Praćenje mikrobne raznolikosti u morskim obalnim ekosustavima korištenjem koncepta tekuće biopsije

Hvala što ste posjetili Nature.com.Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Tekuća biopsija (LB) koncept je koji brzo dobiva na popularnosti u biomedicinskom području.Koncept se uglavnom temelji na otkrivanju fragmenata cirkulirajuće izvanstanične DNA (ccfDNA), koji se uglavnom oslobađaju kao mali fragmenti nakon stanične smrti u različitim tkivima.Mali dio tih fragmenata potječe iz stranih (stranih) tkiva ili organizama.U trenutnom radu primijenili smo ovaj koncept na školjke, sentinel vrstu poznatu po svom visokom kapacitetu filtriranja morske vode.Koristimo sposobnost dagnji da djeluju kao prirodni filtri za hvatanje fragmenata DNK okoliša iz različitih izvora kako bismo pružili informacije o bioraznolikosti morskih obalnih ekosustava.Naši rezultati pokazuju da hemolimfa dagnje sadrži fragmente DNA koji se jako razlikuju po veličini, od 1 do 5 kb.Sekvencioniranje sačmarice pokazalo je da je veliki broj fragmenata DNK stranog mikrobnog podrijetla.Među njima smo pronašli fragmente DNK iz bakterija, arheja i virusa, uključujući viruse za koje je poznato da inficiraju razne domaćine koji se obično nalaze u obalnim morskim ekosustavima.Zaključno, naša studija pokazuje da koncept LB primijenjen na dagnje predstavlja bogat, ali još neistražen izvor znanja o mikrobnoj raznolikosti u morskim obalnim ekosustavima.
Utjecaj klimatskih promjena (CC) na biološku raznolikost morskih ekosustava brzo je rastuće područje istraživanja.Globalno zatopljenje ne samo da uzrokuje značajne fiziološke stresove, već i pomiče evolucijske granice toplinske stabilnosti morskih organizama, utječući na staništa brojnih vrsta, potičući ih na potragu za povoljnijim uvjetima [1, 2].Osim što utječe na bioraznolikost metazoa, CC remeti osjetljivu ravnotežu međudjelovanja domaćina i mikroba.Ova mikrobna disbakterioza predstavlja ozbiljnu prijetnju morskim ekosustavima jer čini morske organizme osjetljivijima na zarazne patogene [3, 4].Vjeruje se da SS imaju važnu ulogu u masovnim smrtima, što predstavlja ozbiljan problem za upravljanje globalnim morskim ekosustavima [5, 6].Ovo je važno pitanje s obzirom na ekonomske, ekološke i prehrambene učinke mnogih morskih vrsta.To posebno vrijedi za školjkaše koji žive u polarnim regijama, gdje su učinci CK neposredniji i teži [6, 7].Zapravo, školjkaši poput Mytilus spp.naširoko se koriste za praćenje učinaka CC-a na morske ekosustave.Nije iznenađujuće da je razvijen relativno velik broj biomarkera za praćenje njihovog zdravlja, često koristeći dvoslojni pristup koji uključuje funkcionalne biomarkere temeljene na enzimskoj aktivnosti ili staničnim funkcijama kao što su vitalnost stanica i fagocitna aktivnost [8].Ove metode također uključuju mjerenje koncentracije indikatora specifičnog tlaka koji se nakupljaju u mekim tkivima nakon apsorpcije velike količine morske vode.Međutim, veliki kapacitet filtracije i poluotvoreni cirkulacijski sustav školjkaša pružaju priliku za razvoj novih hemolimfnih biomarkera korištenjem koncepta tekuće biopsije (LB), jednostavnog i minimalno invazivnog pristupa liječenju bolesnika.uzorci krvi [9, 10].Iako se nekoliko tipova cirkulirajućih molekula može pronaći u ljudskom LB-u, ovaj se koncept primarno temelji na analizi sekvenciranja DNA fragmenata cirkulirajuće izvanstanične DNA (ccfDNA) u plazmi.Zapravo, prisutnost cirkulirajuće DNA u ljudskoj plazmi poznata je od sredine 20. stoljeća [11], ali tek je posljednjih godina pojava visokoučinkovitih metoda sekvenciranja dovela do kliničke dijagnoze temeljene na ccfDNA.Prisutnost ovih cirkulirajućih fragmenata DNA djelomično je posljedica pasivnog oslobađanja genomske DNA (nuklearne i mitohondrijske) nakon stanične smrti. U zdravih osoba koncentracija ccfDNA je normalno niska (<10 ng/mL), ali može biti povećana 5-10 puta kod pacijenata koji boluju od različitih patologija ili su pod stresom, što dovodi do oštećenja tkiva. U zdravih osoba koncentracija ccfDNA je normalno niska (<10 ng/mL), ali može biti povećana 5-10 puta kod pacijenata koji boluju od različitih patologija ili su pod stresom, što dovodi do oštećenja tkiva. U zdravih ljudi koncentracija vkkDNK u normi je niska (<10 ng/ml), ali se može povećati u 5-10 puta u bolesnika s različitom patologijom ili podvrgnutih stresu, potaknutom oštećenjem tkiva. U zdravih ljudi koncentracija cccDNA je normalno niska (<10 ng/mL), ali se može povećati 5-10 puta u bolesnika s različitim patologijama ili pod stresom koji dovodi do oštećenja tkiva.在健康个体中,ccfDNA 的浓度通常较低.(<10 ng/mL,但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍,从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 , ccfdna 的 浓度 较 低 ((<10 ng/ml) 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中可 增加 5-10 倍 , 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Koncentracije ccfDNA obično su niske (<10 ng/ml) kod zdravih ljudi, ali se mogu povećati za 5-10 puta kod pacijenata s različitim patologijama ili stresom, što dovodi do oštećenja tkiva. Koncentracije ccfDNA obično su niske (<10 ng/ml) u zdravih osoba, ali mogu biti povećane 5-10 puta u bolesnika s različitim patologijama ili stresom, što dovodi do oštećenja tkiva.Veličina fragmenata ccfDNA uvelike varira, ali obično se kreće od 150 do 200 bp.[12].Analiza samoproizvedene ccfDNA, tj. ccfDNA iz normalnih ili transformiranih stanica domaćina, može se koristiti za otkrivanje genetskih i epigenetskih promjena prisutnih u nuklearnom i/ili mitohondrijskom genomu, čime se kliničarima pomaže u odabiru specifičnih molekularno-ciljanih terapija [13] .Međutim, ccfDNA se može dobiti iz stranih izvora kao što je ccfDNA iz fetalnih stanica tijekom trudnoće ili iz transplantiranih organa [14,15,16,17].ccfDNA je također važan izvor informacija za otkrivanje prisutnosti nukleinskih kiselina infektivnog agensa (stranog), što omogućuje neinvazivno otkrivanje raširenih infekcija koje nisu identificirane hemokulturama, izbjegavajući invazivnu biopsiju zaraženog tkiva [18].Nedavne studije doista su pokazale da ljudska krv sadrži bogat izvor informacija koji se mogu koristiti za identifikaciju virusnih i bakterijskih patogena, te da je oko 1% ccfDNA pronađene u ljudskoj plazmi stranog podrijetla [19].Ove studije pokazuju da se bioraznolikost cirkulirajućeg mikrobioma organizma može procijeniti analizom ccfDNA.Međutim, donedavno se ovaj koncept koristio isključivo kod ljudi i, u manjoj mjeri, kod drugih kralješnjaka [20, 21].
