Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazivat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Nedavno je razvijena antimikrobna platforma bez kemikalija temeljena na nanotehnologiji korištenjem umjetnih nanostruktura vode (EWNS). EWNS imaju visoki površinski naboj i zasićene su reaktivnim vrstama kisika (ROS) koje mogu stupiti u interakciju s nizom mikroorganizama i inaktivirati ih, uključujući patogene koji se prenose hranom. Ovdje je pokazano da se njihova svojstva tijekom sinteze mogu fino podesiti i optimizirati kako bi se dodatno poboljšao njihov antibakterijski potencijal. Laboratorijska platforma EWNS dizajnirana je za fino podešavanje svojstava EWNS-a promjenom parametara sinteze. Karakterizacija svojstava EWNS-a (naboj, veličina i sadržaj ROS-a) korištenjem modernih analitičkih metoda. Osim toga, procijenjen je njihov potencijal mikrobne inaktivacije protiv mikroorganizama koji se prenose hranom, kao što su Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum i Saccharomyces cerevisiae. Rezultati prikazani ovdje pokazuju da se svojstva EWNS-a mogu fino podesiti tijekom sinteze, što rezultira eksponencijalnim povećanjem učinkovitosti inaktivacije. Konkretno, površinski naboj se povećao za faktor četiri, a reaktivne vrste kisika su se povećale. Brzina uklanjanja mikroba bila je ovisna o mikrobima i kretala se od 1,0 do 3,8 log nakon 45-minutne izloženosti dozi aerosola od 40 000 #/cc EWNS.
Mikrobna kontaminacija glavni je uzrok bolesti koje se prenose hranom uzrokovanih unosom patogena ili njihovih toksina. Samo u Sjedinjenim Državama bolesti koje se prenose hranom uzrokuju oko 76 milijuna bolesti, 325 000 prijema u bolnicu i 5000 smrtnih slučajeva svake godine1. Osim toga, Ministarstvo poljoprivrede Sjedinjenih Država (USDA) procjenjuje da je povećana konzumacija svježih proizvoda odgovorna za 48% svih prijavljenih bolesti koje se prenose hranom u Sjedinjenim Državama2. Troškovi bolesti i smrti uzrokovanih patogenima koji se prenose hranom u Sjedinjenim Državama vrlo su visoki, a Centri za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC) procjenjuju ih na više od 15,6 milijardi američkih dolara godišnje3.
Trenutačno se kemijske4, radijacijske5 i termalne6 antimikrobne intervencije radi osiguranja sigurnosti hrane uglavnom provode na ograničenim kritičnim kontrolnim točkama (KKT) duž proizvodnog lanca (obično nakon berbe i/ili tijekom pakiranja), a ne kontinuirano. Stoga su sklone unakrsnoj kontaminaciji. 7. Bolja kontrola bolesti koje se prenose hranom i kvarenja hrane zahtijeva antimikrobne intervencije koje se potencijalno mogu primijeniti u cijelom kontinuumu od farme do stola, a istovremeno smanjuju utjecaj na okoliš i troškove.
Nedavno je razvijena antimikrobna platforma bez kemikalija, temeljena na nanotehnologiji, koja može inaktivirati površinske i zračne bakterije korištenjem umjetnih vodenih nanostruktura (EWNS). EWNS je sintetiziran korištenjem dva paralelna procesa, elektrospreja i ionizacije vode (slika 1a). Prethodne studije pokazale su da EWNS imaju jedinstven skup fizičkih i bioloških svojstava8,9,10. EWNS imaju prosječno 10 elektrona po strukturi i prosječnu nanoskalnu veličinu od 25 nm (slika 1b,c)8,9,10. Osim toga, elektronska spinska rezonancija (ESR) pokazala je da EWNS sadrži veliku količinu reaktivnih kisikovih vrsta (ROS), uglavnom hidroksilnih (OH•) i superoksidnih (O2-) radikala (slika 1c)8. EVNS je u zraku dugo vremena i može se sudarati s mikroorganizmima suspendiranim u zraku i prisutnima na površini, isporučujući svoj ROS teret i uzrokujući inaktivaciju mikroorganizama (slika 1d). Ove rane studije također su pokazale da EWNS može stupiti u interakciju s raznim gram-negativnim i gram-pozitivnim bakterijama, uključujući mikobakterije, na površinama i u zraku i inaktivirati ih. Transmisijska elektronska mikroskopija pokazala je da je inaktivacija uzrokovana poremećajem stanične membrane. Osim toga, studije akutne inhalacije pokazale su da visoke doze EWNS-a ne uzrokuju oštećenje pluća ili upalu 8.
