथक सुगंधित हृदयों में मायोकार्डियल सिकुड़न को बढ़ाता दिखाया गया है;38 यह सुधार कैल्शियम जमा-संचालित प्रविष्टि (एसओसीई) 39,40 पर प्रभाव से संबंधित माना जाता है।इसके अलावा, डेक्स अपने रिसेप्टर्स को बांधता है, जिससे एक व्यापक इंट्रासेल्युलर प्रतिक्रिया होती है जो प्रतिरक्षा समारोह और सूजन को दबा देती है।
हमारे परिणाम दर्शाते हैं कि भौतिक यांत्रिक उत्तेजना (एमएस) ने Ctrl की तुलना में समग्र संस्कृति प्रदर्शन में सुधार किया, लेकिन संस्कृति में 12 दिनों में व्यवहार्यता, संरचनात्मक अखंडता और हृदय अभिव्यक्ति को बनाए रखने में विफल रहा।Ctrl की तुलना में, CTCM (MT) संस्कृतियों में T3 और Dex को जोड़ने से व्यवहार्यता में सुधार हुआ और 12 दिनों के लिए ताजा हृदय ऊतक के साथ समान प्रतिलेखन प्रोफाइल, संरचनात्मक अखंडता और चयापचय गतिविधि को बनाए रखा गया।इसके अलावा, ऊतक खिंचाव की डिग्री को नियंत्रित करके, एसटीसीएम का उपयोग करके एक हाइपरएक्सटेंशन-प्रेरित कार्डियक हाइपरट्रॉफी मॉडल बनाया गया था, जो एसटीसीएम प्रणाली की बहुमुखी प्रतिभा को दर्शाता है।यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हालांकि कार्डियक रीमॉडलिंग और फाइब्रोसिस में आमतौर पर अक्षुण्ण अंग शामिल होते हैं जिनकी परिसंचारी कोशिकाएं उचित साइटोकिन्स के साथ-साथ फागोसाइटोसिस और अन्य रीमॉडलिंग कारक प्रदान कर सकती हैं, फिर भी हृदय के हिस्से तनाव और आघात के जवाब में फाइब्रोटिक प्रक्रिया की नकल कर सकते हैं।मायोफाइब्रोब्लास्ट में।इसका मूल्यांकन पहले इस कार्डियक स्लाइस मॉडल में किया जा चुका है।यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सीटीसीएम मापदंडों को टैचीकार्डिया, ब्रैडीकार्डिया और मैकेनिकल सर्कुलेटरी सपोर्ट (मैकेनिकल अनलोडेड हार्ट) जैसी कई स्थितियों का अनुकरण करने के लिए दबाव/विद्युत आयाम और आवृत्ति को बदलकर संशोधित किया जा सकता है।यह सिस्टम को दवा परीक्षण के लिए एक माध्यम थ्रूपुट बनाता है।अत्यधिक परिश्रम से प्रेरित कार्डियक हाइपरट्रॉफी को मॉडल करने के लिए सीटीसीएम की क्षमता वैयक्तिकृत चिकित्सा के लिए इस प्रणाली के परीक्षण का मार्ग प्रशस्त करती है।निष्कर्ष में, वर्तमान अध्ययन दर्शाता है कि हृदय ऊतक वर्गों की संस्कृति को बनाए रखने के लिए यांत्रिक खिंचाव और विनोदी उत्तेजना महत्वपूर्ण हैं।
यद्यपि यहां प्रस्तुत आंकड़ों से पता चलता है कि सीटीसीएम अक्षुण्ण मायोकार्डियम के मॉडलिंग के लिए एक बहुत ही आशाजनक मंच है, इस संस्कृति पद्धति की कुछ सीमाएँ हैं।सीटीसीएम संस्कृति की मुख्य सीमा यह है कि यह स्लाइस पर निरंतर गतिशील यांत्रिक तनाव लगाता है, जो प्रत्येक चक्र के दौरान कार्डियक स्लाइस संकुचन की सक्रिय रूप से निगरानी करने की क्षमता को रोकता है।इसके अलावा, कार्डियक सेक्शन (7 मिमी) के छोटे आकार के कारण, पारंपरिक बल सेंसर का उपयोग करके संस्कृति प्रणालियों के बाहर सिस्टोलिक फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने की क्षमता सीमित है।वर्तमान पांडुलिपि में, हम संविदात्मक कार्य के संकेतक के रूप में ऑप्टिकल वोल्टेज का मूल्यांकन करके इस सीमा को आंशिक रूप से दूर करते हैं।हालाँकि, इस सीमा पर आगे काम करने की आवश्यकता होगी और भविष्य में संस्कृति में हृदय के टुकड़ों के कार्य की ऑप्टिकल निगरानी के तरीकों को पेश करके संबोधित किया जा सकता है, जैसे कि कैल्शियम और वोल्टेज-संवेदनशील रंगों का उपयोग करके ऑप्टिकल मैपिंग।सीटीसीएम की एक और सीमा यह है कि कामकाजी मॉडल शारीरिक तनाव (प्रीलोड और आफ्टरलोड) में हेरफेर नहीं करता है।सीटीसीएम में, बहुत बड़े ऊतकों में डायस्टोल (पूर्ण खिंचाव) और सिस्टोल (विद्युत उत्तेजना के दौरान संकुचन की लंबाई) में 25% शारीरिक खिंचाव को पुन: उत्पन्न करने के लिए विपरीत दिशाओं में दबाव प्रेरित किया गया था।इस सीमा को भविष्य के सीटीसीएम डिजाइनों में दोनों तरफ से हृदय के ऊतकों पर पर्याप्त दबाव और हृदय के कक्षों में होने वाले सटीक दबाव-मात्रा संबंधों को लागू करके हटाया जाना चाहिए।
