Hvala što ste posjetili Nature.com.Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Angustifolius lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) je mahunarka koja se koristi za proizvodnju hrane i poboljšanje tla.Globalna ekspanzija NLL-a kao usjeva privukla je mnoge patogene gljive, uključujući antraknozu lupina, koja uzrokuje razornu bolest antraknozu.Dva alela, Lanr1 i AnMan, koji daju povećanu otpornost, korištena su u NLL uzgoju, ali temeljni molekularni mehanizmi ostaju nepoznati.U ovoj studiji, markeri Lanr1 i AnMan korišteni su za pregled europskih NLL uzoraka.Ispitivanje cjepiva u kontroliranom okruženju potvrdilo je učinkovitost oba rezistentna donora.Diferencijalno profiliranje ekspresije gena provedeno je na reprezentativnim rezistentnim i osjetljivim linijama.Otpornost na antraknozu bila je povezana s prekomjernom ekspresijom pojmova ontologije gena "GO:0006952 obrambeni odgovor", "GO:0055114 redoks proces" i "GO:0015979 fotosinteza".Osim toga, linija Lanr1(83A:476) pokazala je značajno reprogramiranje transkriptoma brzo nakon inokulacije, dok su druge linije pokazale kašnjenje u ovom odgovoru za oko 42 sata.Obrambeni odgovori povezani su s genima TIR-NBS, CC-NBS-LRR i NBS-LRR, 10 proteina uključenih u patogenezu, proteinima prijenosa lipida, endoglukan-1,3-β-glukozidazom, proteinima stanične stijenke bogatim glicinom i genima iz reaktivnog puta kisika.Rani odgovori na 83A:476, uključujući pažljivo suzbijanje gena povezanih s fotosintezom, poklopili su se s uspješnom zaštitom tijekom faze vegetativnog rasta gljivične biologije, sugerirajući da efektor pokreće imunitet.Mandeloopova reakcija je usporena, kao i ukupni vodoravni otpor.
Uskolisna vučika (NLL, Lupinus angustifolius L.) je visokoproteinska žitarica podrijetlom iz zapadnog Sredozemlja1,2.Trenutno se uzgaja kao prehrambena kultura za životinje i ljude.Također se smatra zelenom gnojidbom u sustavima rotacije usjeva zbog fiksacije dušika pomoću simbiotskih bakterija koje fiksiraju dušik i ukupnog poboljšanja strukture tla.NLL je prošao kroz brzi proces pripitomljavanja u prošlom stoljeću i još uvijek je pod velikim pritiskom uzgoja3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.S raširenim uzgojem NLL-a, sukcesija patogenih gljiva razvila je nove poljoprivredne niše i uzrokovala nove bolesti koje uništavaju usjeve. Za uzgajivače i uzgajivače lupina najznačajnija je bila pojava antraknoze, uzrokovane patogenom gljivom, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Za uzgajivače i uzgajivače lupina najznačajnija je bila pojava antraknoze, uzrokovane patogenom gljivom, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Najvažnije za uzgajivače i selekcionere lupina bila je pojava antraknoze izazvane patogenom gljivicom Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Uzgajivačima i uzgajivačima lupina najviše je primjećeno pojavljivanje antraknoze koju uzrokuje patogena gljiva Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg , Feiler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Kosa. 1 Najugroženiji za uzgajivače i selekcionere lupina je pojava antraknoze koju izaziva patogena gljivica Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Uzgajivačima i uzgajivačima lupina najupečatljivije je pojava antraknoze koju uzrokuje patogena gljiva Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Najraniji izvještaji o bolesti došli su iz Brazila i Sjedinjenih Država, s tipičnim simptomima koji su se pojavili 1912. odnosno 1929. godine.Međutim, nakon otprilike 30 godina, patogen je označen kao Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld u Celenopravnoj morfologiji. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld u ciljanoj morfologiji. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .i H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。i H. Schlenk,.Preliminarna fenotipizacija bolesti obavljena sredinom 20. stoljeća pokazala je određenu rezistenciju kod NLL-a i čestica žute lupine (L. luteus L.), ali su svi testirani uzorci bijele lupine (L. albus L.) bili vrlo osjetljivi15,16.Studije su pokazale da je razvoj antraknoze povezan s povećanom količinom oborina (vlažnost zraka) i temperaturom (u rasponu od 12-28°C), što dovodi do kršenja otpornosti na višim temperaturama17, 18. Zapravo, vrijeme potrebno za klijanje konidija i početak bolesti bilo je četiri puta kraće na 24°C (4 sata) nego na 12°C (16 sati) u uvjetima visoke vlažnosti19.Stoga je kontinuirano globalno zagrijavanje dovelo do širenja antraknoze.Međutim, bolest je primijećena u Francuskoj (1982.) i Ukrajini (1983.) kao najava nadolazeće prijetnje, ali ju je očito ignorirala industrija lupina u to vrijeme20,21.Nekoliko godina kasnije, ova se razorna bolest proširila po cijelom svijetu i zahvatila je i velike zemlje koje proizvode vučiku kao što su Australija, Poljska i Njemačka22,23,24.Nakon izbijanja antraknoze sredinom 1990-ih, opsežni probir rezultirao je identifikacijom nekoliko rezistentnih donora u uzorcima NLL19.NLL otpornost na antraknozu kontroliraju dva odvojena dominantna alela pronađena u različitim izvorima germplazme: Lanr1 u sorti Tanjil te Wonga i AnMan u kultivaru.Mandalay 25, 26. Ovi aleli nadopunjuju molekularne markere koji podržavaju selekciju otporne germplazme u programima uzgoja25,26,27,28,29,30.Otporna uzgojna linija 83A:476 koja nosi alel Lanr1 križana je s osjetljivom divljom linijom P27255 kako bi se dobila RIL populacija koja se izdvaja za otpornost na antraknozu, što je omogućilo dodjeljivanje lokusa Lanr1 kromosomu NLL-1131, 32, 33. Usklađivanje markera mape povezivanja s bočnih lokusa otpornosti na antraknozu s genomom ic okvira, NLL je otkrio položaj sva tri alela na istom kromosomu (NLL-11), ali na različitim položajima29,34,35.Međutim, zbog malog broja RIL-ova i velike genetske udaljenosti između markera i odgovarajućih alela, ne mogu se izvući pouzdani zaključci o njihovim temeljnim genima.S druge strane, uporaba obrnute genetike u lupinima je teška zbog njihova vrlo niskog potencijala regeneracije, što genetsku manipulaciju čini nezgrapnom37.
Razvoj pripitomljene germplazme koja nosi željeni alel u homozigotnom stanju, kao što je 83A:476 (Lanr1) i Mandelup (AnMan), otvorio je vrata proučavanju otpornosti na antraknozu u svjetlu prisutnosti suprotnih kombinacija alela u divljim populacijama.Mogućnosti molekularnih mehanizama.Usporedite obrambene odgovore generirane određenim genotipovima.Ova studija procijenila je rani odgovor transkriptoma NLL-a na cijepljenje protiv C. lupini.Prvo je pregledan europski NLL panel germplazme koji sadrži 215 linija pomoću molekularnih markera koji označavaju alele Lanr1 i AnMan.Zatim je provedeno fenotipiziranje antraknoze na 50 NLL linija, prethodno odabranih za molekularne markere, u kontroliranim uvjetima.Na temelju ovih eksperimenata odabrane su četiri linije koje se razlikuju po otpornosti na antraknozu i sastavu alela Lanr1/AnMan za profiliranje ekspresije diferencijalnog obrambenog gena korištenjem dvaju komplementarnih pristupa: sekvenciranja RNA visoke propusnosti i kvantifikacije PCR-a u stvarnom vremenu.