(a) Elektroraspršivanje nastaje kada se visoki napon primijeni između kapilarne cijevi koja sadrži tekućinu i protuelektrode. (b) Primjena visokog tlaka rezultira dvama različitim fenomenima: (i) elektroraspršivanjem vode i (ii) stvaranjem reaktivnih vrsta kisika (iona) zarobljenih u EWNS-u. (c) Jedinstvena struktura EWNS-a. (d) Zbog svoje nanoskalne prirode, EWNS su vrlo pokretni i mogu stupiti u interakciju s patogenima u zraku.
Nedavno je dokazana i sposobnost EWNS antimikrobne platforme da inaktivira mikroorganizme koji se prenose hranom na površini svježe hrane. Također je pokazano da se površinski naboj EWNS-a u kombinaciji s električnim poljem može koristiti za postizanje ciljane isporuke. Štoviše, preliminarni rezultati za organske rajčice nakon 90-minutne izloženosti EWNS-u od oko 50 000 #/cm3 bili su ohrabrujući, s uočenim raznim mikroorganizmima koji se prenose hranom, poput E. coli i Listeria 11. Osim toga, preliminarni organoleptički testovi nisu pokazali senzorne učinke u usporedbi s kontrolnim rajčicama. Iako su ovi početni rezultati inaktivacije ohrabrujući za primjenu u sigurnosti hrane čak i pri vrlo niskim dozama EWNS-a od 50 000#/cm3, jasno je da bi veći potencijal inaktivacije bio korisniji za daljnje smanjenje rizika od infekcije i kvarenja.
Ovdje ćemo se usredotočiti na istraživanje razvoja platforme za generiranje EWNS-a kako bismo omogućili fino podešavanje parametara sinteze i optimizaciju fizikalno-kemijskih svojstava EWNS-a radi poboljšanja njihovog antibakterijskog potencijala. Optimizacija se posebno usredotočila na povećanje njihovog površinskog naboja (za poboljšanje ciljane isporuke) i sadržaja ROS-a (za poboljšanje učinkovitosti inaktivacije). Karakterizirati optimizirana fizikalno-kemijska svojstva (veličina, naboj i sadržaj ROS-a) korištenjem modernih analitičkih metoda i korištenjem uobičajenih prehrambenih mikroorganizama poput E.
EVNS je sintetiziran istovremenim elektroraspršivanjem i ionizacijom vode visoke čistoće (18 MΩ cm–1). Električni nebulizator 12 obično se koristi za atomizaciju tekućina i sintezu polimernih i keramičkih čestica 13 i vlakana 14 kontrolirane veličine.
Kao što je detaljno opisano u prethodnim publikacijama 8, 9, 10, 11, u tipičnom eksperimentu, visoki napon je primijenjen između metalne kapilare i uzemljene protuelektrode. Tijekom ovog procesa događaju se dva različita fenomena: i) elektroraspršivanje i ii) ionizacija vode. Jako električno polje između dvije elektrode uzrokuje nakupljanje negativnih naboja na površini kondenzirane vode, što rezultira stvaranjem Taylorovih konusa. Kao rezultat toga, nastaju visoko nabijene kapljice vode, koje se nastavljaju raspadati na manje čestice, kao u Rayleighovoj teoriji16. Istovremeno, jaka električna polja uzrokuju cijepanje i otpuštanje elektrona (ionizaciju) nekih molekula vode, što dovodi do stvaranja velike količine reaktivnih vrsta kisika (ROS)17. Istovremeno generirani ROS18 je enkapsuliran u EWNS (slika 1c).