इस पांडुलिपि में बताई गई ओवरस्ट्रेच-प्रेरित रीमॉडलिंग हाइपरट्रॉफिक हाइपरस्ट्रेच संकेतों की नकल करने तक सीमित है।इस प्रकार, यह मॉडल हास्य या तंत्रिका कारकों (जो इस प्रणाली में मौजूद नहीं है) की आवश्यकता के बिना खिंचाव-प्रेरित हाइपरट्रॉफिक सिग्नलिंग के अध्ययन में मदद कर सकता है।सीटीसीएम की बहुलता को बढ़ाने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है, उदाहरण के लिए, प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ सह-संवर्धन, प्लाज्मा हास्य कारकों को प्रसारित करना, और जब न्यूरोनल कोशिकाओं के साथ सह-संवर्धन सीटीसीएम के साथ रोग मॉडलिंग की संभावनाओं में सुधार करेगा।
इस अध्ययन में तेरह सूअरों का उपयोग किया गया।सभी पशु प्रक्रियाएं संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार की गईं और लुइसविले विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित की गईं।महाधमनी चाप को दबा दिया गया था और हृदय को 1 लीटर बाँझ कार्डियोप्लेजिया (110 मिमी NaCl, 1.2 मिमी CaCl2, 16 मिमी KCl, 16 मिमी MgCl2, 10 मिमी NaHCO3, 5 U/mL हेपरिन, pH 7.4 तक) से भर दिया गया था; बर्फ पर प्रयोगशाला में ले जाने तक दिलों को बर्फ के ठंडे कार्डियोप्लेजिक घोल में संरक्षित किया गया था, जो आमतौर पर <10 मिनट होता है। बर्फ पर प्रयोगशाला में ले जाने तक दिलों को बर्फ के ठंडे कार्डियोप्लेजिक घोल में संरक्षित किया गया था, जो आमतौर पर <10 मिनट होता है। сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. बर्फ पर प्रयोगशाला में ले जाने तक दिलों को बर्फ के ठंडे कार्डियोप्लेजिक घोल में संग्रहित किया गया, जिसमें आमतौर पर <10 मिनट लगते हैं।将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. बर्फ पर प्रयोगशाला में ले जाने तक दिलों को बर्फ के कार्डियोप्लेजिया पर रखें, आमतौर पर <10 मिनट।
CTCM डिवाइस को सॉलिडवर्क्स कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन (CAD) सॉफ़्टवेयर में विकसित किया गया था।संस्कृति कक्ष, डिवाइडर और वायु कक्ष सीएनसी स्पष्ट ऐक्रेलिक प्लास्टिक से बने होते हैं।7 मिमी व्यास वाली बैक-अप रिंग केंद्र में उच्च घनत्व पॉलीथीन (एचडीपीई) से बनी है और इसके नीचे मीडिया को सील करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सिलिकॉन ओ-रिंग को समायोजित करने के लिए एक ओ-रिंग नाली है।एक पतली सिलिका झिल्ली कल्चर चैम्बर को पृथक्करण प्लेट से अलग करती है।सिलिकॉन झिल्ली 0.02″ मोटी सिलिकॉन शीट से लेजर कट है और इसकी कठोरता 35A है।नीचे और ऊपर के सिलिकॉन गास्केट को 1/16″ मोटी सिलिकॉन शीट से लेजर कट किया गया है और इसकी कठोरता 50A है।316L स्टेनलेस स्टील स्क्रू और विंग नट का उपयोग ब्लॉक को जकड़ने और एक वायुरोधी सील बनाने के लिए किया जाता है।
एक समर्पित मुद्रित सर्किट बोर्ड (पीसीबी) को सी-पेस-ईएम प्रणाली के साथ एकीकृत करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।पीसीबी पर स्विस मशीन कनेक्टर सॉकेट सिल्वर-प्लेटेड तांबे के तारों और इलेक्ट्रोड में कांस्य 0-60 स्क्रू द्वारा ग्रेफाइट इलेक्ट्रोड से जुड़े होते हैं।मुद्रित सर्किट बोर्ड को 3डी प्रिंटर के कवर में रखा गया है।
