Hvala što ste posjetili Nature.com.Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Postoji potreba za pouzdanim in vitro sustavom koji može točno reproducirati fiziološko okruženje srca za testiranje lijekova.Ograničena dostupnost sustava kulture ljudskog srčanog tkiva dovela je do netočnih tumačenja učinaka lijekova na srce.Ovdje smo razvili model kulture srčanog tkiva (CTCM) koji elektromehanički stimulira rezove srca i podvrgava se fiziološkom istezanju tijekom sistoličke i dijastoličke faze srčanog ciklusa.Nakon 12 dana kulture, ovaj je pristup djelomično poboljšao održivost srčanih dijelova, ali nije u potpunosti očuvao njihov strukturni integritet.Stoga smo, nakon skrininga malih molekula, otkrili da je dodatak 100 nM trijodtironina (T3) i 1 μM deksametazona (Dex) našem mediju održao mikrostrukturu rezova 12 dana.U kombinaciji s tretmanom T3/Dex, CTCM sustav održavao je transkripcijske profile, vitalnost, metaboličku aktivnost i strukturni integritet na istoj razini kao svježe srčano tkivo tijekom 12 dana.Osim toga, prekomjerno rastezanje srčanog tkiva u kulturi izaziva hipertrofično srčano signaliziranje, pružajući dokaze o sposobnosti CTCM da oponaša hipertrofična stanja izazvana srčanim rastezanjem.Zaključno, CTCM može modelirati fiziologiju i patofiziologiju srca u kulturi tijekom dugih vremenskih razdoblja, omogućujući pouzdani probir lijekova.
Prije kliničkog istraživanja potrebni su pouzdani in vitro sustavi koji mogu točno reproducirati fiziološko okruženje ljudskog srca.Takvi bi sustavi trebali oponašati promijenjeno mehaničko rastezanje, broj otkucaja srca i elektrofiziološka svojstva.Životinjski modeli obično se koriste kao platforma za probir srčane fiziologije s ograničenom pouzdanošću u odražavanju učinaka lijekova na ljudsko srce1,2.U konačnici, eksperimentalni model idealne kulture srčanog tkiva (CTCM) je model koji je vrlo osjetljiv i specifičan za različite terapijske i farmakološke intervencije, točno reproducirajući fiziologiju i patofiziologiju ljudskog srca3.Nepostojanje takvog sustava ograničava otkrivanje novih tretmana zatajenja srca4,5 i dovelo je do kardiotoksičnosti lijeka kao glavnog razloga za izlazak s tržišta6.
Tijekom prošlog desetljeća osam nekardiovaskularnih lijekova povučeno je iz kliničke uporabe jer uzrokuju produljenje QT intervala što dovodi do ventrikularnih aritmija i iznenadne smrti7.Stoga postoji sve veća potreba za pouzdanim pretkliničkim strategijama probira za procjenu kardiovaskularne učinkovitosti i toksičnosti.Nedavna uporaba pluripotentnih kardiomiocita izvedenih iz matičnih stanica (hiPS-CM) u probiru lijekova i testiranju toksičnosti djelomično je rješenje za ovaj problem.Međutim, nezrela priroda hiPS-CM i nedostatak višestanične složenosti srčanog tkiva glavna su ograničenja ove metode.Nedavne studije su pokazale da se ovo ograničenje može djelomično prevladati korištenjem ranog hiPS-CM za formiranje hidrogelova srčanog tkiva nedugo nakon početka spontanih kontrakcija i postupnim povećanjem električne stimulacije tijekom vremena.Međutim, ovim hiPS-CM mikrotkivima nedostaju zrela elektrofiziološka i kontraktilna svojstva miokarda odrasle osobe.Osim toga, ljudsko srčano tkivo ima složeniju strukturu, sastoji se od heterogene mješavine različitih tipova stanica, uključujući endotelne stanice, neurone i stromalne fibroblaste, međusobno povezane specifičnim skupovima proteina izvanstaničnog matriksa.Ova heterogenost nekardiomiocitnih populacija11,12,13 u srcu odraslih sisavaca glavna je prepreka modeliranju srčanog tkiva korištenjem pojedinačnih tipova stanica.Ova glavna ograničenja naglašavaju važnost razvoja metoda za uzgoj intaktnog miokardijalnog tkiva u fiziološkim i patološkim uvjetima.
Uzgajani tanki (300 µm) dijelovi ljudskog srca pokazali su se kao obećavajući model intaktnog ljudskog miokarda.Ova metoda omogućuje pristup kompletnom 3D višestaničnom sustavu sličnom tkivu ljudskog srca.Međutim, do 2019. upotreba uzgojenih presjeka srca bila je ograničena kratkim (24 h) preživljavanjem kulture.To je zbog brojnih čimbenika uključujući nedostatak fizičko-mehaničkog istezanja, sučelje zrak-tekućina i korištenje jednostavnih medija koji ne podržavaju potrebe srčanog tkiva.U 2019. nekoliko je istraživačkih skupina pokazalo da ugradnja mehaničkih čimbenika u sustave kulture srčanog tkiva može produžiti život kulture, poboljšati srčanu ekspresiju i oponašati srčanu patologiju.Dvije elegantne studije 17 i 18 pokazuju da jednoosno mehaničko opterećenje ima pozitivan učinak na srčani fenotip tijekom kulture.Međutim, ove studije nisu koristile dinamičko trodimenzionalno fizikalno-mehaničko opterećenje srčanog ciklusa, budući da su dijelovi srca bili opterećeni ili izometrijskim vlačnim silama 17 ili linearnim auksotoničnim opterećenjem 18 .Ove metode rastezanja tkiva rezultirale su potiskivanjem mnogih srčanih gena ili prekomjernom ekspresijom gena povezanih s abnormalnim odgovorima na rastezanje.Posebno, Pitoulis et al.19 razvili su dinamičnu kupku za kulturu presjeka srca za rekonstrukciju srčanog ciklusa koristeći povratnu informaciju pretvarača sile i pogone napetosti.Iako ovaj sustav omogućuje točnije in vitro modeliranje srčanog ciklusa, složenost i niska propusnost metode ograničavaju primjenu ovog sustava.Naš je laboratorij nedavno razvio pojednostavljeni sustav kulture koji koristi električnu stimulaciju i optimizirani medij za održavanje održivosti dijelova tkiva svinjskog i ljudskog srca do 6 dana20,21.
U trenutnom rukopisu opisujemo model kulture srčanog tkiva (CTCM) koristeći dijelove svinjskog srca koji uključuje humoralne znakove za rekapitulaciju trodimenzionalne srčane fiziologije i patofiziološke distenzije tijekom srčanog ciklusa.Ovaj CTCM može povećati točnost pretkliničkog predviđanja lijekova na razinu nikad prije postignutu pružanjem isplativog srčanog sustava srednjeg protoka koji oponaša fiziologiju/patofiziologiju srca sisavaca za pretkliničko testiranje lijekova.
Hemodinamski mehanički signali igraju ključnu ulogu u održavanju funkcije kardiomiocita in vitro 22,23,24.U trenutnom rukopisu razvili smo CTCM (Slika 1a) koji može oponašati srčano okruženje odrasle osobe inducirajući i električnu i mehaničku stimulaciju na fiziološkim frekvencijama (1,2 Hz, 72 otkucaja u minuti).Kako bi se izbjeglo prekomjerno rastezanje tkiva tijekom dijastole, korišten je uređaj za 3D ispis kako bi se veličina tkiva povećala za 25% (slika 1b).Električni stimulator induciran sustavom C-PACE tempiran je tako da započne 100 ms prije sistole pomoću sustava za prikupljanje podataka za potpunu reprodukciju srčanog ciklusa.Sustav kulture tkiva koristi programabilni pneumatski aktuator (LB Engineering, Njemačka) za cikličko širenje fleksibilne silikonske membrane kako bi se izazvalo širenje kriški srca u gornjoj komori.Sustav je bio spojen na vanjski zračni vod preko pretvarača tlaka, što je omogućilo precizno podešavanje tlaka (± 1 mmHg) i vremena (± 1 ms) (Sl. 1c).
a Pričvrstite dio tkiva na potporni prsten od 7 mm, prikazan plavom bojom, unutar komore za kulturu uređaja.Komora za kulturu odvojena je od zračne komore tankom fleksibilnom silikonskom membranom.Postavite brtvu između svake komore kako biste spriječili curenje.Poklopac uređaja sadrži grafitne elektrode koje omogućuju električnu stimulaciju.b Shematski prikaz uređaja za veliko tkivo, prstena za vođenje i prstena za potporu.Dijelovi tkiva (smeđi) postavljaju se na preveliki uređaj s prstenom za vođenje postavljenim u utor na vanjskom rubu uređaja.Pomoću vodilice pažljivo postavite potporni prsten obložen akrilnim ljepilom za tkivo preko dijela srčanog tkiva.c Grafikon koji prikazuje vrijeme električne stimulacije kao funkciju tlaka u zračnoj komori kojim upravlja programabilni pneumatski aktuator (PPD).Uređaj za prikupljanje podataka korišten je za sinkronizaciju električne stimulacije pomoću senzora tlaka.Kada tlak u komori za kulturu dosegne postavljeni prag, pulsni signal se šalje u C-PACE-EM kako bi se pokrenula električna stimulacija.d Slika četiri CTCM postavljena na policu inkubatora.Četiri uređaja su spojena na jedan PPD preko pneumatskog kruga, a senzori tlaka su umetnuti u hemostatski ventil za praćenje tlaka u pneumatskom krugu.Svaki uređaj sadrži šest dijelova tkiva.
