Hvala što ste posjetili Nature.com.Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Plodnost ptica ovisi o njihovoj sposobnosti da pohrane dovoljno održive sperme kroz dulje vremensko razdoblje u tubulima za pohranu sperme (SST).Točan mehanizam kojim spermiji ulaze, borave i napuštaju SST ostaje kontroverzan.Sperma šarkasi kokoši pokazala je veliku sklonost aglutinaciji, tvoreći pokretne nitaste snopove koji sadrže mnogo stanica.Zbog poteškoća u promatranju pokretljivosti i ponašanja spermija u neprozirnom jajovodu, za proučavanje aglutinacije i pokretljivosti spermija upotrijebili smo mikrofluidni uređaj s mikrokanalnim presjekom sličnim presjeku spermija.Ova studija raspravlja o tome kako se formiraju snopovi spermija, kako se kreću i njihovoj mogućoj ulozi u produženju boravka spermija u SST.Istraživali smo brzinu spermija i reološko ponašanje kada je protok tekućine generiran unutar mikrofluidnog kanala pomoću hidrostatskog tlaka (brzina protoka = 33 µm/s).Spermiji imaju tendenciju plivati ​​protiv struje (pozitivna reologija) i brzina snopa spermija značajno je smanjena u usporedbi s pojedinačnim spermijama.Uočeno je da se snopovi spermija pomiču spiralno i povećavaju duljinu i debljinu kako se regrutira više pojedinačnih spermija. Uočeni su snopovi sperme kako se približavaju i pridržavaju bočne stijenke mikrofluidnih kanala kako bi se izbjeglo da budu povučeni brzinom protoka tekućine > 33 µm/s. Uočeni su snopovi sperme kako se približavaju i pridržavaju bočne stijenke mikrofluidnih kanala kako bi se izbjeglo da budu povučeni brzinom protoka tekućine > 33 µm/s. Napomenuto je da se spermatozoidi približavaju i prilijepaju bočnim stenama mikrofluidnih kanala, kako bi se izbjeglo smetanje s brzinom protoka tekućine> 33 mkm/s. Uočeno je da se snopovi spermija približavaju i prianjaju uz bočne stijenke mikrofluidnih kanala kako bi se izbjeglo odnošenje pri brzinama protoka tekućine >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 µm/s 扫过。33 µm/s 扫过。 Uočeno je da se spermatozoidi približavaju i prilijepaju bočnim stenama mikrožidkostnog kanala, kako bi se izbjeglo smetanje protoka tekućine brzinom > 33 mkm/s. Uočeno je da se snopovi spermija približavaju i prianjaju uz bočne stijenke mikrofluidnog kanala kako bi se izbjeglo da ih odnese protok tekućine pri >33 µm/s.Skenirajuća i transmisijska elektronska mikroskopija otkrile su da su snopovi spermija poduprti obiljem gustog materijala.Dobiveni podaci pokazuju jedinstvenu pokretljivost spermija Sharkazi kokoši, kao i sposobnost spermija da aglutiniraju i formiraju mobilne snopove, što pridonosi boljem razumijevanju dugotrajnog skladištenja spermija u SMT.
Da bi se postigla oplodnja kod ljudi i većine životinja, spermiji i jajašca moraju stići na mjesto oplodnje u pravo vrijeme.Stoga se parenje mora dogoditi prije ili u vrijeme ovulacije.S druge strane, neki sisavci, poput pasa, kao i vrste koje nisu sisavci, poput kukaca, riba, gmazova i ptica, pohranjuju spermu u svojim reproduktivnim organima dulje vrijeme dok njihova jajašca nisu spremna za oplodnju (asinkrona oplodnja 1 ).Ptice su u stanju održati vitalnost spermija sposobnih za oplodnju jajašca 2-10 tjedana2.
Ovo je jedinstvena značajka koja razlikuje ptice od ostalih životinja, jer pruža visoku vjerojatnost oplodnje nakon jedne oplodnje nekoliko tjedana bez istovremenog parenja i ovulacije.Glavni organ za pohranu sperme, nazvan tubul za pohranu sperme (SST), nalazi se u unutarnjim naborima sluznice na uterovaginalnom spoju.Do danas mehanizmi po kojima spermiji ulaze, borave i izlaze iz banke spermija nisu u potpunosti razjašnjeni.Na temelju dosadašnjih istraživanja iznesene su mnoge hipoteze, ali niti jedna nije potvrđena.
Forman4 je pretpostavio da spermatozoidi zadržavaju svoj boravak u SST šupljini kontinuiranim oscilatornim kretanjem suprotno smjeru protoka tekućine kroz proteinske kanale smještene na SST epitelnim stanicama (reologija).ATP se iscrpljuje zbog stalne flagelarne aktivnosti potrebne za održavanje spermija u lumenu SST-a, a pokretljivost na kraju opada dok se spermiji ne iznesu iz banke spermija protokom tekućine i započnu novo putovanje niz uzlazni jajovod kako bi oplodili spermije.Jaje (Forman4).Ovaj model skladištenja sperme podupire detekcija akvaporina 2, 3 i 9 pomoću imunocitokemije prisutnih u epitelnim stanicama SST.Do danas nedostaju studije o reologiji kokošjeg sjemena i njegovoj ulozi u skladištenju SST, selekciji vaginalne sperme i konkurenciji spermija.Kod kokoši sperma ulazi u vaginu nakon prirodnog parenja, ali više od 80% spermija izbacuje se iz vagine ubrzo nakon parenja.Ovo sugerira da je vagina primarno mjesto za selekciju sperme kod ptica.Osim toga, objavljeno je da manje od 1% spermija oplođenih u vagini završi u SST-u2.Kod umjetnog osjemenjivanja pilića u vagini, broj spermija koji dosežu SST ima tendenciju povećanja 24 sata nakon osjemenjivanja.Do sada je mehanizam odabira spermija tijekom ovog procesa nejasan, a pokretljivost spermija može igrati važnu ulogu u preuzimanju spermija SST.Zbog debelih i neprozirnih stijenki jajovoda teško je izravno pratiti pokretljivost spermija u jajovodima ptica.Stoga nam nedostaje osnovno znanje o tome kako spermatozoidi prelaze u SST nakon oplodnje.
