Hvala što ste posjetili Nature.com.Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Evolucija mikrobnih parazita uključuje suprotstavljanje između prirodne selekcije, koja uzrokuje poboljšanje parazita, i genetskog pomaka, koji uzrokuje da paraziti gube gene i nakupljaju štetne mutacije.Ovdje, kako bismo razumjeli kako se ova protuučinak događa na razini jedne makromolekule, opisujemo cryo-EM strukturu ribosoma Encephalitozoon cuniculi, eukariotskog organizma s jednim od najmanjih genoma u prirodi.Ekstremno smanjenje rRNA u ribosomima E. cuniculi popraćeno je strukturnim promjenama bez presedana, kao što je evolucija dosad nepoznatih spojenih rRNA poveznica i rRNA bez izbočina.Osim toga, ribosom E. cuniculi preživio je gubitak fragmenata i proteina rRNA tako što je razvio sposobnost korištenja malih molekula kao strukturnog oponašanja degradiranih fragmenata i proteina rRNA.Sveukupno, pokazujemo da molekularne strukture za koje se dugo smatralo da su smanjene, degenerirane i podložne iscrpljujućim mutacijama imaju niz kompenzacijskih mehanizama koji ih održavaju aktivnima unatoč ekstremnim molekularnim kontrakcijama.
Budući da većina skupina mikrobnih parazita ima jedinstvene molekularne alate za iskorištavanje svojih domaćina, često moramo razviti različite terapije za različite skupine parazita1,2.Međutim, novi dokazi sugeriraju da su neki aspekti evolucije parazita konvergentni i uvelike predvidljivi, što ukazuje na potencijalnu osnovu za široke terapijske intervencije u mikrobnim parazitima3,4,5,6,7,8,9.
Prethodni rad identificirao je zajednički evolucijski trend kod mikrobnih parazita koji se naziva redukcija genoma ili propadanje genoma10,11,12,13.Trenutna istraživanja pokazuju da kada mikroorganizmi odustanu od slobodnog načina života i postanu unutarstanični paraziti (ili endosimbionti), njihovi genomi prolaze kroz spore, ali nevjerojatne metamorfoze tijekom milijuna godina9,11.U procesu poznatom kao propadanje genoma, mikrobni paraziti nakupljaju štetne mutacije koje mnoge prethodno važne gene pretvaraju u pseudogene, što dovodi do postupnog gubitka gena i mutacijskog kolapsa14,15.Ovaj kolaps može uništiti do 95% gena u najstarijim intracelularnim organizmima u usporedbi s blisko srodnim slobodnoživućim vrstama.Dakle, evolucija unutarstaničnih parazita je povlačenje konopa između dviju suprotstavljenih sila: Darwinove prirodne selekcije, koja dovodi do poboljšanja parazita, i kolapsa genoma, bacajući parazite u zaborav.Ostaje nejasno kako je parazit uspio izaći iz te borbe i zadržati aktivnost svoje molekularne strukture.
Iako mehanizam propadanja genoma nije u potpunosti shvaćen, čini se da se događa uglavnom zbog čestog genetskog pomaka.Budući da paraziti žive u malim, aseksualnim i genetski ograničenim populacijama, ne mogu učinkovito eliminirati štetne mutacije koje se ponekad javljaju tijekom replikacije DNK.To dovodi do nepovratne akumulacije štetnih mutacija i smanjenja genoma parazita.Kao rezultat toga, parazit ne samo da gubi gene koji mu više nisu potrebni za preživljavanje u unutarstaničnom okruženju.Nemogućnost populacija parazita da učinkovito eliminiraju sporadične štetne mutacije uzrokuje nakupljanje tih mutacija u cijelom genomu, uključujući njihove najvažnije gene.
Velik dio našeg trenutnog razumijevanja smanjenja genoma temelji se isključivo na usporedbama sekvenci genoma, s manje pozornosti na promjene u stvarnim molekulama koje obavljaju kućne funkcije i služe kao potencijalne mete za lijekove.Komparativne studije su pokazale da teret štetnih unutarstaničnih mikrobnih mutacija čini predispoziciju proteinima i nukleinskim kiselinama za pogrešno savijanje i agregaciju, čineći ih ovisnijima o pratiocu i preosjetljivijima na toplinu19,20,21,22,23.Osim toga, različiti paraziti - neovisna evolucija ponekad odvojena čak 2,5 milijarde godina - doživjeli su sličan gubitak centara za kontrolu kvalitete u njihovoj sintezi proteina5,6 i mehanizmima popravka DNK24.Međutim, malo se zna o utjecaju unutarstaničnog načina života na sva druga svojstva staničnih makromolekula, uključujući molekularnu prilagodbu sve većem teretu štetnih mutacija.
U ovom radu, radi boljeg razumijevanja evolucije proteina i nukleinskih kiselina intracelularnih mikroorganizama, odredili smo strukturu ribosoma intracelularnog parazita Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi je organizam sličan gljivici koji pripada skupini parazitskih mikrosporija koje imaju neobično male eukariotske genome i stoga se koriste kao modelni organizmi za proučavanje propadanja genoma25,26,27,28,29,30.Nedavno je određena cryo-EM struktura ribosoma za umjereno reducirane genome Microsporidia, Paranosema locustae i Vairimorpha necatrix31,32 (~3,2 Mb genoma).Ove strukture sugeriraju da se određeni gubitak amplifikacije rRNA nadoknađuje razvojem novih kontakata između susjednih ribosomskih proteina ili stjecanjem novih msL131,32 ribosomskih proteina.Vrste Encephalitozoon (genom ~2,5 milijuna bp), zajedno sa svojim najbližim srodnikom Ordosporom, pokazuju krajnji stupanj redukcije genoma u eukariota – imaju manje od 2000 gena za kodiranje proteina, a očekuje se da njihovi ribosomi nisu samo lišeni ekspanzijskih fragmenata rRNA (fragmenti rRNA koji razlikuju eukariotske ribosome od bakterijskih ribosoma), već imaju i četiri rebra osomalnih proteina zbog nedostatka homologa u genomu E. cuniculi26,27,28.Stoga smo zaključili da ribosom E. cuniculi može otkriti dosad nepoznate strategije za molekularnu prilagodbu propadanju genoma.