सीटीसीएम डिवाइस को एक प्रोग्रामेबल न्यूमेटिक एक्चुएटर (पीपीडी) द्वारा नियंत्रित किया जाता है जो हृदय चक्र के समान नियंत्रित परिसंचरण दबाव बनाता है।जैसे ही वायु कक्ष के अंदर दबाव बढ़ता है, लचीली सिलिकॉन झिल्ली ऊपर की ओर फैलती है, जिससे माध्यम ऊतक स्थल के नीचे आ जाता है।डायस्टोल के दौरान हृदय के शारीरिक विस्तार की नकल करते हुए, द्रव के इस निष्कासन से ऊतक का क्षेत्र खिंच जाएगा।विश्राम के चरम पर, ग्रेफाइट इलेक्ट्रोड के माध्यम से विद्युत उत्तेजना लागू की गई, जिससे वायु कक्ष में दबाव कम हो गया और ऊतक वर्गों का संकुचन हुआ।पाइप के अंदर वायु प्रणाली में दबाव का पता लगाने के लिए एक दबाव सेंसर के साथ एक हेमोस्टैटिक वाल्व होता है।प्रेशर सेंसर द्वारा महसूस किया गया दबाव लैपटॉप से ​​जुड़े डेटा कलेक्टर पर लागू होता है।यह गैस चैम्बर के अंदर दबाव की निरंतर निगरानी की अनुमति देता है।जब अधिकतम चैम्बर दबाव (मानक 80 एमएमएचजी, 140 एमएमएचजी ओएस) तक पहुंच गया, तो डेटा अधिग्रहण डिवाइस को 2 एमएस के लिए द्विध्रुवीय वोल्टेज सिग्नल उत्पन्न करने के लिए सी-पेस-ईएम सिस्टम को एक सिग्नल भेजने का आदेश दिया गया, जिसे 4 वी पर सेट किया गया।
हृदय खंड प्राप्त किए गए और 6 कुओं में संवर्धन की स्थिति इस प्रकार की गई: कटे हुए हृदयों को स्थानांतरण पोत से ठंडी (4° C.) कार्डियोप्लेजिया वाली ट्रे में स्थानांतरित करें।बाएं वेंट्रिकल को एक बाँझ ब्लेड से अलग किया गया और 1-2 सेमी3 के टुकड़ों में काट दिया गया।इन ऊतक ब्लॉकों को ऊतक चिपकने वाले ऊतक समर्थन से जोड़ा गया था और टायरोड के समाधान वाले एक कंपन माइक्रोटोम ऊतक स्नान में रखा गया था और लगातार ऑक्सीजन युक्त (3 ग्राम / एल 2,3-ब्यूटेनडियोन मोनोऑक्साइम (बीडीएम), 140 मिमी NaCl (8.18 ग्राम), 6 मिमी KCl (0.447 ग्राम), 10 मिमी डी-ग्लूकोज (1.86 ग्राम), 10 मिमी HEPES (2.38 ग्राम), 1 mM MgCl2 (1 मिली 1 M घोल), 1.8 mM CaCl2 (1.8 मिली 1 M घोल), 1 L ddH2O तक)।कंपन करने वाले माइक्रोटोम को 80 हर्ट्ज की आवृत्ति, 2 मिमी के क्षैतिज कंपन आयाम और 0.03 मिमी/सेकेंड की अग्रिम दर पर 300 µm मोटी स्लाइस काटने के लिए सेट किया गया था।घोल को ठंडा रखने के लिए टिश्यू बाथ को बर्फ से घेरा गया था और तापमान 4°C पर बनाए रखा गया था।जब तक एक कल्चर प्लेट के लिए पर्याप्त खंड प्राप्त नहीं हो जाते, तब तक ऊतक अनुभागों को माइक्रोटोम स्नान से बर्फ पर लगातार ऑक्सीजन युक्त टायरोड समाधान वाले ऊष्मायन स्नान में स्थानांतरित करें।ट्रांसवेल संस्कृतियों के लिए, ऊतक वर्गों को बाँझ 6 मिमी चौड़े पॉलीयूरेथेन समर्थन से जोड़ा गया था और 6 मिलीलीटर अनुकूलित माध्यम (199 मध्यम, 1x आईटीएस पूरक, 10% एफबीएस, 5 एनजी / एमएल वीईजीएफ, 10 एनजी / एमएल एफजीएफ-क्षारीय और 2 एक्स एंटीबायोटिक-एंटीफंगल) में रखा गया था।सी-पेस के माध्यम से ऊतक वर्गों पर विद्युत उत्तेजना (10 वी, आवृत्ति 1.2 हर्ट्ज) लागू की गई थी।टीडी स्थितियों के लिए, प्रत्येक माध्यम परिवर्तन पर 100 एनएम और 1 μM पर ताजा टी3 और डेक्स जोड़े गए।प्रतिस्थापन से पहले माध्यम को दिन में 3 बार ऑक्सीजन से संतृप्त किया जाता है।ऊतक वर्गों को एक इनक्यूबेटर में 37°C और 5% CO2 पर सुसंस्कृत किया गया।
सीटीसीएम संस्कृतियों के लिए, ऊतक अनुभागों को संशोधित टायरोड के समाधान वाले पेट्री डिश में एक कस्टम-निर्मित 3 डी प्रिंटर पर रखा गया था।डिवाइस को हृदय के टुकड़े के आकार को सपोर्ट रिंग के क्षेत्र के 25% तक बढ़ाने के लिए डिज़ाइन किया गया है।ऐसा इसलिए किया जाता है ताकि टायरोड के घोल से माध्यम में स्थानांतरित होने के बाद और डायस्टोल के दौरान हृदय के हिस्सों में खिंचाव न हो।हिस्टोएक्रेलिक गोंद का उपयोग करके, 300 µm मोटे खंडों को 7 मिमी व्यास वाली एक सपोर्ट रिंग पर तय किया गया था।ऊतक अनुभागों को सपोर्ट रिंग से जोड़ने के बाद, अतिरिक्त ऊतक अनुभागों को काट दें और संलग्न ऊतक अनुभागों को बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर टायरोड समाधान के स्नान में वापस रखें जब तक कि एक उपकरण के लिए पर्याप्त अनुभाग तैयार न हो जाएं।सभी उपकरणों के लिए कुल प्रसंस्करण समय 2 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए।6 ऊतक अनुभागों को उनके समर्थन रिंगों से जोड़ने के बाद, CTCM डिवाइस को इकट्ठा किया गया था।सीटीसीएम कल्चर चैम्बर 21 मिलीलीटर पूर्व-ऑक्सीजनयुक्त माध्यम से पहले से भरा हुआ है।ऊतक अनुभागों को कल्चर चैंबर में स्थानांतरित करें और पिपेट के साथ किसी भी हवाई बुलबुले को सावधानीपूर्वक हटा दें।फिर ऊतक अनुभाग को छेद में निर्देशित किया जाता है और धीरे से जगह पर दबाया जाता है।अंत में, इलेक्ट्रोड कैप को डिवाइस पर रखें और डिवाइस को इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।फिर CTCM को एयर ट्यूब और C-PACE-EM सिस्टम से कनेक्ट करें।वायवीय एक्चुएटर खुलता है और वायु वाल्व सीटीसीएम खोलता है।सी-पेस-ईएम प्रणाली को 2 एमएस के लिए द्विध्रुवीय गति के दौरान 1.2 हर्ट्ज पर 4 वी वितरित करने के लिए कॉन्फ़िगर किया गया था।इलेक्ट्रोड पर ग्रेफाइट के संचय से बचने के लिए माध्यम को दिन में दो बार बदला जाता था और इलेक्ट्रोड को दिन में एक बार बदला जाता था।यदि आवश्यक हो, तो उनके नीचे गिरे किसी भी हवाई बुलबुले को बाहर निकालने के लिए ऊतक वर्गों को उनके संस्कृति कुओं से हटाया जा सकता है।एमटी उपचार स्थितियों के लिए, टी3/डेक्स को 100 एनएम टी3 और 1 माइक्रोएम डेक्स के साथ प्रत्येक माध्यम परिवर्तन के साथ ताजा जोड़ा गया था।सीटीसीएम उपकरणों को एक इनक्यूबेटर में 37°C और 5% CO2 पर संवर्धित किया गया।
हृदय के टुकड़ों के विस्तारित प्रक्षेप पथ प्राप्त करने के लिए, एक विशेष कैमरा प्रणाली विकसित की गई थी।नेविटर ज़ूम 7000 18-108 मिमी मैक्रो लेंस (नेविटर, सैन फ्रांसिस्को, सीए) के साथ एक एसएलआर कैमरा (कैनन रेबेल टी7आई, कैनन, टोक्यो, जापान) का उपयोग किया गया था।माध्यम को ताज़ा माध्यम से बदलने के बाद कमरे के तापमान पर विज़ुअलाइज़ेशन किया गया।कैमरा 51° के कोण पर स्थित है और वीडियो 30 फ्रेम प्रति सेकंड पर रिकॉर्ड किया जाता है।सबसे पहले, दिल के टुकड़ों की गति को मापने के लिए इमेज-जे के साथ ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर (MUSCLEMOTION43) का उपयोग किया गया था।शोर से बचने के लिए दिल के टुकड़ों की धड़कन के लिए रुचि के क्षेत्रों को परिभाषित करने के लिए MATLAB (मैथवर्क्स, नैटिक, एमए, यूएसए) का उपयोग करके मास्क बनाया गया था।मैन्युअल रूप से खंडित मास्क को एक फ्रेम अनुक्रम में सभी छवियों पर लागू किया जाता है और फिर मसलमोशन प्लग-इन में भेज दिया जाता है।मसल मोशन संदर्भ फ्रेम के सापेक्ष अपनी गति को मापने के लिए प्रत्येक फ्रेम में पिक्सेल की औसत तीव्रता का उपयोग करता है।डेटा को रिकॉर्ड किया गया, फ़िल्टर किया गया और चक्र के समय को मापने और हृदय चक्र के दौरान ऊतक खिंचाव का आकलन करने के लिए उपयोग किया गया।रिकॉर्ड किए गए वीडियो को प्रथम-क्रम शून्य-चरण डिजिटल फ़िल्टर का उपयोग करके पोस्ट-प्रोसेस किया गया था।ऊतक खिंचाव (पीक-टू-पीक) को मापने के लिए, रिकॉर्ड किए गए सिग्नल में चोटियों और गर्तों के बीच अंतर करने के लिए पीक-टू-पीक विश्लेषण किया गया था।इसके अलावा, सिग्नल बहाव को खत्म करने के लिए छठे क्रम के बहुपद का उपयोग करके डिट्रेंडिंग किया जाता है।वैश्विक ऊतक गति, चक्र समय, विश्राम समय और संकुचन समय (पूरक कार्यक्रम कोड 44) निर्धारित करने के लिए प्रोग्राम कोड MATLAB में विकसित किया गया था।
तनाव विश्लेषण के लिए, यांत्रिक खिंचाव मूल्यांकन के लिए बनाए गए उन्हीं वीडियो का उपयोग करते हुए, हमने सबसे पहले मसलमोशन सॉफ्टवेयर के अनुसार गति शिखर (गति के उच्चतम (ऊपरी) और निम्नतम (निचले) बिंदु) का प्रतिनिधित्व करने वाली दो छवियों का पता लगाया।फिर हमने ऊतक क्षेत्रों को खंडित किया और खंडित ऊतक पर छायांकन एल्गोरिदम का एक रूप लागू किया (पूरक छवि 2 ए)।खंडित ऊतक को फिर दस उपसतहों में विभाजित किया गया था, और प्रत्येक सतह पर तनाव की गणना निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके की गई थी: तनाव = (सुपर-सडाउन)/सडाउन, जहां सुपर और डाउन क्रमशः कपड़े के ऊपर और नीचे की छाया से आकार की दूरी हैं (पूरक छवि .2 बी)।