U ovom radu koristimo LB potencijal za analizu ccfDNA Aulacomya atra, južne vrste koja se obično nalazi na subantarktičkom otočju Kerguelen, skupini otoka na vrhu velike visoravni koja je nastala prije 35 milijuna godina.vulkanska erupcija.Koristeći in vitro eksperimentalni sustav, otkrili smo da dagnje brzo preuzimaju fragmente DNK u morskoj vodi i ulaze u hemolimfni odjeljak.Sekvencioniranje sačmarice pokazalo je da ccfDNA hemolimfe dagnji sadrži fragmente DNK vlastitog i nevlastitog porijekla, uključujući simbiotske bakterije i fragmente DNK iz bioma tipičnih za hladne vulkanske morske obalne ekosustave.Hemolimfna ccfDNA također sadrži virusne sekvence izvedene iz virusa s različitim rasponima domaćina.Također smo pronašli fragmente DNK iz višestaničnih životinja kao što su ribe koštunjače, morske anemone, alge i insekti.Zaključno, naša studija pokazuje da se koncept LB može uspješno primijeniti na morske beskralješnjake kako bi se stvorio bogat genomski repertoar u morskim ekosustavima.
Odrasle jedinke (55-70 mm duge) Mytilus platensis (M. platensis) i Aulacomya atra (A. atra) sakupljene su s međuplimnih stjenovitih obala Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E .).Otoci Kerguelen u prosincu 2018. Druge odrasle plave dagnje (Mytilus spp.) nabavljene su od komercijalnog dobavljača (PEI Mussel King Inc., Otok princa Edwarda, Kanada) i stavljene u gazirani spremnik s kontroliranom temperaturom (4°C) koji sadrži 10–20 L umjetne salamure od 32‰.(umjetna morska sol Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, SAD).Za svaki pokus izmjerena je duljina i težina pojedinačnih školjki.
Besplatni protokol otvorenog pristupa za ovaj program dostupan je na mreži (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Ukratko, LB hemolimfa je sakupljena iz mišića abduktora kako je opisano [22].Hemolimfa je pročišćena centrifugiranjem na 1200×g 3 minute, supernatant je zamrznut (-20°C) do upotrebe.Za izolaciju i pročišćavanje cfDNA, uzorci (1,5-2,0 ml) su odmrznuti i obrađeni pomoću NucleoSnap cfDNA kompleta (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) prema uputama proizvođača.ccfDNA je pohranjena na -80°C do daljnje analize.U nekim pokusima, ccfDNA je izolirana i pročišćena pomoću QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada).Pročišćena DNA je kvantificirana korištenjem standardnog PicoGreen testa.Distribucija fragmenata izolirane ccfDNA analizirana je kapilarnom elektroforezom korištenjem bioanalizatora Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) korištenjem High Sensitivity DNA Kit.Ispitivanje je provedeno pomoću 1 µl uzorka ccfDNA prema uputama proizvođača.
Za sekvenciranje fragmenata ccfDNA hemolimfe, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) pripremio je biblioteke sačmarica pomoću kompleta Illumina DNA Mix iz kompleta Illumina MiSeq PE75.Korišten je standardni adapter (BioO).Datoteke s neobrađenim podacima dostupne su u arhivi čitanja sekvenci NCBI (SRR8924808 i SRR8924809).Osnovna kvaliteta čitanja procijenjena je pomoću FastQC [23].Trimmomatic [24] korišten je za isječke adaptera i očitanja loše kvalitete.Očitavanja sačmarice s uparenim krajevima FLASH su spojena u duža pojedinačna očitavanja s minimalnim preklapanjem od 20 bp kako bi se izbjegla nepodudaranja [25]. Spojena čitanja označena su s BLASTN pomoću baze podataka NCBI taksonomije školjkaša (e vrijednost < 1e-3 i 90% homologije), a maskiranje sekvenci niske složenosti izvedeno je pomoću DUST [26]. Spojena čitanja označena su s BLASTN pomoću baze podataka NCBI taksonomije školjkaša (e vrijednost < 1e-3 i 90% homologije), a maskiranje sekvenci niske složenosti izvedeno je pomoću DUST [26]. Ujedinjeni podaci bili su zabilježeni uz pomoć BLASTN-a korištenjem baze podataka taksonomije dvustvornih moljuskova NCBI (značenje e < 1e-3 i 90% gomologije), a maskiranje uzastopne niske složenosti izvršeno je pomoću DUST [26]. Skupna očitavanja označena su s BLASTN pomoću NCBI baze podataka taksonomije školjkaša (e vrijednost < 1e-3 i 90% homologije), a maskiranje niza niske složenosti provedeno je pomoću DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库(e 值< 1e-3 和90% 同源性)用BLASTN 注释合并的读数,并使用DUST [26] 行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 (((<1e-3 和 90% 同源) 用 用 用 注释 合并 读数 , 并 使用 prašina [26] 进行复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Ujedinjeni podaci bili su zabilježeni uz pomoć BLASTN-a korištenjem taksonomske baze podataka dvustvornih moljuskova NCBI (značajnost e <1e-3 i 90% gomologije), a maskiranje uzastopne niske složenosti izvršeno je pomoću DUST [26]. Skupna očitavanja označena su s BLASTN pomoću NCBI taksonomske baze podataka o školjkašima (e vrijednost <1e-3 i 90% homologije), a maskiranje niza niske složenosti provedeno je pomoću DUST [26].Čitanja su podijeljena u dvije skupine: vezana uz sekvence školjkaša (ovdje nazvana samočitanja) i nepovezana (nesamočitanja).Dvije skupine su odvojeno sastavljene pomoću MEGAHIT-a za generiranje kontiga [27].U međuvremenu, taksonomska distribucija očitavanja mikrobioma vanzemaljaca klasificirana je pomoću Kraken2 [28] i grafički predstavljena Krona kružnim dijagramom na Galaxy [29, 30].Iz naših preliminarnih eksperimenata utvrđeno je da je optimalni kmer kmer-59. Sopstveni kontigi su zatim identificirani usklađivanjem s BLASTN (bazom podataka NCBI školjkaša, e vrijednost < 1e−10 i 60% homologije) za konačnu napomenu. Sopstveni kontigi su zatim identificirani usklađivanjem s BLASTN (bazom podataka NCBI školjkaša, e vrijednost < 1e−10 i 60% homologije) za konačnu napomenu. Zatim su vlastiti kontigenti identificirani putem supostavljenja s BLASTN (baza podataka dvostvornih moljuskova NCBI, vrijednost e <1e-10 i gomologija 60%) za konačnu bilješku. Samokontigovi su zatim identificirani uspoređivanjem s BLASTN (NCBI baza podataka o školjkašima, e vrijednost <1e-10 i 60% homologije) za konačnu napomenu.