Hvala što ste posjetili Nature.com.Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Nekontrolirano krvarenje jedan je od vodećih uzroka smrti.Postizanje brze hemostaze osigurava preživljavanje subjekta kao prva pomoć tijekom borbe, prometnih nesreća i operacija smanjenja smrti.Kompozitna skela ojačana nanoporoznim vlaknima (NFRCS) izvedena iz jednostavnog hemostatskog sastava koji stvara film (HFFC) kao kontinuirana faza može pokrenuti i poboljšati hemostazu.Razvoj NFRCS-a temelji se na dizajnu krila vretenca.Struktura krila vretenaca sastoji se od poprečnih i uzdužnih krila, a membrane krila su međusobno povezane kako bi se održala cjelovitost mikrostrukture.HFFC ravnomjerno oblaže površinu vlakna filmom nanometarske debljine i povezuje nasumično raspoređenu debljinu pamuka (Ct) (disperznu fazu) u nanoporoznu strukturu.Kombinacija kontinuirane i disperzne faze smanjuje cijenu proizvoda deset puta u usporedbi s komercijalno dostupnim proizvodima.Modificirani NFRCS (tamponi ili narukvice) mogu se koristiti u raznim biomedicinskim primjenama.Studije in vivo zaključile su da razvijeni Cp NFRCS pokreće i pojačava proces koagulacije na mjestu primjene.NFRCS može modulirati mikrookruženje i djelovati na staničnoj razini zbog svoje nanoporozne strukture što rezultira boljim zacjeljivanjem rana u modelu ekscizijske rane.
Nekontrolirano krvarenje tijekom borbenih, intraoperativnih i hitnih situacija može predstavljati ozbiljnu prijetnju životu ranjenika1.Ova stanja dalje dovode do ukupnog povećanja perifernog vaskularnog otpora, što dovodi do hemoragičnog šoka.Odgovarajuće mjere za kontrolu krvarenja tijekom i nakon operacije smatraju se potencijalno opasnima po život2,3.Oštećenje velikih krvnih žila dovodi do velikog gubitka krvi, što rezultira stopom smrtnosti od ≤ 50% u borbi i 31% tijekom operacije1.Masivni gubitak krvi dovodi do smanjenja volumena tijela, što smanjuje minutni volumen srca.Povećanje ukupnog perifernog vaskularnog otpora i progresivno oštećenje mikrocirkulacije dovode do hipoksije u organima za održavanje života.Može doći do hemoragijskog šoka ako se stanje nastavi bez učinkovite intervencije1,4,5.Ostale komplikacije uključuju progresiju hipotermije i metaboličku acidozu, kao i poremećaj koagulacije koji otežava proces koagulacije.Teški hemoragijski šok povezan je s većim rizikom od smrti6,7,8.U slučaju III (progresivnog) šoka, transfuzija krvi neophodna je za preživljavanje bolesnika tijekom intraoperativnog i postoperativnog morbiditeta i mortaliteta.Kako bismo prevladali sve gore navedene situacije opasne po život, razvili smo kompozitnu skelu ojačanu nanoporoznim vlaknima (NFRCS) koja koristi minimalnu koncentraciju polimera (0,5%) koristeći kombinaciju hemostatskih polimera topivih u vodi.
Upotrebom ojačanja vlaknima mogu se razviti isplativi proizvodi.Nasumično raspoređena vlakna nalikuju strukturi krila vretenca, uravnotežena vodoravnim i okomitim prugama na krilima.Poprečne i uzdužne vene krila komuniciraju s membranom krila (slika 1).NFRCS se sastoji od ojačanog Ct kao sustava skele bolje fizičke i mehaničke čvrstoće (Slika 1).Zbog pristupačnosti i vještine izrade, kirurzi radije koriste mjerače pamučnog konca (Ct) tijekom operacija i previjanja. Stoga, s obzirom na višestruke prednosti, uključujući > 90% kristalne celuloze (utječe na poboljšanje hemostatske aktivnosti), Ct je korišten kao koštani sustav NFRCS9,10. Stoga, s obzirom na višestruke prednosti, uključujući > 90% kristalne celuloze (utječe na poboljšanje hemostatske aktivnosti), Ct je korišten kao koštani sustav NFRCS9,10. Slijedom toga, uzimajući u obzir njegove brojne prednosti, u tom broju > 90% kristalne celuloze (učestvuje u povećanju hemostatske aktivnosti), Ct je korišten u sustavu skeleta NFRCS9,10. Stoga, s obzirom na mnoge prednosti, uključujući >90% kristalne celuloze (koja je uključena u povećanu hemostatsku aktivnost), Ct je korišten kao NFRCS koštani sustav9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性，，Ct 被用作NFRCS9 ,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Stoga, s obzirom na mnoge prednosti, uključujući više od 90% kristalne celuloze (pomaže u poboljšanju hemostatske aktivnosti), Ct je korišten kao skela za NFRCS9,10.Ct je bio površinski obložen (uočeno je stvaranje nano-debelog filma) i međusobno povezan s hemostatskim sastavom koji stvara film (HFFC).HFFC djeluje poput matrigela, držeći zajedno nasumično postavljene Ct.Razvijena konstrukcija prenosi naprezanje unutar disperzne faze (armaturna vlakna).Teško je dobiti nanoporozne strukture dobre mehaničke čvrstoće korištenjem minimalnih koncentracija polimera.Osim toga, nije lako prilagoditi različite kalupe za različite biomedicinske primjene.
Slika prikazuje dijagram NFRCS dizajna koji se temelji na strukturi krila vretenca (A).Ova slika prikazuje usporednu analogiju strukture krila vretenca (presiječne i uzdužne vene krila međusobno su povezane) i fotomikrografiju presjeka Cp NFRCS (B).Shematski prikaz NFRCS.