हृदय के हिस्सों को 48 घंटों के लिए 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड में स्थिर किया गया।स्थिर ऊतकों को 1 घंटे के लिए 10% और 20% सुक्रोज में निर्जलित किया गया, फिर रात भर में 30% सुक्रोज में निर्जलित किया गया।फिर अनुभागों को इष्टतम काटने वाले तापमान यौगिक (ओसीटी यौगिक) में एम्बेड किया गया और धीरे-धीरे एक आइसोपेंटेन/सूखी बर्फ स्नान में जमे हुए किया गया।अलग होने तक ओसीटी एम्बेडिंग ब्लॉकों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।स्लाइड्स को 8 माइक्रोमीटर की मोटाई वाले अनुभागों के रूप में तैयार किया गया था।
दिल के हिस्सों से ओसीटी को हटाने के लिए, स्लाइड्स को हीटिंग ब्लॉक पर 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।प्रत्येक स्लाइड में 1 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, फिर कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए पीबीएस में 0.1% ट्राइटन-एक्स सेट करके अनुभागों में प्रवेश करें।गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी को नमूने से जुड़ने से रोकने के लिए, स्लाइड में 3% बीएसए समाधान का 1 मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।फिर बीएसए को हटा दिया गया और स्लाइडों को पीबीएस से धोया गया।प्रत्येक नमूने को पेंसिल से चिह्नित करें।प्राथमिक एंटीबॉडी (1% बीएसए में पतला 1:200) (कनेक्सिन 43 (एबीकैम; #एबी11370), एनएफएटीसी4 (एबीकैम; #एबी99431) और ट्रोपोनिन-टी (थर्मो साइंटिफिक; #एमए5-12960) को 90 मिनट में जोड़ा गया, फिर माउस एलेक्सा फ्लोर 488 (थर्मो साइंटिफिक; #) के खिलाफ माध्यमिक एंटीबॉडी (1% बीएसए में पतला 1:200) A16079), खरगोश एलेक्सा फ्लोर 594 (थर्मो साइंटिफिक; #T6391) के खिलाफ अतिरिक्त 90 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 3 बार धोया गया पृष्ठभूमि से लक्ष्य धुंधला को अलग करने के लिए, हमने नियंत्रण के रूप में केवल माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया। अंत में, डीएपीआई परमाणु दाग ​​जोड़ा गया और स्लाइड्स को वेक्टाशील्ड (वेक्टर प्रयोगशालाओं) में रखा गया और नेल पॉलिश के साथ सील कर दिया गया। -x आवर्धन) और 40x आवर्धन के साथ कीन्स माइक्रोस्कोप।
पीबीएस में 5 μg/ml पर WGA-एलेक्सा फ्लोर 555 (थर्मो साइंटिफिक; #W32464) का उपयोग WGA स्टेनिंग के लिए किया गया और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए निश्चित वर्गों पर लगाया गया।फिर स्लाइडों को पीबीएस से धोया गया और सूडान ब्लैक को प्रत्येक स्लाइड में जोड़ा गया और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया।फिर स्लाइडों को पीबीएस से धोया गया और वेक्टाशील्ड एम्बेडिंग माध्यम जोड़ा गया।स्लाइडों को कीएंस माइक्रोस्कोप पर 40x आवर्धन पर देखा गया।
ऊपर वर्णित अनुसार नमूनों से OCT हटा दिया गया था।OCT को हटाने के बाद, स्लाइड्स को रात भर बौइन के घोल में डुबोएं।फिर स्लाइडों को 1 घंटे के लिए आसुत जल से धोया गया और फिर 10 मिनट के लिए बिब्रिच एलो एसिड फुकसिन समाधान में रखा गया।फिर स्लाइडों को आसुत जल से धोया गया और 10 मिनट के लिए 5% फॉस्फोमोलिब्डेनम/5% फॉस्फोटंगस्टिक एसिड के घोल में रखा गया।बिना धोए, स्लाइडों को 15 मिनट के लिए सीधे एनिलिन नीले घोल में डालें।फिर स्लाइडों को आसुत जल से धोया गया और 2 मिनट के लिए 1% एसिटिक एसिड समाधान में रखा गया।स्लाइडों को 200 एन इथेनॉल में सुखाया गया और जाइलीन में स्थानांतरित किया गया।10x उद्देश्य के साथ कीन्स माइक्रोस्कोप का उपयोग करके दागदार स्लाइडों की कल्पना की गई।कीएन्स एनालाइज़र सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके फ़ाइब्रोसिस क्षेत्र प्रतिशत निर्धारित किया गया था।
