Nature.com पर आने के लिए धन्यवाद। आप जिस ब्राउज़र संस्करण का उपयोग कर रहे हैं, उसमें CSS समर्थन सीमित है। सर्वोत्तम अनुभव के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि आप अपडेट किया गया ब्राउज़र उपयोग करें (या इंटरनेट एक्सप्लोरर में संगतता मोड अक्षम करें)। इस बीच, निरंतर समर्थन सुनिश्चित करने के लिए, हम साइट को स्टाइल और जावास्क्रिप्ट के बिना प्रस्तुत करेंगे।
AFEX से पूर्व उपचारित मकई के भूसे में स्थायी ओलिगोसेकेराइड के जटिल विश्लेषण के लिए नई प्रतिरक्षाविज्ञानी और द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्रिक विधियाँ। लिग्नोसेल्यूलोसिक बायोमास जीवाश्म ईंधन का एक स्थायी विकल्प है और इसका व्यापक रूप से खाद्य, चारा, ईंधन और रसायनों जैसे उत्पादों के उत्पादन के लिए जैव प्रौद्योगिकी विकसित करने के लिए उपयोग किया जाता है। इन प्रौद्योगिकियों की कुंजी पौधों की कोशिका भित्तियों में मौजूद जटिल कार्बोहाइड्रेट को ग्लूकोज, ज़ाइलोज़ और अरबीनोज़ जैसे सरल शर्करा में परिवर्तित करने के लिए लागत-प्रतिस्पर्धी प्रक्रियाओं का विकास है। क्योंकि लिग्नोसेल्यूलोसिक बायोमास बहुत जिद्दी होता है, इसलिए इसे वांछित उत्पाद प्राप्त करने के लिए थर्मोकेमिकल उपचार (जैसे, अमोनिया फाइबर एक्सफोलिएशन (AFEX), तनु अम्ल (DA), आयनिक तरल पदार्थ (IL)) और जैविक उपचार (जैसे, एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस और माइक्रोबियल किण्वन) के संयोजन के अधीन किया जाना चाहिए। हालांकि, जब हाइड्रोलिसिस प्रक्रिया में वाणिज्यिक फंगल एंजाइम का उपयोग किया जाता है, तो बनने वाली घुलनशील शर्कराओं में से केवल 75-85% मोनोसैकेराइड होते हैं, और शेष 15-25% घुलनशील, असाध्य ओलिगोसेकेराइड होते हैं, जो हमेशा सूक्ष्मजीवों के लिए उपलब्ध नहीं होते हैं। पहले, हमने कार्बन और डायटोमेसियस अर्थ पृथक्करण और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के संयोजन का उपयोग करके घुलनशील जिद्दी ओलिगोसेकेराइड को सफलतापूर्वक अलग और शुद्ध किया है, और उनके एंजाइम अवरोधक गुणों की भी जांच की है। हमने पाया है कि उच्च डिग्री के पोलीमराइजेशन (डीपी) मिथाइलेटेड यूरोनिक एसिड प्रतिस्थापन वाले ओलिगोसेकेराइड को कम डीपी और तटस्थ ओलिगोसेकेराइड की तुलना में वाणिज्यिक एंजाइम मिश्रणों के साथ संसाधित करना अधिक कठिन है। यहां हम कई अतिरिक्त तरीकों के इस्तेमाल की रिपोर्ट कर रहे हैं, जिसमें प्लांट सेल दीवारों और एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसेट्स में ग्लाइकेन बॉन्ड की विशेषता के लिए प्लांट बायोमास ग्लाइकेन्स के लिए विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAbs) का उपयोग करके ग्लाइकेन प्रोफाइलिंग, मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर डिसोर्प्शन आयनीकरण, टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमेट्री शामिल हैं। MALDI-TOF-MS) नकारात्मक आयनों के द्वितीयक क्षय के बाद स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त संरचना-सूचनात्मक डायग्नोस्टिक चोटियों, गैस क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (GC-MS) का उपयोग व्युत्पन्न के साथ और बिना ऑलिगोसेकेराइड बॉन्ड की विशेषता के लिए करता है। ऑलिगोसेकेराइड्स (DP 4–20) के छोटे आकार के कारण, इन अणुओं को mAb बाइंडिंग और विशेषता के लिए उपयोग करना मुश्किल है। इस समस्या को दूर करने के लिए, हमने एक नई बायोटिन संयुग्मन-आधारित ओलिगोसेकेराइड स्थिरीकरण विधि लागू की, जिसने माइक्रोप्लेट सतह पर कम डीपी घुलनशील ओलिगोसेकेराइड के बहुमत को सफलतापूर्वक लेबल किया, जिसका उपयोग विशिष्ट बंधन विश्लेषण के लिए उच्च थ्रूपुट एमएबी सिस्टम में किया गया था। यह नई विधि भविष्य में अधिक उन्नत उच्च थ्रूपुट ग्लाइकोम परख के विकास की सुविधा प्रदान करेगी जिसका उपयोग नैदानिक ​​उद्देश्यों के लिए बायोमार्कर में मौजूद ओलिगोसेकेराइड को अलग करने और उनकी विशेषता बताने के लिए किया जा सकता है।
कृषि, वानिकी, घास और लकड़ी की सामग्रियों से बना लिग्नोसेल्यूलोसिक बायोमास, उच्च मूल्य वाले उत्पादों का उत्पादन करने के लिए भोजन, चारा, ईंधन और रासायनिक अग्रदूतों सहित जैव-आधारित उत्पादों के उत्पादन के लिए एक संभावित फीडस्टॉक है1। पौधों की कोशिका भित्तियों में मौजूद कार्बोहाइड्रेट (जैसे सेल्यूलोज और हेमीसेल्यूलोज) को रासायनिक प्रसंस्करण और जैव-परिवर्तन (जैसे एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस और माइक्रोबियल किण्वन) द्वारा मोनोसैकेराइड में विघटित किया जाता है। सामान्य पूर्व-उपचारों में अमोनिया फाइबर विस्तार (AFEX), तनु अम्ल (DA), आयनिक द्रव (IL), और भाप विस्फोट (SE) शामिल हैं, जो पौधों की कोशिका भित्तियों को खोलकर लिग्नोसेल्यूलोज उत्पादन को कम करने के लिए रसायनों और गर्मी के संयोजन का उपयोग करते हैं3,4। पदार्थ की हठधर्मिता, 5. एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस को वाणिज्यिक सक्रिय कार्बोहाइड्रेट युक्त एंजाइमों (CAZymes) और माइक्रोबियल किण्वन का उपयोग करके उच्च ठोस भार पर किया जाता है ताकि जैव-आधारित ईंधन और रसायन 6 का उत्पादन किया जा सके।
