Hvala što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili isključite način rada kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali stalnu podršku, prikazat ćemo web mjesto bez stilova i JavaScripta.
Morfogeneza ljudskog crijeva uspostavlja značajke kripte-resice 3D epitelne mikroarhitekture i prostorne organizacije. Ova jedinstvena struktura potrebna je za održavanje homeostaze crijeva zaštitom niše matičnih stanica u bazalnoj kripti od egzogenih mikrobnih antigena i njihovih metabolita. Osim toga, crijevne resice i izlučujuća sluz predstavljaju funkcionalno diferencirane epitelne stanice sa zaštitnom barijerom na površini crijevne sluznice. Stoga je rekreacija 3D epitelnih struktura presudna za konstrukciju in vitro modela crijeva. Posebno, organski mimetički gut-on-a-chip može inducirati spontanu 3D morfogenezu crijevnog epitela s poboljšanim fiziološkim funkcijama i biomehanikom. Ovdje pružamo reproducibilni protokol za robusnu indukciju crijevne morfogeneze u gu t na mikrofluidnom čipu kao iu Transwell ugrađenom hibridnom čipu. Opisujemo detaljne metode za izradu uređaja, uzgoj Caco-2 ili intestinalnih organoidnih epitelnih stanica u konvencionalnim postavkama kao i na mikrofluidnoj platformi, indukciju 3D morfogeneze i karakterizaciju uspostavljenog 3D epitela korištenjem višestrukih modaliteta snimanja. Ovaj protokol postiže regeneraciju funkcionalnih crijeva mikroarhitekturu kontroliranjem bazolateralnog protoka tekućine tijekom 5 dana. Naša metoda morfogeneze in vitro koristi fiziološki relevantan smični stres i mehaničko gibanje i ne zahtijeva složeni stanični inženjering ili manipulaciju, što bi moglo nadmašiti druge postojeće tehnike. Predviđamo da bi naš predloženi protokol mogao imati široke implikacije za biomedicinsku istraživačku zajednicu, pružajući metodu za regeneraciju 3D slojeva intestinalnog epitela in vitro za biomedicinske, kliničke i farmaceutske primjene.
Eksperimenti pokazuju da crijevne epitelne Caco-2 stanice uzgojene u gut-on-a-chip1,2,3,4,5 ili dvoslojnim mikrofluidnim uređajima6,7 mogu biti podvrgnute spontanoj 3D morfogenezi in vitro bez jasnog razumijevanja temeljnog mehanizma. U našoj nedavnoj studiji otkrili smo da je uklanjanje bazolateralno izlučenih antagonista morfogena iz uređaja za kulturu potrebno i dovoljno za induciranje 3D epitelne smrti fogeneza in vitro, što je dokazano Caco-2 i intestinalnim organoidima dobivenim od pacijenata.Epitelne stanice su potvrđene. U ovoj smo se studiji posebno usredotočili na staničnu proizvodnju i distribuciju koncentracije snažnog Wnt antagonista, Dickkopf-1 (DKK-1), u gut-on-a-chip i modificiranim mikrofluidnim uređajima koji sadrže Transwell umetke, nazvane "Hibridni čip". Demonstriramo da je dodatak egzogenih Wnt antagonista (kao što je DKK-1, Wnt represor 1, izlučen mršav protein 1, ili Soggy-1) u crijevima na čipu inhibira morfogenezu ili remeti prestrukturirani 3D epitelni sloj, sugerirajući da je antagonistički stres tijekom kulture odgovoran za intestinalnu morfogenezu in vitro. Stoga je praktičan pristup postizanju snažne morfogeneze na epitelnom sučelju uklanjanje ili minimalno održavanje razina Wnt antagonista u bazolateralnom dijelu ment aktivnim ispiranjem (npr. u gut-on-a-chip ili hibridnim-on-a-chip platformama) ili difuzijom .Bazolateralni medij (npr. iz Transwellovih umetaka u velike bazolateralne rezervoare u bušotinama).
U ovom protokolu pružamo detaljnu metodu za izradu mikrouređaja crijeva na čipu i hibridnih čipova koji se mogu umetnuti Transwell (koraci 1-5) za uzgoj crijevnih epitelnih stanica na poroznim membranama na bazi polidimetilsiloksana (PDMS) (koraci 6A, 7A, 8, 9) ili poliesterskim membranama Transwell umetaka (koraci 6B, 7B, 8, 9) i induciranu 3D morfogenezu in vitro (korak 10). Također smo identificirali stanične i molekularne značajke indikativne za histogenezu specifičnu za tkivo i staničnu diferencijaciju ovisnu o liniji primjenom višestrukih modaliteta snimanja (koraci 11-24). Induciramo morfogenezu pomoću ljudskih crijevnih epitelnih stanica, kao što su Caco-2 ili crijevni organoidi, u dva formata kulture s tehničkim detaljima uključujući površinske modifikacije in vitro. Da bismo inducirali 3D morfogenezu iz 2D epitelnih monoslojeva, uklonili smo antagoniste morfogena u oba kultivirana oblika protokom medija u bazolateralni odjeljak kulture. Konačno, pružamo prikaz korisnosti 3D epitela koji se može regenerirati telijskog sloja koji se može koristiti za modeliranje epitelnog rasta ovisnog o morfogenu, uzdužnih kokultura domaćina i mikrobioma, infekcije patogenom, upalne ozljede, disfunkcije epitelne barijere i terapija koje se temelje na probioticima Primjer utjecaja.