Na sl. 2a prikazan je sustav za generiranje EWNS-a razvijen i korišten u sintezi EWNS-a u ovoj studiji. Pročišćena voda pohranjena u zatvorenoj boci dovodila se kroz teflonsku cijev (unutarnjeg promjera 2 mm) u iglu od nehrđajućeg čelika 30G (metalna kapilara). Protok vode kontrolira se tlakom zraka unutar boce, kao što je prikazano na slici 2b. Igla je postavljena na teflonsku konzolu i može se ručno podesiti na određenu udaljenost od protuelektrode. Protuelektroda je polirani aluminijski disk s rupom u sredini za uzorkovanje. Ispod protuelektrode nalazi se aluminijski lijevak za uzorkovanje, koji je spojen s ostatkom eksperimentalnog uređaja putem otvora za uzorkovanje (slika 2b). Kako bi se izbjeglo nakupljanje naboja koje bi moglo poremetiti rad uzorkivača, sve komponente uzorkivača su električno uzemljene.
(a) Sustav za generiranje inženjerskih nanostruktura vode (EWNS). (b) Presjek uzorkivača i elektrospreja, s prikazom najvažnijih parametara. (c) Eksperimentalni postav za inaktivaciju bakterija.
Gore opisani sustav za generiranje EWNS-a sposoban je mijenjati ključne radne parametre kako bi se olakšalo fino podešavanje svojstava EWNS-a. Podesite primijenjeni napon (V), udaljenost između igle i protuelektrode (L) i protok vode (φ) kroz kapilaru kako biste fino podesili karakteristike EWNS-a. Simbol koji se koristi za predstavljanje različitih kombinacija: [V (kV), L (cm)]. Podesite protok vode kako biste dobili stabilan Taylorov konus određenog skupa [V, L]. Za potrebe ove studije, promjer otvora protuelektrode (D) održavan je na 0,5 inča (1,29 cm).
Zbog ograničene geometrije i asimetrije, jakost električnog polja ne može se izračunati iz prvih principa. Umjesto toga, za izračun električnog polja korišten je softver QuickField™ (Svendborg, Danska). Električno polje nije uniformno, pa je vrijednost električnog polja na vrhu kapilare korištena kao referentna vrijednost za različite konfiguracije.
Tijekom studije, nekoliko kombinacija napona i udaljenosti između igle i protuelektrode procijenjeno je u smislu formiranja Taylorovog konusa, stabilnosti Taylorovog konusa, stabilnosti proizvodnje EWNS-a i ponovljivosti. Različite kombinacije prikazane su u Dodatnoj tablici S1.
Izlaz EWNS sustava za generiranje bio je izravno spojen na Scanning Mobility Particle Size Analyzer (SMPS, Model 3936, TSI, Shoreview, MN) za mjerenje koncentracije broja čestica, kao i na Aerosol Faraday Electrometer (TSI, Model 3068B, Shoreview, MN). ) za mjerenje struja aerosola kako je opisano u našoj prethodnoj publikaciji. I SMPS i aerosol elektrometar uzorkovali su pri brzini protoka od 0,5 L/min (ukupni protok uzorka 1 L/min). Koncentracija broja čestica i protok aerosola mjereni su 120 sekundi. Mjerenje se ponavlja 30 puta. Na temelju mjerenja struje izračunava se ukupni naboj aerosola i procjenjuje se prosječni EWNS naboj za zadani ukupan broj odabranih EWNS čestica. Prosječni trošak EWNS-a može se izračunati pomoću jednadžbe (1):
gdje je IEl izmjerena struja, NSMPS je digitalna koncentracija izmjerena SMPS-om, a φEl je brzina protoka po elektrometru.
Budući da relativna vlažnost (RH) utječe na površinski naboj, temperatura i (RH) održavane su konstantnima tijekom eksperimenta na 21 °C odnosno 45%.
Za mjerenje veličine i životnog vijeka EWNS-a korišteni su mikroskopija atomskih sila (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) i sonda AC260T (Olympus, Tokio, Japan). Frekvencija skeniranja AFM-a bila je 1 Hz, područje skeniranja 5 μm × 5 μm i 256 linija skeniranja. Sve slike su podvrgnute poravnanju slike 1. reda pomoću Asylum softvera (raspon maske 100 nm, prag 100 pm).