वाणिज्यिक एंजाइमों में CAZymes एंजाइमों के एक जटिल मिश्रण से बने होते हैं जो जटिल कार्बोहाइड्रेट-शर्करा बंधों को सहक्रियात्मक रूप से तोड़कर मोनोसैकेराइड2,7 बनाते हैं। जैसा कि हमने पहले बताया, कार्बोहाइड्रेट के साथ लिग्निन के सुगंधित पॉलिमर का जटिल नेटवर्क उन्हें अत्यधिक अड़ियल बनाता है, जो अपूर्ण शर्करा रूपांतरण की ओर ले जाता है, जिससे 15-25% सेक्स ऑलिगोसेकेराइड जमा हो जाते हैं जो प्रीट्रीटेड बायोमास के एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस के दौरान उत्पन्न नहीं होते हैं। यह विभिन्न बायोमास प्रीट्रीटमेंट विधियों के साथ एक आम समस्या है। इस अड़चन के कुछ कारणों में हाइड्रोलिसिस के दौरान एंजाइम अवरोध, या प्लांट बायोमास में शर्करा बंधों को तोड़ने के लिए आवश्यक आवश्यक एंजाइमों की अनुपस्थिति या निम्न स्तर शामिल हैं। शर्करा की संरचना और संरचनात्मक विशेषताओं को समझना, जैसे कि ऑलिगोसेकेराइड में शर्करा बंध, हमें हाइड्रोलिसिस के दौरान शर्करा रूपांतरण में सुधार करने में मदद करेगा, जिससे जैव-तकनीकी प्रक्रियाएँ पेट्रोलियम-व्युत्पन्न उत्पादों के साथ लागत-प्रतिस्पर्धी बन जाएँगी।
कार्बोहाइड्रेट की संरचना का निर्धारण करना चुनौतीपूर्ण है और इसके लिए लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (एलसी)11,12, न्यूक्लियर मैग्नेटिक रेजोनेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी (एनएमआर)13, केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई)14,15,16 और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस)17 जैसी विधियों के संयोजन की आवश्यकता होती है। , अठारह। लेजर डिसोर्प्शन और मैट्रिक्स (एमएएलडीआई-टीओएफ-एमएस) का उपयोग करके आयनीकरण के साथ टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमेट्री जैसी एमएस विधियाँ कार्बोहाइड्रेट संरचनाओं की पहचान करने के लिए एक बहुमुखी विधि हैं। हाल ही में, सोडियम आयन एडक्ट्स के टकराव-प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) टेंडेम एमएस का सबसे व्यापक रूप से ऑलिगोसेकेराइड अटैचमेंट पोजिशन, एनोमेरिक कॉन्फ़िगरेशन, अनुक्रम और ब्रांचिंग पोजिशन 20, 21 के अनुरूप फिंगरप्रिंट की पहचान करने के लिए उपयोग किया गया है।
ग्लाइकेन विश्लेषण कार्बोहाइड्रेट बॉन्ड की गहन पहचान के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है22। यह विधि जटिल कार्बोहाइड्रेट लिंकेज को समझने के लिए जांच के रूप में पौधे की कोशिका भित्ति ग्लाइकेन को निर्देशित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAbs) का उपयोग करती है। दुनिया भर में 250 से अधिक mAbs उपलब्ध हैं, जिन्हें विभिन्न सैकराइड्स का उपयोग करके विभिन्न रैखिक और शाखित ओलिगोसेकेराइड्स के विरुद्ध डिज़ाइन किया गया है24। पौधे की कोशिका भित्ति की संरचना, संरचना और संशोधनों को चिह्नित करने के लिए कई mAbs का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, क्योंकि पौधे की कोशिका के प्रकार, अंग, आयु, विकासात्मक अवस्था और विकास पर्यावरण25,26 के आधार पर महत्वपूर्ण अंतर होते हैं। हाल ही में, इस पद्धति का उपयोग पौधे और पशु प्रणालियों में पुटिका आबादी और उपकोशिकीय मार्करों, विकासात्मक चरणों या पर्यावरणीय उत्तेजनाओं द्वारा निर्धारित ग्लाइकेन परिवहन में उनकी संबंधित भूमिकाओं को समझने और एंजाइमेटिक गतिविधि को निर्धारित करने के लिए किया गया है। ग्लाइकेन और ज़ाइलन की कुछ अलग संरचनाओं की पहचान की गई है जिनमें पेक्टिन (पी), ज़ाइलन (एक्स), मैनन (एम), ज़ाइलोग्लूकेन्स (XylG), मिश्रित बॉन्ड ग्लूकेन्स (MLG), अरेबिनॉक्सिलन (ArbX), गैलेक्टोमैनन (GalG), ग्लूकोरोनिक एसिड-अरबिनॉक्सिलन (GArbX) और अरेबिनो-गैलेक्टन (ArbG)29 शामिल हैं।
हालांकि, इन सभी शोध प्रयासों के बावजूद, केवल कुछ अध्ययनों ने उच्च ठोस भार (एचएसएल) हाइड्रोलिसिस के दौरान ओलिगोसेकेराइड संचय की प्रकृति पर ध्यान केंद्रित किया है, जिसमें ओलिगोसेकेराइड रिलीज, हाइड्रोलिसिस के दौरान ओलिगोमेरिक चेन लंबाई में परिवर्तन, विभिन्न कम डीपी पॉलिमर और उनके वक्र शामिल हैं। वितरण 30,31,32। इस बीच, हालांकि ग्लाइकेन विश्लेषण ग्लाइकेन संरचना के व्यापक विश्लेषण के लिए एक उपयोगी उपकरण साबित हुआ है, एंटीबॉडी विधियों का उपयोग करके पानी में घुलनशील कम डीपी ओलिगोसेकेराइड का मूल्यांकन करना मुश्किल है। 5-10 kDa से कम आणविक भार वाले छोटे DP ओलिगोसेकेराइड ELISA प्लेट 33, 34 से बंधते नहीं हैं और एंटीबॉडी जोड़ने से पहले धुल जाते हैं।
यहाँ, पहली बार, हम मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके एविडिन-लेपित प्लेटों पर एलिसा परख का प्रदर्शन करते हैं, जिसमें घुलनशील दुर्दम्य ओलिगोसेकेराइड के लिए एक-चरण बायोटिनिलेशन प्रक्रिया को ग्लाइकोम विश्लेषण के साथ जोड़ा जाता है। ग्लाइकोम विश्लेषण के लिए हमारे दृष्टिकोण को हाइड्रोलाइज्ड शुगर रचनाओं के ट्राइमेथिलसिलिल (TMS) व्युत्पन्नकरण का उपयोग करके पूरक ओलिगोसेकेराइड लिंकेज के MALDI-TOF-MS और GC-MS आधारित विश्लेषण द्वारा मान्य किया गया था। इस अभिनव दृष्टिकोण को भविष्य में एक उच्च-थ्रूपुट विधि के रूप में विकसित किया जा सकता है और बायोमेडिकल अनुसंधान में व्यापक अनुप्रयोग पाया जा सकता है35।
