Neke teme rješavanja problema s LC-om nikada nisu zastarjele, jer postoje problemi u LC praksi, čak i kako se tehnologija instrumenata s vremenom poboljšava. Postoji mnogo načina na koje se problemi mogu pojaviti u LC sustavu i završiti u lošem obliku vrha. Kada se pojave problemi povezani s oblikom vrha, kratki popis mogućih uzroka tih rezultata pomaže pojednostaviti naše iskustvo rješavanja problema.
Bilo je zabavno pisati ovu kolumnu „Rješavanje problema s LC-om“ i razmišljati o temama svaki mjesec, jer neke teme nikad ne izlaze iz mode. Dok u području istraživanja kromatografije određene teme ili ideje zastarevaju jer ih zamjenjuju novije i bolje ideje, u području rješavanja problema, od prvog članka o rješavanju problema koji se pojavio u ovom časopisu (tada LC Journal) (s obzirom na to da su neke teme još uvijek relevantne) 1983. (1). Tijekom proteklih nekoliko godina usmjerio sam nekoliko odjeljaka o rješavanju problema s LC-om na suvremene trendove koji utječu na tekućinsku kromatografiju (LC) (na primjer, relativna usporedba našeg razumijevanja učinka tlaka na zadržavanje [2] Novi napredak), našu interpretaciju rezultata LC-a i kako rješavati probleme s modernim LC instrumentima. U ovomjesečnom nastavku nastavljam svoju seriju (3), koja je započela u prosincu 2021., a koja se usredotočila na neke od „životnih“ tema rješavanja problema s LC-om - elementi koji su izvrsni za svakog rješavača problema su bitni, bez obzira na starost sustava koji koristimo. Središnja tema ove serije vrlo je relevantna za LCGC-ov poznati zidni dijagram „Vodič za rješavanje problema s LC-om“ (4) koji visi u mnogi laboratoriji. Za treći dio ove serije odlučio sam se usredotočiti na probleme vezane uz oblik ili karakteristike vrha. Nevjerojatno, zidna tablica navodi 44 različita potencijalna uzroka lošeg oblika vrha! Ne možemo detaljno razmotriti sve ove probleme u jednom članku, pa ću se u ovom prvom nastavku na tu temu usredotočiti na neke od onih koje najčešće viđam. Nadam se da će mladi i stari korisnici LC-a pronaći korisne savjete i podsjetnike o ovoj važnoj temi.
Sve češće na pitanja o rješavanju problema odgovaram s "sve je moguće". Ovaj odgovor može se činiti jednostavnim kada se razmatraju opažanja koja je teško interpretirati, ali često ga smatram prikladnim. S obzirom na mnoge moguće uzroke lošeg oblika vrha, važno je ostati otvorenog uma kada se razmatra u čemu bi mogao biti problem i moći odrediti prioritete potencijalnih uzroka kako bismo započeli s našim naporima za rješavanje problema, usredotočujući se na one najčešće mogućnosti, ova je točka vrlo važna.
Ključni korak u svakoj vježbi rješavanja problema - ali onaj koji mislim da je podcijenjen - jest prepoznavanje da postoji problem koji treba riješiti. Prepoznavanje da postoji problem često znači prepoznavanje da se ono što se događa s alatom razlikuje od naših očekivanja, koja su oblikovana teorijom, empirijskim znanjem i iskustvom (5). "Oblik vrha" na koji se ovdje referira zapravo se ne odnosi samo na oblik vrha (simetričan, asimetričan, gladak, pahuljast, vodeći rub, rep itd.), već i na širinu. Naša očekivanja za stvarni oblik vrha su jednostavna. Teorija (6) dobro podupire očekivanje iz udžbenika da bi u većini slučajeva kromatografski vrhovi trebali biti simetrični i odgovarati obliku Gaussove distribucije, kao što je prikazano na slici 1a. Ono što očekujemo od širina vrhova složenije je pitanje i o toj temi ćemo raspravljati u budućem članku. Ostali oblici vrhova na slici 1 pokazuju neke od drugih mogućnosti koje bi se mogle uočiti - drugim riječima, neke od načina na koje bi stvari mogle poći po zlu. U ostatku ovog dijela posvetit ćemo vrijeme raspravi o nekim specifičnim primjerima situacija koje mogu dovesti do ovih vrsta oblika.