NFRC-ovi su razvijeni korištenjem HFFC-a kao kontinuirane faze za rješavanje gore navedenih ograničenja.HFFC se sastoji od različitih hemostatskih polimera koji stvaraju film uključujući kitozan (kao glavni hemostatski polimer) s metilcelulozom (MC), hidroksipropil metilcelulozom (HPMC 50 cp) i polivinil alkoholom (PVA)) (125 kDa) kao potpornim polimerom koji potiče stvaranje tromba.formiranje.Dodatak polivinilpirolidina K30 (PVP K30) poboljšao je sposobnost upijanja vlage NFRCS-a.Polietilen glikol 400 (PEG 400) dodan je kako bi se poboljšalo umrežavanje polimera u spojenim polimernim mješavinama.Tri različita HFFC hemostatska sastava (Cm HFFC, Ch HFFC i Cp HFFC), naime kitozan s MC (Cm), kitozan s HPMC (Ch) i kitozan s PVA (Cp), primijenjena su na Ct.Različite in vitro i in vivo studije karakterizacije potvrdile su hemostatsku aktivnost NFRCS-a i djelovanje na zacjeljivanje rana.Kompozitni materijali koje nudi NFRCS mogu se koristiti za prilagođavanje različitih oblika skela kako bi se zadovoljile specifične potrebe.
Osim toga, NFRCS se može modificirati kao zavoj ili rola za pokrivanje cijelog područja ozljede donjih ekstremiteta i drugih dijelova tijela.Posebno za borbene ozljede ekstremiteta, dizajnirani NFRCS dizajn može se promijeniti u poluruku ili cijelu nogu (dodatna slika S11).NFRCS se može napraviti u narukvicu s ljepilom za tkivo, koja se može koristiti za zaustavljanje krvarenja od teških suicidalnih ozljeda zapešća.Naš glavni cilj je razviti NFRCS sa što manje polimera koji se može isporučiti velikoj populaciji (ispod granice siromaštva) i koji se može staviti u pribor za prvu pomoć.Jednostavan, učinkovit i ekonomičan dizajn, NFRCS koristi lokalnim zajednicama i može imati globalni utjecaj.
Hitozan (molekularne težine 80 kDa) i amarant nabavljeni su od Mercka, Indija.Hidroksipropil metilceluloza 50 Cp, polietilen glikol 400 i metilceluloza su kupljeni od Loba Chemie Pvt.LLC, Mumbai.Polivinil alkohol (molekulska težina 125 kDa) (87-90% hidroliziran) je kupljen od National Chemicals, Gujarat.Polivinilpirolidin K30 nabavljen je od Molychema, Mumbai, sterilni štapići kupljeni su od Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, s vodom Milli Q (sustav za pročišćavanje vode Direct-Q3, Merck, Indija) kao nosačem.
NFRCS je razvijen metodom liofilizacije11,12.Svi HFFC sastavi (Tablica 1) pripremljeni su korištenjem mehaničke miješalice.Pripremite 0,5% otopinu kitozana korištenjem 1% octene kiseline u vodi kontinuiranim miješanjem na 800 okretaja u minuti na mehaničkoj mješali.Točna težina napunjenog polimera navedena u tablici 1 dodana je u otopinu kitozana i miješana dok nije dobivena bistra otopina polimera.PVP K30 i PEG 400 dodani su dobivenoj smjesi u količinama navedenim u tablici 1, a miješanje je nastavljeno dok se ne dobije bistra viskozna polimerna otopina.Rezultirajuća kupka otopine polimera je sonikirana 60 minuta kako bi se uklonili zarobljeni mjehurići zraka iz smjese polimera.Kao što je prikazano na dodatnoj slici S1(b), Ct je ravnomjerno raspoređen u svakoj jažici ploče sa 6 jažica (kalup) dopunjenoj s 5 ml HFFC-a.
Ploča sa šest jažica je sonikirana 60 minuta kako bi se postiglo ravnomjerno vlaženje i distribucija HFFC-a u Ct mreži.Zatim zamrznite ploču sa šest jažica na -20°C 8-12 sati.Ploče za zamrzavanje su liofilizirane 48 sati da se dobiju različite formulacije NFRCS.Isti postupak se koristi za proizvodnju različitih oblika i struktura, kao što su tamponi ili cilindrični tamponi, ili bilo koji drugi oblik za različite primjene.
Točno odvagani kitozan (80 kDa) (3%) se pomoću magnetske miješalice otopi u 1% octenoj kiselini.U dobivenu otopinu kitozana dodan je 1% PEG 400 i miješano 30 minuta.Dobivenu otopinu ulijte u četvrtastu ili pravokutnu posudu i zamrznite na -80°C 12 sati.Smrznuti uzorci su liofilizirani 48 sati da se dobije porozni Cs13.
Razvijeni NFRCS podvrgnut je eksperimentima pomoću infracrvene spektroskopije s Fourierovom transformacijom (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokio, Japan) kako bi se potvrdila kemijska kompatibilnost kitozana s drugim polimerima14,15.FTIR spektri (širina spektralnog raspona od 400 do 4000 cm-1) svih ispitivanih uzoraka dobiveni su izvođenjem 32 skeniranja.