然后通过与BLASTN(双壳贝类NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% 同源性)对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN(双壳贝类NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% Zatim su identificirani vlastiti kontigi za konačnu bilješku putem supostavljenosti s BLASTN (baza podataka NCBI za dvostvorne mekušce, vrijednost e <1e-10 i gomologija 60%). Samokontigovi su zatim identificirani za konačnu napomenu uspoređivanjem s BLASTN (NCBI baza podataka školjkaša, e vrijednost <1e-10 i 60% homologije). Paralelno, kontigovi skupina koje nisu vlastite označeni su s BLASTN (nt NCBI baza podataka, e vrijednost < 1e-10 i 60% homologije). Paralelno, kontigovi skupina koje nisu vlastite označeni su s BLASTN (nt NCBI baza podataka, e vrijednost < 1e-10 i 60% homologije). Paralelno su kontigumenti stranog roda bili označeni pomoću BLASTN (baza podataka nt NCBI, vrijednost e <1e-10 i gomologija 60%). Paralelno, kontigovi stranih skupina označeni su s BLASTN (NT NCBI baza podataka, e vrijednost <1e-10 i 60% homologije).平行地,用BLASTN(nt NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% 同源性)注释非自身组重叠群。平行地,用BLASTN(nt NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% 同源性)注释非自身组重叠群。 Paralelno kontigi, koji se ne odnose na vlastitu grupu, bili su označeni pomoću BLASTN (baza podataka nt NCBI, vrijednost e <1e-10 i gomologija 60%). Paralelno, kontigovi ne-samih skupina označeni su s BLASTN (nt NCBI baza podataka, e vrijednost <1e-10 i 60% homologije). BLASTX je također proveden na nesamostalnim kontigovima korištenjem NCBI baza podataka nr i RefSeq proteina (e vrijednost < 1e-10 i 60% homologije). BLASTX je također proveden na nesamostalnim kontigovima korištenjem NCBI baza podataka nr i RefSeq proteina (e vrijednost < 1e-10 i 60% homologije). BLASTX je također proveden na nesamostalnim kontigama korištenjem baze podataka belka nr i RefSeq NCBI (značenje e <1e-10 i gomologija 60%). BLASTX je također izveden na ne-samostalnim kontigovima koristeći nr i RefSeq NCBI proteinske baze podataka (e vrijednost < 1e-10 i 60% homologije).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX(e 值< 1e-10 和60% 同源性)。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX(e 值< 1e-10 和60% 同源性)。 BLASTX također izvodi nesamostalne kontigate korištenjem baze podataka belka nr i RefSeq NCBI (značenje e <1e-10 i gomologija 60%). BLASTX je također izveden na ne-samostalnim kontigovima koristeći nr i RefSeq NCBI proteinske baze podataka (e vrijednost <1e-10 i 60% homologija).Skupovi BLASTN i BLASTX nesamokontigova predstavljaju konačne kontigove (pogledajte dopunsku datoteku).
Početnice koje se koriste za PCR navedene su u tablici S1.Taq DNA polimeraza (Bio Basic Canada, Markham, ON) korištena je za pojačanje ccfDNA ciljnih gena.Korišteni su sljedeći reakcijski uvjeti: denaturacija na 95°C tijekom 3 minute, 95°C tijekom 1 minute, postavljena temperatura žarenja tijekom 1 minute, elongacija na 72°C tijekom 1 minute, 35 ciklusa i konačno 72°C unutar 10 minuta..PCR proizvodi su odvojeni elektroforezom u agaroznim gelovima (1,5%) koji sadrže SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) na 95 V.
Dagnje (Mytilus spp.) su aklimatizirane u 500 ml oksigenirane morske vode (32 PSU) 24 sata na 4°C.Plazmidna DNA koja sadrži umetak koji kodira cDNA sekvencu ljudskog galektina-7 (NCBI pristupni broj L07769) dodana je u bočicu u konačnoj koncentraciji od 190 µg/µl.Dagnje inkubirane pod istim uvjetima bez dodatka DNA bile su kontrola.Treći kontrolni spremnik sadržavao je DNK bez dagnji.Za praćenje kvalitete DNA u morskoj vodi, uzorci morske vode (20 μl; tri ponavljanja) uzeti su iz svakog spremnika u navedeno vrijeme.Za sljedivost plazmidne DNA, LB dagnje su sakupljene u naznačeno vrijeme i analizirane qPCR-om i ddPCR-om.Zbog visokog sadržaja soli u morskoj vodi, alikvoti su razrijeđeni u PCR kvalitetnoj vodi (1:10) prije svih PCR testova.
Digitalna kapljična PCR (ddPCR) provedena je korištenjem BioRad QX200 protokola (Misissauga, Ontario, Kanada).Koristite temperaturni profil za određivanje optimalne temperature (tablica S1).Kapi su generirane korištenjem QX200 generatora kapi (BioRad).ddPCR je proveden na sljedeći način: 95°C tijekom 5 minuta, 50 ciklusa od 95°C tijekom 30 s i dane temperature žarenja tijekom 1 minute i 72°C tijekom 30 sekundi, 4°C tijekom 5 minuta i 90°C unutar 5 minuta.Broj kapi i pozitivnih reakcija (broj kopija/µl) mjeren je QX200 čitačem kapi (BioRad).Uzorci s manje od 10.000 kapljica su odbijeni.Kontrola uzorka nije izvršena svaki put kada je ddPCR pokrenut.
qPCR je proveden pomoću Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australija) i LGALS7 specifičnih primera.Svi kvantitativni PCR-ovi su izvedeni u 20 µl korištenjem QuantiFast SYBR Green PCR kompleta (QIAGEN).qPCR je započeo s 15 minuta inkubacije na 95 °C nakon čega je uslijedilo 40 ciklusa na 95 °C tijekom 10 sekundi i na 60 °C tijekom 60 sekundi s jednim prikupljanjem podataka.Krivulje taljenja generirane su uzastopnim mjerenjima na 95 °C tijekom 5 s, 65 °C tijekom 60 s i 97 °C na kraju qPCR-a.Svaki qPCR izveden je u tri primjerka, osim kontrolnih uzoraka.