Ponekad se vrhovi uopće ne uočavaju na kromatogramu tamo gdje se očekuje da će biti eluirani. Gornji zidni grafikon pokazuje da je odsutnost vrha (pod pretpostavkom da uzorak zapravo sadrži ciljani analit u koncentraciji koja bi trebala učiniti odziv detektora dovoljnim da ga vidi iznad šuma) obično povezana s nekim problemom instrumenta ili netočnim uvjetima mobilne faze (ako se uopće uočavaju). vrhovi, obično previše „slabi“). Kratak popis potencijalnih problema i rješenja u ovoj kategoriji može se pronaći u Tablici I.
Kao što je gore spomenuto, pitanje koliko širenja vrha treba tolerirati prije nego što se tome posveti pažnja i pokuša se popraviti složena je tema o kojoj ću raspravljati u budućem članku. Moje iskustvo je da značajno širenje vrha često prati značajna promjena oblika vrha, a repovi vrha su češći nego predvrh ili cijepanje. Međutim, nominalno simetrični vrhovi su također prošireni, što može biti uzrokovano nekoliko različitih razloga:
Svaki od ovih problema detaljno je raspravljen u prethodnim izdanjima časopisa Troubleshooting LC, a čitatelji zainteresirani za ove teme mogu se pozvati na te prethodne članke za informacije o uzrocima i potencijalnim rješenjima tih problema. Više detalja.
Rep vrhova, frontalizacija vrhova i cijepanje mogu biti uzrokovani kemijskim ili fizičkim pojavama, a popis potencijalnih rješenja za ove probleme uvelike varira, ovisno o tome imamo li posla s kemijskim ili fizičkim problemom. Često, usporedbom različitih vrhova u kromatogramu, možete pronaći važne tragove o tome koji je krivac. Ako svi vrhovi u kromatogramu pokazuju slične oblike, uzrok najvjerojatnije nije fizički. Ako je pogođen samo jedan ili nekoliko vrhova, ali ostali izgledaju dobro, uzrok je najvjerojatnije kemijski.
Kemijski uzroci repova vrhova previše su složeni da bi se ovdje ukratko raspravljali. Zainteresirani čitatelj upućuje se na nedavno izdanje časopisa „LC Troubleshooting“ za detaljniju raspravu (10). Međutim, lako je pokušati smanjiti masu ubrizganog analita i vidjeti poboljšava li se oblik vrha. Ako je tako, onda je to dobar pokazatelj da je problem „preopterećenje masom“. U ovom slučaju, metoda se mora ograničiti na ubrizgavanje malih masa analita ili se kromatografski uvjeti moraju promijeniti tako da se dobri oblici vrhova mogu dobiti čak i s ubrizganim većim masama.
Također postoje mnogi potencijalni fizički razlozi za pojavu repova vrhova. Čitatelji zainteresirani za detaljnu raspravu o mogućnostima upućuju se na još jedno nedavno izdanje časopisa „LC Troubleshooting“ (11). Jedan od češćih fizičkih uzroka pojave repova vrhova je loša veza u točki između injektora i detektora (12). Ekstreman primjer prikazan je na slici 1d, dobivenoj u mom laboratoriju prije nekoliko tjedana. U ovom slučaju, izgradili smo sustav s novim ventilom za ubrizgavanje koji prije nismo koristili i instalirali smo petlju za ubrizgavanje malog volumena s ferulom koja je bila oblikovana na kapilaru od nehrđajućeg čelika. Nakon nekoliko početnih eksperimenata s rješavanjem problema, shvatili smo da je dubina otvora u statoru ventila za ubrizgavanje mnogo veća nego što smo navikli, što je rezultiralo velikim mrtvim volumenom na dnu otvora. Ovaj problem se lako rješava zamjenom petlje za ubrizgavanje drugom cijevi, a ferulu možemo prilagoditi u odgovarajući položaj kako bismo uklonili mrtvi volumen na dnu otvora.