Brzina apsorpcije krvi (BAR) za sve formulacije procijenjena je korištenjem metode koju su opisali Chen et al.16 s malim izmjenama.Razvijeni NFRK svih sastava sušeni su u vakuumskoj pećnici na 105°C preko noći kako bi se uklonilo zaostalo otapalo.30 mg NFRCS (početna težina uzorka – W0) i 30 mg Ct (pozitivna kontrola) stavljeno je u odvojene posude koje sadrže predsmjesu od 3,8% natrijevog citrata.U unaprijed određenim vremenskim intervalima, tj. 5, 10, 20, 30, 40 i 60 sekundi, NFRCS su uklanjani i njihove površine očišćene od neapsorbirane krvi stavljanjem uzoraka na Ct na 30 sekundi.Uzeta je u obzir konačna težina krvi koju je apsorbirao NFRCS 16 (W1) u svakoj vremenskoj točki.Izračunajte postotak BAR pomoću sljedeće formule:
Vrijeme zgrušavanja krvi (BCT) određeno je kako su objavili Wang i sur.17 .Vrijeme potrebno da se cijela krv (štakorska krv prethodno pomiješana s 3,8% natrijevim citratom) zgruša u prisutnosti NFRCS izračunato je kao BCT testnog uzorka.Različite NFRCS komponente (30 mg) stavljene su u bočice od 10 ml s navojnim čepom i inkubirane na 37°C.U bočicu je dodana krv (0,5 ml) i dodano je 0,3 ml 0,2 M CaCl2 da se aktivira koagulacija krvi.Na kraju, preokrenite bočicu svakih 15 sekundi (do 180°) dok se ne formira čvrsti ugrušak.BCT uzorka procjenjuje se brojem okretaja vaila17,18.Na temelju BCT-a, dva optimalna sastava iz NFRCS Cm, Ch i Cp odabrana su za daljnje studije karakterizacije.
BCT sastava Ch NFRCS i Cp NFRCS određen je primjenom metode koju su opisali Li et al.19 .Stavite 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs (pozitivna kontrola) u zasebne Petrijeve zdjelice (37 °C).Krv koja je sadržavala 3,8% natrijeva citrata pomiješana je s 0,2 M CaCl2 u volumnom omjeru 10:1 kako bi se započeo proces zgrušavanja krvi.20 µl 0,2 M CaCl2 mješavine krvi štakora naneseno je na površinu uzorka i stavljeno u praznu Petrijevu zdjelicu.Kontrola je bila krv ulivena u prazne Petrijeve zdjelice bez Ct.U fiksnim intervalima od 0, 3 i 5 minuta, zaustavite zgrušavanje dodavanjem 10 ml deionizirane (DI) vode u uzorak koji sadrži posudu bez ometanja ugruška.Nezgrušani eritrociti (eritrociti) podliježu hemolizi u prisutnosti deionizirane vode i oslobađaju hemoglobin.Hemoglobin u različitim vremenskim točkama (HA(t)) mjeren je na 540 nm (λmax hemoglobin) korištenjem UV-Vis spektrofotometra.Kao referentni standard uzeta je apsolutna apsorpcija hemoglobina (AH(0)) u 0 min od 20 µl krvi u 10 ml deionizirane vode.Relativni unos hemoglobina (RHA) koagulirane krvi izračunat je iz omjera HA(t)/HA(0) korištenjem iste serije krvi.
Pomoću analizatora teksture (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, SAD) određena su adhezivna svojstva NFRK na oštećeno tkivo.Cilindričnu posudu s otvorenim dnom prislonite na unutrašnjost svinjske kože (bez sloja masnoće).Uzorci (Ch NFRCS i Cp NFRCS) naneseni su kanilom u cilindrične kalupe kako bi se stvorilo prianjanje na kožu svinje.Nakon 3 minute inkubacije na sobnoj temperaturi (RT) (25°C), NFRCS adhezivna snaga je zabilježena pri konstantnoj brzini od 0,5 mm/sek.
Glavna značajka kirurških brtvila je povećanje zgrušavanja krvi uz smanjenje gubitka krvi.Koagulacija bez gubitaka u NFRCS procijenjena je prethodno objavljenom metodom s malim izmjenama 19 .Napravite epruvetu za mikrocentrifugu (2 ml) (unutarnjeg promjera 10 mm) s rupom 8 × 5 mm2 na jednoj strani epruvete za centrifugu (koja predstavlja otvorenu ranu).NFRCS se koristi za zatvaranje otvora, a traka se koristi za brtvljenje vanjskih rubova.Dodajte 20 µl 0,2 M CaCl2 u epruvetu mikrocentrifuge koja sadrži 3,8% predsmjesu natrijevog citrata.Nakon 10 minuta mikrocentrifugalne epruvete su izvađene iz posuda i utvrđeno je povećanje mase posuda zbog istjecanja krvi iz NFRK (n = 3).Gubitak krvi Ch NFRCS i Cp NFRCS uspoređeni su s Cs.
Mokri integritet NFRCS-a određen je na temelju metode koju su opisali Mishra i Chaudhary21 uz manje izmjene.Stavite NFRCS u Erlenmeyerovu tikvicu od 100 ml s 50 ml vode i vrtite 60 s bez stvaranja vrha.Vizualni pregled i određivanje prioriteta uzoraka za fizički integritet na temelju prikupljanja.
Snaga vezanja HFFC-a na Ct proučavana je pomoću prethodno objavljenih metoda s manjim izmjenama.Integritet površinske prevlake procijenjen je izlaganjem NFRK akustičnim valovima (vanjski podražaj) u prisutnosti milliQ vode (Ct).Razvijeni NFRCS Ch NFRCS i Cp NFRCS stavljeni su u čašu napunjenu vodom i sonikirani 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 odnosno 30 minuta.Nakon sušenja, razlika u postotku između početne i konačne težine NFRCS-a korištena je za izračun postotka gubitka materijala (HFFC).In vitro BCT dodatno je podržao snagu vezivanja ili gubitak površinskih materijala.Učinkovitost HFFC vezanja na Ct osigurava koagulaciju krvi i elastičnu prevlaku na površini Ct22.