एंजाइमों और एंटीबॉडी के अनुवादोत्तर संशोधन, जैसे कि ग्लाइकोसिलेशन,36 उनकी जैविक गतिविधि को प्रभावित करते हैं। उदाहरण के लिए, सीरम प्रोटीन के ग्लाइकोसिलेशन में परिवर्तन सूजन संबंधी गठिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और ग्लाइकोसिलेशन में परिवर्तन का उपयोग निदान मार्कर37 के रूप में किया जाता है। साहित्य में विभिन्न ग्लाइकेन को विभिन्न रोगों में आसानी से प्रकट होने की सूचना दी गई है, जिसमें जठरांत्र संबंधी मार्ग और यकृत, वायरल संक्रमण, डिम्बग्रंथि, स्तन और प्रोस्टेट कैंसर38,39,40 की पुरानी सूजन संबंधी बीमारियाँ शामिल हैं। एंटीबॉडी-आधारित ग्लाइकेन एलिसा विधियों का उपयोग करके ग्लाइकेन की संरचना को समझना जटिल एमएस विधियों के उपयोग के बिना रोग निदान में अतिरिक्त विश्वास प्रदान करेगा।
हमारे पिछले अध्ययन से पता चला है कि जिद्दी ऑलिगोसेकेराइड प्रीट्रीटमेंट और एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस (चित्रा 1) के बाद भी अनहाइड्रोलाइज्ड रहे। हमारे पहले प्रकाशित कार्य में, हमने AFEX-प्रीट्रीटेड कॉर्न स्टोवर हाइड्रोलाइज़ेट (ACSH)8 से ऑलिगोसेकेराइड को अलग करने के लिए एक सक्रिय चारकोल सॉलिड-फ़ेज़ निष्कर्षण विधि विकसित की। प्रारंभिक निष्कर्षण और पृथक्करण के बाद, ऑलिगोसेकेराइड को आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (SEC) द्वारा आगे विभाजित किया गया और आणविक भार के क्रम में एकत्र किया गया। विभिन्न प्रीट्रीटमेंट से निकले शुगर मोनोमर्स और ऑलिगोमर्स का विश्लेषण शुगर कंपोजिशन एनालिसिस द्वारा किया गया। विभिन्न प्रीट्रीटमेंट विधियों द्वारा प्राप्त शुगर ऑलिगोमर्स की सामग्री की तुलना करते समय, जिद्दी ऑलिगोसेकेराइड की उपस्थिति बायोमास को मोनोसेकेराइड में बदलने में एक आम समस्या है और इससे शुगर की पैदावार में कम से कम 10-15% और यहाँ तक कि 18% तक की कमी हो सकती है। इस विधि का उपयोग ओलिगोसेकेराइड अंशों के आगे बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए किया जाता है। परिणामी ACH और विभिन्न आणविक भार वाले इसके बाद के अंशों का उपयोग इस कार्य में ओलिगोसेकेराइड के लक्षण वर्णन के लिए प्रयोगात्मक सामग्री के रूप में किया गया था।
प्रीट्रीटमेंट और एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस के बाद, लगातार ऑलिगोसेकेराइड अनहाइड्रोलाइज्ड रहे। यहाँ (A) एक ऑलिगोसेकेराइड पृथक्करण विधि है जिसमें ऑलिगोसेकेराइड को सक्रिय कार्बन और डायटोमेसियस अर्थ के पैक्ड बेड का उपयोग करके AFEX-प्रीट्रीटेड कॉर्न स्टोवर हाइड्रोलाइज़ेट (ACSH) से अलग किया जाता है; (B) ऑलिगोसेकेराइड को अलग करने की विधि। ऑलिगोसेकेराइड को आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (SEC) द्वारा आगे अलग किया गया; (C) विभिन्न प्रीट्रीटमेंट (पतला एसिड: DA, आयनिक तरल: IL और AFEX) से मुक्त किए गए सैकराइड मोनोमर्स और ऑलिगोमर्स। एंजाइमैटिक हाइड्रोलिसिस स्थितियां: 25% (w/w) की उच्च ठोस लोडिंग (लगभग 8% ग्लूकेन लोडिंग), 96 घंटे हाइड्रोलिसिस, 20 मिलीग्राम/जी वाणिज्यिक एंजाइम लोडिंग (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 अनुपात) और (D) AFEX पूर्व-उपचारित मकई स्टोवर (ACS) से जारी ग्लूकोज, ज़ाइलोज़ और अरबीनोज़ के शुगर मोनोमर्स और ओलिगोमर्स।
ग्लाइकेन विश्लेषण ठोस बायोमास अवशेषों से अलग किए गए अर्क में ग्लाइकेन के व्यापक संरचनात्मक विश्लेषण के लिए एक उपयोगी उपकरण साबित हुआ है। हालाँकि, इस पारंपरिक विधि41 का उपयोग करके पानी में घुलनशील सैकराइड्स का प्रतिनिधित्व कम किया जाता है क्योंकि कम आणविक भार वाले ओलिगोसेकेराइड्स को एलिसा प्लेटों पर स्थिर करना मुश्किल होता है और एंटीबॉडी जोड़ने से पहले उन्हें धोया जाता है। इसलिए, एंटीबॉडी बाइंडिंग और लक्षण वर्णन के लिए, एविडिन-लेपित एलिसा प्लेटों पर घुलनशील, गैर-अनुपालन वाले ओलिगोसेकेराइड्स को कोट करने के लिए एक-चरण बायोटिनाइलेशन विधि का उपयोग किया गया था। इस विधि का परीक्षण हमारे पहले से उत्पादित ACSH और उसके आणविक भार (या पोलीमराइजेशन की डिग्री, DP) के आधार पर एक अंश का उपयोग करके किया गया था। कार्बोहाइड्रेट के कम करने वाले सिरे पर बायोटिन-एलसी-हाइड्राजाइड जोड़कर ओलिगोसेकेराइड बाइंडिंग आत्मीयता को बढ़ाने के लिए एक-चरण बायोटिनाइलेशन का उपयोग किया गया था (चित्र 2)। घोल में, अपचयन करने वाले सिरे पर हेमीएसीटल समूह बायोटिन-एलसी-हाइड्राजाइड के हाइड्राजाइड समूह के साथ प्रतिक्रिया करके हाइड्राज़ोन बॉन्ड बनाता है। अपचयन एजेंट NaCNBH3 की उपस्थिति में, हाइड्राज़ोन बॉन्ड एक स्थिर बायोटिनलेटेड अंतिम उत्पाद में कम हो जाता है। शर्करा अपचयन करने वाले सिरे के संशोधन के साथ, कम DP ओलिगोसेकेराइड्स का ELISA प्लेटों से बंधन संभव हो गया, और हमारे अध्ययन में यह ग्लाइकेन-लक्षित mAbs का उपयोग करके एविडिन-लेपित प्लेटों पर किया गया था।
बायोटिनिलेटेड ऑलिगोसेकेराइड के लिए ELISA पर आधारित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की स्क्रीनिंग। यहाँ (A) ऑलिगोसेकेराइड के संयुक्त बायोटिनिलेशन और उसके बाद न्यूट्राविडिन लेपित प्लेटों पर ग्लाइकेन-लक्षित mAbs के साथ ELISA स्क्रीनिंग और (B) प्रतिक्रिया उत्पादों के बायोटिनिलेशन के लिए एक-चरणीय प्रक्रिया को दर्शाता है।
