Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Koristite verziju preglednika s ograničenom CSS podrškom. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažuriranu verziju preglednika (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). Osim toga, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, stranicu prikazujemo bez stilova i JavaScripta.
Nedavno je razvijena antimikrobna platforma bez kemikalija temeljena na nanotehnologiji korištenjem umjetnih vodenih nanostruktura (EWNS). EWNS imaju visoki površinski naboj i bogate su reaktivnim vrstama kisika (ROS) koje mogu stupiti u interakciju s nizom mikroorganizama i inaktivirati ih, uključujući patogene koji se prenose hranom. Ovdje je pokazano da se njihova svojstva tijekom sinteze mogu fino podesiti i optimizirati kako bi se dodatno poboljšao njihov antibakterijski potencijal. Laboratorijska platforma EWNS dizajnirana je za fino podešavanje svojstava EWNS-a promjenom parametara sinteze. Karakterizacija svojstava EWNS-a (naboj, veličina i sadržaj ROS-a) provedena je korištenjem modernih analitičkih metoda. Osim toga, mikroorganizmi u hrani poput Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum i Saccharomyces cerevisiae inokulirani su na površinu organskih rajčica kako bi se procijenio njihov potencijal mikrobne inaktivacije. Rezultati prikazani ovdje pokazuju da se svojstva EWNS-a mogu fino podesiti tijekom sinteze, što rezultira eksponencijalnim povećanjem učinkovitosti inaktivacije. Posebno se površinski naboj povećao za faktor četiri, a sadržaj ROS-a se povećao. Brzina uklanjanja mikroba bila je ovisna o mikrobima i kretala se od 1,0 do 3,8 log nakon 45 minuta izloženosti dozi aerosola od 40 000 #/cm3 EWNS.
Mikrobna kontaminacija glavni je uzrok bolesti koje se prenose hranom uzrokovanih unosom patogena ili njihovih toksina. Bolesti koje se prenose hranom uzrokuju oko 76 milijuna bolesti, 325 000 hospitalizacija i 5000 smrtnih slučajeva svake godine samo u Sjedinjenim Državama1. Osim toga, Ministarstvo poljoprivrede Sjedinjenih Država (USDA) procjenjuje da je povećana konzumacija svježih proizvoda odgovorna za 48 posto svih bolesti koje se prenose hranom prijavljenih u Sjedinjenim Državama2. Troškovi bolesti i smrti od patogena koji se prenose hranom u Sjedinjenim Državama vrlo su visoki, a Centri za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC) procjenjuju ih na više od 15,6 milijardi američkih dolara godišnje3.
Trenutačno se kemijske4, radijacijske5 i termalne6 antimikrobne intervencije radi osiguranja sigurnosti hrane uglavnom provode na ograničenim kritičnim kontrolnim točkama (KKT) u proizvodnom lancu (obično nakon berbe i/ili tijekom pakiranja), umjesto da se kontinuirano provode na način da svježi proizvodi budu podložni unakrsnoj kontaminaciji7. Antimikrobne intervencije potrebne su za bolju kontrolu bolesti koje se prenose hranom i kvarenja hrane te imaju potencijal za primjenu u cijelom kontinuumu od farme do stola. Manji utjecaj i troškovi.
Nedavno je razvijena nanotehnološka antimikrobna platforma bez kemikalija za inaktivaciju bakterija na površinama i u zraku korištenjem umjetnih vodenih nanostruktura (EWNS). Za sintezu EVNS-a korištena su dva paralelna procesa: elektrosprej i ionizacija vode (slika 1a). Prethodno je pokazano da EWNS imaju jedinstven skup fizičkih i bioloških svojstava8,9,10. EWNS ima prosječno 10 elektrona po strukturi i prosječnu nanometarsku veličinu od 25 nm (slika 1b,c)8,9,10. Osim toga, elektronska spinska rezonancija (ESR) pokazala je da EWNS sadrže veliku količinu reaktivnih kisikovih vrsta (ROS), uglavnom hidroksilne (OH•) i superoksidne (O2-) radikale (slika 1c)8. EWNS su dugo ostajali u zraku i mogli bi se sudarati s mikrobima suspendiranim u zraku i prisutnima na površinama, isporučujući svoj ROS teret i uzrokujući inaktivaciju mikroba (slika 1d). Te ranije studije također su pokazale da EWNS može stupiti u interakciju s raznim gram-negativnim i gram-pozitivnim bakterijama od javnog značaja, uključujući mikobakterije, na površinama i u zraku i inaktivirati ih. Transmisijska elektronska mikroskopija pokazala je da je inaktivacija uzrokovana poremećajem stanične membrane. Osim toga, studije akutne inhalacije pokazale su da visoke doze EWNS-a ne uzrokuju oštećenje pluća ili upalu8.