Naša krio-EM struktura predstavlja najmanji eukariotski citoplazmatski ribosom koji se može karakterizirati i pruža uvid u to kako krajnji stupanj redukcije genoma utječe na strukturu, sastavljanje i evoluciju molekularnog stroja koji je sastavni dio stanice.Otkrili smo da ribosom E. cuniculi krši mnoge široko očuvane principe savijanja RNK i sastavljanja ribosoma i otkrili smo novi, prethodno nepoznati ribosomalni protein.Sasvim neočekivano, pokazujemo da su ribosomi mikrosporije razvili sposobnost vezanja malih molekula i pretpostavljamo da skraćivanja u rRNA i proteinima pokreću evolucijske inovacije koje u konačnici mogu prenijeti korisne kvalitete ribosomima.
Kako bismo poboljšali naše razumijevanje evolucije proteina i nukleinskih kiselina u unutarstaničnim organizmima, odlučili smo izolirati spore E. cuniculi iz kultura zaraženih stanica sisavaca kako bismo pročistili njihove ribosome i odredili strukturu tih ribosoma.Teško je dobiti veći broj parazitskih mikrosporija jer se mikrosporije ne mogu uzgajati u hranjivoj podlozi.Umjesto toga, oni rastu i razmnožavaju se samo unutar stanice domaćina.Stoga, da bismo dobili biomasu E. cuniculi za pročišćavanje ribosoma, inficirali smo staničnu liniju bubrega sisavaca RK13 sa sporama E. cuniculi i uzgajali ove zaražene stanice nekoliko tjedana kako bismo omogućili E. cuniculi da raste i razmnožava se.Koristeći monosloj zaraženih stanica od oko pola četvornog metra, uspjeli smo pročistiti oko 300 mg spora Microsporidia i upotrijebiti ih za izolaciju ribosoma.Zatim smo razbili pročišćene spore staklenim kuglicama i izolirali sirove ribosome korištenjem postupnog polietilen glikolnog frakcioniranja lizata.To nam je omogućilo da dobijemo približno 300 µg sirovih ribosoma E. cuniculi za strukturnu analizu.
Zatim smo prikupili cryo-EM slike koristeći dobivene uzorke ribosoma i obradili te slike pomoću maski koje odgovaraju velikoj ribosomskoj podjedinici, maloj glavi podjedinice i maloj podjedinici.Tijekom ovog procesa prikupili smo slike od oko 108 000 ribosomskih čestica i izračunali cryo-EM slike s razlučivošću od 2,7 Å (dodatne slike 1-3).Zatim smo upotrijebili cryoEM slike za modeliranje rRNA, ribosomskog proteina i faktora hibernacije Mdf1 povezanog s ribosomima E. cuniculi (Slika 1a, b).
a Struktura ribosoma E. cuniculi u kompleksu s faktorom hibernacije Mdf1 (pdb id 7QEP).b Karta faktora hibernacije Mdf1 povezanog s ribosomom E. cuniculi.c Karta sekundarne strukture koja uspoređuje oporavljenu rRNA u Microsporidian vrstama s poznatim ribosomskim strukturama.Ploče pokazuju položaj amplificiranih fragmenata rRNA (ES) i aktivnih mjesta ribosoma, uključujući mjesto dekodiranja (DC), petlju sarcicina (SRL) i centar peptidil transferaze (PTC).d Gustoća elektrona koja odgovara centru peptidil transferaze ribosoma E. cuniculi sugerira da ovo katalitičko mjesto ima istu strukturu u parazitu E. cuniculi i njegovim domaćinima, uključujući H. sapiens.e, f Odgovarajuća elektronska gustoća centra za dekodiranje (e) i shematska struktura centra za dekodiranje (f) pokazuju da E. cuniculi ima ostatke U1491 umjesto A1491 (brojčano E. coli) u mnogim drugim eukariotima.Ova promjena sugerira da bi E. cuniculi mogla biti osjetljiva na antibiotike koji ciljaju ovo aktivno mjesto.
Za razliku od prethodno utvrđenih struktura ribosoma V. necatrix i P. locustae (obje strukture predstavljaju istu obitelj mikrosporidija Nosematidae i vrlo su slične jedna drugoj), 31,32 ribosomi E. cuniculi prolaze kroz brojne procese rRNA i fragmentacije proteina.Daljnja denaturacija (dodatne slike 4-6).U rRNA, najupečatljivije promjene uključivale su potpuni gubitak amplificiranog 25S rRNA fragmenta ES12L i djelomičnu degeneraciju spirala h39, h41 i H18 (slika 1c, dopunska slika 4).Među ribosomskim proteinima, najupečatljivije promjene uključivale su potpuni gubitak proteina eS30 i skraćivanje proteina eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 i ​​eS7 (dodatne slike 4, 5).
