Usvajanje i distribucija hranjivih tvari integriraju hranjenje insekata i karakteristike životnog ciklusa. Kako bi nadoknadili nedostatke specifičnih hranjivih tvari u različitim životnim fazama, insekti mogu dobiti te hranjive tvari putem dopunske prehrane, na primjer, hranjenjem izlučevinama kralježnjaka u procesu poznatom kao lokve. Čini se da je komarac Anopheles arabiani pothranjen i stoga mu trebaju hranjive tvari i za metabolizam i za reprodukciju. Cilj ove studije bio je procijeniti poboljšava li agitacija An. arabiensis na kravljem urinu radi usvajanja hranjivih tvari karakteristike životnog ciklusa.
Pobrinite se da je sigurno. arabiensis je privukao miris svježeg, 24-satnog, 72-satnog i 168 sati starog kravljeg urina, a ženke koje traže domaćina i hranjene krvlju (48 sati nakon obroka krvi) mjerene su u Y-cijevi olfaktometra, a gravidne ženke procijenjene su za test mriještenja. Zatim je korištena kombinirana kemijska i elektrofiziološka analiza za identifikaciju bioaktivnih spojeva u kravljem urinu u sve četiri dobne skupine. Sintetičke smjese bioaktivnih spojeva procijenjene su u Y-cijevi i terenskim pokusima. Kako bi se istražio kravlji urin i njegov glavni spoj koji sadrži dušik, urea, kao potencijalne dodatne prehrane za vektore malarije, izmjereni su parametri hranjenja i karakteristike životnog ciklusa. Procijenjen je udio ženki komaraca i količina apsorbiranog kravljeg urina i uree. Nakon hranjenja, ženke su procijenjene na preživljavanje, let u privezanom položaju i reprodukciju.
Tražiti krv i hranu domaćina. U laboratorijskim i terenskim studijama, Arape je privukao prirodni i sintetički miris svježeg i starog kravljeg urina. Gravidne ženke bile su ravnodušne prema reakcijama kravljeg urina na mjestima mriještenja. Ženke koje traže domaćina i sišu krv aktivno apsorbiraju kravlji urin i ureu te raspoređuju te resurse prema kompromisima tijekom životnog ciklusa kao funkciju fiziološkog stanja za let, preživljavanje ili reprodukciju.
Anopheles arabinis prikuplja i distribucija kravljeg urina radi poboljšanja karakteristika životnog ciklusa. Dodatno hranjenje kravljim urinom izravno utječe na kapacitet vektora povećanjem dnevnog preživljavanja i gustoće vektora, a neizravno promjenom aktivnosti leta te bi stoga trebalo uzeti u obzir u budućim modelima.
Prikupljanje i distribucija hranjivih tvari integrira karakteristike ishrane insekata i životnog ciklusa [1,2,3]. Insekti su sposobni birati i nabaviti hranu te provoditi kompenzacijsko hranjenje na temelju dostupnosti hrane i potreba za hranjivim tvarima [1, 3]. Distribucija hranjivih tvari ovisi o životnom ciklusu i može dovesti do različitih zahtjeva za kvalitetom i količinom prehrane u različitim životnim fazama insekata [1, 2]. Kako bi nadoknadili nedostatke specifičnih hranjivih tvari, insekti ih mogu dobiti dopunskim hranjenjem, poput blata, raznih izmeta i sekreta kralježnjaka te strvina, proces poznat kao lokve [2]. Iako je prvenstveno opisan niz vrsta leptira i moljaca, pojilišta se javljaju i u drugim redovima insekata, a privlačenje i hranjenje ovim vrstama resursa može imati značajan utjecaj na zdravlje i druge životne karakteristike [2, 4, 5, 6],7]. Malarijski komarac Anopheles gambiae sensu lato (sl) pojavljuje se kao 'pothranjena' odrasla jedinka [8], pa zalijevanje može igrati važnu ulogu u njegovim životnim karakteristikama, ali to je ponašanje do sada bilo zanemareno. Korištenje agitacije kao sredstva za povećanje unosa hranjivih tvari u ovom važnom vozilu zaslužuje pozornost jer može imati važne epidemiološke posljedice.
Unos dušika kod odraslih ženki komaraca Anopheles ograničen je zbog niskih kalorijskih rezervi koje nose iz larvalne faze i neučinkovitog korištenja krvnog brašna [9]. Ženka Ann.gambiae sl obično to kompenzira dopunjavanjem dopunskim krvnim obrocima [10, 11], čime se više ljudi dovodi u rizik od zaraze bolešću, a komarci u veći rizik od predatora. Alternativno, komarci mogu koristiti dopunsko hranjenje izlučevinama kralježnjaka kako bi stekli dušične spojeve koji poboljšavaju prilagodbu i sposobnost leta, kao što su pokazali drugi kukci [2]. U tom smislu, zanimljiva je snažna i izrazita privlačnost jedne od srodnih vrsta unutar gambijskog kompleksa vrsta sl, Anopheles arabinis, svježeg i odležanog kravljeg urina [12,13,14]. Anopheles arabinis je oportunistički u svojim preferencijama domaćina i poznato je da se povezuje sa stokom i hrani se njome. Kravlji urin je resurs bogat dušičnim spojevima, pri čemu urea čini 50-95% ukupnog dušika u svježem urinu [15, 16]. Kako kravlji urin stari, Mikroorganizmi koriste te resurse za smanjenje složenosti dušičnih spojeva unutar 24 sata [15]. S brzim porastom amonijaka, povezanim sa smanjenjem organskog dušika, napreduju alkalofilni mikroorganizmi (od kojih mnogi proizvode spojeve otrovne za komarce) [15], što može biti ženka Ann.arabiensis koju preferira urin star 24 sata ili manje [13, 14].
U ovoj studiji traženi su domaćini i An hranjeni krvlju. Tijekom svog prvog ciklusa gonadotropina, arabiensis je procijenjen na stjecanje dušičnih spojeva, uključujući ureu, miješanjem urina. Zatim je proveden niz eksperimenata kako bi se procijenilo kako ženke komaraca raspoređuju ovaj potencijalni hranjivi resurs za poboljšano preživljavanje, reprodukciju i daljnje traženje hrane. Konačno, procijenjen je miris svježeg i starog kravljeg urina kako bi se utvrdilo pružaju li oni pouzdane tragove za domaćina i An hranjene krvlju. U svojoj potrazi za ovim potencijalnim hranjivim resursom, arabiensis je otkrio kemijske korelacije iza uočene različite privlačnosti. Sintetičke mješavine mirisa hlapljivih organskih spojeva (VOC) identificirane u 24-satnom urinu dalje su procijenjene u terenskim uvjetima, proširujući rezultate dobivene u laboratorijskim uvjetima i pokazujući učinak mirisa goveđeg urina na različita fiziološka stanja. Privlačnost komaraca. Dobiveni rezultati potvrđuju da An arabiensis stječe i distribuira dušične spojeve pronađene u urinu kralježnjaka kako bi utjecao na karakteristike životnog ciklusa. Ovi rezultati se raspravljaju u kontekstu potencijalnih epidemioloških posljedica i kako se mogu koristiti za nadzor i kontrolu vektora.