Budući da su dagnje poznate po visokoj stopi filtracije, prvo smo istražili mogu li filtrirati i zadržati fragmente DNK prisutne u morskoj vodi.Također nas je zanimalo nakupljaju li se ti fragmenti u njihovom poluotvorenom limfnom sustavu.Riješili smo ovaj problem eksperimentalno prateći sudbinu topivih fragmenata DNK dodanih u akvarijume s plavim dagnjama.Kako bismo olakšali praćenje fragmenata DNK, koristili smo stranu (ne vlastitu) plazmidnu DNK koja sadrži ljudski gen galektin-7.ddPCR prati fragmente plazmidne DNA u morskoj vodi i školjkama.Naši rezultati pokazuju da ako je količina fragmenata DNA u morskoj vodi ostala relativno konstantna tijekom vremena (do 7 dana) u odsutnosti dagnji, tada je u prisutnosti dagnji ta razina gotovo potpuno nestala unutar 8 sati (Slika 1a,b).Fragmenti egzogene DNA lako su detektirani unutar 15 minuta u intravalvularnoj tekućini i hemolimfi (slika 1c).Ti se fragmenti još uvijek mogu otkriti do 4 sata nakon izlaganja.Ova aktivnost filtriranja u odnosu na fragmente DNA usporediva je s aktivnošću filtriranja bakterija i algi [31].Ovi rezultati sugeriraju da dagnje mogu filtrirati i akumulirati stranu DNK u svojim tekućinskim odjeljcima.
Relativne koncentracije plazmidne DNA u morskoj vodi u prisutnosti (A) ili odsutnosti (B) dagnji, mjereno ddPCR-om.U A, rezultati su izraženi kao postoci, s rubovima okvira koji predstavljaju 75. i 25. percentil.Prilagođena logaritamska krivulja prikazana je crvenom bojom, a područje osjenčano sivom bojom predstavlja 95% interval pouzdanosti.U B, crvena linija predstavlja srednju vrijednost, a plava linija predstavlja 95% interval pouzdanosti za koncentraciju.C Akumulacija plazmidne DNA u hemolimfi i valvularnoj tekućini dagnji u različitim vremenima nakon dodavanja plazmidne DNA.Rezultati su predstavljeni kao apsolutni broj otkrivenih kopija/mL (±SE).
Zatim smo istražili podrijetlo ccfDNA u dagnjama prikupljenim iz ležišta dagnji na otočju Kerguelen, udaljenoj skupini otoka s ograničenim antropogenim utjecajem.U tu svrhu izolirana je cccDNA iz hemolimfe dagnji i pročišćena metodama koje se uobičajeno koriste za pročišćavanje ljudske cccDNA [32, 33].Otkrili smo da su prosječne koncentracije ccfDNA hemolimfe u dagnjama u rasponu niskih mikrograma po ml hemolimfe (vidi tablicu S2, dodatne informacije).Ovaj raspon koncentracija puno je veći nego kod zdravih ljudi (niski nanogrami po mililitru), ali u rijetkim slučajevima, kod pacijenata oboljelih od raka, razina ccfDNA može doseći nekoliko mikrograma po mililitru [34, 35].Analiza raspodjele veličine ccfDNA hemolimfe pokazala je da ti fragmenti jako variraju u veličini, u rasponu od 1000 bp do 1000 bp.do 5000 bp (slika 2).Slični rezultati dobiveni su korištenjem QIAamp Investigator Kit-a na bazi silicijevog dioksida, metode koja se obično koristi u forenzičkoj znanosti za brzu izolaciju i pročišćavanje genomske DNA iz uzoraka DNA niske koncentracije, uključujući ccfDNA [36].
Reprezentativni ccfDNA elektroforegram hemolimfe dagnji.Ekstrahirano s NucleoSnap Plasma Kit (gore) i QIAamp DNA Investigator Kit.B Violinski dijagram koji prikazuje distribuciju koncentracija ccfDNA hemolimfe (±SE) u školjkama.Crne i crvene linije predstavljaju medijan, odnosno prvi i treći kvartil.
Otprilike 1% ccfDNA u ljudi i primata ima strani izvor [21, 37].S obzirom na poluotvoreni cirkulacijski sustav školjkaša, morsku vodu bogatu mikrobima i distribuciju veličine ccfDNA dagnje, pretpostavili smo da ccfDNA hemolimfe dagnje može sadržavati bogat i raznolik skup mikrobne DNA.Kako bismo testirali ovu hipotezu, sekvencirali smo ccfDNA hemolimfe iz uzoraka Aulacomya atra prikupljenih s otočja Kerguelen, dajući više od 10 milijuna očitavanja, od kojih je 97,6% prošlo kontrolu kvalitete.Očitanja su zatim klasificirana prema vlastitim i ne-vlastitim izvorima koristeći BLASTN i NCBI baze podataka školjkaša (Sl. S1, Dodatne informacije).
Kod ljudi, i nuklearna i mitohondrijska DNA mogu se otpustiti u krvotok [38].Međutim, u ovoj studiji nije bilo moguće detaljno opisati nuklearnu genomsku DNK dagnji, s obzirom na to da genom A. atra nije sekvenciran niti opisan.Međutim, uspjeli smo identificirati niz fragmenata ccfDNA našeg vlastitog podrijetla koristeći biblioteku školjkaša (Sl. S2, Dodatne informacije).Također smo potvrdili prisutnost fragmenata DNA vlastitog podrijetla usmjerenom PCR amplificiranjem onih gena A. atra koji su sekvencirani (slika 3).Slično tome, s obzirom da je mitohondrijski genom A. atra dostupan u javnim bazama podataka, mogu se pronaći dokazi o prisutnosti mitohondrijskih fragmenata ccfDNA u hemolimfi A. atra.Prisutnost fragmenata mitohondrijske DNA potvrđena je PCR amplifikacijom (slika 3).