Koristeći jedan pneumatski aktuator, mogli smo kontrolirati 4 CTCM uređaja, od kojih je svaki mogao držati 6 presjeka tkiva (slika 1d).U CTCM-u, tlak zraka u zračnoj komori pretvara se u sinkroni tlak u komori s tekućinom i izaziva fiziološko širenje presjeka srca (Slika 2a i Dodatni film 1).Procjena istezanja tkiva na 80 mm Hg.Umjetnost.pokazala je rastezanje presjeka tkiva za 25% (slika 2b).Pokazalo se da ovaj postotak istezanja odgovara fiziološkoj duljini sarkomera od 2,2–2,3 µm za normalnu kontraktilnost srčanog dijela17,19,25.Kretanje tkiva procijenjeno je pomoću prilagođenih postavki kamere (dodatna slika 1).Amplituda i brzina kretanja tkiva (Slika 2c, d) odgovarala je istezanju tijekom srčanog ciklusa i vremenu tijekom sistole i dijastole (Slika 2b).Rastezanje i brzina srčanog tkiva tijekom kontrakcije i opuštanja ostali su konstantni 12 dana u kulturi (slika 2f).Kako bismo procijenili učinak električne stimulacije na kontraktilnost tijekom kulture, razvili smo metodu za određivanje aktivne deformacije pomoću algoritma sjenčanja (dodatna slika 2a,b) i uspjeli smo razlikovati deformacije sa i bez električne stimulacije.Isti presjek srca (sl. 2f).U pomičnom području reza (R6-9) voltaža tijekom električne stimulacije bila je 20% viša nego u odsutnosti električne stimulacije, što ukazuje na doprinos električne stimulacije kontraktilnoj funkciji.
Reprezentativni tragovi mjerenja tlaka u zračnoj komori, tlaka u komori s tekućinom i kretanja tkiva potvrđuju da tlak u komori mijenja tlak u komori s tekućinom, uzrokujući odgovarajuće pomicanje presjeka tkiva.b Reprezentativni tragovi postotka istezanja (plavo) dijelova tkiva koji odgovaraju postotku rastezanja (narančasto).c Izmjereno kretanje srčanog presjeka u skladu je s izmjerenom brzinom gibanja.(d) Reprezentativne putanje cikličnog kretanja (plava linija) i brzine (narančasta točkasta linija) u presjeku srca.e Kvantifikacija vremena ciklusa (n = 19 rezova po skupini, od različitih svinja), vremena kontrakcije (n = 19 rezova po skupini), vremena opuštanja (n = 19 rezova po skupini, od različitih svinja), kretanja tkiva (n = 25).rezovi)/skupina iz različitih svinja), vršna sistolička brzina (n = 24(D0), 25(D12) rezova/skupina iz različitih svinja) i vršna stopa opuštanja (n=24(D0), 25(D12) rezova/skupina iz različitih svinja).Dvostrani Studentov t-test nije pokazao značajnu razliku ni u jednom parametru.f Reprezentativni tragovi analize naprezanja presjeka tkiva s (crveno) i bez (plavo) električne stimulacije, deset regionalnih područja isječaka tkiva iz istog presjeka.Donje ploče prikazuju kvantifikaciju postotka razlike u napetosti u dijelovima tkiva sa i bez električne stimulacije u deset područja iz različitih odjeljaka. (n = 8 kriški/skupini od različitih svinja, proveden je Studentov t-test s dva repa; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 kriški/skupini od različitih svinja, proveden je Studentov t-test s dva repa; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 rezova/skupina od različitih svinja, provodi se dvostrani t-kriterij Stjudenta; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 dijelova/skupina od različitih svinja, dvostrani Studentov t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 (n = 8 rezova/skupina, od različitih svinja, dvostrani kriterij Stjudenta; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 odjeljaka/skupina, od različitih svinja, dvostrani Studentov t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Stupci pogrešaka predstavljaju srednju vrijednost ± standardna devijacija.
U našem prethodnom statičkom biomimetičkom sustavu kulture reza srca [20, 21] održavali smo održivost, funkciju i strukturni integritet reza srca 6 dana primjenom električne stimulacije i optimiziranjem sastava medija.Međutim, nakon 10 dana te su brojke naglo pale.Pozvat ćemo se na dijelove uzgojene u našem prethodnom sustavu statične biomimetičke kulture 20, 21 kontrolnim uvjetima (Ctrl) i koristit ćemo naš prethodno optimizirani medij kao MC uvjete i kulturu pod istovremenom mehaničkom i električnom stimulacijom (CTCM).nazvao .Prvo smo utvrdili da je mehanička stimulacija bez električne stimulacije bila nedovoljna za održavanje vitalnosti tkiva tijekom 6 dana (dodatna slika 3a,b).Zanimljivo, uvođenjem fizikalno-mehaničke i električne stimulacije pomoću STCM-a, održivost 12-dnevnih srčanih presjeka ostala je ista kao u svježim srčanim presjecima u MS uvjetima, ali ne i u Ctrl uvjetima, kao što je prikazano MTT analizom (slika 1).3a).Ovo sugerira da mehanička stimulacija i simulacija srčanog ciklusa mogu održati presjeke tkiva održivim dvostruko duže nego što je navedeno u našem prethodnom sustavu statične kulture.Međutim, procjena strukturnog integriteta dijelova tkiva imunološkim označavanjem srčanog troponina T i koneksina 43 pokazala je da je ekspresija koneksina 43 bila značajno viša u MC tkivima 12. dana nego u kontrolama istog dana.Međutim, jednolika ekspresija konneksina 43 i formiranje Z-diska nisu u potpunosti održani (slika 3b).Koristimo okvir umjetne inteligencije (AI) za kvantificiranje strukturnog integriteta tkiva26, cjevovod dubokog učenja temeljen na slikama koji se temelji na bojanju troponina-T i koneksina43 za automatsko kvantificiranje strukturnog integriteta i fluorescencije presjeka srca u smislu snage lokalizacije.Ova metoda koristi konvolucionarnu neuronsku mrežu (CNN) i okvir dubokog učenja za pouzdano kvantificiranje strukturnog integriteta srčanog tkiva na automatiziran i nepristran način, kao što je opisano u referenci.26. MC tkivo pokazalo je poboljšanu strukturnu sličnost s danom 0 u usporedbi sa statičkim kontrolnim presjecima.Osim toga, Massonovo trikromno bojenje otkrilo je značajno niži postotak fibroze u MS uvjetima u usporedbi s kontrolnim uvjetima 12. dana kulture (Slika 3c).Iako je CTCM povećao održivost presjeka srčanog tkiva 12. dana na razinu sličnu onoj svježeg srčanog tkiva, nije značajno poboljšao strukturni integritet isječaka srca.