Probir skupa NLL germplazme (N = 215) s markerima Lanr1 (Anseq3 i Anseq4) i AnMan (Anseq4) i AnMan (AnManM1) pokazao je da samo jedna linija (95726, blizu Salamanca-b) pojačava alel "otpornosti" za sve markere, dok je "Prisutnost 'osjetljivih' alela" pronašla udio svih oznaka sadrži 158 (~73,5%) redaka.Trinaest linija proizvelo je dva "otporna" alela markera Lanr1, a 8 linija proizvelo je "otporne" alele Lanr1.marker.Alel "otpora" AnMan markera (dodatna tablica S1).Dvije su linije bile heterozigotne za Anseq3 marker i jedna heterozigotna za AnManM1 marker.42 linije (19,5%) nosile su suprotne faze alela Anseq3 i Anseq4, što ukazuje na visoku učestalost rekombinacije između ova dva lokusa.Fenotipovi antraknoze u kontroliranim uvjetima (dodatna tablica S2) otkrili su varijabilnost u otpornosti testiranih genotipova, što se odrazilo na ozbiljnost antraknoze.Razlike u srednjim ocjenama kretale su se od 1,8 (umjereno otporne) do 6,9 (osjetljive), a razlike u masi biljaka kretale su se od 0,62 (osjetljive) do 4,45 g (otporne). Postojala je značajna korelacija između vrijednosti uočenih u dva ponavljanja pokusa (0,51 za rezultate ozbiljnosti bolesti, P = 0,00017 i 0,61 za težinu biljke, P < 0,0001), kao i između ova dva parametra (− 0,59 i − 0,77, P < 0,0001). Postojala je značajna korelacija između vrijednosti uočenih u dva ponavljanja eksperimenta (0,51 za rezultate ozbiljnosti bolesti, P = 0,00017 i 0,61 za težinu biljke, P < 0,0001), kao i između ova dva parametra (− 0,59 i − 0,77, P < 0,0001). Utvrđena je točna korelacija između značenja koja se promatraju u dva ponovljena eksperimenta (0,51 za težinu bolesti, P = 0,00017 i 0,61 za masu biljaka, P < 0,0001), kao i između ova dva parametra (-0,59 i -0,77, R < 0,0001) 0,0001). Nađena je značajna korelacija između vrijednosti uočenih u dva ponavljanja eksperimenta (0,51 za bodove ozbiljnosti bolesti, P = 0,00017 i 0,61 za težinu biljke, P < 0,0001), kao i između ova dva parametra (- 0,59 i -0,77, P < 0,0001) 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0,51，P = 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间Ｔ(- 0,59 和- 0,77，P <0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为 分为 0,5 1, p = 0,00017, 植物 为 为 0,61, p <0,0001) 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59 和– 0,59和 – 0,59 和 - 0,77，P < 0,0001). Uočena je značajna korelacija između značenja koja se promatraju u dvije ponovljenosti (ocjena težine bolesti 0,51, P = 0,00017 i masa biljke 0,61, P <0,0001), i između ova dva parametra (-0,59 i -0,0001) 0,77, P <0,0001. Postojala je značajna korelacija između vrijednosti opaženih u duplikatu (ocjena ozbiljnosti bolesti 0,51, P = 0,00017 i težina biljke 0,61, P < 0,0001) i između ova dva parametra (-0,59 i -0 ,0001) 0,77, P<0,0001. ).Tipični simptomi koji se vide kod osjetljivih biljaka uključuju savijanje i uvijanje stabljike nalik strukturi "pastirskog luka", praćeno ovalnim lezijama s narančastim/ružičastim sporozoitima (dodatna slika 1).Australski uzorci koji nose gene Lanr1 (83A:476 i Tanjil) i AnMan (Mandelup) umjereno su otporni, 0,0331 i 0,0036).Neke linije koje također nose "otporne" Lanr1 i/ili AnMan alele pokazuju simptome bolesti.
Zanimljivo je da je nekoliko NLL linija kojima nedostaje "otporan" marker alel otkrilo visoku razinu otpornosti na antraknozu (usporedivu ili višu nego za genotipove Lanr1 ili AnMan), kao što su Boregine (vrijednost P < 0,0001 za oba parametra), Bojar (vrijednost P < 0,0001 za rezultat i 0,001 za težinu biljke) i populacija B-549/79b (vrijednost P < 0. 0001 za rezultat i neznačajno za težinu). Zanimljivo je da je nekoliko NLL linija kojima nedostaje "otporan" marker alel otkrilo visoku razinu otpornosti na antraknozu (usporedivu ili višu nego za genotipove Lanr1 ili AnMan), kao što su Boregine (vrijednost P < 0,0001 za oba parametra), Bojar (vrijednost P < 0,0001 za rezultat i 0,001 za težinu biljke) i populacija B-549/79b (vrijednost P < 0. 0001 za rezultat i neznačajno za težinu). Zanimljivo je da je nekoliko linija NLL, lišenih bilo kakvog «rezistentnog» markerskog alela, pokazalo visoku razinu otpornosti na antraknozu (supostavljivu ili više visoku nego za genotipe Lanr1 ili AnMan), kao što je Boregine (značaj P <0,0001 za oba parametra), Bojar (značaj P < 0,0001 za ocjene i 0,001 za masu biljaka) i populaciju B-549/ 79b (značenje P <0,0001 za ocjenjivanje i nevažno za masu). Zanimljivo je da je nekoliko NLL linija kojima nedostaje 'otporan' markerski alel pokazalo visoku razinu otpornosti na antraknozu (usporedivu ili višu nego za genotipove Lanr1 ili AnMan), kao što su Boregine (vrijednost P < 0,0001 za oba parametra), Bojar (vrijednost P < 0,0001 za procjenu i 0,001 za težinu biljke) i populacija B-549/79b (vrijednost P < 0. 0001 za ocjenu i nije značajno za težinu).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1 或AnM an 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001，植物重量为0 0,001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）。 Zanimljivo je da neki NLL sustavi koji nemaju nikakve “antigene” markere pokazuju visoku horizontalnu otpornost (ekvivalentnu Lanr1 ili AnMan genima ili višoj), kao što su Boregine (oba parametra P < 0,0001), Bojar (P vrijednost < 0,0001, težina biljke 0,001) i soj B-549/79b (P vrijednost < 0,0001, težina nije značajna). Zanimljivo je da su neke linije NLL, lišene bilo kojih markerskih alelija «otpornosti», pokazale visoku razinu otpornosti na antraknozu (usporedno ili više, nego kod genotipa Lanr1 ili AnMan), kao što je Boregine (značaj P za sve parametre <0,0001), Bojar (značaj P <0,0001, masa biljaka 0,001) i populacija B-549/79b (ocjena ka P-značenje <0,0001, masa neznačajna). Zanimljivo, neke NLL linije kojima nedostaju aleli markera 'otpornosti' pokazale su visoke razine otpornosti na antraknozu (usporedive ili veće od genotipova Lanr1 ili AnMan), kao što su Boregine (P-vrijednost za oba parametra <0,0001), Bojar (P-vrijednost <0,0001, težina biljke 0,001) i populacija B-549/79b (P-vrijednost <0,0). 001, težina nije značajna).Ovaj fenomen ukazuje na mogućnost novog genetskog izvora otpornosti, objašnjavajući uočeni nedostatak korelacije između genotipova markera i fenotipova bolesti (vrijednosti P od ~0,42 do ~0,98).Stoga je Kolmogorov-Smirnovljev test pokazao da su podaci o otpornosti na antraknozu približno normalno raspoređeni za rezultate (P-vrijednosti 0,25 i 0,11) i masu biljke (P-vrijednosti 0,47 i 0,55), što sugerira moju hipotezu da je uključeno više alela od Lanr1 i AnMan.
Na temelju rezultata probira otpornosti na antraknozu odabrane su 4 linije za analizu transkriptoma: 83A:476, Boregine, Mandelup i Populacija 22660. Te su linije ponovno testirane na otpornost na antraks u eksperimentima inokulacije RNA sekvenciranjem, pod uvjetom da su bile iste kao u prethodnom testu.Vrijednosti rezultata bile su sljedeće: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) i populacija 22660 (6,11 ± 1,29).