ऑलिगोसेकेराइड-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ एविडिन-लेपित प्लेटों को प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी में जोड़ा गया और प्रकाश- और समय-संवेदनशील माध्यम में धोया गया। एंटीबॉडी बाइंडिंग पूरी होने के बाद, प्लेट को इनक्यूबेट करने के लिए TMB सब्सट्रेट जोड़ें। अंत में सल्फ्यूरिक एसिड के साथ प्रतिक्रिया को रोक दिया गया। एंटीबॉडी-विशिष्ट क्रॉस-लिंकिंग का पता लगाने के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी की बाइंडिंग ताकत निर्धारित करने के लिए इनक्यूबेटेड प्लेटों का विश्लेषण ELISA रीडर का उपयोग करके किया गया। प्रयोग के विवरण और मापदंडों के लिए, संबंधित अनुभाग "सामग्री और विधियाँ" देखें।
हम ACSH में मौजूद घुलनशील ऑलिगोसेकेराइड्स के साथ-साथ लिग्नोसेल्यूलोसिक हाइड्रोलिसेट्स से अलग किए गए कच्चे और शुद्ध ऑलिगोसेकेराइड अंशों की विशेषता बताकर विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए इस नई विकसित विधि की उपयोगिता को प्रदर्शित करते हैं। जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है, बायोएसाइलेटेड ग्लाइकोम परख विधियों का उपयोग करके ACSH में पहचाने जाने वाले सबसे आम एपिटोप-प्रतिस्थापित ज़ाइलन आमतौर पर यूरोनिक (U) या मिथाइलुरोनिक (MeU) और पेक्टिक अरबिनोगैलेक्टान होते हैं। उनमें से अधिकांश गैर-हाइड्रोलाइज्ड सॉलिड्स (UHS)43 के ग्लाइकेन के विश्लेषण पर हमारे पिछले अध्ययन में भी पाए गए थे।
सेल वॉल ग्लाइकेन को निर्देशित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके पुनर्संयोजी ओलिगोसेकेराइड एपिटोप का पता लगाना। "तटस्थ" अंश ACN अंश है और "अम्लीय" अंश FA अंश है। हीटमैप पर चमकीले लाल रंग उच्च एपिटोप सामग्री को इंगित करते हैं, और चमकीले नीले रंग एक खाली पृष्ठभूमि को इंगित करते हैं। पैमाने पर रंग मान N = 2 के फॉर्मूलेशन के लिए कच्चे OD मानों पर आधारित हैं। एंटीबॉडी द्वारा पहचाने जाने वाले मुख्य एपिटोप दाईं ओर दिखाए गए हैं।
इन गैर-सेल्यूलोज संरचनाओं को परीक्षण किए गए वाणिज्यिक एंजाइम मिश्रण में सबसे आम सेल्यूलेज और हेमीसेल्यूलेज द्वारा विभाजित नहीं किया जा सका, जिसमें सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले वाणिज्यिक एंजाइम शामिल हैं। इसलिए, उनके हाइड्रोलिसिस के लिए नए सहायक एंजाइम की आवश्यकता होती है। आवश्यक गैर-सेल्यूलोज सहायक एंजाइमों के बिना, ये गैर-सेल्यूलोज बॉन्ड मोनोसैकेराइड में पूर्ण रूपांतरण को रोकते हैं, भले ही उनके मूल शर्करा पॉलिमर को बड़े पैमाने पर छोटे टुकड़ों में हाइड्रोलाइज किया गया हो और वाणिज्यिक एंजाइम मिश्रणों का उपयोग करके भंग किया गया हो।
सिग्नल वितरण और इसकी बंधन शक्ति के आगे के अध्ययन से पता चला कि उच्च DP शर्करा अंशों (A, B, C, DP 20+ तक) में बंधन एपिटोप कम DP अंशों (D, E, F, DP) की तुलना में डिमर्स में कम थे (चित्र 1)। एसिड के टुकड़े तटस्थ टुकड़ों की तुलना में गैर-सेल्यूलोज एपिटोप में अधिक आम हैं। ये घटनाएँ हमारे पिछले अध्ययन में देखे गए पैटर्न के अनुरूप हैं, जहाँ उच्च DP और एसिड के अंश एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस के प्रति अधिक प्रतिरोधी थे। इसलिए, गैर-सेल्यूलोज ग्लाइकेन एपिटोप और U और MeU प्रतिस्थापन की उपस्थिति ओलिगोसेकेराइड की स्थिरता में बहुत योगदान दे सकती है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कम DP ओलिगोसेकेराइड के लिए बंधन और पता लगाने की दक्षता समस्याग्रस्त हो सकती है इसका परीक्षण विभिन्न लम्बाई के वाणिज्यिक ओलिगोसेकेराइडों का उपयोग करके किया जा सकता है, जिनमें से प्रत्येक में केवल एक एपिटोप होता है जो एक विशिष्ट mAb से बंधता है।
इस प्रकार, संरचना-विशिष्ट एंटीबॉडी के उपयोग से कुछ प्रकार के अड़ियल बॉन्ड का पता चला। उपयोग किए गए एंटीबॉडी के प्रकार, उपयुक्त बंधन पैटर्न और इसके द्वारा उत्पादित सिग्नल की ताकत (सबसे अधिक और सबसे कम प्रचुर मात्रा में) के आधार पर, नए एंजाइमों की पहचान की जा सकती है और अधिक पूर्ण ग्लाइकोकनवर्जन के लिए एंजाइम मिश्रण में अर्ध-मात्रात्मक रूप से जोड़ा जा सकता है। ACSH ओलिगोसेकेराइड के विश्लेषण को एक उदाहरण के रूप में लेते हुए, हम प्रत्येक बायोमास सामग्री के लिए ग्लाइकेन बॉन्ड का एक डेटाबेस बना सकते हैं। यहाँ यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एंटीबॉडी की अलग-अलग आत्मीयता को ध्यान में रखा जाना चाहिए, और यदि उनकी आत्मीयता अज्ञात है, तो यह विभिन्न एंटीबॉडी के संकेतों की तुलना करते समय कुछ कठिनाइयाँ पैदा करेगा। इसके अलावा, एक ही एंटीबॉडी के लिए नमूनों के बीच ग्लाइकेन बॉन्ड की तुलना सबसे अच्छा काम कर सकती है। इन जिद्दी बॉन्ड को फिर CAZyme डेटाबेस से जोड़ा जा सकता है, जिससे हम एंजाइमों की पहचान कर सकते हैं, उम्मीदवार एंजाइमों का चयन कर सकते हैं और बॉन्ड-ब्रेकिंग एंजाइमों के लिए परीक्षण कर सकते हैं, या बायोरिफाइनरियों में उपयोग के लिए इन एंजाइमों को व्यक्त करने के लिए माइक्रोबियल सिस्टम विकसित कर सकते हैं44।