Homogenost razvijenog NFRCS-a određena je BCT-om uzoraka (30 mg) uzetih s nasumično odabranih općih lokacija NFRCS-a.Slijedite prethodno spomenutu BCT proceduru kako biste utvrdili usklađenost s NFRCS.Blizina između svih pet uzoraka osigurava jednoliku površinsku pokrivenost i taloženje HFFC-a u mreži Ct.
Nominalna površina kontakta s krvlju (NBCA) određena je kao što je prethodno objavljeno uz neke izmjene.Koagulirajte krv stezanjem 20 µl krvi između dvije površine Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs.Nakon 1 sata, dva dijela stenta su razdvojena i ručno je izmjerena površina ugruška.Prosječna vrijednost triju ponavljanja smatrana je NBCA NFRCS19.
Analiza dinamičke sorpcije pare (DVS) korištena je za procjenu učinkovitosti NFRCS za apsorpciju vode iz vanjskog okruženja ili s mjesta ozljede odgovornog za početak koagulacije.DVS procjenjuje ili bilježi upijanje i gubitak pare u uzorku gravimetrijski pomoću ultraosjetljive vage s rezolucijom mase od ±0,1 µg.Parcijalni tlak pare (relativna vlažnost) stvara elektronički regulator masenog protoka oko uzorka miješanjem zasićenih i suhih plinova nositelja. Prema smjernicama Europske farmakopeje, na temelju postotka upijanja vlage u uzorcima, uzorci su kategorizirani u 4 kategorije (0–0,012% w/w− nehigroskopni, 0,2–2% w/w blago higroskopni, 2–15% umjereno higroskopni i > 15% vrlo higroskopni)23. Prema smjernicama Europske farmakopeje, na temelju postotka upijanja vlage u uzorcima, uzorci su kategorizirani u 4 kategorije (0–0,012% w/w− nehigroskopni, 0,2–2% w/w blago higroskopni, 2–15% umjereno higroskopni i > 15% vrlo higroskopni)23.Sukladno preporukama Europske farmakopeje, ovisno o postotku upijanja vlage uzorcima, uzorci su podijeljeni u 4 kategorije (0–0,012 % w/w – nehigroskopni, 0,2–2 % w/w blago higroskopni, 2– petnaest %).% umjereno higroskopičan i > 15% vrlo higroskopičan)23. % umjereno higroskopno i > 15% vrlo higroskopno)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012% w/w- 非吸湿性、0,2-2% w /w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（0-0,012% W/w- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2% w/w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23。Sukladno preporukama Europske farmakopeje uzorci su podijeljeni u 4 klase ovisno o postotku vlage koju uzorak apsorbira (0-0,012% maseni – nehigroskopni, 0,2-2% težinski slabo higroskopni, 2-15% težinski).% umjereno gigroskopski, > 15 % vrlo gigroskopski) 23. % umjereno higroskopan, > 15 % vrlo higroskopan) 23.Higroskopska učinkovitost NFCS X NFCS i TsN NFCS određena je na analizatoru DVS TA TGA Q5000 SA.Tijekom ovog procesa dobiveni su vrijeme rada, relativna vlažnost (RH) i težina uzorka u stvarnom vremenu na 25°C24.Sadržaj vlage izračunava se preciznom NFRCS analizom mase pomoću sljedeće jednadžbe:
MC je NFRCS vlažnost.m1 – suha težina NSAID-a.m2 je NFRCS masa u stvarnom vremenu pri danoj RH.
Ukupna površina procijenjena je pomoću eksperimenta adsorpcije dušika s tekućim dušikom nakon pražnjenja uzoraka na 25 °C tijekom 10 sati (< 7 × 10–3 Torr). Ukupna površina procijenjena je pomoću eksperimenta adsorpcije dušika s tekućim dušikom nakon pražnjenja uzoraka na 25 °C tijekom 10 sati (< 7 × 10–3 Torr). Ukupna površina površine ocijenjena je uz pomoć eksperimenta adsorpcije azota židkim azotom nakon isparavanja uzoraka pri 25 °S tijekom 10 sati (< 7 × 10–3 Torr). Ukupna površina procijenjena je pomoću eksperimenta adsorpcije dušika s tekućim dušikom nakon što su uzorci pražnjeni na 25°C tijekom 10 sati (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。Temperatura do 25°C Ukupna površina površine ocijenjena je korištenjem eksperimenata za adsorpciju azota i azotnih kiselina nakon isparavanja uzoraka tijekom 10 sati pri 25°C (< 7 × 10-3 torr). Ukupna površina procijenjena je korištenjem eksperimenata adsorpcije dušika s tekućim dušikom nakon što su uzorci pražnjeni 10 sati na 25°C (< 7 x 10-3 torr).Ukupna površina, volumen pora i NFRCS veličina pora određeni su Quantachrome-om iz NOVA 1000e, Austrija uz korištenje RS 232 softvera.
Pripremite 5% eritrocita (fiziološka otopina kao razrjeđivač) iz cijele krvi.Zatim prenesite alikvot HFFC-a (0,25 ml) na ploču s 96 jažica i 5% RBC mase (0,1 ml).Inkubirajte smjesu na 37°C 40 minuta.Mješavina crvenih krvnih stanica i seruma smatrana je pozitivnom kontrolom, a mješavina fiziološke otopine i crvenih krvnih stanica negativnom kontrolom.Hemaglutinacija je određena prema Stajitzky ljestvici.Predložene ljestvice su sljedeće: + + + + gusti zrnasti agregati;+ + + glatki donji jastučići sa zakrivljenim rubovima;+ + glatki donji jastučići s poderanim rubovima;+ uski crveni prstenovi oko rubova glatkih jastučića;– (negativno) diskretni crveni gumb 12 u središtu donjeg otvora.