Fronte vrhova poput onih prikazanih na slici 1e također mogu biti uzrokovane fizičkim ili kemijskim problemima. Uobičajeni fizički uzrok vodećeg ruba je da sloj čestica u koloni nije dobro zbijen ili da su se čestice s vremenom reorganizirale. Kao i kod repa vrha uzrokovanog ovim fizičkim fenomenom, najbolji način za rješavanje ovog problema je zamjena kolone i nastavak rada. U osnovi, oblici vrhova vodećeg ruba kemijskog podrijetla često nastaju zbog onoga što nazivamo "nelinearnim" uvjetima zadržavanja. U idealnim (linearnim) uvjetima, količina analita koju zadržava stacionarna faza (dakle, faktor zadržavanja) linearno je povezana s koncentracijom analita u koloni. Kromatografski to znači da kako se masa analita ubrizganog u kolonu povećava, vrh postaje viši, ali ne i širi. Ovaj odnos se prekida kada je ponašanje zadržavanja nelinearno, a vrhovi ne samo da postaju viši, već i širi kako se ubrizgava veća masa. Osim toga, nelinearni oblici određuju oblik kromatografskih vrhova, što rezultira vodećim ili pratećim rubovima. Kao i kod preopterećenja masom koje uzrokuje rep vrha (10), vođenje vrha uzrokovano Nelinearno zadržavanje može se dijagnosticirati i smanjenjem mase ubrizganog analita. Ako se oblik vrha poboljša, metoda se mora modificirati kako ne bi premašila kvalitetu ubrizgavanja koja uzrokuje vodeći rub ili se kromatografski uvjeti moraju promijeniti kako bi se to ponašanje smanjilo.
Ponekad opažamo ono što se čini kao „razdvojeni“ vrh, kao što je prikazano na slici 1f. Prvi korak u rješavanju ovog problema je utvrditi je li oblik vrha posljedica djelomične koelucije (tj. prisutnosti dvaju različitih, ali blisko eluirajućih spojeva). Ako zapravo postoje dva različita analita koji eluiraju blizu jedan drugome, tada je riječ o poboljšanju njihove rezolucije (na primjer, povećanjem selektivnosti, retencije ili broja ploča), a prividni „razdvojeni“ vrhovi povezani su s fizičkim svojstvima. Performanse nemaju nikakve veze sa samom kolonom. Često je najvažniji trag za ovu odluku pokazuju li svi vrhovi u kromatogramu razdvojene oblike ili samo jedan ili dva. Ako je samo jedan ili dva, vjerojatno je riječ o problemu koelucije; ako su svi vrhovi razdvojeni, vjerojatno je riječ o fizičkom problemu, najvjerojatnije povezanom sa samom kolonom.
Razdvojeni vrhovi povezani s fizičkim svojstvima same kolone obično su posljedica djelomično blokiranih ulaznih ili izlaznih frita ili reorganizacije čestica u koloni, što omogućuje mobilnoj fazi brži protok od mobilne faze u određenim područjima formiranja kanala kolone u drugim regijama (11). Djelomično začepljena frita ponekad se može ukloniti preusmjeravanjem protoka kroz kolonu; međutim, po mom iskustvu, to je obično kratkoročno, a ne dugoročno rješenje. To je često kobno s modernim kolonama ako se čestice rekombiniraju unutar kolone. U ovom trenutku najbolje je zamijeniti kolonu i nastaviti.