trakasti grafikon prikazuje kvantifikaciju održivosti MTT svježih kriški srca (D0) ili kulture kriški srca tijekom 12 dana bilo u statičkoj kulturi (D12 Ctrl) ili u CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) rezova/skupina iz različitih svinja, izvodi se jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u usporedbi s D0 i **p < 0,01 u usporedbi s D12 Ctrl). stupčasti grafikon prikazuje kvantifikaciju MTT održivosti svježih kriški srca (D0) ili kulture kriški srca tijekom 12 dana bilo u statičkoj kulturi (D12 Ctrl) ili u CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) rezova/skupina iz različitih svinja, izvodi se jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u usporedbi na D0 i **p < 0,01 u usporedbi s D12 Ctrl).histogram prikazuje kvantifikaciju održivosti MTT svježih presjeka srca (D0) ili kulture isječaka srca tijekom 12 dana bilo u statičkoj kulturi (D12 kontrola) ili CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrola). ), 12 (D12 MC) sekcija/skupina iz različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test;####p < 0,0001 u usporedbi s D0 i **p < 0,01 u usporedbi s D12 Ctrl). ####p < 0,0001 u usporedbi s D0 i **p < 0,01 u usporedbi s D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) 或心脏切片培养12天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001 ，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)histogram koji prikazuje kvantifikaciju održivosti MTT u svježim presjecima srca (D0) ili isječcima srca uzgojenim 12 dana u statičkoj kulturi (D12 kontrola) ili CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrola)), 12 (D12 MC) sekcija/skupina različitih svinja, jednosmjerni ANOVA test;####p < 0,0001 u usporedbi s D0, **p < 0,01 u usporedbi s D12 Ctrl). ####p < 0,0001 u usporedbi s D0, **p < 0,01 u usporedbi s D12 Ctrl).b Troponin-T (zeleno), koneksin 43 (crveno) i DAPI (plavo) u svježe izoliranim presjecima srca (D0) ili isječcima srca uzgajanim u statičkim uvjetima (Ctrl) ili uvjetima CTCM (MC) tijekom 12 dana) reprezentativnih imunofluorescentnih slika (prazna skala = 100 µm). Kvantifikacija strukturalnog integriteta srčanog tkiva pomoću umjetne inteligencije (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezova/skupina od svake različite svinje, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u usporedbi s D0 i ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). Kvantifikacija strukturne cjelovitosti srčanog tkiva pomoću umjetne inteligencije (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezova/skupina svaki od različitih svinja, provodi se jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u usporedbi s D0 i ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). Količestvena procjena strukturne cjelosti srčanog tkiva vještačkog intelekta (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezova/grupa različitih svinja, provodi se jednofaktorski test ANOVA; ####p < 0,0001 u usporedbi s D0 i ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva pomoću umjetne inteligencije (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) presjeka/skupina iz različitih svinja, proveden jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u odnosu na D0 i ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezova/skupina svake različite svinje, jednosmjerni ANOVA test;####p < 0,0001 与D0 相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) kriški/skupina svake od različitih svinja, jednosmjerni ANOVA test;####p < 0,0001 与D0相比， ****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Iskusni intelekt za količinsku ocjenu strukturne cjelovitosti srčanog tkiva (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezova/skupina svake od različitih svinja, odnosni test ANOVA; ####p <0,0001 naspram D0 Za sravnjenja ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). Umjetna inteligencija za kvantificiranje strukturnog integriteta srčanog tkiva (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) odjeljaka/skupina za svaku od različitih svinja, jednosmjerni ANOVA test; ####p<0,0001 naspram .D0 Za usporedbu ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (lijevo) i kvantifikacija (desno) za rezove srca obojene Massonovom trikromnom bojom (Scale bare = 500 µm) (n = 10 rezova/skupina svaka od različite svinje, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u usporedbi s D0 i ***p < 0,001 u usporedbi s D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (lijevo) i kvantifikacija (desno) za rezove srca obojene Massonovom trikromnom bojom (Scale bare = 500 µm) (n = 10 rezova/skupina svaka od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; #### p < 0,0001 u usporedbi s D0 i ***p < 0,001 u usporedbi s D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (udio) i količinska procjena (isprava) rez srca, ukrašen trokromnim krasiteljem Massona (mašina bez pokrivanja = 500 mkm) (n = 10 rezova/grupa od različitih svinja, provodi se odnosni test ANOVA; #### p < 0,0001 u usporedbi s D0 i ***p < 0,001 u usporedbi s D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (lijevo) i kvantifikacija (desno) presjeka srca obojenih Massonovom trikromnom bojom (ljestvica bez premaza = 500 µm) (n = 10 isječaka/skupina različitih svinja, proveden jednosmjerni ANOVA test; #### p < 0,0001 u usporedbi s D0 i ***p < 0,001 u usporedbi s D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比） . C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001 与D0相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Reprezentativne slike (udio) i kvantitativna analiza (uzorak) sreza srca, ukrašenog trikromnim krasiteljem Massona (čista skala = 500 mkm) (n = 10 sreza/grupa, svaka od druge svinje, testirano pomoću jednofaktorne disperzijske analize ;### #p < 0,0001 u usporedbi s D0, ***p < 0,001 u usporedbi s D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (lijevo) i kvantifikacija (desno) presjeka srca obojenih Massonovom trikromnom bojom (prazno = 500 µm) (n = 10 isječaka/skupina, svaki od različite svinje, testirano jednosmjernom analizom varijance; ### # p < 0,0001 u usporedbi s D0, ***p < 0,001 u usporedbi s D12 Ctrl).Stupci pogrešaka predstavljaju srednju vrijednost ± standardna devijacija.
Pretpostavili smo da bi se dodavanjem malih molekula u medij kulture, integritet kardiomiocita mogao poboljšati i razvoj fibroze smanjiti tijekom CTCM kulture.Stoga smo pregledali male molekule koristeći naše statičke kontrolne kulture20,21 zbog malog broja zbunjujućih čimbenika.Za ovaj pregled odabrani su deksametazon (Dex), trijodtironin (T3) i SB431542 (SB).Ove male molekule prethodno su korištene u kulturama hiPSC-CM za induciranje sazrijevanja kardiomiocita povećanjem duljine sarkomera, T-tubula i brzine provođenja.Osim toga, poznato je da i Dex (glukokortikoid) i SB suzbijaju upalu29,30.Stoga smo testirali hoće li uključivanje jedne ili kombinacije ovih malih molekula poboljšati strukturni integritet dijelova srca.Za početni pregled, doza svakog spoja je odabrana na temelju koncentracija koje se obično koriste u modelima stanične kulture (1 μM Dex27, 100 nM T327 i 2,5 μM SB31).Nakon 12 dana kulture, kombinacija T3 i Dex rezultirala je optimalnim strukturnim integritetom kardiomiocita i minimalnim fibroznim remodeliranjem (dodatne slike 4 i 5).Osim toga, korištenje dvostrukih ili dvostrukih koncentracija T3 i Dexa proizvelo je štetne učinke u usporedbi s normalnim koncentracijama (dodatna slika 6a,b).
Nakon početnog pregleda, izvršili smo izravnu usporedbu 4 uvjeta kulture (Slika 4a): Ctrl: dijelovi srca uzgojeni u našoj prethodno opisanoj statičkoj kulturi korištenjem našeg optimiziranog medija;20.21 TD: T3 i Ctrl su dodali Dex u srijedu;MC: presjeci srca uzgojeni u CTCM koristeći naš prethodno optimizirani medij;i MT: CTCM s T3 i Dex dodanim u medij.Nakon 12 dana uzgoja, održivost MS i MT tkiva ostala je ista kao u svježim tkivima procijenjenim MTT testom (Slika 4b).Zanimljivo je da dodavanje T3 i Dex transwell kulturama (TD) nije rezultiralo značajnim poboljšanjem održivosti u usporedbi s Ctrl uvjetima, što ukazuje na važnu ulogu mehaničke stimulacije u održavanju održivosti srčanih dijelova.
