Javascript je trenutno onemogućen u vašem pregledniku. Neke značajke ove web stranice neće raditi kada je javascript onemogućen.
Registrirajte se sa svojim specifičnim podacima i određenim lijekom koji vas zanima, a mi ćemo spojiti informacije koje ste dali s člancima u našoj opsežnoj bazi podataka i odmah vam e-poštom poslati PDF kopiju.
作者 Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 7 Livia Manzella1,21 Odjel za kliničku i eksperimentalnu medicinu cine, Sveučilište Catania, Catania, 95123, Italija;2 Centar za eksperimentalnu onkologiju i hematologiju, AOU Policlinico “G.Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Italija;3 Medicinska onkologija, AOU Poliklinika “G.Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Italija;4 Medicinska genetika, ARNAS Garibaldi, Catania, 95123, Italija;5 Medicine Genetics, ASP, Syracuse, 96100, Italija;6 Odjel za biomedicinske i biotehnološke znanosti, Sveučilište u Cataniji, medicinska genetika, Catania, Italija, 95123;7Oasi Research Institute-IRCCS, Troina, 94018, Italija Komunikacije: Stefania Stella, tel +39 095 378 1946, e-pošta [e-pošta zaštićena];[email protected] Svrha: Mutacije zametne linije u BRCA1 i BRCA2 i utvrđeni rak dojke (BC), jajnika (OC) i drugi povezani sa životnim rizikom od raka. Testiranje na gen BRCA ključno je za procjenu individualnog rizika, kao i za pronalaženje metoda prevencije kod zdravih nositelja i prilagođavanje tretmana kod pacijenata oboljelih od raka. Prevalencija promjena BRCA1 i BRCA2 uvelike varira među zemljopisnim regijama, iako postoje podaci o BR Patogene varijante CA u sicilijanskim obiteljima, nedostaju studije posebno usmjerene na populacije u istočnoj Siciliji. Cilj naše studije bio je istražiti učestalost i distribuciju BRCA patogenih promjena germinativne linije u kohorti pacijenata s BC-om s istočne Sicilije i procijeniti njihovu povezanost sa specifičnim svojstvima BC-a korištenjem sekvenciranja sljedeće generacije. Prisutnost promjena u korelaciji s stupnjem tumora i indeksom proliferacije. REZULTATI: Sveukupno, 35 pacijenata (9%) imalo je patogenu varijantu BRCA, 17 (49%) u BRCA1 i 18 (51%) u BRCA2. Promjene BRCA1 prevladavaju u trostruko negativnih pacijenata s BC-om, dok su mutacije BRCA2 češće u pacijenata s BC-om u lumenu. U usporedbi s onima koji nisu bili nositelji, ispitanici s varijantama BRCA1 imali su značajno viši stupanj tumora i proliferaciju ativni indeks. Zaključci: Naši nalazi daju pregled BRCA mutacijskog statusa u bolesnika s BC-om s istočne Sicilije i potvrđuju ulogu NGS analize u identificiranju pacijenata s nasljednim BC-om. Sve u svemu, ovi su podaci u skladu s prethodnim dokazima koji podupiru BRCA probir za pravilnu prevenciju i liječenje raka kod nositelja mutacije.
Rak dojke (BC) najčešći je zloćudni tumor u svijetu i najsmrtonosniji rak u žena.1 Biološke značajke koje određuju prognozu i kliničko ponašanje BC-a opsežno su proučavane i djelomično razjašnjene tijekom vremena. Zapravo, trenutno se koristi nekoliko surogatnih markera za klasifikaciju BC-a u različite molekularne podtipove. To su estrogenski (ER) i/ili progesteronski receptor (PgR), pojačanje receptora 2 humanog epidermalnog faktora rasta (HER2). , indeks proliferacije Ki-67 i stupanj tumora (G).2 Kombinacija ovih varijabli identificirala je sljedeće kategorije BC-a: 1) Luminalni tumori, koji pokazuju ekspresiju ER i/ili PgR, činili su 75% BC-ova. Ovi tumori su dalje podijeljeni u Luminal A, kada je Ki-67 bio ispod 20% i HER2 negativan, i Luminal B, kada je Ki-67 bio jednak ili veći od 20% i u prisutnosti amplifikacija HER2, bez obzira na indeks proliferacije;2) HER2+ tumori koji su ER i PgR negativni, ali pokazuju pojačanje HER2. Ova skupina čini 10% svih tumora dojke;3) Trostruki negativni rak dojke (TNBC), koji ne pokazuje ekspresiju ER i PgR i pojačanje HER2, čini oko 15% karcinoma dojke.2-4