Reologija je nedavno prepoznata kao važan čimbenik koji kontrolira transport sperme u genitalijama sisavaca.Na temelju sposobnosti pokretnih spermija da migriraju u suprotnom smjeru, Zaferani i suradnici8 upotrijebili su corra mikrofluidni sustav za pasivnu izolaciju pokretnih spermija iz uzoraka sjemena.Ova vrsta razvrstavanja sjemena ključna je za medicinsko liječenje neplodnosti i kliničko istraživanje i preferira se u odnosu na tradicionalne metode koje zahtijevaju puno vremena i rada te mogu ugroziti morfologiju i strukturni integritet sperme.Međutim, do danas nisu provedena istraživanja o utjecaju izlučevina iz spolnih organa kokoši na pokretljivost spermija.
Bez obzira na mehanizam koji održava spermu pohranjenu u SST, mnogi su istraživači primijetili da se rezidentni spermatozoidi aglutiniraju glavom u glavu u SST kokoši 9, 10, prepelica 2 i purana 11 kako bi formirali aglutinirane snopove sperme.Autori sugeriraju da postoji veza između ove aglutinacije i dugotrajnog skladištenja spermija u SST.
Tingari i Lake12 izvijestili su o snažnoj povezanosti između spermija u žlijezdama kokoši koje primaju spermu i postavili pitanje da li spermiji ptica aglutiniraju na isti način kao spermiji sisavaca.Vjeruju da duboke veze između spermija u sjemenovodu mogu biti posljedica stresa uzrokovanog prisutnošću velikog broja spermija u malom prostoru.
Pri procjeni ponašanja spermija na svježim visećim stakalcima mogu se uočiti prolazni znakovi aglutinacije, osobito na rubovima sjemenih kapljica.Međutim, aglutinacija je često bila poremećena rotacijskim djelovanjem povezanim s kontinuiranim kretanjem, što objašnjava prolaznu prirodu ovog fenomena.Istraživači su također primijetili da su se nakon dodavanja razrjeđivača sjemenoj tekućini pojavili izduženi agregati stanica poput "niti".
Rani pokušaji oponašanja spermija napravljeni su uklanjanjem tanke žice s viseće kapi, što je rezultiralo izduženom vezikulom nalik na spermu koja strši iz kapi sjemena.Spermatozoidi su se odmah poredali na paralelan način unutar vezikule, ali cijela je jedinica brzo nestala zbog 3D ograničenja.Stoga je za proučavanje aglutinacije spermija potrebno promatrati pokretljivost i ponašanje spermija izravno u izoliranim tubulima za skladištenje spermija, što je teško postići.Stoga je potrebno razviti instrument koji oponaša spermatozoide kako bi se poduprla istraživanja pokretljivosti spermija i aglutinacijskog ponašanja.Brillard i suradnici13 izvijestili su da je prosječna duljina tubula za pohranu sperme kod odraslih pilića 400-600 µm, ali neki SST-ovi mogu biti dugi i do 2000 µm.Mero i Ogasawara14 podijelili su sjemene žlijezde na povećane i neuvećane tubule za skladištenje sperme, od kojih su obje bile iste duljine (~500 µm) i širine vrata (~38 µm), ali srednji promjer lumena tubula bio je 56,6 i 56,6 µm.., odnosno 11,2 μm.U trenutnoj studiji koristili smo mikrofluidički uređaj s veličinom kanala od 200 µm × 20 µm (Š × V), čiji je presjek donekle blizak presjeku pojačanog SST-a.Osim toga, ispitali smo pokretljivost spermija i ponašanje aglutinacije u tekućoj tekućini, što je u skladu s Foremanovom hipotezom da tekućina koju proizvode SST epitelne stanice održava spermije u lumenu u protustrujnom (reološkom) smjeru.
Cilj ovog istraživanja bio je prevladati probleme promatranja pokretljivosti spermija u jajovodu i izbjeći poteškoće proučavanja reologije i ponašanja spermija u dinamičnom okruženju.Upotrijebljen je mikrofluidni uređaj koji stvara hidrostatski tlak za simulaciju pokretljivosti spermija u genitalijama kokoši.
Kad se kap razrijeđenog uzorka sperme (1:40) stavi u mikrokanalni uređaj, mogu se identificirati dvije vrste pokretljivosti spermija (izolirani spermij i vezani spermij).Osim toga, spermatozoidi su imali tendenciju plivati ​​protiv struje (pozitivna reologija; video 1, 2). Iako su snopovi spermija imali manju brzinu od brzine usamljenih spermija (p < 0,001), oni su povećali postotak spermija koji pokazuju pozitivnu reotaksiju (p < 0,001; tablica 2). Iako su snopovi spermija imali manju brzinu od brzine usamljenih spermija (p < 0,001), oni su povećali postotak spermija koji pokazuju pozitivnu reotaksiju (p < 0,001; tablica 2). Iako su pukotine spermatozoida imale veću brzinu nego kod pojedinačnih spermatozoida (p < 0,001), povećale su postotak spermatozoida, pokazujući pozitivnu reotaksu (p < 0,001; tablica 2). Iako su snopovi spermija imali manju brzinu od brzine pojedinačnih spermija (p < 0,001), oni su povećali postotak spermija koji pokazuju pozitivnu reotaksiju (p < 0,001; tablica 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子 百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）)）))) Iako je brzina punjenja spermatozoida bila niža od one kod pojedinačnih spermatozoida (p < 0,001), oni su povećali postotak spermatozoida s pozitivnom reologijom (p < 0,001; tablica 2). Iako je brzina snopića spermija bila niža od brzine pojedinačnih spermija (p < 0,001), oni su povećali postotak spermija s pozitivnom reologijom (p < 0,001; tablica 2).Pozitivna reologija za pojedinačne spermatozoide i pramenove procjenjuje se na približno 53% odnosno 85%.