कुछ संशोधनों के साथ निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार CyQuant™ MTT सेल व्यवहार्यता परख (इन्विट्रोजन, कार्ल्सबैड, CA), कैटलॉग संख्या V13154।विशेष रूप से, एमटीटी विश्लेषण के दौरान एक समान ऊतक आकार सुनिश्चित करने के लिए 6 मिमी व्यास वाले एक सर्जिकल पंच का उपयोग किया गया था।निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ऊतकों को व्यक्तिगत रूप से एमटीटी सब्सट्रेट युक्त 12-वेल प्लेट के कुओं में चढ़ाया गया था।अनुभागों को 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया जाता है और जीवित ऊतक बैंगनी फॉर्मेज़ान यौगिक बनाने के लिए एमटीटी सब्सट्रेट को चयापचय करता है।एमटीटी सॉल्यूशन को 1 मिली डीएमएसओ से बदलें और हृदय के हिस्सों से बैंगनी फॉर्मेज़ान को निकालने के लिए 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।नमूनों को 96-अच्छी तरह से स्पष्ट निचली प्लेटों में डीएमएसओ में 1:10 पतला किया गया और साइटेशन प्लेट रीडर (बायोटेक) का उपयोग करके 570 एनएम पर बैंगनी रंग की तीव्रता मापी गई।हृदय के प्रत्येक टुकड़े के वजन के अनुसार रीडिंग को सामान्य किया गया।
जैसा कि पहले बताया गया है, ग्लूकोज उपयोग परख के लिए हार्ट स्लाइस मीडिया को 1 μCi/ml [5-3H]-ग्लूकोज (मोरावेक बायोकेमिकल्स, ब्रे, सीए, यूएसए) युक्त मीडिया से बदल दिया गया था।ऊष्मायन के 4 घंटे के बाद, 0.2 एन एचसीएल के 100 μl युक्त एक खुली माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 100 μl माध्यम जोड़ें।फिर ट्यूब को 37°C पर 72 घंटों के लिए [3H]2O को वाष्पित करने के लिए 500 μl dH2O युक्त जगमगाहट ट्यूब में रखा गया था।फिर जगमगाहट ट्यूब से माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को हटा दें और 10 मिलीलीटर जगमगाहट तरल पदार्थ डालें।ट्राई-कार्ब 2900TR लिक्विड सिंटिलेशन एनालाइज़र (पैकार्ड बायोसाइंस कंपनी, मेरिडेन, सीटी, यूएसए) का उपयोग करके सिंटिलेशन गिनती की गई।ग्लूकोज उपयोग की गणना तब [5-3एच]-ग्लूकोज विशिष्ट गतिविधि, अपूर्ण संतुलन और पृष्ठभूमि, [5-3एच]-बिना लेबल वाले ग्लूकोज के कमजोर पड़ने और जगमगाहट काउंटर दक्षता को ध्यान में रखकर की गई थी।डेटा को हृदय के वर्गों के द्रव्यमान के लिए सामान्यीकृत किया जाता है।
ट्राइज़ोल में ऊतक समरूपीकरण के बाद, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार क्यूजेन miRNeasy माइक्रो किट #210874 का उपयोग करके आरएनए को हृदय अनुभाग से अलग किया गया था।आरएनएसेक लाइब्रेरी की तैयारी, अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण निम्नानुसार किया गया:
आरएनए लाइब्रेरी की तैयारी के लिए प्रारंभिक सामग्री के रूप में प्रति नमूना 1 μg आरएनए का उपयोग किया गया था।निर्माता की सिफारिशों के बाद इलुमिना (एनईबी, यूएसए) के लिए एनईबीनेक्स्ट अल्ट्राटीएम आरएनए लाइब्रेरी तैयारी किट का उपयोग करके अनुक्रमण लाइब्रेरी तैयार की गई थी, और प्रत्येक नमूने के लिए विशेषता अनुक्रमों में इंडेक्स कोड जोड़े गए थे।संक्षेप में, पॉली-टी ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स से जुड़े चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके एमआरएनए को कुल आरएनए से शुद्ध किया गया था।एनईबीनेक्स्ट फर्स्ट स्ट्रैंड सिंथेसिस रिएक्शन बफर (5X) में उच्च तापमान पर द्विसंयोजक धनायनों का उपयोग करके विखंडन किया जाता है।पहले स्ट्रैंड सीडीएनए को यादृच्छिक हेक्सामर प्राइमर और एम-एमयूएलवी रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (आरएनएएस एच-) का उपयोग करके संश्लेषित किया गया था।फिर दूसरे स्ट्रैंड सीडीएनए को डीएनए पोलीमरेज़ I और RNase H का उपयोग करके संश्लेषित किया जाता है। शेष ओवरहैंग को एक्सोन्यूक्लिज़/पोलीमरेज़ गतिविधि द्वारा कुंद सिरों में बदल दिया जाता है।