Ispitni lijevak je uklonjen, a površina tinjca postavljena je na udaljenost od 2,0 cm od protuelektrode tijekom prosječnog vremena od 120 s kako bi se izbjegla aglomeracija čestica i stvaranje nepravilnih kapljica na površini tinjca. EWNS je raspršen izravno na površinu svježe rezanog tinjca (Ted Pella, Redding, CA). Slika površine tinjca odmah nakon AFM raspršivanja. Kontaktni kut površine svježe rezanog nemodificiranog tinjca je blizu 0°, tako da je EVNS raspršen na površini tinjca u obliku kupole. Promjer (a) i visina (h) difuznih kapljica izmjereni su izravno iz AFM topografije i korišteni za izračun kupolastog difuzijskog volumena EWNS-a pomoću naše prethodno validirane metode. Pod pretpostavkom da ugrađeni EWNS imaju isti volumen, ekvivalentni promjer može se izračunati pomoću jednadžbe (2):
Na temelju naše prethodno razvijene metode, korištena je spinska zamka elektronske spinske rezonancije (ESR) za detekciju prisutnosti kratkotrajnih radikalnih međuprodukata u EWNS-u. Aerosoli su propuštani kroz 650 μm Midget raspršivač (Ace Glass, Vineland, NJ) koji je sadržavao 235 mM otopinu DEPMPO(5-(dietoksifosforil)-5-metil-1-pirolin-N-oksida) (Oxis International Inc.). Portland, Oregon. Sva ESR mjerenja provedena su pomoću Bruker EMX spektrometra (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, SAD) i ravne ćelije. Za prikupljanje i analizu podataka korišten je Acquisit softver (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, SAD). Određivanje karakteristika ROS-a provedeno je samo za skup radnih uvjeta [-6,5 kV, 4,0 cm]. Koncentracije EWNS-a mjerene su pomoću SMPS-a nakon što su uzeti u obzir gubici EWNS-a u impaktoru.
Razina ozona praćena je pomoću 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Colorado)8,9,10.
Za sva EWNS svojstva, srednja vrijednost se koristi kao mjerna vrijednost, a standardna devijacija se koristi kao pogreška mjerenja. T-testovi su provedeni kako bi se usporedile vrijednosti optimiziranih EWNS atributa s odgovarajućim vrijednostima baznog EWNS-a.
Slika 2c prikazuje prethodno razvijen i karakteriziran sustav "povlačenja" elektrostatskog taloženja (EPES) koji se može koristiti za ciljanu isporuku EWNS-a na površinu. EPES koristi EVNS naboje koji se mogu "voditi" izravno na površinu mete pod utjecajem jakog električnog polja. Detalji EPES sustava prikazani su u nedavnoj publikaciji Pyrgiotakisa i suradnika 11. Dakle, EPES se sastoji od 3D printane PVC komore sa suženim krajevima i sadrži dvije paralelne metalne ploče od nehrđajućeg čelika (nehrđajući čelik 304, s ogledalskim premazom) u sredini udaljene 15,24 cm. Ploče su bile spojene na vanjski izvor visokog napona (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), donja ploča je uvijek bila spojena na pozitivni napon, a gornja ploča je uvijek bila spojena na uzemljenje (plutajuće uzemljenje). Zidovi komore prekriveni su aluminijskom folijom, koja je električno uzemljena kako bi se spriječio gubitak čestica. Komora ima zatvorena prednja vrata za punjenje koja omogućuju postavljanje ispitnih površina na plastične stalke koji ih podižu iznad donje metalne ploče kako bi se izbjegle smetnje visokog napona.
Učinkovitost taloženja EWNS-a u EPES-u izračunata je prema prethodno razvijenom protokolu detaljno opisanom u Dodatnoj slici S111.
Kao kontrolna komora, druga cilindrična protočna komora bila je serijski spojena na EPES sustav, u kojem je korišten međuprostorni HEPA filter za uklanjanje EWNS-a. Kao što je prikazano na slici 2c, EWNS aerosol je pumpan kroz dvije ugrađene komore. Filter između kontrolne sobe i EPES-a uklanja sve preostale EWNS-e što rezultira istom temperaturom (T), relativnom vlagom (RH) i razinama ozona.