Uočeno je da spermatozoidi sharkasi pilića odmah nakon ejakulacije formiraju linearne snopove, koji se sastoje od desetaka jedinki.Ti se pramenovi s vremenom povećavaju u duljinu i debljinu i mogu ostati in vitro nekoliko sati prije nego što nestanu (videozapis 3).Ovi nitasti snopovi oblikovani su poput spermatozoida ehidne koji se formiraju na kraju epididimisa.Utvrđeno je da sjeme kokoši Sharkashi ima veliku tendenciju aglutinacije i formiranja mrežastog snopa u manje od jedne minute nakon prikupljanja.Ove grede su dinamične i mogu se zalijepiti za sve obližnje zidove ili statične objekte.Iako snopovi spermija smanjuju brzinu spermija, jasno je da makroskopski povećavaju njihovu linearnost.Duljina snopića varira ovisno o broju spermija sakupljenih u snopiće.Izolirana su dva dijela snopa: početni dio, uključujući slobodnu glavu aglutiniranog spermija, i završni dio, uključujući rep i cijeli distalni kraj spermija.Kamerom velike brzine (950 fps) promatrane su slobodne glavice aglutiniranih spermija u početnom dijelu snopa, koji su svojim oscilatornim kretanjem odgovorni za kretanje snopa, vukući preostale u snop spiralnim kretanjem (Video 4).Međutim, kod dugih čuperaka uočeno je da su neke slobodne glavice spermija priljubljene uz tijelo, a krajnji dio čuperka djeluje kao lopatica koja pomaže pokretanju čuperka.
Dok se u sporom protoku tekućine snopići spermija kreću paralelno jedni s drugima, međutim, počinju se preklapati i lijepiti za sve što miruje, kako ih struja ne bi isprala kako se brzina protoka povećava.Snopići nastaju kada se šaka spermija približi jedna drugoj, počnu se sinkronizirano kretati i omotavati jedna oko druge, a zatim se zalijepe za ljepljivu tvar.Slike 1 i 2 pokazuju kako se spermiji približavaju jedan drugome, formirajući spoj dok se repovi omotavaju jedan oko drugoga.
Istraživači su primijenili hidrostatski tlak kako bi stvorili protok tekućine u mikrokanalu za proučavanje reologije sperme.Korišten je mikrokanal veličine 200 µm × 20 µm (Š × V) i duljine 3,6 µm.Koristite mikrokanale između spremnika sa štrcaljkama na krajevima.Korištene su prehrambene boje kako bi kanali bili vidljiviji.
Pričvrstite interkonekcijske kabele i pribor na zid.Video je snimljen fazno kontrastnim mikroskopom.Uz svaku sliku prikazane su fazno kontrastne mikroskopije i slike mapiranja.(A) Veza između dva potoka opire se protoku zbog spiralnog gibanja (crvena strelica).(B) Veza između snopa cijevi i stijenke kanala (crvene strelice), istovremeno su povezani s dva druga snopa (žute strelice).(C) Snopovi spermija u mikrofluidnom kanalu počinju se spajati jedni s drugima (crvene strelice), tvoreći mrežu snopova spermija.(D) Stvaranje mreže snopova spermija.
Kada je kap razrijeđene sperme unesena u mikrofluidni uređaj i stvoren je protok, promatrano je da se snop sperme kreće suprotno od smjera protoka.Snopići tijesno priliježu uz stijenke mikrokanala, a slobodne glave u početnom dijelu snopića tijesno priliježu uz njih (video 5).Također se lijepe za sve nepokretne čestice na svom putu, poput krhotina, kako bi se oduprle da ih struja odnese.Tijekom vremena ti pramenovi postaju dugi filamenti koji hvataju druge pojedinačne spermatozoide i kraće pramenove (Video 6).Kako se protok počinje usporavati, dugačke linije sperme počinju formirati mrežu linija sperme (Video 7; Slika 2).
Pri velikoj brzini protoka (V > 33 µm/s), spiralni pokreti niti su povećani kao pokušaj da se uhvate mnogi pojedinačni spermiji koji stvaraju snopove koji se bolje odupiru lebdećoj sili protoka. Pri velikoj brzini protoka (V > 33 µm/s), spiralni pokreti niti su povećani kao pokušaj da se uhvate mnogi pojedinačni spermiji koji stvaraju snopove koji se bolje odupiru lebdećoj sili protoka. Pri visokoj brzini protoka (V > 33 mkm/s) spiralne pokrete nitej usilivaju, budući da oni pokušavaju uzeti mnoštvo pojedinačnih spermatozoida, koji formiraju pukotine, koji se bolje suprotstavljaju drejfujućem silnom toku. Pri velikim brzinama protoka (V > 33 µm/s), spiralni pokreti niti se povećavaju dok pokušavaju uhvatiti mnoge pojedinačne spermatozoide koji tvore snopove koji se bolje mogu oduprijeti sili protoka.在高流速 (V > 33 µm/s) 时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ， 从而更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。 Pri velikim brzinama protoka (V > 33 mkm/s) spiralno kretanje nitej povećava se u pokušaju zahvaćanja mnoštva pojedinačnih spermatozoida koji stvaraju pukotine da bi se bolje suprotstavili silama protoka drejfa. Pri velikim brzinama protoka (V > 33 µm/s), spiralno kretanje filamenata se povećava u pokušaju da se uhvati mnogo pojedinačnih spermija koji tvore snopove kako bi se bolje oduprli silama strujanja.Također su pokušali pričvrstiti mikrokanale na bočne stijenke.
Snopovi spermija identificirani su kao nakupine glava spermija i uvijenih repova pomoću svjetlosne mikroskopije (LM).Snopovi spermija s različitim agregatima također su identificirani kao uvijene glave i flagelarni agregati, višestruki spojeni repovi spermija, glave spermija pričvršćene na rep i glave spermija sa savijenim jezgrama kao višestruko spojene jezgre.transmisijska elektronska mikroskopija (TEM).Skenirajuća elektronska mikroskopija (SEM) pokazala je da su snopovi spermija obloženi agregati glava spermija, a nakupine spermija pokazuju pričvršćenu mrežu omotanih repova.