Među ovim podtipovima BC-a, stupanj tumora i indeks proliferacije predstavljaju biomarkere presjeka koji su izravno i neovisno povezani s agresivnošću i prognozom tumora.5,6
Uz prethodno spomenute biološke značajke, uloga naslijeđenih genetskih promjena koje dovode do razvoja BC-a postala je sve važnija u posljednjih nekoliko godina.7 Otprilike 1 od 10 tumora dojke naslijeđen je zbog promjena u klici u određenim genima.8 Dvije velike epidemiološke studije koje su uključile više od 180 000 žena nedavno su identificirale skupinu od osam gena (tj. ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C i RAD51D) primarno odgovorni za nasljedni BC. Među ovim genima, BRCA1 i BRCA2 (u daljnjem tekstu BRCA1/2) pokazali su najjaču korelaciju s razvojem tumora dojke.9-12 Zapravo, mutacije BRCA1/2 germinativne linije značajno povećavaju doživotni rizik od BC-a, kao i drugih zloćudnih bolesti, uključujući jajnike, prostate, gušterače, kolorektalnog i melanoma. Od dobi od 13 do 80 godina, kumulativna incidencija BC je 72% u žena s BRCA1 patogenom varijantom (PV) i 69% u žena s BRCA2 PV.14
Naime, nedavna publikacija sugerira da rizik od BC-ja ovisi o tipu PV-a. Zapravo, u usporedbi s patogenim skraćenim varijantama, upadljive missense varijante, posebno u genu BRCA1, povezane su sa smanjenim rizikom od BC-a, osobito u starijih žena.15
Prisutnost BRCA1 ili BRCA2 PV bila je povezana s različitim biološkim i kliničko-patološkim značajkama.16,17 BC-i povezani s BRCA1 obično su klinički agresivni, slabo diferencirani i visoko proliferativni. Ti su tumori obično trostruko negativni i rano počinju. Tumori koji se javljaju u pacijenata s mutiranim BRCA2 tipično pokazuju umjerene do dobro diferencirane stupnjeve i varijabilni proliferativni indeksi. Ovi su tumori češći u lumenu B i obično se javljaju u starijih odraslih osoba.16-18 Značajno je da mutacije u BRCA1 i BRCA2 povećavaju osjetljivost na specifične tretmane, uključujući soli platine i ciljane lijekove kao što su inhibitori poli(ADP-riboza) polimeraze (PARPi).19,20
Tijekom proteklih nekoliko godina, implementacija sekvencioniranja sljedeće generacije (NGS) u kliničkoj praksi omogućila je sve većem broju pacijenata s BC-om da se podvrgnu molekularnom testiranju na sindrome osjetljivosti na rak, uključujući BRCA1/2.21 Istodobno, definicije temeljene na preciznim kriterijima u vezi s obiteljskom poviješću, demografskim i kliničko-patološkim karakteristikama za bolju identifikaciju pojedinaca vrijednih testiranja na BRCA1/2.22,23 U tom kontekstu, dokazi e se nakuplja na BRCA1/2 probiru u određenim populacijama, naglašavajući razlike među zemljopisnim regijama.24-27 Iako postoje izvješća o kohorti BC-a u zapadnoj Siciliji, manje je podataka dostupno o BRCA1/2 probiru u populaciji istočne Sicilije.28,29
Ovdje opisujemo rezultate probira BRCA1/2 zametne linije u bolesnika s BC-om s istočne Sicilije, dodatno povezujući prisutnost mutacija BRCA1 ili BRCA2 s glavnim kliničko-patološkim značajkama ovih tumora.
Retrospektivna studija provedena je u "Centru za eksperimentalnu onkologiju i hematologiju" u bolnici Policlinico.Rodolico – San Marco u Cataniji. Od siječnja 2017. do ožujka 2021. ukupno 455 pacijenata s rakom dojke i jajnika, melanomom, gušterače ili prostatom upućeno je u naš laboratorij za molekularnu dijagnostiku na BRCA/2 genetsko testiranje. Ovo je istraživanje provedeno u skladu s Decla obroka iz Helsinkija, a svi su sudionici dali pismeni informirani pristanak prije molekularne analize.
Histološke i biološke karakteristike (ER, PgR, HER2 status, Ki-67 i stupanj) BC-a procijenjene su na biopsiji jezgre ili kirurškim uzorcima, uzimajući u obzir samo agresivne komponente tumora. Na temelju ovih karakteristika, BC-ovi su klasificirani kako slijedi: luminalni A (ER+ i/ili PgR+, HER2-, Ki-67<20%), luminalni B (ER+ i/ili PgR+, HER2-, Ki-67≥20%), luminalni B-HER2+ (ER i/ili PgR+, HER2+), HER2+ (ER i PgR-, HER2+) ili trostruki negativni (ER i PgR-, HER2-).