Hemokompatibilnost NFRCS proučavana je prema metodi Međunarodne organizacije za standardizaciju (ISO) (ISO10993-4, 1999.)26,27.Gravimetrijska metoda koju su opisali Singh et al.Napravljene su manje izmjene za procjenu stvaranja tromba u prisutnosti ili na površini NFRCS.500 mg Cs, Ch NFRCS i Cp NFRCS inkubirano je u fosfatnom puferu fiziološke otopine (PBS) 24 sata na 37°C.Nakon 24 sata, PBS je uklonjen i NFRCS je tretiran sa 2 ml krvi koja je sadržavala 3,8% natrijevog citrata.Na površinu NFRCS-a dodajte 0,04 ml 0,1 M CaCl2 inkubiranim uzorcima.Nakon 45 minuta dodano je 5 ml destilirane vode da se zaustavi koagulacija.Zgrušana krv na površini NFRK tretirana je 36-38% otopinom formaldehida.Ugrušci fiksirani formaldehidom su osušeni i izvagani.Postotak tromboze procijenjen je izračunavanjem težine čaše bez krvi i uzorka (negativna kontrola) i čaše s krvlju (pozitivna kontrola).
Kao početna potvrda, uzorci su vizualizirani pod optičkim mikroskopom kako bi se razumjela sposobnost HFFC površinskog premaza, međusobno povezane Ct i Ct mreže da tvore pore.Tanki dijelovi Ch i Cp iz NFRCS-a su odrezani oštricom skalpela.Dobiveni presjek stavljen je na predmetno stakalce, prekriven pokrovnim stakalcem, a rubovi su fiksirani ljepilom.Pripremljena stakalca promatrana su pod optičkim mikroskopom i snimljene su fotografije pri različitim povećanjima.
Taloženje polimera u Ct mrežama vizualizirano je pomoću fluorescentne mikroskopije na temelju metode koju su opisali Rice i sur.29. HFFC sastav korišten za formulaciju je pomiješan s fluorescentnom bojom (amarant), a NFRCS (Ch & Cp) su pripremljeni prema prethodno spomenutoj metodi. HFFC sastav korišten za formulaciju je pomiješan s fluorescentnom bojom (amarant), a NFRCS (Ch & Cp) su pripremljeni prema prethodno spomenutoj metodi.HFFC sastav korišten za formulaciju pomiješan je s fluorescentnom bojom (amarant) i NFRCS (Ch i Cp) je dobiven u skladu s prethodno spomenutom metodom.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。HFFC sastav korišten u formulaciji pomiješan je s fluorescentnom bojom (Amarant) i dobio je NFRCS (Ch i Cp), kao što je ranije spomenuto.Iz dobivenih uzoraka izrezani su tanki rezovi NFRK, stavljeni na stakalce i prekriveni pokrovnim stakalcima.Promatrajte pripremljena stakalca pod fluorescentnim mikroskopom koristeći zeleni filter (310-380 nm).Slike su snimljene s povećanjem od 4x kako bi se razumjeli Ct odnosi i višak taloženja polimera u Ct mreži.
Površinska topografija NFRCS Ch i Cp određena je pomoću mikroskopa atomske sile (AFM) s ultra-oštrom TESP konzolom u načinu tapkanja: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Tajvan.Površinska hrapavost je određena pomoću srednjeg kvadrata (RMS) pomoću softvera (Scanning Probe Image Processor).Razne NFRCS lokacije prikazane su na 3D slikama kako bi se provjerila ujednačenost površine.Standardna devijacija rezultata za određeno područje definirana je kao hrapavost površine.RMS jednadžba korištena je za kvantificiranje hrapavosti površine NFRCS31.
Studije temeljene na FESEM-u provedene su korištenjem FESEM-a, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokio, kako bi se razumjela površinska morfologija Ch NFRCS i Cp NFRCS, koja je pokazala bolji BCT nego Cm NFRCS.Studija FESEM provedena je prema metodi koju su opisali Zhao i sur.32 s manjim izmjenama.NFRCS 20 do 30 mg Ch NFRCS i Cp NFRCS prethodno su pomiješani s 20 ul 3,8% natrijevog citrata prethodno pomiješanog s krvlju štakora.Uzorcima obrađenim krvlju dodano je 20 μl 0,2 M CaCl2 kako bi se pokrenula koagulacija i uzorci su inkubirani na sobnoj temperaturi 10 minuta.Osim toga, višak eritrocita uklonjen je s površine NFRCS ispiranjem fiziološkom otopinom.
Naknadni uzorci tretirani su s 0,1% glutaraldehidom i zatim osušeni u pećnici s vrućim zrakom na 37°C kako bi se uklonila vlaga.Osušeni uzorci su premazani i analizirani 32 .Ostale slike dobivene tijekom analize bile su stvaranje ugrušaka na površini pojedinačnih pamučnih vlakana, taloženje polimera između Ct, morfologija (oblik) eritrocita, cjelovitost ugruška i morfologija eritrocita u prisutnosti NFRCS.Netretirana NFRCS područja i NFRCS područja tretirana Ch i Cp inkubirana s krvlju skenirana su na elementarne ione (natrij, kalij, dušik, kalcij, magnezij, cink, bakar i selen)33.Usporedite postotke elementarnih iona između tretiranih i netretiranih uzoraka kako biste razumjeli nakupljanje elementarnih iona tijekom stvaranja ugruška i homogenost ugruška.