Vrh na slici 1g, također iz nedavnog primjera u mom vlastitom laboratoriju, obično ukazuje na to da je signal toliko visok da je dosegao gornju granicu raspona odziva. Kod optičkih detektora apsorbancije (u ovom slučaju UV-Vis), kada je koncentracija analita vrlo visoka, analit apsorbira većinu svjetlosti koja prolazi kroz protočnu ćeliju detektora, ostavljajući vrlo malo svjetlosti za detekciju. U tim uvjetima, na električni signal iz fotodetektora snažno utječu različiti izvori šuma, poput zalutale svjetlosti i "tamne struje", što signal čini vrlo "mutnim" po izgledu i neovisnim o koncentraciji analita. Kada se to dogodi, problem se često može lako riješiti smanjenjem volumena ubrizgavanja analita - smanjenjem volumena ubrizgavanja, razrjeđivanjem uzorka ili oboje.
U školi kromatografije koristimo signal detektora (tj. y-os u kromatogramu) kao indikator koncentracije analita u uzorku. Stoga se čini neobičnim vidjeti kromatogram sa signalom ispod nule, jer je jednostavno tumačenje da to ukazuje na negativnu koncentraciju analita - što naravno nije fizički moguće. Po mom iskustvu, negativni vrhovi se najčešće opažaju pri korištenju optičkih detektora apsorbancije (npr. UV-vis).
U ovom slučaju, negativni vrh jednostavno znači da molekule koje eluiraju iz kolone apsorbiraju manje svjetlosti od same mobilne faze neposredno prije i nakon vrha. To se može dogoditi, na primjer, kada se koriste relativno niske valne duljine detekcije (<230 nm) i aditivi mobilne faze koji apsorbiraju većinu svjetlosti na tim valnim duljinama. Takvi aditivi mogu biti komponente otapala mobilne faze poput metanola ili komponente pufera poput acetata ili formata. Negativni vrhovi mogu se zapravo koristiti za pripremu kalibracijske krivulje i dobivanje točnih kvantitativnih informacija, tako da ne postoji temeljni razlog da ih se izbjegava per se (ova metoda se ponekad naziva „neizravna UV detekcija“) (13). Međutim, ako zaista želimo u potpunosti izbjeći negativne vrhove, u slučaju detekcije apsorbancije, najbolje rješenje je koristiti drugu valnu duljinu detekcije tako da analit apsorbira više od mobilne faze ili promijeniti sastav mobilne faze tako da apsorbiraju manje svjetlosti od analita.
Negativni vrhovi mogu se pojaviti i pri korištenju detekcije indeksa loma (RI) kada se indeks loma komponenti osim analita u uzorku, poput matrice otapala, razlikuje od indeksa loma mobilne faze. To se događa i kod UV-Vis detekcije, ali taj se učinak obično smanjuje u odnosu na RI detekciju. U oba slučaja, negativni vrhovi mogu se minimizirati bližim usklađivanjem sastava matrice uzorka s sastavom mobilne faze.
U trećem dijelu o osnovnoj temi rješavanja problema s LC-om, raspravljao sam o situacijama u kojima se opaženi oblik vrha razlikuje od očekivanog ili normalnog oblika vrha. Učinkovito rješavanje problema takvih problema započinje poznavanjem očekivanih oblika vrha (na temelju teorije ili prethodnog iskustva s postojećim metodama), tako da su odstupanja od tih očekivanja očita. Problemi s oblikom vrha imaju mnogo različitih potencijalnih uzroka (preširok, rep, vodeći rub itd.). U ovom nastavku detaljno raspravljam o nekim od razloga koje najčešće viđam. Poznavanje ovih detalja pruža dobro mjesto za početak rješavanja problema, ali ne obuhvaća sve mogućnosti. Čitatelji zainteresirani za detaljniji popis uzroka i rješenja mogu se pozvati na LCGC „Vodič za rješavanje problema s LC-om“.
(4) Zidna tablica LCGC „Vodič za rješavanje problema s LC-om“. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021.).
(6) A. Felinger, Analiza podataka i obrada signala u kromatografiji (Elsevier, New York, NY, 1998.), str. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF i Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.