Neke teme za rješavanje problema s LC-om nikada nisu zastarjele, budući da postoje problemi u praksi LC-a, iako se tehnologija instrumenata s vremenom poboljšava. Postoji mnogo načina na koje se problemi mogu pojaviti u LC sustavu i završiti u lošem obliku vrha. Kada se pojave problemi povezani s oblikom vrha, kratki popis mogućih uzroka za ove rezultate pomaže pojednostaviti naše iskustvo rješavanja problema.
Bilo je zabavno pisati ovu kolumnu “LC Troubleshooting” i razmišljati o temama svaki mjesec, jer neke teme nikad ne izlaze iz mode. Dok u području istraživanja kromatografije određene teme ili ideje postaju zastarjele jer ih zamjenjuju novije i bolje ideje, u području rješavanja problema, otkako se prvi članak o rješavanju problema pojavio u ovom časopisu (u to vrijeme LC Journal) jer su neke teme još uvijek relevantne) 1983. (1 ).Tijekom proteklih nekoliko godina usmjerio sam nekoliko odjeljaka o rješavanju problema s LC-om na suvremene trendove koji utječu na tekućinsku kromatografiju (LC) (na primjer, relativna usporedba našeg razumijevanja učinka pritiska na retenciju [2] Novi napredak) Naše tumačenje rezultata LC-a i kako otkloniti probleme s modernim LC instrumentima. U ovomjesečnom izdanju nastavljam svoju seriju (3), koja je započela u prosincu 2021., a koja se fokusirala na neke od tema o "životu i smrti" pri rješavanju problema s LC-om — elementi koji su odlični za bilo koji alat za rješavanje problema bitni su, bez obzira na starost sustava koji koristimo. Temeljna tema ove serije vrlo je relevantna za poznati LCGC-ov zidni grafikon "Vodič za rješavanje problema s LC-om" (4) koji visi u mnogim laboratorijima. Za treći dio ove serije odlučio sam se usredotočiti na pitanja koja se odnose na oblik vrha ili karakteristike vrha. Nevjerojatno, zidni grafikon navodi 44 različita potencijalna uzroka lošeg vršnog oblika! Ne možemo detaljno razmotriti sve ove probleme u jednom članku, pa ću se u ovom prvom dijelu o toj temi usredotočiti na neke od onih koje najčešće vidim. Nadam se da će mladi i stari korisnici LC-a pronaći neke korisne savjete i podsjetnike o ovoj važnoj temi.
Sve češće odgovaram na pitanja o rješavanju problema sa "sve je moguće". Ovaj odgovor se može činiti laganim kada uzmemo u obzir zapažanja koja je teško protumačiti, ali smatram da je često prikladan. Uz mnoge moguće uzroke lošeg oblika vrha, važno je imati otvoren um kada razmatrate što bi problem mogao biti i moći odrediti prioritet potencijalnih uzroka kako bismo započeli naše napore u rješavanju problema, usredotočujući se na one najčešće mogućnosti, ova točka je vrlo važna.moguće.
Ključni korak u svakoj vježbi rješavanja problema - ali onaj za koji mislim da je podcijenjen - je prepoznavanje da postoji problem koji treba riješiti. Prepoznavanje da postoji problem često znači prepoznavanje da je ono što se događa s alatom različito od naših očekivanja, koja su oblikovana teorijom, empirijskim znanjem i iskustvom (5). "Oblik vrha" koji se ovdje spominje zapravo se ne odnosi samo na oblik vrha (simetričan, asimetričan, gladak). , paperjast, vodeći rub, rep, itd.), ali također i na širinu. Naša očekivanja za stvarni oblik vrha su jednostavna. Teorija (6) dobro podupire očekivanje iz udžbenika da bi, u većini slučajeva, kromatografski vrhovi trebali biti simetrični i odgovarati obliku Gaussove distribucije, kao što je prikazano na slici 1a. Ono što očekujemo od širina vrha složenije je pitanje, a o ovoj ćemo temi raspravljati u budućem članku. Drugi oblik vrha s na slici 1 pokazuju neke od drugih mogućnosti koje se mogu uočiti—drugim riječima, neke od načina na koje bi stvari mogle poći po zlu. U ostatku ovog dijela posvetit ćemo vrijeme raspravljanju o nekim specifičnim primjerima situacija koje mogu dovesti do ovih oblika oblika.