Anopheles arabicans (soj Dongola) držane su na temperaturi od 25 ± 2 °C, 65 ± 5% relativne vlažnosti i ciklusu svjetlo:tama od 12:12 sati. Ličinke su uzgajane u plastičnim posudama (20 cm × 18 cm × 7 cm) napunjenim destiliranom vodom i hranjene hranom za ribe Tetramin® (Tetra Werke, Melle, Njemačka). Kukuljice su sakupljene u čašice od 30 ml (Nolato Hertila, Åstorp, Švedska), a zatim prebačene u Bugdorm kaveze (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Tajvan) kako bi se omogućilo izlijeganje odraslih individua. Odraslim individuama je opskrbljivana 10%-tna otopina saharoze ad libitum do 4 dana nakon izlijeganja (dpe), nakon čega je ženkama koje traže domaćina ponuđena prehrana neposredno prije pokusa ili su izgladnjivane preko noći s destiliranom vodom prije pokusa, kako je opisano u nastavku. Ženke korištene za pokuse s letnim cijevima izgladnjivane su samo 4-6 sati s vodom ad libitum. Kako bi se komarci koji sišu krv za naknadne biološke testove, 4 dpe ženke su dobile defibrotičnu ovčju krv (Håtunalab, Bro, SE) korištenjem membranskog sustava hranjenja (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK). Potpuno preopterećene ženke su zatim prebačene u pojedinačne kaveze i izravno su im davana prehrana, kako je opisano u nastavku, ili 10%-tna saharoza ad libitum tijekom 3 dana prije dolje opisanih eksperimenata. Potonje ženke su korištene za biološke testove u letnim cijevima i prebačene u laboratorij, a zatim su primale destiliranu vodu ad libitum tijekom 4-6 sati prije eksperimenta.
Testovi hranjenja korišteni su za kvantificiranje konzumacije urina i uree kod odraslih ženki An.Arab. Ženke koje traže domaćina i hranjene krvlju dobivale su prehranu koja je sadržavala 1% razrijeđenog svježeg i odležanog kravljeg urina, različite koncentracije uree i dvije kontrole (10% saharoze i vode) tijekom 48 sati. Osim toga, u prehranu je dodana prehrambena boja (1 mg ml-1 ksilen cijanid FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) i isporučena u matrici 4 × 4 u mikrocentrifugalnim epruvetama od 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, SAD; Slika 1A) Napunite do ruba (~300 µl). Kako biste izbjegli konkurenciju između komaraca i potencijalne učinke boje, stavite 10 komaraca u veliku Petrijevu zdjelicu (promjera 12 cm i visine 6 cm; Semadeni, Ostermundigen, CH; Slika 1A) u potpunom mraku na 25 ± 2 cm °C i relativne vlažnosti od 65 ± 5%. Ovi eksperimenti ponovljeni su 5 do 10 puta. Nakon izlaganja prehrani, komarci su smješteni na -20 °C do daljnje analize.
Tražite goveđi urin i ureu koje apsorbiraju domaćin i ženka Anopheles arabianus koja siše krv. U pokusu hranjenja (A), ženkama komaraca dana je prehrana koja se sastojala od svježeg i odležanog kravljeg urina, različitih koncentracija uree, saharoze (10%) i destilirane vode (H2O). Ženke koje traže domaćina (B) i ženke koje se hrane krvlju (C) apsorbirale su više saharoze od bilo koje druge testirane prehrane. Imajte na umu da su ženke koje traže domaćina apsorbirale 72-satni kravlji urin manje od 168-satnog kravljeg urina (B). Prosječni ukupni sadržaj dušika (± standardna devijacija) urina prikazan je na umetku. Ženke koje traže domaćina (D, F) i ženke koje sišu krv (E, G) unose ureu na način ovisan o dozi. Prosječni udahnuti volumeni (D, E) s različitim slovima značajno su se razlikovali jedni od drugih (jednosmjerna ANOVA korištenjem Tukeyjeve post hoc analize; p < 0,05). Trake pogreške predstavljaju standardnu ​​pogrešku srednje vrijednosti (BE). Ravna isprekidana linija predstavlja logaritamsko-linearnu regresijsku liniju (F, G).
Kako bi se oslobodila apsorbirana hrana, komarci su pojedinačno stavljeni u mikrocentrifugalne epruvete od 1,5 ml koje su sadržavale 230 µl destilirane vode, a tkivo je razdvojeno pomoću jednokratnog tučka i bežičnog motora (VWR International, Lund, SE), nakon čega je slijedilo centrifugiranje pri 10 krpm tijekom 10 minuta. Supernatant (200 µl) prenesen je na mikroploču s 96 jažica (Sigma-Aldrich) i apsorbancija (λ620) određena je pomoću čitača mikroploča na bazi spektrofotometra (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm. Alternativno, komarci su samljeveni u 1 ml destilirane vode, od čega je 900 µl preneseno u kivetu za spektrofotometrijsku analizu (λ620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Za kvantificiranje unosa hranom, standardna krivulja je pripremljena serijskim razrjeđivanjem kako bi se dobilo 0,2 µl do 2,4 µl ksilena koncentracije 1 mg ml-1. cijanid. Zatim je optička gustoća poznatih koncentracija boje korištena za određivanje količine hrane koju je svaki komarac progutao.
Podaci o volumenu analizirani su jednosmjernom analizom varijance (ANOVA), nakon čega su uslijedile Tukeyjeve post hoc parne usporedbe (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, SAD, 1989.–2007.). Linearne regresijske analize opisale su unos uree ovisan o koncentraciji i usporedile odgovore između komaraca koji traže domaćina i komaraca koji sišu krv (GraphPad Prism v8.0.0 za Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, SAD).
Otprilike 20 µl uzoraka urina iz svake dobne skupine vezano je na Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) i enkapsulirano u limene kapsule (8 mm × 5 mm). Kapsule su umetnute u komoru za izgaranje CHNS/O analizatora (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) kako bi se odredio sadržaj dušika u svježem i starom urinu prema protokolu proizvođača. Ukupni dušik (g N l-1) kvantificiran je na temelju poznatih koncentracija uree korištenih kao standard.