Prije procjene statusa mutacije BRCA1 i BRCA2, multidisciplinarni tim koji je uključivao onkologa, genetičara i psihologa proveo je konzultacije o genetici tumora za svakog pacijenta kako bi se utvrdila prisutnost BRCA1 i/ili BRCA1.ili pojedinci s visokim rizikom od PV-a u genu BRCA2. Odabir pacijenata proveden je prema smjernicama Talijanskog društva za medicinsku onkologiju (AIOM) i lokalnim sicilijanskim preporukama.30,31 Ovi kriteriji uključuju: (i) obiteljsku povijest poznatih patogenih varijanti u genima osjetljivosti (npr. BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN);(ii) mužjaci s BC;(iii) oni s BC i OC;(iv) žene s BC <36 godina, TNBC <60 godina ili bilateralni BC <50 godina;(v) osobna medicinska povijest BC <50 godina i najmanje jedan rođak u prvom koljenu: (a) BC < 50 godina;(b) nemucinozni i negranični OC bilo koje dobi;(c) bilateralni BC;(d) muški BC;(e) rak gušterače;(f) rak prostate;(vi) dvije ili više osobne anamneze BC-a > 50 godina i obiteljske povijesti BC-a, OC-a ili raka gušterače za rođake koji su međusobno u prvom koljenu (uključujući rođake s kojima je ona u prvom koljenu);(vii) Osobna anamneza OK i najmanje jedan rođak u prvom koljenu: (a) pr. Kr. <50 godina;(b) NOC;(c) bilateralni BC;(d) muški BC;(vii) žena sa seroznim OC visokog stupnja.
Uzorak periferne krvi od 20 mL dobiven je od svakog pacijenta i sakupljen u EDTA epruvete (BD Biosciences). Genomska DNK izolirana je iz 0,7 mL uzoraka pune krvi pomoću QIAsymphony DSP DNA Midi kompleta Isolation Kit (QIAGEN, Hilden, Italija) u skladu s uputama proizvođača i propuštena kroz Qubit® 3.0 fluorometar (Thermo Fisher Scientific, Wal tham, MA, SAD) Izvršite kvantifikaciju.Ciljno obogaćivanje i pripremu biblioteke izvodi Oncomine™ BRCA Research Assay Chef, spreman za učitavanje u Ion AmpliSeq™ Chef Reagens DL8 Kit za automatiziranu pripremu biblioteke u skladu s uputama proizvođača. Komplet se sastoji od dva skupa multipleksnih PCR primera koji se mogu koristiti za proučavanje svih gena BRCA1 (NM_007300.3) i BRCA2 (NM_000059.3).B Ukratko, 15 µL svakog razrijeđenog uzorka DNK (10 ng) dodano je u ploče s barkodom za pripremu biblioteke, a svi reagensi i potrošni materijal napunjeni su na instrument Ion Chef™. Automatizirana priprema biblioteke i skupljanje biblioteke barkodiranih uzoraka zatim su izvedeni na instrumentu Ion Chef™. Broj pripremljenih biblioteka zatim je procijenjen Qubit® 3.0 fluorometrom (Thermo Fisher Scientific, Walt ham, MA, SAD) u skladu s uputama proizvođača. Konačno, biblioteke se kombiniraju u ekvimolarnim omjerima u epruvetama s uzorcima biblioteke Ion Chef™ (epruvete s barkodom) i učitavaju u instrument Ion Chef™. Sekvenciranje je izvedeno pomoću instrumenta Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific) (Thermo Fisher Scientific) pomoću čipa Ion 510 (Thermo Fisher Scientific). Podaci analizu su izvršili Amplicon Suite (SmartSeq srl) i Ion Reporter Software.
Sva nomenklatura varijanti slijedila je trenutne smjernice Konzorcija za varijacije ljudskog genoma, dostupne na internetu (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). Klinički značaj varijanti BRCA1/2 definiran je pomoću klasifikacije Međunarodnog konzorcija ENIGMA (Mreža utemeljena na dokazima za tumačenje mutantnih alela germline, https://enigmaconsortium.org/) i savjetovanja različite baze podataka kao što su ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD i UMD. Klasifikacija uključuje pet različitih kategorija rizika: benigne (kategorija I), vjerojatno benigne (kategorija II), varijantu nesigurnog značaja (VUS, kategorija III), vjerojatno patogene (kategorija IV) i patogene (kategorija V). VarSome je također analizirao učinak mutacija na strukturu proteina i funkcija, informativni alat s pristupom 30 baza podataka.32
Kako bi se dodijelio potencijalni klinički značaj svakom VUS-u, korišteni su sljedeći računalni algoritmi za predviđanje proteina: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:// /genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) i Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd _input.php).Varijante klasificirane kao klasa 1 i 2 smatrane su divljim tipom.