Protokol Illumina NovaSeq 6000 postigao je prosječno 40,5 Mread parova po uzorku (29,7 do 54,4 Mread) (dodatna tablica S3).Rezultati usklađenosti u referentnoj sekvenci bili su u rasponu od 75,5% do 88,6%.Prosječna korelacija podataka o broju očitanih između eksperimentalnih varijanti između bioloških ponavljanja bila je u rasponu od 0,812 do 0,997 (srednja vrijednost 0,959). Od 35.170 analiziranih gena, 2917 nije pokazalo ekspresiju, a ostalih 4785 gena eksprimirano je na zanemarivoj razini (osnovna srednja vrijednost < 5). Od 35.170 analiziranih gena, 2917 nije pokazalo ekspresiju, a ostalih 4785 gena eksprimirano je na zanemarivoj razini (osnovna srednja vrijednost < 5). Od 35 170 proanaliziranih gena 2917 nije pokazalo ekspresiju, a ostalih 4785 gena ekspresirano je na neznačajnoj razini (bazno srednje <5). Od 35.170 analiziranih gena, 2917 nije pokazalo nikakvu ekspresiju, a preostalih 4785 gena eksprimirano je na zanemarivoj razini (osnovna srednja vrijednost <5).在分析的35,170 个基因中, 2917 个没有表达, 他他4785 个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5).35,170 Od 35 170 proanaliziranih gena 2917 nije ekspresirano, a preostalih 4785 gena imalo je neznačajnu ekspresiju (bazno srednje značenje <5). Od 35 170 analiziranih gena, 2917 nije bilo eksprimirano, a preostalih 4785 gena imalo je zanemarivu ekspresiju (osnovna srednja vrijednost <5).Stoga je broj gena za koje se smatra da su eksprimirani (osnovna srednja vrijednost ≥ 5) tijekom eksperimenta bio 27 468 (78,1%) (dodatna tablica S4).
Od prve vremenske točke, sve su NLL linije odgovorile na inokulaciju C. lupini (soj Col-08) reprogramiranjem transkriptoma (tablica 1), međutim, uočene su značajne razlike između linija.Stoga je rezistentna linija 83A:476 (koja nosi gen Lanr1) pokazala značajno reprogramiranje transkriptoma u prvoj vremenskoj točki (6 hpi) s 31-69-strukim povećanjem broja izoliranih gore-dolje-gena u usporedbi s drugim vremenskim točkama u ovoj vremenskoj točki.Osim toga, ovaj vrhunac bio je kratkotrajan, jer je ekspresija samo nekoliko gena ostala značajno promijenjena u drugoj vremenskoj točki (12 hpi).Zanimljivo, Boregine, koji je također pokazao visoku razinu otpornosti u testu presađivanja, nije prošao tako masovno reprogramiranje transkripcije tijekom eksperimenta.Međutim, broj različito izraženih gena (DEG) bio je isti za Boregine i 83A:476 na 12 HPI.I Mandelup i populacija 22660 pokazali su vrhunce DEG u posljednjoj vremenskoj točki (48 l/s), što ukazuje na relativno kašnjenje obrambenih odgovora.
Budući da je 83A:476 prošao masivno reprogramiranje transkriptoma kao odgovor na C. lupini na 6 HPI u usporedbi sa svim drugim linijama, ~91% DEG-ova opaženih u ovoj vremenskoj točki bilo je specifično za lozu (Slika 1).Međutim, došlo je do određenog preklapanja u ranim odgovorima između studija, jer se 68,5%, 50,9% i 52,6% DEG u Boregineu, Mandelupu i populaciji 22660 preklapalo s onima pronađenim u 83A:476 u određenim vremenskim točkama.Međutim, ti DEG-ovi činili su samo mali dio (0,97–1,70%) svih DEG-ova koji su trenutačno otkriveni pomoću 83A:476.Osim toga, 11 DEG iz svih linija bilo je koherentno u to vrijeme (dodatne tablice S4-S6), uključujući uobičajene komponente obrambenih odgovora biljaka: protein prijenosa lipida (TanjilG_32225), enzim endoglukan-1,3-β-glukozid (TanjilG_23384), dva proteina inducibilna stresom poput SAM22 (TanjilG_31528 i TanjilG_3 1531), osnovni protein lateksa (TanjilG_32352) i dva proteina strukturne stanične stijenke bogata glicinom (TanjilG_19701 i TanjilG_19702).Također je postojalo relativno veliko preklapanje u odgovorima transkriptoma između 83A:476 i Boregine na 24 HPI (ukupno 16-38% DEG) i između Mandelupa i Populacije 22660 na 48 HPI (ukupno 14-20% DEG).
Vennov dijagram koji prikazuje broj različito izraženih gena (DEG) u linijama uskolisne lupine (NLL) inokuliranih s Colletotrichum lupini (soj Col-08 dobiven iz polja lupine u Wierzhenicama, Poljska, 1999.).Analizirane linije NLL bile su: 83A:476 (otporna, nosi alel Lanr1), Boregine (otporna, nepoznata genetska pozadina), Mandelup (umjereno otporna, nosi alel AnMan) i populacija 22660 (vrlo osjetljiva).Kratica hpi stoji satima nakon cijepljenja.Nulte vrijednosti su uklonjene kako bi se grafikon pojednostavio.
Skup prekomjerno eksprimiranih gena na 6 hpi analiziran je na prisutnost kanonskih R genskih domena (dodatna tablica S7).Ova je studija otkrila indukciju transkriptoma klasičnih gena otpornosti na bolesti s NBS-LRR domenama samo na 83A:476.Ovaj set se sastojao od jednog TIR-NBS-LRR gena (tanjilg_05042), pet CC-NBS-LRR gena (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 i tanjilg_16162) i četiri NBS-LR, Tanjilg_16162) i četiri NBS-LRRE (tanjilg_16162) kao i Four NBS-Lrr (tanjilg_16162) i Four NBS-LRR (TANJILG_16162).Svi ovi geni imaju kanonske domene raspoređene u očuvane sekvence.Osim gena NBS-LRR domene, aktivirano je nekoliko RLL kinaza na 6 hpi, naime jedna u Boregineu (TanjilG_19877), dvije u Mandelupu (TanjilG_07141 i TanjilG_19877) i u populaciji 22660 (TanjilG_09014 i TanjilG_10361) i dvije u 83A 27:47 6.
Geni sa značajno promijenjenom ekspresijom kao odgovor na inokulaciju s C. lupini (soj Col-08) podvrgnuti su analizi obogaćivanja genske ontologije (GO) (dodatna tablica S8). Najčešće prezastupljeni pojam biološkog procesa bio je "GO:0006952 obrambeni odgovor" koji se pojavio u 6 od 16 (vrijeme × crta) kombinacija s visokim značajem (P vrijednost < 0,001) (Slika 2). Najčešće prezastupljeni pojam biološkog procesa bio je "GO:0006952 obrambeni odgovor" koji se pojavio u 6 od 16 (vrijeme × crta) kombinacija s visokim značajem (P vrijednost < 0,001) (Slika 2). Najčešće izmjereno prikazan termin biološkog procesa bio je «GO: 0006952 zaštitni odgovor», koji se pojavio u 6 od 16 (vrijeme × linija) kombinacije s visokom značajnošću (značenje P <0,001) (slika 2). Najčešće prezastupljeni pojam biološkog procesa bio je 'GO:0006952 obrambeni odgovor', koji se pojavio u 6 od 16 (vrijeme × linija) kombinacija s visokim značajem (P vrijednost <0,001) (Slika 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”,，它出现在16 个（时间×线）组合中的6个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 Najreprezentativniji pojam biološkog procesa je "GO:0006952 obrambeni odgovor", koji se pojavljuje u 6 od 16 (时间×线) kombinacija, s visokim značajem (P vrijednost < 0,001) (图2) . Najčešće izmjereno prikazan termin biološkog procesa bio je «GO: 0006952 obrambeni odgovor», koji se pojavio u 6 od 16 kombinacija (vrijeme × linija) s visokom značajnošću (značenje P <0,001) (slika 2). Najčešće prezastupljeni pojam biološkog procesa bio je 'GO:0006952 obrambeni odgovor', koji se pojavio u 6 od 16 kombinacija (vrijeme × linija) s visokim značajem (P vrijednost < 0,001) (Slika 2).Ovaj termin je bio previše zastupljen u dvije vremenske točke u 83A: 476 i Boregine (6 i 24 hpi) i u jednoj vremenskoj točki u Mandelupu i Populaciji 22660 (12 odnosno 6 hpi).Ovo je očekivani rezultat, koji naglašava antifungalni odgovor rezistentnih linija.Osim toga, 83A:476 je odgovorio na C. lupini brzim induciranjem gena povezanih s oksidativnim praskom predstavljenim pojmom "GO:0055114 redoks proces", što ukazuje na specifičan obrambeni odgovor, dok je Boregine otkrio specifične obrambene odgovore, povezane s izrazom "GO".:0006950 Odgovor na stres”.Populacija 22660 aktivirala je odgovor horizontalne otpornosti koji uključuje sekundarne metabolite, ističući prekomjeran broj pojmova "GO:0016104 Proces biosinteze triterpena" i "GO:0006722 Proces metabolizma triterpena" (oba pojma pripadaju istom skupu gena), uzimajući u obzir rezultate analize obogaćivanja GO izraza, stabilnost Mandelupove reakcije bila je između Boregine i Populacije 22660. Osim toga, rana reakcija 83A:476 (6 hpi) i odgođena reakcija Mandelup i Populacija 22660 uključuju pojam GO:0015979 'fotosinteza' i druge povezane biološke procese.