(a) Elektroraspršivanje nastaje kada se visoki napon primijeni između kapilare koja sadrži tekućinu i protuelektrode. (b) Primjena visokog napona rezultira dvama različitim fenomenima: (i) elektroraspršivanjem vode i (ii) stvaranjem reaktivnih vrsta kisika (iona) zarobljenih u EWNS-u. (c) Jedinstvena struktura EWNS-a. (d) EWNS su vrlo mobilni zbog svoje nanoskalne prirode i mogu stupiti u interakciju s patogenima u zraku.
Nedavno je dokazana i sposobnost EWNS antimikrobne platforme da inaktivira mikroorganizme koji se prenose hranom na površini svježe hrane. Također je pokazano da se površinski naboj EWNS-a može koristiti u kombinaciji s električnim poljem za ciljanu dostavu. Što je još važnije, obećavajući početni rezultat od približno 1,4 log smanjenja aktivnosti organske rajčice protiv raznih mikroorganizama u hrani poput E. coli i Listeria uočen je unutar 90 minuta izlaganja EWNS-u pri koncentraciji od približno 50 000#/cm311. Osim toga, preliminarni organoleptički testovi nisu pokazali organoleptički učinak u usporedbi s kontrolnom rajčicom. Iako ovi početni rezultati inaktivacije obećavaju sigurnost hrane čak i pri vrlo niskim dozama EWNS-a od 50 000#/cm3, jasno je da bi veći potencijal inaktivacije bio korisniji za daljnje smanjenje rizika od infekcije i kvarenja.
Ovdje ćemo se usredotočiti na istraživanje razvoja platforme za generiranje EWNS-a kako bismo fino podesili parametre sinteze i optimizirali fizikalno-kemijska svojstva EWNS-a radi poboljšanja njihovog antibakterijskog potencijala. Optimizacija se posebno usredotočila na povećanje njihovog površinskog naboja (za poboljšanje ciljane isporuke) i sadržaja ROS-a (za poboljšanje učinkovitosti inaktivacije). Karakterizacija optimiziranih fizikalno-kemijskih svojstava (veličina, naboj i sadržaj ROS-a) korištenjem modernih analitičkih metoda i korištenjem uobičajenih mikroorganizama u hrani kao što su E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae i M. parafortuitum.
EVNS je sintetiziran istovremenim elektroraspršivanjem i ionizacijom vode visoke čistoće (18 MΩ cm–1). Električni atomizer 12 obično se koristi za atomizaciju tekućina i sintetičkih polimernih i keramičkih čestica 13 te vlakana 14 kontrolirane veličine.
Kao što je detaljno opisano u prethodnim publikacijama 8, 9, 10, 11, u tipičnom eksperimentu, visoki napon se primjenjuje između metalne kapilare i uzemljene protuelektrode. Tijekom ovog procesa događaju se dva različita fenomena: 1) elektroraspršivanje i 2) ionizacija vode. Jako električno polje između dvije elektrode uzrokuje nakupljanje negativnih naboja na površini kondenzirane vode, što rezultira stvaranjem Taylorovih konusa. Kao rezultat toga, nastaju visoko nabijene kapljice vode, koje se nastavljaju raspadati na manje čestice, prema Rayleighovoj teoriji16. Istovremeno, jako električno polje uzrokuje cijepanje i otpuštanje elektrona nekih molekula vode (ionizacija), čime se stvara velika količina reaktivnih vrsta kisika (ROS)17. Istovremeno generirani ROS18 paketi enkapsulirani su u EWNS (slika 1c).