Morfologija i ultrastruktura spermija, formiranje snopića spermija proučavani su svjetlosnim mikroskopom (polovični presjek), pretražnim elektronskim mikroskopom (SEM) i transmisijskim elektronskim mikroskopom (TEM), razmazi spermija obojeni su akridin narančastom i pregledani epifluorescentnim mikroskopom.
Bojanje razmaza spermija akridin narančastom (Slika 3B) pokazalo je da su glavice spermija slijepljene i prekrivene sekretornim materijalom, što je dovelo do stvaranja velikih pramenova (Slika 3D).Snopovi spermija sastojali su se od agregata spermija s mrežom pričvršćenih repova (Slika 4A-C).Snopovi spermija sastoje se od repova mnogih spermija zalijepljenih zajedno (Sl. 4D).Tajne (sl. 4E,F) prekrivale su glave snopova spermija.
Formiranje snopa spermija Korištenjem fazno kontrastne mikroskopije i razmaza spermija obojenih akridin narančastom, pokazalo se da se glavice spermija drže zajedno.(A) Rano formiranje čuperka spermija počinje sa spermijem (bijeli krug) i tri spermija (žuti krug), sa spiralom koja počinje na repu i završava na glavi.(B) Fotomikrografija razmaza sperme obojenog akridin narančastom bojom koja prikazuje slijepljene glave spermija (strelice).Iscjedak prekriva glavu(e).Povećanje × 1000. (C) Razvoj velike zrake koja se prenosi protokom u mikrofluidnom kanalu (upotrebom kamere velike brzine pri 950 fps).(D) Mikrografija razmaza sperme obojenog akridin narančastom koja pokazuje velike pramenove (strelice).Povećanje: ×200.
Skenirajući elektronski mikrograf snopa spermija i razmaza sperme obojenog akridin narančastom.(A, B, D, E) su digitalne skenirane elektronske mikrofotografije spermija u boji, a C i F su mikrofotografije razmaza sperme obojenih akridin narančastom bojom koji pokazuju pričvršćivanje višestrukih spermija koji obavijaju kaudalnu mrežu.(AC) Skupine spermija prikazane su kao mreža pričvršćenih repova (strelice).(D) Prianjanje nekoliko spermija (s ljepljivom tvari, ružičasti obris, strelica) koji se omotavaju oko repa.(E i F) Agregati glave spermija (pokazivači) prekriveni ljepljivim materijalom (pokazivači).Spermatozoidi su formirali snopove s nekoliko vrtložnih struktura (F).(C) ×400 i (F) ×200 povećanja.
Korištenjem transmisijske elektronske mikroskopije otkrili smo da snopovi spermija imaju pričvršćene repove (Slika 6A, C), glave pričvršćene na repove (Slika 6B) ili glave pričvršćene na repove (Slika 6D).Glave spermija u snopu su zakrivljene, predstavljajući u presjeku dvije jezgre (slika 6D).U incizijskom snopu, spermatozoidi su imali uvijenu glavu s dvije jezgre i više flagelarnih regija (slika 5A).
Digitalni elektronski mikrograf u boji koji prikazuje spojne repove u snopu spermija i aglutinirajući materijal koji povezuje glave spermija.(A) Pričvršćeni rep velikog broja spermija.Primijetite kako rep izgleda u portretnoj (strelica) i pejzažnoj (strelica) projekciji.(B) Glava (strelica) spermija povezana je s repom (strelica).(C) Nekoliko repova spermija (strelice) je pričvršćeno.(D) Aglutinacijski materijal (AS, plavo) povezuje četiri glave spermija (ljubičasto).
Skenirajuća elektronska mikroskopija korištena je za otkrivanje glava spermija u snopovima spermija prekrivenih sekretima ili membranama (Slika 6B), što ukazuje da su snopovi spermija usidreni izvanstaničnim materijalom.Aglutinirani materijal koncentriran je u glavi spermija (sklop nalik glavi meduze; slika 5B) i proširen distalno, dajući sjajno žuti izgled pod fluorescentnom mikroskopijom kada je obojen akridin narančastom (slika 6C).Ova tvar je jasno vidljiva pod skenirajućim mikroskopom i smatra se vezivom.Polu-tanki rezovi (Slika 5C) i razmazi sperme obojeni akridin narančastom pokazali su snopove spermija koji sadrže gusto zbijene glavice i uvijene repove (Slika 5D).
Razne fotomikrografije koje pokazuju agregaciju glavica i presavijenih repova spermija različitim metodama.(A) Digitalna transmisiona elektronska mikrografija u boji presjeka snopa spermija koja prikazuje umotanu glavu spermija s dvodijelnom jezgrom (plavo) i nekoliko flagelarnih dijelova (zeleno).(B) Digitalna skenirana elektronska mikrografija u boji koja prikazuje skupinu glava spermija sličnih meduzi (strelice) koje izgledaju kao da su prekrivene.(C) Polutanak presjek koji prikazuje agregirane glave spermija (strelice) i uvijene repove (strelice).(D) Mikrografija razmaza sperme obojenog akridin narančastom bojom koja pokazuje nakupine glava spermija (strelice) i uvijene prianjajuće repove (strelice).Imajte na umu da ljepljiva tvar (S) prekriva glavicu spermija.(D) × 1000 povećanje.
Korištenjem transmisijske elektronske mikroskopije (Slika 7A), također je primijećeno da su glave spermija bile uvrnute i da su jezgre imale spiralni oblik, što je potvrđeno razmazima spermija obojenim akridin narančastom bojom i pregledanim pomoću fluorescentne mikroskopije (Slika 7B).
(A) Digitalna transmisiona elektronska mikrografija u boji i (B) razmaz sperme obojen akridin narančastom bojom koji pokazuje uvijene glave i pričvršćenje glava i repova spermija (strelice).(B) × 1000 povećanje.