Termini ontologije gena bioprocesa odabrani u napomeni različito izraženih gena tijekom odgovora transkriptoma uskolisne lupine (NLL) inokulirane antraksnom lupinom (soj Col-08 dobiven iz polja lupine u Wierzhenicama, Poljska, 1999.) uvelike su pretjerani.Analizirane linije NLL bile su: 83A:476 (otporna, nosi homozigotni alel Lanr1), Boregine (otporna, nepoznata genetska podloga), Mandelup (umjereno otporna, nosi homozigotni alel AnMan) i populacija 22660 (osjetljiva).
Budući da je ova studija imala za cilj identificirati gene koji pridonose otpornosti na antraknozu, geni dodijeljeni pojmovima GO "GO: 0006952 obrambeni odgovori" i "GO: 0055114 redoks procesi" analizirani su s graničnim vrijednostima budući da početna vrijednost znači ≥ 30 s najmanje jednom linijom.× točka u vremenu kombinirajući statistički značajne vrijednosti log2 (promjena puta).Broj gena koji zadovoljavaju ove kriterije bio je 65 za GO:0006952 i 524 za GO:0055114.
83A:476 otkrio je dva pika DEG označena izrazom GO:0006952, prvi na 6 gena po inču (64 gena, regulacija gore i dolje) i drugi na 24 gena po inču (15 gena, samo regulacija na gore).Boregine je također pokazao da je GO:0006952 dosegao vrhunac u istoj vremenskoj točki, ali s manje DEG (11 i 8) i preferiranom aktivacijom.Mandeloop je pokazao dva vrhunca GO:0006952 na 12 i 48 HPI, oba noseći 12 gena (prvi s aktivirajućim genima, a drugi samo sa supresivnim genima), dok je populacija 22660 na 6 HPI (13 gena) imala veću dominaciju vrha povećanja.regulacija.Treba napomenuti da je 96,4% GO:0006952 DEG u ovim vrhovima imalo istu vrstu odgovora (gore ili dolje), što ukazuje na značajno preklapanje obrambenih odgovora unatoč razlikama u broju uključenih gena.Najveća skupina sekvenci povezanih s pojmom GO:0006952 kodira protein poruke povezan sa gladovanjem i stresom 22 (sličan SAM22), koji pripada klasu proteina klase 10 proteina povezanog s patogenezom (PR-10) i lateksu proteina jezgre.sličan (MLP-like) protein) protein (slika 3).Dvije su se skupine razlikovale po prirodi izražavanja i smjeru odgovora.Geni koji kodiraju proteine ​​slične SAM22 pokazali su dosljednu i značajnu indukciju u ranim vremenskim točkama (6 ili 12 hpi) i općenito nisu reagirali na kraju eksperimenta (48 hpi), dok su proteini slični MLP-u pokazali koordinaciju na 6 hpi.hpi.83A:476 i Mandelup na 48 hp/in, gotovo sve druge podatkovne točke nisu reagirale.Osim toga, razlike u profilima ekspresije proteinskih gena sličnih SAM22 pratile su uočenu varijabilnost u otpornosti na antraknozu, budući da su otpornije linije imale više vremenskih točaka koje značajno induciraju te gene nego osjetljiviji geni.Još jedan PR-10 gen sličan LlR18A/B pokazao je vrlo sličan uzorak ekspresije proteinskom genu sličnom SAM22.
Identificirane su glavne komponente pojma biološkog procesa "GO:0006952 obrambeni odgovor" i obrasci ekspresije gena kandidata za alele Lanr1 i AnMan.Ljestvica Log2 predstavlja log2 vrijednosti (promjena puta) između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobiven iz polja lupina, Wizhenica, Poljska, 1999.) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka u istoj vremenskoj točki.Analizirane su sljedeće linije uskolisne lupine: 83A:476 (otporna, nosi homozigotni alel Lanr1), Boregine (otporna, nepoznata genetska pozadina), Mandelup (umjereno otporna, nosi homozigotni alel AnMan) i populacija 22660 (osjetljiva).
Osim toga, procijenjeni su profili ekspresije gena kandidata za RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) i AnMan (TanjilG_12861) (slika 3).Gen TanjilG_05042 pokazao je značajan odgovor (aktivaciju) na 83A:476 samo u prvoj vremenskoj točki (6 hpi), dok je TanjilG_12861 bio značajan u Mandeloopu samo u dvije vremenske točke: 6 hpi (niža regulacija) i 24 hpi (6 hpi).S.).podesivo) ).
Geni s najvećom ekspresijom u pojmu GO:0055114 “redoks proces” bili su geni koji kodiraju proteine ​​citokroma P450 i peroksidazu (slika 4).Za uzorke izolirane iz 83A:476 na 6 HPI, maksimalne ili minimalne log2 (fold change) vrijednosti (za 86,6% gena) općenito su opažene između inokuliranih i kontrolnih biljaka, naglašavajući visoku reakciju ovog genotipa na inokulirani spol.83A:476 pokazao je najznačajniji GO: 0055114 DEG na 6 hpi (503 gena), dok su ostale linije na 48 hpi (Boregine, 31 gen; Mandelup, 85 gena; i populacija 22660, 78 gena)).U većini gena obitelji GO:0055114 uočena su dva tipa odgovora na cijepljenje (aktivacija i inhibicija).Zanimljivo je da je do 97,6% DEG-ova identificiranih za pojam GO: 0055114 u Mandelupeu na 48 hp. Ova opažanja sugeriraju da je, usprkos znatno manjem opsegu (tj. broj mutiranih redoks gena, 85 naspram 503), obrazac odgovora odgođenog transkriptoma mandeloupa na antraknozu sličan ranom odgovoru 83A:4 76.U Boregineu i Populaciji 22660 ova je konvergencija niža i iznosi 51,6%, odnosno 75,6%.
Otkriveni su obrasci izražavanja glavnih komponenti pojma biološkog procesa “GO:0055114 Redoks proces”.Ljestvica Log2 predstavlja log2 vrijednosti (promjena puta) između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobiven iz polja lupina, Wizhenica, Poljska, 1999.) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka u istoj vremenskoj točki.Analizirane su sljedeće linije uskolisne lupine: 83A:476 (otporna, nosi homozigotni alel Lanr1), Boregine (otporna, nepoznata genetska pozadina), Mandelup (umjereno otporna, nosi homozigotni alel AnMan) i populacija 22660 (osjetljiva).
83A:476 Transkriptomski odgovori na inokulaciju s C. lupini (soj Col-08) također su uključivali koordinirano utišavanje gena pripisano terminu GO:0015979 "fotosinteza" i drugim srodnim biološkim procesima (SLIKA 5).Ovaj skup GO:0015979 DEG sadržavao je 105 gena koji su bili značajno potisnuti na 6 hpi na 83A:476.U ovoj podskupu, 37 gena je također smanjeno u Mandelupu na 48 HPI i 35 u istoj vremenskoj točki u 22660 populaciji, uključujući 19 DEG zajedničkih za oba genotipa.Nijedan DEG povezan s izrazom GO: 0015979 nije značajno aktiviran ni u jednoj kombinaciji (linija x vrijeme).
Otkriveni su obrasci izražavanja glavnih komponenti pojma biološkog procesa "GO:0015979 Fotosinteza".Ljestvica Log2 predstavlja log2 vrijednosti (promjena puta) između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobiven iz polja lupina, Wizhenica, Poljska, 1999.) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka u istoj vremenskoj točki.Analizirane su sljedeće linije uskolisne lupine: 83A:476 (otporna, nosi homozigotni alel Lanr1), Boregine (otporna, nepoznata genetska pozadina), Mandelup (umjereno otporna, nosi homozigotni alel AnMan) i populacija 22660 (osjetljiva).
Na temelju rezultata diferencijalne analize ekspresije i vjerojatno uključenih u obrambene odgovore protiv patogenih gljivica, ovaj skup od sedam gena odabran je za kvantifikaciju profila ekspresije pomoću PCR-a u stvarnom vremenu (dodatna tablica S9).