यह मूल्यांकन करने के लिए कि कैसे प्रतिरक्षात्मक तरीके लिग्नोसेल्यूलोसिक हाइड्रोलाइजेट्स में मौजूद कम आणविक भार वाले ओलिगोसेकेराइड्स की विशेषता के लिए वैकल्पिक तरीकों का पूरक हैं, हमने MALDI (चित्र 4, S1-S8) और उसी पैनल (चित्र 5) के ओलिगोसेकेराइड भाग पर GC-MS पर आधारित TMS-व्युत्पन्न सैकराइड्स का विश्लेषण किया। MALDI का उपयोग यह तुलना करने के लिए किया जाता है कि क्या ओलिगोसेकेराइड अणुओं का द्रव्यमान वितरण इच्छित संरचना से मेल खाता है। चित्र 4 में तटस्थ घटकों ACN-A और ACN-B का MS दिखाया गया है। ACN-A विश्लेषण ने DP 4–8 (चित्र 4) से लेकर DP 22 (चित्र S1) तक की पेंटोस शर्कराओं की एक श्रृंखला की पुष्टि की, चित्र S3 जैसे पूरक सामग्री में, FA-C अम्लीय अंश द्रव्यमान वितरण मानचित्र 8-15 की DP के साथ (Me)U प्रतिस्थापित पेंटोस शर्करा की एक सीमा दिखाते हैं जो ELISA-आधारित mAb स्क्रीनिंग में पाए गए प्रतिस्थापित ज़ाइलान के अनुरूप हैं। एपिटोप सुसंगत हैं।
ACS में मौजूद घुलनशील गैर-अनुपालक ओलिगोसेकेराइड्स का MALDI-MS स्पेक्ट्रम। यहाँ, (A) ACN-A कम वज़न श्रेणी के अंश जिसमें मिथाइलेटेड यूरोनिक एसिड (DP 4-8) प्रतिस्थापित ग्लूकोरोक्सिलन ओलिगोसेकेराइड्स होते हैं और (B) ACN-B ज़ाइलन और मिथाइलेटेड यूरोनिक एसिड ओलिगोसेकेराइड्स ग्लूकोरोक्सिलन (DP 8-15) से प्रतिस्थापित होते हैं।
दुर्दम्य ऑलिगोसेकेराइड के ग्लाइकेन अवशेषों की संरचना का विश्लेषण। यहाँ (A) GC-MS विश्लेषण का उपयोग करके प्राप्त विभिन्न ऑलिगोसेकेराइड अंशों की TMS सैकराइड संरचना। (B) ऑलिगोसेकेराइड में मौजूद विभिन्न TMS-व्युत्पन्न शर्कराओं की संरचनाएँ। ACN - तटस्थ ऑलिगोसेकेराइड युक्त एसिटोनाइट्राइल अंश और FA - एसिड ऑलिगोसेकेराइड युक्त फ़ेरुलिक एसिड अंश।
ओलिगोसेकेराइड अंश के LC-MS विश्लेषण से एक और दिलचस्प निष्कर्ष निकाला गया, जैसा कि चित्र S9 में दिखाया गया है (विधियाँ इलेक्ट्रॉनिक पूरक सामग्री में देखी जा सकती हैं)। ACN-B अंश के बंधन के दौरान हेक्सोज और -OAc समूहों के टुकड़े बार-बार देखे गए। यह खोज न केवल ग्लाइकोम और MALDI-TOF विश्लेषण में देखे गए विखंडन की पुष्टि करती है, बल्कि पूर्व-उपचारित लिग्नोसेल्यूलोसिक बायोमास में संभावित कार्बोहाइड्रेट व्युत्पन्नों के बारे में नई जानकारी भी प्रदान करती है।
हमने TMS ग्लाइकेन व्युत्पन्नकरण का उपयोग करके ऑलिगोसेकेराइड अंशों का ग्लाइकेन संरचना विश्लेषण भी किया। GC-MS का उपयोग करके, हमने ऑलिगोसेकेराइड अंश (चित्र 5) में न्यूरल (गैर-व्युत्पन्न) और अम्लीय शर्करा (GluA और GalA) की संरचना निर्धारित की। ग्लूकोरोनिक एसिड अम्लीय घटकों C और D में पाया जाता है, जबकि गैलेक्टुरोनिक एसिड अम्लीय घटकों A और B में पाया जाता है, जो दोनों अम्लीय शर्करा के उच्च DP घटक हैं। ये परिणाम न केवल हमारे ELISA और MALDI डेटा की पुष्टि करते हैं, बल्कि ऑलिगोसेकेराइड संचय के हमारे पिछले अध्ययनों के अनुरूप भी हैं। इसलिए, हमारा मानना ​​है कि ऑलिगोसेकेराइड के बायोटिनाइलेशन और उसके बाद ELISA स्क्रीनिंग का उपयोग करने वाली आधुनिक प्रतिरक्षात्मक विधियाँ विभिन्न जैविक नमूनों में घुलनशील पुनरावर्ती ऑलिगोसेकेराइड का पता लगाने के लिए पर्याप्त हैं।
चूंकि एलिसा-आधारित mAb स्क्रीनिंग विधियों को कई अलग-अलग तरीकों से मान्य किया गया है, इसलिए हम इस नई मात्रात्मक विधि की क्षमता का और पता लगाना चाहते थे। दो वाणिज्यिक ओलिगोसेकेराइड, ज़ाइलोहेक्सासैकेराइड ओलिगोसेकेराइड (XHE) और 23-α-L-अरबिनोफ्यूरानोसिल-ज़ाइलोट्रियोज़ (A2XX) खरीदे गए और सेल वॉल ग्लाइकेन को लक्षित करने वाले एक नए mAb दृष्टिकोण का उपयोग करके उनका परीक्षण किया गया। चित्र 6 बायोटिनाइलेटेड बाइंडिंग सिग्नल और ओलिगोसेकेराइड सांद्रता की लॉग सांद्रता के बीच एक रैखिक सहसंबंध दिखाता है, जो एक संभावित लैंगमुइर सोखना मॉडल का सुझाव देता है। एमएबी में, सीसीआरसी-एम137, सीसीआरसी-एम138, सीसीआरसी-एम147, सीसीआरसी-एम148, और सीसीआरसी-एम151 एक्सएचई के साथ सहसंबंधित हैं, और सीसीआरसी-एम108, सीसीआरसी-एम109, और एलएम11 1 एनएम से 100 नैनो की सीमा में ए2एक्सएक्स के साथ सहसंबंधित हैं। प्रयोग के दौरान एंटीबॉडी की सीमित उपलब्धता के कारण, प्रत्येक ओलिगोसेकेराइड सांद्रता के साथ सीमित प्रयोग किए गए थे। यहां यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कुछ एंटीबॉडी सब्सट्रेट के रूप में एक ही ओलिगोसेकेराइड पर बहुत अलग तरह से प्रतिक्रिया करते हैं, संभवतः क्योंकि वे थोड़े अलग एपिटोप से बंधते हैं और बहुत अलग बंधन संबंध रख सकते हैं। नए एमएबी दृष्टिकोण को वास्तविक नमूनों पर लागू करने पर सटीक एपिटोप पहचान के तंत्र और निहितार्थ बहुत अधिक जटिल होंगे।
विभिन्न ग्लाइकेन-लक्ष्यित mAbs की पहचान सीमा निर्धारित करने के लिए दो वाणिज्यिक ओलिगोसेकेराइड का उपयोग किया गया था। यहाँ, ओलिगोसेकेराइड सांद्रता के लॉग सांद्रता के साथ रैखिक सहसंबंध (A) mAb के साथ XHE और (B) mAb के साथ A2XX के लिए लैंगमुइर सोखना पैटर्न को इंगित करते हैं। संबंधित एपिटोप्स परख में सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किए जाने वाले वाणिज्यिक ओलिगोसेकेराइड की संरचनाओं को इंगित करते हैं।