Zanimljivo je otkriće da se Sharkazijev spermij skuplja u pokretne nitaste snopove.Svojstva ovih snopova omogućuju nam razumijevanje njihove moguće uloge u apsorpciji i skladištenju spermija u SST.
Nakon parenja, spermatozoidi ulaze u vaginu i podvrgavaju se intenzivnom procesu selekcije, što rezultira ulaskom samo ograničenog broja spermija u SST15,16.Do danas su nejasni mehanizmi kojima spermiji ulaze i izlaze iz SST.U peradi se spermatozoidi pohranjuju u SST dulje razdoblje od 2 do 10 tjedana, ovisno o vrsti6.Ostaje kontroverza oko stanja sjemena tijekom skladištenja u SST.Jesu li u pokretu ili miruju?Drugim riječima, kako spermiji održavaju svoj položaj u SST-u tako dugo?
Forman4 je predložio da se boravak i izbacivanje SST-a mogu objasniti u smislu pokretljivosti spermija.Autori pretpostavljaju da spermiji održavaju svoj položaj plivajući protiv protoka tekućine koju stvara SST epitel i da se spermiji izbacuju iz SST kada njihova brzina padne ispod točke u kojoj se počinju kretati unatrag zbog nedostatka energije.Zaniboni5 je potvrdio prisutnost akvaporina 2, 3 i 9 u apikalnom dijelu SST epitelnih stanica, što može neizravno podržavati Foremanov model skladištenja sperme.U trenutnoj studiji otkrili smo da gotovo polovica Sharkashijevih spermija pokazuje pozitivnu reologiju u tekućoj tekućini i da aglutinirani snopovi spermija povećavaju broj spermija koji pokazuju pozitivnu reologiju, iako ih aglutinacija usporava.Kako spermiji putuju ptičjim jajovodom do mjesta oplodnje nije u potpunosti razjašnjeno.Kod sisavaca folikularna tekućina kemoterapiju privlači spermatozoide.Međutim, vjeruje se da kemoatraktanti usmjeravaju spermatozoide na približavanje velikim udaljenostima7.Stoga su drugi mehanizmi odgovorni za transport sperme.Zabilježeno je da je sposobnost sperme da se usmjeri i teče prema tekućini jajovoda koja se oslobađa nakon parenja glavni čimbenik u ciljanju sperme kod miševa.Parker 17 sugerirao je da spermiji prelaze jajovode plivajući protiv cilijarnog toka kod ptica i gmazova.Iako to nije eksperimentalno dokazano na pticama, Adolphi18 je prvi otkrio da ptičja sperma daje pozitivne rezultate kada se tanki sloj tekućine između pokrovnog stakalca i stakalca stvori trakom filter papira.reologija.Hino i Yanagimachi [19] stavili su mišji kompleks jajnik-tubar-maternica u perfuzijski prsten i ubrizgali 1 µl tinte u istmus kako bi vizualizirali protok tekućine u jajovodima.Primijetili su vrlo aktivno kretanje kontrakcije i opuštanja u jajovodu, pri čemu su se sve kuglice tinte ravnomjerno kretale prema ampuli jajovoda.Autori naglašavaju važnost protoka tekućine u jajovodima iz donjeg u gornji dio jajovoda za podizanje spermija i oplodnju.Brillard20 izvijestio je da u kokoši i purana spermatozoidi migriraju aktivnim kretanjem od vaginalnog ulaza, gdje su pohranjeni, do utero-vaginalnog spoja, gdje su pohranjeni.Međutim, to kretanje nije potrebno između uterovaginalnog spoja i infundibuluma jer se spermiji transportiraju pasivnim pomicanjem.Poznavajući ove prethodne preporuke i rezultate dobivene u trenutnoj studiji, može se pretpostaviti da je sposobnost spermija da se kreću uzvodno (reologija) jedno od svojstava na kojima se temelji proces odabira.To određuje prolaz spermija kroz vaginu i njihov ulazak u CCT radi skladištenja.Kao što je Forman4 predložio, ovo također može olakšati proces ulaska spermija u SST i njegovo stanište na određeno vrijeme, a zatim izaći kada njihova brzina počne usporavati.
S druge strane, Matsuzaki i Sasanami 21 sugerirali su da ptičji spermatozoidi prolaze kroz promjene pokretljivosti od stanja mirovanja do pokretljivosti u muškom i ženskom reproduktivnom traktu.Inhibicija rezidentne pokretljivosti spermija u SST-u predložena je kao objašnjenje dugog vremena skladištenja sperme i zatim pomlađivanja nakon napuštanja SST-a.U uvjetima hipoksije, Matsuzaki et al.1 izvijestio je o visokoj proizvodnji i otpuštanju laktata u SST, što može dovesti do inhibicije rezidentne pokretljivosti spermija.U ovom slučaju važnost reologije spermija ogleda se u selekciji i apsorpciji spermija, a ne u njihovom skladištenju.
Obrazac aglutinacije sperme smatra se vjerojatnim objašnjenjem za dugo razdoblje skladištenja sperme u SST-u, jer je to uobičajeni obrazac zadržavanja sperme u peradi2,22,23.Bakst i sur.2 primijetili su da je većina spermija prirasla jedna uz drugu, tvoreći fascikularne nakupine, a pojedinačni spermiji rijetko su pronađeni u CCM prepelice.S druge strane, Wen i sur.24 primijetili su više raspršenih spermija i manje čuperaka spermija u lumenu SST kod pilića.Na temelju ovih opažanja može se pretpostaviti da se sklonost aglutinaciji spermija razlikuje između ptica i između spermija u istom ejakulatu.Osim toga, Van Krey et al.9 sugerira da je nasumična disocijacija aglutiniranih spermija odgovorna za postupno prodiranje spermija u lumen jajovoda.Prema ovoj hipotezi, spermatozoidi s nižim aglutinacijskim kapacitetom trebaju se prvo izbaciti iz SST.U tom kontekstu, sposobnost aglutinacije spermija može biti čimbenik koji utječe na ishod kompeticije spermija u prljavih ptica.Osim toga, što dulje aglutinirani spermij disocira, dulje se održava plodnost.