Pretpostavljeni proteinski gen TanjilG_10657 značajno je induciran u svim proučavanim linijama i vremenskim točkama u usporedbi s kontrolnim (mimičnim) biljkama (dodatne tablice S10, S11).Osim toga, profil ekspresije TanjilG_10657 pokazao je rastući trend tijekom eksperimenta za sve linije.Populacija 22660 pokazala je najveću osjetljivost TanjilG_10657 na inokulaciju sa 114-strukom aktivacijom i najvišom relativnom razinom ekspresije (4,4 ± 0,4) na 24 HPI (Slika 6a).Proteinski gen PR10 LlR18A TanjilG_27015 također je pokazao aktivaciju u svim linijama i vremenskim točkama, sa statističkom značajnošću u većini podatkovnih točaka (slika 6b).Slično TanjilG_10657, najviša relativna razina ekspresije TanjilG_27015 primijećena je u 22660 inokulirane populacije na 24 HPI (19,5 ± 2,4).Gen kiselinske endohitinaze TanjilG_04706 bio je značajno pojačano reguliran u svim linijama iu svim vremenskim točkama osim za Boregine 6 hpi (Slika 6c).Bio je snažno induciran u prvoj vremenskoj točki (6 HPI) na 83A:476 (za 10,5 puta) i umjereno povećan u drugim linijama (za 6,6-7,5 puta).Tijekom eksperimenta, ekspresija TanjilG_04706 ostala je na sličnim razinama u 83A:476 i Boregineu, dok je u Mandelupu i populaciji 22660 značajno porasla, dosegnuvši relativno visoke vrijednosti (5,9 ± 1,5 odnosno 6,2 ± 1,5).Gen TanjilG_23384 sličan endoglukan-1,3-β-glukozidazi pokazao je visoku aktivaciju u prve dvije vremenske točke (6 i 12 hpi) u svim linijama osim u populaciji 22660 (Slika 6d).Najviše relativne razine ekspresije TanjilG_23384 primijećene su u drugoj vremenskoj točki (12 hpi) u Mandelupu (2,7 ± 0,3) i 83A:476 (1,5 ± 0,1).Na 24 HPI, ekspresija TanjilG_23384 bila je relativno niska u svim proučavanim linijama (od 0,04 ± 0,009 do 0,44 ± 0,12).
Profili ekspresije odabranih gena (ag) otkriveni kvantitativnom PCR.Brojevi 6, 12 i 24 predstavljaju sate nakon cijepljenja.Geni LanDExH7 i LanTUB6 korišteni su za normalizaciju, a LanTUB6 za kalibraciju između serija.Trake pogrešaka predstavljaju standardnu ​​devijaciju na temelju tri biološka ponavljanja, od kojih je svaki prosjek triju tehničkih ponavljanja. Statistička značajnost razlika u razinama ekspresije između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobiven 1999. iz polja lupine u Wierzenici, Poljska) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka označene su iznad podatkovnih točaka (*P vrijednost < 0,05, **P vrijednost ≤ 0,01, ***P vrijednost ≤ 0,001). Statistička značajnost razlika u razinama ekspresije između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobiven 1999. iz polja lupine u Wierzenici, Poljska) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka označene su iznad podatkovnih točaka (*P vrijednost < 0,05, **P vrijednost ≤ 0,01, ***P vrijednost ≤ 0,001). Statistička značajnost razlike u razini ekspresije između inokuliranih (Colletotrichum lupini, grm Col-08, dobiveno 1999 g. s polja lupine u Verženicama, Poljska) i kontrolnih (ložno inokuliranih) biljaka označenih nad točkama podataka (*značenje P < 0,05, **značenje P ≤ 0,01, ***značenje P ≤ 0 ,001). Statistički značajne razlike u razinama ekspresije između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobiven 1999. iz polja lupine u Wierzhenicama, Poljska) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka zabilježene su iznad podatkovnih točaka (*P-vrijednost < 0,05, **P-vrijednost ≤ 0,01, ***P-vrijednost ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001)。接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物 之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Statistički značajne razlike u razini ekspresije između inokuliranih (Colletotrichum lupini, stamm Col-08, dobiveno s poljima lupine u Verženicama, Poljska, 1999.) i kontrolnih (ložno inokuliranih) biljaka označenih nad točkama vrijednosti podataka (* P < 0,05, ** P-značenje ≤ 0,01, ***P-značenje ≤ 0,001). Statistički značajne razlike u razinama ekspresije između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobiven iz polja lupine u Verzhenicama, Poljska, 1999.) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka zabilježene su iznad podatkovnih točaka (*P-vrijednost < 0,05, **P-vrijednost ≤ 0,01, ***P-vrijednost ≤ 0,001).Analizirane linije NLL bile su: 83A:476 (otporna, nosi homozigotni alel Lanr1), Mandelup (umjereno otporna, nosi homozigotni alel AnMan), Boregine (otporna, nepoznata genetska podloga) i populacija 22660 (osjetljiva).
Kandidat za gen TanjilG_05042 na lokusu Lanr1 pokazao je znatno drugačiji uzorak ekspresije od profila dobivenih iz studija RNA-seq (slika 6e).Značajna aktivacija ovog gena primijećena je u Mandelupu i populaciji 22660 (do 39,7 odnosno 11,7 puta), što je rezultiralo relativno visokim razinama ekspresije (do 1,4 ± 0,14 odnosno 7,2 ± 1,3).83A:476 također je otkrio određenu regulaciju gena TanjilG_05042 (do 3,8 puta), međutim, postignute relativne razine ekspresije (0,044 ± 0,002) bile su više od 30 puta niže od onih opaženih u Mandelupu i populaciji 22660.analiziran qPCR-om pokazao je značajne razlike u razinama ekspresije između genotipova u lažno cijepljenim (kontrolnim) varijantama, dosegnuvši 58-struku razliku između populacija 22660 i 83A:476, kao i između populacija 22660 i 22660. Dvostruka razlika postignuta je između Boreginea i Mandalupa.
Kandidat gen na AnMan lokusu, TanjilG_12861, aktiviran je kao odgovor na cijepljenje u 83A:476 i Mandelup, bio je neutralan u populaciji 22660, i bio je smanjen u Boregine (Slika 6f).Relativna ekspresija gena TanjilG_12861 bila je najveća u inokuliranom 83A: 476 (0,14±0,01).Gen za protein toplinskog šoka klase I od 17,4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 pokazao je niže relativne razine ekspresije u svim proučavanim sojevima i vremenskim točkama (Slika 6g).Najveća vrijednost primijećena je kod 24 HPI u populaciji od 22660 (0,14 ± 0,02, osmerostruko povećanje odgovora na cijepljenje).
Usporedba profila ekspresije gena (slika 7) otkrila je visoku korelaciju između TanjilG_10657 i četiri druga gena: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) i TanjilG_04706 (r = 0,79).Takvi rezultati mogu ukazivati ​​na koregulaciju ovih gena tijekom obrambenih odgovora.Geni TanjilG_12861 i TanjilG_23384 pokazali su različite profile ekspresije s nižim vrijednostima Pearsonovog koeficijenta korelacije (od 0,08 do 0,43 odnosno -0,19 do 0,28) u usporedbi s drugim genima.
Korelacije između profila ekspresije gena otkrivene su kvantitativnom PCR.Analizirane su sljedeće linije uskolisne vučike: 83A:476 (otporna, nosi homozigotni alel Lanr1), Mandelup (umjereno otporna, nosi homozigotni alel AnMan), Boregine (otporna, nepoznata genetska pozadina) i populacija 22660 (osjetljiva).Izračunate su tri vremenske točke (6, 12 i 24 sata nakon inokulacije), uključujući inokulirane (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobiven iz polja lupine u Wierzhenicama, Poljska, 1999.) i kontrolne (lažno inokulirane) biljke.Ljestvica pokazuje vrijednost Pearsonovog koeficijenta korelacije.