Na sl. 2a prikazan je sustav za generiranje EWNS-a razvijen i korišten u sintezi EWNS-a u ovoj studiji. Pročišćena voda pohranjena u zatvorenoj boci dovodila se kroz teflonsku cijev (unutarnjeg promjera 2 mm) u iglu od nehrđajućeg čelika 30G (metalna kapilara). Kao što je prikazano na slici 2b, protok vode kontrolira se tlakom zraka unutar boce. Igla je pričvršćena na teflonsku konzolu koja se može ručno podesiti na određenu udaljenost od protuelektrode. Protuelektroda je polirani aluminijski disk s rupom u sredini za uzorkovanje. Ispod protuelektrode nalazi se aluminijski lijevak za uzorkovanje, koji je spojen s ostatkom eksperimentalnog uređaja putem otvora za uzorkovanje (slika 2b). Sve komponente uzorkivača električno su uzemljene kako bi se izbjeglo nakupljanje naboja koje bi moglo degradirati uzorkovanje čestica.
(a) Sustav za generiranje inženjerskih nanostruktura vode (EWNS). (b) Presjek uzorkivača i elektroraspršivača s najvažnijim parametrima. (c) Eksperimentalni postav za inaktivaciju bakterija.
Gore opisani sustav za generiranje EWNS-a sposoban je mijenjati ključne radne parametre kako bi se olakšalo fino podešavanje EWNS svojstava. Podesite primijenjeni napon (V), udaljenost između igle i protuelektrode (L) te protok vode (φ) kroz kapilaru kako biste fino podesili EWNS karakteristike. Simboli [V (kV), L (cm)] koriste se za označavanje različitih kombinacija. Podesite protok vode kako biste dobili stabilan Taylorov konus određenog skupa [V, L]. Za potrebe ove studije, otvor protuelektrode (D) postavljen je na 0,5 inča (1,29 cm).
Zbog ograničene geometrije i asimetrije, jakost električnog polja ne može se izračunati iz prvih principa. Umjesto toga, za izračun električnog polja korišten je softver QuickField™ (Svendborg, Danska). Električno polje nije uniformno, pa je vrijednost električnog polja na vrhu kapilare korištena kao referentna vrijednost za različite konfiguracije.
Tijekom studije, nekoliko kombinacija napona i udaljenosti između igle i protuelektrode procijenjeno je u smislu formiranja Taylorovog konusa, stabilnosti Taylorovog konusa, stabilnosti proizvodnje EWNS-a i ponovljivosti. Različite kombinacije prikazane su u Dodatnoj tablici S1.
Izlaz sustava za generiranje EWNS-a bio je izravno spojen na Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS, model 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) za mjerenje koncentracije broja čestica i korišten je s Faradayevim aerosolnim elektrometrom (TSI, model 3068B, Shoreview, SAD). MN) za mjerenje protoka aerosola, kako je opisano u našoj prethodnoj publikaciji9. I SMPS i aerosolni elektrometar uzorkovali su pri brzini protoka od 0,5 L/min (ukupni protok uzorka 1 L/min). Koncentracije čestica i protoci aerosola mjereni su 120 s. Mjerenje ponovite 30 puta. Ukupni naboj aerosola izračunava se iz trenutnih mjerenja, a prosječni EWNS naboj procjenjuje se iz ukupnog broja uzorkovanih EWNS čestica. Prosječni trošak EWNS-a može se izračunati pomoću jednadžbe (1):
gdje je IEl izmjerena struja, NSMPS je brojčana koncentracija izmjerena SMPS-om, a φEl je brzina protoka do elektrometra.
Budući da relativna vlažnost (RH) utječe na površinski naboj, temperatura i (RH) su tijekom eksperimenta održavane konstantnima na 21 °C odnosno 45%.
Za mjerenje veličine i životnog vijeka EWNS-a korišteni su mikroskopija atomskih sila (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, Kalifornija) i AC260T sonda (Olympus, Tokio, Japan). Brzina skeniranja AFM-a je 1 Hz, a područje skeniranja je 5 µm × 5 µm s 256 linija skeniranja. Sve slike su podvrgnute poravnanju slike prvog reda pomoću Asylum softvera (maska ​​s rasponom od 100 nm i pragom od 100 pm).
Uklonite lijevak za uzorkovanje i postavite površinu tinjca na udaljenost od 2,0 cm od protuelektrode tijekom prosječnog vremena od 120 s kako biste izbjegli koalescenciju čestica i stvaranje nepravilnih kapljica na površini tinjca. EWNS je nanesen izravno na svježe izrezane površine tinjca (Ted Pella, Redding, CA). Odmah nakon raspršivanja, površina tinjca je vizualizirana pomoću AFM-a. Površinski kontaktni kut svježe izrezanog nemodificiranog tinjca je blizu 0°, pa se EWNS širi preko površine tinjca u obliku kupole20. Promjer (a) i visina (h) difuznih kapljica izmjereni su izravno iz AFM topografije i korišteni za izračun kupolastog difuzijskog volumena EWNS pomoću naše prethodno validirane metode8. Pod pretpostavkom da ugrađeni EVNS ima isti volumen, ekvivalentni promjer može se izračunati iz jednadžbe (2):
U skladu s našom prethodno razvijenom metodom, korištena je spinska zamka elektronske spinske rezonancije (ESR) za detekciju prisutnosti kratkotrajnih radikalnih međuprodukata u EWNS-u. Aerosoli su propušteni kroz otopinu koja sadrži 235 mM DEPMPO (5-(dietoksifosforil)-5-metil-1-pirolin-N-oksid) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Sva EPR mjerenja provedena su pomoću Bruker EMX spektrometra (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, SAD) i nizova ravnih ćelija. Za prikupljanje i analizu podataka korišten je Acquisit softver (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, SAD). Karakterizacija ROS-a provedena je samo za skup radnih uvjeta [-6,5 kV, 4,0 cm]. Koncentracije EWNS-a mjerene su pomoću SMPS-a nakon što se uzeo u obzir gubitak EWNS-a u impaktoru.
Razina ozona praćena je pomoću 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Colorado)8,9,10.
Za sva EWNS svojstva, izmjerena vrijednost je srednja vrijednost mjerenja, a pogreška mjerenja je standardna devijacija. Proveden je t-test za usporedbu vrijednosti optimiziranog EWNS atributa s odgovarajućom vrijednošću osnovnog EWNS-a.
Slika 2c prikazuje prethodno razvijen i karakteriziran sustav za prolaz elektrostatskog taloženja (EPES) koji se može koristiti za ciljanje EWNS11 na površine. EPES koristi EWNS naboj u kombinaciji s jakim električnim poljem kako bi ga izravno "usmjerio" na površinu mete. Pojedinosti o EPES sustavu prikazane su u nedavnoj publikaciji Pyrgiotakisa i suradnika.11. Dakle, EPES se sastoji od 3D printane PVC komore sa suženim krajevima koja sadrži dvije paralelne metalne ploče od nehrđajućeg čelika (nehrđajući čelik 304, poliran zrcalno) u sredini udaljene 15,24 cm. Ploče su bile spojene na vanjski izvor visokog napona (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), donja ploča je uvijek bila pozitivna, a gornja ploča uvijek uzemljena (plutajuća). Stijenke komore prekrivene su aluminijskom folijom, koja je električno uzemljena kako bi se spriječio gubitak čestica. Komora ima zatvorena prednja vrata za utovar koja omogućuju postavljanje ispitnih površina na plastične stalke, podižući ih s donje metalne ploče kako bi se izbjegle smetnje visokog napona.
Učinkovitost taloženja EWNS-a u EPES-u izračunata je prema prethodno razvijenom protokolu detaljno opisanom u Dodatnoj slici S111.
Kao kontrolna komora, drugi protok kroz cilindričnu komoru spojen je serijski s EPES sustavom pomoću među-HEPA filtera za uklanjanje EWNS-a. Kao što je prikazano na slici 2c, EWNS aerosol je pumpan kroz dvije komore spojene serijski. Filter između kontrolne sobe i EPES-a uklanja sve preostale EWNS-e što rezultira istom temperaturom (T), relativnom vlagom (RH) i razinama ozona.
Utvrđeno je da važni mikroorganizmi koji se prenose hranom kontaminiraju svježe proizvode, kao što su Escherichia coli (ATCC #27325), fekalni indikator, Salmonella enterica (ATCC #53647), patogen koji se prenosi hranom, Listeria innocua (ATCC #33090), alternativa patogenoj Listeria monocytogenes, Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) kao alternativa kvascu koji uzrokuje kvarenje, i Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) kao otpornije žive bakterije kupljene su od ATCC-a (Manassas, Virginia).
Nasumično kupite kutije organskih rajčica s lokalne tržnice i stavite ih u hladnjak na 4°C do upotrebe (do 3 dana). Odaberite rajčice za eksperimentiranje jedne veličine, promjera oko 1,2 cm.
Protokoli za inkubaciju, inokulaciju, izlaganje i brojanje kolonija detaljno su opisani u našim prethodnim publikacijama i detaljno objašnjeni u Dodatnim podacima 11. Učinkovitost EWNS-a procijenjena je izlaganjem inokuliranih rajčica koncentraciji od 40 000 #/cm3 tijekom 45 minuta. Ukratko, u vremenu t = 0 min, tri rajčice korištene su za procjenu preživjelih mikroorganizama. Tri rajčice stavljene su u EPES i izložene EWNS-u pri 40 000 #/cc (rajčice izložene EWNS-u), a tri druge stavljene su u kontrolnu komoru (kontrolne rajčice). Nijedna skupina rajčica nije podvrgnuta dodatnoj obradi. Rajčice izložene EWNS-u i kontrolne skupine uklonjene su nakon 45 minuta kako bi se procijenio učinak EWNS-a.
Svaki je eksperiment proveden u tri ponavljanja. Analiza podataka provedena je prema protokolu opisanom u Dodatnim podacima.
Uzorci bakterija E. coli, Enterobacter i L. innocua izloženi EWNS-u (45 min, koncentracija EWNS aerosola 40 000 #/cm3) i neizloženi su taloženi kako bi se procijenili mehanizmi inaktivacije. Talog je fiksiran 2 sata na sobnoj temperaturi u 0,1 M otopini natrijevog kakodilata (pH 7,4) s fiksativom od 2,5% glutaraldehida, 1,25% paraformaldehida i 0,03% pikrinske kiseline. Nakon ispiranja, fiksirani su s 1% osmijevog tetroksida (OsO4)/1,5% kalijevog ferocijanida (KFeCN6) tijekom 2 sata, isprani 3 puta vodom i inkubirani u 1% uranil acetatu tijekom 1 sata, zatim isprani dva puta vodom. Naknadna dehidracija od 10 minuta s 50%, 70%, 90%, 100% alkoholom. Uzorci su zatim stavljeni u propilen oksid na 1 sat i impregnirani smjesom propilen oksida i TAAP Epona u omjeru 1:1 (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Uzorci su ugrađeni u TAAB Epon i polimerizirani na 60°C tijekom 48 sati. Očvrsnuta granulirana smola je izrezana i vizualizirana TEM-om pomoću JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japan), konvencionalnog transmisijskog elektronskog mikroskopa opremljenog AMT 2k CCD kamerom (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, SAD).
Svi eksperimenti provedeni su u tri ponavljanja. Za svaku vremensku točku, bakterijski ispirci su nasađeni u tri ponavljanja, što je rezultiralo ukupno devet podatkovnih točaka po točki, čiji je prosjek korišten kao bakterijska koncentracija za taj određeni organizam. Standardna devijacija korištena je kao pogreška mjerenja. Sve točke se računaju.
Logaritam smanjenja koncentracije bakterija u usporedbi s t = 0 min izračunat je pomoću sljedeće formule:
gdje je C0 koncentracija bakterija u kontrolnom uzorku u vremenu 0 (tj. nakon što se površina osušila, ali prije stavljanja u komoru), a Cn je koncentracija bakterija na površini nakon n minuta izlaganja.
Kako bi se uzelo u obzir prirodno razgrađivanje bakterija tijekom razdoblja izlaganja od 45 minuta, izračunata je i logaritamska redukcija u usporedbi s kontrolom nakon 45 minuta na sljedeći način:
Gdje je Cn koncentracija bakterija u kontrolnom uzorku u vremenu n, a Cn-Control je koncentracija kontrolnih bakterija u vremenu n. Podaci su prikazani kao logaritam smanjenja u usporedbi s kontrolom (bez izloženosti EWNS-u).
Tijekom studije, nekoliko kombinacija napona i udaljenosti između igle i protuelektrode procijenjeno je u smislu formiranja Taylorovog konusa, stabilnosti Taylorovog konusa, stabilnosti proizvodnje EWNS-a i ponovljivosti. Različite kombinacije prikazane su u Dodatnoj tablici S1. Odabrana su dva slučaja za potpunu studiju koja pokazuje stabilna i ponovljiva svojstva (Taylorov konus, proizvodnja EWNS-a i stabilnost tijekom vremena). Na slici 3 prikazani su rezultati o naboju, veličini i sadržaju ROS-a za dva slučaja. Rezultati su također sažeti u Tablici 1. Za referencu, Slika 3 i Tablica 1 uključuju svojstva prethodno sintetiziranog neoptimiziranog EWNS-a8, 9, 10, 11 (osnovni EWNS). Izračuni statističke značajnosti korištenjem dvostranog t-testa ponovno su objavljeni u Dodatnoj tablici S2. Osim toga, dodatni podaci uključuju studije o utjecaju promjera otvora za uzorkovanje protuelektrode (D) i udaljenosti između uzemljene elektrode i vrha igle (L) (Dodatne slike S2 ​​i S3).
(a–c) Raspodjela veličine AFM-a. (d–f) Karakteristika površinskog naboja. (g) Karakterizacija ROS-a i ESR-a.
Također je važno napomenuti da su za sve gore navedene uvjete izmjerene ionizacijske struje bile u rasponu od 2-6 µA, a naponi u rasponu od -3,8 do -6,5 kV, što je rezultiralo potrošnjom energije za ovaj jedno-terminalni EWNS modul za generiranje manjom od 50 mW. Iako je EWNS sintetiziran pod visokim tlakom, razine ozona bile su vrlo niske, nikada ne prelazeći 60 ppb.
Dodatna slika S4 prikazuje simulirana električna polja za scenarije [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm]. Polja prema scenarijima [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm] izračunata su kao 2 × 10⁶ V/m odnosno 4,7 × 10⁶ V/m. To je i očekivano, budući da je omjer napona i udaljenosti mnogo veći u drugom slučaju.
Na sl. 3a i b prikazan je promjer EWNS-a izmjeren AFM8. Prosječni promjeri EWNS-a za scenarije [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm] izračunati su kao 27 nm odnosno 19 nm. Geometrijske standardne devijacije distribucija za slučajeve [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm] iznose 1,41 odnosno 1,45, što ukazuje na usku distribuciju veličine. I srednja veličina i geometrijska standardna devijacija vrlo su blizu osnovnom EWNS-u, a iznose 25 nm odnosno 1,41. Na sl. 3c prikazana je distribucija veličine osnovnog EWNS-a izmjerena istom metodom pod istim uvjetima.
Na sl. 3d,e prikazani su rezultati karakterizacije naboja. Podaci su prosječna mjerenja 30 istovremenih mjerenja koncentracije (#/cm3) i struje (I). Analiza pokazuje da je prosječni naboj na EWNS-u 22 ± 6 e- i 44 ± 6 e- za [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm]. U usporedbi s Baseline-EWNS-om (10 ± 2 e-), njihov površinski naboj je značajno veći, dvostruko veći od scenarija [-6,5 kV, 4,0 cm] i četiri puta veći od scenarija [-3,8 kV, 0,5 cm]. 3f prikazuje osnovne podatke o plaćanju EWNS-a.
Iz EWNS karata koncentracije broja čestica (Dodatne slike S5 i S6) može se vidjeti da scena [-6,5 kV, 4,0 cm] ima značajno veći broj čestica od scene [-3,8 kV, 0,5 cm]. Također treba napomenuti da su EWNS koncentracije broja čestica praćene do 4 sata (Dodatne slike S5 i S6), gdje je stabilnost EWNS generacije pokazala iste razine koncentracije broja čestica u oba slučaja.