Iako je agregacija spermija i agregacija u snopove opažena u nekoliko studija2,22,24, nisu detaljno opisani zbog složenosti njihovog kinematičkog promatranja unutar SST.Učinjeno je nekoliko pokušaja proučavanja aglutinacije spermija in vitro.Opsežna, ali prolazna agregacija uočena je kada je tanka žica uklonjena s viseće kapi sjemena.To dovodi do činjenice da izduženi mjehurić strši iz kapi, oponašajući sjemenu žlijezdu.Zbog 3D ograničenja i kratkog vremena sušenja kapanjem, cijeli je blok brzo propao9.U trenutnoj studiji, koristeći Sharkashi piliće i mikrofluidne čipove, uspjeli smo opisati kako se ti pramenovi formiraju i kako se kreću.Snopovi sperme formirani su odmah nakon prikupljanja sjemena i utvrđeno je da se kreću u spirali, pokazujući pozitivnu reologiju kada su prisutni u protoku.Nadalje, kada se makroskopski promatraju, uočeno je da snopovi spermija povećavaju linearnost pokretljivosti u usporedbi s izoliranim spermatozoidima.Ovo sugerira da se aglutinacija spermija može dogoditi prije penetracije SST-a i da proizvodnja spermija nije ograničena na malo područje zbog stresa kao što je prethodno predloženo (Tingari i Lake12).Tijekom formiranja čuperka spermiji sinkronizirano plivaju dok se ne spoje, zatim im se repovi omotaju jedan oko drugoga i glavica spermija ostaje slobodna, ali se rep i distalni dio spermija spajaju ljepljivom tvari.Stoga je slobodna glava ligamenta odgovorna za kretanje, povlačeći ostatak ligamenta.Skenirajuća elektronska mikroskopija snopova spermija pokazala je pričvršćene glave spermija prekrivene puno ljepljivog materijala, što sugerira da su glave spermija bile pričvršćene u snopove u mirovanju, što se moglo dogoditi nakon što su stigli do mjesta skladištenja (SST).
Kada se razmaz sperme oboji akridin narančastom, izvanstanični ljepljivi materijal oko spermija može se vidjeti pod fluorescentnim mikroskopom.Ova tvar omogućuje snopovima spermija da se prilijepe za sve okolne površine ili čestice tako da ne lebde s okolnim strujanjem.Dakle, naša opažanja pokazuju ulogu adhezije spermija u obliku pokretnih snopova.Njihova sposobnost da plivaju protiv struje i drže se obližnjih površina omogućuju spermijima da ostanu duže u SST.
Rothschild25 koristio je hemocitometrijsku kameru za proučavanje plutajuće raspodjele goveđeg sjemena u kapi suspenzije, snimajući mikrofotografije kroz kameru s vertikalnom i horizontalnom optičkom osi mikroskopa.Rezultati su pokazali da su spermatozoidi privučeni površinom komore.Autori sugeriraju da bi mogla postojati hidrodinamička interakcija između spermija i površine.Uzimajući ovo u obzir, zajedno sa sposobnošću sjemena pilića Sharkashi da formira ljepljive pramenove, može se povećati vjerojatnost da će sjeme prianjati na SST stijenku i biti pohranjeno na dulje vrijeme.
Bccetti i Afzeliu26 izvijestili su da je glikokaliks sperme potreban za prepoznavanje i aglutinaciju gameta.Forman10 primijetio je da je hidroliza α-glikozidnih veza u glikoprotein-glikolipidnim oblogama tretiranjem ptičjeg sjemena neuraminidazom rezultirala smanjenom plodnošću bez utjecaja na pokretljivost spermija.Autori sugeriraju da učinak neuraminidaze na glikokaliks smanjuje sekvestraciju sperme na utero-vaginalnom spoju, čime se smanjuje plodnost.Njihova opažanja ne mogu zanemariti mogućnost da liječenje neuraminidazom može smanjiti prepoznavanje spermija i jajnih stanica.Forman i Engel10 otkrili su da je plodnost smanjena kada su kokoši intravaginalno osjemenjene sjemenom tretiranim neuraminidazom.Međutim, IVF sa spermom tretiranom neuraminidazom nije utjecao na plodnost u usporedbi s kontrolnim pilićima.Autori su zaključili da promjene u glikoprotein-glikolipidnom omotaču oko membrane spermija smanjuju sposobnost spermija za oplodnju ometanjem sekvestracije spermija na utero-vaginalnom spoju, što zauzvrat povećava gubitak spermija zbog brzine utero-vaginalnog spoja, ali ne utječe na prepoznavanje spermija i jajne stanice.
Kod purana Bakst i Bauchan 11 pronašli su male vezikule i fragmente membrane u lumenu SST-a i primijetili da su se neke od tih granula stopile s membranom spermija.Autori sugeriraju da ti odnosi mogu pridonijeti dugoročnom skladištenju spermija u SST.Međutim, istraživači nisu precizirali izvor tih čestica, izlučuju li ih CCT epitelne stanice, proizvode li ih i izlučuje muški reproduktivni sustav ili proizvode sami spermiji.Također, ove čestice su odgovorne za aglutinaciju.Grützner i suradnici27 izvijestili su da epididimalne epitelne stanice proizvode i izlučuju specifičan protein koji je potreban za formiranje jednoporanih sjemenih kanala.Autori također navode da disperzija ovih snopova ovisi o interakciji epididimalnih proteina.Nixon i suradnici28 otkrili su da adneksi izlučuju protein, kiseli osteonektin bogat cisteinom;SPARC je uključen u stvaranje čuperaka sperme kod kratkokljunih ehidni i kljunaša.Raspršenje ovih zraka povezano je s gubitkom ovog proteina.