Stoga se ekstremna redukcija genoma vrsta Encephalotozoon/Ordospora odražava na strukturu njihovih ribosoma: ribosomi E. cuniculi doživljavaju najdramatičniji gubitak sadržaja proteina u eukariotskim citoplazmatskim ribosomima koji podliježu strukturnoj karakterizaciji, a nemaju ni one rRNA i fragmente proteina koji su široko očuvani ne samo kod eukariota, već i u tri domene života.Struktura ribosoma E. cuniculi daje prvi molekularni model za ove promjene i otkriva evolucijske događaje koji su previđeni i od strane komparativne genomike i studija unutarstanične biomolekularne strukture (Dopunska slika 7).U nastavku opisujemo svaki od ovih događaja zajedno s njihovim vjerojatnim evolucijskim podrijetlom i njihovim potencijalnim utjecajem na funkciju ribosoma.
Zatim smo otkrili da, uz velika skraćivanja rRNA, ribosomi E. cuniculi imaju varijacije rRNA na jednom od svojih aktivnih mjesta.Iako središte peptidil transferaze ribosoma E. cuniculi ima istu strukturu kao i drugi ribosomi eukariota (Slika 1d), središte za dekodiranje se razlikuje zbog varijacije sekvence na nukleotidu 1491 (Numeriranje E. coli, Slika 1e, f).Ovo opažanje je važno jer mjesto dekodiranja eukariotskih ribosoma obično sadrži ostatke G1408 i A1491 u usporedbi s ostacima bakterijskog tipa A1408 i G1491.Ova varijacija leži u osnovi različite osjetljivosti bakterijskih i eukariotskih ribosoma na obitelj aminoglikozida ribosomskih antibiotika i drugih malih molekula koje ciljaju na mjesto dekodiranja.Na mjestu dekodiranja ribosoma E. cuniculi, ostatak A1491 zamijenjen je s U1491, potencijalno stvarajući jedinstveno sučelje vezanja za male molekule koje ciljaju ovo aktivno mjesto.Ista varijanta A14901 također je prisutna u drugim mikrosporijama kao što su P. locustae i V. necatrix, što sugerira da je široko rasprostranjena među vrstama mikrosporija (Slika 1f).
Budući da su naši uzorci ribosoma E. cuniculi bili izolirani iz metabolički neaktivnih spora, testirali smo cryo-EM mapu E. cuniculi za prethodno opisano vezanje ribosoma pod stresom ili uvjetima gladovanja.Faktori hibernacije 31,32,36,37, 38. Usporedili smo prethodno utvrđenu strukturu ribosoma u hibernaciji s cryo-EM mapom ribosoma E. cuniculi.Za docking su korišteni ribosomi S. cerevisiae u kompleksu s faktorom hibernacije Stm138, ribosomi skakavca u kompleksu s faktorom Lso232 te ribosomi V. necatrix u kompleksu s faktorima Mdf1 i Mdf231.U isto vrijeme, pronašli smo cryo-EM gustoću koja odgovara faktoru mirovanja Mdf1.Slično vezanju Mdf1 na ribosom V. necatrix, Mdf1 se također veže na ribosom E. cuniculi, gdje blokira E mjesto ribosoma, vjerojatno pomažući da ribosomi postanu dostupni kada spore parazita postanu metabolički neaktivne nakon inaktivacije tijela (Slika 2).).
Mdf1 blokira E mjesto ribosoma, što izgleda pomaže inaktivirati ribosom kada spore parazita postanu metabolički neaktivne.U strukturi ribosoma E. cuniculi otkrili smo da Mdf1 stvara prethodno nepoznat kontakt sa stablom ribosoma L1, dijelom ribosoma koji olakšava otpuštanje deacilirane tRNA iz ribosoma tijekom sinteze proteina.Ovi kontakti sugeriraju da se Mdf1 odvaja od ribosoma koristeći isti mehanizam kao deacetilirana tRNA, pružajući moguće objašnjenje kako ribosom uklanja Mdf1 da reaktivira sintezu proteina.
Međutim, naša je struktura otkrila nepoznati kontakt između Mdf1 i kraka ribosoma L1 (dio ribosoma koji pomaže oslobađanju deacilirane tRNA iz ribosoma tijekom sinteze proteina).Konkretno, Mdf1 koristi iste kontakte kao segment lakta deacilirane tRNA molekule (slika 2).Ovo prethodno nepoznato molekularno modeliranje pokazalo je da se Mdf1 odvaja od ribosoma koristeći isti mehanizam kao deacetilirana tRNA, što objašnjava kako ribosom uklanja ovaj faktor hibernacije da bi ponovno aktivirao sintezu proteina.
Prilikom konstruiranja modela rRNA, otkrili smo da ribosom E. cuniculi ima abnormalno presavijene fragmente rRNA, koje smo nazvali spojena rRNA (slika 3).U ribosomima koji obuhvaćaju tri domene života, rRNA se savija u strukture u kojima se većina baza rRNA ili spaja u paru baza i savija jedna s drugom ili stupa u interakciju s ribosomskim proteinima38,39,40.Međutim, u ribosomima E. cuniculi, čini se da rRNA krše ovo načelo savijanja pretvarajući neke od svojih spirala u nesavijena područja rRNA.
Struktura spirale H18 25S rRNA u S. cerevisiae, V. necatrix i E. cuniculi.Tipično, u ribosomima koji se protežu kroz tri životne domene, ovaj poveznik se uvija u RNA spiralu koja sadrži 24 do 34 ostatka.U Microsporidia, nasuprot tome, ovaj rRNA linker se postupno reducira na dva jednolančana linkera bogata uridinom koji sadrže samo 12 ostataka.Većina tih ostataka izložena je otapalima.Slika pokazuje da izgleda da parazitske mikrosporije krše opća načela presavijanja rRNA, gdje su baze rRNA obično spregnute s drugim bazama ili uključene u interakcije rRNA-protein.U mikrosporiji, neki fragmenti rRNA poprimaju nepovoljan nabor, u kojem bivša spirala rRNA postaje jednolančani fragment izdužen gotovo u ravnoj liniji.Prisutnost ovih neobičnih regija omogućuje rRNA mikrosporije da veže udaljene fragmente rRNA koristeći minimalan broj baza RNA.