ग्लाइकेन-लक्षित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (ग्लाइकोमिक विश्लेषण या एलिसा-आधारित mAb स्क्रीनिंग) का उपयोग पौधे के बायोमास को बनाने वाले अधिकांश प्रमुख सेल दीवार ग्लाइकेन के गहन लक्षण वर्णन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। हालाँकि, शास्त्रीय ग्लाइकेन विश्लेषण केवल बड़ी सेल दीवार ग्लाइकेन की विशेषता बताता है, क्योंकि अधिकांश ऑलिगोसेकेराइड्स को एलिसा प्लेटों पर कुशलतापूर्वक स्थिर नहीं किया जाता है। इस अध्ययन में, AFEX-पूर्व उपचारित मकई के स्टोवर को उच्च ठोस सामग्री पर एंजाइमेटिक रूप से हाइड्रोलाइज़ किया गया था। हाइड्रोलाइज़ेट में पुनर्संयोजी सेल दीवार कार्बोहाइड्रेट की संरचना निर्धारित करने के लिए शर्करा विश्लेषण का उपयोग किया गया था। हालाँकि, हाइड्रोलाइज़ेट में छोटे ऑलिगोसेकेराइड्स के mAb विश्लेषण को कम करके आंका जाता है, और एलिसा प्लेटों पर ऑलिगोसेकेराइड्स को प्रभावी रूप से स्थिर करने के लिए अतिरिक्त उपकरणों की आवश्यकता होती है।
हम यहाँ ऑलिगोसेकेराइड बायोटिनाइलेशन के संयोजन द्वारा एमएबी स्क्रीनिंग के लिए एक नवीन और कुशल ऑलिगोसेकेराइड स्थिरीकरण विधि की रिपोर्ट करते हैं, जिसके बाद न्यूट्राविडिन™ लेपित प्लेटों पर एलिसा स्क्रीनिंग की जाती है। स्थिर बायोटिनाइलेटेड ऑलिगोसेकेराइड ने एंटीबॉडी के लिए पर्याप्त आत्मीयता दिखाई, जिससे अड़ियल ऑलिगोसेकेराइड का तेजी से और कुशल पता लगाना संभव हो गया। मास स्पेक्ट्रोमेट्री पर आधारित इन जिद्दी ऑलिगोसेकेराइड की संरचना के विश्लेषण ने इम्यूनोस्क्रीनिंग के इस नए दृष्टिकोण के परिणामों की पुष्टि की। इस प्रकार, ये अध्ययन प्रदर्शित करते हैं कि ऑलिगोसेकेराइड बायोटिनाइलेशन और ग्लाइकेन-लक्षित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ एलिसा स्क्रीनिंग के संयोजन का उपयोग ऑलिगोसेकेराइड में क्रॉसलिंक का पता लगाने के लिए किया जा सकता है और ऑलिगोसेकेराइड की संरचना की विशेषता वाले अन्य जैव रासायनिक अध्ययनों में व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है।
यह बायोटिन-आधारित ग्लाइकन प्रोफाइलिंग विधि प्लांट बायोमास में घुलनशील ओलिगोसेकेराइड के अड़ियल कार्बोहाइड्रेट बॉन्ड की जांच करने में सक्षम पहली रिपोर्ट है। यह समझने में मदद करता है कि बायोफ्यूल उत्पादन की बात आने पर बायोमास के कुछ हिस्से इतने जिद्दी क्यों होते हैं। यह विधि ग्लाइकोम विश्लेषण विधियों में एक महत्वपूर्ण अंतर को भरती है और प्लांट ओलिगोसेकेराइड से परे सब्सट्रेट की एक विस्तृत श्रृंखला में इसके अनुप्रयोग का विस्तार करती है। भविष्य में, हम बायोटिनाइलेशन के लिए रोबोटिक्स का उपयोग कर सकते हैं और ELISA का उपयोग करके नमूनों के उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण के लिए हमने जो विधि विकसित की है उसका उपयोग कर सकते हैं।
पायनियर 33A14 हाइब्रिड बीजों से उगाए गए मकई के भूसे (सीएस) को 2010 में रे, कोलोराडो में क्रेमर फ़ार्म से काटा गया था। ज़मीन के मालिक की अनुमति से, इस बायोमास का इस्तेमाल शोध के लिए किया जा सकता है। नमूनों को कमरे के तापमान पर जिप-लॉक बैग में < 6% नमी पर रखा गया था। नमूनों को कमरे के तापमान पर जिप-लॉक बैग में < 6% नमी पर रखा गया था। Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. नमूनों को कमरे के तापमान पर जिपर वाले बैग में <6% आर्द्रता पर सूखा रखा गया था।样品在室温下以干燥<6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной तापमान वृद्धि <6%। नमूनों को कमरे के तापमान पर 6% से कम आर्द्रता पर जिपर बैग में रखा जाता है।अध्ययन में स्थानीय और राष्ट्रीय दिशा-निर्देशों का अनुपालन किया गया। NREL प्रोटोकॉल का उपयोग करके संरचना विश्लेषण किया गया। संरचना में 31.4% ग्लूकेन, 18.7% ज़ाइलन, 3.3% अरेबिनन, 1.2% गैलेक्टन, 2.2% एसिटाइल, 14.3% लिग्निन, 1.7% प्रोटीन और 13. 4% राख पाई गई।
सेलिक® CTec2 (138 mg प्रोटीन/ml, लॉट VCNI 0001) नोवोजाइम्स (फ्रैंकलिनटन, NC, USA) से सेल्युलेस, β-ग्लूकोसिडेस और सेलिक® HTec2 (157 mg प्रोटीन/ml, लॉट VHN00001) का एक जटिल मिश्रण है। मल्टीफ़ेक्ट पेक्टिनेज® (72 mg प्रोटीन/mL), पेक्टिन डिग्रेडिंग एंजाइमों का एक जटिल मिश्रण, ड्यूपॉन्ट इंडस्ट्रियल बायोसाइंसेस (पालो ऑल्टो, CA, USA) द्वारा दान किया गया था। एंजाइम प्रोटीन सांद्रता को प्रोटीन सामग्री का अनुमान लगाकर (और गैर-प्रोटीन नाइट्रोजन के योगदान को घटाकर) केजेल्डाहल नाइट्रोजन विश्लेषण (AOAC विधि 2001.11, डेयरी वन कोऑपरेटिव इंक., इथाका, NY, USA) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। डायटोमेसियस अर्थ 545 को EMD मिलिपोर (बिलरिका, MA) से खरीदा गया था। सक्रिय कार्बन (DARCO, 100 मेश ग्रैन्यूल्स), एविसेल (PH-101), बीच ज़ाइलान और अन्य सभी रसायन सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुईस, MO) से खरीदे गए थे।
AFEX प्रीट्रीटमेंट GLBRC (बायोमास कन्वर्जन रिसर्च लेबोरेटरी, MSU, लैंसिंग, MI, USA) में किया गया। प्री-ट्रीटमेंट 140° C पर 15 मिनट के लिए किया गया। 46 रेजिडेंस टाइम 1:1 अनुपात में निर्जल अमोनिया और बायोमास को 60% (w/w) लोडिंग पर स्टेनलेस स्टील बेंचटॉप बैच रिएक्टर (पार्र इंस्ट्रूमेंट्स कंपनी) में लोड किया गया। इसमें 30 मिनट लगे। रिएक्टर को 140°C पर लाया गया और अमोनिया को तेजी से छोड़ा गया, जिससे बायोमास जल्दी से कमरे के तापमान पर वापस आ गया। AFEX प्री-ट्रीटेड कॉर्न स्टोवर (ACS) की संरचना अनुपचारित कॉर्न स्टोवर (UT-CS) के समान थी।