Ponekad se vrhovi uopće ne uočavaju u kromatogramu gdje se očekuje da će biti eluirani. Gornji zidni dijagram pokazuje da je odsutnost vrha (pod pretpostavkom da uzorak zapravo sadrži ciljani analit u koncentraciji koja bi trebala učiniti odgovor detektora dovoljnim da se vidi iznad šuma) obično povezan s nekim problemom s instrumentom ili netočnim uvjetima mobilne faze (ako se uopće primijeti).vrhovi, obično preslabi). Kratak popis potencijalnih problema i rješenja u ovoj kategoriji može se pronaći u tablici I.
Kao što je gore spomenuto, pitanje koliko širenja vrha treba tolerirati prije nego što se obrati pozornost i pokuša popraviti složena je tema o kojoj ću raspravljati u budućem članku. Moje iskustvo je da je značajno širenje vrha često popraćeno značajnom promjenom oblika vrha, a rep vrha je češći nego prije vrha ili razdvajanja. Međutim, nominalno simetrični vrhovi su također prošireni, što može biti uzrokovano nekoliko različitih razloga:
Svaki od ovih problema je detaljno razmatran u prethodnim izdanjima Troubleshooting LC, a čitatelji zainteresirani za ove teme mogu se obratiti ovim prethodnim člancima za informacije o uzrocima i potencijalnim rješenjima za ove probleme.Više detalja.
Zaostajanje vrha, frontiranje vrha i razdvajanje mogu biti uzrokovani kemijskim ili fizičkim fenomenima, a popis mogućih rješenja za te probleme uvelike varira, ovisno o tome imamo li posla s kemijskim ili fizičkim problemom. Često, usporedbom različitih vrhova u kromatogramu, možete pronaći važne naznake o tome koji je krivac. Ako svi vrhovi u kromatogramu pokazuju slične oblike, uzrok najvjerojatnije nije fizički. .Ako je zahvaćen samo jedan ili nekoliko vrhova, ali ostali izgledaju dobro, uzrok je najvjerojatnije kemijski.
Kemijski uzroci vršnog zaostajanja previše su složeni da bi se ovdje ukratko raspravljalo. Zainteresirani čitatelj upućuje se na nedavno izdanje "LC Troubleshooting" za dublju raspravu (10). Međutim, lako je pokušati smanjiti masu ubrizganog analita i vidjeti hoće li se oblik vršne vrijednosti poboljšati. Ako je tako, onda je to dobar znak da je problem "preopterećenje mase". U ovom slučaju, metoda mora biti ograničena na ubrizgavanje male mase analita, ili se kromatografski uvjeti moraju promijeniti tako da se mogu dobiti dobri oblici vrhova čak i s ubrizganim većim masama.
Postoje i mnogi potencijalni fizički razlozi za vršno ubrizgavanje. Čitatelji zainteresirani za detaljnu raspravu o mogućnostima upućuju se na još jedno nedavno izdanje "LC Troubleshooting" (11). Jedan od češćih fizičkih uzroka vršnog tailinga je loša veza na točki između injektora i detektora (12). Ekstremni primjer prikazan je na slici 1d, dobiven u mom laboratoriju prije nekoliko tjedana. U ovom slučaju, izgradili smo sustav s novom injekcijom ventil koji prije nismo koristili i instalirali petlju za ubrizgavanje malog volumena s ferulom koja je bila ulivena na kapilaru od nehrđajućeg čelika. Nakon nekih početnih eksperimenata za rješavanje problema, shvatili smo da je dubina otvora u statoru ventila za ubrizgavanje mnogo dublja nego što smo navikli, što je rezultiralo velikim mrtvim volumenom na dnu otvora. Ovaj se problem lako rješava zamjenom petlje za ubrizgavanje drugom cijevi, možemo prilagoditi željezo postavite u pravilan položaj kako biste uklonili mrtvi volumen na dnu priključka.