Najupečatljiviji primjer ove evolucijske tranzicije može se promatrati u spirali H18 25S rRNA (slika 3).Kod vrsta od E. coli do ljudi, baze ove rRNA spirale sadrže 24-32 nukleotida, tvoreći blago nepravilnu spiralu.U prethodno identificiranim ribosomskim strukturama iz V. necatrix i P. locustae,31,32 baze spirale H18 su djelomično odmotane, ali je uparivanje nukleotidnih baza očuvano.Međutim, u E. cuniculi ovaj fragment rRNA postaje najkraći linkeri 228UUUGU232 i 301UUUUUUUUU307.Za razliku od tipičnih fragmenata rRNA, ovi poveznici bogati uridinom ne namotavaju se niti ostvaruju opsežan kontakt s ribosomskim proteinima.Umjesto toga, usvajaju otapalo otvorene i potpuno razmotane strukture u kojima su lanci rRNA produženi gotovo ravno.Ova istegnuta konformacija objašnjava kako E. cuniculi koristi samo 12 RNA baza da popuni prazninu od 33 Å između H16 i H18 rRNA spirala, dok je drugim vrstama potrebno najmanje dvostruko više rRNA baza da popune prazninu.
Dakle, možemo pokazati da su, energetski nepovoljnim savijanjem, parazitske mikrosporije razvile strategiju kontrakcije čak i onih segmenata rRNA koji ostaju uglavnom očuvani među vrstama u tri domene života.Očigledno, nakupljanjem mutacija koje transformiraju spirale rRNA u kratke poli-U poveznice, E. cuniculi može formirati neobične fragmente rRNA koji sadrže što je moguće manje nukleotida za ligaciju distalnih fragmenata rRNA.Ovo pomaže objasniti kako je mikrosporija postigla dramatično smanjenje svoje osnovne molekularne strukture bez gubitka strukturnog i funkcionalnog integriteta.
Druga neobična značajka rRNA E. cuniculi je pojava rRNA bez zadebljanja (slika 4).Izbočine su nukleotidi bez parova baza koji se izvijaju iz RNA spirale umjesto da se skrivaju u njoj.Većina izbočina rRNA djeluju kao molekularna ljepila, pomažući u vezivanju susjednih ribosomskih proteina ili drugih fragmenata rRNA.Neka od ispupčenja djeluju kao šarke, dopuštajući spirali rRNA da se savije i optimalno savije za produktivnu sintezu proteina 41 .
a Izbočenje rRNA (brojčano S. cerevisiae) nedostaje u strukturi ribosoma E. cuniculi, ali je prisutno u većini drugih eukariota b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens i E. cuniculi unutarnji ribosomi.parazitima nedostaju mnoge drevne, visoko očuvane rRNA izbočine.Ta zadebljanja stabiliziraju strukturu ribosoma;stoga, njihova odsutnost u mikrosporiji ukazuje na smanjenu stabilnost rRNA savijanja u parazitima mikrosporije.Usporedba s P stabljikama (L7/L12 stabljike kod bakterija) pokazuje da se gubitak rRNA izbočina ponekad podudara s pojavom novih izbočina pokraj izgubljenih izbočina.Heliks H42 u 23S/28S rRNA ima drevnu izbočinu (U1206 u Saccharomyces cerevisiae) za koju se procjenjuje da je stara najmanje 3,5 milijarde godina zbog svoje zaštite u tri domene života.Kod mikrosporije se to ispupčenje eliminira.Međutim, uz izgubljeno ispupčenje pojavilo se novo izbočenje (A1306 kod E. cuniculi).
Zapanjujuće, otkrili smo da ribosomima E. cuniculi nedostaje većina rRNA izbočina koja se nalaze u drugim vrstama, uključujući više od 30 izbočina sačuvanih kod drugih eukariota (Slika 4a).Ovaj gubitak eliminira mnoge kontakte između ribosomskih podjedinica i susjednih spirala rRNA, ponekad stvarajući velike šuplje šupljine unutar ribosoma, čineći ribosom E. cuniculi poroznijim u usporedbi s tradicionalnijim ribosomima (Slika 4b).Naime, otkrili smo da je većina tih izbočina također izgubljena u prethodno identificiranim ribosomskim strukturama V. necatrix i P. locustae, koje su previđene prethodnim strukturnim analizama31,32.
Ponekad je gubitak rRNA izbočina popraćen razvojem novih izbočina pored izgubljenog izbočenja.Na primjer, ribosomska P-stabljika sadrži U1208 izbočinu (kod Saccharomyces cerevisiae) koja je preživjela od E. coli do ljudi i stoga se procjenjuje da je stara 3,5 milijardi godina.Tijekom sinteze proteina, ovo izbočenje pomaže stabljici P da se kreće između otvorene i zatvorene konformacije tako da ribosom može regrutirati čimbenike translacije i dostaviti ih na aktivno mjesto.U ribosomima E. cuniculi ovo zadebljanje je odsutno;međutim, novo zadebljanje (G883) koje se nalazi samo u tri para baza može pridonijeti obnovi optimalne fleksibilnosti stabljike P (slika 4c).
Naši podaci o rRNA bez izbočina sugeriraju da minimizacija rRNA nije ograničena na gubitak rRNA elemenata na površini ribosoma, već također može uključivati ​​jezgru ribosoma, stvarajući molekularni defekt specifičan za parazite koji nije opisan u slobodnoživućim stanicama.promatraju se žive vrste.