Utvrđeno je da važni mikroorganizmi koji se prenose hranom kontaminiraju svježu hranu, kao što su E. coli (ATCC #27325), indikator fekalija, Salmonella enterica (ATCC #53647), patogen koji se prenosi hranom, Listeria insect (ATCC #33090), surogat za patogenu Listeria monocytogenes, izvedena iz ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), zamjena za kvasac kvarenja, i otpornija inaktivirana bakterija, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Kupite nasumične kutije organskih rajčica s lokalne tržnice i stavite ih u hladnjak na 4°C do upotrebe (do 3 dana). Pokusne rajčice bile su sve iste veličine, promjera oko 1,2 cm.
Protokoli za kulturu, inokulaciju, ekspoziciju i brojanje kolonija detaljno su opisani u našoj prethodnoj publikaciji i u Dodatnim podacima. Učinkovitost EWNS-a procijenjena je izlaganjem inokuliranih rajčica koncentraciji od 40 000 #/cm3 tijekom 45 minuta. Ukratko, tri rajčice korištene su za procjenu preživjelih mikroorganizama u vremenu t = 0 min. Tri rajčice stavljene su u EPES i izložene EWNS-u pri 40 000 #/cc (rajčice izložene EWNS-u), a preostale tri stavljene su u kontrolnu komoru (kontrolne rajčice). Dodatna obrada rajčica u obje skupine nije provedena. Rajčice izložene EWNS-u i kontrolne rajčice uklonjene su nakon 45 minuta kako bi se procijenio učinak EWNS-a.
Svaki je eksperiment proveden u tri ponavljanja. Analiza podataka provedena je prema protokolu opisanom u Dodatnim podacima.
Mehanizmi inaktivacije procijenjeni su sedimentacijom izloženih uzoraka EWNS-a (45 min pri koncentraciji aerosola EWNS-a od 40 000 #/cm3) i neozračenih uzoraka bezopasnih bakterija E. coli, Salmonella enterica i Lactobacillus. Čestice su fiksirane u 2,5% glutaraldehidu, 1,25% paraformaldehidu i 0,03% pikrinskoj kiselini u 0,1 M natrijevom kakodilatnom puferu (pH 7,4) tijekom 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja, naknadno fiksirati s 1% osmijevog tetroksida (OsO4)/1,5% kalijevog ferocijanida (KFeCN6) tijekom 2 sata, isprati 3 puta u vodi i inkubirati u 1% uranil acetatu tijekom 1 sata, zatim isprati dva puta u vodi, a zatim dehidrirati 10 minuta u 50%, 70%, 90%, 100% alkoholu. Uzorci su zatim stavljeni u propilen oksid na 1 sat i impregnirani smjesom propilen oksida i TAAP Epona u omjeru 1:1 (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Uzorci su ugrađeni u TAAB Epon i polimerizirani na 60°C tijekom 48 sati. Očvrsnuta granulirana smola je izrezana i vizualizirana TEM-om pomoću konvencionalnog transmisijskog elektronskog mikroskopa JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japan) opremljenog AMT 2k CCD kamerom (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, SAD).
Svi eksperimenti provedeni su u tri ponavljanja. Za svaku vremensku točku, bakterijski ispirci su nasađeni u tri ponavljanja, što je rezultiralo s ukupno devet podatkovnih točaka po točki, čiji je prosjek korišten kao bakterijska koncentracija za taj određeni mikroorganizam. Standardna devijacija korištena je kao pogreška mjerenja. Sve točke se računaju.
Logaritam smanjenja koncentracije bakterija u usporedbi s t = 0 min izračunat je pomoću sljedeće formule:
gdje je C0 koncentracija bakterija u kontrolnom uzorku u vremenu 0 (tj. nakon što se površina osušila, ali prije stavljanja u komoru), a Cn je koncentracija bakterija na površini nakon n minuta izlaganja.
Kako bi se uzelo u obzir prirodno razgrađivanje bakterija tijekom 45-minutne izloženosti, logaritam smanjenja u usporedbi s kontrolom nakon 45 minuta također je izračunat na sljedeći način:
gdje je Cn koncentracija bakterija u kontrolnom uzorku u vremenu n, a Cn-Control je koncentracija kontrolnih bakterija u vremenu n. Podaci su prikazani kao logaritam smanjenja u usporedbi s kontrolom (bez izloženosti EWNS-u).
Tijekom studije, nekoliko kombinacija napona i udaljenosti između igle i protuelektrode procijenjeno je u smislu formiranja Taylorovog konusa, stabilnosti Taylorovog konusa, stabilnosti proizvodnje EWNS-a i ponovljivosti. Različite kombinacije prikazane su u Dodatnoj tablici S1. Za sveobuhvatnu studiju odabrana su dva slučaja koja pokazuju stabilna i ponovljiva svojstva (Taylorov konus, stvaranje EWNS-a i stabilnost tijekom vremena). Na slici 3 prikazani su rezultati za naboj, veličinu i sadržaj ROS-a u oba slučaja. Rezultati su također sažeti u Tablici 1. Za referencu, i Slika 3 i Tablica 1 uključuju svojstva prethodno sintetiziranog neoptimiziranog EWNS-a8, 9, 10, 11 (osnovni EWNS). Izračuni statističke značajnosti korištenjem dvostranog t-testa ponovno su objavljeni u Dodatnoj tablici S2. Osim toga, dodatni podaci uključuju studije utjecaja promjera otvora za uzorkovanje protuelektrode (D) i udaljenosti između uzemljene elektrode i vrha (L) (Dodatne slike S2 ​​i S3).
(ac) Raspodjela veličine mjerena AFM-om. (df) Karakteristika površinskog naboja. (g) ROS karakterizacija EPR-a.
Također je važno napomenuti da je za sve gore navedene uvjete izmjerena struja ionizacije bila između 2 i 6 μA, a napon između -3,8 i -6,5 kV, što je rezultiralo potrošnjom energije manjom od 50 mW za ovaj pojedinačni kontaktni modul za generaciju EWNS-a. Iako je EWNS sintetiziran pod visokim tlakom, razine ozona bile su vrlo niske, nikada ne prelazeći 60 ppb.
Dodatna slika S4 prikazuje simulirana električna polja za scenarije [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm]. Za scenarije [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm], izračuni polja su 2 × 10⁶ V/m i 4,7 × 10⁶ V/m. To je očekivano, budući da je u drugom slučaju omjer napona i udaljenosti mnogo veći.
Na sl. 3a i b prikazan je promjer EWNS-a izmjeren pomoću AFM8. Izračunati prosječni promjeri EWNS-a bili su 27 nm i 19 nm za sheme [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm]. Za scenarije [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm], geometrijske standardne devijacije distribucija su 1,41 i 1,45, što ukazuje na usku distribuciju veličine. I srednja veličina i geometrijska standardna devijacija vrlo su blizu osnovnom EWNS-u, na 25 nm i 1,41. Na sl. 3c prikazana je distribucija veličine osnovnog EWNS-a izmjerena istom metodom pod istim uvjetima.
Na sl. 3d,e prikazani su rezultati karakterizacije naboja. Podaci su prosječna mjerenja 30 istovremenih mjerenja koncentracije (#/cm3) i struje (I). Analiza pokazuje da je prosječni naboj na EWNS-u 22 ± 6 e- i 44 ± 6 e- za [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm]. Imaju značajno veće površinske naboje u usporedbi s osnovnim EWNS-om (10 ± 2 e-), dva puta veće od scenarija [-6,5 kV, 4,0 cm] i četiri puta veće od scenarija [-3,8 kV, 0,5 cm]. Slika 3f prikazuje podatke o naboju za osnovni EWNS.
Iz karata koncentracije EWNS broja (dodatne slike S5 i S6) može se vidjeti da scenarij [-6,5 kV, 4,0 cm] ima znatno više čestica od scenarija [-3,8 kV, 0,5 cm]. Također vrijedi napomenuti da je koncentracija EWNS broja praćena do 4 sata (dodatne slike S5 i S6), gdje je stabilnost generacije EWNS pokazala iste razine koncentracije broja čestica u oba slučaja.