U trenutnoj studiji, ultrastrukturna analiza pomoću elektronske mikroskopije pokazala je da su spermiji prionuli na veliku količinu gustog materijala.Smatra se da su te tvari odgovorne za aglutinaciju koja se kondenzira između i oko prianjajućih glava, ali u nižim koncentracijama u području repa.Pretpostavljamo da se ova aglutinirajuća tvar izlučuje iz muškog reproduktivnog sustava (epididimisa ili sjemenovoda) zajedno sa sjemenom, budući da često opažamo odvajanje sjemena od limfe i sjemene plazme tijekom ejakulacije.Zabilježeno je da, dok ptičji spermiji prolaze kroz epididimis i sjemenovod, prolaze kroz promjene povezane sa sazrijevanjem koje podržavaju njihovu sposobnost vezanja proteina i stjecanja glikoproteina povezanih s lemom plazme.Postojanost ovih proteina na rezidentnim membranama spermija u SST sugerira da ti proteini mogu utjecati na stjecanje stabilnosti membrane spermija 30 i odrediti njihovu plodnost 31 .Ahammad i suradnici32 izvijestili su da su spermatozoidi dobiveni iz različitih dijelova muškog reproduktivnog sustava (od testisa do distalnog sjemenovoda) pokazali progresivno povećanje održivosti u uvjetima skladištenja u tekućini, bez obzira na temperaturu skladištenja, a održivost kod pilića također se povećava u jajovodima nakon umjetne oplodnje.
Čuperci sperme kokoši Sharkashi imaju različite karakteristike i funkcije od ostalih vrsta kao što su ehidne, kljunari, šumski miševi, jelenji štakori i zamorci.Kod sharkasi pilića, stvaranje snopova spermija smanjilo je njihovu brzinu plivanja u usporedbi s pojedinačnim spermatozoidima.Međutim, ti su snopovi povećali postotak reološki pozitivnih spermija i povećali sposobnost spermija da se stabiliziraju u dinamičnom okruženju.Stoga naši rezultati potvrđuju prethodnu sugestiju da je aglutinacija spermija u SST povezana s dugotrajnim skladištenjem sperme.Također pretpostavljamo da sklonost spermija stvaranju čuperaka može kontrolirati brzinu gubitka spermija u SST, što može promijeniti ishod nadmetanja spermija.Prema ovoj pretpostavci, spermiji s niskom sposobnošću aglutinacije prvi oslobađaju SST, dok spermiji s visokom sposobnošću aglutinacije daju većinu potomaka.Stvaranje snopova spermija s jednom porom je korisno i utječe na omjer roditelj-dijete, ali koristi drugačiji mehanizam.Kod ehidni i kljunara, spermatozoidi su raspoređeni paralelno jedan s drugim kako bi se povećala brzina snopa naprijed.Snopovi ehidni kreću se oko tri puta brže od pojedinačnih spermija.Vjeruje se da je stvaranje takvih čuperaka sperme kod ehidna evolucijska prilagodba za održavanje dominacije, budući da su ženke promiskuitetne i obično se pare s nekoliko mužjaka.Stoga se spermatozoidi iz različitih ejakulata žestoko natječu za oplodnju jajašca.
Aglutinirani spermatozoidi šarkasi pilića lako se vizualiziraju korištenjem fazno kontrastne mikroskopije, što se smatra prednošću jer omogućuje jednostavno proučavanje ponašanja spermija in vitro.Mehanizam kojim formiranje čuperka sperme potiče reprodukciju kod šarkasi kokoši također se razlikuje od onog koji se vidi kod nekih placentnih sisavaca koji predstavljaju kooperativno ponašanje sperme kao što su šumski miševi, gdje neki spermatozoidi dopiru do jaja, pomažući drugim srodnim jedinkama da dopru i oštete njihova jajašca.dokazati se.altruistično ponašanje.Samooplodnja 34. Još jedan primjer kooperativnog ponašanja u spermatozoidima pronađen je kod jelenskih miševa, gdje su se spermiji mogli identificirati i kombinirati s genetski najsrodnijim spermatozoidima i formirati kooperativne grupe kako bi povećali svoju brzinu u usporedbi s nesrodnim spermatozoidima35.
Rezultati dobiveni ovom studijom nisu u suprotnosti s Fomanovom teorijom o dugotrajnom skladištenju spermija u SWS.Istraživači izvješćuju da se stanice sperme nastavljaju kretati u toku epitelnih stanica koje oblažu SST tijekom duljeg vremenskog razdoblja, a nakon određenog vremenskog razdoblja, zalihe energije u stanicama sperme su iscrpljene, što rezultira smanjenjem brzine, što omogućuje izbacivanje tvari male molekularne težine.energija spermija s protokom tekućine iz lumena SST Šupljina jajovoda.U trenutnoj studiji primijetili smo da polovica pojedinačnih spermija pokazuje sposobnost plivanja protiv tekućina koje teku, a njihovo prianjanje u snopu povećava njihovu sposobnost da pokažu pozitivnu reologiju.Nadalje, naši su podaci u skladu s podacima Matsuzakija i sur.1 koji je izvijestio da povećano lučenje laktata u SST može inhibirati rezidentnu pokretljivost spermija.Međutim, naši rezultati opisuju stvaranje pokretnih ligamenata spermija i njihovo reološko ponašanje u prisutnosti dinamičkog okruženja unutar mikrokanala u pokušaju da se razjasni njihovo ponašanje u SST.Buduća bi se istraživanja mogla usredotočiti na određivanje kemijskog sastava i podrijetla aglutinirajućeg agensa, što će nedvojbeno pomoći istraživačima da razviju nove načine za pohranjivanje tekućeg sjemena i produljenje trajanja plodnosti.
Petnaest 30 tjedana starih golovratih mužjaka sharkasi (homozigotni dominantni; Na Na) odabrani su kao donori sperme u studiji.Ptice su uzgajane na istraživačkoj farmi peradi Poljoprivrednog fakulteta Sveučilišta Ashit, guverner Ashit, Egipat.Ptice su smještene u pojedinačne kaveze (30 x 40 x 40 cm), podvrgnute programu osvjetljenja (16 sati svjetla i 8 sati tame) i hranjene hranom koja je sadržavala 160 g sirovih proteina, 2800 kcal metaboličke energije, 35 g kalcija svaka.5 grama dostupnog fosfora po kilogramu prehrane.