उच्च ठोस ACSH 25% (w/w) (लगभग 8% डेक्सट्रान लोडिंग) को ऑलिगोसेकेराइड के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक प्रारंभिक सामग्री के रूप में तैयार किया गया था। ACS का एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस एक वाणिज्यिक एंजाइम मिश्रण का उपयोग करके किया गया था जिसमें सेलिक® सीटीईसी2 10 मिलीग्राम प्रोटीन/जी ग्लूकेन (प्रीट्रीटेड बायोमास में), एचटेक2 (नोवोजाइम्स, फ्रैंकलिन्टन, एनसी), 5 मिलीग्राम प्रोटीन/जी ग्लूकेन और मल्टीफेक्ट पेक्टिनेज (जेनेनकोर इंक, यूएसए) शामिल थे। ), 5 मिलीग्राम प्रोटीन/जी डेक्सट्रान। 3 लीटर, पीएच 4.8, 50 डिग्री सेल्सियस और 250 आरपीएम की कार्यशील मात्रा वाले 5-लीटर बायोरिएक्टर में एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस किया गया था। 96 घंटों तक हाइड्रोलिसिस के बाद, हाइड्रोलाइज़ेट को 6000 आरपीएम पर 30 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एकत्र किया गया और फिर 14000 आरपीएम पर 30 मिनट के लिए अनहाइड्रोलाइज्ड ठोस पदार्थों को हटाने के लिए एकत्र किया गया। फिर हाइड्रोलाइज़ेट को 0.22 मिमी फ़िल्टर बीकर के माध्यम से बाँझ फ़िल्टरेशन के अधीन किया गया। फ़िल्टर किए गए हाइड्रोलाइज़ेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ बोतलों में संग्रहीत किया गया और फिर कार्बन पर विभाजित किया गया।
एनआरईएल प्रयोगशाला विश्लेषण प्रक्रियाओं के अनुसार अर्क-आधारित बायोमास नमूनों की संरचना का विश्लेषण: संरचना विश्लेषण के लिए नमूनों की तैयारी (एनआरईएल/टीपी-510-42620) और बायोमास में संरचनात्मक कार्बोहाइड्रेट और लिग्निन का निर्धारण (एनआरईएल/टीपी-510 - 42618)47.
हाइड्रोलाइज़ेट स्ट्रीम का ओलिगोसेकेराइड विश्लेषण ऑटोक्लेव-आधारित एसिड हाइड्रोलिसिस विधि का उपयोग करके 2 मिली स्केल पर किया गया था। हाइड्रोलाइज़ेट नमूने को 10 मिली स्क्रू कैप कल्चर ट्यूब में 72% सल्फ्यूरिक एसिड के 69.7 µl के साथ मिलाएं और 121 °C पर एक बेंचटॉप पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, बर्फ पर ठंडा करें और एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) शीशी में फ़िल्टर करें। एसिड-हाइड्रोलाइज्ड नमूने में कुल चीनी सांद्रता से गैर-हाइड्रोलाइज्ड नमूने में मोनोसैकेराइड की सांद्रता घटाकर ओलिगोसेकेराइड की सांद्रता निर्धारित की गई थी।
एसिड हाइड्रोलाइज्ड बायोमास में ग्लूकोज, ज़ाइलोज़ और अरबीनोज़ सांद्रता का विश्लेषण बायो-रेड एमिनेक्स एचपीएक्स-87एच कॉलम पर ऑटोसैम्पलर, कॉलम हीटर, आइसोक्रेटिक पंप और अपवर्तक सूचकांक डिटेक्टर से सुसज्जित शिमादज़ू एचपीएलसी सिस्टम का उपयोग करके किया गया था। कॉलम को 50 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था और पानी में 0.6 मिली/मिनट 5 एमएम H2SO4 के साथ निक्षालित किया गया था।
हाइड्रोलाइज़ेट सुपरनैटेंट को पतला किया गया और मोनोमर और ओलिगोसेकेराइड सामग्री के लिए विश्लेषण किया गया। एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस के बाद प्राप्त मोनोमेरिक शर्करा का विश्लेषण HPLC द्वारा किया गया, जो बायो-रेड (हरक्यूलिस, CA) एमिनेक्स HPX-87P कॉलम और एक ऐश गार्ड कॉलम से सुसज्जित था। कॉलम का तापमान 80°C पर बनाए रखा गया था, पानी को 0.6 मिली/मिनट की प्रवाह दर के साथ मोबाइल चरण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। संदर्भ 41, 48, 49 में वर्णित विधियों के अनुसार 121°C पर तनु अम्ल में हाइड्रोलिसिस द्वारा ओलिगोसेकेराइड निर्धारित किए गए थे।
पहले से वर्णित प्रक्रियाओं 27, 43, 50, 51 का उपयोग करके कच्चे, AFEX पूर्व-उपचारित और सभी गैर-हाइड्रोलाइज्ड बायोमास अवशेषों (सीरियल सेल दीवार के अर्क के उत्पादन और उनकी mAb स्क्रीनिंग सहित) पर सैकराइड विश्लेषण किया गया था। ग्लाइकोम विश्लेषण के लिए, पौधे की कोशिका भित्ति सामग्री के अल्कोहल-अघुलनशील अवशेषों को बायोमास अवशेषों से तैयार किया जाता है और अमोनियम ऑक्सालेट (50 mM), सोडियम कार्बोनेट (50 mM और 0.5% w/v), CON जैसे तेजी से आक्रामक अभिकर्मकों के साथ सीरियल निष्कर्षण के अधीन किया जाता है। (1M और 4M, दोनों 1% w/v सोडियम बोरोहाइड्राइड के साथ) और एसिड क्लोराइट जैसा कि पहले वर्णित है 52,53। अर्क को तब सेल दीवार ग्लाइकेन के लिए निर्देशित mAb50s के एक जटिल पैनल के खिलाफ ELISA के अधीन किया गया था, पादप कोशिका भित्ति ग्लाइकेन को लक्ष्य करने वाले mAbs को प्रयोगशाला स्टॉक (CCRC, JIM और MAC श्रृंखला) से खरीदा गया था।
ऑलिगोसेकेराइड का एक-चरण बायोटिनिलीकरण। बायोटिन-एलसी-हाइड्राजाइड के साथ कार्बोहाइड्रेट का संयुग्मन निम्नलिखित प्रक्रिया का उपयोग करके किया गया था। बायोटिन-एलसी-हाइड्राजाइड (4.6 मिलीग्राम/12 μmol) को डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (DMSO, 70 μl) में जोरदार सरगर्मी और 65 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए गर्म करके घोला गया था। ग्लेशियल एसिटिक एसिड (30 µl) मिलाया गया और मिश्रण को सोडियम साइनोबोरोहाइड्राइड (6.4 मिलीग्राम/100 µmol) पर डाला गया और लगभग 1 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करने के बाद पूरी तरह से घुल गया। फिर, प्रतिक्रिया मिश्रण के 5 से 8 μl को सूखे ऑलिगोसेकेराइड (1-100 nmol) में मिलाया गया ताकि कम करने वाले सिरे पर लेबल का 10 गुना या उससे अधिक मोलर अधिशेष प्राप्त हो सके। प्रतिक्रिया 2 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर की गई, जिसके बाद नमूनों को तुरंत शुद्ध किया गया। बिना किसी कमी के लेबलिंग प्रयोगों में कोई सोडियम साइनोबोरोहाइड्राइड का उपयोग नहीं किया गया था, और नमूनों को 2.5 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया दी गई थी।