Razni mitohondrijski geni bili su prisutni u hemolimfi A. atra (crvene točkice – dionički broj: SRX5705969) i M. platensis (plave točkice – dionički broj: SRX5705968) umnoženoj PCR-om.Slika prilagođena iz Breton et al., 2011 B Amplifikacija supernatanta hemolimfe iz A. atra Pohranjeno na FTA papiru.Koristite bušilicu od 3 mm za dodavanje izravno u PCR epruvetu koja sadrži PCR mješavinu.
S obzirom na obilan sadržaj mikroba u morskoj vodi, prvo smo se usredotočili na karakterizaciju sekvenci mikrobne DNA u hemolimfi.Da bismo to učinili, koristimo dvije različite strategije.Prva strategija koristila je Kraken2, program za klasifikaciju sekvenci temeljen na algoritmu koji može identificirati sekvence mikroba s točnošću usporedivom s BLAST-om i drugim alatima [28].Za više od 6719 očitanja utvrđeno je da su bakterijskog podrijetla, dok su 124 i 64 bila iz arheja odnosno virusa (slika 4).Najzastupljeniji fragmenti bakterijske DNA bili su Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) i Bacteroidetes (17%) (Slika 4a).Ova je distribucija u skladu s prethodnim studijama mikrobioma morske plave dagnje [39, 40].Gammaproteobacteria bile su glavna klasa Proteobacteria (44%), uključujući mnoge Vibrionales (Slika 4b).Metoda ddPCR potvrdila je prisutnost fragmenata DNA Vibrio u ccfDNA hemolimfe A. atra (slika 4c) [41].Da bi se dobilo više informacija o bakterijskom podrijetlu ccfDNA, uzet je dodatni pristup (Sl. S2, Dodatne informacije). U ovom slučaju, očitavanja koja su se preklapala sastavljena su kao uparena očitavanja i klasificirana kao vlastita (školjke) ili nevlastita podrijetla pomoću BLASTN i e vrijednosti 1e-3 i granične vrijednosti s >90% homologije. U ovom slučaju, očitavanja koja su se preklapala sastavljena su kao uparena očitavanja i klasificirana kao vlastita (školjke) ili nevlastita podrijetla pomoću BLASTN i e vrijednosti 1e-3 i granične vrijednosti s >90% homologije. U ovom slučaju ispravke su sastavljene kao stavke s parnim krajevima i klasificirane kao vlastite (dvustvorčati moljuski) ili druge po podrijetlu pomoću BLASTN i značenja e 1e-3 i ocjene s gomologijom> 90%. U ovom slučaju, očitanja koja se preklapaju prikupljena su kao očitanja s parnim krajevima i klasificirana su kao izvorna (bivalve) ili neoriginalna pomoću BLASTN i e vrijednosti 1e-3 i granične vrijednosti s >90% homologije.在这种情况下,重叠的读数组装为配对末端读数,并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90% 同源性的截止值分类为自身(双壳类)或非自身来源。在 这 种 情况 下 , 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 , 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的 值和> 90% 同源性 的 分类 自身 (双 壳类) 非 自身。。。。。。。。。 U ovom slučaju prekrivajuće stavke su prikupljene kao stavke s parnim krajevima i klasificirane kao vlastite (dvustvorčati moljuski) ili neosobne po podrijetlu s korištenjem vrijednosti e BLASTN i 1e-3 i poroga gomologije> 90%. U ovom slučaju, očitanja koja se preklapaju prikupljena su kao očitanja u paru i klasificirana kao vlastita (školjke) ili neoriginalna pomoću vrijednosti e BLASTN i 1e-3 i praga homologije >90%.Budući da genom A. atra još nije sekvenciran, upotrijebili smo de novo strategiju sklapanja MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) asemblera.Ukupno 147.188 kontiga je identificirano kao ovisno (školjke) podrijetla.Ovi kontigi su zatim eksplodirani s e-vrijednostima od 1e-10 pomoću BLASTN i BLASTX.Ova nam je strategija omogućila identificiranje 482 fragmenta bez školjkaša prisutnih u ccfDNA A. atra.Više od polovice (57%) ovih fragmenata DNA dobiveno je od bakterija, uglavnom od škržnih simbionta, uključujući sulfotrofne simbionte, i od škržnih simbionta Solemya velum (Sl. 5).
Relativna brojnost na razini tipa.B Raznolikost mikroba dva glavna tipa (Firmicutes i Proteobacteria).Reprezentativno umnožavanje ddPCR C Vibrio spp.A. Fragmenti gena 16S rRNA (plavo) u tri atra hemolimfe.
Ukupno su analizirana 482 prikupljena kontiga.Opći profil taksonomske distribucije metagenomskih kontig anotacija (prokarioti i eukarioti).B Detaljna distribucija fragmenata bakterijske DNA identificirane pomoću BLASTN i BLASTX.
Kraken2 analiza također je pokazala da ccfDNA dagnji sadrži fragmente DNA arhea, uključujući fragmente DNA Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) i Thaurmarcheota (11%) (Slika 6a).Prisutnost fragmenata DNA izvedenih iz Euryarchaeota i Crenarchaeota, prethodno pronađenih u mikrobnoj zajednici kalifornijskih dagnji, ne bi trebala biti iznenađenje [42].Iako se Euryarchaeota često povezuje s ekstremnim uvjetima, sada je poznato da su i Euryarchaeota i Crenarcheota među najčešćim prokariotima u morskom kriogenom okolišu [43, 44].Prisutnost metanogenih mikroorganizama u školjkama nije iznenađujuća, s obzirom na nedavna izvješća o opsežnim curenjima metana iz curenja na dnu na visoravni Kerguelen [45] i moguću mikrobnu proizvodnju metana uočenu uz obalu otočja Kerguelen [46].
Naša se pažnja zatim usmjerila na očitavanja DNK virusa.Koliko znamo, ovo je prvo istraživanje sadržaja virusa u dagnjama koje nije ciljano.Očekivano, pronašli smo fragmente DNA bakteriofaga (Caudovirales) (Slika 6b).Međutim, najčešća virusna DNK dolazi iz grupe nukleocitovirusa, također poznatih kao nuklearni citoplazmatski virus velike DNK (NCLDV), koji ima najveći genom od svih virusa.Unutar ovog tipa, većina DNA sekvenci pripada obiteljima Mimimidoviridae (58%) i Poxviridae (21%), čiji prirodni domaćini uključuju kralježnjake i člankonošce, dok mali dio tih DNA sekvenci pripada poznatim virološkim algama.Inficira morske eukariotske alge.Sekvence su također dobivene iz Pandora virusa, divovskog virusa s najvećom veličinom genoma od svih poznatih virusnih rodova.Zanimljivo je da je raspon domaćina za koje se zna da su zaraženi virusom, kako je utvrđeno sekvenciranjem ccfDNA hemolimfe, bio relativno velik (Slika S3, Dodatne informacije).Uključuje viruse koji inficiraju insekte kao što su Baculoviridae i Iridoviridae, kao i viruse koji inficiraju amebe, alge i kralježnjake.Također smo pronašli sekvence koje odgovaraju genomu Pithovirus sibericum.Pitovirusi (također poznati kao "zombi virusi") prvi su put izolirani iz 30 000 godina starog permafrosta u Sibiru [47].Stoga su naši rezultati u skladu s prethodnim izvješćima koja pokazuju da nisu sve moderne vrste ovih virusa izumrle [48] i da bi ti virusi mogli biti prisutni u udaljenim subarktičkim morskim ekosustavima.