Na temelju podataka dobivenih pri 6 konjskih snaga po inču, WGCNA je izvedena na 9981 DEG identificiranom usporedbom inokuliranih i kontrolnih biljaka kako bi se usredotočili na rane obrambene odgovore (dodatna tablica S12).Pronađena su 22 genska modula (klastera) s koreliranim (pozitivnim ili negativnim) profilima ekspresije između genotipova i eksperimentalnih varijanti. U prosjeku, razine ekspresije gena padale su redom 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (u obje varijante, međutim, ovaj je trend bio jači u kontrolnih biljaka). U prosjeku, razine ekspresije gena padale su redom 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (u obje varijante, međutim, ovaj je trend bio jači u kontrolnih biljaka). U srednjoj razini ekspresije gena smanjile su se u redoslijedu 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (u obje varijante, međutim, ta je tendencija bila silnija u kontrolnim rastenjima). U prosjeku, razine ekspresije gena smanjile su se redoslijedom 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (u obje varijante, međutim, ovaj je trend bio jači u kontrolnih biljaka).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> stanovništvo 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种 在在 植物 中 更）...... U srednjoj razini ekspresije gena smanjile su se u nizu 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (za razliku od ostalih varijanti ova tendencija je bila silnija u kontrolnim rastenjima). U prosjeku, razine ekspresije gena smanjile su se u seriji 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (međutim, u obje varijante, ovaj trend je bio jači u kontrolnim biljkama).Cijepljenje je rezultiralo pojačanom ekspresijom gena, posebno u modulima 18, 19, 14, 6 i 1 (silaznim redoslijedom učinka), negativnom regulacijom (npr. moduli 9 i 20) ili s neutralnim učincima (npr. moduli 11, 22, 8 i 13).Analiza obogaćivanja termina GO (dodatna tablica S13) otkrila je "GO: 0006952 Zaštitne reakcije" za inokulirani modul (18) s maksimalnom aktivacijom, uključujući gene analizirane qPCR-om (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 i TanjilG_27015), kao i mnoge Inokulacije koje su najviše potisnute moduli fotosinteze (9).Koncentrator modula 18 (slika 8) identificiran je kao gen TanjilG_26536 koji kodira protein LlR18B sličan PR-10, a koncentrator modula 9 identificiran je kao gen TanjilG_28955 koji kodira protein fotosustava II PsbQ.Kandidat za gen za otpornost na antraknozu Lanr1, TanjilG_05042, pronađen je u modulu 22 (Slika 9) i povezan je s pojmovima "GO:0044260 Cellular makromolekularni metabolički procesi" i "GO:0006355 Regulacija transkripcije, DNA šablon" koji nosi središte TanjilG_01212.gen kodira faktor transkripcije toplinskog stresa A-4a (HSFA4a).
Ponderirana mrežna analiza koekspresije gena modula s previše zastupljenim terminima bioloških procesa "GO: 0006952 obrambeni odgovori".Ligacija je pojednostavljena kako bi se istaknula četiri gena analizirana qPCR-om (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 i TanjilG_27015).
Ponderirana mrežna analiza ko-ekspresije gena modula s prezastupljenim terminom biološkog procesa "GO: 0006355: regulacija transkripcije, modeliranje DNK" i nosi kandidatski gen otpornosti na antraknozu Lanr1 TanjilG_05042.Ligacija je pojednostavljena kako bi se izolirao gen TanjilG_05042 i središnji gen TanjilG_01212.
Provjera otpornosti na antraknozu prikupljena u Australiji pokazala je da je većina rano puštenih kultivara bila osjetljiva;Kalya, Coromup i Mandelup opisani su kao umjereno otporni, dok su Wonga, Tanjil i 83A:476 opisani kao visoko otporni26,27,31.imao je isti alel otpornosti, označen Lanr1, a Coromup i Mandelup imali su drugačiji alel, označen AnMan10, 26, 39, dok je Kalya prenijela drugačiji alel., Lanr2.Probir za otpornost na antraknozu u Njemačkoj rezultirao je identifikacijom otporne linije Bo7212 s kandidatskim alelom koji nije Lanr1, označen kao LanrBo36.
Naša je studija otkrila vrlo nisku učestalost (oko 6%) alela Lanr1 u testiranoj germplazmi.Ovo zapažanje je u skladu s rezultatima probira istočnoeuropske germplazme pomoću markera Anseq3 i Anseq4, koji su pokazali da je alel Lanr1 prisutan u samo dvije bjeloruske linije.Ovo sugerira da se alel Lanr1 još ne koristi naširoko u lokalnim programima uzgoja, za razliku od Australije, gdje je to jedan od ključnih alela za uzgoj uz pomoć markera.To može biti posljedica niže razine otpornosti koju pruža alel Lanr1 u europskim terenskim uvjetima u usporedbi s australskim izvješćem.Nadalje, studije o antraknozi u područjima s velikom količinom oborina u Australiji pokazale su da reakcije otpornosti posredovane alelom Lanr1 možda neće biti učinkovite u vremenskim uvjetima koji pogoduju rastu i brzom razvoju patogena19,42.Zapravo, u ovoj studiji, neki simptomi antraknoze također su primijećeni u genotipovima koji nose alel Lanr1, što sugerira da otpornost može nestati pod optimalnim uvjetima za razvoj C. lupini.Osim toga, moguće su lažno pozitivne interpretacije prisutnosti Anseq3 i Anseq4 markera, koji su približno 1 cM od Lanr1 lokusa 28,30,43.
Naše je istraživanje pokazalo da je 83A:476, koji nosi alel Lanr1, odgovorio na inokulaciju C. lupini reprogramiranjem transkriptoma velikih razmjera u prvoj analiziranoj vremenskoj točki (6 hpi), dok su kod Mandelupa, koji nosi alel AnMan, transkriptomski odgovori uočeni mnogo kasnije.(od 24 do 48 KS).Ove vremenske varijacije u obrambenim odgovorima povezane su s razlikama u simptomima bolesti, naglašavajući važnost ranog prepoznavanja patogena za uspješan odgovor na otpornost.Da bi zarazile biljno tkivo, spore antraksa moraju proći kroz nekoliko razvojnih faza na površini domaćina, uključujući klijanje, diobu stanica i formiranje apresorija.Dodatak je infektivna struktura koja se pričvršćuje na površinu domaćina i olakšava prodiranje u tkiva domaćina.Tako su spore C. gloeosporioides u ekstraktu graška pokazale prvu diobu jezgre nakon 75-90 minuta inkubacije, formiranje klicine cijevi nakon 90-120 minuta i suzbijanje nakon 4 sata 45 .Mango C. gloeosporioides pokazao je više od 40% klijanja konidija nakon 3 sata inkubacije i oko 20% formiranja apresora nakon 4 sata.Gen CAP20 povezan s virulencijom C. gloeosporioides pokazao je transkripcijsku aktivnost u konidijama koje stvaraju epifite nakon 3,5 h inkubacije u površinskom vosku avokada s visokim koncentracijama proteina CAP20 nakon 4 h 46 min.Slično, aktivnost gena biosinteze melanina u C. trifolii inducirana je tijekom 2-satne inkubacije nakon čega je uslijedilo stvaranje apresorija nakon 1 sata.Istraživanja lisnog tkiva pokazala su da jagode inokulirane s C. acutatum imaju prvo suzbijanje na 8 hpi, dok rajčice inokulirane s C. coccodes imaju prvo suzbijanje na 4 hpi48,49.uglavnom u skladu s vremenskom skalom Colletotrichum spp.infektivni proces.Brzi obrambeni odgovori na 83A:476 sugeriraju uključenost gena otpornosti biljaka i imuniteta izazvanog efektorom (ETI) u ovoj liniji, dok Mandelupovi odgođeni odgovori podržavaju hipotezu imuniteta izazvanog mikro-povezanim molekularnim uzorkom (MTI) 50. Rani odgovori na 83A: 476 i Mandelup.Djelomično preklapanje između gore ili dolje reguliranih gena u odgođenom odgovoru također podupire ovaj koncept, budući da se ETI često smatra ubrzanim i pojačanim MTI odgovorom koji kulminira programiranom staničnom smrću na mjestu infekcije, poznatom kao anafilaktički šok 51,52.