Nakon modeliranja kanonskih ribosomskih proteina i rRNA, otkrili smo da konvencionalne ribosomske komponente ne mogu objasniti tri dijela cryo-EM slike.Dva od ovih fragmenata male su molekule (slika 5, dopunska slika 8).Prvi segment je stiješnjen između ribosomskih proteina uL15 i eL18 na poziciji koju obično zauzima C-kraj eL18, koji je skraćen u E. cuniculi.Iako ne možemo odrediti identitet ove molekule, veličina i oblik ovog otoka gustoće dobro se objašnjava prisutnošću molekula spermidina.Njegovo vezanje na ribosom je stabilizirano mutacijama specifičnim za mikrosporiju u proteinima uL15 (Asp51 i Arg56), koje izgleda povećavaju afinitet ribosoma za ovu malu molekulu, budući da dopuštaju uL15 da omota malu molekulu u strukturu ribosoma.Dopunska slika 2).8, dodatni podaci 1, 2).
Cryo-EM slika koja pokazuje prisutnost nukleotida izvan riboze vezane na ribosom E. cuniculi.U ribosomu E. cuniculi ovaj nukleotid zauzima isto mjesto kao nukleotid 25S rRNA A3186 (numeracija Saccharomyces cerevisiae) u većini drugih eukariotskih ribosoma.b U ribosomskoj strukturi E. cuniculi, ovaj nukleotid se nalazi između ribosomskih proteina uL9 i eL20, čime se stabilizira kontakt između dva proteina.Analiza očuvanja sekvence cd eL20 među vrstama mikrosporije.Filogenetsko stablo vrsta Microsporidia (c) i višestruko poravnanje sekvenci proteina eL20 (d) pokazuju da su nukleotidni vezni ostaci F170 i K172 očuvani u većini tipičnih Microsporidia, s iznimkom S. lophii, s iznimkom ranog grananja Microsporidia, koji je zadržao ekstenziju ES39L rRNA.e Ova slika pokazuje da su ostaci za vezanje nukleotida F170 i K172 prisutni samo u eL20 genoma visoko reducirane mikrosporije, ali ne i u drugim eukariotima.Sveukupno, ovi podaci sugeriraju da su mikrosporidijanski ribosomi razvili vezno mjesto nukleotida za koje se čini da veže molekule AMP i koristi ih za stabilizaciju interakcija protein-protein u strukturi ribosoma.Visoka očuvanost ovog veznog mjesta u Microsporidia i njegova odsutnost u drugim eukariotima sugerira da bi ovo mjesto moglo omogućiti selektivnu prednost preživljavanja Microsporidia.Prema tome, džep za vezanje nukleotida u ribosomu mikrosporije ne čini se degeneriranom značajkom ili krajnjim oblikom degradacije rRNA kao što je prethodno opisano, već prije korisnom evolucijskom inovacijom koja omogućuje ribosomu mikrosporije da izravno veže male molekule, koristeći ih kao građevne blokove molekule.gradivne jedinice za ribosome.Ovo otkriće čini ribosom mikrosporije jedinim ribosomom za koji se zna da koristi jedan nukleotid kao svoj strukturni građevni element.f Hipotetski evolucijski put izveden iz vezanja nukleotida.
Druga gustoća niske molekularne težine nalazi se na granici između ribosomskih proteina uL9 i eL30 (Sl. 5a).Ovo sučelje je prethodno opisano u strukturi ribosoma Saccharomyces cerevisiae kao vezno mjesto za 25S nukleotid rRNA A3186 (dio ES39L rRNA ekstenzije)38.Pokazalo se da u degeneriranim ribosomima P. locustae ES39L ovo sučelje veže nepoznati pojedinačni nukleotid 31, te se pretpostavlja da je taj nukleotid reducirani konačni oblik rRNA, u kojem je duljina rRNA ~130-230 baza.ES39L se reducira na jedan nukleotid 32.43.Naše cryo-EM slike podržavaju ideju da se gustoća može objasniti nukleotidima.Međutim, veća rezolucija naše strukture pokazala je da je ovaj nukleotid ekstraribosomska molekula, vjerojatno AMP (Sl. 5a, b).
Zatim smo pitali je li se mjesto vezanja nukleotida pojavilo u ribosomu E. cuniculi ili je postojalo ranije.Budući da je vezanje nukleotida uglavnom posredovano ostacima Phe170 i Lys172 u ribosomskom proteinu eL30, procijenili smo očuvanje ovih ostataka u 4396 reprezentativnih eukariota.Kao u gore navedenom slučaju uL15, otkrili smo da su ostaci Phe170 i Lys172 visoko očuvani samo u tipičnoj Microsporidia, ali odsutni u drugim eukariotima, uključujući atipičnu Microsporidia Mitosporidium i Amphiamblys, u kojima fragment ES39L rRNA nije reduciran 44, 45, 46 (Slika 5c).-e).
Uzeti zajedno, ovi podaci podupiru ideju da su E. cuniculi i moguće druge kanonske mikrosporije razvile sposobnost učinkovitog hvatanja velikog broja malih metabolita u strukturi ribosoma kako bi kompenzirale pad razine rRNA i proteina.Čineći to, razvili su jedinstvenu sposobnost vezanja nukleotida izvan ribosoma, pokazujući da parazitske molekularne strukture kompenziraju hvatajući obilje malih metabolita i koristeći ih kao strukturne mimike degradirane RNA i fragmenata proteina..