Debljina Cp HFFC površinskog premaza na Ct površini određena je pomoću FESEM-a.Poprečni presjeci Cp NFRCS izrezani su iz okvira i premazani prskanjem.Rezultirajući uzorci premaza prskanjem promatrani su FESEM-om i izmjerena je debljina površinskog premaza 34, 35, 36.
Rendgenski mikro-CT pruža 3D nedestruktivnu sliku visoke rezolucije i omogućuje vam proučavanje unutarnjeg strukturnog uređenja NFRK-a.Micro-CT koristi zraku X-zraka koja prolazi kroz uzorak za snimanje lokalnog linearnog koeficijenta slabljenja X-zraka u uzorku, što pomaže u dobivanju morfoloških informacija.Unutarnja lokacija Ct u Cp NFRCS i Cp NFRCS tretiranoj krvlju ispitana je mikro-CT-om kako bi se razumjela učinkovitost apsorpcije i zgrušavanje krvi u prisutnosti NFRCS37,38,39.3D strukture uzoraka tretiranih krvlju i netretiranih Cp NFRCS rekonstruirane su pomoću mikro-CT-a (V|tome|x S240, Phoenix, Njemačka).Korištenjem softvera VG STUDIO-MAX verzije 2.2, nekoliko rendgenskih slika snimljeno je iz različitih kutova (idealna pokrivenost od 360°) kako bi se razvile 3D slike za NFRCS.Prikupljeni podaci projekcije rekonstruirani su u 3D volumetrijske slike pomoću odgovarajućeg jednostavnog softvera 3D ScanIP Academic.
Dodatno, da bi se razumjela distribucija ugruška, 20 µl prethodno izmiješane citrirane krvi i 20 µl 0,2 M CaCl2 dodano je u NFRCS da bi se pokrenulo zgrušavanje krvi.Pripremljene uzorke ostavimo da se stvrdnu.NFRK površina je obrađena s 0,5% glutaraldehidom i sušena u pećnici s vrućim zrakom na 30-40 °C 30 minuta.Krvni ugrušak nastao na NFRCS-u je skeniran, rekonstruiran i vizualizirana je 3D slika krvnog ugruška.
Antibakterijski testovi provedeni su na Cp NFRCS (najbolje u usporedbi s Ch NFRCS) koristeći prethodno opisanu metodu s manjim modifikacijama.Antibakterijsko djelovanje Cp NFRCS i Cp HFFC određeno je pomoću tri različita testna mikroorganizma [S.aureus (gram-pozitivne bakterije), E.coli (gram-negativne bakterije) i bijela Candida (C.albicans)] koji rastu na agaru u Petrijevim zdjelicama u inkubatoru.Ravnomjerno inokulirajte 50 ml razrijeđene suspenzije bakterijske kulture u koncentraciji od 105-106 CFU ml-1 na agar medij.Ulijte medij u Petrijevu zdjelicu i ostavite da se skrutne.Jažice su napravljene na površini ploče s agarom kako bi se napunile s HFFC (3 jažice za HFFC i 1 za negativnu kontrolu).Dodajte 200 µl HFFC u 3 jažice i 200 µl pH 7,4 PBS u 4. jažicu.S druge strane petrijeve zdjelice stavite Cp NFRCS disk od 12 mm na skrutnuti agar i navlažite ga PBS-om (pH 7,4).Tablete ciprofloksacina, ampicilina i flukonazola smatraju se referentnim standardima za Staphylococcus aureus, Escherichia coli i Candida albicans.Ručno izmjerite zonu inhibicije i snimite digitalnu sliku zone inhibicije.
Nakon institucionalnog etičkog odobrenja, studija je provedena na Kasturba Medical College of Education and Research u Manipalu, Karnataka, u južnoj Indiji.In vitro TEG eksperimentalni protokol pregledao je i odobrio Institucionalni etički odbor medicinskog fakulteta Kasturba, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Subjekti su regrutirani među dobrovoljnim darivateljima krvi (u dobi od 18 do 55 godina) iz bolničke banke krvi.Uz to, od volontera je dobiven obrazac informiranog pristanka za uzimanje uzoraka krvi.Nativni TEG (N-TEG) ​​korišten je za proučavanje učinka formulacije Cp HFFC na punu krv prethodno pomiješanu s natrijevim citratom.N-TEG je široko poznat po svojoj ulozi u reanimaciji na mjestu pružanja skrbi, što kliničarima stvara probleme zbog mogućnosti klinički značajnog kašnjenja rezultata (rutinski testovi koagulacije).N-TEG analiza provedena je korištenjem pune krvi.Informirani pristanak i detaljna medicinska povijest dobiveni su od svih sudionika.Studija nije uključivala sudionike s hemostatskim ili trombotičkim komplikacijama poput trudnoće/porođaja ili bolesti jetre.Ispitanici koji su uzimali lijekove koji utječu na kaskadu koagulacije također su bili isključeni iz studije.Svim ispitanicima učinjene su osnovne laboratorijske pretrage (hemoglobin, protrombinsko vrijeme, aktivirani tromboplastin i broj trombocita) prema standardnim postupcima.N-TEG određuje viskoelastičnost krvnog ugruška, početnu strukturu ugruška, interakciju čestica, jačanje ugruška i lizu ugruška.N-TEG analiza pruža grafičke i numeričke podatke o zajedničkim učincima nekoliko staničnih elemenata i plazme.N-TEG analiza provedena je na dva različita volumena Cp HFFC (10 µl i 50 µl).Kao rezultat, 1 ml pune krvi s limunskom kiselinom dodan je u 10 μl Cp HFFC.Dodajte 1 ml (Cp HFFC + citrirana krv), 340 µl miješane krvi u 20 µl 0,2 M CaCl2 koja sadrži TEG posudu.Nakon toga, TEG posude su stavljene u TEG® 5000, US za mjerenje R, K, alfa kuta, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% uzoraka krvi u prisutnosti Cp HFFC41.