Većina gena koji se pripisuju prezastupljenom pojmu Gene Ontology GO:0006952 "Obrambeni odgovor" su 11 homologa proteina poruka 22 o postu izazvanom stresom (slično SAM22) i sedam glavnih proteina sličnih lateksu (MLP).-slični proteini 31, 34, 43 i 423 pokazali su sličnost sekvence.Geni slični SAM22 pokazali su značajnu aktivaciju koja je trajala dulje, pokazujući povećane razine otpornosti na antraknozu (83A:476 i Boregine).Međutim, geni slični MLP-u bili su smanjeni samo u linijama koje nose alel kandidata za otpornost (83A:476/Lanr1 na 6 hpi i Mandelup/AnMan na 24 hpi).Treba napomenuti da svi identificirani homolozi slični SAM22 potječu iz klastera gena koji se prostire na približno 105 kb, dok geni slični MLP potječu iz zasebnih regija genoma.Koordinirana aktivacija takvih gena sličnih SAM22 također je pronađena u našoj prethodnoj studiji otpornosti NLL na inokulaciju Diaporthetoxica, sugerirajući da su uključeni u horizontalne komponente obrambenog odgovora.Ovaj zaključak podupiru i izvješća o pozitivnom odgovoru gena sličnih SAM22 na ozljedu ili liječenje salicilnom kiselinom, induktorima gljivica ili vodikovim peroksidom.
Pokazalo se da geni slični MLP-u reagiraju na različite abiotičke i biotičke stresove, uključujući bakterijske, virusne i patogene gljivične infekcije u mnogim biljnim vrstama55.Smjerovi odgovora na određene interakcije između biljaka i patogena kretali su se od snažnog porasta (tj. tijekom infestacije pamuka s Verticillium dahliae) do značajnog pada (tj. nakon infekcije stabla jabuke s Alternaria spp.)56,57.Značajno smanjenje gena 423 sličnog MLP-u primijećeno je tijekom obrane avokada od infekcije F. niger i tijekom infekcije stabla jabuke Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola i Alternaria alternata su patotipovi jabuke58,59.Osim toga, jabučni kalusi koji prekomjerno izražavaju gen 423 sličan MLP-u imali su nižu ekspresiju gena povezanih s otpornošću i bili su osjetljiviji na gljivične infekcije59.Nakon Fusarium oxysporum f, gen 423 sličan MLP-u također je bio potisnut u otpornoj germplazmi običnog graha.cn.Infekcija graha 60.
Ostali članovi obitelji PR-10 identificirani u našoj RNA-seq studiji bili su geni LlR18A i LlR18B kao odgovor na pojačanu regulaciju, kao i pojačano regulirani (1 gen) ili smanjeno (3 gena) gen za protein prijenosa lipida DIR1..Osim toga, WGCNA ističe gen LlR18B kao središte u ovom modulu, koji je vrlo osjetljiv na cijepljenje i nosi nekoliko gena zaštitnog odgovora.Geni LlR18A i LlR18B inducirani su u lišću žute lupine kao odgovor na patogene bakterije, kao i u NLL stabljikama nakon inokulacije D. toxica, dok je rižin homolog ovih gena, RSOsPR10, brzo induciran gljivičnom infekcijom koja je vjerojatno uključena u signalni put jasmonske kiseline53,61,62. Gen DIR1 kodira nespecifične li pid transportne proteine ​​koji su potrebni za nastanak sistemske stečene rezistencije (SAR).S razvojem zaštitnih reakcija, protein DIR1 se prenosi iz žarišta infekcije kroz floem kako bi inducirao SAR u udaljenim organima.Zanimljivo je da je gen TanjilG_02313 DIR1 značajno induciran u prvoj vremenskoj točki u linijama 84A:476 i populaciji 22660, ali se otpornost na antraknozu uspješno razvila samo u liniji 84A:476.Ovo može ukazivati ​​na neku subfunkcionalizaciju gena DIR1 u NLL, budući da su preostala tri homologa odgovorila na inokulaciju samo u liniji 83A:476 pri 6 hpi, a taj je odgovor bio usmjeren prema dolje.
U našem istraživanju, najčešće komponente koje odgovaraju biološkom procesu pod nazivom "GO:0055114 Redoks proces" bile su protein citokroma P450, peroksidaza, 9S-/13S-lipoksigenaza linolne kiseline i oksidaza 1-aminociklopropan-1-karboksilne kiseline.Osim toga, naš WGCNA definira homolog HSFA4a kao čvorište koje nosi module kao što je Lanr1 kandidat za gen otpornosti TanjilG_05042.HSFA4a je komponenta redoks-ovisne regulacije nuklearne transkripcije u biljkama.
Proteini citokroma P450 su oksidoreduktaze koje kataliziraju reakcije hidroksilacije ovisne o NADPH i/ili O2 u primarnom i sekundarnom metabolizmu, uključujući metabolizam ksenobiotika, kao i hormona, masnih kiselina, sterola, komponenti stanične stijenke, biopolimera i biosinteze zaštitnih spojeva 69. U našoj studiji, varijabilnost u funkciji biljnog citokroma P450 smanjena je s -1 0,6 log2 (kratka promjena) na 5,7 zbog velikog broja promijenjenih homologa (37) i razlika u obrascima odgovora između specifičnih gena, što odražava reviziju prema gore..Korištenje samo RNA-seq podataka za rasvjetljavanje navodne biološke funkcije NLL gena u tako velikoj superobitelji proteina bilo bi vrlo spekulativno.Međutim, valja napomenuti da su neki geni citokroma P450 povezani s povećanom otpornošću na patogene gljivice ili bakterije, uključujući doprinos alergijskim reakcijama69,70,71.
Peroksidaze klase III višenamjenski su biljni enzimi uključeni u širok raspon metaboličkih procesa tijekom rasta i razvoja biljke, kao i kao odgovor na okolišne stresove kao što su slanost, suša, visoki intenzitet svjetlosti i napad patogena72.Peroksidaze su uključene u interakciju nekoliko biljnih vrsta s Anthracisom, uključujući Stylosanthes humilis i C. gloeosporioides, Lens culinaris i C. truncatum, Phaseolus vulgaris i C. lindemuthianum, Cucumis sativus i C. lagenarium73,74,75,76.Odgovor je vrlo brz, ponekad čak i na 4 HPI, prije nego što gljiva prodre u biljno tkivo73.Gen peroksidaze također je reagirao na inokulaciju D. toxica NLL.Uz njihove tipične funkcije reguliranja oksidativnog pucanja ili uklanjanja oksidativnog stresa, peroksidaze mogu ometati rast patogena stvaranjem fizičkih barijera na temelju ojačanja stanične stijenke tijekom lignifikacije, podjedinice ili unakrsnog povezivanja specifičnih spojeva.Ova se funkcija in silico može pripisati genu TanjilG_03329 koji kodira navodnu anionsku peroksidazu koja stvara lignin, a koja je u našoj studiji značajno pojačana u liniji otpornoj na 83A:476 na 6 HPI, ali ne i u drugim sojevima i vremenskim točkama koje nisu odgovorile.
9S-/13S-lipoksigenaza linolne kiseline je prvi korak u oksidativnom putu biosinteze lipida78.Produkti ovog puta imaju višestruke funkcije u obrani biljaka, uključujući jačanje stanične stijenke stvaranjem naslaga kaloze i pektina te regulaciju oksidativnog stresa proizvodnjom reaktivnih vrsta kisika79,80,81,82,83.U ovoj studiji, ekspresija 9S-/13S-lipoksigenaze linolne kiseline je promijenjena u svim sojevima, ali u osjetljivoj populaciji 22660, pojačana regulacija je prevladavala u različitim vremenskim točkama, dok u sojevima koji nose otporni Lanr1 i AnMan alel, to naglašava diverzifikaciju oksilipinskog sloja u zaštitnim reakcijama antraksa između ovih genotipova.
Homolog 1-aminociklopropan-1-karboksilat oksidaze (ACO) bio je značajno pojačan (9 gena) ili smanjen (2 gena) kada je inokuliran lupinom.Uz dvije iznimke, svi ovi odgovori dogodili su se pri 6 KS.na 83A:476.Enzimska reakcija posredovana ACO proteinima korak je koji ograničava brzinu u proizvodnji etilena i stoga je visoko regulirana84.Etilen je biljni hormon koji igra različite uloge u regulaciji razvoja biljaka i odgovora na abiotičke i biotičke stresne uvjete.Indukcija ACO transkripcije i aktivacija etilenskog signalnog puta uključeni su u povećanje otpornosti riže na hemibiotrofnu gljivu oryzae oryzae reguliranjem proizvodnje reaktivnih kisikovih vrsta i fitoaleksina.Vrlo sličan proces infekcije lišća pronađen između M. oryzae i C. lupini88,89, u pozadini značajne regulacije ACO homologa u liniji 83A:476 o kojoj je izvješteno u ovoj studiji, pomiče mogućnost davanja otpornosti na NLL antraknozu Etilen kao signalni središnji korak u molekularnim putovima.