Konačno, testirali smo možemo li pronaći fragmente DNK drugih višestaničnih životinja.Ukupno 482 strana kontiga identificirana su pomoću BLASTN i BLASTX s bibliotekama nt, nr i RefSeq (genomska i proteinska).Naši rezultati pokazuju da među stranim fragmentima ccfDNA višestaničnih životinja prevladava DNA koštanih kostiju (slika 5).Također su pronađeni fragmenti DNK insekata i drugih vrsta.Relativno velik dio fragmenata DNA nije identificiran, vjerojatno zbog podzastupljenosti velikog broja morskih vrsta u genomskim bazama podataka u usporedbi s kopnenim vrstama [49].
U ovom radu primjenjujemo LB koncept na dagnje, tvrdeći da sekvenciranje ccfDNA hemolimfe može pružiti uvid u sastav morskih obalnih ekosustava.Konkretno, otkrili smo da 1) hemolimfa dagnji sadrži relativno visoke koncentracije (mikrogramske razine) relativno velikih (~1-5 kb) cirkulirajućih fragmenata DNA;2) ovi fragmenti DNA su neovisni i nesamostalni 3) Među stranim izvorima ovih fragmenata DNA pronašli smo bakterijsku, arhealnu i virusnu DNA, kao i DNA drugih višestaničnih životinja;4) Akumulacija ovih stranih fragmenata ccfDNA u hemolimfi događa se brzo i doprinosi unutarnjoj aktivnosti filtriranja dagnji.Zaključno, naša studija pokazuje da koncept LB, koji se do sada uglavnom primjenjivao u području biomedicine, kodira bogat, ali neistražen izvor znanja koji se može koristiti za bolje razumijevanje interakcije između sentinel vrsta i njihovog okoliša.
Osim kod primata, izolacija ccfDNA zabilježena je i kod sisavaca, uključujući miševe, pse, mačke i konje [50, 51, 52].Međutim, koliko znamo, naša je studija prva koja je izvijestila o otkrivanju i sekvenciranju ccfDNA u morskim vrstama s otvorenim sustavom cirkulacije.Ova anatomska značajka i sposobnost filtriranja dagnji mogu, barem djelomično, objasniti različite karakteristike veličine cirkulirajućih fragmenata DNK u usporedbi s drugim vrstama.Kod ljudi, većina fragmenata DNA koji cirkuliraju u krvi su mali fragmenti veličine od 150 do 200 bp.s maksimalnim vrhom od 167 bp [34, 53].Mali, ali značajan dio fragmenata DNA veličine je između 300 i 500 bp, a oko 5% je dulje od 900 bp.[54].Razlog za ovu distribuciju veličine je taj što se glavni izvor ccfDNA u plazmi javlja kao rezultat stanične smrti, bilo zbog stanične smrti ili zbog nekroze cirkulirajućih hematopoetskih stanica kod zdravih pojedinaca ili zbog apoptoze tumorskih stanica kod pacijenata s rakom (poznato kao cirkulirajuća tumorska DNK)., ctDNA).Raspodjela veličine ccfDNA hemolimfe koju smo pronašli u školjkama kretala se od 1000 do 5000 bp, što sugerira da ccfDNA školjke ima drugačije podrijetlo.Ovo je logična hipoteza, budući da dagnje imaju poluotvoren vaskularni sustav i žive u morskim vodenim sredinama koje sadrže visoke koncentracije mikrobne genomske DNA.Zapravo, naši laboratorijski eksperimenti koji koriste egzogenu DNK pokazali su da dagnje nakupljaju fragmente DNK u morskoj vodi, barem nakon nekoliko sati oni se razgrađuju nakon staničnog unosa i/ili oslobađaju i/ili pohranjuju u raznim organizacijama.S obzirom na rijetkost stanica (i prokariotskih i eukariotskih), korištenje intravalvularnih odjeljaka smanjit će količinu ccfDNA iz vlastitih izvora kao i iz stranih izvora.Uzimajući u obzir važnost urođene imunosti školjkaša i velikog broja cirkulirajućih fagocita, nadalje smo pretpostavili da je čak i strana ccfDNA obogaćena cirkulirajućim fagocitima koji nakupljaju stranu DNA nakon gutanja mikroorganizama i/ili staničnih ostataka.Uzeti zajedno, naši rezultati pokazuju da je ccfDNA hemolimfe školjkaša jedinstveno spremište molekularnih informacija i učvršćuje njihov status kao nadzorne vrste.
Naši podaci pokazuju da sekvenciranje i analiza fragmenata ccfDNA hemolimfe bakterijskog porijekla može pružiti ključne informacije o bakterijskoj flori domaćina i bakterijama prisutnim u okolnom morskom ekosustavu.Tehnike sekvenciranja hitaca otkrile su sekvence komenzalne bakterije A. atra gill koje bi bile promašene da su korištene konvencionalne metode identifikacije 16S rRNA, dijelom zbog pristranosti referentne biblioteke.Zapravo, naša upotreba LB podataka prikupljenih od M. platensis u istom sloju dagnji u Kerguelenu pokazala je da je sastav bakterijskih simbionta povezanih sa škrgama bio isti za obje vrste dagnji (Sl. S4, Dodatne informacije).Ova sličnost dviju genetski različitih dagnji može odražavati sastav bakterijskih zajednica u hladnim, sumpornim i vulkanskim naslagama Kerguelena [55, 56, 57, 58].Više razine mikroorganizama koji reduciraju sumpor dobro su opisane prilikom vađenja dagnji iz bioturbiranih obalnih područja [59], kao što je obala Port-au-Francea.Druga je mogućnost da komenzalna flora dagnji može biti pogođena horizontalnim prijenosom [60, 61].Potrebna su dodatna istraživanja kako bi se utvrdila korelacija između morskog okoliša, površine morskog dna i sastava simbiotskih bakterija u školjkama.Ove studije su trenutno u tijeku.