Treći nesimulirani dio naše cryo-EM karte, pronađen u velikoj ribosomskoj podjedinici.Relativno visoka rezolucija (2,6 Å) naše karte sugerira da ova gustoća pripada proteinima s jedinstvenim kombinacijama velikih ostataka bočnog lanca, što nam je omogućilo da ovu gustoću identificiramo kao prethodno nepoznat ribosomalni protein koji smo identificirali kao Nazvan je msL2 (Microsporidia-specific protein L2) (metode, slika 6).Naše pretraživanje homologije pokazalo je da je msL2 sačuvan u klasu Microsporidia roda Encephaliter i Orosporidium, ali ga nema u drugim vrstama, uključujući druge Microsporidia.U ribosomskoj strukturi, msL2 zauzima prazninu formiranu gubitkom produžene ES31L rRNA.U ovoj praznini, msL2 pomaže stabilizirati presavijanje rRNA i može nadoknaditi gubitak ES31L (Slika 6).
a Elektronska gustoća i model mikrosporidije specifičnog ribosomskog proteina msL2 pronađenog u ribosomima E. cuniculi.b Većina eukariotskih ribosoma, uključujući 80S ribosom Saccharomyces cerevisiae, ima ES19L rRNA pojačanje izgubljeno u većini mikrosporidijanskih vrsta.Prethodno utvrđena struktura ribosoma V. necatrix microsporidia sugerira da je gubitak ES19L kod ovih parazita kompenziran evolucijom novog ribosomskog proteina msL1.U ovoj smo studiji otkrili da je ribosom E. cuniculi također razvio dodatni ribosomalni RNA mimik protein kao prividnu kompenzaciju za gubitak ES19L.Međutim, msL2 (trenutačno označen kao hipotetski protein ECU06_1135) i msL1 imaju različito strukturno i evolucijsko podrijetlo.c Ovo otkriće stvaranja evolucijski nepovezanih ribosomskih proteina msL1 i msL2 sugerira da ako ribosomi akumuliraju štetne mutacije u svojoj rRNA, mogu postići neviđene razine raznolikosti sastava čak i u malom podskupu blisko povezanih vrsta.Ovo otkriće moglo bi pomoći u razjašnjavanju podrijetla i evolucije mitohondrijskog ribosoma, koji je poznat po visoko smanjenoj rRNA i abnormalnoj varijabilnosti u sastavu proteina među vrstama.
Zatim smo usporedili protein msL2 s prethodno opisanim proteinom msL1, jedinim poznatim ribosomskim proteinom specifičnim za mikrosporiju pronađenim u ribosomu V. necatrix.Željeli smo testirati jesu li msL1 i msL2 evolucijski povezani.Naša je analiza pokazala da msL1 i msL2 zauzimaju istu šupljinu u strukturi ribosoma, ali imaju različite primarne i tercijarne strukture, što ukazuje na njihovo nezavisno evolucijsko podrijetlo (slika 6).Stoga naše otkriće msL2 pruža dokaze da skupine kompaktnih eukariotskih vrsta mogu neovisno razviti strukturno različite ribosomske proteine ​​kako bi nadoknadili gubitak fragmenata rRNA.Ovo je otkriće značajno po tome što većina citoplazmatskih eukariotskih ribosoma sadrži nepromjenjivi protein, uključujući istu obitelj od 81 ribosomskog proteina.Pojava msL1 i msL2 u različitim klasovima mikrosporije kao odgovor na gubitak proširenih segmenata rRNA sugerira da degradacija molekularne arhitekture parazita uzrokuje da paraziti traže kompenzacijske mutacije, što može na kraju dovesti do njihovog stjecanja u različitim populacijama parazita.strukture.
Konačno, kada je naš model bio dovršen, usporedili smo sastav ribosoma E. cuniculi s onim predviđenim iz sekvence genoma.Prethodno se smatralo da nekoliko ribosomskih proteina, uključujući eL14, eL38, eL41 i eS30, nedostaju u genomu E. cuniculi zbog očitog odsustva njihovih homologa u genomu E. cuniculi.Gubitak mnogih ribosomskih proteina također se predviđa u većini drugih visoko smanjenih intracelularnih parazita i endosimbionata.Na primjer, iako većina slobodnoživućih bakterija sadrži istu obitelj od 54 ribosomska proteina, samo 11 od tih proteinskih obitelji ima detektabilne homologe u svakom analiziranom genomu bakterija ograničenih na domaćina.U prilog ovoj zamisli, eksperimentalno je uočen gubitak ribosomskih proteina u mikrosporidiji V. necatrix i P. locustae, kojima nedostaju proteini eL38 i eL4131,32.
Međutim, naše strukture pokazuju da su samo eL38, eL41 i eS30 zapravo izgubljeni u ribosomu E. cuniculi.Protein eL14 bio je očuvan i naša je struktura pokazala zašto se ovaj protein nije mogao pronaći u traženju homologije (slika 7).U ribosomima E. cuniculi većina veznog mjesta eL14 izgubljena je zbog degradacije ES39L pojačanog rRNA.U nedostatku ES39L, eL14 je izgubio većinu svoje sekundarne strukture, a samo 18% sekvence eL14 bilo je identično u E. cuniculi i S. cerevisiae.Ovo loše očuvanje sekvence je izvanredno jer čak i Saccharomyces cerevisiae i Homo sapiens - organizmi koji su evoluirali u razmaku od 1,5 milijardi godina - dijele više od 51% istih ostataka u eL14.Ovaj nenormalni gubitak očuvanja objašnjava zašto je E. cuniculi eL14 trenutno označen kao navodni protein M970_061160, a ne kao ribosomski protein eL1427.