U ovoj studiji, uočena je velika supresija mnogih gena povezanih s fotosintezom na 6 hpi u 83A:476 i na 48 hpi u Mandeloopu i populaciji 22660.Opseg i progresija ovih promjena proporcionalna je razini.U ovom pokusu opažena je otpornost na antraknozu.Nedavno je zabilježeno snažno i rano potiskivanje transkripata povezanih s fotosintezom u nekoliko modela interakcija biljaka i patogena, uključujući patogene bakterije i gljive.Žurba (od 2 HPI u nekim interakcijama) i globalna supresija gena povezanih s fotosintezom kao odgovor na infekciju mogu potaknuti biljnu imunost na temelju razvoja reaktivnih vrsta kisika i njihove interakcije s putem salicilne kiseline za posredovanje alergijskih reakcija 90,94.
U zaključku, mehanizmi obrambenog odgovora predloženi za najotporniju liniju (83A:476) uključuju brzo prepoznavanje patogena genom R (vjerojatno TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) i signaliziranje salicilne kiseline i etilena posredovano alergijskim odgovorom, nakon čega slijedi uspostavljanje SAR dugog dometa.djelovanje je podržano proteinom DIR-1.Treba napomenuti da je biotrofno razdoblje za infekciju C. lupini vrlo kratko (otprilike 2 dana), nakon čega slijedi nekrotični rast95.Prijelaz između ovih stadija može biti povezan s nekrozom i ekspresijom proteina inducibilnih etilenom koji djeluju kao okidači za reakcije preosjetljivosti u biljkama domaćinima.Stoga je vremenski okvir za uspješno hvatanje C. lupini u biotrofnom stadiju vrlo uzak.Reprogramiranje gena povezanih s redoksom i fotosintezom opaženo u 83A:476 na 6 hpi je u skladu s napredovanjem gljivičnih hifa i najavljuje razvoj uspješnog zaštitnog odgovora u biotrofnom stadiju.Transkriptomski odgovori Mandelupa i populacije 22660 mogu biti previše odgođeni da bi uhvatili gljivicu prije prelaska na nekrotični rast, međutim, Mandelup može biti učinkovitiji od populacije 22660 jer relativno brza regulacija proteina PR-10 potiče horizontalnu otpornost.
Čini se da je ETI, vođen kanonskim R genom, uobičajeni mehanizam otpornosti graha na antraknozu.Dakle, u modelu mahunarke Medicago truncatula, otpornost na antraknozu daje gen RCT1, član TIR-NBS-LRR97 klase biljnih R gena.Ovaj gen također daje otpornost na antraknozu širokog spektra kod lucerne kada se prenese na osjetljive biljke.U običnom grahu (P. vulgaris) do danas je identificirano više od dva tuceta gena otpornosti na antraknozu.Neki od ovih gena nalaze se u regijama u kojima nedostaju nikakvi kanonski R geni, međutim mnogi drugi su smješteni na rubovima kromosoma koji nose klaster NBS-LRR gena, uključujući TIR-NBS-LRRs99.SSR studija na cijelom genomu također je potvrdila povezanost gena NBS-LRR s otpornošću na antraknozu u običnom grahu.Kanonski gen R također je pronađen u genomskoj regiji koja nosi glavni lokus otpornosti na antraknozu u bijeloj lupini 101.
Naš rad pokazuje da neposredna reakcija otpornosti, aktivirana u ranoj fazi infekcije biljke (po mogućnosti najkasnije 12 hpi), učinkovito štiti uskolisnu lupinu od antraknoze koju uzrokuje patogena gljiva Collelotrichum lupini.Koristeći sekvencioniranje visoke propusnosti, pokazali smo profile diferencijalne ekspresije gena otpornosti na antraknozu u biljkama NLL posredovane genima otpornosti Lanr1 i AnMan.Uspješna obrana uključuje pažljivo dizajniranje gena za proteine ​​uključene u redoks, fotosintezu i patogenezu unutar nekoliko sati nakon prvog kontakta biljke s patogenom.Slične zaštitne reakcije, ali vremenski odgođene, mnogo su manje učinkovite u zaštiti biljaka od bolesti.Otpornost na antraks posredovana genom Lanr1 nalikuje tipičnom brzom odgovoru gena R (imunitet potaknut efektorom), dok gen AnMan najvjerojatnije pruža horizontalni odgovor (imunitet potaknut molekularnim uzorkom povezanim s mikrobom), pružajući umjerenu razinu održivosti.
215 NLL linija korištenih za probir markera antraknoze sastojalo se od 74 kultivara, 60 linija dobivenih križanjem ili uzgojem, 5 mutanata i 76 divljih ili originalnih germplazmi.Linije su dolazile iz 17 zemalja, uglavnom iz Poljske (58), Španjolske (47), Njemačke (27), Australije (26), Rusije (19), Bjelorusije (7), Italije (5) i drugih linija.iz 10 zemalja.Set također uključuje referentne otporne linije: 83A:476, Tanjil, Wonga koja nosi alel Lanr1 i Mandelup koja nosi alel AnMan.Linije su dobivene iz Europske baze podataka o genetskim resursima lupina koju održava Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Poljska (dodatna tablica S1).
Biljke su uzgajane u kontroliranim uvjetima (fotoperiod 16 sati, temperatura 25°C danju i 18°C ​​noću).Analizirana su dva biološka replika.DNK je izolirana iz tri tjedna starih listova pomoću DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Njemačka) prema protokolu.Kvaliteta i koncentracija izolirane DNA procijenjena je spektrofotometrijskim metodama (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD).Analizirani su markeri AnManM1 koji označavaju gen otpornosti na antraknozu AnMan (izveden iz sorte Mandelup) i markeri Anseq3 i Anseq4 koji prate gen Lanr1 (izveden iz sorte Tanjil) 11,26,28.Homozigoti za rezistentni alel ocijenjeni su kao „1″, osjetljivi – kao „0″, a heterozigoti – kao 0,5.
Na temelju rezultata pregleda za markere AnManM1, AnSeq3 i AnSeq4 i dostupnosti sjemena za konačne pokuse praćenja, odabrano je 50 NLL linija za fenotipiziranje otpornosti na antraknozu.Analiza je provedena u duplikatu u računalno kontroliranom stakleniku s 14-satnim fotoperiodom s temperaturnim rasponom od 22°C danju i 19°C noću.Sjeme se prije sjetve izgrebe (oštrom oštricom odreže sjemenka na suprotnoj strani zametka) kako bi se spriječilo dormantnost sjemena zbog pretvrde ovojnice i kako bi se osiguralo ravnomjerno klijanje.Biljke su uzgajane u posudama (11 × 11 × 21 cm) sa sterilnom zemljom (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varšava, Poljska).Inokulacija je provedena sojem Colletotrichum lupini Col-08, uzgojenim 1999. iz stabljika uskolisne vučike uzgojene u polju u Verzhenici, Velikoj Poljskoj (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E).Dobiti područje.Izolati su uzgajani u SNA mediju na 20°C pod crnim svjetlom 21 dan da se izazove sporulacija.Četiri tjedna nakon sjetve, kada su biljke dosegle fazu 4-6 listova, inokulacija je provedena prskanjem suspenzijom konidija u koncentraciji od 0,5 x 106 konidija po ml.Nakon inokulacije, biljke su držane u mraku 24 sata pri vlažnosti od oko 98% i temperaturi od 25°C kako bi se olakšalo klijanje konidija i proces infekcije.Biljke su zatim uzgajane pod 14-satnim fotoperiodom na 22°C danju/19°C noću i 70% vlažnosti.Ocjena bolesti napravljena je 22 dana nakon inokulacije i kretala se od 0 (imuno) do 9 (vrlo osjetljivo) ovisno o prisutnosti ili odsutnosti nekrotičnih lezija na stabljici i lišću.Osim toga, nakon bodovanja, izmjerena je težina biljaka.Odnosi između genotipova markera i fenotipova bolesti izračunati su kao točkaste dvosekvencijske korelacije (odsutnost heterozigotnih markera u skupu linija za analizu fenotipa otpornosti na antraknozu).