Vršne fronte poput onih prikazanih na slici 1e također mogu biti uzrokovane fizičkim ili kemijskim problemima. Uobičajeni fizički uzrok vodećeg ruba je da sloj čestica stupca nije dobro zbijen ili da su se čestice reorganizirale tijekom vremena. Kao i kod vršnog repa uzrokovanog ovim fizičkim fenomenom, najbolji način da se to riješi je zamijeniti stupac i nastaviti dalje. U osnovi, oblici vrha vodećeg ruba kemijskog podrijetla često proizlaze iz onoga što nazivamo "ne- linearni” retencijski uvjeti. Pod idealnim (linearnim) uvjetima, količina analita koju zadržava stacionarna faza (dakle, retencijski faktor) linearno je povezana s koncentracijom analita u koloni. Kromatografski, to znači da kako se masa analita ubrizganog u kolonu povećava, vršna vrijednost postaje viša, ali ne i širi. Ovaj odnos se prekida kada je retencijsko ponašanje nelinearno, a vršne vrijednosti ne samo da postaju ta manji, ali i širi što se više mase ubrizgava. Osim toga, nelinearni oblici određuju oblik kromatografskih vrhova, što rezultira vodećim ili stražnjim rubovima. Kao i kod preopterećenja mase koje uzrokuje vršni rep (10), vršno vođenje uzrokovano nelinearnim zadržavanjem također se može dijagnosticirati smanjenjem mase ubrizganog analita. Ako se oblik vrha poboljša, metoda se mora modificirati tako da ne premaši kvalitetu ubrizgavanja koja uzrokuje vodeći rub, ili kromatografski uvjeti moraju se promijeniti kako bi se ovo ponašanje svelo na minimum.
Ponekad opažamo nešto što se čini kao "razdvojeni" vrh, kao što je prikazano na slici 1f. Prvi korak u rješavanju ovog problema je utvrditi je li oblik vrha posljedica djelomične koelucije (tj. prisutnosti dvaju različitih spojeva koji se međusobno dobro eluiraju). Ako zapravo postoje dva različita analita koja eluiraju blizu jedan drugoga, tada je stvar poboljšanja njihove rezolucije (na primjer, povećanjem selektivnosti, zadržavanja ili broja ploča) i prividnog "Razdvojeni" vrhovi povezani su s fizičkim performansama. Izvedba nema nikakve veze sa samim stupcem. Često je najvažniji trag ove odluke pokazuju li svi vrhovi u kromatogramu podijeljene oblike ili samo jedan ili dva. Ako su samo jedan ili dva, vjerojatno je problem koelucije;ako su svi vrhovi podijeljeni, to je vjerojatno fizički problem, najvjerojatnije povezan sa samim stupcem.
Podijeljeni vrhovi povezani s fizičkim svojstvima same kolone obično su posljedica djelomično blokiranih ulaznih ili izlaznih frita, ili reorganizacije čestica u koloni, što omogućuje mobilnoj fazi da teče brže od mobilne faze u određenim područjima formiranja kanala kolone. u drugim regijama (11). Djelomično začepljena frita ponekad se može očistiti preokretanjem protoka kroz kolonu;međutim, prema mom iskustvu, to je obično kratkoročno, a ne dugoročno rješenje. Ovo je često kobno kod modernih kolona ako se čestice rekombiniraju unutar kolone. U ovom trenutku, najbolje je zamijeniti kolonu i nastaviti.