Duljina i koncentracija ccfDNA hemolimfe, njezino jednostavno pročišćavanje i visoka kvaliteta koja omogućuje brzo sekvencioniranje sačmarice neke su od mnogih prednosti korištenja ccfDNA dagnji za procjenu bioraznolikosti u morskim obalnim ekosustavima.Ovaj pristup je posebno učinkovit za karakterizaciju virusnih zajednica (viroma) u danom ekosustavu [62, 63].Za razliku od bakterija, arheja i eukariota, virusni genomi ne sadrže filogenetski očuvane gene kao što su 16S sekvence.Naši rezultati pokazuju da se tekuće biopsije indikatorskih vrsta kao što su dagnje mogu koristiti za identifikaciju relativno velikog broja fragmenata ccfDNA virusa za koje se zna da inficiraju domaćine koji tipično nastanjuju obalne morske ekosustave.To uključuje viruse za koje je poznato da inficiraju protozoe, člankonošce, kukce, biljke i bakterijske viruse (npr. bakteriofage).Slična je raspodjela pronađena kada smo ispitali hemolimfni ccfDNA virom plavih dagnji (M. platensis) prikupljenih u istom sloju dagnji u Kerguelenu (tablica S2, dodatne informacije).Puško sekvenciranje ccfDNA doista je novi pristup koji dobiva na zamahu u proučavanju viroma ljudi ili drugih vrsta [21, 37, 64].Ovaj je pristup osobito koristan za proučavanje dvolančanih DNA virusa, budući da niti jedan gen nije sačuvan među svim dvolančanim DNA virusima, što predstavlja najrazličitiju i najširu klasu virusa u Baltimoreu [65].Iako većina ovih virusa ostaje neklasificirana i može uključivati ​​viruse iz potpuno nepoznatog dijela virusnog svijeta [66], otkrili smo da su viromi i rasponi domaćina dagnji A. atra i M. platensis između ove dvije vrste.slično (vidi sliku S3, dodatne informacije).Ova sličnost nije iznenađujuća, jer može odražavati nedostatak selektivnosti u unosu DNK prisutne u okolišu.Buduće studije koje koriste pročišćenu RNA trenutno su potrebne za karakterizaciju RNA viroma.
U našoj smo studiji upotrijebili vrlo rigorozan cjevovod prilagođen iz rada Kowarskog i kolega [37], koji su koristili brisanje u dva koraka združenih očitavanja i kontiga prije i poslije sklapanja izvorne ccfDNA, što je rezultiralo visokim udjelom nemapiranih očitavanja.Stoga ne možemo isključiti mogućnost da neka od ovih nemapiranih očitanja još uvijek imaju vlastito podrijetlo, prvenstveno zato što nemamo referentni genom za ovu vrstu dagnje.Također smo koristili ovaj cjevovod jer smo bili zabrinuti zbog himera između vlastitih i ne-osobnih čitanja i duljina čitanja koje generira Illumina MiSeq PE75.Još jedan razlog za većinu neistraženih očitanja je taj što većina morskih mikroba, posebno u udaljenim područjima kao što je Kerguelen, nije označena.Koristili smo Illumina MiSeq PE75, pretpostavljajući duljinu fragmenata ccfDNA sličnu ljudskoj ccfDNA.Za buduće studije, s obzirom na naše rezultate koji pokazuju da ccfDNA hemolimfe ima dulja očitanja od ljudi i/ili sisavaca, preporučujemo korištenje platforme za sekvenciranje koja je prikladnija za dulje fragmente ccfDNA.Ova praksa će znatno olakšati prepoznavanje više indikacija za dublju analizu.Dobivanje trenutno nedostupne potpune sekvence nuklearnog genoma A. atra također bi uvelike olakšalo razlikovanje ccfDNA iz vlastitih i ne-vlastitih izvora.S obzirom na to da je naše istraživanje usredotočeno na mogućnost primjene koncepta tekuće biopsije na dagnje, nadamo se da će se, kako se ovaj koncept bude koristio u budućim istraživanjima, razviti novi alati i cjevovodi za povećanje potencijala ove metode za proučavanje mikrobne raznolikosti dagnji.morski ekosustav.
Kao neinvazivni klinički biomarker, povišene razine ccfDNA u ljudskoj plazmi povezane su s raznim bolestima, oštećenjima tkiva i stresnim stanjima [67,68,69].Ovo povećanje povezano je s otpuštanjem fragmenata DNA vlastitog podrijetla nakon oštećenja tkiva.Ovaj smo problem riješili pomoću akutnog toplinskog stresa, u kojem su dagnje bile nakratko izložene temperaturi od 30 °C.Ovu smo analizu proveli na tri različite vrste dagnji u tri neovisna pokusa.Međutim, nismo pronašli nikakve promjene u razinama ccfDNA nakon akutnog toplinskog stresa (vidi sliku S5, dodatne informacije).Ovo otkriće može objasniti, barem djelomično, činjenicu da dagnje imaju poluotvoren krvožilni sustav i akumuliraju velike količine strane DNA zbog svoje visoke aktivnosti filtriranja.S druge strane, dagnje, poput mnogih beskralješnjaka, mogu biti otpornije na oštećenje tkiva izazvano stresom, čime se ograničava oslobađanje ccfDNA u njihovoj hemolimfi [70, 71].