Naš protokol može biti koristan širokom rasponu znanstvenika u osnovnim (npr. biologija crijevne sluznice, biologija matičnih stanica i razvojna biologija) i primijenjenim istraživanjima (npr. pretkliničko testiranje lijekova, modeliranje bolesti, inženjerstvo tkiva i gastroenterologija) širokog utjecaja. Zbog ponovljivosti i robusnosti našeg protokola za induciranje 3D morfogeneze crijevnog epitela in vitro, predviđamo da će naš tehnička strategija može se širiti publici koja proučava dinamiku stanične signalizacije tijekom intestinalnog razvoja, regeneracije ili homeostaze. Osim toga, naš je protokol koristan za ispitivanje infekcije pod različitim infektivnim uzročnicima kao što su Norovirus 8, Teški akutni respiratorni sindrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 ili Vibrio cholerae.Slušanja patologije i patogeneze bolesti također su korisna. Korištenje mikrofiziološkog sustava crijeva na čipu može omogućiti uzdužnu kokulturu 10 i naknadnu procjenu obrane domaćina, imunoloških odgovora i popravka ozljeda povezanih s patogenima u gastrointestinalnom (GI) traktu 11. Drugi GI poremećaji povezani sa sindromom propusnih crijeva, celijakijom, Crohnovom bolešću, ulceroznim kolitisom, pouchitisom ili sindrom iritabilnog crijeva može se simulirati kada se 3D slojevi intestinalnog epitela pripreme pomoću pacijentovih 3D slojeva intestinalnog epitela, te bolesti uključuju atrofiju resica, skraćivanje kripte, oštećenje sluznice ili oslabljenu epitelnu barijeru. Biopsija ili crijevni organoidi izvedeni iz matičnih stanica12,13. Kako bi bolje modelirali veću složenost okruženja bolesti, čitatelji može razmotriti dodavanje tipova stanica relevantnih za bolest, kao što su mononuklearne stanice periferne krvi pacijenta (PBMC), u modele koji sadrže 3D mikroarhitekture crijevnih resica-kripti.tkivno specifične imunološke stanice, 5.
Budući da se 3D epitelna mikrostruktura može fiksirati i vizualizirati bez procesa rezanja, gledatelje koji rade na prostornoj transkriptomici i slikama visoke ili super-rezolucije moglo bi zanimati naše mapiranje prostorno-vremenske dinamike gena i proteina na epitelnim nišama.Zanima me tehnologija. Odgovor na mikrobne ili imunološke podražaje. Nadalje, longitudinalni preslušavanje domaćina i mikrobioma 10, 14 koji koordinira homeostazu crijeva može se uspostaviti u 3D sloju crijevne sluznice zajedničkim uzgojem različitih mikrobnih vrsta, mikrobnih zajednica ili fekalne mikrobiote, posebno u crijevima na čipu.u platformi. Ovaj je pristup osobito privlačan publici koja proučava imunologiju sluznice, gastroenterologiju, ljudski mikrobiom, kulturomiku i kliničku mikrobiologiju koja želi kultivirati prethodno nekultiviranu crijevnu mikrobiotu u laboratoriju. Ako se naš protokol morfogeneze in vitro može prilagoditi skalabilnim formatima kulture, kao što su umetci s više jažica u ploče s 24, 96 ili 384 jažice koji kontinuirano nadopunjuju baso lateralnim odjeljcima, protokol se također može distribuirati onima koji razvijaju farmaceutske, biomedicinske ili visokoučinkovite platforme za skrining ili validaciju za prehrambenu industriju. Kao dokaz principa, nedavno smo demonstrirali izvedivost multipleksnog sustava morfogeneze visoke propusnosti skalabilnog na format ploče s 24 jažice. Osim toga, višestruki proizvodi organa na čipu komercijalizirani su16,17,18. ali, validacija naše in vitro metode morfogeneze može se ubrzati i potencijalno usvojiti u mnogim istraživačkim laboratorijima, industriji ili vladinim i regulatornim agencijama kako bi se razumjelo stanično reprogramiranje in vitro morfogeneze crijeva na transkriptomskoj razini za testiranje lijekova ili bioterapeutika. Apsorpcija i transport kandidata za lijek procijenjeni su korištenjem 3D surogata crijeva ili korištenjem prilagođenih ili komercijalnih modela organa na čipu za procjenu ponovljivosti proces morfogeneze crijeva.
Ograničen broj eksperimentalnih modela koji su relevantni za ljude korišten je za proučavanje morfogeneze crijevnog epitela, uglavnom zbog nedostatka provedivih protokola za induciranje 3D morfogeneze in vitro. Zapravo, velik dio trenutnog znanja o morfogenezi crijeva temelji se na studijama na životinjama (npr. ribe zebre20, miševi21 ili kokoši22). Međutim, one su radno i skupo intenzivne, mogu se etički upitni, i što je najvažnije, ne određuju precizno ljudske razvojne procese. Ovi modeli također su vrlo ograničeni u svojoj sposobnosti testiranja na višesmjerni skalabilni način. Stoga, naš protokol za regeneraciju 3D struktura tkiva in vitro nadmašuje in vivo životinjske modele kao i druge tradicionalne statične 2D modele stanične kulture. Kao što je prethodno opisano, korištenje 3D epitelnih struktura omogućilo nam je ispitivanje prostornih lokalizacija diferenciranih stanica u osovini kripta-vilus kao odgovor na različite mukozne ili imunološke podražaje. 3D epitelni slojevi mogu pružiti prostor za proučavanje kako se mikrobne stanice natječu u formiranju prostornih niša i ekološke evolucije kao odgovor na čimbenike domaćina (npr. unutarnji naspram vanjskih slojeva sluzi, izlučivanje IgA i antimikrobnih peptida). Nadalje, 3D epitelna morfologija može nam omogućiti da razumijemo kako crijevna mikrobiota strukturira svoje zajednice i sinergijski proizvodi mikrobne metabolite (npr. kratkolančane masne kiseline) koji oblikuju staničnu organizaciju i niše matičnih stanica u bazalnim kriptama. Ove značajke mogu se dokazati samo kada se 3D epitelni slojevi uspostave in vitro.
Uz našu metodu stvaranja 3D intestinalnih epitelnih struktura, postoji nekoliko in vitro metoda. Intestinalna organoidna kultura najsuvremenija je tehnika tkivnog inženjeringa koja se temelji na uzgoju crijevnih matičnih stanica u specifičnim morfogenim uvjetima23,24,25. Međutim, upotreba 3D organoidnih modela za transportnu analizu ili kokulture domaćina i mikrobioma često je izazovna jer je crijevni lumen zatvoren unutar organoida i stoga je uvođenje luminalnih komponenti kao što su mikrobne stanice ili egzogeni antigeni ograničeno.Pristup organoidnim lumenima može se poboljšati pomoću mikroinjektora,26,27 ali ova je metoda invazivna i radno intenzivna te zahtijeva specijalizirano znanje za izvođenje. Nadalje, tradicionalne organoidne kulture održavane u hidrogelnim skelama u statičkim uvjetima ne odražavaju točno aktivnu in vivo biomehaniku.