डीएनए टुकड़े के 3′ सिरे के एडिनाइलेशन के बाद, इसे संकरण के लिए तैयार करने के लिए हेयरपिन लूप संरचना वाला एक एनईबीनेक्स्ट एडाप्टर इसके साथ जोड़ा जाता है।पसंदीदा लंबाई 150-200 बीपी के सीडीएनए टुकड़े के चयन के लिए।लाइब्रेरी के टुकड़ों को AMPure XP सिस्टम (बेकमैन कूल्टर, बेवर्ली, यूएसए) का उपयोग करके शुद्ध किया गया था।फिर, एक एडाप्टर के साथ आकार-चयनित सीडीएनए लिगेट के साथ 3 μl यूजर एंजाइम (एनईबी, यूएसए) का उपयोग पीसीआर से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए और फिर 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए किया गया था।फिर फ़्यूज़न हाई-फ़िडेलिटी डीएनए पोलीमरेज़, यूनिवर्सल पीसीआर प्राइमर और इंडेक्स (एक्स) प्राइमर का उपयोग करके पीसीआर का प्रदर्शन किया गया।अंत में, पीसीआर उत्पादों को शुद्ध किया गया (एएमप्योर एक्सपी सिस्टम) और लाइब्रेरी की गुणवत्ता का मूल्यांकन एगिलेंट बायोएनालाइजर 2100 सिस्टम पर किया गया।सीडीएनए लाइब्रेरी को नोवासेक सीक्वेंसर का उपयोग करके अनुक्रमित किया गया था।इल्लुमिना की कच्ची छवि फ़ाइलों को CASAVA बेस कॉलिंग का उपयोग करके कच्ची रीड्स में परिवर्तित किया गया था।कच्चा डेटा FASTQ(fq) प्रारूप फ़ाइलों में संग्रहीत किया जाता है जिसमें पढ़ने के अनुक्रम और संबंधित आधार गुण होते हैं।फ़िल्टर किए गए अनुक्रमण को Sscrofa11.1 संदर्भ जीनोम से मिलान करने के लिए HISAT2 का चयन करें।सामान्य तौर पर, HISAT2 किसी भी आकार के जीनोम का समर्थन करता है, जिसमें 4 बिलियन बेस से बड़े जीनोम भी शामिल हैं, और अधिकांश मापदंडों के लिए डिफ़ॉल्ट मान निर्धारित हैं।RNA Seq डेटा से स्प्लिसिंग रीड्स को HISAT2 का उपयोग करके कुशलतापूर्वक संरेखित किया जा सकता है, जो वर्तमान में उपलब्ध सबसे तेज़ प्रणाली है, किसी भी अन्य विधि की तुलना में समान या बेहतर सटीकता के साथ।
प्रतिलेखों की प्रचुरता सीधे जीन अभिव्यक्ति के स्तर को दर्शाती है।जीन अभिव्यक्ति के स्तर का आकलन जीनोम या एक्सॉन से जुड़े प्रतिलेखों (अनुक्रमण गणना) की प्रचुरता से किया जाता है।रीड्स की संख्या जीन अभिव्यक्ति स्तर, जीन लंबाई और अनुक्रमण गहराई के समानुपाती होती है।एफपीकेएम (प्रति मिलियन आधार जोड़े अनुक्रमित प्रतिलेख के प्रति हजार आधार जोड़े के टुकड़े) की गणना की गई और DESeq2 पैकेज का उपयोग करके अंतर अभिव्यक्ति के पी-मूल्य निर्धारित किए गए।फिर हमने अंतर्निहित आर-फ़ंक्शन "पी.एडजस्ट" के आधार पर बेंजामिनी-होचबर्ग विधि9 का उपयोग करके प्रत्येक पी मान के लिए झूठी खोज दर (एफडीआर) की गणना की।
थर्मो (थर्मो, बिल्ली संख्या 11756050) से सुपरस्क्रिप्ट IV विलो मास्टर मिश्रण का उपयोग करके हृदय वर्गों से पृथक आरएनए को 200 एनजी/μl की सांद्रता पर सीडीएनए में परिवर्तित किया गया था।मात्रात्मक आरटी-पीसीआर एक एप्लाइड बायोसिस्टम्स एंडुरा प्लेट माइक्रोएम्प 384-वेल पारदर्शी प्रतिक्रिया प्लेट (थर्मो, बिल्ली संख्या 4483319) और माइक्रोएम्प ऑप्टिकल चिपकने वाला (थर्मो, बिल्ली संख्या 4311971) का उपयोग करके किया गया था।प्रतिक्रिया मिश्रण में 5 μl टैक्मैन फास्ट एडवांस्ड मास्टर मिक्स (थर्मो, कैट # 4444557), 0.5 μl टैक्मैन प्राइमर और 3.5 μl H2O प्रति कुएं में मिश्रित थे।मानक क्यूपीसीआर चक्र चलाए गए और एप्लाइड बायोसिस्टम्स क्वांटस्टूडियो 5 रीयल-टाइम पीसीआर उपकरण (384-वेल मॉड्यूल; उत्पाद # ए28135) का उपयोग करके सीटी मान मापा गया।टैकमैन प्राइमर थर्मो (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH) से खरीदे गए थे। GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) सभी नमूनों के CT मान हाउसकीपिंग जीन GAPDH के लिए सामान्यीकृत किए गए थे।