Dijagram eksperimentalnog dizajna koji prikazuje četiri uvjeta kulture korištena za procjenu učinaka mehaničke stimulacije i dodatka T3/Dex na medij tijekom 12 dana. b Stupčasti grafikon prikazuje kvantifikaciju održivosti 12 dana nakon kulture u sva 4 uvjeta kulture (Ctrl, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim kriškama srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) rezova/skupina različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 , ###p < 0,001 u usporedbi s D0 i **p < 0,01 u usporedbi s D12 Ctrl). b Stupčasti grafikon prikazuje kvantifikaciju održivosti 12 dana nakon kulture u sva 4 uvjeta kulture (Ctrl, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim kriškama srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) rezova/skupina različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 , ###p < 0,001 u usporedbi s D0 i **p < 0,01 u usporedbi s D12 ctrl). b Gistogram pokazuje umjerenu ocjenu sposobnosti rada kroz 12 dana nakon kultiviranja u sva 4 uvjeta kultiviranja (kontrola, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim rezovima srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) rezova/grupa od različitih svinja, proveden je odnostoronjski test ANOVA ; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 u usporedbi s D0 i **p < 0,01 u usporedbi s D12 Ctrl). b Stupčasti grafikon prikazuje kvantifikaciju održivosti 12 dana nakon kulture u sva 4 uvjeta kulture (kontrola, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim dijelovima srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) odjeljaka/skupina različitih svinja, jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0 001, ###p < 0,001 u odnosu na D0 i **p < 0,01 u usporedbi s D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D12) MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001，###p < 0,001 与D0 相比，**p < 0,01与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Gistogram, koji pokazuje sva 4 uvjeta kultiviranja (kontrola, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim rezovima srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), od različitih svinja 12 (D12 MC) srez/grupa, odnostoronjski test ANOVA; ####p <0,0001, ###p < 0,001 u usporedbi s D0, **p <0,01 u usporedbi s kontrolom D12). b Histogram koji prikazuje sva 4 uvjeta kulture (kontrola, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim dijelovima srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), iz različitih svinja 12 (D12 MC) odjeljaka/skupina, jednosmjerni ANOVA test; ####p<0,0001, ###p<0,001 naspram D0 , **p<0,01 u odnosu na kontrolu D12). c Stupčasti grafikon prikazuje kvantifikaciju protoka glukoze 12 dana nakon kulture u sva 4 uvjeta kulture (Ctrl, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim rezovima srca (D0) (n = 6 rezova/skupina iz različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ###p < 0,001, u usporedbi s D0 i ***p < 0,001 u usporedbi s D12 Ctrl). c Stupčasti grafikon prikazuje kvantifikaciju protoka glukoze 12 dana nakon kulture u sva 4 uvjeta kulture (Ctrl, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim rezovima srca (D0) (n = 6 rezova/skupina iz različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ###p < 0,001, u usporedbi s D0 i ***p < 0,001 u usporedbi s D12 Ctrl). c Gistogram pokazuje količinsku ocjenu protoka glukoze kroz 12 dana nakon kultiviranja u sva 4 uvjeta kultiviranja (kontrola, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim rezovima srca (D0) (n = 6 rezova/skupina od različitih svinja, jednostrani Izvodi se test ANOVA; ###p < 0,001 u usporedbi s D0 i ***p < 0,001 u usporedbi s D12 Ctrl). c Histogram pokazuje kvantifikaciju protoka glukoze 12 dana nakon uzgoja pod sva 4 uvjeta kulture (kontrola, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim dijelovima srca (D0) (n = 6 odjeljaka/skupina iz različitih svinja, proveden jednosmjerni ANOVA test; ###p < 0,001 u usporedbi s D0 i ***p < 0,001 u usporedbi s D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12 天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ， 培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Gistogram, koji pokazuje kvantitetnu ocjenu protoka glukoze kroz 12 dana nakon kultiviranja za sva 4 uvjeta kultiviranja (kontrola, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim rezovima srca (D0) (n = 6 rezova/grupa, od različitih svinja, jednostrani Proveden je ANOVA test; ###p < 0,001 u usporedbi s D0, ***p < 0,001 u usporedbi s D12 (kontrola). c Histogram koji prikazuje kvantifikaciju protoka glukoze 12 dana nakon uzgoja za sva 4 uvjeta kulture (kontrola, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim dijelovima srca (D0) (n = 6 odjeljaka/skupina, od različitih svinja, jednostrano. Kad su provedeni ANOVA testovi, ###p < 0,001 u usporedbi s D0, ***p < 0,001 u usporedbi s D12 (kontrola).d Dijagrami analize soja svježeg (plavo), tkiva 12. dana MC (zeleno) i 12. dana MT (crveno) tkiva na deset regionalnih točaka presjeka tkiva (n = 4 kriške po skupini, jednosmjerni ANOVA test; nije bilo značajne razlike između skupina).e Dijagram vulkana koji prikazuje različito izražene gene u svježim presjecima srca (D0) u usporedbi s isječcima srca uzgojenim u statičkim uvjetima (Ctrl) ili pod uvjetima MT (MT) tijekom 10-12 dana.f Toplinska karta gena sarkomera za dijelove srca uzgojene pod svakim od uvjeta kulture.Stupci pogrešaka predstavljaju srednju vrijednost ± standardna devijacija.
Metabolička ovisnost o prijelazu s oksidacije masnih kiselina na glikolizu obilježje je dediferencijacije kardiomiocita.Nezreli kardiomiociti prvenstveno koriste glukozu za proizvodnju ATP-a i imaju hipoplastične mitohondrije s nekoliko krista5,32.Analize iskorištenja glukoze pokazale su da je u uvjetima MC i MT iskorištenje glukoze bilo slično onome u tkivima 0. dana (Slika 4c).Međutim, Ctrl uzorci pokazali su značajno povećanje iskorištenja glukoze u usporedbi sa svježim tkivom.Ovo ukazuje na to da kombinacija CTCM i T3/Dex povećava vitalnost tkiva i čuva metabolički fenotip 12-dnevno uzgojenih srčanih dijelova.Osim toga, analiza soja je pokazala da su razine soja ostale iste kao u svježem srčanom tkivu 12 dana u uvjetima MT i MS (Slika 4d).
Kako bismo analizirali ukupni utjecaj CTCM-a i T3/Dex-a na globalni transkripcijski krajolik srčanog tkiva, izveli smo RNAseq na srčanim rezovima iz sva četiri različita uvjeta kulture (Dodatni podaci 1).Zanimljivo je da su MT sekcije pokazale visoku transkripcijsku sličnost sa svježim srčanim tkivom, sa samo 16 različito izraženih od 13.642 gena.Međutim, kao što smo ranije pokazali, Ctrl rezovi prikazali su 1229 različito izraženih gena nakon 10-12 dana u kulturi (slika 4e).Ovi su podaci potvrđeni qRT-PCR-om gena srca i fibroblasta (dodatna slika 7a-c).Zanimljivo je da su Ctrl dijelovi pokazali smanjenu regulaciju gena srčanog i staničnog ciklusa i aktivaciju upalnih genskih programa.Ovi podaci sugeriraju da je dediferencijacija, koja se normalno događa nakon dugotrajnog uzgoja, potpuno oslabljena u MT uvjetima (dodatna slika 8a,b).Pažljivo proučavanje gena sarkomera pokazalo je da su samo pod MT uvjetima geni koji kodiraju sarkomere (Slika 4f) i ionski kanal (Dodatna slika 9) sačuvani, štiteći ih od supresije u uvjetima Ctrl, TD i MC.Ovi podaci pokazuju da s kombinacijom mehaničke i humoralne stimulacije (T3/Dex), transkriptom srčanog presjeka može ostati sličan svježim srčanim rezovima nakon 12 dana u kulturi.
Ove transkripcijske nalaze podupire činjenica da je strukturni integritet kardiomiocita u dijelovima srca najbolje očuvan u MT uvjetima tijekom 12 dana, kao što je prikazano intaktnim i lokaliziranim koneksinom 43 (slika 5a).Osim toga, fibroza u dijelovima srca u uvjetima MT bila je značajno smanjena u usporedbi s Ctrl i slično kao i na svježim dijelovima srca (slika 5b).Ovi podaci pokazuju da kombinacija mehaničke stimulacije i T3/Dex tretmana učinkovito čuva strukturu srca u dijelovima srca u kulturi.