Sangerovo sekvenciranje potvrdilo je prisutnost svake patogene varijante. Ukratko, dizajniran je par specifičnih početnica za svaku otkrivenu varijantu korištenjem referentnih sekvenci gena BRCA1 i BRCA2 (NG_005905.2, NM_007294.3 i NG_012772.3, NM_000059.3, respektivno). Stoga je izvršena ciljana PCR praćena Sangerovom sekvencom nciranje.
Pacijenti koji su bili negativni na testu na gen BRCA1/2 testirani su pomoću amplifikacije sonde ovisne o multipleksnoj ligaciji (MLPA) u skladu s uputama proizvođača kako bi se procijenila prisutnost velikih genomskih rearranžmana (LGR). Ukratko, uzorci DNK se denaturiraju i koristi se do 60 sondi specifičnih za gen BRCA1 i BRCA2, od kojih svaka otkriva specifičnu sekvencu DNK duljine približno 60 nukleotida.Pro produkti pojačanja, koji se sastoje od jedinstvenog skupa PCR amplikona, zatim su analizirani kapilarnom elektroforezom i softverom Cofalyser.Net u kombinaciji s odgovarajućim Cofalyser tablicama specifičnim za seriju (www.mrcholland.com).
Odabrane kliničko-patološke varijable (histološki stupanj i Ki-67% indeks proliferacije) bile su povezane s prisutnošću BRCA1/2 PV, izračunate pomoću softvera Prism v. 8.4 koristeći Fisherov egzaktni test uz pretpostavku da je p-vrijednost <0,05 značajna.
Između siječnja 2017. i ožujka 2021. 455 pacijenata pretraženo je na mutacije BRCA1/2 zametne linije. Testiranje mutacija obavljeno je u Centru za eksperimentalnu onkologiju i hematologiju bolnice Policlinico. Prema sicilijanskim smjernicama (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, N. 02-Venerdì 10 Gennaio 2020), Rodolico iz Catanije – San Marco” sveukupno, 389 pacijenata Bilo je raka dojke, 37 raka jajnika, 16 raka gušterače, 8 raka prostate i 5 melanoma.Distribucija pacijenata prema vrsti raka i rezultatima analize prikazana je na slici 1.
Slika 1 prikazuje dijagram toka koji prikazuje pregled studije. Pacijenti s tumorima dojke, melanoma, gušterače, prostate ili jajnika testirani su na mutacije u genima BRCA1 i BRCA2.
Kratice: PVs, patogena varijanta;VUS, varijanta nesigurnog značenja;WT, divlji tip BRCA1/2 sekvence.
Selektivno smo usmjerili naše studije na skupine oboljelih od raka dojke. Pacijentice su imale medijan dobi od 49 godina (raspon 23-89) i pretežno su bile žene (n=376, ili 97%).
Od ovih subjekata, 64 (17%) imalo je BRCA1/2 mutacije i sve su bile žene. Trideset pet (9%) imalo je PV, a 29 (7,5%) imalo je VUS. Sedamnaest (48,6%) od 35 patogenih varijanti pojavilo se u BRCA1 i 18 (51,4%) u BRCA2, dok se 5 VUS pojavilo u BRCA1 (17,2%) i 24 (82). .8%) u BRCA2 (slike 1 i 2).LGR nije bio prisutan u analizi MLPA.
Slika 2. Analiza mutacija BRCA1 i BRCA2 u 389 pacijenata s rakom dojke. (A) Distribucija patogenih varijanti (PV) (crveno), varijanti nesigurnog značaja (VUS) (narančasto) i WT (plavo) u 389 pacijenata s rakom dojke;(B) 389 pacijenata s rakom dojke. Trideset i pet (9%) imalo je BRCA1/2 patogene varijante (PV). Među njima, 17 (48,6%) bili su nositelji BRCA1 PV (tamnocrveni), a 18 (51,4%) bili su nositelji BRCA2 (svijetlocrveni);(C) 29 (7,5%) od 389 ispitanika imalo je VUS, 5 (17,2%) BRCA1 gena (tamnonarančasto) i 24 (82,8%) BRCA2 gena (svijetlonarančasto).
Kratice: PVs, patogena varijanta;VUS, varijanta nesigurnog značenja;WT, divlji tip BRCA1/2 sekvence.
Zatim smo istražili prevalenciju molekularnih podtipova BC u pacijenata s BRCA1/2 PV. Distribucija je uključivala 2 (5,7%) luminalni A, 15 (42,9%) luminalni B, 3 (8,6%) luminalni B-HER2+, 2 (5,7%) HER2+ i 13 (37,1%) TNBC bolesnika. Među BRCA1-pozitivnim pacijentima, 5 (29,4 %) imala su luminalni B BC, 2 (11,8%) imala su HER2+ bolest, a 10 (58,8%) imalo je TNBC. Tumori bez BRCA1 mutacija bili su luminalni A ili luminalni B-HER2+ (Slika 3). U BRCA2-pozitivnoj podskupini, 10 (55,6%) tumori bili su luminalni B, 3 (16,7%) bili su luminalni B-HER2+, 3 (16,7%) TNBC i 2 (11,1%) bili su luminalni A (Slika 3). U ovoj skupini nisu bili prisutni HER2+ tumori. Stoga su BRCA1 mutacije prevladavajuće u TNBC pacijenata, dok su BRCA2 promjene prevladavajuće u lumenu B pojedinaca.
Slika 3 Prevalencija podtipova raka dojke u bolesnika s patogenim varijantama BRCA1 i BRCA2. Histogrami koji pokazuju distribuciju BRCA1- (tamnocrveni) i BRCA2- (svijetlocrveni) PV među molekularnim podtipovima pacijenata s rakom dojke. Brojevi prijavljeni unutar svakog okvira predstavljaju postotak pacijenata s BRCA1 i BRCA2 PV za svaki podtip raka dojke.
Kratice: PVs, patogena varijanta;HER2+, pozitivan receptor humanog epidermalnog faktora rasta 2;TNBC, trostruko negativan rak dojke.
Naknadno smo procijenili tip i lokalizaciju gena BRCA1 i BRCA2 PV. U BRCA1 PV promatrali smo 7 jednonukleotidnih varijanti (SNV), 6 delecija, 3 duplikacije i 1 umetanje. Samo jedna mutacija (c.5522delG) predstavlja novo otkriće. Najčešći BRCA1 PV otkriven u oba subjekta bio je c.5035_5039 delCTAAT. Ova promjena uključuje brisanje pet nukleotida (CTAAT) u BRCA1 egzonu 15, što rezultira supstitucijom aminokiseline leucina tirozinom na kodonu 1679, a zbog pomaka okvira translacije s predviđenim alternativnim stop kodonom dovodi do preuranjenog skraćivanja proteina. Sve druge promjene otkrivene su samo u jednom slučaju. Značajno, jedan od prijavljenih PV-a nalazio se u konsenzusna regija mjesta spajanja (c.4357+1G>T) (Tablica 1).
Što se tiče BRCA2 PV, uočili smo 6 delecija, 6 SNV-ova i 2 duplikacije. Nijedna od pronađenih promjena nije nova. Tri mutacije su se ponovile u našoj populaciji, c.428dup i c.8487+1G>A uočene u 3 subjekta, nakon čega slijedi c.5851_5854delAGTT pronađen u dva slučaja. Promjena c.428dup uključuje ponavljanje C u eksonu 5 BRCA2, za koji se predviđa da kodira skraćeni, nefunkcionalni protein. Mutacija c.8487+1G>A javlja se u introničkoj regiji BRCA2 introna 19 (± 1,2) i utječe na konsenzusnu sekvencu spajanja, što rezultira promijenjenim spajanjem što rezultira abnormalnim ili odsutnim proteinom. Patogena varijanta c.5851_5854delAGTT je do 4-nukleotidne delecije s nukleotidnih pozicija 5851 do 5854 u kodirajućem eksonu 10 gena BRCA2 i rezultira translacijskim pomakom okvira s predviđenim alternativnim stop kodonom (p.S1951WfsTer). Značajno je da su, kao što je ranije objavljeno, obje promjene c.631G>A i c.7008-2A>T otkrivene kod istog pacijenta.34 Prva mutacija uključuje zamjenu adenozina (A) u BRCA2 eksonu 7 nukleotidom koji sadrži gvanin (G) što rezultira promjenom valina u izoleucin na kodonu 211, izoleucin aminokiselina je aminokiselina s vrlo sličnim svojstvima. Ova promjena utječe na normalno spajanje mRNA. Druga varijanta nalazi se u introničkoj regiji i rezultira dvostrukom A u subtimin (T) mjesto prije eksona 13 gena koji kodira BRCA2. Promjena c.7008-2A>T može generirati više transkripata različitih duljina. Nadalje, u skupini BRCA2 PV, 4 od 18 promjena (22,2%) bile su intronične.
Zatim smo mapirali BRCA1/2 štetne mutacije u funkcionalnim domenama i regijama vezanjem proteina (Slika 4). U genu BRCA1, 50% PV-ova bilo je smješteno u regiji klastera raka dojke (BCCR), dok je 22% mutacija bilo smješteno u regiji klastera raka jajnika (OCCR) (Slika 4A). U BRCA2 PV, 35,7% varijanti bilo je smješteno u regiji pr. CR regija i 42,8% mutacija locirano je u OCCR (Slika 4B). Zatim smo procijenili lokaciju PV-a unutar domena proteina BRCA1 i BRCA2. Za protein BRCA1 pronašli smo tri PV-a u domeni petlje i zavojnice i dvije mutacije u domeni BRCT (Slika 4A). Za protein BRCA2, 4 PV-a mapirana su na ponavljanje BRC dok su 3 intronske i 3 egzoničke promjene otkrivene u oligo/oligosaharid-vezujućim (OB) i toranjskim (T) domenama (Slika 4B).
Slika 4 Shematski prikaz proteina BRCA1 i BRCA2 i lokalizacija patogenih varijanti. Ova slika prikazuje distribuciju patogenih varijanti BRCA1 (A) i BRCA2 (B) u bolesnika s rakom dojke. Egzonske mutacije prikazane su plavom bojom, dok su intronske varijante prikazane narančastom. Visina trake predstavlja broj slučajeva. Prijavljeni su proteini BRCA1 i BRCA2 i njihove funkcionalne domene. (A) BR Protein CA1 sadrži domenu petlje (RING) i sekvencu nuklearne lokalizacije (NLS), domenu namotane zavojnice, domenu klastera SQ/TQ (SCD) i C-terminalnu domenu BRCA1 (BRCT). (B) Protein BRCA2 sadrži osam BRC ponavljanja, domenu koja veže DNA sa spiralnom domenom (Helical), tri nabora za vezanje oligonukleotida/oligosaharida (OB), toranj domena (T) i NLS na C strani. Područja koja se nazivaju regija raka dojke (BCCR) i regija raka jajnika (OCCR) prikazana su na dnu.*Predstavljaju mutacije koje određuju zaustavne kodone.
Zatim smo istražili kliničko-patološke značajke BC-a koje bi mogle korelirati s prisutnošću BRCA1/2 PV. Potpuna klinička evidencija bila je dostupna za 181 BRCA1/2-negativnog pacijenta (koji nisu nositelji) i sve nositelje (n = 35). Postojala je korelacija između stope proliferacije tumora i stupnja.
Izračunali smo distribuciju Ki-67 na temelju medijana naše kohorte (25%, raspon <10-90%). Subjekti s Ki-67 < 25% definirani su kao "niski Ki-67″, dok su pojedinci s vrijednostima ≥ 25% smatrani "visokim Ki-67″. Značajne Ki-67 razlike (p<0,01) pronađene su između onih koji nisu nositelji i nositelja BRCA1 PV s (slika 5A).
Slika 5 Korelacija Ki-67 s distribucijom stupnja u žena s rakom dojke sa i bez BRCA1 i BRCA2 PV. (A) Okvir koji prikazuje srednje vrijednosti Ki-67 kod 181 pacijenta koji nije nositelj BC-a naspram pacijenata s BRCA1 (18) ili BRCA2 (17) PV-a. P vrijednosti ispod 0,5 smatrane su statistički značajnim. (B) Histogram koji predstavlja raspodjelu bolesnika s BC-om u skupine histološkog stupnja (G2 i G3) prema statusu mutacije BRCA1 i BRCA2 (ispitanici WT, nositelji BRCA1 i BRCA2 PVs).
Isto tako, ispitali smo je li stupanj tumora u korelaciji s prisutnošću BRCA1/2 PV. Budući da G1 BC nije bio prisutan u našoj populaciji, podijelili smo pacijente u dvije skupine (G2 ili G3). U skladu s rezultatima Ki-67, analiza je otkrila statistički značajnu korelaciju između stupnja tumora i mutacije BRCA1, s većim udjelom tumora G3 kod nositelja BRCA1 u usporedbi s onima koji nisu nositelji (p<0,0 05) (Slika 5B).
Napredak u tehnologiji sekvenciranja DNK omogućio je napredak bez presedana u genetskom testiranju BRCA1/2, s ključnim implikacijama za pacijente s obiteljskom poviješću raka. Do danas je približno 20 000 varijanti BRCA1/2 identificirano i klasificirano prema Američkom društvu medicinske genetike 35 i sustavu ENIGMA.35,36 Dobro je poznato da BRCA1/2 mutacijski spektar varira u širokom rasponu. ly kroz zemljopisne regije.37 Unutar Italije, stopa BRCA1/2 PV-a kretala se od 8% do 37%, pokazujući veliku varijabilnost unutar zemlje.38,39 S populacijom od gotovo 5 milijuna, Sicilija je peta najveća regija u Italiji u smislu broja stanovnika. Iako postoje podaci o distribuciji BRCA1/2 u zapadnoj Siciliji, nema opsežnih dokaza u istočnom dijelu otoka.
Naša je studija jedno od prvih izvješća o incidenciji BRCA1/2 PV u pacijenata s BC-om na istočnoj Siciliji.28 Našu smo analizu usmjerili na BC jer je to daleko najčešća bolest u našoj kohorti.
Prilikom testiranja 389 pacijenata s BC-om, 9% ih je nosilo BRCA1/2 PV-ove, ravnomjerno raspoređene između BRCA1 i BRCA2. Ovi su rezultati u skladu s onima koji su prethodno prijavljeni u talijanskoj populaciji.28 Zanimljivo je da su 3% (13/389) naše skupine bili muškarci. Ova stopa je viša od očekivane za muški rak dojke (1% svih BC-ova),40 odražavajući naš odabir populacija na temelju rizika mutacije BRCA1/2. Međutim, niti jedan od ovih muškaraca nije razvio BRCA1/2 PV, pa su bili kandidati za daljnju molekularnu analizu kako bi se isključila prisutnost manje uobičajenih mutacija kao što su PALB2, RAD51C i D, između ostalih. Varijante nesigurnog značaja pronađene su u 7% subjekata kod kojih je BRCA2 VUS bio evidentan. Čak je i ovaj rezultat u skladu s već postojećim dokazima.28,41,42
Kada smo analizirali distribuciju BC molekularnih podtipova u BRCA1/2 mutantnih žena, potvrdili smo poznate povezanosti između TNBC i BRCA1 PV (58,8%) i između luminalnog B BC i BRCA2 PV (55,6%).16,43 Lumenalni A i HER2+ tumori u BRCA1 i BRCA2 PV nositelja su u skladu s postojećim literaturnim podacima.16,43
Zatim se fokusiramo na tip i lokaciju BRCA1/2 PV. U našoj kohorti, najčešći BRCA1 PV bio je c.5035_5039delCTAAT. Iako su Incorvaia et al.nisu opisali ovu varijantu u svojoj kohorti na Siciliji, drugi autori su je prijavili kao germinalnu liniju BRCA1 PV.34 Nekoliko BRCA1 PV je pronađeno u našoj kohorti – npr. c.181T>G, c.514del, c.3253dupA i c.5266dupC – koje su uočene na Siciliji.28 Od njih, dvije mutacije osnivača BRCA1 (c.18 1T>G i c.5266dupC) obično se nalaze u aškenaskih Židova u istočnoj i srednjoj Europi (Poljska, Češka, Slovenija, Austrija, Mađarska, Bjelorusija i Njemačka), 44,45 i, u Sjedinjenim Državama i Argentini, nedavno je definirana kao "ponavljajuća varijanta klice" u talijanskih pacijenata s BC i OC. Varijanta 34c.514del prethodno je identificirana u 8 pacijenata s rakom dojke sa sjevera Siciliji u Palermu i Messini. Zanimljivo je da čak i Incorvaia et al.pronašli varijantu c.3253dupA u nekim obiteljima u Cataniji.28 Najreprezentativniji BRCA2 PV su c.428dup, c.5851_5854delAGTT i intronic varijanta c.8487+1G>A, koji su detaljnije prijavljeni 28 kod pacijenta u Palermu s c.428dup, c.5851_5854delAGTT PV je uočen u kućanstvima na sjeverozapadu Sicilije, uglavnom u regijama Trapani i Palermo, dok je c.5851_5854delAGTT PV primijećen u kućanstvima na sjeverozapadu Sicilije. Varijanta 8487+1G>A bila je češća u ispitanika iz Messine, Palerma i Caltanissette.28 Rebbeck et al.prethodno je opisao promjenu c.5851_5854delAGTT u Kolumbiji.37 Još ​​jedan BRCA2 PV, c.631+1G>A, pronađen je u pacijenata s BC i OC sa Sicilije (Agrigento, Siracusa i Ragusa).28 Značajno, uočili smo koegzistenciju dviju varijanti BRCA2 (BRCA2 c.631G>A i c.7008-2A>T ) kod istog pacijenta, za kojeg smo pretpostavili da je odvojen u cis načinu, kao što je ranije objavljeno.34,46 Ove BRCA2 uble mutacije doista se često opažaju u talijanskoj regiji i otkriveno je da uvode preuranjene stop kodone, utječući na spajanje messenger RNA i uzrokujući neuspjeh proteina BRCA2.47,48
Također smo mapirali BRCA1 i BRCA2 PV u navodnim OCCR i BCCR regijama proteinskih domena i gena. Ove regije opisali su Rebbeck et al.kao rizična područja za razvoj raka jajnika i dojke, respektivno.49 Međutim, dokazi o povezanosti između lokacije varijanti germinativne linije i rizika od raka dojke ili jajnika i dalje su kontroverzni.28,50-52 U našoj populaciji, BRCA1 PV-ovi bili su pretežno smješteni u BCCR regiji, dok su BRCA2 PV-ovi bili pretežno smješteni u OCCR regiji. Međutim, nismo uspjeli pronaći nikakvu povezanost između navodnog OCCR-a i BC-a. CR regije i obilježja BC-a. To može biti posljedica ograničenog broja pacijenata s mutacijama BRCA1/2. Iz perspektive domene proteina, BRCA1 PV-ovi su raspoređeni duž cijelog proteina, a promjene BRCA2 prvenstveno se nalaze u domeni ponavljanja BRC-a.
Konačno, povezali smo kliničko-patološke značajke BC s BRCA1/2 PV. Zbog ograničenog broja uključenih pacijenata, pronašli smo samo značajnu korelaciju između Ki-67 i stupnja tumora. Iako su procjena i tumačenje Ki-67 i dalje donekle kontroverzni, sigurno je da su visoke stope proliferacije povezane s povećanim rizikom od recidiva bolesti i smanjenim preživljavanjem. ", a "nizak" Ki-67 je 20%. Međutim, ovaj se prag ne odnosi na našu populaciju pacijenata s mutacijom BRCA1/2, koja ima srednju vrijednost Ki-67 od 25%. Ovaj trend u visokim stopama Ki-67 može se objasniti prevalencijom u našim kohortama luminalnog B i TNBC-a, od kojih je bilo prisutno nekoliko tumora luminalnog A. Međutim, čini se da neki dokazi sugeriraju da je viša granična vrijednost Ki-67 (25– 30%) može bolje stratificirati pacijente prema njihovoj prognozi.53,54 Iz rezultata naše analize, značajna korelacija ne iznenađuje. Javlja se između visokog Ki-67 i stupnjeva i prisutnosti BRCA1 PV. Zapravo, tumori povezani s BRCA1 tipični su za TNBC i pokazuju agresivnija svojstva.16,17
Zaključno, ova studija daje izvješće o mutacijskom statusu BRCA1/2 u kohorti BC-a s istočne Sicilije. Sveukupno, naši su nalazi u skladu s već postojećim dokazima, kako u smislu prevalencije mutacija tako i kliničko-patoloških značajki u BC-u. Za procjenu prisutnosti opravdano je više studija u većim populacijama pacijenata s BC-om s mutantima BRCA1/2, kao što je korištenje multigenomske proširene mutacijske analize. PV-ova koji su različiti i rjeđi od BRCA1/2. To će omogućiti identifikaciju i pravilno upravljanje sve većim brojem ispitanika s povećanim rizikom od raka zbog genetskih mutacija.
Potvrdili smo da su pacijenti potpisali informirani pristanak za anonimno puštanje svojih uzoraka tumora u istraživačke svrhe. Svi su pacijenti potpisali pismeni informirani pristanak u skladu s Helsinškom deklaracijom. Prema politici AOU Policlinico “G.Rodolico – S.Marco”, ova je studija bila izuzeta iz etičkog pregleda jer je analiza BRCA1/2 provedena u skladu s kliničkom praksom i svi su pacijenti dali pismeni informirani pristanak. Pacijenti su također pristali na korištenje njihovih podataka u istraživačke svrhe.
Zahvaljujemo prof. Paolu Vigneriju na pomoći u njezi pacijenata s rakom dojke na zahtjev Etičkog povjerenstva.
Federica Martorana izvještava o honorarima Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis, Pfizer. Ostali autori izjavljuju da nema sukoba interesa u ovom radu.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al.Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN procjenjuje učestalost i smrtnost od 36 vrsta raka u 185 zemalja širom svijeta.CA Cancer J Clin.2021;71(3):209-249.doi: 10.3322/caac.21660