i Ribosom Microsporidia izgubio je ekstenziju ES39L rRNA, što je djelomično eliminiralo mjesto vezivanja ribosomskog proteina eL14.U nedostatku ES39L, protein mikrospore eL14 prolazi kroz gubitak sekundarne strukture, u kojoj se bivša α-heliks koja veže rRNA degenerira u petlju minimalne duljine.b Višestruko poravnanje sekvenci pokazuje da je protein eL14 visoko očuvan u eukariotskim vrstama (57% identičnosti sekvenci između homologa kvasca i ljudi), ali je slabo očuvan i divergentan u mikrosporidiji (u kojoj nije više od 24% ostataka identično homologu eL14).od S. cerevisiae ili H. sapiens).Ovo loše očuvanje sekvence i varijabilnost sekundarne strukture objašnjava zašto homolog eL14 nikada nije pronađen u E. cuniculi i zašto se smatra da je ovaj protein izgubljen u E. cuniculi.Nasuprot tome, E. cuniculi eL14 prethodno je označen kao navodni protein M970_061160.Ovo zapažanje sugerira da je raznolikost genoma mikrosporije trenutno precijenjena: neki geni za koje se trenutno smatra da su izgubljeni u mikrosporiji zapravo su sačuvani, iako u visoko diferenciranim oblicima;umjesto toga, za neke se smatra da kodiraju gene mikrosporije za proteine ​​specifične za crve (npr. hipotetski protein M970_061160) koji zapravo kodiraju vrlo različite proteine ​​koji se nalaze u drugim eukariotima.
Ovo otkriće sugerira da denaturacija rRNA može dovesti do dramatičnog gubitka očuvanja sekvence u susjednim ribosomskim proteinima, čineći te proteine ​​neprimjetljivima za traženje homologije.Stoga možemo precijeniti stvarni stupanj molekularne degradacije u organizmima s malim genomom, budući da neki proteini za koje se smatra da su izgubljeni zapravo postoje, iako u vrlo izmijenjenim oblicima.
Kako paraziti mogu zadržati funkciju svojih molekularnih strojeva u uvjetima ekstremne redukcije genoma?Naša studija odgovara na ovo pitanje opisujući složenu molekularnu strukturu (ribosom) E. cuniculi, organizma s jednim od najmanjih eukariotskih genoma.
Već je gotovo dva desetljeća poznato da se molekule proteina i RNA u mikrobnim parazitima često razlikuju od svojih homolognih molekula u slobodnoživućim vrstama jer im nedostaju centri za kontrolu kvalitete, smanjene su na 50% svoje veličine u slobodnoživućim mikrobima itd.mnoge iscrpljujuće mutacije koje oštećuju savijanje i funkcioniranje.Na primjer, očekuje se da ribosomima organizama s malim genomom, uključujući mnoge intracelularne parazite i endosimbionte, nedostaje nekoliko ribosomskih proteina i do jedne trećine nukleotida rRNA u usporedbi sa slobodnoživućim vrstama 27, 29, 30, 49. Međutim, način na koji te molekule funkcioniraju u parazitu ostaje uglavnom misterij, proučavan uglavnom putem komparativne genomike.
Naša studija pokazuje da struktura makromolekula može otkriti mnoge aspekte evolucije koje je teško izdvojiti iz tradicionalnih komparativnih genomskih studija intracelularnih parazita i drugih organizama kojima je domaćin ograničen (Dopunska slika 7).Na primjer, primjer proteina eL14 pokazuje da možemo precijeniti stvarni stupanj degradacije molekularnog aparata kod parazitskih vrsta.Danas se vjeruje da encefalitični paraziti imaju stotine gena specifičnih za mikrosporiju.Međutim, naši rezultati pokazuju da su neki od ovih naizgled specifičnih gena zapravo samo vrlo različite varijante gena koji su uobičajeni kod drugih eukariota.Štoviše, primjer proteina msL2 pokazuje kako previđamo nove ribosomske proteine ​​i podcjenjujemo sadržaj parazitskih molekularnih strojeva.Primjer malih molekula pokazuje kako možemo previdjeti najgenijalnije inovacije u parazitskim molekularnim strukturama koje im mogu dati novu biološku aktivnost.
Uzeti zajedno, ovi rezultati poboljšavaju naše razumijevanje razlika između molekularnih struktura organizama ograničenih domaćina i njihovih parnjaka u organizmima koji žive slobodno.Pokazujemo da molekularni strojevi, za koje se dugo smatralo da su reducirani, degenerirani i podložni raznim iscrpljujućim mutacijama, umjesto toga imaju skup sustavno zanemarenih neobičnih strukturnih značajki.
S druge strane, neglomazni fragmenti rRNA i spojeni fragmenti koje smo pronašli u ribosomima E. cuniculi sugeriraju da smanjenje genoma može promijeniti čak i one dijelove osnovnog molekularnog stroja koji su sačuvani u tri domene života – nakon gotovo 3,5 milijarde godina.nezavisna evolucija vrsta.
Fragmenti rRNA bez ispupčenja i spojeni fragmenti rRNA u ribosomima E. cuniculi od posebnog su interesa u svjetlu prethodnih studija molekula RNA u endosimbiotskim bakterijama.Na primjer, kod endosimbionta lisne uši Buchnera aphidicola, pokazalo se da molekule rRNA i tRNA imaju strukture osjetljive na temperaturu zbog pristranosti sastava A+T i visokog udjela nekanonskih parova baza20,50.Smatra se da su ove promjene u RNK, kao i promjene u proteinskim molekulama, odgovorne za pretjeranu ovisnost endosimbionta o partnerima i nemogućnost endosimbionta da prenose toplinu 21, 23 .Iako rRNA parazitske mikrosporije ima strukturno različite promjene, priroda tih promjena sugerira da smanjena toplinska stabilnost i veća ovisnost o proteinima šaperona mogu biti zajedničke značajke molekula RNA u organizmima sa smanjenim genomima.
S druge strane, naše strukture pokazuju da su mikrosporidije parazita razvile jedinstvenu sposobnost da se odupru široko očuvanoj rRNA i fragmentima proteina, razvijajući sposobnost korištenja obilnih i lako dostupnih malih metabolita kao strukturnog oponašanja degeneriranih fragmenata rRNA i proteina.Degradacija molekularne strukture..Ovo mišljenje podupire činjenica da se male molekule koje nadoknađuju gubitak fragmenata proteina u rRNA i ribosomima E. cuniculi vežu na ostatke specifične za mikrosporiju u proteinima uL15 i eL30.Ovo sugerira da bi vezanje malih molekula na ribosome moglo biti proizvod pozitivne selekcije, u kojoj su mutacije specifične za mikrosporidije u ribosomskim proteinima odabrane zbog njihove sposobnosti da povećaju afinitet ribosoma za male molekule, što može dovesti do učinkovitijih ribosomskih organizama.Ovo otkriće otkriva pametnu inovaciju u molekularnoj strukturi mikrobnih parazita i daje nam bolje razumijevanje kako molekularne strukture parazita održavaju svoju funkciju unatoč reduktivnoj evoluciji.
Trenutno je identifikacija ovih malih molekula nejasna.Nije jasno zašto se izgled ovih malih molekula u strukturi ribosoma razlikuje među vrstama mikrosporije.Konkretno, nije jasno zašto se vezanje nukleotida opaža u ribosomima E. cuniculi i P. locustae, a ne u ribosomima V. necatrix, unatoč prisutnosti ostatka F170 u proteinima eL20 i K172 V. necatrix.Ovo brisanje može biti uzrokovano ostatkom 43 uL6 (koji se nalazi u blizini džepa za vezanje nukleotida), koji je tirozin u V. necatrix, a ne treonin u E. cuniculi i P. locustae.Glomazni aromatski bočni lanac Tyr43 može ometati vezanje nukleotida zbog steričkog preklapanja.Alternativno, očito brisanje nukleotida može biti posljedica niske rezolucije cryo-EM snimanja, što ometa modeliranje fragmenata ribosoma V. necatrix.
S druge strane, naš rad sugerira da proces raspadanja genoma može biti inventivna sila.Konkretno, struktura ribosoma E. cuniculi sugerira da gubitak rRNA i fragmenata proteina u ribosomu mikrosporije stvara evolucijski pritisak koji potiče promjene u strukturi ribosoma.Ove se varijante pojavljuju daleko od aktivnog mjesta ribosoma i čini se da pomažu u održavanju (ili obnavljanju) optimalnog sklopa ribosoma koji bi inače bio poremećen smanjenom rRNA.Ovo sugerira da se čini da je glavna inovacija ribosoma mikrosporije evoluirala u potrebu za prigušivanjem genskog drifta.
Možda to najbolje ilustrira vezivanje nukleotida, koje do sada nije uočeno kod drugih organizama.Činjenica da su ostaci za vezanje nukleotida prisutni u tipičnoj mikrosporiji, ali ne i kod drugih eukariota, sugerira da mjesta za vezanje nukleotida nisu samo ostaci koji čekaju da nestanu ili konačno mjesto za rRNA koja se vraća u oblik pojedinačnih nukleotida.Umjesto toga, ova se stranica čini kao korisna značajka koja se mogla razviti tijekom nekoliko rundi pozitivne selekcije.Mjesta vezanja nukleotida mogu biti nusproizvod prirodne selekcije: nakon što se ES39L razgradi, mikrosporidije su prisiljene tražiti kompenzaciju kako bi obnovile optimalnu biogenezu ribosoma u nedostatku ES39L.Budući da ovaj nukleotid može oponašati molekularne kontakte nukleotida A3186 u ES39L, molekula nukleotida postaje građevni blok ribosoma, čije se vezanje dodatno poboljšava mutacijom sekvence eL30.
S obzirom na molekularnu evoluciju intracelularnih parazita, naša studija pokazuje da sile Darwinove prirodne selekcije i genetski drift propadanja genoma ne djeluju paralelno, već osciliraju.Prvo, genetski drift eliminira važna svojstva biomolekula, čineći kompenzaciju prijeko potrebnom.Tek kada paraziti zadovolje ovu potrebu kroz Darwinovu prirodnu selekciju, njihove će makromolekule imati priliku razviti svoje najimpresivnije i najinovativnije osobine.Važno je da evolucija veznih mjesta nukleotida u ribosomu E. cuniculi sugerira da ovaj obrazac molekularne evolucije od gubitka do dobitka ne samo da amortizira štetne mutacije, već ponekad daje posve nove funkcije parazitskim makromolekulama.
Ova je ideja u skladu s teorijom pokretne ravnoteže Sewella Wrighta, koja tvrdi da strogi sustav prirodne selekcije ograničava sposobnost organizama da inoviraju51,52,53.Međutim, ako genetski pomak poremeti prirodnu selekciju, ti pomaci mogu proizvesti promjene koje same po sebi nisu prilagodljive (ili čak štetne), već vode do daljnjih promjena koje osiguravaju veću sposobnost ili novu biološku aktivnost.Naš okvir podupire ovu ideju ilustrirajući da se ista vrsta mutacije koja smanjuje nabor i funkciju biomolekule čini glavnim okidačem za njezino poboljšanje.U skladu s evolucijskim modelom u kojem svi pobjeđuju, naša studija pokazuje da je propadanje genoma, koje se tradicionalno smatra degenerativnim procesom, također glavni pokretač inovacija, ponekad, a možda čak i često, dopuštajući makromolekulama da steknu nove parazitske aktivnosti.može ih koristiti.