NT-ProBNP की मीडिया रिलीज़ का मूल्यांकन निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार NT-ProBNP किट (पिग) (कैट नं. MBS2086979, MyBioSource) का उपयोग करके किया गया था।संक्षेप में, प्रत्येक नमूने और मानक का 250 μl प्रत्येक कुएं में दो प्रतियों में जोड़ा गया था।नमूना जोड़ने के तुरंत बाद, प्रत्येक कुएं में परख अभिकर्मक ए के 50 μl जोड़ें।प्लेट को धीरे से हिलाएं और सीलेंट से सील करें।फिर गोलियों को 1 घंटे के लिए 37°C पर इनक्यूबेट किया गया।फिर घोल को एस्पिरेट करें और कुओं को 1X वॉश घोल के 350 μl से 4 बार धोएं, हर बार 1-2 मिनट के लिए वॉश घोल को इनक्यूबेट करें।फिर प्रति कुएं में 100 μl परख अभिकर्मक बी डालें और प्लेट सीलेंट से सील करें।टैबलेट को धीरे से हिलाया गया और 30 मिनट के लिए 37°C पर इनक्यूबेट किया गया।घोल को एस्पिरेट करें और कुओं को 1X वॉश घोल के 350 μl से 5 बार धोएं।प्रत्येक कुएं में 90 μl सब्सट्रेट समाधान जोड़ें और प्लेट को सील करें।प्लेट को 37°C पर 10-20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।प्रत्येक कुएं में 50 μl स्टॉप सॉल्यूशन जोड़ें।प्लेट को तुरंत 450 एनएम पर सेटेशन (बायोटेक) प्लेट रीडर सेट का उपयोग करके मापा गया था।
समूह आकार चुनने के लिए पावर विश्लेषण किया गया जो 5% प्रकार I त्रुटि दर के साथ पैरामीटर में 10% पूर्ण परिवर्तन का पता लगाने के लिए >80% शक्ति प्रदान करेगा। समूह आकार चुनने के लिए पावर विश्लेषण किया गया जो 5% प्रकार I त्रुटि दर के साथ पैरामीटर में 10% पूर्ण परिवर्तन का पता लगाने के लिए >80% शक्ति प्रदान करेगा। Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспеч ат >80% वार्षिक आय पर 10% वार्षिक आय पर 5% वार्षिक आय той ошибок типа I. पावर विश्लेषण समूह आकारों का चयन करने के लिए किया गया था जो 5% प्रकार I त्रुटि दर के साथ 10% पूर्ण पैरामीटर परिवर्तन का पता लगाने के लिए > 80% पावर प्रदान करेगा।80% से अधिक की लागत से 10% से अधिक की लागत से 5% से अधिक की आय प्राप्त होती है।80% से अधिक की लागत से 10% से अधिक की लागत से 5% से अधिक की आय प्राप्त होती है। Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспеч कुल राशि > 80% अधिकतम आय 10% वार्षिक आय और 5% частоты ошибок типа I. एक समूह आकार का चयन करने के लिए एक शक्ति विश्लेषण किया गया था जो 10% पूर्ण पैरामीटर परिवर्तन और 5% प्रकार I त्रुटि दर का पता लगाने के लिए >80% शक्ति प्रदान करेगा।प्रयोग से पहले ऊतक अनुभागों को यादृच्छिक रूप से चुना गया था।सभी विश्लेषण कंडीशन ब्लाइंड थे और सभी डेटा का विश्लेषण करने के बाद ही नमूनों को डिकोड किया गया था।सभी सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए ग्राफपैड प्रिज्म सॉफ्टवेयर (सैन डिएगो, सीए) का उपयोग किया गया था। सभी आँकड़ों के लिए, पी-मानों को मान <0.05 पर महत्वपूर्ण माना जाता था। सभी आँकड़ों के लिए, पी-मानों को <0.05 मानों पर महत्वपूर्ण माना जाता था। Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. सभी आँकड़ों के लिए, पी-मानों को <0.05 मानों पर महत्वपूर्ण माना जाता था।对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. सभी आँकड़ों के लिए, पी-मानों को <0.05 मानों पर महत्वपूर्ण माना जाता था।दो-पूंछ वाले छात्र का टी-टेस्ट केवल 2 तुलनाओं के साथ डेटा पर किया गया था।कई समूहों के बीच महत्व निर्धारित करने के लिए एक-तरफ़ा या दो-तरफ़ा एनोवा का उपयोग किया गया था।पोस्ट हॉक परीक्षण करते समय, कई तुलनाओं को ध्यान में रखते हुए तुकी के सुधार को लागू किया गया था।एफडीआर और पी.एडजस्ट की गणना करते समय आरएनएसेक डेटा में विशेष सांख्यिकीय विचार होते हैं जैसा कि विधि अनुभाग में वर्णित है।
अध्ययन डिज़ाइन के बारे में अधिक जानकारी के लिए, इस लेख से जुड़ा नेचर रिसर्च रिपोर्ट सार देखें।