a Reprezentativne imunofluorescentne slike troponina-T (zeleno), koneksina 43 (crveno) i DAPI (plavo) u svježe izoliranim presjecima srca (D0) ili uzgojene tijekom 12 dana u sva četiri uvjeta kulture isječaka srca (ljestvica = 100 µm).). Kvantifikacija strukturalnog integriteta srčanog tkiva pomoću umjetne inteligencije (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) rezova/skupina različitih svinja, provodi se jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u usporedbi s D0 i *p < 0,05, ili ****p < 0,0001 u usporedbi s D 12 Ctrl). Kvantifikacija strukturne cjelovitosti srčanog tkiva pomoću umjetne inteligencije (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) rezova/skupina različitih svinja, provodi se jednosmjerni ANOVA test; #### p < 0,0001 u usporedbi s D0 i *p < 0,05, ili ****p < 0,0001 u usporedbi s D 12 Ctrl). Količestvena procjena strukturne cjelovitosti tkiva srca uz pomoć umjetnog intelekta (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) rezova/grupa od različitih svinja, proveden jednofaktorski test ANOVA; #### p < 0,0001 u usporedbi s D0 i *p < 0,05 ili ****p < 0,0001 u usporedbi s D1 2 Ctrl). Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva korištenjem umjetne inteligencije (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) presjeka/skupina iz različitih svinja, proveden jednosmjerni ANOVA test; #### p < 0,0001 u usporedbi s D0 i *p < 0,05 ili ****p < 0,0001 u usporedbi s D1 2 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） 人工智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl相比）。Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva korištenjem umjetne inteligencije u različitih svinja (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) odjeljaka/skupina) s jednosmjernim ANOVA testom;#### p < 0,0001 u usporedbi s D0 i *p < 0,05 ili ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). #### p < 0,0001 u usporedbi s D0 i *p < 0,05 ili ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). b Reprezentativne slike i kvantifikacija za rezove srca obojene Massonovom trikromnom bojom (skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) rezova/skupina različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u usporedbi s D0 i ***p < 0,001, ili ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). b Reprezentativne slike i kvantifikacija za rezove srca obojene Massonovom trikromnom bojom (skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) rezova/skupina različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u usporedbi s D0 i ***p < 0,001, ili ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). b Reprezentativne slike i kvantitativna procjena rezova srca, ukrašenog trikromnim krasiteljem Massona (masovna linija = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) rezova/skupina od različitih svinja, provodi se odnosnostrani test ANOVA; ####p < 0,0001 u usporedbi s D0 i ***p < 0,001 ili ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). b Reprezentativne slike i kvantifikacija presjeka srca obojenih Massonovom trikromnom bojom (ljestvica = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) presjeka/skupina različitih svinja, provedena jednosmjerna ANOVA; ####p < 0,0001 naspram D0 i ***p < 0,00 1 ili ****p < 0,0001 naspram D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 mason 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001 与D0 相比， ***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Reprezentativne slike i kvantitativna procjena rezova srca, ukrašenih trikromom Massona (mašinska linija = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) rezova od različitih svinja/grupa, jedan način ANOVA; ####p < 0,0001 u usporedbi s D0, ***p < 0, 001 ili ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). b Reprezentativne slike i kvantifikacija presjeka srca obojenih Massonovim trikromom (ljestvica = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) isječaka različitih svinja/grupe, jedna ANOVA metoda; ####p < 0,0001 u usporedbi s D0, ***p < 0,001 ili ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl).Stupci pogrešaka predstavljaju srednju vrijednost ± standardna devijacija.
Konačno, sposobnost CTCM-a da oponaša srčanu hipertrofiju procijenjena je povećanjem istezanja srčanog tkiva.U CTCM-u, vršni tlak u zračnoj komori porastao je s 80 mmHg na 80 mmHg.Umjetnost.(normalno istezanje) do 140 mmHg Art.(Slika 6a).To odgovara povećanju istezanja od 32% (Slika 6b), što je prethodno prikazano kao odgovarajući postotak istezanja potrebnog za dijelove srca da postignu duljinu sarkomera sličnu onoj viđenoj kod hipertrofije.Rastezanje i brzina srčanog tkiva tijekom kontrakcije i opuštanja ostali su konstantni tijekom šest dana kulture (slika 6c).Srčano tkivo iz stanja MT bilo je podvrgnuto normalnom istezanju (MT (Normalno)) ili uvjetima prenaprezanja (MT (OS)) tijekom šest dana.Već nakon četiri dana u kulturi, hipertrofični biomarker NT-ProBNP bio je značajno povišen u mediju pod MT (OS) uvjetima u usporedbi s MT (normalnim) uvjetima (slika 7a).Osim toga, nakon šest dana uzgoja, veličina stanica u MT (OS) (Slika 7b) značajno se povećala u usporedbi s dijelovima MT srca (normalno).Osim toga, nuklearna translokacija NFATC4 značajno je povećana u prenapregnutim tkivima (Slika 7c).Ovi rezultati pokazuju progresivni razvoj patološkog preoblikovanja nakon hiperdistenzije i podržavaju koncept da se CTCM uređaj može koristiti kao platforma za proučavanje signalizacije srčane hipertrofije izazvane rastezanjem.
Reprezentativni tragovi mjerenja tlaka u zračnoj komori, tlaka u komori s tekućinom i kretanja tkiva potvrđuju da tlak u komori mijenja tlak u komori s tekućinom, uzrokujući odgovarajuće pomicanje presjeka tkiva.b Reprezentativne krivulje postotka istezanja i stope istezanja za normalno rastegnute (narančasto) i prenapeto (plavo) dijelove tkiva.c Stupčasti grafikon koji prikazuje vrijeme ciklusa (n = 19 rezova po skupini, od različitih svinja), vrijeme kontrakcije (n = 18-19 rezova po skupini, od različitih svinja), vrijeme opuštanja (n = 19 rezova po skupini, od različitih svinja)), amplitudu kretanja tkiva (n = 14 rezova po skupini, iz različitih svinja), vršnu sistoličku brzinu (n = 14 rezova po skupini, iz različitih svinja) i vršno opuštanje stopa acije (n = 14 (D0), 15 (D6) ) odjeljaka/skupina) iz različitih svinja), dvostrani Studentov t-test nije pokazao značajnu razliku ni u jednom parametru, što ukazuje da su ti parametri ostali konstantni tijekom 6 dana kulture s prenaponom.Stupci pogrešaka predstavljaju srednju vrijednost ± standardna devijacija.
Kvantifikacija koncentracije NT-ProBNP u stupčastom grafu u mediju kulture iz rezova srca uzgojenih u uvjetima MT normalnog istezanja (Norm) ili prekomjernog rastezanja (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4 MTOS) rezova/skupina iz različitih svinja, provedena je dvosmjerna ANOVA; **p < 0,01 u usporedbi s normalnim rastezanjem). Kvantifikacija koncentracije NT-ProBNP u stupčastom grafu u mediju kulture iz rezova srca uzgojenih u uvjetima MT normalnog istezanja (Norm) ili prekomjernog rastezanja (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4 MTOS) rezova/skupina iz različitih svinja, izvedena je dvosmjerna ANOVA; **p < 0,01 u usporedbi s normalnim rastezanjem).Kvantitativni histogram koncentracije NT-ProBNP u mediju kulture iz rezova srca uzgojenih u uvjetima normalnog istezanja MT (norma) ili prekomjernog istezanja (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4).MTOS) rezova/skupina iz različitih svinja, provedena je dvofaktorska analiza varijance;**p < 0,01 u usporedbi s normalnim rastezanjem). **p < 0,01 u usporedbi s normalnim istezanjem). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01）. a Kvantifikacija koncentracije NT-ProBNP u rezovima srca uzgojenim u uvjetima MT normalnog istezanja (Norm) ili prekomjernog rastezanja (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) iz različitih 猪的切片/组，可以双向方方发发动; **u usporedbi s normalnim rastezanjem, p < 0,01).histogram Kvantifikacija koncentracija NT-ProBNP u rezovima srca uzgojenim u uvjetima normalnog istezanja MT (norma) ili prekomjernog istezanja (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) i D4 MTOS) rezova/skupina različitih svinja, dvosmjerna analiza varijance;**p < 0,01 u usporedbi s normalnim rastezanjem). **p < 0,01 u usporedbi s normalnim istezanjem). b Reprezentativne slike za rezove srca obojene troponinom-T i WGA (lijevo) i kvantificiranje veličine stanica (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) stanica/skupina iz 10 različitih rezova različitih svinja, izveden je Studentov t-test s dva repa; ****p < 0,0001 u usporedbi s normalnim rastezanjem). b Reprezentativne slike za rezove srca obojene troponinom-T i WGA (lijevo) i kvantificiranje veličine stanica (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) stanica/skupina iz 10 različitih rezova različitih svinja, proveden je Studentov t-test s dva repa; ****p < 0,0001 u usporedbi s normalnim rastezanjem). b Reprezentativne slike rezova srca, ukrašenih troponinom-T i AZP (slijed) i količinsko određivanje veličine stanica (sprava) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) stanica/skupina od 10 različitih rezova od različitih svinja, dva- provodi hvostov t-kriterij Stjudenta; ****p < 0,0001 u usporedbi s normalnim rastezanjem ). b Reprezentativne slike presjeka srca obojenih troponinom-T i AZP (lijevo) i kvantifikacija veličine stanica (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) stanica/skupina iz 10 različitih presjeka različitih svinja, proveden je dvosmjerni Studentov t-test; ****p < 0,0001 u usporedbi s normalnim sojem). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS ），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）. b Reprezentativne slike presjeka srca obojenih kalkareinom-T i WGA (lijevo) i veličina stanica (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 iz 10 različitih rezova (D6 MTNorm)) Stanice/组，两方法有尾学生t test；u usporedbi s normalnim istezanjem，****p < 0,00 01). b Reprezentativne slike rezova srca, ukrašenih troponinom-T i AZP (udio) i količinska procjena veličine stanica (ispravka) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) od 10 različitih ureza različitih svinja Kletki/grupa, dvostrani kriterij Stjudenta; ****p < 0,0001 u usporedbi s normalnim rastom). b Reprezentativne slike presjeka srca obojenih troponinom-T i AZP (lijevo) i kvantifikacija veličine stanica (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) iz 10 različitih isječaka različitih svinja) Stanice/skupina, dvostrani kriterij Studentov t;****p < 0,0001 u usporedbi s normalnim sojem). c Reprezentativne slike za dan 0 i dan 6 MTOS srčanih rezova imunološki obilježenih za troponin-T i NFATC4 i kvantificiranje translokacije NFATC4 u jezgre CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rezova/skupina iz različitih svinja, proveden je dvostrani Studentov t-test; *p < 0,05). c Reprezentativne slike za dan 0 i dan 6 MTOS srčanih rezova imunološki obilježenih za troponin-T i NFATC4 i kvantificiranje translokacije NFATC4 u jezgre CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rezova/skupina iz različitih svinja, proveden je dvostrani Studentov t-test; *p < 0,05). c Reprezentativne slike za rezove srca 0 i 6 dana MTOS, imunomeficijente za troponin-T i NFATC4, i količinsku ocjenu translokacije NFATC4 u jadra kavernoznih stanica (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rezova/skupina od različitih svinja, ispunjava dvostrani t-kriterij Stjudenta; *p < 0,05). c Reprezentativne slike za presjeke srca na 0 i 6 dana MTOS, imunološki obilježene za troponin-T i NFATC4, i kvantificiranje NFATC4 translokacije u jezgri kavernoznih stanica (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) kriške/skupina iz različitih svinja) proveden dvosmjerni Studentov t-test;*p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Reprezentativne slike kalkanina-T i NFATC4 imunološkog označavanja 第0天和第6天MTOS rezova srca, i NFATC4 iz različitih NFATC4 易位至CM stanične jezgre的količine化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组, 时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Reprezentativne slike rezova srca MTOS na 0 i 6 dana za imunomarkiranje troponinom-T i NFATC4 i količinsku ocjenu translokacije NFATC4 u jadra CM od različitih svinja (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rez/grupa, dva hvostatna t-kriterija Stjudenta; *p < 0,05). c Reprezentativne slike MTOS presjeka srca 0. i 6. dana za imunološko označavanje troponina-T i NFATC4 i kvantifikaciju translokacije NFATC4 u jezgri CM-a iz različitih svinja (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rezova po skupini, dvostrani t-kriterij Studentov; *p < 0,05).Stupci pogrešaka predstavljaju srednju vrijednost ± standardnu ​​devijaciju.
Translacijska kardiovaskularna istraživanja zahtijevaju stanične modele koji točno reproduciraju srčano okruženje.U ovoj studiji razvijen je i karakteriziran CTCM uređaj koji može stimulirati ultratanke dijelove srca.CTCM sustav uključuje fiziološki sinkroniziranu elektromehaničku stimulaciju i obogaćivanje T3 i Dex tekućinom.Kada su dijelovi svinjskog srca bili izloženi ovim čimbenicima, njihova održivost, strukturni integritet, metabolička aktivnost i ekspresija transkripcije ostali su isti kao u svježem srčanom tkivu nakon 12 dana kulture.Osim toga, pretjerano istezanje srčanog tkiva može uzrokovati hipertrofiju srca uzrokovanu hiperekstenzijom.Sve u svemu, ovi rezultati podržavaju kritičnu ulogu fizioloških uvjeta kulture u održavanju normalnog srčanog fenotipa i pružaju platformu za probir lijekova.
Mnogi čimbenici doprinose stvaranju optimalnog okruženja za funkcioniranje i preživljavanje kardiomiocita.Najočitiji od ovih čimbenika povezani su s (1) međustaničnim interakcijama, (2) elektromehaničkom stimulacijom, (3) humoralnim čimbenicima i (4) metaboličkim supstratima.Fiziološke interakcije između stanica zahtijevaju složene trodimenzionalne mreže više tipova stanica koje podržava izvanstanični matriks.Takve složene stanične interakcije teško je rekonstruirati in vitro kokulturom pojedinačnih tipova stanica, ali se lako mogu postići korištenjem organotipske prirode srčanih dijelova.
Mehaničko istezanje i električna stimulacija kardiomiocita kritični su za održavanje srčanog fenotipa33,34,35.Dok se mehanička stimulacija naširoko koristi za hiPSC-CM kondicioniranje i sazrijevanje, nekoliko elegantnih studija nedavno je pokušalo mehaničku stimulaciju srčanih kriški u kulturi korištenjem jednoosnog opterećenja.Ove studije pokazuju da 2D jednoosno mehaničko opterećenje ima pozitivan učinak na fenotip srca tijekom kulture.U tim studijama, dijelovi srca bili su ili opterećeni izometrijskim vlačnim silama17, linearnim auksotoničnim opterećenjem18 ili je srčani ciklus rekreiran pomoću povratne sprege pretvarača sile i pogona napetosti.Međutim, ove metode koriste jednoosno rastezanje tkiva bez optimizacije okoliša, što rezultira potiskivanjem mnogih srčanih gena ili prekomjernom ekspresijom gena povezanih s abnormalnim odgovorima na rastezanje.Ovdje opisani CTCM daje 3D elektromehanički podražaj koji oponaša prirodni srčani ciklus u smislu vremena ciklusa i fiziološkog rastezanja (25% rastezanja, 40% sistole, 60% dijastole i 72 otkucaja u minuti).Iako ova trodimenzionalna mehanička stimulacija sama po sebi nije dovoljna za održavanje cjelovitosti tkiva, kombinacija humoralne i mehaničke stimulacije pomoću T3/Dex potrebna je za adekvatno održavanje vitalnosti, funkcije i cjelovitosti tkiva.
Humoralni čimbenici igraju važnu ulogu u modulaciji fenotipa srca odrasle osobe.To je istaknuto u studijama HiPS-CM u kojima su T3 i Dex dodani u medije kulture kako bi se ubrzalo sazrijevanje stanica.T3 može utjecati na transport aminokiselina, šećera i kalcija kroz stanične membrane36.Osim toga, T3 potiče ekspresiju MHC-α i regulaciju MHC-β naniže, potičući stvaranje miofibrila koji se brzo trzaju u zrelim kardiomiocitima u usporedbi sa miofibrilima koji se sporo trzaju u fetalnom CM-u.Nedostatak T3 u bolesnika s hipotireozom rezultira gubitkom miofibrilarnih vrpci i smanjenom stopom razvoja tonusa37.Dex djeluje na glukokortikoidne receptore i pokazalo se da povećava kontraktilnost miokarda u izoliranim perfuziranim srcima;38 smatra se da je ovo poboljšanje povezano s učinkom na ulazak uzrokovan depozitom kalcija (SOCE) 39,40.Osim toga, Dex se veže na svoje receptore, uzrokujući širok unutarstanični odgovor koji potiskuje imunološku funkciju i upalu30.
Naši rezultati pokazuju da je fizičko-mehanička stimulacija (MS) poboljšala ukupnu izvedbu kulture u usporedbi s Ctrl-om, ali nije uspjela održati održivost, strukturni integritet i srčanu ekspresiju tijekom 12 dana u kulturi.U usporedbi s Ctrl, dodavanje T3 i Dex kulturama CTCM (MT) poboljšalo je održivost i održalo slične profile transkripcije, strukturni integritet i metaboličku aktivnost sa svježim srčanim tkivom tijekom 12 dana.Dodatno, kontroliranjem stupnja istezanja tkiva, pomoću STCM-a stvoren je model srčane hipertrofije izazvan hiperekstenzijom, što ilustrira svestranost STCM sustava.Treba napomenuti da iako pregradnja srca i fibroza obično uključuju intaktne organe čije cirkulirajuće stanice mogu osigurati odgovarajuće citokine kao i fagocitozu i druge čimbenike preoblikovanja, dijelovi srca još uvijek mogu oponašati fibrozni proces kao odgovor na stres i traumu.u miofibroblaste.Ovo je prethodno procijenjeno u ovom modelu srčanog presjeka.Treba napomenuti da se parametri CTCM mogu modulirati promjenom tlaka/električne amplitude i frekvencije kako bi se simulirala mnoga stanja kao što su tahikardija, bradikardija i mehanička potpora cirkulaciji (mehaničko neopterećeno srce).To sustav čini srednjom propusnošću za testiranje lijekova.Sposobnost CTCM-a da modelira hipertrofiju srca izazvanu prenaprezanjem utire put testiranju ovog sustava za personaliziranu terapiju.Zaključno, ova studija pokazuje da su mehaničko rastezanje i humoralna stimulacija kritični za održavanje kulture dijelova srčanog tkiva.