Vršna vrijednost na slici 1g, također iz nedavnog slučaja u mom vlastitom laboratoriju, obično označava da je signal toliko visok da je dosegao gornju granicu raspona odziva. Za detektore optičke apsorbancije (UV-vis u ovom slučaju), kada je koncentracija analita vrlo visoka, analit apsorbira većinu svjetlosti koja prolazi kroz protočnu ćeliju detektora, ostavljajući vrlo malo svjetlosti za detekciju. Pod ovim uvjetima, električni signal iz fotodetektora je pod jakim utjecajem različitih izvora šuma, kao što je zalutala svjetlost i "tamna struja", čineći signal vrlo "nejasnim" izgledom i neovisnim o koncentraciji analita.Kada se to dogodi, problem se često može lako riješiti smanjenjem volumena ubrizgavanja analita—smanjenjem volumena ubrizgavanja, razrjeđivanjem uzorka ili oboje.
In chromatography school, we use the detector signal (ie, the y-axis in the chromatogram) as an indicator of the analyte concentration in the sample.So it seems odd to see a chromatogram with a signal below zero, as the simple interpretation is that this indicates a negative analyte concentration – which of course is not physically possible.In my experience, negative peaks are most often observed when using optical absorbance detectors (eg, UV-vis).
U ovom slučaju, negativni vrh jednostavno znači da molekule koje eluiraju iz kolone apsorbiraju manje svjetlosti od same mobilne faze neposredno prije i nakon vrha. To se može dogoditi, na primjer, kada se koriste relativno niske valne duljine detekcije (<230 nm) i aditivi mobilne faze koji apsorbiraju većinu svjetlosti na tim valnim duljinama. Takvi aditivi mogu biti komponente otapala mobilne faze kao što je metanol ili komponente pufera kao što su acetat ili format. negativne vršne vrijednosti za pripremu kalibracijske krivulje i dobivanje točnih kvantitativnih informacija, tako da nema temeljnog razloga za njihovo izbjegavanje same po sebi (ova se metoda ponekad naziva "neizravna UV detekcija") (13). Međutim, ako stvarno želimo potpuno izbjeći negativne vršne vrijednosti, u slučaju detekcije apsorbancije, najbolje je rješenje koristiti drugu valnu duljinu detekcije tako da analit apsorbira više od mobilne faze ili promijeniti sastav mobilne faze tako da apsorbiraju manje svjetlosti od analita.
Negativni vrhovi također se mogu pojaviti kada se koristi otkrivanje indeksa loma (RI) kada se indeks loma komponenata osim analita u uzorku, kao što je matrica otapala, razlikuje od indeksa loma mobilne faze. To se također događa s UV-vis detekcijom, ali ovaj učinak ima tendenciju da bude oslabljen u odnosu na detekciju RI. U oba slučaja, negativni vrhovi mogu se minimizirati bližim usklađivanjem sastava matrice uzorka onom mobilne faze.
U trećem dijelu o osnovnoj temi rješavanja problema s LC-om, raspravljao sam o situacijama u kojima se opaženi oblik vrha razlikuje od očekivanog ili normalnog oblika vrha. Učinkovito rješavanje takvih problema počinje poznavanjem očekivanih oblika vrha (temeljeno na teoriji ili prethodnom iskustvu s postojećim metodama), tako da su odstupanja od ovih očekivanja očita. Problemi s oblikom vrha imaju mnogo različitih potencijalnih uzroka (preširoko, rep, vodeći rub itd.). U ovom nastavku detaljno raspravljam o nekim od razloga Vidim najčešće. Poznavanje ovih detalja predstavlja dobro mjesto za početak rješavanja problema, ali ne obuhvaća sve mogućnosti. Čitatelji koje zanima detaljniji popis uzroka i rješenja mogu se obratiti LCGC zidnoj tablici “LC Troubleshooting Guide”.
(4) Zidna tablica LCGC “LC Troubleshooting Guide” https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analiza podataka i obrada signala u kromatografiji (Elsevier, New York, NY, 1998.), str. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF i Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.