Kako bi se procijenio učinak prehrane na preživljavanje ženki koje traže domaćina i sišu krv, komarci su pojedinačno smješteni u velike Petrijeve zdjelice (promjera 12 cm i visine 6 cm; Semadeni) s rupom prekrivenom mrežicom u poklopcu (promjera 3 cm) s filterom za ventilaciju i opskrbu hranom. Prehrana je dana neposredno nakon 4 dana nakon otvaranja usta i uključivala je 1% razrijeđenog svježeg i odležanog kravljeg urina, četiri koncentracije uree i dvije kontrole, 10% saharoze i vode. Svaka prehrana je pipetirana na zubni tampon (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) umetnut u špricu od 5 ml (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, SE), klip je uklonjen i postavljen na vrh Petrijeve zdjelice (slika 1).1A). Mijenjajte prehranu svaki dan. Održavajte laboratorij kako je gore opisano. Preživjeli komarci brojani su dva puta dnevno, dok su mrtvi komarci odbačeni dok posljednji komarac nije uginuo (n = 40 po tretmanu). Preživljavanje komaraca hranjenih različitim prehranama statistički je analizirano pomoću Kaplan-Meyerovih krivulja preživljavanja i log-rank testova. usporediti distribuciju preživljavanja između dijeta (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Prilagođeni leteći mlin za komarce prema Attisanu i suradnicima [17], izrađen od prozirnih akrilnih ploča debljine 5 mm (10 cm širine x 10 cm duljine x 10 cm visine) bez prednje i stražnje ploče (slika 3: gore). Zglobni sklop s vertikalnom cijevi izrađenom od plinske kromatografske kolone (0,25 mm unutarnji promjer; 7,5 cm duljine) s krajevima zalijepljenim za iglu za insekte obješenu između para neodimskih magneta udaljenih 9 cm. Horizontalna cijev izrađena od istog materijala (6,5 cm duljine) prepolovila je vertikalnu cijev kako bi formirala privezanu ruku i ruku koja je nosila mali komad aluminijske folije kao signal za prekid svjetlosti.
Ženke izgladnjele 24 sata hranjene su gore navedenom prehranom 30 minuta prije obuzdavanja. Potpuno nahranjene ženke komaraca zatim su pojedinačno anestezirane na ledu 2-3 minute i pričvršćene na igle za kukce pčelinjim voskom (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE), a zatim vezane za krakove horizontalnih cijevi. Leteći mlin. Broj okretaja po letu zabilježen je posebno izrađenim zapisivačem podataka, a zatim pohranjen i prikazan pomoću softvera PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Leteći mlin smješten je u prostoriju s reguliranom klimom (12 h:12 h, svjetlo:tama, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% relativne vlažnosti).
Kako bi se vizualizirao obrazac aktivnosti leta, izračunata je ukupna preletena udaljenost (m) i ukupan broj uzastopnih aktivnosti leta po satu tijekom 24-satnog razdoblja. Osim toga, prosječne preletene udaljenosti pojedinačnih ženki uspoređene su među tretmanima i analizirane korištenjem jednosmjerne ANOVA i Tukeyjeve post hoc analize (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), gdje se prosječna udaljenost smatrala zavisnom varijablom, dok je tretman neovisni faktor. Osim toga, prosječan broj rundi izračunava se u koracima od 10 minuta.
Kako bi se procijenio učinak prehrane na reproduktivne performanse An.arabiensis, šest ženki (4 dpe) prebačeno je izravno u Bugdorm kaveze (30 cm × 30 cm × 30 cm) nakon uzimanja krvi, a zatim im je obezbijeđena eksperimentalna prehrana tijekom 48 sati kako je gore opisano. Prehrana je zatim uklonjena, a trećeg dana obezbijeđene su posude za mriješćenje (30 ml; Nolato Hertila) napunjene s 20 ml destilirane vode tijekom 48 sati, mijenjajući ih svaka 24 sata. Svaki režim prehrane ponovite 20-50 puta. Jaja su prebrojana i zabilježena za svaki eksperimentalni kavez. Poduzorci jaja korišteni su za procjenu srednje veličine i varijacije duljine pojedinačnih jaja (n ≥ 200 po prehrani) pomoću mikroskopa Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, Njemačka) opremljenog Leica kamerom (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., Njemačka). Preostala jaja držana su u klimatiziranoj prostoriji pod standardnim uvjetima uzgoja tijekom 24 sata, a poduzorak nedavno izlijeganih ličinki prvog stadija (n ≥ 200 po prehrani) izmjeren je kako je gore opisano. Broj jaja te veličina jaja i ličinki uspoređeni su između tretmana korištenjem jednosmjerne ANOVA i Tukeyjeve post hoc analize (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Hlapljive tvari iz svježeg (1 sat nakon uzorkovanja), urina odležanog 24 sata, 72 sata i 168 sati prikupljene su iz uzoraka prikupljenih od goveda pasmine Zebu i Arsi. Radi praktičnosti, uzorci urina prikupljeni su rano ujutro dok su krave još bile u štali. Uzorci urina prikupljeni su od 10 jedinki i 100-200 ml svakog uzorka prebačeno je u pojedinačne poliamidne vrećice za pečenje (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, Njemačka) u 3 l poliamidnim bačvama s poklopcem u plastičnim bačvama od vinilklorida. Hlapljive tvari iz svakog uzorka goveđeg urina prikupljene su izravno (svježe) ili nakon zrenja na sobnoj temperaturi tijekom 24 sata, 72 sata i 168 sati, tj. svaki uzorak urina bio je reprezentativan za svaku dobnu skupinu.
Za prikupljanje hlapljivih tvari iz prostora iznad tekućine korišten je sustav zatvorene petlje za cirkulaciju plina filtriranog aktivnim ugljenom (100 ml min-1) kroz poliamidnu vrećicu do adsorpcijske kolone tijekom 2,5 sata pomoću dijafragmalne vakuumske pumpe (KNF Neuberger, Freiburg, Njemačka). Kao kontrola, prikupljanje iz prostora iznad tekućine provedeno je iz prazne poliamidne vrećice. Adsorpcijska kolona izrađena je od teflonske cijevi (5,5 cm x 3 mm unutarnji promjer) koja sadrži 35 mg Porapaka Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, SAD) između čepova od staklene vune. Prije upotrebe, kolona je isprana s 1 ml redestiliranog n-heksana (Merck, Darmstadt, Njemačka) i 1 ml pentana (99,0% čistoće, otapalo GC kvalitete, Sigma Aldrich). Adsorbirane hlapljive tvari eluirane su s 400 μl pentana. Sakupljene tvari iz prostora iznad tekućine skupljene su i pohranjene na -20°C do daljnje analize.