Iako ovdje prikazani podaci sugeriraju da je CTCM platforma koja obećava za modeliranje intaktnog miokarda, ova metoda kulture ima neka ograničenja.Glavno ograničenje CTCM kulture je da nameće stalne dinamičke mehaničke naprezanja na rezove, što onemogućuje mogućnost aktivnog praćenja kontrakcija srčanog rezanja tijekom svakog ciklusa.Osim toga, zbog male veličine srčanih dijelova (7 mm), ograničena je mogućnost procjene sistoličke funkcije izvan sustava kulture pomoću tradicionalnih senzora sile.U trenutnom rukopisu djelomično smo prevladali ovo ograničenje procjenom optičkog napona kao pokazatelja kontraktilne funkcije.Međutim, ovo će ograničenje zahtijevati daljnji rad i moglo bi se riješiti u budućnosti uvođenjem metoda za optičko praćenje funkcije srčanih rezova u kulturi, kao što je optičko mapiranje pomoću kalcija i boja osjetljivih na napon.Još jedno ograničenje CTCM-a je da radni model ne manipulira fiziološkim stresom (preopterećenje i naknadno opterećenje).U CTCM-u, pritisak je induciran u suprotnim smjerovima kako bi se reproduciralo 25% fiziološkog rastezanja u dijastoli (puno rastezanje) i sistoli (duljina kontrakcije tijekom električne stimulacije) u vrlo velikim tkivima.Ovo bi ograničenje trebalo ukloniti u budućim dizajnima CTCM odgovarajućim pritiskom na srčano tkivo s obje strane i primjenom točnih odnosa tlaka i volumena koji se javljaju u srčanim komorama.
Remodeliranje izazvano prekomjernim istezanjem o kojem se izvještava u ovom rukopisu ograničeno je na oponašanje signala hipertrofičnog hiperistezanja.Stoga ovaj model može pomoći u proučavanju hipertrofične signalizacije izazvane rastezanjem bez potrebe za humoralnim ili neuralnim čimbenicima (koji ne postoje u ovom sustavu).Potrebne su daljnje studije kako bi se povećala množina CTCM-a, na primjer, kokultiviranje s imunološkim stanicama, cirkulirajućim humoralnim čimbenicima plazme i inervacijom kada će kokultiviranje s neuronskim stanicama poboljšati mogućnosti modeliranja bolesti s CTCM-om.
U ovoj studiji korišteno je trinaest svinja.Svi postupci na životinjama izvedeni su u skladu s institucionalnim smjernicama i odobrio ih je Odbor za institucionalnu skrb i korištenje životinja Sveučilišta Louisville.Luk aorte je stegnut i srce je perfuzirano s 1 L sterilne kardioplegije (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparina, pH do 7,4); srca su čuvana u ledeno hladnoj kardioplegičkoj otopini do transporta u laboratorij na ledu, što je obično <10 min. srca su čuvana u ledeno hladnoj kardioplegičkoj otopini do transporta u laboratorij na ledu, što je obično <10 min. srca su pohranjena u ledjanom kardioplegijskom rastvoru za prijenos u laboratoriju na ledu, što obično traje <10 min. srca su pohranjena u ledeno hladnoj kardioplegičkoj otopini do transporta u laboratorij na ledu, što obično traje <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Držite srce u ledjanoj kardioplegiji do transporta u laboratoriju na ledu, obično <10 min. Držite srca na ledu kardioplegija do transporta u laboratorij na ledu, obično <10 min.
CTCM uređaj je razvijen u SolidWorks softveru za računalno potpomognuto projektiranje (CAD).Komore za kulturu, pregrade i zračne komore izrađene su od CNC prozirne akrilne plastike.Pomoćni prsten promjera 7 mm izrađen je od polietilena visoke gustoće (HDPE) u sredini i ima utor za o-prsten za smještaj silikonskog o-prstena koji se koristi za brtvljenje medija ispod.Tanka silika membrana odvaja komoru za kulturu od ploče za odvajanje.Silikonska membrana je laserski izrezana iz silikonske ploče debljine 0,02 inča i ima tvrdoću od 35A.Donje i gornje silikonske brtve laserski su izrezane iz silikonske ploče debljine 1/16″ i imaju tvrdoću od 50A.Vijci od nehrđajućeg čelika 316L i krilne matice koriste se za pričvršćivanje bloka i stvaranje hermetičke brtve.
Namjenska tiskana ploča (PCB) dizajnirana je za integraciju sa sustavom C-PACE-EM.Utičnice švicarskog strojnog konektora na tiskanoj ploči spojene su na grafitne elektrode pomoću posrebrenih bakrenih žica i brončanih 0-60 vijaka uvrnutih u elektrode.Tiskana ploča smještena je u poklopac 3D printera.
CTCM uređajem upravlja programabilni pneumatski aktuator (PPD) koji stvara kontrolirani cirkulacijski tlak sličan srčanom ciklusu.Kako se tlak unutar zračne komore povećava, fleksibilna silikonska membrana se širi prema gore, potiskujući medij ispod mjesta tkiva.Područje tkiva tada će se rastegnuti ovim izbacivanjem tekućine, oponašajući fiziološko širenje srca tijekom dijastole.Na vrhuncu relaksacije primijenjena je električna stimulacija preko grafitnih elektroda, što je smanjilo tlak u zračnoj komori i izazvalo kontrakciju dijelova tkiva.Unutar cijevi nalazi se hemostatski ventil sa senzorom tlaka za detekciju tlaka u zračnom sustavu.Tlak koji osjeti senzor tlaka primjenjuje se na sakupljač podataka spojen na prijenosno računalo.To omogućuje kontinuirano praćenje tlaka unutar plinske komore.Kada je postignut maksimalni tlak u komori (standardni 80 mmHg, 140 mmHg OS), uređaju za prikupljanje podataka je naređeno da pošalje signal C-PACE-EM sustavu za generiranje dvofaznog naponskog signala u trajanju od 2 ms, postavljenog na 4 V.
Dobiveni su presjeci srca i uvjeti kulture u 6 jažica su izvedeni kako slijedi: Prebacite sakupljena srca iz posude za prijenos u pladanj koji sadrži hladnu (4°C) kardioplegiju.Lijeva klijetka je izolirana sterilnom oštricom i izrezana na komade od 1-2 cm3.Ti su blokovi tkiva pričvršćeni na nosače tkiva ljepilom za tkivo i stavljeni u vibrirajuću mikrotomsku kupku tkiva koja je sadržavala Tyrodeovu otopinu i kontinuirano oksigenirana (3 g/L 2,3-butandion monooksima (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g).), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukoze (1,86 g), 1 0 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M otopine), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M otopine), do 1 L ddH2O).Vibrirajući mikrotom postavljen je za rezanje kriški debljine 300 µm na frekvenciji od 80 Hz, horizontalnoj amplitudi vibracija od 2 mm i brzini napredovanja od 0,03 mm/s.Kupka tkiva je okružena ledom kako bi se otopina održala hladnom, a temperatura je održavana na 4°C.Prenesite presjeke tkiva iz kupelji mikrotoma u kupelj za inkubaciju koja sadrži kontinuirano oksigeniranu otopinu Tyrode na ledu dok se ne dobije dovoljno sekcija za jednu ploču kulture.Za transwell kulture, sekcije tkiva su pričvršćene na sterilne poliuretanske nosače širine 6 mm i postavljene u 6 ml optimiziranog medija (medij 199, 1x ITS dodatak, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalni i 2X antibiotik-antifungik).Električna stimulacija (10 V, frekvencija 1,2 Hz) primijenjena je na dijelove tkiva kroz C-Pace.Za TD uvjete, svježi T3 i Dex dodani su u koncentraciji od 100 nM i 1 μM pri svakoj promjeni medija.Medij je zasićen kisikom prije zamjene 3 puta dnevno.Sekcije tkiva uzgajane su u inkubatoru na 37°C i 5% CO2.