Protokol studije in vivo pregledao je i odobrio Institucionalni odbor za etiku životinja (IAEC), Medicinski fakultet Kasturba, Institut za visoko obrazovanje Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Svi pokusi na životinjama izvedeni su u skladu s preporukama Povjerenstva za kontrolu i nadzor pokusa na životinjama (CPCSEA).Sve in vivo NFRCS studije (2 × 2 cm2) provedene su na ženkama Wistar štakora (težine 200 do 250 g).Sve životinje su aklimatizirane na temperaturi od 24-26°C, životinje su imale slobodan pristup standardnoj hrani i vodi ad libitum.Sve su životinje nasumično podijeljene u različite skupine, a svaka se skupina sastojala od tri životinje.Sva su istraživanja provedena u skladu s Studijama na životinjama: Izvješće o pokusima in vivo 43 .Prije studije, životinje su anestezirane intraperitonealnom (ip) primjenom smjese od 20-50 mg ketamina (po 1 kg tjelesne težine) i 2-10 mg ksilazina (po 1 kg tjelesne težine).Nakon studije izračunat je volumen krvarenja procjenom razlike između početne i konačne težine uzoraka, prosječna vrijednost dobivena iz tri testa uzeta je kao volumen krvarenja uzorka.
Implementiran je model amputacije repa štakora kako bi se razumio potencijal NFRCS-a za moduliranje krvarenja u traumi, borbi ili prometnoj nesreći (model ozljede).Odrežite 50% repa oštricom skalpela i stavite ga na zrak 15 sekundi kako biste osigurali normalno krvarenje.Osim toga, test uzorci su stavljeni na rep štakora primjenom pritiska (Ct, Cs, Ch NFRCS i Cp NFRCS).Krvarenje i PCT prijavljeni su za ispitne uzorke (n = 3)17,45.
Učinkovitost NFRCS kontrole tlaka u borbi istraživana je na modelu površinske femoralne arterije.Femoralna arterija je izložena, punktirana 24G troakarom i krvarena unutar 15 sekundi.Nakon što se uoči nekontrolirano krvarenje, ispitni uzorak se stavlja na mjesto uboda uz primjenu pritiska.Neposredno nakon primjene ispitnog uzorka, zabilježeno je vrijeme zgrušavanja i promatrana je hemostatska učinkovitost sljedećih 5 minuta.Isti postupak ponovljen je s Cs i Ct46.
Dowling i sur.47 predložili su model ozljede jetre za procjenu hemostatskog potencijala hemostatskih materijala u kontekstu intraoperativnog krvarenja.BCT je zabilježen za Ct uzorke (negativna kontrola), Cs framework (pozitivna kontrola), Ch NFRCS uzorke i Cp NFRCS uzorke.Suprahepatična šuplja vena štakora je izložena izvođenjem srednje laparotomije.Nakon toga je škarama izrezan distalni dio lijevog režnja.Oštricom skalpela napravite rez na jetri i pustite je da krvari nekoliko sekundi.Točno izvagani Ch NFRCS i Cp NFRCS ispitni uzorci postavljeni su na oštećenu površinu bez ikakvog pozitivnog tlaka i zabilježen je BCT.Kontrolna skupina (Ct) zatim je primijenila pritisak nakon čega je uslijedio Cs 30 s47 bez prekida ozljede.
In vivo testovi zacjeljivanja rana provedeni su korištenjem modela ekscizijske rane za procjenu svojstava zacjeljivanja rana razvijenih NFRCS-ova na bazi polimera.Modeli ekscizijskih rana odabrani su i izvedeni prema prethodno objavljenim metodama uz manje modifikacije19,32,48.Sve životinje su anestezirane kao što je prethodno opisano.Probijačem za biopsiju (12 mm) napravite kružni duboki rez na koži leđa.Pripremljena mjesta rana previjena su Cs (pozitivna kontrola), Ct (prepoznavanje da pamučni jastučići ometaju cijeljenje), Ch NFRCS i Cp NFRCS (eksperimentalna skupina) i negativna kontrola bez ikakvog tretmana.Svaki dan istraživanja, površina rane je mjerena kod svih štakora.Digitalnim fotoaparatom snimite područje rane i stavite novi zavoj.Postotak zatvaranja rane mjeren je sljedećom formulom:
Na temelju postotka zatvaranja rane 12. dana istraživanja, koža štakora najbolje skupine je izrezana ((Cp NFRCS) i kontrolna skupina) i proučavana H&E bojenjem i Massonovim trikromnim bojanjem. Na temelju postotka zatvaranja rane 12. dana istraživanja, koža štakora najbolje skupine je izrezana ((Cp NFRCS) i kontrolna skupina) i proučavana H&E bojenjem i Massonovim trikromnim bojanjem.Na temelju postotka zatvaranja rana 12. dana istraživanja, štakorima najbolje skupine ((Cp NFRCS) i kontrolne skupine) izrezana je koža i ispitana bojenjem hematoksilin-eozinom i Massonovim trikromom.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和Mas sin三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组)Štakori u najboljoj skupini ((Cp NFRCS) i kontrolne skupine) izrezani su radi bojenja hematoksilin-eozinom i Massonovog trikromnog bojenja na temelju postotka zatvaranja rana 12. dana studije.Provedeni postupak bojenja proveden je prema prethodno opisanim metodama49,50.Ukratko, nakon fiksacije u 10% formalinu, uzorci su dehidrirani korištenjem niza stupnjevanih alkohola.Upotrijebite mikrotom da biste dobili tanke dijelove (5 µm debljine) izrezanog tkiva.Tanki serijski presjeci kontrola i Cp NFRCS tretirani su hematoksilinom i eozinom radi proučavanja histopatoloških promjena.Massonova trikromna boja korištena je za otkrivanje stvaranja kolagenih fibrila.Dobivene rezultate slijepo su proučavali patolozi.