Prema podacima 36, ​​​​37, sjeme je prikupljeno od mužjaka masažom abdomena.Ukupno 45 uzoraka sjemena prikupljeno je od 15 muškaraca tijekom 3 dana.Sjeme (n = 15/dan) odmah je razrijeđeno 1:1 (v:v) s Belsville Poultry Diluentom za sjemenu peradi, koji sadrži kalijev difosfat (1,27 g), mononatrijev glutamat monohidrat (0,867 g), fruktozu (0,5 d) bezvodni natrij.acetat (0,43 g), tris(hidroksimetil)aminometan (0,195 g), kalijev citrat monohidrat (0,064 g), kalijev monofosfat (0,065 g), magnezijev klorid (0,034 g) i H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolarnost 333 mOsm/kg38.Razrijeđeni uzorci sjemena prvo su ispitani pod svjetlosnim mikroskopom kako bi se osigurala dobra kvaliteta sjemena (vlažnost), a zatim pohranjeni u vodenoj kupelji na 37°C do upotrebe unutar pola sata nakon prikupljanja.
Kinematika i reologija spermija opisana je pomoću sustava mikrofluidnih uređaja.Uzorci sjemena su dalje razrijeđeni do 1:40 u razrjeđivaču sjemena ptica Beltsville, stavljeni u mikrofluidički uređaj (vidi dolje), a kinetički parametri su određeni korištenjem sustava za kompjuteriziranu analizu sjemena (CASA) koji je prethodno razvijen za karakterizaciju mikrofluida.o pokretljivosti spermija u tekućim medijima (Odsjek za strojarstvo, Tehnički fakultet, Sveučilište Assiut, Egipat).Dodatak se može preuzeti na: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Mjerena je brzina krivulje (VCL, μm/s), linearna brzina (VSL, μm/s) i prosječna brzina putanje (VAP, μm/s).Videozapisi spermija snimljeni su pomoću mikroskopa s invertnim faznim kontrastom Optika XDS-3 (s objektivom od 40x) spojenog na kameru Tucson ISH1000 pri 30 fps tijekom 3 s.Koristite CASA softver za proučavanje najmanje tri područja i 500 putanja spermija po uzorku.Snimljeni video je obrađen CASA-om kućne izrade.Definicija pokretljivosti u dodatku CASA temelji se na brzini plivanja spermija u usporedbi s brzinom protoka i ne uključuje druge parametre kao što je kretanje s jedne na drugu stranu jer se pokazalo da je to pouzdanije u protoku tekućine.Reološko kretanje opisuje se kao kretanje spermija suprotno smjeru protoka tekućine.Spermiji s reološkim svojstvima podijeljeni su s brojem pokretnih spermija;spermatozoidi koji su bili u mirovanju i konvektivno pokretni spermiji isključeni su iz brojanja.
Sve korištene kemikalije nabavljene su od Elgomhoria Pharmaceuticals (Kairo, Egipat), osim ako nije drugačije navedeno.Uređaj je proizveden kako su opisali El-sherry et al.40 s nekim izmjenama.Materijali korišteni za izradu mikrokanala uključivali su staklene ploče (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negativni otpornik (MicroChem, Newton, CA), diaceton alkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Njemačka) i poliaceton.-184, Dow Corning, Midland, Michigan).Mikrokanali su proizvedeni mekom litografijom.Prvo je prozirna zaštitna maska ​​za lice sa željenim mikrokanalnim dizajnom otisnuta na pisaču visoke rezolucije (Prismatic, Cairo, Egypt and Pacific Arts and Design, Markham, ON).Majstori su izrađeni od staklenih ploča kao podloga.Ploče su očišćene u acetonu, izopropanolu i deioniziranoj vodi i zatim obložene sa 20 µm slojem SU8-25 centrifugiranjem (3000 okretaja u minuti, 1 min).Slojevi SU-8 su potom lagano osušeni (65°C, 2 min i 95°C, 10 min) i izloženi UV zračenju 50 s.Pecite nakon izlaganja na 65°C i 95°C 1 minutu i 4 minute za umrežavanje izloženih SU-8 slojeva, nakon čega slijedi razvijanje u diaceton alkoholu 6,5 minuta.Tvrdo ispecite vafle (200°C 15 minuta) kako biste dodatno učvrstili sloj SU-8.
PDMS je pripremljen miješanjem monomera i učvršćivača u težinskom omjeru 10:1, zatim otplinjen u vakuumskom eksikatoru i izliven na glavni okvir SU-8.PDMS je osušen u pećnici (120°C, 30 min), zatim su kanali izrezani, odvojeni od glavnog i perforirani kako bi se omogućilo pričvršćivanje cijevi na ulazu i izlazu mikrokanala.Konačno, PDMS mikrokanali su trajno pričvršćeni na mikroskopska stakalca pomoću prijenosnog korona procesora (Electro-Technic Products, Chicago, IL) kako je opisano drugdje.Mikrokanal korišten u ovoj studiji je dimenzija 200 µm × 20 µm (Š × V) i dugačak je 3,6 cm.
Protok tekućine induciran hidrostatskim tlakom unutar mikrokanala postiže se održavanjem razine tekućine u ulaznom rezervoaru iznad visinske razlike Δh39 u izlaznom rezervoaru (slika 1).
gdje je f koeficijent trenja, definiran kao f = C/Re za laminarno strujanje u pravokutnom kanalu, gdje je C konstanta koja ovisi o omjeru širine i visine kanala, L je duljina mikrokanala, Vav je prosječna brzina unutar mikrokanala, Dh je hidraulički promjer kanala, g – ubrzanje sile teže.Pomoću ove jednadžbe prosječna brzina kanala može se izračunati pomoću sljedeće jednadžbe: