Hvala što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili isključite način rada kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali stalnu podršku, prikazat ćemo web mjesto bez stilova i JavaScripta.
Porozne čestice silicijevog dioksida pripremljene su sol-gel metodom uz neke modifikacije kako bi se dobile makroporozne čestice. Ove čestice su derivatizirane polimerizacijom reverzibilnog adicionog prijenosa fragmentacije lanca (RAFT) s N-fenilmaleimid-metilvinilizocijanatom (PMI) i stirenom za pripremu N-fenilmaleimid interkalacije polistirenske (PMP) stacionarne faze. Kolona od nehrđajućeg čelika s uskim provrtom s (100 × 1,8 mm id) pakirani su pakiranjem u gnojnicu. Procijenjena kromatografska izvedba odvajanja PMP kolone mješavine peptida koja se sastoji od pet peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin enkefalin) i digestije ljudskog serumskog albumina (HAS) tripsinom. Pod optimalnim uvjetima eluiranja, teoretski broj ploča mješavine peptida iznosi čak 280 000 ploča/m². Uspoređujući učinak odvajanja razvijene kolone s komercijalnom kolonom Ascentis Express RP-Amide, primijećeno je da je učinak odvajanja PMP kolone bio bolji od komercijalne kolone u smislu učinkovitosti odvajanja i rezolucije.
Posljednjih je godina biofarmaceutska industrija postala globalno tržište u ekspanziji sa značajnim povećanjem tržišnog udjela. S eksplozivnim rastom biofarmaceutske industrije1,2,3, analiza peptida i proteina je vrlo poželjna. Osim ciljnog peptida, tijekom sinteze peptida stvara se nekoliko nečistoća, stoga je potrebno kromatografsko pročišćavanje da bi se dobili peptidi željene čistoće. Analiza i karakterizacija proteina u tjelesnim tekućinama, tkiva i stanica izuzetno je izazovan zadatak zbog velikog broja potencijalno detektabilnih vrsta u jednom uzorku. Iako je masena spektrometrija učinkovit alat za sekvencioniranje peptida i proteina, ako se takvi uzorci ubrizgavaju u maseni spektrometar u jednom prolazu, odvajanje neće biti idealno. Ovaj se problem može ublažiti provedbom odvajanja tekućinskom kromatografijom (LC) prije MS analize, što će smanjiti broj analita koji ulaze u maseni spektrometar u određenom vremenu4,5,6. Osim toga, tijekom odvajanja tekuće faze, analiti se mogu fokusirati u uskim područjima, čime se koncentriraju ti analiti i poboljšava osjetljivost MS detekcije. Tekućinska kromatografija (LC) značajno je napredovala tijekom prošlog desetljeća i postala popularna tehnika u proteomskoj analizi7,8,9,10.
Tekućinska kromatografija reverzne faze (RP-LC) naširoko se koristi za pročišćavanje i odvajanje peptidnih smjesa koristeći oktadecil-modificirani silicij (ODS) kao stacionarnu fazu11,12,13. Međutim, RP stacionarne faze ne omogućuju zadovoljavajuće odvajanje peptida i proteina zbog njihove složene strukture i amfifilne prirode 14,15. Stoga, posebno dizajnirane stacionarne faze potrebni su za analizu peptida i proteina s polarnim i nepolarnim dijelovima kako bi stupili u interakciju s tim analitima i zadržali ih16. Kromatografija mješovitog načina rada, koja pruža multimodalne interakcije, može biti alternativa RP-LC za odvajanje peptida, proteina i drugih složenih smjesa. Pripremljeno je nekoliko stacionarnih faza mješovitog načina rada, a kolone napunjene ovim fazama korištene su za odvajanje peptida i proteina17 ,18,19,20,21. Miješane stacionarne faze (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polarna interkalacija/RPLC) prikladne su za odvajanje peptida i proteina zbog prisutnosti polarnih i nepolarnih skupina22,23,24,25,26,27,28. Slično, polarne interkalirajuće stacionarne faze s kovalentno vezanim polarnim skupinama pokazuju dobru moć odvajanja i jedinstvenu selektivnost za polarne i nepolarne analite, jer odvajanje ovisi o interakciji između analita i stacionarne faze.Multimodalne interakcije 29, 30, 31, 32. Nedavno su Zhang et al.30 je pripremio poliaminsku stacionarnu fazu s dodecilnim završetkom i uspješno odvojio ugljikovodike, antidepresive, flavonoide, nukleozide, estrogene i nekoliko drugih analita. Polarni interkalator ima i polarne i nepolarne skupine, tako da se može koristiti za odvajanje peptida i proteina koji imaju i hidrofobne i hidrofilne dijelove. Kolone s polarnim ugrađenim stupcima (npr. C18 s ugrađenim amidom kolone) su komercijalno dostupne pod trgovačkim nazivom Ascentis Express RP-Amide kolone, ali te se kolone koriste samo za analizu amina 33.
U trenutnoj studiji pripremljena je polarna stacionarna faza (polistiren s ugrađenim N-fenilmaleimidom) i procijenjena za odvajanje peptida i tripsinskih digestija HSA. Stacionarna faza je pripremljena korištenjem sljedeće strategije. Porozne čestice silicijevog dioksida pripremljene su prema postupku danom u našoj prethodnoj publikaciji s nekim modifikacijama protokola pripreme. Omjer uree, polietilen glikola (PEG), TMOS , vodena octena kiselina prilagođena je za pripremu čestica silicijevog dioksida s velikom veličinom pora. Drugo, novi ligand, fenilmaleimid-metil vinil izocijanat, sintetiziran je i korišten za derivatiziranje čestica silicijevog dioksida za pripremu polarne ugrađene stacionarne faze. Rezultirajuća stacionarna faza pakirana je u kolonu od nehrđajućeg čelika (100 × 1,8 mm unutarnjeg promjera) pomoću optimizirane sheme pakiranja. Pakiranje kolone je potpomognuto s mehaničkim vibracijama kako bi se osiguralo formiranje homogenog sloja unutar kolone. Ocijenite odvajanje smjese peptida napunjene kolone koja se sastoji od pet peptida;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) i tripsin digest humanog serumskog albumina (HAS). Uočeno je da se mješavina peptida i tripsin digest HSA odvajaju s dobrom rezolucijom i učinkovitošću. Učinkovitost odvajanja PMP kolone uspoređena je s onom u koloni Ascentis Express RP-Amide. Uočeno je da su peptidi i proteini dobro odvojeni i učinkoviti na koloni PMP, koja je bila učinkovitija od kolone Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilen glikol), urea, octena kiselina, trimetoksi ortosilikat (TMOS), trimetil klorosilan (TMCS), tripsin, humani serumski albumin (HSA), amonijev klorid, urea, heksan metildisilazan (HMDS), metakriloil klorid (MC), stiren, 4-hidroksi-TEMPO, benzoil peroksid (B). PO), acetonitril HPLC stupnja (ACN), metanol, 2-propanol i aceton kupljen od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD).
Smjesa uree (8 g), polietilen glikola (8 g) i 8 mL 0,01 N octene kiseline miješana je 10 minuta, a zatim je u to dodano 24 mL TMOS-a pod ledeno hladnim uvjetima. Reakcijska smjesa je zagrijavana na 40°C 6 sati, a zatim na 120°C 8 sati u autoklavu od nehrđajućeg čelika. Voda je izlivena i preostali materijal je očišćen. sušena na 70°C 12 sati. Osušena meka masa je glatko samljevena u pećnici i kalcinirana na 550°C 12 sati. Tri serije su pripremljene i karakterizirane za ispitivanje ponovljivosti veličine čestica, veličine pora i površine.
Površinskom modifikacijom čestica silicijevog dioksida s prethodno sintetiziranim ligandom fenilmaleimid-metilvinilizocijanatom (PCMP) nakon čega je uslijedila radijalna polimerizacija sa stirenom, pripravljen je spoj koji sadrži polarne skupine.Stacionarna faza za agregate i polistirenske lance. Postupak pripreme opisan je u nastavku.
N-fenilmaleimid (200 mg) i metil vinil izocijanat (100 mg) otopljeni su u suhom toluenu, a 0,1 mL 2,2'-azoizobutironitrila (AIBN) je dodano u reakcijsku tikvicu da se pripremi fenilmaleimid-metil vinil izocijanat kopolimer (PMCP). Smjesa je zagrijavana na 60°C tijekom 3 sati, filtrira se i suši u pećnici na 40°C 3 sata.
Osušene čestice silicijevog dioksida (2 g) su dispergirane u suhom toluenu (100 mL), miješane i sonikirane u tikvici s okruglim dnom od 500 mL 10 minuta. PMCP (10 mg) je otopljen u toluenu i dodan kap po kap u reakcijsku tikvicu putem lijevka za kapanje. Smjesa je refluksirana na 100°C 8 sati, filtrirana i isprana acetonom i osušena na 60°C 3 sata. Zatim su čestice silicijevog dioksida vezane na PMCP (100 g) otopljene u toluenu (200 ml) i dodan je 4-hidroksi-TEMPO (2 mL) u prisutnosti 100 µL dibutilkositrenog dilaurata kao katalizatora. Smjesa je miješana na 50°C 8 sati, filtrirana i sušena na 50°C 3 sata sati.
Stiren (1 mL), benzoil peroksid BPO (0,5 mL) i TEMPO-PMCP-vezane čestice silicijevog dioksida (1,5 g) su dispergirane u toluenu i pročišćene dušikom. Polimerizacija stirena je provedena na 100°C 12 sati. Rezultirajući produkt je ispran metanolom i osušen na 60°C preko noći. Prikazana je cjelokupna reakcijska shema na slici 1.
Uzorci su degazirani na 393 K tijekom 1 sata kako bi se dobio rezidualni tlak manji od 10-3 Torr. Količina N2 adsorbiranog pri relativnom tlaku od P/P0 = 0,99 korištena je za određivanje ukupnog volumena pora. Morfologija golih i ligand-vezanih čestica silicijevog dioksida ispitana je skenirajućom elektronskom mikroskopijom (Hitachi High Technologies, Tokio, Japan). Osušeni uzorci ( goli silicijev dioksid i čestice silicijevog dioksida vezane ligandom) stavljene su na aluminijsku kolonu pomoću ljepljive karbonske trake. Zlato je naneseno na uzorke pomoću Q150T raspršivača, a na uzorke je nanesen sloj Au od 5 nm. To poboljšava učinkovitost procesa upotrebom niskih napona i omogućuje fino zrno, hladno raspršivanje. Thermo Electron (Waltham, MA, SAD) Flash EA1112 analizator elemenata je korišten za elementarnu analizu. Analizator veličine čestica Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 korišten je za dobivanje raspodjele veličine čestica. Gole čestice silicijevog dioksida i čestice silicijevog dioksida vezane ligandom (svaka po 5 mg) su dispergirane u 5 mL izopropanola, sonikirane 10 minuta, vorteksirane 5 minuta i stavljene na optičku klupu Mastersizera. Thermo gravimetrijska analiza provedena je brzinom od 5 °C u minuti u temperaturnom rasponu od 30 do 800 °C.
Staklom obloženi stupci uskog provrta od nehrđajućeg čelika dimenzija (100 × 1,8 mm unutarnjeg promjera) pakirani su metodom pakiranja kaše, primjenom istog postupka koji je korišten u Ref.31. Kolona od nehrđajućeg čelika (obložena staklom, 100 × 1,8 mm unutarnjeg promjera) s izlaznim priključkom koji sadrži fritu od 1 µm spojena je na paker gnojnice (Alltech Deerfield, IL, SAD). Pripremite kašu stacionarne faze suspendiranjem 150 mg stacionarne faze u 1,2 mL metanola i pošaljite je u kolonu za skladištenje. Metanol je također korišten kao otapalo suspenzije kao pogonsko otapalo. Napunite kolonu uzastopno primjenom tlaka od 100 MP tijekom 10 minuta, 80 MP tijekom 15 minuta i 60 MP tijekom 30 minuta. Tijekom pakiranja, primijenjene su mehaničke vibracije s dva GC mućkača za kolonu (Alltech, Deerfield, IL, SAD) kako bi se osiguralo ravnomjerno pakiranje kolone. Zatvorite paker gnojnice i polako otpuštajte pritisak kako biste spriječili oštećenje unutar kolone. Odspojite kolonu iz jedinice za pakiranje gnojnice i spojite drugu armaturu na ulaz i na LC sustav kako biste provjerili njegovu izvedbu.
Konstruirana je LC pumpa (10AD Shimadzu, Japan), injektor (Valco (SAD) C14 W.05) s petljom za ubrizgavanje od 50 nL, membranski degazer (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapilarni prozor. Poseban detektor uređaja µLC (UV-2075) i mikrokolone obložene staklom. Koristite vrlo uske i kratke spojne cijevi kako biste smanjili učinak dodatnog proširenja vrpce kolone. Nakon pakiranja, kapilare (50 μm id 365 i kapilare reducirajućeg spoja (50 μm) instalirane su na izlazu redukcijskog spoja od 1/16″. Prikupljanje podataka i kromatografska obrada obavljeni su pomoću softvera Multichro 2000. Praćenje na 254 nm Analiti su testirani na UV apsorbanciju. Kromatografske podatke analizirao je OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin iz ljudskog seruma, liofilizirani prah, ≥ 96% (elektroforeza u agaroznom gelu) 3 mg pomiješano s tripsinom (1,5 mg), 4,0 M ureom (1 mL) i 0,2 M amonijevim bikarbonatom (1 mL). Otopina je miješana 10 minuta i držana u vodenoj kupelji na 37°C 6 sati, zatim je ugašena s 1 mL 0,1% TFA. Filtrirajte otopinu i čuvajte ispod 4 °C.
Razdvajanje mješavina peptida i digestije tripsina HSA procijenjeno je odvojeno na PMP kolonama. Provjerite razdvajanje smjese peptida i digestije tripsina HSA pomoću PMP kolone i usporedite rezultate s kolonom Ascentis Express RP-Amide. Teoretski broj ploča izračunava se na sljedeći način:
SEM slike golih čestica silicijevog dioksida i ligand-vezanih čestica silicijevog dioksida prikazane su na Sl.2 .So slike golih čestica silicijevog dioksida (a, b) pokazuju da su, za razliku od naših prethodnih studija, ove čestice sferične u kojima su čestice izdužene ili imaju nepravilnu simetriju. Površina silicijevih čestica vezanih za ligand (c, d) je glatko od onih čestica golih silikata, a koje mogu biti uslijed polci-a, koje mogu biti uslijed koalicija na kore.
Slike s skenirajućim elektronskim mikroskopom golih čestica silicijevog dioksida (A, B) i čestica silicijevog dioksida vezanih ligandima (C, D).
Distribucije veličine čestica golih čestica silicijevog dioksida i čestica silicijevog dioksida vezanih ligandom prikazane su na slici 3(A). Krivulje raspodjele veličine čestica temeljene na volumenu pokazale su da se veličina čestica silicijevog dioksida povećala nakon kemijske modifikacije (slika 3A). Podaci o distribuciji veličine čestica čestica silicijevog dioksida iz trenutne studije i prethodne studije uspoređeni su u tablici 1(A). Veličina čestica temeljena na volumenu, d(0,5), P MP je 3,36 μm, u usporedbi s našom prethodnom studijom s ad(0,5) vrijednošću od 3,05 μm (čestice silicijevog dioksida vezane za polistiren)34. Ova je serija imala užu distribuciju veličine čestica u usporedbi s našom prethodnom studijom zbog različitih omjera PEG-a, uree, TMOS-a i octene kiseline u reakcijskoj smjesi. Veličina čestica PMP faze malo je veća od veličine čestica silicijevog dioksida vezanog za polistiren fazu čestica koju smo prethodno proučavali. To znači da je površinska funkcionalizacija čestica silicijevog dioksida sa stirenom samo taložila sloj polistirena (0,97 µm) na površini silicijevog dioksida, dok je u PMP fazi debljina sloja bila 1,38 µm.
Raspodjela veličine čestica (A) i raspodjela veličine pora (B) golih čestica silicijevog dioksida i čestica silicijevog dioksida vezanih ligandom.
Veličina pora, volumen pora i površina čestica silicijevog dioksida iz trenutne studije dani su u tablici 1(B). PSD profili golih čestica silicijevog dioksida i čestica silicijevog dioksida vezanih ligandom prikazani su na slici 3(B). Rezultati su usporedivi s našim prethodnim istraživanjem. Veličine pora golih čestica i čestica silicijevog dioksida vezanih na ligand su 310, odnosno 241, što ukazuje da se veličina pora smanjuje za 69 nakon kemijske modifikacije, kao što je prikazano u tablici 1(B), a promjena krivulje prikazana je na slici 3(B). Slično tome, volumen pora čestica silicijevog dioksida smanjio se s 0,67 na 0,58 cm3/g nakon kemijske modifikacije. Specifična površina trenutno proučavanih čestica silicijevog dioksida je 116 m2/g, što je usporedivo s našom prethodnom studijom (124 m2/g). prikazano u tablici 1(B), površina (m2/g) čestica silicija također se smanjila sa 116 m2/g na 105 m2/g nakon kemijske modifikacije.
Rezultati elementarne analize stacionarne faze prikazani su u tablici 2. Udio ugljika u trenutnoj stacionarnoj fazi je 6,35%, što je niže od udjela ugljika u našoj prethodnoj studiji (čestice silicijevog dioksida vezane polistirenom, 7,93%35 odnosno 10,21%) 42. Udio ugljika u trenutnoj stacionarnoj fazi je nizak, jer u pripremi trenutnog SP-a, osim stirena, neki polarni ligandi kao što je npr. korišteni su fenilmaleimid-metilvinilizocijanat (PCMP) i 4-hidroksi-TEMPO. Težinski postotak dušika trenutne stacionarne faze je 2,21%, u usporedbi s 0,1735 odnosno 0,85 težinskih % dušika u prethodnim studijama. To znači da je težinski % dušika veći u trenutnoj stacionarnoj fazi zbog fenilmaleimida. Slično tome, sadržaj ugljika u proizvodima ( 4) i (5) bili su 2,7% odnosno 2,9%, dok je sadržaj ugljika u konačnom proizvodu (6) bio 6,35%, kao što je prikazano u tablici 2. Gubitak težine je provjeren s PMP stacionarnom fazom, a krivulja TGA prikazana je na slici 4. Krivulja TGA pokazuje gubitak težine od 8,6%, što je u dobrom skladu s sadržajem ugljika (6,35%) jer ligandi ne sadrže samo C već i N, O i H.
Fenilmaleimid-metilvinilizocijanatni ligand odabran je za površinsku modifikaciju čestica silicija jer ima polarne fenilmaleimidne skupine i vinilizocijanatne skupine. Vinil izocijanatne skupine mogu dalje reagirati sa stirenom polimerizacijom živih radikala. Drugi razlog je umetanje skupine koja ima umjerenu interakciju s analitom i nema snažnu elektrostatsku interakciju između analita i stacionarne faze, budući da p henilmaleimidni dio nema virtualni naboj pri normalnom pH. Polaritet stacionarne faze može se kontrolirati optimalnom količinom stirena i vremenom reakcije polimerizacije slobodnih radikala. Posljednji korak reakcije (polimerizacija slobodnih radikala) je kritičan i može promijeniti polaritet stacionarne faze. Elementarna analiza je provedena kako bi se provjerilo opterećenje ugljikom ovih stacionarnih faza. Uočeno je da povećanje količine stirena i vremena reakcije povećavaju opterećenje ugljikom stacionarne faze i obrnuto. SP-ovi pripremljeni s različitim koncentracijama stirena imaju različita opterećenja ugljikom. Opet, stavite te stacionarne faze u stupce od nehrđajućeg čelika i provjerite njihovu kromatografsku izvedbu (selektivnost, razlučivost, N vrijednost itd.). Na temelju ovih eksperimenata odabrana je optimizirana formulacija za pripremu PMP stacionarne faze kako bi se osigurao kontrolirani polaritet i dobro zadržavanje analita.
Pet smjesa peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin enkefalin) također je procijenjeno korištenjem PMP kolone uz korištenje mobilne faze;60/40 (v/v) acetonitril/voda (0,1% TFA) pri brzini protoka od 80 μL/min. Pod optimalnim uvjetima eluiranja, teorijski broj ploča (N) po stupcu (100 × 1,8 mm id) je 20 000 ± 100 (200 000 ploča/m²). Tablica 3 daje N vrijednosti za tri PMP stupca i boju togrami su prikazani na slici 5A. Brza analiza na PMP koloni pri visokoj brzini protoka (700 μL/min), pet peptida je eluirano unutar jedne minute, N vrijednosti su bile vrlo dobre, 13,500 ± 330 po koloni (100 × 1,8 mm id), Odgovara 135,000 ploča/m (Slika 5B). Tri identične veličine kolone (100 × 1,8 mm id) pakirani su s tri različite serije PMP stacionarne faze kako bi se provjerila ponovljivost. Koncentracija analita za svaku kolonu zabilježena je korištenjem optimalnih uvjeta eluiranja i broja teoretskih ploča N i vremena zadržavanja za odvajanje iste ispitne smjese na svakoj koloni. Podaci o ponovljivosti za PMP kolone prikazani su u Tablici 4. Ponovljivost PMP kolone dobro korelira s vrlo niskim %RSD vrijednostima, kao što je prikazano u Tablici 3 .
Razdvajanje smjese peptida na PMP koloni (B) i Ascentis Express RP-Amide koloni (A);mobilna faza 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP dimenzije kolone (100 × 1,8 mm id);analitički Redoslijed ispiranja spojeva: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) i 5 (leucinska kiselina enkefalin)).
PMP kolona (100 × 1,8 mm unutarnjeg promjera) procijenjena je za odvajanje triptičkih digestija humanog serumskog albumina u tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti. Kromatogram na slici 6 pokazuje da je uzorak dobro odvojen i rezolucija je vrlo dobra. HSA digestije su analizirane uz brzinu protoka od 100 µL/min, mobilnu fazu 70/30 acetonitril/voda i 0,1% TFA. Kao što je prikazano u kromatogramu (Slika 6), HSA digestija je podijeljena u 17 vrhova koji odgovaraju 17 peptida. Izračunata je učinkovitost odvajanja svakog vrha u HSA digestiji, a vrijednosti su dane u Tablici 5.
Triptični digest HSA (100 × 1,8 mm unutarnjeg promjera) odvojen je na PMP koloni;brzina protoka (100 uL/min), mobilna faza 60/40 acetonitril/voda s 0,1% TFA.
gdje je L duljina kolone, η je viskoznost mobilne faze, ΔP je protutlak kolone, a u je linearna brzina mobilne faze. Propusnost PMP kolone bila je 2,5 × 10-14 m2, brzina protoka bila je 25 μL/min, a korišteno je 60/40 v/v ACN/voda. Propusnost PMP kolone (100 × 1,8 mm id ) bila je slična onoj iz naše prethodne studije Ref.34. Propusnost kolone napunjene površinski poroznim česticama je: 1,7 × 10-15 za čestice od 1,3 μm, 3,1 × 10-15 za čestice od 1,7 μm, 5,2 × 10-15 i 2,5 × 10-14 m2 za čestice od 2,6 μm za 5 μm čestice 43. Stoga je propusnost PMP faze slična onoj 5 μm čestica jezgra-ljuska.
gdje je Wx težina kolone napunjene kloroformom, Wy je težina kolone napunjene metanolom, a ρ je gustoća otapala. Gustoće metanola (ρ = 0,7866) i kloroforma (ρ = 1,484). Ukupna poroznost kolona SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm id) 34 i C18-U rea kolone 31 koje smo prethodno proučavali bile su 0,63 odnosno 0,55. To znači da prisutnost liganda uree smanjuje propusnost stacionarne faze. S druge strane, ukupna poroznost PMP kolone (100 × 1,8 mm id) je 0,60. Propusnost PMP kolona niža je od one kolona napunjenih česticama silicijevog dioksida vezanim na C18 jer u C18-tipu u stacionarnim fazama C18 ligandi su vezani za čestice silicijevog dioksida kao linearni lanci, dok se u stacionarnim fazama tipa polistirena oko njih formira relativno debeli sloj polimera. U tipičnom eksperimentu, poroznost kolone izračunava se kao:
Slika 7A,B prikazuje PMP kolonu (100 × 1,8 mm unutarnjeg promjera) i Ascentis Express RP-Amide kolonu (100 × 1,8 mm unutarnjeg promjera) koristeći iste uvjete eluiranja (tj. 60/40 ACN/H2O i 0,1 % TFA).) van Deemterove parcele.Odabrane mješavine peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) pripremljene su u 20 µL/ Minimalna brzina protoka za obje kolone je 800 µL/min. Minimalne vrijednosti HETP pri optimalnoj brzini protoka (80 µL/min) za PMP kolonu i kolona Ascentis Express RP-Amide bila je 2,6 µm, odnosno 3,9 µm. Vrijednosti HETP pokazuju da je učinkovitost odvajanja kolone PMP (100 × 1,8 mm unutarnjeg promjera) mnogo bolja od komercijalno dostupne kolone Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm unutarnjeg promjera). Van Deemterov grafikon na slici 7(A) pokazuje da smanjenje vrijednosti N s povećanje protoka nije značajno u usporedbi s našom prethodnom studijom. Veća učinkovitost odvajanja kolone PMP (100 × 1,8 mm id) u usporedbi s kolonom Ascentis Express RP-Amide temelji se na poboljšanjima u obliku čestica, veličini i složenim postupcima pakiranja kolone koji se koriste u trenutnom radu34.
(A) van Deemterov dijagram (HETP u odnosu na linearnu brzinu mobilne faze) dobiven korištenjem kolone PMP (100 × 1,8 mm unutarnjeg promjera) u 60/40 ACN/H2O s 0,1% TFA. (B) van Deemterov grafikon (HETP u odnosu na linearnu brzinu mobilne faze) dobiven korištenjem kolone Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm unutarnjeg promjera) u 60/4 0 ACN/H2O s 0,1% TFA.
Polistirenska stacionarna faza s umetnutim polarom pripremljena je i procijenjena za odvajanje sintetičkih peptidnih smjesa i tripsinskih digestija humanog serumskog albumina (HAS) u tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti. Kromatografska izvedba PMP kolona za peptidne smjese izvrsna je u učinkovitosti odvajanja i rezoluciji. Poboljšana izvedba odvajanja PMP kolona posljedica je niza razloga, kao što su veličina čestica i veličina pora si čestica lica, kontrolirana sinteza stacionarne faze i složeno pakiranje kolone. Osim visoke učinkovitosti odvajanja, nizak protutlak u koloni pri visokim brzinama protoka još je jedna prednost ove stacionarne faze. PMP kolone pokazuju dobru reproducibilnost i mogu se koristiti za analizu smjesa peptida i tripsinsku digestiju različitih proteina. Ovu kolonu namjeravamo koristiti za odvajanje prirodnih proizvoda, bioaktivnih spojeva iz ljekovitog bilja i ekstrakata gljiva u tekućini kroma tografija. U budućnosti će se PMP kolone također procjenjivati ​​za odvajanje proteina i monoklonskih antitijela.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Istraživanje sustava za odvajanje peptida kromatografijom reverzne faze I. dio: Razvoj protokola za karakterizaciju kolone.J.Kromatografija.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Poboljšani aktivni peptidi dizajnirani za liječenje zaraznih bolesti. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintetski terapeutski peptidi: znanost i tržište. otkriće lijekova.15 (1-2) danas, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.Kromatografija.A 1261, 78-90 (2012).
Liu, W. et al. Napredna tekućinska kromatografija-masena spektrometrija omogućuje ugradnju široko ciljane metabolomike i proteomike.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Uloga UHPLC u razvoju lijekova.J.Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Temeljni i praktični aspekti ultravisokotlačne tekućinske kromatografije za brza odvajanja.J.Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Primjena tekućinske kromatografije ultravisoke učinkovitosti u razvoju lijekova.J.Kromatografija.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Monolitni makroporozni hidrogelovi pripremljeni od emulzija ulja u vodi s visokom unutarnjom fazom za učinkovito pročišćavanje enterovirusa. Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Uloga tekućinske kromatografije u proteomici.J.Kromatografija.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Novi trendovi u odvajanju terapeutskih peptida i proteina tekućinskom kromatografijom reverzne faze: teorija i primjena.J.Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Dvodimenzionalno odvajanje peptida korištenjem RP-RP-HPLC sustava korištenjem različitih pH vrijednosti u prvoj i drugoj dimenziji odvajanja.J.Sep. Sci. 28 (14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Istražene su karakteristike prijenosa mase i kinetička izvedba visokoučinkovitih kromatografskih stupaca napunjenih s C18 sub-2 μm potpuno i površinski poroznim česticama. J.Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al.Nedavni trendovi i analitički izazovi u izolaciji, identifikaciji i validaciji biljnih bioaktivnih peptida.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Proteomski krajolik kraljevstva života. Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Nizvodna obrada terapeutskih peptida preparativnom tekućinskom kromatografijom. Molecule (Basel, Švicarska) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Mješovita kromatografija i njezina primjena na biopolimere.J.Kromatografija.A 1218(49), 8813-8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ligandi za mješovitu proteinsku kromatografiju: princip, karakterizacija i dizajn.J.Biotehnologija.144(1), 3-11 (2009).