Stabilnost Cp NFRCS uzoraka proučavana je na sobnoj temperaturi (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) tijekom 12 mjeseci51.Cp NFRCS (promjena boje površine i rast mikroba) vizualno je pregledan i testiran na otpornost na habanje i BCT u skladu s gornjim metodama navedenim u odjeljku Materijali i metode.
Skalabilnost i ponovljivost Cp NFRCS ispitana je pripremom Cp NFRCS veličine 15×15 cm2.Osim toga, uzorci od 30 mg (n = 5) izrezani su iz različitih Cp NFRCS frakcija i BCT ispitivanih uzoraka je procijenjen kao što je ranije opisano u odjeljku Metode.
Pokušali smo razviti različite oblike i strukture koristeći Cp NFRCS sastave za različite biomedicinske primjene.Takvi oblici ili konfiguracije uključuju stožaste štapiće za krvarenje iz nosa, stomatološke zahvate i cilindrične štapiće za vaginalno krvarenje.
Svi skupovi podataka izraženi su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija i analizirani su ANOVA-om koristeći Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, SAD) nakon čega je slijedio Bonferronijev test višestrukih usporedbi (*p<0,05).
Svi postupci provedeni u studijama na ljudima bili su u skladu sa standardima Instituta i Nacionalnog istraživačkog vijeća, kao i Helsinškom deklaracijom iz 1964. i njezinim naknadnim izmjenama ili sličnim etičkim standardima.Svi sudionici upoznati su sa značajkama istraživanja i njegovom dobrovoljnom karakteru.Podaci o sudionicima ostaju povjerljivi nakon prikupljanja.In vitro TEG eksperimentalni protokol pregledao je i odobrio Institucionalni etički odbor medicinskog fakulteta Kasturba, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Volonteri su potpisali informirani pristanak za uzimanje uzoraka krvi.
Svi postupci provedeni u studijama na životinjama provedeni su u skladu s Medicinskim fakultetom Kastuba, Institutom za visoko obrazovanje Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Svi osmišljeni pokusi na životinjama provedeni su u skladu sa smjernicama Odbora za kontrolu i nadzor pokusa na životinjama (CPCSEA).Svi autori slijede smjernice ARRIVE.
FTIR spektri svih NFRCS su analizirani i uspoređeni sa spektrom kitozana prikazanim na slici 2A.Karakteristični spektralni vrhovi kitozana (zabilježeni) na 3437 cm-1 (istezanje OH i NH, preklapanje), 2945 i 2897 cm-1 (istezanje CH), 1660 cm-1 (naprezanje NH2), 1589 cm-1 (savijanje N–H), 1157 cm-1 (istezanje mosta O-), 1067 cm-1 (istezanje C–O, sekundarni hidro ksil), 993 cm-1 (razvučeni CO, Bo-OH) 52.53.54.Dodatna tablica S1 prikazuje vrijednosti FTIR NFRCS apsorpcijskog spektra za kitozan (reporter), čisti kitozan, Cm, Ch i Cp.FTIR spektri svih NFRCS (Cm, Ch i Cp) pokazali su iste karakteristične apsorpcijske trake kao čisti kitozan bez ikakvih značajnih promjena (slika 2A).Rezultati FTIR-a potvrdili su nepostojanje kemijskih ili fizičkih interakcija između polimera korištenih za razvoj NFRCS-a, što ukazuje da su korišteni polimeri inertni.
In vitro karakterizacija Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs.(A) predstavlja kombinirane FTIR spektre sastava hitozana i Cm NFRCS, Ch NFRCS i Cp NFRCS pod kompresijom.(B) a) Stopa preuzimanja NFRCS Cm, Ch, Cp i Cg iz cijele krvi (n = 3);Uzorci Ct pokazali su veći BAR jer pamučni štapić ima veću učinkovitost upijanja;b) Krv nakon apsorpcije krvi Ilustracija apsorbiranog uzorka.Grafički prikaz BCT ispitnog uzorka C (Cp NFRCS je imao najbolji BCT (15 s, n = 3)). Podaci u C, D, E i G prikazani su kao srednja vrijednost ± SD, a stupci pogrešaka predstavljaju SD, ***p < 0,0001. Podaci u C, D, E i G prikazani su kao srednja vrijednost ± SD, a stupci pogrešaka predstavljaju SD, ***p < 0,0001. Podaci u C, D, E i G prikazani su kao srednje ± standardno odstupanje, a pogrešne ploče predstavljaju standardno odstupanje, ***p <0,0001. Podaci u C, D, E i G prikazani su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija, a stupci pogrešaka predstavljaju standardnu ​​devijaciju, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Podaci u C, D, E i G prikazani su kao srednja vrijednost ± standardno odstupanje, pogrešne ploče predstavljaju standardno odstupanje, ***p <0,0001. Podaci u C, D, E i G prikazani su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija, trake grešaka predstavljaju standardnu ​​devijaciju, ***p<0,0001.