बायोटिनिलेटेड ऑलिगोसेकेराइड के नमूनों की एलिसा कोटिंग और धुलाई। बायोटिनिलेटेड नमूनों के 25 μl (प्रत्येक सांद्रित नमूने के 100 μl को 0.1 M ट्रिस बफर सॉल्यूशन (TBS) के 5 ml में पतला किया गया) को एविडिन-लेपित प्लेट के प्रत्येक वेल में मिलाया गया। नियंत्रण कुओं को 0.1 M TBS में 10 μg/ml की सांद्रता पर 50 μl बायोटिन के साथ लेपित किया गया था। खाली माप के लिए कोटिंग के रूप में विआयनीकृत पानी का उपयोग किया गया था। टैबलेट को अंधेरे में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था। ग्रेनियर फ्लैट 3A के लिए प्रोग्राम नंबर 11 का उपयोग करके 0.1 M TBS में 0.1% स्किम्ड मिल्क से प्लेट को 3 बार धोएं।
प्राथमिक एंटीबॉडी का जोड़ और धुलाई। प्रत्येक वेल में 40 µl प्राथमिक एंटीबॉडी डालें। माइक्रोप्लेट को अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। फिर प्लेटों को ग्रेनियर फ़्लैट 3A के लिए वॉश प्रोग्राम #11 का उपयोग करके 0.1M TBS में 0.1% दूध के साथ 3 बार धोया गया।
सेकेंडरी एंटीबॉडी डालें और धोएँ। प्रत्येक वेल में 50 µl माउस/चूहा सेकेंडरी एंटीबॉडी (0.1 M TBS में 0.1% दूध में 1:5000 पतला) डालें। माइक्रोप्लेट को अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। फिर माइक्रोप्लेट्स को ग्रेनियर फ़्लैट 5A प्लेट वॉश प्रोग्राम #12 का उपयोग करके 0.1 M TBS में 0.1% दूध से 5 बार धोया गया।
सब्सट्रेट जोड़ना। बेस सब्सट्रेट में 3,3′,5,5′-टेट्रामेथिलबेन्ज़िडीन (TMB) के 50 µl डालें (बफ़र की 2 बूँदें, TMB की 3 बूँदें, हाइड्रोजन पेरोक्साइड की 2 बूँदें 15 ml डीआयनाइज़्ड पानी में डालकर)। TMB सब्सट्रेट तैयार करें। और उपयोग से पहले भंवर करें)। माइक्रोप्लेट को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। अंधेरे में।
चरण पूरा करें और टैब्लेट पढ़ें। प्रत्येक वेल में 1 N सल्फ्यूरिक एसिड के 50 µl डालें और ELISA रीडर का उपयोग करके 450 से 655 nm तक अवशोषण रिकॉर्ड करें।
विआयनीकृत जल में इन विश्लेषकों के 1 मिलीग्राम/एमएल घोल तैयार करें: अरबीनोज, रैमनोज, फ्यूकोज, ज़ाइलोज़, गैलेक्टुरोनिक एसिड (GalA), ग्लूकोरोनिक एसिड (GlcA), मैनोज़, ग्लूकोज, गैलेक्टोज़, लैक्टोज़, एन-एसिटाइलमैनोसामाइन (manNAc), एन-एसिटाइलग्लुकोसामिन (glcNAc), एन-एसिटाइलगैलेक्टोसामाइन (galNAc), इनोसिटोल (आंतरिक मानक)। तालिका 1 में दिखाए गए 1 मिलीग्राम/एमएल चीनी घोल को मिलाकर दो मानक तैयार किए गए। नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर जमाया जाता है और तब तक लाइओफ़िलाइज़ किया जाता है जब तक कि सारा पानी निकल न जाए (आमतौर पर लगभग 12-18 घंटे)।
विश्लेषणात्मक संतुलन पर स्क्रू कैप ट्यूब में 100-500 µg नमूना डालें। मिलाई गई मात्रा को रिकॉर्ड करें। नमूने को विलायक की एक विशिष्ट सांद्रता में घोलना और इसे तरल अंश के रूप में ट्यूब में जोड़ना सबसे अच्छा है। प्रत्येक नमूना ट्यूब के लिए आंतरिक मानक के रूप में 1 मिलीग्राम/एमएल इनोसिटोल के 20 µl का उपयोग करें। नमूने में मिलाए गए आंतरिक मानक की मात्रा मानक ट्यूब में मिलाए गए आंतरिक मानक की मात्रा के समान होनी चाहिए।
स्क्रू कैप वाली शीशी में 8 मिली निर्जल मेथनॉल डालें। फिर 3 एन. मेथेनॉलिक एचसीएल घोल के 4 मिली डालें, ढक्कन बंद करके हिलाएं। इस प्रक्रिया में पानी का उपयोग नहीं होता है।
ऑलिगोसेकेराइड नमूनों और मानक TMS ट्यूबों में 1 M HCl मेथनॉल घोल के 500 µl डालें। नमूनों को थर्मल ब्लॉक में 80° C पर रात भर (168 घंटे) इनक्यूबेट किया गया। एक सुखाने वाले मैनिफोल्ड का उपयोग करके कमरे के तापमान पर मेथनॉलिस उत्पाद को सुखाएं। 200 µl MeOH डालें और फिर से सुखाएं। यह प्रक्रिया दो बार दोहराई जाती है। नमूने में 200 µl मेथनॉल, 100 µl पाइरिडीन और 100 µl एसिटिक एनहाइड्राइड डालें और अच्छी तरह मिलाएँ। नमूनों को कमरे के तापमान पर 30 मिनट तक इनक्यूबेट करें और सुखाएँ। 200 µl मेथनॉल डालें और फिर से सुखाएँ।
200 µl ट्राई-सिल डालें और 20 मिनट के लिए ट्यूब को गर्म करें। 80°C, फिर कमरे के तापमान पर ठंडा करें। नमूने को लगभग 50 µl की मात्रा तक सुखाने के लिए एक सुखाने वाले मैनिफोल्ड का उपयोग करें। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि हमने नमूनों को पूरी तरह से सूखने नहीं दिया।
2 मिली हेक्सेन डालें और भंवर द्वारा अच्छी तरह मिलाएँ। 5-3/4 इंच व्यास वाले पिपेट के ऊपर कांच की ऊन डालकर पाश्चर पिपेट (5-8 मिमी) की नोक को कांच की ऊन के टुकड़े से भरें। नमूनों को 2 मिनट के लिए 3000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। किसी भी अघुलनशील अवशेष को अवक्षेपित किया जाता है। नमूने को 100-150 µl तक सुखाएँ। लगभग 1 μl की मात्रा को 80 °C के प्रारंभिक तापमान और 2.0 मिनट के प्रारंभिक समय पर GC-MS में इंजेक्ट किया गया (तालिका 2)।