Do danas je DNK analiza bioraznolikosti u vodenim ekosustavima uglavnom bila usmjerena na metabarkodiranje ekološke DNK (eDNK).Međutim, ova je metoda obično ograničena u analizi bioraznolikosti kada se koriste primeri.Korištenje sekvencioniranja sačmarice zaobilazi ograničenja PCR-a i pristran odabir setova početnica.Stoga je, u određenom smislu, naša metoda bliža nedavno korištenoj visokoučinkovitoj eDNA Shotgun metodi sekvenciranja, koja može izravno sekvencirati fragmentiranu DNA i analizirati gotovo sve organizme [72, 73].Međutim, postoji niz temeljnih pitanja koja razlikuju LB od standardnih eDNA metoda.Naravno, glavna razlika između eDNA i LB je korištenje prirodnih filtarskih domaćina.Zabilježeno je korištenje morskih vrsta kao što su spužve i školjkaši (Dresseina spp.) kao prirodni filtar za proučavanje eDNA [74, 75].Međutim, Dreissenina studija koristila je biopsije tkiva iz kojih je ekstrahirana DNK.Analiza ccfDNA iz LB-a ne zahtijeva biopsiju tkiva, specijaliziranu i ponekad skupu opremu i logistiku povezanu s eDNA ili biopsijom tkiva.Zapravo, nedavno smo izvijestili da se ccfDNA iz LB-a može pohraniti i analizirati uz FTA podršku bez održavanja hladnog lanca, što je veliki izazov za istraživanja u udaljenim područjima [76].Ekstrakcija ccfDNA iz tekućih biopsija također je jednostavna i pruža DNK visoke kvalitete za sekvencioniranje i PCR analizu.Ovo je velika prednost s obzirom na neka tehnička ograničenja povezana s analizom eDNA [77].Jednostavnost i niska cijena metode uzorkovanja također je posebno pogodna za dugoročne programe praćenja.Osim njihove visoke sposobnosti filtriranja, još jedna dobro poznata značajka školjkaša je kemijski mukopolisaharidni sastav njihove sluzi, koji potiče apsorpciju virusa [78, 79].To školjkaše čini idealnim prirodnim filtrom za karakterizaciju bioraznolikosti i utjecaja klimatskih promjena u određenom vodenom ekosustavu.Iako se prisutnost fragmenata DNK izvedenih iz domaćina može smatrati ograničenjem metode u usporedbi s eDNA, trošak povezan s posjedovanjem takve izvorne ccfDNA u usporedbi s eDNA istovremeno je razumljiv zbog ogromne količine informacija dostupnih za zdravstvene studije.offset domaćin.To uključuje prisutnost virusnih sekvenci integriranih u genom domaćina domaćina.Ovo je posebno važno za dagnje, s obzirom na prisutnost vodoravno prenosivih leukemijskih retrovirusa u školjkašima [80, 81].Još jedna prednost LB-a u odnosu na eDNA je ta što iskorištava fagocitnu aktivnost cirkulirajućih krvnih stanica u hemolimfi, koja guta mikroorganizme (i njihove genome).Fagocitoza je glavna funkcija krvnih stanica u školjkaša [82].Konačno, metoda iskorištava visok kapacitet filtriranja dagnji (prosječno 1,5 l/h morske vode) i dvodnevnu cirkulaciju, što povećava miješanje različitih slojeva morske vode, omogućujući hvatanje heterologne eDNA.[83, 84].Stoga je ccfDNA analiza dagnji zanimljiv put s obzirom na prehrambene, ekonomske i utjecaje dagnji na okoliš.Slično analizi LB prikupljenih od ljudi, ova metoda također otvara mogućnost mjerenja genetskih i epigenetskih promjena u DNK domaćina kao odgovor na egzogene tvari.Na primjer, mogu se zamisliti tehnologije treće generacije sekvenciranja za izvođenje analize metilacije na razini genoma u nativnoj ccfDNA pomoću sekvenciranja nanopora.Ovaj bi proces trebao biti olakšan činjenicom da je duljina fragmenata ccfDNA dagnje idealno kompatibilna s platformama za dugo čitanje sekvenciranja koje omogućuju analizu metilacije DNA na cijelom genomu iz jednog ciklusa sekvenciranja bez potrebe za kemijskim transformacijama.85,86] Ovo je zanimljiva mogućnost, jer je pokazano da obrasci metilacije DNA odražavaju odgovor na okolišni stres i traju tijekom mnogih generacija.Stoga može pružiti vrijedan uvid u temeljne mehanizme koji upravljaju odgovorom nakon izlaganja klimatskim promjenama ili zagađivačima [87].Međutim, uporaba LB-a nije bez ograničenja.Nepotrebno je reći da to zahtijeva prisutnost indikatorskih vrsta u ekosustavu.Kao što je gore spomenuto, korištenje LB-a za procjenu bioraznolikosti određenog ekosustava također zahtijeva rigorozan bioinformatički cjevovod koji uzima u obzir prisutnost fragmenata DNK iz izvora.Drugi veliki problem je dostupnost referentnih genoma za morske vrste.Nadamo se da će inicijative poput Projekta genoma morskih sisavaca i nedavno uspostavljenog projekta Fish10k [88] olakšati takvu analizu u budućnosti.Primjena LB koncepta na morske organizme koji se hrane filtrima također je kompatibilna s najnovijim dostignućima u tehnologiji sekvenciranja, što ga čini prikladnim za razvoj multi-omskih biomarkera za pružanje važnih informacija o zdravlju morskih staništa kao odgovor na okolišni stres.
Podaci o sekvenciranju genoma pohranjeni su u NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 pod Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Utjecaj klimatskih promjena na morski život i ekosustave.Cole biologija.2009.;19: P602 – P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Razmotrite kombinirane utjecaje klimatskih promjena i drugih lokalnih stresora na morski okoliš.opće znanstveno okruženje.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Znanost o prvom martu.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Smanjena otpornost na toplinu u uvjetima ponavljajućeg toplinskog stresa objašnjava visoku ljetnu smrtnost plavih školjki.Znanstveno izvješće 2019.;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Nedavne promjene u učestalosti, uzrocima i opsegu uginuća životinja.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Višestruki patogeni nespecifični za vrstu mogli su uzrokovati masovnu smrtnost Pinne nobilis.Život.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Potencijalni utjecaj klimatskih promjena na arktičke zoonoze.Int J Cirkumpolarno zdravlje.2005;64: 468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. i sur.Plave dagnje (Mytilus edulis spp.) kao signalni organizmi u praćenju onečišćenja obalnog područja: prikaz.Ožujak Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integracija tekuće biopsije u liječenju raka.Nat Rev Clean Oncol.2017.;14: 531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Tekuće sazrijevanje biopsije: Omogućuje cirkulaciju DNK tumora.Nat Rev Rak.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleinske kiseline u ljudskoj plazmi.Zapisnici sa sastanaka podružnica Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Nova uloga DNA bez stanica kao molekularnog markera za liječenje raka.Kvantifikacija biomolarne analize.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Tekuća biopsija ulazi u kliniku – problemi provedbe i budući izazovi.Nat Rev Clin Oncol.2021.;18: 297-312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW i drugi.Fetalna DNK prisutna je u majčinoj plazmi i serumu.Lanceta.1997.;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studija tijeka trudnoće i njenih komplikacija pomoću cirkulirajuće izvanstanične RNA u krvi žena tijekom trudnoće.Dopedijatrija.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Tekuća biopsija: DNA bez stanica davatelja koristi se za otkrivanje alogenih lezija u presatku bubrega.Nat Rev Nephrol.2021.;17: 591-603.
Juan FC, Lo YM Inovacije u prenatalnoj dijagnostici: sekvenciranje genoma plazme majke.Anna dr. med.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Brzo otkrivanje patogena s metagenomskim sekvenciranjem zaraženih tjelesnih tekućina sljedeće generacije.Nat Medicina.2021;27:115-24.


Vrijeme objave: 14. kolovoza 2022