Bihevioralne reakcije komaraca An koji traže domaćina i jedu krv. Hlapljivi ekstrakti u headspace prostoru prikupljeni iz svježeg, 24-satnog, 72-satnog i 168-satnog urina analizirani su na hlapljive ekstrakte komaraca Arabidopsis pomoću ravne staklene cijevi olfaktometara [18]. Eksperimenti su provedeni tijekom ZT 13-15, vrhunca Anove aktivnosti traženja doma. Arab [19]. Staklena cijev olfaktometar (80 cm × 9,5 cm unutarnji promjer) osvijetljena je s 3 ± 1 lx crvenog svjetla odozgo. Protok zraka filtriran ugljenom i ovlažen (25 ± 2 °C, 65 ± 2% relativne vlažnosti) prošao je biotest pri 30 cm s-1. Zrak se propušta kroz niz mrežastih sita od nehrđajućeg čelika, stvarajući laminarni tok i jednoliku strukturu perjanice. Dozator za zubne tampone (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), obješen na zavojnicu od 5 cm na kraju okrenutom prema vjetru olfaktometrom, s promjenom stimulatora svakih 5 minuta. Za analizu je kao stimulus korišteno 10 μl svakog ekstrakta iz prostora iznad površine tijela, razrijeđenog 1:10. Jednaka količina pentana korištena je kao kontrola. Pojedinačni komarci koji traže domaćina ili sišu krv smješteni su u pojedinačne kaveze za puštanje 2-3 sata prije početka eksperimenta. Kavez za puštanje postavljen je na stranu olfaktometra niz vjetar, a komarci su se aklimatizirali 1 minutu, a zatim je otvoren leptir ventil kaveza za puštanje. Privlačnost prema tretmanu ili kontroli analizirana je kao udio komaraca koji su došli u kontakt s izvorom unutar 5 minuta od puštanja. Svaki hlapljivi ekstrakt iz prostora iznad površine tijela i kontrola replicirani su najmanje 30 puta, a kako bi se izbjegli učinci bilo kojeg dana, isti broj tretmana i kontrola testiran je svakog eksperimentalnog dana. Odgovori na traženje od domaćina i krvlju hranjenih Ans. Skupovi arapski u odnosu na skupove iz prostora iznad površine tijela analizirani su korištenjem nominalne logističke regresije, nakon čega su uslijedile parne usporedbe za omjere neparnih vrijednosti (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institut Inc.).
Anov odgovor na mrijest. Ekstrakti iz svježeg i odležanog kravljeg urina analizirani su u Bugdorm kavezima (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Plastične čašice (30 mL; Nolato Hertila) napunjene s 20 mL destilirane vode služile su kao supstrat za mrijest i postavljene su u suprotne kutove kaveza, udaljene 24 cm. Čašice za tretman prilagođene su s 10 μl svakog ekstrakta iz prostog prostora u razrjeđenju 1:10. Za podešavanje kontrolne čašice korištena je jednaka količina pentana. Čašice za tretman i kontrolne čašice zamijenjene su između svakog eksperimenta kako bi se kontrolirali učinci položaja. Deset ženki hranjenih krvlju pušteno je u eksperimentalne kaveze u ZT 9-11, a jaja u čašicama prebrojana su 24 sata kasnije. Formula za izračun indeksa mrijesta je: (broj jaja položenih u čašicu za tretman – broj jaja položenih u kontrolnu čašicu) / (ukupan broj položenih jaja). Svaki tretman ponovljen je 8 puta.
Analiza ženke An.arabiensis plinskom kromatografijom i detekcijom uzoraka elektronske antene (GC-EAD) provedena je kako je prethodno opisano [20]. Ukratko, svježi hlapljivi ekstrakti iz prostora iznad pare odvojeni su pomoću Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, SAD) opremljenog HP-5 kolonom (30 m × 0,25 mm un. promjera, debljina filma 0,25 μm, Agilent Technologies). i starenje urina. Vodik je korišten kao mobilna faza s prosječnom linearnom brzinom protoka od 45 cm s-1. Svaki uzorak (2 μl) ubrizgavan je 30 sekundi u načinu rada bez podjele s ulaznom temperaturom od 225 °C. Temperatura GC pećnice programirana je od 35 °C (zadržavanje 3 minute) do 300 °C (zadržavanje 10 minuta) pri 10 °C min-1. U razdjelniku efluenta GC-a dodano je 4 psi dušika i podijeljeno 1:1 u Gerstel 3D/2 križu s malim mrtvim volumenom (Gerstel, Mülheim, Njemačka) između detektora ionizacije plamena i EAD-a. Kapilara efluenta GC-a za EAD propuštena je kroz Gerstel ODP-2 prijenosnu liniju, koja prati temperaturu GC pećnice plus 5 °C, u staklenu cijev (10 cm × 8 mm), gdje je pomiješana s ugljikom filtriranim, ovlaženim zrakom (1,5 l min-1). Antena je postavljena 0,5 cm od izlaz cijevi. Svaki pojedinačni komarac predstavljao je jednu replikaciju, a za komarce koji traže domaćina provedena su najmanje tri ponavljanja na uzorcima urina svake dobi.
Identifikacija bioaktivnih spojeva u headspace kolekcijama svježeg i odležanog goveđeg urina korištenjem kombiniranog GC i masenog spektrometra (GC-MS; 6890 GC i 5975 MS; Agilent Technologies) za izazivanje antenskih odgovora u GC-EAD analizi, radeći u modu ionizacije elektronskim udarom na 70 eV. GC je bio opremljen HP-5MS UI-obloženom kapilarnom kolonom od taljenog silicija (unutarnji promjer 60 m × 0,25 mm, debljina filma 0,25 μm) korištenjem helija kao mobilne faze s prosječnom linearnom brzinom protoka od 35 cm s-1. Uzorak od 2 μl je ubrizgan korištenjem istih postavki injektora i temperature pećnice kao za GC-EAD analizu. Spojevi su identificirani na temelju njihovog vremena zadržavanja (Kovátov indeks) i masenih spektara u usporedbi s prilagođenom bibliotekom i NIST14 bibliotekom (Agilent). Identificirani spojevi su potvrđeni ubrizgavanjem autentičnih standarda (Dodatna datoteka 1: Tablica S2). Za kvantifikaciju, heptil acetat (10 ng, Kao vanjski standard ubrizgan je 99,8% kemijske čistoće, Aldrich).