Na sl. 3g prikazan je EPR spektar nakon oduzimanja optimizirane EWNS kontrole (pozadina) na [-6,5 kV, 4,0 cm]. ROS spektri su također uspoređeni s Baseline-EWNS scenarijem u prethodno objavljenom radu. Broj EWNS-a koji reagiraju sa spinskim zamkama izračunat je na 7,5 × 10⁴ EWNS/s, što je slično prethodno objavljenom Baseline-EWNS8. EPR spektri jasno su pokazali prisutnost dvije vrste ROS-a, pri čemu je O2- dominantna vrsta, a OH• manje zastupljen. Osim toga, izravna usporedba intenziteta vrhova pokazala je da optimizirani EWNS ima značajno veći sadržaj ROS-a u usporedbi s osnovnim EWNS-om.
Na sl. 4 prikazana je učinkovitost taloženja EWNS-a u EPES-u. Podaci su također sažeti u Tablici I i uspoređeni s originalnim EWNS podacima. Za oba slučaja EUNS-a, taloženje je blizu 100% čak i pri niskom naponu od 3,0 kV. Tipično, 3,0 kV je dovoljno za 100% taloženje, bez obzira na promjenu površinskog naboja. Pod istim uvjetima, učinkovitost taloženja Baseline-EWNS-a bila je samo 56% zbog njihovog nižeg naboja (prosječno 10 elektrona po EWNS-u).
Na sl. 5 i u tablici 2 sažeto je prikazana vrijednost inaktivacije mikroorganizama inokuliranih na površini rajčice nakon izlaganja oko 40 000 #/cm3 EWNS-a tijekom 45 minuta pri optimalnom načinu rada [-6,5 kV, 4,0 cm]. Inokulirani E. coli i Lactobacillus innocuous pokazali su značajno smanjenje od 3,8 log tijekom izlaganja od 45 minuta. Pod istim uvjetima, S. enterica imala je smanjenje od 2,2 log, dok su S. cerevisiae i M. parafortutum imali smanjenje od 1,0 log.
Elektronske mikrografije (Slika 6) prikazuju fizičke promjene izazvane EWNS-om na bezopasnim stanicama Escherichia coli, Streptococcus i Lactobacillus, što dovodi do njihove inaktivacije. Kontrolne bakterije imale su netaknute stanične membrane, dok su izložene bakterije imale oštećene vanjske membrane.
Elektronsko-mikroskopsko snimanje kontrolnih i izloženih bakterija otkrilo je oštećenje membrane.
Podaci o fizikalno-kemijskim svojstvima optimiziranih EWNS-a zajedno pokazuju da su svojstva (površinski naboj i sadržaj ROS-a) EWNS-a značajno poboljšana u usporedbi s prethodno objavljenim osnovnim podacima EWNS-a8,9,10,11. S druge strane, njihova veličina ostala je u nanometarskom rasponu, vrlo slično prethodno objavljenim rezultatima, što im je omogućilo da ostanu u zraku dulje vrijeme. Opažena polidisperznost može se objasniti promjenama površinskog naboja koje određuju veličinu EWNS-a, slučajnošću Rayleighovog efekta i potencijalnom koalescencijom. Međutim, kako su detaljno opisali Nielsen i suradnici22, visoki površinski naboj smanjuje isparavanje učinkovitim povećanjem površinske energije/napona kapljice vode. U našoj prethodnoj publikaciji8 ova je teorija eksperimentalno potvrđena za mikrokapljice22 i EWNS. Gubitak naboja tijekom vremena također može utjecati na veličinu i doprinijeti opaženoj raspodjeli veličine.
Osim toga, naboj po strukturi iznosi oko 22-44 e-, ovisno o situaciji, što je znatno više u usporedbi s osnovnim EWNS-om, koji ima prosječni naboj od 10 ± 2 elektrona po strukturi. Međutim, treba napomenuti da je to prosječni naboj EWNS-a. Seto i sur. Pokazalo se da je naboj nehomogen i slijedi logaritamsko-normalnu distribuciju21. U usporedbi s našim prethodnim radom, udvostručenje površinskog naboja udvostručuje učinkovitost taloženja u EPES sustavu na gotovo 100%11.