Slika 3g prikazuje EPR spektar nakon oduzimanja kontrole (pozadine) za optimizirani EWNS na [-6,5 kV, 4,0 cm]. ROS spektar je također uspoređen s osnovnim EWNS-om u prethodno objavljenom radu. Izračunati broj EWNS-a koji reagiraju sa spinskom zamkom je 7,5 × 10⁴ EWNS/s, što je slično prethodno objavljenom Baseline-EWNS8. EPR spektri jasno su ukazivali na prisutnost dvije vrste ROS-a, gdje je O2- prevladavao, dok je OH• bio prisutan u manjoj količini. Osim toga, izravna usporedba intenziteta vrhova pokazala je da optimizirani EWNS ima značajno veći sadržaj ROS-a u usporedbi s osnovnim EWNS-om.
Na sl. 4 prikazana je učinkovitost taloženja EWNS-a u EPES-u. Podaci su također sažeti u Tablici I i uspoređeni s originalnim EWNS podacima. Za oba EUNS slučaja, taloženje je bilo blizu 100% čak i pri niskom naponu od 3,0 kV. Tipično, 3,0 kV je dovoljno za postizanje 100% taloženja bez obzira na promjenu površinskog naboja. Pod istim uvjetima, učinkovitost taloženja Baseline-EWNS-a bila je samo 56% zbog nižeg naboja (prosječno 10 elektrona po EWNS-u).
Slika 5 i Tablica 2 sažimaju stupanj inaktivacije mikroorganizama inokuliranih na površini rajčice nakon izlaganja približno 40 000 #/cm3 EWNS-a tijekom 45 minuta pod optimalnim scenarijem [-6,5 kV, 4,0 cm]. Inokulirane E. coli i L. innocua pokazale su značajno smanjenje od 3,8 log nakon 45 minuta izlaganja. Pod istim uvjetima, S. enterica pokazala je niže log smanjenje od 2,2 log, dok su S. cerevisiae i M. parafortuitum pokazali smanjenje od 1,0 log.
Elektronske mikrografije (Slika 6) prikazuju fizičke promjene izazvane EWNS-om u stanicama E. coli, Salmonella enterica i L. innocua što dovodi do inaktivacije. Kontrolne bakterije pokazale su netaknute stanične membrane, dok su izložene bakterije imale oštećene vanjske membrane.
Elektronsko-mikroskopsko snimanje kontrolnih i izloženih bakterija otkrilo je oštećenje membrane.
Podaci o fizikalno-kemijskim svojstvima optimiziranog EWNS-a zajedno pokazuju da su svojstva EWNS-a (površinski naboj i sadržaj ROS-a) značajno poboljšana u usporedbi s prethodno objavljenim osnovnim podacima EWNS-a8,9,10,11. S druge strane, njihova veličina ostala je u nanometarskom rasponu, što je vrlo slično prethodno objavljenim rezultatima, što im omogućuje da ostanu u zraku dulje vrijeme. Opažena polidisperznost može se objasniti promjenama površinskog naboja, koje određuju veličinu Rayleighovog efekta, slučajnosti i potencijalnog spajanja EWNS-a. Međutim, kako su detaljno opisali Nielsen i suradnici22, visoki površinski naboj smanjuje isparavanje učinkovitim povećanjem površinske energije/napona kapljice vode. Ova teorija je eksperimentalno potvrđena za mikrokapljice22 i EWNS u našoj prethodnoj publikaciji8. Gubitak vremena također može utjecati na veličinu i doprinijeti opaženoj raspodjeli veličine.
Osim toga, naboj po strukturi iznosi oko 22–44 e-, ovisno o okolnostima, što je znatno više u usporedbi s osnovnim EWNS-om, koji ima prosječni naboj od 10 ± 2 elektrona po strukturi. Međutim, treba napomenuti da je to prosječni naboj EWNS-a. Seto i sur. Pokazalo se da naboj nije jednolik i slijedi logaritamsko-normalnu distribuciju21. U usporedbi s našim prethodnim radom, udvostručenje površinskog naboja udvostručuje učinkovitost taloženja u EPES sustavu na gotovo 100%11.