Procjena učinkovitosti sintetičke mješavine mirisa koja se sastoji od bioaktivnih spojeva identificiranih u svježem i ostarjelom urinu za privlačenje Ans.arabiensis koji traži domaćina i siše krv, korištenjem istog olfaktometra i protokola kao gore. Sintetičke mješavine oponašale su sastav i udjele spojeva u miješanim hlapljivim ekstraktima svježeg, 24-satnog, 48-satnog, 72-satnog i 168-satnog urina (Slika 5D-G; Dodatna datoteka 1: Tablica S2). Za analizu, koristite 10 μl razrjeđenja 1:100 potpuno sintetičke mješavine, s ukupnom brzinom oslobađanja u rasponu od približno 140-2400 ng h-1, za procjenu privlačnosti za domaćina i komarce koji sišu krv. Nakon toga, test se provodi na potpunim mješavinama, u kojima se uklanjaju subtraktivne mješavine pojedinačnih spojeva potpune mješavine. Tražite odgovore od domaćina i Ans.arabiensis koji se hrani krvlju. Arab u odnosu na sintetičke i subtraktivne mješavine analizirani su korištenjem nominalne logističke regresije, nakon čega slijede parne usporedbe za omjere neparnih vrijednosti (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institut Inc.).
Kako bi se procijenilo može li kravlji urin poslužiti kao znak za stanište domaćina za malarijska komaraca, svježi i stari kravlji urin, prikupljen kako je gore opisano, i voda stavljeni su u mrežaste kante od 3 l (100 ml) i postavljeni u klopke s mamcima za domaćine (BG-HDT verzija; BioGents, Regensburg, Njemačka). Deset klopki postavljeno je 50 m udaljeno na pašnjaku, 400 m od seoske zajednice (Silay, Etiopija, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) i bez stoke, na stalnim uzgajalištima i selima. Pet klopki zagrijano je kako bi se simulirala prisutnost domaćina, dok je pet klopki ostavljeno negrijano. Svaka lokacija tretmana rotira se svake noći ukupno pet noći. Broj komaraca uhvaćenih u klopkama s mamcima od urina različite starosti uspoređen je korištenjem logističke regresije s beta binomnom distribucijom (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
U selu s endemskom malarijom u blizini grada Makija, regija Oromia, Etiopija (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; slika 6A). Studija je provedena između sredine kolovoza i sredine rujna prije godišnjeg prskanja rezidualnim insekticidima u zatvorenom prostoru, uz dugo kišno razdoblje. Za studiju je odabrano pet pari kuća (udaljenih 20–50 m) smještenih na rubu sela (slika 6A). Kriteriji korišteni za odabir kuća bili su: životinje nisu dopuštene u kući, kuhanje u zatvorenom prostoru (vučenje drva za ogrjev ili ugljena) nije bilo dopušteno (barem tijekom probnog razdoblja) i kuće s najviše dva stanovnika, koje spavaju u neinsekticidima. ispod tretirane mreže protiv komaraca. Etičko odobrenje odobrio je Odbor za institucionalnu reviziju etike istraživanja (IRB/022/2016) Fakulteta prirodnih znanosti (CNS-IRB) Sveučilišta u Addis Abebi, u skladu sa smjernicama utvrđenim Helsinškom deklaracijom Svjetskog liječničkog udruženja. Suglasnost svakog nositelja kućanstva dobivena je uz pomoć osoblja za zdravstvenu pomoć. Cijeli proces odobravaju lokalne uprave na razini okruga i odjela („kebele“). Eksperimentalni dizajn slijedio je dizajn latinskog kvadrata 2 × 2, u kojem su sintetičke smjese i kontrole dodijeljene uparenim kućama prve noći i zamjenjivane između kuća sljedeće eksperimentalne noći. Ovaj proces ponovljen je deset puta. Osim toga, kako bi se procijenila aktivnost komaraca u odabranim kućama, CDC klopke postavljene su da rade pet uzastopnih noći na početku, u sredini i na kraju terenskog pokusa u isto doba dana.
Sintetska smjesa koja sadrži šest bioaktivnih spojeva otopljena je u heptanu (97,0% otapalo GC čistoće, Sigma Aldrich) i ispuštana brzinom od 140 ng h-1 pomoću dozatora s pamučnim fitiljem [20]. Dozator s fitiljem omogućio je oslobađanje svih spojeva u konstantnim omjerima tijekom 12-satnog eksperimenta. Heptan je korišten kao kontrola. Bočica je obješena pored ulazne točke svjetlosne klopke Centra za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, SAD; Slika 6A). Klopke su obješene 0,8 – 1 m iznad tla, blizu podnožja kreveta, a volonter je spavao pod netretiranom mrežom protiv komaraca i radio je između 18:00 i 06:30. Komarci uhvaćeni prema spolu i fiziološkom statusu (nehranjeni, hranjeni, polugravidni i gravidni [21]) naknadno su pregledani pomoću PCR analize kako bi se identificirala vrsta morfološki identificirana kao A. gambiae sl. Članovi kompleksa [23]. Na terenu U ovoj studiji, hvatanje sparenih kuća analizirano je korištenjem nominalnog logističkog modela prilagodbe, gdje je privlačnost bila zavisna varijabla, a tretman (sintetička smjesa vs. kontrola) bio je fiksni učinak (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Ovdje prikazujemo χ2 i p-vrijednosti iz testa omjera vjerojatnosti.
Procijenite je li sigurno. arabiensis je uspio dobiti urin, svoj glavni izvor dušika, ureu, izravnim hranjenjem, unutar 48 sati od primjene tijekom 4 dana nakon (dpe) pokusa hranjenja ženki koje traže domaćina i hranjene krvlju (slika 1A). I ​​ženke koje traže domaćina i ženke koje sišu krv apsorbirale su značajno više saharoze nego bilo koja druga prehrana ili voda (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 i F(5,299) = 56,00, p < 0,0001; slike 1B,C). Nadalje, ženke koje traže domaćina jele su manje urina nakon 72 sata u usporedbi s urinom nakon 168 sati (slika 1B). Kada im je ponuđena prehrana koja sadrži ureu, ženke koje traže domaćina apsorbirale su značajno veću količinu uree pri 2,69 mM u usporedbi sa svim ostalim koncentracijama i vodom, dok su se ne razlikovale od 10% saharoze (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Slika 1D). To je bilo u suprotnosti s odgovorom ženki hranjenih krvlju, koje su obično apsorbirale značajno više hrane koja sadrži ureu nego vode, iako značajno manje od 10% saharoze (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Slika 1).1E). Nadalje, pri usporedbi dvaju fizioloških stanja, flebotomizirane ženke apsorbirale su više uree od ženki koje traže domaćina pri najnižim koncentracijama, a te su ženke apsorbirale slične količine uree pri višim koncentracijama (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Slika 1F, G). Dok se činilo da unos iz prehrane koja sadrži ureu ima optimalne vrijednosti (Slika 1D, E), ženke u oba fiziološka stanja mogle su modulirati količinu apsorbirane uree u cijelom rasponu koncentracija uree na logaritamski linearan način (Slika 1F, G). ).Slično tome, čini se da komarci kontroliraju unos dušika reguliranjem količine apsorbiranog urina, budući da se količina dušika u urinu odražava na apsorbiranoj količini (umetci slike 1B, C i B).
Kako bi se procijenili učinci urina i uree na preživljavanje komaraca koji traže domaćina i koji sišu krv, ženke su hranjene urinom svih četiriju dobnih skupina (svježim, 24 sata, 72 sata i 168 sati nakon taloženja), a raspon koncentracija uree, kao i destilirana voda i 10 % saharoze služili su kao kontrola (Slika 2A). Ova analiza preživljavanja pokazala je da prehrana ima značajan utjecaj na ukupno preživljavanje ženki koje traže domaćina (urin: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Slika 2B, C) i ženki koje su se hranile krvlju (urin: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001;). Slika 2D,E). U svim eksperimentima, ženke hranjene prehranom od urina, uree i vode imale su značajno niže stope preživljavanja u usporedbi sa ženkama hranjenim prehranom saharozom (Slika 2B-E). Ženke koje traže domaćina hranjene svježim i ustajalim urinom pokazale su različite stope preživljavanja, pri čemu su one hranjene 72-satnim ustajalim urinom (p = 0,016) imale najnižu vjerojatnost preživljavanja (Slika 2B). Nadalje, ženke koje traže domaćina hranjene 135 mM ureom preživjele su dulje od kontrolne skupine s vodom (p < 0,04) (Slika 2C). U usporedbi s vodom, žene hranjene svježim urinom i 24-satnim urinom preživjele su dulje (p = 0,001 i p = 0,012; Slika 2D), dok su žene hranjene 72-satnim urinom preživjele dulje od onih hranjenih kratkim svježim urinom i 24-satnim urinom (p < 0,0001 i p = 0,013; Slika 2D). Kada su hranjene 135 mM ureom, ženke hranjene krvlju preživjele su dulje od svih ostalih koncentracija uree i vode (p < 0,013; slika 2E).
Preživljavanje domaćina i ženki Anopheles arabinis koje sišu krv, hranjenih kravljim urinom i ureom. U biološkom testu (A), ženkama komaraca dana je prehrana koja se sastojala od svježeg i odležanog kravljeg urina, različitih koncentracija uree, saharoze (10%) i destilirane vode (H2O). Preživljavanje komaraca koji traže domaćina (B, C) i komaraca koji sišu krv (D, E) bilježeno je svakih 12 sati dok sve ženke koje su se hranile urinom (B, D) i ureom (C, E), te kontrolne, saharoza i voda, nisu uginule.
Ukupna udaljenost i broj krugova određeni u testu leta tijekom 24-satnog razdoblja razlikovali su se između komaraca koji traže domaćina i komaraca koji sišu krv, koji su pokazali manju ukupnu aktivnost leta (slika 3). Komarci koji traže domaćina, a koji su davali svježi i ostarjeli urin ili saharozu i vodu, pokazali su različite obrasce leta (slika 3), pri čemu su ženke koje su se hranile svježim urinom bile aktivnije u zoru, dok su one koje su se hranile 24 i 168 sati starim komarcima. Komarci koji su se hranili urinom pokazivali su različite obrasce leta i bili su prvenstveno dnevni. Ženke komaraca koje su davale saharozu ili 72-satni urin pokazale su aktivnost tijekom cijelog 24-satnog razdoblja, dok su ženke koje su davale vodu bile aktivnije tijekom sredine razdoblja. Komarci hranjeni saharozom pokazali su najviše razine aktivnosti kasno navečer i rano ujutro, dok su oni koji su unosili 72 sata star urin doživjeli stalan pad aktivnosti tijekom 24 sata (slika 3).
Izvedba leta ženki Anopheles arabinis koje sišu krv i traže domaćina, a hrane se kravljim urinom i ureom. U testu leta, ženke komaraca koje su se hranile svježim i starim kravljim urinom, različitim koncentracijama uree, saharoze (10%) i destilirane vode (H2O) bile su privezane za horizontalne, slobodno rotirajuće krakove (gore). Za ženke koje traže domaćina (lijevo) i ženke koje sišu krv (desno) zabilježeni su ukupna udaljenost i broj letova na sat za svaku prehranu tijekom 24-satnog razdoblja (tamno: sivo; svijetlo: bijelo). Prosječna udaljenost i prosječan broj napada prikazani su desno od grafa cirkadijalne aktivnosti. Trake pogreške predstavljaju standardnu ​​pogrešku srednje vrijednosti. Statistička analiza vidi tekst
Općenito, ukupna aktivnost leta ženki koje traže domaćina slijedila je obrazac sličan onome duljine leta tijekom 24-satnog razdoblja. Na srednju duljinu leta značajno je utjecala unesena prehrana (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), a ženke koje traže domaćina konzumirale su 72 sata urina preletjele su značajno veće udaljenosti u usporedbi sa svim ostalim prehranama (p < 0,0001), a komarci hranjeni saharozom letjeli su dulje od komaraca hranjenih svježim (p = 0,022) i 24 sata starim urinom (p = 0,022). Za razliku od obrasca aktivnosti leta opisanog prehranom urinom, ženke koje traže domaćina hranjene ureom pokazale su trajnu aktivnost leta tijekom 24-satnog razdoblja, s vrhuncem tijekom druge polovice tamne faze (slika 3). Iako su obrasci aktivnosti bili slični, ženke koje traže domaćina hranjene ureom značajno su povećale srednju duljinu leta ovisno o apsorbiranoj koncentraciji (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Ženke koje traže domaćina hranjene bilo kojom koncentracijom uree letjele su dulje od ženki hranjenih vodom ili saharozom (p < 0,03).
Ukupna aktivnost leta komaraca koji sišu krv bila je stabilna i održana tijekom 24 sata u svim vrstama prehrane, s povećanom aktivnošću urina tijekom druge polovice tamnog razdoblja kod ženki hranjenih vodom, kao i kod ženki hranjenih svježom vodom i ženki starih 24 sata (slika 3). Dok je prehrana urinom značajno utjecala na prosječnu udaljenost leta kod ženki hranjenih krvlju (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), prehrana ureom nije (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) s drugim urinom i kontrolnom prehranom (svježi urin, p = 0,0091; 72 sata, p = 0,0022; 168 sati, p = 0,001; saharoza, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Utjecaji hranjenja urinom i ureom na reproduktivne parametre procijenjeni su biološkim testovima polaganja jaja (Slika 4A) i istraženi su prema broju jaja koje je položila svaka ženka, veličini jaja i novoizleglim ličinkama prvog stadija. Broj položenih jaja. Ženke arapskog ... 187) = 7,86, p < 0,0001), sa značajno većim ličinkama koje izlaze iz jaja koje su položile ženke stare 24 i 72 sata hranjene urinom nego iz jaja koje su položile ličinke jaja. Ženke hranjene vodom i ženke hranjene urinom 168 sati (Slika 4D).
Reproduktivne performanse ženki Anopheles arabinis koje se hrane kravljim urinom i ureom. Ženke komaraca hranjene krvlju hranjene su prehranom koja se sastojala od svježeg i odležanog kravljeg urina, različitih koncentracija uree, saharoze (10%) i destilirane vode (H2O) tijekom 48 sati prije stavljanja u biološke testove i dobivanja supstrata za polaganje jaja 48 sati (A). Broj jaja (B, E), veličina jaja (C, F) i veličina ličinki (D, G) bili su značajno pogođeni pruženom prehranom (kravlji urin: BD; urea: EG). Srednje vrijednosti za svaki parametar izmjeren korištenjem različitih naziva slova značajno su se razlikovale jedna od druge (jednosmjerna ANOVA korištenjem Tukeyjeve post hoc analize; p < 0,05). Trake pogreške predstavljaju standardnu ​​pogrešku srednje vrijednosti.
Kao glavna dušična komponenta urina, urea, kada se davala kao prehrana ženkama hranjenim krvlju, značajno je utjecala na reproduktivne parametre u svim studijama. Broj jaja koje su položile ženke hranjene ureom, nakon obroka krvi, ovisno o koncentraciji uree (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), ženke hranjene koncentracijama uree između 134 µM i 1,34 mM položile su više jaja (slika 4E). Ženke hranjene koncentracijama uree od 134 µM ili više položile su veća jaja od ženki hranjenih vodom (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; slika 4F), a veličina ličinki, iako je bila pod utjecajem sličnih koncentracija uree u majki (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001), bila je varijabilnija (slika 4G).
Ukupna privlačnost hlapljivim ekstraktima iz prostora iznad urina goveda koji traže domaćina. Na vrstu *arabiensis* procijenjenu u olfaktometru sa staklenom cijevi (slika 5A) značajno je utjecala starost urina (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; slika 5B). Post hoc analiza pokazala je da miris ustajalog urina nakon 24 sata uzrokuje značajno veću razinu privlačnosti u usporedbi sa svim ostalim tretmanima (72 sata: p = 0,0060, 168 sati: p = 0,012, pentan: p = 0,00070), osim mirisa svježeg urina (p = 0,13; slika 5B). Iako se ukupna privlačnost komaraca koji sišu krv mirisom urina nije značajno razlikovala (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; slika 5C), utvrđeno je da su te ženke značajno privlačnije hlapljivim ekstraktima iz prostora iznad urina u usporedbi s urinom starim 72 sata u usporedbi s kontrolnom skupinom (p = 0,0066; Slika 5C).
Bihevioralni odgovori na mirise prirodnog i sintetičkog kravljeg urina u potrazi za domaćinom i komarcima koji se hrane krvlju Anopheles arabianus. Shema olfaktometra sa staklenom cijevi (A). Privlačenje hlapljivih ekstrakata iz svježeg i ostarjelog kravljeg urina na domaćina (B) i komarce koji sišu krv (C). Pronađite reakciju pipaka Lorda An. Prikazani su ekstrakti iz svježeg (D), 24-satnog (E), 72-satnog (F) i 168-satnog (G) kravljeg urina. Tragovi detekcije elektronske antene (EAD) pokazuju promjene napona kao odgovor na bioaktivne spojeve u gornjem prostoru eluirane iz plinskog kromatografa i detektirane detektorom ionizacije plamena (FID). Mjerna traka predstavlja amplitudu odgovora (mV) u odnosu na vrijeme zadržavanja (s). Prikazana su svojstva i brzine oslobađanja (µg h-1) biološki aktivnih spojeva. Jedna zvjezdica (*) označava konzistentan odgovor niske amplitude. Dvostruke zvjezdice (**) označavaju nereproducibilne odgovore. Pronađite domaćina (H) i komarce koji sišu krv. (I) An.arabiensis ima različitu privlačnost prema sintetičkim mješavinama mirisa svježeg i starog kravljeg urina. Prosječni udjeli komaraca privučenih različitim slovima značajno su se razlikovali jedan od drugoga (jednosmjerna ANOVA korištenjem Tukeyjeve post hoc analize; p < 0,05). Trake pogreške predstavljaju standardnu ​​pogrešku skale.
Ženka Ann.arabiensis, 72 sata i 120 sati nakon krvnog obroka, tijekom mrijesta, nije pokazala preferenciju za hlapljive ekstrakte iz svježeg i odležanog kravljeg urina u usporedbi s kontrolama s pentanom (χ2 = 3,07, p > 0,05; Dodatna datoteka 1: Slika S1).
Za ženke vrste Ann.arabiensis, GC-EAD i GC-MS analize identificirale su osam, šest, tri i tri bioaktivna spoja (slika 5D-G). Iako su uočene razlike u broju spojeva koji su izazvali elektrofiziološke odgovore, većina tih spojeva bila je prisutna u svakom hlapljivom ekstraktu iz prostora iznad urina prikupljenom iz svježeg i ostarjelog urina. Stoga su za svaki ekstrakt u daljnje analize uključeni samo spojevi koji su izazvali fiziološki odgovor ženskih antena iznad praga.
Ukupna brzina oslobađanja hlapljivih bioaktivnih spojeva u kolekciji iz prostora iznad urina povećala se s 29 µg h-1 u svježem urinu na 242 µg h-1 u urinu starom 168 sati, uglavnom zbog p-krezola i m-formaldehida. Povećanje fenola, kao i fenola, smanjivalo se s povećanjem starosti urina, što je bilo u korelaciji s uočenim smanjenjem intenziteta signala (obilja) u kromatogramu (slika 5D)-G lijevi panel) i fiziološkim odgovorima na ove spojeve (slika 5D-G desni panel).
Sveukupno, sintetska smjesa imala je sličan prirodni omjer bioaktivnih spojeva identificiranih u hlapljivim ekstraktima svježeg i odležanog urina (slika 5D–G) i nije se činila značajno privlačnom u potrazi za domaćinom (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; slika 5H) ili komarcima koji sišu krv (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; slika 5I). Međutim, post hoc usporedbe parova između tretmana pokazale su da su komarci koji traže domaćina bili značajno privlačniji sintetičkoj smjesi 24 sata odležanog urina u usporedbi s kontrolama s pentanom (p = 0,0086; slika 5H).
Kako bi se procijenila uloga pojedinačnih komponenti u sintetičkim smjesama urina stareg 24 sata, šest subtraktivnih smjesa uspoređeno je s potpunim smjesama u Y-cijevi, u kojem su uklonjeni pojedinačni spojevi. Kod komaraca koji traže domaćina, oduzimanje pojedinačnih spojeva iz potpune smjese imalo je značajan učinak na bihevioralne reakcije (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Dodatna datoteka 1: Slika S2A), sve subtraktivne smjese bile su privlačnije od potpuno pomiješanih. Nasuprot tome, uklanjanje pojedinačnih spojeva iz potpuno sintetičke smjese nije utjecalo na bihevioralne reakcije komaraca koji sišu krv (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), s izuzetkom dekanala, koji je rezultirao nižim razinama privlačnosti u usporedbi s potpunom smjesom (p = 0,022; Dodatna datoteka 1: Slika S2B).
U selu u Etiopiji, endemskom za malariju, procijenjena je učinkovitost sintetičke mješavine 24-satnog kravljeg urina u privlačenju komaraca u poljskim uvjetima tijekom deset noći (slika 6A). Ukupno je uhvaćeno i identificirano 4861 komarac, od kojih je 45,7% bilo Anthropus.gambiae sl, 18,9% Anopheles pharoensis i 35,4% Culex spp. (Dodatna datoteka 1: Tablica S1). Anopheles arabinis jedini je član kompleksa vrsta An.Gambian identificiran PCR analizom. U prosjeku je uhvaćeno 320 komaraca po noći, tijekom kojih su zamke sa sintetičkim mješavinama mamaca uhvatile više komaraca nego uparene zamke bez mješavine (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Zamke bez mamaca postavljene su svake od pet kontrolnih noći na početku, u sredini i na kraju pokusa. Sličan broj komaraca uhvaćen je u svakom paru zamki, što ukazuje Nema pristranosti između kuća (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) i nema pada populacije tijekom razdoblja istraživanja. U usporedbi s kontrolnim klopkama, broj komaraca uhvaćenih u klopkama koje su sadržavale sintetičku smjesu značajno se povećao: traženje domaćina (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), nedavno hranjenje krvlju (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) i gravidnost (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Dodatna datoteka 1: Tablica S1). To se također odražava na ukupnom broju uhvaćenih komaraca: traženje domaćina > sisanje krvi > gravidni > polugravidni > mužjak.
Terenska evaluacija učinkovitosti 24-satne sintetičke mješavine mirisa kravljeg urina. Terenska ispitivanja provedena su u južno-središnjoj Etiopiji (karta), u blizini grada Makija (umetnuti dio), korištenjem svjetlosne zamke Centra za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC) (desno) u parnim kućicama, s dizajnom latinskog kvadrata (zračna snimka) (A). Sintetičke CDC fotozamke s mirisnim mamcem privlače i hvataju ženke Anopheles arabesques (B), ali ne i Anopheles farroes (C), na drugačiji način, učinak ovisan o fiziološkom stanju. Osim toga, ove su zamke uhvatile značajno povećan broj komaraca domaćina Culex. (D) U usporedbi s kontrolom. Trake s lijeve strane predstavljaju prosječni indeks selekcije komaraca uhvaćenih u parovima zamki s mirisnim mamcem (zeleno) i kontrolnih (otvorenih) (N = 10), dok trake s desne strane predstavljaju prosječni indeks selekcije u parovima kontrolnih zamki (otvorene; N = 5). Zvjezdice označavaju razinu statističke značajnosti (*p = 0,01 i ***p < 0,0001).
Tri vrste su uhvaćene na različite načine u klopkama koje su sadržavale sintetičke smjese. Traženje domaćina (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), hranjenje krvlju (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) i gravidnost (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) pokazalo je da je .arabiensis uhvaćen u klopci ispuštajući sintetičku smjesu (slika 6B), dok se količina An nije razlikovala. Pronađeni su Pharaensis u različitim fiziološkim stanjima (slika 6C). Kod Culexa je uočen samo značajan porast broja komaraca koji traže domaćine u klopkama s mamcima od sintetičke smjese (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; slika 6D) u usporedbi s kontrolnim klopkama.
Za procjenu koriste li malarijski komarci miris kravljeg urina kao znak staništa domaćina korištene su klopke s mamcima za domaćine smještene izvan potencijalnih domaćina između mjesta razmnožavanja i ruralnih zajednica u Etiopiji. U odsutnosti znakova domaćina, vrućine i sa ili bez prisutnosti mirisa kravljeg urina, nisu uhvaćeni komarci (Dodatna datoteka 1: Slika S3). Međutim, u prisutnosti visoke temperature i mirisa kravljeg urina, ženke malarijskih komaraca bile su privučene i uhvaćene, iako u malom broju, neovisno o starosti urina (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Dodatna datoteka 1: Slika S3). Nasuprot tome, kontrolne skupine s vodom nisu uhvatile malarijske komarce na visokim temperaturama (Dodatna datoteka 1: Slika S3).
Komarci protiv malarije stječu i distribuiraju spojeve koji sadrže dušik kompenzacijskim hranjenjem kravljim urinom (tj. lokvama) kako bi poboljšali karakteristike životnog ciklusa, slično kao i drugi kukci [2, 4, 24, 25, 26]. Kravlji urin je lako dostupan obnovljivi resurs usko povezan s odmorištima vektora malarije, poput štala za krave i visoke vegetacije u blizini seoskih domova i mjesta za mrijest. Ženke komaraca lociraju ovaj resurs mirisom i sposobne su regulirati unos dušičnih spojeva u urinu, uključujući ureu, glavnu dušičnu komponentu u urinu [15, 16]. Ovisno o fiziološkom stanju ženke komarca, hranjive tvari u urinu dodjeljuju se kako bi se poboljšala aktivnost leta i preživljavanje ženki komaraca koje traže domaćina, kao i preživljavanje i reproduktivne karakteristike jedinki koje se hrane krvlju tijekom prvog gonadotropnog ciklusa. Stoga miješanje urina igra važnu nutritivnu ulogu za vektore malarije koji su zatvoreni poput pothranjenih odraslih [8], jer ženkama komaraca omogućuje stjecanje važnih dušičnih spojeva sudjelovanjem u hranjenju niskog rizika. Ovo otkriće ima značajne epidemiološke posljedice, jer ženke povećavaju svoj životni vijek, aktivnost i reproduktivni učinak, što sve utječe na kapacitet vektora. Nadalje, ovo ponašanje može biti meta budućih programa upravljanja vektorima.