Drugi pristupi koje koristi nekoliko istraživačkih grupa koriste prestrukturirane 3D hidrogelne skele za oponašanje epitelne strukture crijeva uzgojem izoliranih ljudskih crijevnih stanica na površini gela. Izradite hidrogelne skele koristeći 3D ispisane, mikromljevene ili litografski proizvedene kalupe. Ova metoda pokazuje samoorganizirani raspored izoliranih epitelnih stanica in vitro s fiziološki relevantnim gradijentima morfogena , uspostavljajući epitelnu strukturu visokog omjera i preslušavanje strome i epitela uključivanjem stromalnih stanica u skelu. Međutim, priroda prestrukturiranih skela može spriječiti prikaz samog spontanog morfogenetskog procesa. Ovi modeli također ne pružaju dinamički luminalni ili intersticijski protok, nedostajući smični stres tekućine koji je crijevnim stanicama potreban da prođu kroz morfogenezu i dobiju fiziološku funkciju. Druga nedavna studija koristila je hidrogelne skele u mikrofluidnoj platformi i uzorkovane intestinalne epitelne strukture korištenjem tehnika laserskog jetkanja. Mišji intestinalni organoidi slijede ugravirane uzorke kako bi formirali crijevne cjevaste strukture, a intraluminalni protok tekućine može se rekapitulirati pomoću mikrofluidnog modula. Međutim, ovaj model ne pokazuje spontane morfogenetske procese niti uključuje crijevne mehanobiološke pokrete Tehnike .3D ispisa iz iste grupe uspjele su stvoriti minijaturne crijevne cijevi sa spontanim morfogenetskim procesima. Unatoč složenoj izradi različitih crijevnih segmenata unutar cijevi, ovom modelu također nedostaje luminalni protok tekućine i mehanička deformacija. Osim toga, operativnost modela može biti ograničena, posebno nakon završetka procesa bioprintanja, uznemirujući eksperimentalne uvjete ili međustaničke interakcije. Umjesto toga, naš predloženi protokol pruža spontani crijevni morfogen esis, fiziološki relevantan smični stres, biomehanika koja oponaša motilitet crijeva, dostupnost neovisnih apikalnih i bazolateralnih odjeljaka i ponovno stvaranje složenih bioloških mikrookoliša modularnosti. Stoga, naš in vitro 3D protokol morfogeneze može pružiti komplementarni pristup za prevladavanje izazova postojećih metoda.
Naš je protokol u potpunosti usmjeren na 3D epitelnu morfogenezu, sa samo epitelnim stanicama u kulturi i bez drugih vrsta okolnih stanica kao što su mezenhimalne stanice, endotelne stanice i imunološke stanice. Kao što je prethodno opisano, jezgra našeg protokola je indukcija epitelne morfogeneze uklanjanjem inhibitora morfogena izlučenih na bazolateralnoj strani uvedenog medija. Dok robusna modularnost naš gut-on-a-chip i hibrid-on-a-chip omogućuje nam ponovno stvaranje valovitog 3D epitelnog sloja, dodatne biološke složenosti kao što su epitelno-mezenhimalne interakcije33,34, taloženje izvanstaničnog matriksa (ECM) 35 i, u našem modelu, značajke kripta-vilusa koje prenose niše matičnih stanica u bazalnim kriptama i dalje treba razmotriti. Stromalne stanice (npr. fibro blasti) u mezenhimu igraju ključnu ulogu u proizvodnji ECM proteina i regulaciji intestinalne morfogeneze in vivo35,37,38. Dodatak mezenhimalnih stanica našem modelu poboljšao je morfogenetski proces i učinkovitost pričvršćivanja stanica. Endotelni sloj (tj. kapilare ili limfatici) igra važnu ulogu u regulaciji molekularnog transporta39 i regrutiranju imunoloških stanica40 u crijevima mikrookruženje. Nadalje, vaskulaturne komponente koje se mogu povezati između modela tkiva preduvjet su kada su modeli tkiva dizajnirani da demonstriraju interakcije više organa. Stoga će možda biti potrebno uključiti endotelne stanice za modeliranje točnijih fizioloških značajki s rezolucijom na razini organa. Imunosne stanice dobivene od pacijenata također su bitne za prikaz urođenih imunoloških odgovora, prezentacije antigena, urođenog adaptivnog imunološkog preslušavanja i tkivno-specifičnog preslušavanja c imunitet u kontekstu oponašanja crijevne bolesti.
Korištenje hibridnih čipova jednostavnije je od crijeva na čipu jer je postavljanje uređaja jednostavnije, a upotreba Transwell umetaka omogućuje skalabilnu kulturu crijevnog epitela. Međutim, komercijalno dostupni Transwell umetci s poliesterskim membranama nisu elastični i ne mogu simulirati pokrete slične peristaltici. Nadalje, apikalni odjeljak Transwell umetka postavljenog u hibridni čip ostao je nepomičan bez ikakvih pokreta. ar stres na apikalnoj strani. Jasno je da statička svojstva u apikalnom odjeljku rijetko omogućuju dugotrajnu kokulturu bakterija u hibridnim čipovima. Dok možemo robusno inducirati 3D morfogenezu u Transwell umetcima kada koristimo hibridne čipove, nedostatak fiziološki relevantne biomehanike i apikalnog protoka tekućine može ograničiti izvedivost platformi hibridnih čipova za potencijalne primjene.
Pune rekonstrukcije osi ljudske kripte i resice u kulturama crijeva na čipu i hibrida na čipu nisu u potpunosti utvrđene. Budući da morfogeneza počinje od epitelnog monosloja, 3D mikroarhitekture ne moraju nužno pružati morfološku sličnost s kriptama in vivo. Iako smo karakterizirali proliferirajuću staničnu populaciju blizu domene bazalne kripte u mikromotoru 3D epitela, regije kripte i resica nisu bile jasno razgraničene. Iako viši gornji kanali na čipu dovode do povećane visine mikroinžinjerskog epitela, najveća je visina još uvijek ograničena na ~300–400 µm. Stvarna dubina ljudskih crijevnih kripti u tankom i debelom crijevu je ~135 µm odnosno ~400 µm, a visina resice tankog crijeva su ~600 µm41.
Sa stajališta snimanja, in situ snimanje super-razlučivosti 3D mikroarhitektura može biti ograničeno na utrobu na čipu, budući da je potrebna radna udaljenost od leće objektiva do epitelnog sloja reda veličine nekoliko milimetara. Da bi se prevladao ovaj problem, može biti potreban udaljeni objektiv. Nadalje, izrada tankih presjeka za pripremu uzorka za slikanje izazovna je zbog visoke elastičnosti PDMS-a. Nadalje, budući da mikroproizvodnja crijeva sloj po sloj na čipu uključuje trajno prianjanje između svakog sloja, iznimno je izazovno otvoriti ili ukloniti gornji sloj kako bi se ispitala površinska struktura epitelnog sloja. Na primjer, pomoću skenirajućeg elektronskog mikroskopa (SEM).
Hidrofobnost PDMS-a bila je ograničavajući čimbenik u mikrofluidnim studijama koje se bave hidrofobnim malim molekulama, budući da PDMS može nespecifično adsorbirati takve hidrofobne molekule. Alternative PDMS-u mogu se razmotriti s drugim polimernim materijalima. Alternativno, površinska modifikacija PDMS-a (npr. oblaganje lipofilnim materijalima 42 ili poli(etilen glikolom) 43) može se razmotriti za smanjenje adsorpcija hidrofobnih molekula.
Naposljetku, naša metoda nije dobro okarakterizirana u smislu pružanja probira visoke propusnosti ili eksperimentalne platforme prilagođene korisniku "jedna veličina za sve". Trenutačni protokol zahtijeva pumpu štrcaljke po mikrouređaju, što zauzima prostor u CO2 inkubatoru i sprječava eksperimente velikih razmjera. Ovo ograničenje može se značajno poboljšati skalabilnošću inovativnih formata kulture (npr. 24 jažice, 96 jažica ili 384- dobro porozni umeci koji omogućuju kontinuirano nadopunjavanje i uklanjanje bazolateralnog medija).
Kako bismo inducirali 3D morfogenezu ljudskog crijevnog epitela in vitro, upotrijebili smo intestinalni uređaj s mikrofluidnim čipom koji sadrži dva paralelna mikrokanala i elastičnu poroznu membranu između kako bismo stvorili sučelje lumen-kapilara. Također demonstriramo upotrebu jednokanalnog mikrofluidnog uređaja (hibridnog čipa) koji osigurava kontinuirani bazolateralni protok ispod polariziranih slojeva epitela koji rastu na Transwell umetcima. U obje platforme, morfogeneza različitih epitelnih stanica ljudskog crijeva može se demonstrirati primjenom usmjerene manipulacije protoka kako bi se uklonili antagonisti morfogena iz bazolateralnog odjeljka. Cijeli eksperimentalni postupak (Slika 1) sastoji se od pet dijelova: (i) mikroproizvodnja crijevnog čipa ili Transwell umetljivog hibridnog čipa (koraci 1-5; okvir 1), (ii) priprema crijevne epitelne stanice (Caco-2 stanice) ili ljudske crijevne organoide;okviri 2-5), (iii) kultura intestinalnih epitelnih stanica na intestinalnim čipovima ili hibridnim čipovima (koraci 6-9), (iv) indukcija 3D morfogeneze in vitro (korak 10) i (v) ) za karakterizaciju 3D epitelne mikrostrukture (koraci 11-24). Konačno, odgovarajuća kontrolna skupina (razmotrena dalje u nastavku) dizajnirana je za validaciju učinkovitost in vitro morfogeneze usporedbom epitelne morfogeneze sa prostornim, vremenskim, uvjetnim ili proceduralnim kontrolama.
Koristili smo dvije različite platforme kulture: gut-on-a-chip s ravnim kanalima ili nelinearnim zakrivljenim kanalima, ili hibridne čipove koji sadrže Transwell (TW) umetke u mikrofluidnom uređaju, proizvedene kako je opisano u Okviru 1, i korak 1 -5. "Izrada uređaja" pokazuje glavne korake u izradi jednog čipa ili hibridnog čipa. "Kultura ljudskih crijevnih epitelnih stanica" objašnjava izvor stanica (Caco-2 ili ljudski crijevni organoidi) i postupak kulture koji se koristi u ovom protokolu. "In vitro morfogeneza" pokazuje sveukupne korake u kojima se Caco-2 ili epitelne stanice izvedene iz organoida uzgajaju na crijevnom čipu ili na Transwell umetcima hibridnog čipa, nakon čega slijedi indukcija 3D morfogeneze i formiranje karakterizirane epitelne strukture. Broj koraka programa ili broj okvira prikazan je u nastavku svaka strelica. Aplikacija pruža primjere kako se utvrđeni intestinalni epitelni slojevi mogu koristiti, na primjer, u karakterizaciji diferencijacije stanica, studijama fiziologije crijeva, uspostavljanju ekosustava mikrobioma domaćina i modeliranju bolesti. Imunofluorescentne slike u "Diferencijaciji stanica" prikazuju jezgre, F-aktin i MUC2 izražene u 3D Caco-2 epitelnom sloju generiranom u crijevima čip.MUC2 signalizacija prisutna je u vrčastim stanicama i sluzi koja se izlučuje s površina sluznice. Fluorescentne slike u Gut Physiology pokazuju sluz proizvedenu bojenjem na ostatke sijalne kiseline i N-acetilglukozamina korištenjem fluorescentnog aglutinina pšeničnih klica. Dvije preklapajuće slike u "Host-Microbe Co-Cultures" pokazuju reprezentativne kokulture domaćina i mikrobioma u crijevima na čip. Lijeva ploča prikazuje kokulturu E. coli koja eksprimira zeleni fluorescentni protein (GFP) s mikroinženjerskim 3D Caco-2 epitelnim stanicama. Desna ploča prikazuje lokalizaciju GFP E. coli kokultivirane s 3D Caco-2 epitelnim stanicama, nakon čega slijedi imunofluorescentno bojenje s F-aktinom (crveno) i jezgrama (plavo). Modeliranje bolesti ilustrira zdrave naspram propusnih crijeva u čipovima za upalu crijeva pod fiziološkim izazovom bakterijskim antigenima (npr. lipopolisaharid, LPS) i imunološkim stanicama (npr. PBMC;zelena).Caco-2 stanice su uzgajane kako bi se uspostavio 3D epitelni sloj. Skala, 50 µm. Slike u donjem redu: "Diferencijacija stanica" prilagođena dopuštenjem iz reference.2.Oxford University Press;Reproducirano uz dopuštenje iz Ref.5.NAS;“Kokultura domaćina i mikroba” prilagođeno uz dopuštenje iz ref.3.NAS;“Modeliranje bolesti” prilagođeno uz dopuštenje reference.5.NAS.
I gut-on-chip i hibridni čipovi proizvedeni su korištenjem PDMS replika koje su izvađene iz silikonskih kalupa mekom litografijom1,44 i s uzorkom SU-8. Dizajn mikrokanala u svakom čipu određen je uzimanjem u obzir hidrodinamike kao što su smično naprezanje i hidrodinamički tlak1,4,12. Izvorni dizajn crijeva-na-čipu (prošireni podaci, slika 1a), koji se sastojao od dva jukstaponirana paralelna ravna mikrokanala, evoluirao je u složeni crijevo na čipu (prošireni podaci, slika 1b) koji uključuje par zakrivljenih mikrokanala za induciranje povećanog vremena zadržavanja tekućine, nelinearnih obrazaca protoka i višeosne deformacije kultiviranih stanica (sl. 2a–f) 12. Kada se treba ponovno stvoriti složenija biomehanika crijeva, složena gu mogu se odabrati t-on-a-chips. Pokazali smo da zamršeni Gut-Chip također snažno inducira 3D morfogenezu u sličnom vremenskom okviru sa sličnim stupnjem rasta epitela u usporedbi s izvornim Gut-Chip-om, bez obzira na tip kultivirane stanice. Stoga, za induciranje 3D morfogeneze, linearni i složeni dizajni crijeva na čipu su međusobno zamjenjivi. PDMS replike očvrsnute na silicij molu ds sa uzorcima SU-8 dali su negativne karakteristike nakon vađenja iz kalupa (Sl.2a). Za izradu crijeva na čipu, pripremljeni gornji PDMS sloj je uzastopno spojen na porozni PDMS film i zatim poravnat s donjim PDMS slojem nepovratnim spajanjem pomoću koronske obrade (Sl. 2b–f). Za proizvodnju hibridnih čipova, stvrdnute PDMS replike su zalijepljene na stakalce kako bi se stvorili jednokanalni mikrofluidni uređaji koji mogu prihvatiti modiraju Transwell umetke (Slika 2h i Prošireni podaci Slika 2). Proces povezivanja izvodi se tretiranjem površina PDMS replike i stakla tretmanom kisikovom plazmom ili koronom. Nakon sterilizacije mikrofabriciranog uređaja pričvršćenog na silikonsku cijev, postavka uređaja bila je spremna za izvođenje 3D morfogeneze intestinalnog epitela (Slika 2g).
a, Shematski prikaz pripreme dijelova PDMS-a iz silikonskih kalupa s uzorkom SU-8. Nestvrdnuta otopina PDMS-a izlivena je na silikonski kalup (lijevo), očvrsnula na 60 °C (u sredini) i izvađena iz kalupa (desno). Izvađeni PDMS je izrezan na komade i očišćen za daljnju upotrebu.b, Fotografija silikonskog kalupa korištenog za pripremu gornjeg sloja PDMS-a.c, Fotografija silikonskog kalupa d korišten za izradu PDMS porozne membrane.d, Niz fotografija gornje i donje PDMS komponente i sklopljenog intestinalnog uređaja na čipu.e, Shema poravnanja gornje, membrane i donje PDMS komponente. Svaki je sloj nepovratno spojen obradom plazmom ili koronom.f, Shema proizvedenog uređaja gut-on-a-chip s superponiranim zakrivljenim mikrokanom nels i vakuumske komore.g, Postavljanje crijeva na čipu za mikrofluidnu staničnu kulturu. Proizvedeno crijevo na čipu sastavljeno od silikonske cijevi i štrcaljke postavljeno je na pokrovno stakalce. Uređaj za čip postavljen je na poklopac Petrijeve zdjelice od 150 mm radi obrade. Vezivo se koristi za zatvaranje silikonske cijevi.h, Vizualne snimke proizvodnje hibridnog čipa i 3D morfogeneza korištenjem hibridnih čipova. Transwell umeci pripremljeni neovisno za kulturu 2D monoslojeva intestinalnih epitelnih stanica umetnuti su u hibridni čip kako bi se inducirala intestinalna 3D morfogeneza. Medij se perfundira kroz mikrokanale ispod sloja stanica postavljenog na Transwell umetku. Ljestvica, 1 cm.h Ponovno tiskano uz dopuštenje reference.4.Elsevier.
U ovom protokolu, stanična linija Caco-2 i intestinalni organoidi korišteni su kao epitelni izvori (Slika 3a). Obje vrste stanica uzgajane su neovisno (Okvir 2 i Okvir 5) i korištene za zasijavanje ECM-om obloženih mikrokanala crijeva na čipu ili Transwell umetaka. Kada su stanice konfluentne (>95% pokrivenost u bocama), rutinski kultivirane Caco-2 stanice (između prolaza) 10 i 50) u T-bocama skupljaju se kako bi se pripremile disocirane stanične suspenzije tekućinom za tripsinizaciju (kutija 2). Ljudski intestinalni organoidi iz intestinalnih biopsija ili kirurških resekcija uzgajani su u kupolama Matrigel skele u pločama s 24 jažice za podršku strukturnom mikrookruženju. Medij koji sadrži esencijalne morfogene (kao što su Wnt, R-spondin i No ggin) i faktori rasta pripremljeni kako je opisano u Okviru 3 dodavali su se svaki drugi dan dok organoidi nisu narasli do ~500 µm u promjeru. Potpuno odrasli organoidi se sakupe i razdvoje u pojedinačne stanice za sadnju u crijeva ili Transwell umetke na čipu (Okvir 5). Kao što smo ranije izvijestili, može se razlikovati prema vrsti bolesti12,13 (npr. ulcerozni kolitis, Crohnova bolest, kolorektalna bolest). talnog karcinoma ili normalnog donora), mjesto lezije (npr. lezija u odnosu na područje bez lezije) i gastrointestinalno mjesto u traktu (npr. dvanaesnik, jejunum, ileum, cekum, debelo crijevo ili rektum). U Okviru 5 pružamo optimizirani protokol za uzgoj organoida debelog crijeva (koloida) koji obično zahtijevaju veće koncentracije morfogena od organoida tankog crijeva.
a, Tijek rada za indukciju morfogeneze crijeva u crijevnom čipu. Caco-2 ljudski crijevni epitel i crijevni organoidi koriste se u ovom protokolu za demonstraciju 3D morfogeneze. Izolirane epitelne stanice posađene su u pripremljeni uređaj crijeva na čipu (priprema čipa). Nakon što su stanice posađene (zasijane) i pričvršćene (pričvršćene) na PDMS porozne membrane na dan 0 (D0), apikalni (AP) protok se pokreće i održava prva 2 dana (protok, AP, D0-D2). Bazolateralni (BL) protok također se pokreće zajedno s cikličkim istezanjem (istezanje, protok, AP i BL) kada se formira potpuni 2D monosloj. Intestinalna 3D morfogeneza dogodila se spontano nakon 5 dana mikrofluidne kulture (morfogeneza, D 5). Slike faznog kontrasta pokazuju reprezentativnu morfologiju stanica Caco-2 u svakom eksperimentalnom koraku ili vremenskoj točki (trakasti grafikon, 100 µm). Četiri shematska dijagrama koja prikazuju odgovarajuće kaskade morfogeneze crijeva (gore desno). Isprekidane strelice u shemi predstavljaju smjer protoka tekućine.b, SEM slika koja prikazuje površinsku topologiju utvrđenog 3D Caco-2 epitela (lijevo). Označeno umetnuto povećano područje (bijeli isprekidani okvir) prikazuje regenerirane mikrovile na 3D sloju Caco-2 (desno).c, Vodoravni pogled sprijeda uspostavljenog Caco-2 3D, klaudina (ZO-1, crveno) i kontinuirane četkaste rubne membrane s oznakom F-aktin (zeleno) i jezgre (plavo) Imunofluorescentna konfokalna vizualizacija epitelnih stanica na crijevnim čipovima. Strelice koje pokazuju na srednji shematski prikaz lokacije žarišne ravnine za svaki konfokalni pogled.d, Vremenski tok morfoloških promjena u organoidima uzgojenim na čipu dobiven fazno kontrastnom mikroskopijom 3., 7., 9., 11. i 13. dana. Umetak (gore desno) prikazuje veliko povećanje priložene slike.e, DIC fotomikrografija organoidnog 3D epitela uspostavljenog u crijevima na rezu snimljenom 7. dana.f, Preko postavljene imunofluorescentne slike koje pokazuju markere za matične stanice (LGR5;magenta), vrčaste stanice (MUC2; zelena), F-aktin (siva) i jezgre (cijan) uzgojene na crijevnim čipovima 3 dana, odnosno (lijevo) i 13-dnevni (srednji) organoidi na epitelnom sloju. Vidi i Sliku 3 s proširenim podacima, koja ističe LGR5 signalizaciju bez MUC2 signalizacije. Fluorescencijske slike koje prikazuju epitelnu mikrostrukturu (desno) 3D organa oidni epitel uspostavljen u crijevima na čipu bojenjem plazma membrane bojom CellMask (desno) 13. dana kulture. Skala je 50 μm osim ako nije drugačije navedeno.b Ponovno tiskano uz dopuštenje reference.2.Oxford University Press;c Prilagođeno uz dopuštenje Reference.2.Oxford University Press;e i f prilagođeno dopuštenjem referencom.12 Pod licencom Creative Commons CC BY 4.0.
U utrobi na čipu, potrebno je modificirati hidrofobnu površinu PDMS porozne membrane za uspješno oblaganje ECM-om. U ovom protokolu primjenjujemo dvije različite metode za modifikaciju hidrofobnosti PDMS membrana. Za uzgoj Caco-2 stanica, površinska aktivacija samo tretmanom UV/ozonom bila je dovoljna za smanjenje hidrofobnosti površine PDMS, premazivanje ECM-a i pričvršćivanje Caco-2 stanica na PDMS membranu .Međutim, mikrofluidna kultura organoidnog epitela zahtijeva površinsku funkcionalizaciju temeljenu na kemikalijama kako bi se postiglo učinkovito taloženje ECM proteina uzastopnom primjenom polietilenimina (PEI) i glutaraldehida na PDMS mikrokanale. Nakon površinske modifikacije, ECM proteini su deponirani da pokriju funkcionaliziranu površinu PDMS i zatim uvedeni u izolirani organoidni epitel. Nakon što su stanice pričvršćene, počinje mikrofluidna stanična kultura perfuzijom samo medija u gornji mikrokanal dok stanice ne formiraju potpuni monosloj, dok donji mikrokanal održava statične uvjete. Ova optimizirana metoda za površinsku aktivaciju i ECM premaz omogućuje pričvršćivanje organoidnog epitela za induciranje 3D morfogeneze na površini PDMS.
Transwell kulture također zahtijevaju ECM premaz prije nasađivanja stanica;međutim, Transwell kulture ne zahtijevaju složene korake predtretmana za aktiviranje površine poroznih umetaka. Za uzgoj Caco-2 stanica na Transwell umetcima, ECM premaz na poroznim umetcima ubrzava pričvršćivanje disociranih Caco-2 stanica (<1 sat) i stvaranje barijere čvrstog spoja (<1-2 dana). Za uzgoj organoida na Transwell umetcima, izolirani organoidi se nasađuju na umetke obložene ECM-om, pričvršćene na površinu membrane. (<3 h) i održava se sve dok organoidi ne formiraju potpuni monosloj s integritetom barijere. Transwell kulture izvode se u pločama s 24 jažice bez upotrebe hibridnih čipova.
In vitro 3D morfogeneza može se pokrenuti primjenom protoka tekućine na bazolateralni aspekt utvrđenog epitelnog sloja. U crijevima na čipu, epitelna morfogeneza je započela kada je medij perfundiran u gornji i donji mikrokanal (Slika 3a). Kao što je prethodno opisano, kritično je uvesti protok tekućine u donji (bazolateralni) odjeljak za kontinuirano uklanjanje usmjerenih izlučenih inhibitora morfogena .Kako bismo osigurali dovoljno hranjivih tvari i seruma stanicama vezanim na poroznim membranama i generirali luminalni smični stres, obično primjenjujemo dvostruki protok u crijevima na čipu. U hibridnim čipovima, Transwell umeci koji sadrže epitelne monoslojeve umetnuti su u hibridne čipove. Zatim je medij primijenjen ispod bazolateralne strane poroznog Transwell umetka kroz mikrokanal. Došlo je do intestinalne morfogeneze 3 -5 dana nakon inicijacije bazolateralnog protoka u obje platforme kulture.
Morfološke značajke mikroinženjerskih 3D epitelnih slojeva mogu se analizirati primjenom različitih modaliteta snimanja, uključujući mikroskopiju s faznim kontrastom, mikroskopiju s diferencijalnim interferencijskim kontrastom (DIC), SEM ili imunofluorescentnu konfokalnu mikroskopiju (slike 3 i 4). Snimanje s faznim kontrastom ili DIC može se jednostavno izvesti u bilo kojem trenutku tijekom kulture za praćenje oblika i izbočenja 3D epitelnih slojeva.D zahvaljujući optičkoj prozirnosti PDMS-a i poliesterskih filmova, i gut-on-a-chip i hibridne platforme čipa mogu pružiti in situ slike u stvarnom vremenu bez potrebe za sečenjem ili rastavljanjem uređaja. Prilikom izvođenja imunofluorescentnog snimanja (slike 1, 3c, f i 4b, c), stanice se obično fiksiraju s 4% (wt/vol) paraformaldehida ( PFA), a zatim Triton X-100 i 2% (wt/vol)) goveđi serumski albumin (BSA), redom. Ovisno o tipu stanice, mogu se koristiti različiti fiksativi, permeabilizatori i sredstva za blokiranje. Primarna antitijela koja ciljaju markere stanica ili regije ovisne o liniji koriste se za isticanje stanica imobiliziranih in situ na čipu, nakon čega slijede sekundarna antitijela zajedno s bojom koja cilja bilo koju jezgru nas (npr. 4',6-diamidino-2-fenilen) indol, DAPI) ili F-aktin (npr. fluorescentno obilježeni faloidin). Živo snimanje temeljeno na fluorescenciji također se može izvesti in situ za otkrivanje proizvodnje sluzi (Sl.1, “Diferencijacija stanica” i “Fiziologija crijeva”), nasumična kolonizacija mikrobnih stanica (Slika 1, “Kokultura domaćina i mikroba”), regrutiranje imunoloških stanica (Slika 1, 'Modeliranje bolesti') ili konture 3D epitelne morfologije (Slika 3c,f i 4b,c). Prilikom modificiranja crijeva na čip za odvajanje gornjeg sloja od donjeg sloja mikrokanala, kao što je opisano u referenci. Kao što je prikazano na slici 2, 3D epitelna morfologija kao i mikrovili na apikalnoj granici četkice mogu se vizualizirati SEM-om (Slika 3b). Ekspresija markera diferencijacije može se procijeniti izvođenjem kvantitativnog PCR5 ili sekvenciranja jednostanične RNA. U ovom slučaju, 3D slojevi epitelnih stanica rastu n u crijevima čips ili hibridni čips se bere tripsinizacijom i zatim koristi za molekularnu ili genetsku analizu.
a, Tijek rada za indukciju intestinalne morfogeneze u hibridnom čipu. Caco-2 i crijevni organoidi koriste se u ovom protokolu za demonstraciju 3D morfogeneze u hibridnoj platformi čipa. Disocirane epitelne stanice posađene su u pripremljene Transwell umetke (TW prep; vidi sliku u nastavku). Nakon što su stanice posađene (zasijane) i pričvršćene na poliesterske membrane u Transwell umetci, sve su stanice uzgajane u statičkim uvjetima (TW kultura). Nakon 7 dana, jedan Transwell umetak koji sadrži 2D monosloj epitelnih stanica integriran je u hibridni čip za uvođenje bazolateralnog toka (Flow, BL), što je u konačnici dovelo do stvaranja 3D epitelnog sloja (morfogeneza). Mikrografije faznog kontrasta koje pokazuju morfološke značajke epitelnih stanica ljudskih organa izvedenih iz normalnog donora (linija C103) uzlaznog debelog crijeva u svakom eksperimentalnom koraku ili vremenskoj točki. Sheme u gornjim slojevima ilustriraju eksperimentalnu konfiguraciju za svaki korak.b, Hibridni čipovi (lijevo shematski prikaz) mogu dovesti do 3D morfogeneze organoidnih epitelnih stanica s konfokalnim mikroskopskim prikazima odozgo prema dolje snimljenim na različitim Z pozicijama (gornji, srednji i donji;vidi desnu shemu i odgovarajuće isprekidane linije).pokazao očite morfološke karakteristike. F-aktin (cijan), jezgra (siva).c, Fluorescentne konfokalne mikrografije (3D pogled pod kutom) epitelnih stanica izvedenih iz organoida uzgojenih u statičkom Transwellu (TW; umetnuto unutar bijelog isprekidanog okvira) u odnosu na hibridni čip (najveći puni snimak) uspoređujući 2D u odnosu na 3D morfologiju, respektivno. Par 2D okomitih križnih rezni prikazi (umetnuti u gornjem desnom kutu; "XZ") također pokazuju 2D i 3D značajke. Skalna traka, 100 µm.c Ponovno tiskano uz dopuštenje reference.4.Elsevier.
Kontrole se mogu pripremiti uzgojem istih stanica (Caco-2 ili intestinalnih organoidnih epitelnih stanica) u dvodimenzionalne monoslojeve pod uobičajenim uvjetima statičke kulture. Značajno, gubitak hranjivih tvari može rezultirati zbog ograničenog volumenskog kapaciteta mikrokanala (tj. ~4 µL u gornjem kanalu na izvornom dizajnu crijevnog čipa). Stoga se također može odrediti morfologija epitela prije i nakon primjene bazolateralnog protoka u usporedbi.
Proces meke litografije trebao bi se izvoditi u čistoj prostoriji. Za svaki sloj na čipu (gornji i donji sloj i membrane) i hibridne čipove korištene su različite fotomaske i izrađene na odvojenim silicijskim pločicama jer su visine mikrokanala bile različite. Ciljane visine gornjih i donjih mikrokanala crijeva na čipu su 500 µm odnosno 200 µm. Cilj kanala visina hibridnog čipa je 200 µm.
Stavite silikonsku pločicu od 3 inča u posudu s acetonom. Lagano vrtite ploču 30 sekundi, a zatim osušite pločicu na zraku. Prebacite pločicu na pločicu s IPA-om, a zatim okretajte pločicu 30 s da biste je očistili.
Otopina piranha (mješavina vodikovog peroksida i koncentrirane sumporne kiseline, 1:3 (vol/vol)) može se po izboru koristiti za maksimalno uklanjanje organskih ostataka s površine silicijske ploče.
Piranha otopina je izuzetno korozivna i stvara toplinu. Potrebne su dodatne sigurnosne mjere. Za odlaganje otpada, ostavite otopinu da se ohladi i prebacite je u čisti, suhi spremnik za otpad. Koristite sekundarne spremnike i pravilno označite spremnike za otpad. Molimo slijedite sigurnosne smjernice postrojenja za detaljnije postupke.
Oblatne dehidrirati stavljanjem na ploču zagrijanu na 200 °C 10 min. Nakon dehidracije napolitanku pet puta protresti na zraku da se ohladi.
Ulijte ~10 g fotootpora SU-8 2100 na sredinu očišćene silikonske pločice. Pincetom ravnomjerno rasporedite fotootpor po ploči. Povremeno stavite oblatnu na ploču zagrijanu na 65°C kako bi fotootpor bio manje ljepljiv i lakši za mazanje. Ne stavljajte vafer direktno na vruću ploču.
SU-8 je ravnomjerno raspoređen na pločicu nanošenjem centrifuge. Programirajte ulaznu rotaciju SU-8 na 5-10 s da se širi pri 500 okretaja u minuti pri ubrzanju od 100 okretaja u minuti/s. Postavite glavnu vrtnju za uzorkovanje debljine 200 µm pri 1500 okretaja u minuti ili postignite debljinu od 250 µm (stvarajući visinu od 500 µm). za gornji sloj crijeva na čipu; pogledajte “Kritični koraci” u nastavku) postavite na ubrzanje od 300 o/min 30 sekundi pri 1200 o/min.
Glavna brzina centrifuge može se podesiti prema ciljnoj debljini uzorka SU-8 na silicijskoj pločici.
Za izradu SU-8 uzoraka visine 500 µm za gornji sloj crijeva na čipu, koraci centrifugiranja i mekog pečenja ove kutije (koraci 7 i 8) uzastopno su ponovljeni (pogledajte korak 9) kako bi se proizvela dva sloja od 250 µm debelog sloja SU-8, koji se može naslagati i spojiti UV izlaganjem u koraku 12 ove kutije, čineći sloj 500 µm visok.
Mekano ispecite oblatne obložene SU-8 tako da ih pažljivo stavite na vruću ploču na 65 °C tijekom 5 minuta, zatim promijenite postavku na 95 °C i inkubirajte dodatnih 40 minuta.
Da biste postigli visinu uzorka SU-8 od 500 μm u gornjem mikrokanalu, ponovite korake 7 i 8 da biste generirali dva sloja SU-8 debljine 250 μm.
Koristeći UV Mask Aligner, provedite test lampom u skladu s uputama proizvođača kako biste izračunali vrijeme ekspozicije pločice. (vrijeme ekspozicije, ms) = (doza ekspozicije, mJ/cm2)/(snaga lampe, mW/cm2).
Nakon određivanja vremena ekspozicije, postavite fotomasku na držač maske UV maske alignera i postavite fotomasku na pločicu premazanu SU-8.
Postavite otisnutu površinu fotomaske izravno na SU-8 obloženu stranu silikonske pločice kako biste smanjili UV disperziju.
Izložite SU-8 obloženu pločicu i fotomasku okomito 260 mJ/cm2 UV svjetla tijekom unaprijed određenog vremena izlaganja (pogledajte korak 10 u ovom okviru).
Nakon izlaganja UV zračenju, silikonske vafle obložene SU-8 pečene su na 65°C 5 minuta i 95°C 15 minuta na svakoj vrućoj ploči kako bi se izradili uzorci visine 200 µm. Produžite vrijeme nakon pečenja na 95 °C na 30 minuta za izradu uzoraka visine 500 µm.
Razvijač se ulije u staklenu posudu, a pečena oblatna se stavi u posudu. Volumen SU-8 razvijača može varirati ovisno o veličini staklene ploče. Pazite da koristite dovoljno SU-8 razvijača da u potpunosti uklonite neeksponirani SU-8. Na primjer, kada koristite staklenu posudu promjera 150 mm s kapacitetom od 1 L, upotrijebite ~300 mL SU-8 razvijača. Kalup razvijajte 25 minuta uz povremeno lagano kuhanje. rotacija.
Isperite razvijeni kalup s ~10 mL svježeg razvijača, a zatim IPA raspršivanjem otopine pomoću pipete.
Stavite pločicu u plazma čistač i izložite je plazmi kisika (atmosferski plin, ciljni tlak 1 × 10−5 Torr, snaga 125 W) 1,5 min.
Stavite pločicu u vakuumski eksikator sa staklenim stakalcem unutra. Pločice i pločice se mogu postaviti jedna pored druge. Ako je vakuumski eksikator podijeljen na nekoliko slojeva pločom, stavite stakalce u donju komoru, a pločice u gornju komoru. Nakapajte 100 μL otopine trikloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktil)silana na čašu kliznite i primijenite vakuum za silanizaciju.
Odmrznite bočicu zamrznutih stanica Caco-2 u vodenoj kupelji na 37°C, zatim prenesite otopljene stanice u tikvicu T75 koja sadrži 15 ml Caco-2 medija prethodno zagrijanog na 37°C.
Za propuštanje Caco-2 stanica pri ~90% konfluentnosti, prvo zagrijte Caco-2 medij, PBS i 0,25% tripsina/1 mM EDTA u vodenoj kupelji na 37°C.
Aspirirajte medij vakuumskom aspiracijom. Dvaput isperite stanice s 5 mL toplog PBS-a ponavljanjem vakuumske aspiracije i dodavanjem svježeg PBS-a.