Za CTCM kulture, presjeci tkiva stavljeni su na prilagođeni 3D printer u Petrijevu zdjelicu koja sadrži modificiranu Tyrodeovu otopinu.Uređaj je dizajniran za povećanje veličine kriške srca za 25% površine potpornog prstena.To se radi kako se dijelovi srca ne bi rastezali nakon prijenosa iz Tyrodeove otopine u medij i tijekom dijastole.Koristeći histoakrilno ljepilo, sekcije debljine 300 µm fiksirane su na potporni prsten promjera 7 mm.Nakon pričvršćivanja dijelova tkiva na potporni prsten, odrežite višak dijelova tkiva i stavite spojene dijelove tkiva natrag u kupku s otopinom Tyrode na ledu (4°C) dok se ne pripremi dovoljno dijelova za jedan uređaj.Ukupno vrijeme obrade za sve uređaje ne smije biti duže od 2 sata.Nakon što je 6 dijelova tkiva pričvršćeno na svoje potporne prstenove, CTCM uređaj je sastavljen.CTCM komora za kulturu je prethodno napunjena s 21 ml prethodno oksigeniranog medija.Prenesite dijelove tkiva u komoru za kulturu i pipetom pažljivo uklonite sve mjehuriće zraka.Dio tkiva se zatim vodi u rupu i nježno pritisne na mjesto.Na kraju, stavite poklopac elektrode na uređaj i prenesite uređaj u inkubator.Zatim spojite CTCM na zračnu cijev i C-PACE-EM sustav.Otvara se pneumatski aktuator i zračni ventil otvara CTCM.Sustav C-PACE-EM konfiguriran je za isporuku 4 V pri 1,2 Hz tijekom bifazičnog stimuliranja tijekom 2 ms.Medij je mijenjan dva puta dnevno, a elektrode su mijenjane jednom dnevno kako bi se izbjeglo nakupljanje grafita na elektrodama.Ako je potrebno, dijelovi tkiva mogu se ukloniti iz njihovih jažica za kulturu kako bi se izbacili svi mjehurići zraka koji su možda pali ispod njih.Za uvjete liječenja MT-om, T3/Dex je dodan svjež sa svakom promjenom medija sa 100 nM T3 i 1 μM Dex.CTCM uređaji uzgajani su u inkubatoru na 37°C i 5% CO2.
Da bi se dobile rastegnute putanje presjeka srca, razvijen je poseban sustav kamera.Korišten je SLR fotoaparat (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) s makro objektivom Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, CA).Vizualizacija je provedena na sobnoj temperaturi nakon zamjene medija svježim medijem.Kamera je postavljena pod kutom od 51°, a video se snima pri 30 sličica u sekundi.Prvo je korišten softver otvorenog koda (MUSCLEMOTION43) sa Image-J za kvantificiranje gibanja presjeka srca.Maska je stvorena korištenjem MATLAB-a (MathWorks, Natick, MA, SAD) za definiranje područja od interesa za otkucaje srca kako bi se izbjegla buka.Ručno segmentirane maske primjenjuju se na sve slike u nizu kadrova i zatim prosljeđuju dodatku MUSCLEMOTION.Muscle Motion koristi prosječni intenzitet piksela u svakom okviru kako bi kvantificirao svoje kretanje u odnosu na referentni okvir.Podaci su snimljeni, filtrirani i korišteni za kvantificiranje vremena ciklusa i procjenu istezanja tkiva tijekom srčanog ciklusa.Snimljeni video je naknadno obrađen pomoću digitalnog filtra nulte faze prvog reda.Kako bi se kvantificiralo rastezanje tkiva (od vrha do vrha), provedena je analiza od vrha do vrha kako bi se razlikovali vrhovi i najniži nivoi u snimljenom signalu.Osim toga, detrending se izvodi pomoću polinoma 6. reda kako bi se eliminirao pomak signala.Programski kod razvijen je u MATLAB-u za određivanje globalnog kretanja tkiva, vremena ciklusa, vremena opuštanja i vremena kontrakcije (Dopunski programski kod 44).
Za analizu naprezanja, korištenjem istih videozapisa stvorenih za procjenu mehaničkog istezanja, prvo smo pratili dvije slike koje predstavljaju vrhunce kretanja (najvišu (gornju) i najnižu (donju) točku kretanja) prema softveru MUSCLEMOTION.Zatim smo segmentirali regije tkiva i primijenili oblik algoritma sjenčanja na segmentirano tkivo (dopunska slika 2a).Segmentirano tkivo je zatim podijeljeno na deset podpovršina, a naprezanje na svakoj površini izračunato je pomoću sljedeće jednadžbe: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, gdje su Sup i Sdown udaljenosti oblika od gornje i donje sjene tkanine, respektivno (dodatna slika .2b).
Presjeci srca su fiksirani u 4% paraformaldehidu 48 sati.Fiksirana tkiva su dehidrirana u 10% i 20% saharozi 1 sat, zatim u 30% saharozi preko noći.Sekcije su zatim umetnute u spoj za optimalnu temperaturu rezanja (OCT spoj) i postupno zamrznute u kupelji izopentan/suhi led.Čuvajte OCT blokove za ugradnju na -80 °C do odvajanja.Stakalca su pripremljena kao rezovi debljine 8 μm.
Za uklanjanje OCT-a sa srčanih presjeka, stakalca zagrijavajte na bloku za grijanje na 95 °C 5 minuta.Dodajte 1 ml PBS-a na svako stakalce i inkubirajte 30 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim prožmite rezove postavljanjem 0,1% Triton-X u PBS-u 15 minuta na sobnoj temperaturi.Kako biste spriječili vezivanje nespecifičnih antitijela na uzorak, dodajte 1 ml 3% otopine BSA na stakalca i inkubirajte 1 sat na sobnoj temperaturi.BSA je zatim uklonjen i stakalca su isprana s PBS.Svaki uzorak označite olovkom.Primarna antitijela (razrijeđena 1:200 u 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) i troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) dodavana su tijekom 90 minuta, zatim sekundarna antitijela (razrijeđena 1:200 u 1% BSA) protiv miša Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), protiv zečjeg Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) dodatnih 90 minuta Isprano 3 puta s PBS-om. Kako bismo razlikovali ciljano bojenje od pozadine, koristili smo samo sekundarno antitijelo kao kontrolu. Na kraju je dodana DAPI nuklearna boja i stakalca su stavljena u vectashield (Vector Laboratories) i zapečaćena lakom za nokte.-x povećanje) i Keyence mikroskop s povećanjem od 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) u koncentraciji od 5 μg/ml u PBS-u upotrijebljen je za bojenje WGA i primijenjen na fiksirane dijelove 30 minuta na sobnoj temperaturi.Stakalca su zatim isprana s PBS-om i sudansko crno je dodano svakom stakalcu i inkubirano 30 minuta.Stakalca su zatim isprana s PBS-om i dodan je medij za ugradnju vectashielda.Stakalca su vizualizirana na Keyence mikroskopu pri 40x povećanju.
OCT je uklonjen iz uzoraka kako je gore opisano.Nakon uklanjanja OCT-a, stakalca uronite u Bouinovu otopinu preko noći.Stakalca su zatim isprana destiliranom vodom 1 sat i zatim stavljena u otopinu Bibrich aloe kiseline fuksina 10 minuta.Zatim su stakalca isprana destiliranom vodom i stavljena u otopinu 5% fosfomolibdena/5% fosfovolframove kiseline na 10 minuta.Bez ispiranja, premjestite stakalca izravno u otopinu anilin plave na 15 minuta.Zatim su stakalca isprana destiliranom vodom i stavljena u 1% otopinu octene kiseline na 2 minute.Stakalca su osušena u 200 N etanolu i prebačena u ksilen.Obojena stakalca vizualizirana su pomoću Keyence mikroskopa s objektivom 10x.Postotak površine fibroze je kvantificiran pomoću softvera Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT test vitalnosti stanica (Invitrogen, Carlsbad, CA), kataloški broj V13154, prema protokolu proizvođača s nekim izmjenama.Posebno je korišten kirurški bušilac promjera 6 mm kako bi se osigurala jednolika veličina tkiva tijekom MTT analize.Tkiva su pojedinačno postavljena u jažice ploče s 12 jažica koja sadrži MTT supstrat prema protokolu proizvođača.Sekcije se inkubiraju na 37°C tijekom 3 sata, a živo tkivo metabolizira MTT supstrat kako bi se stvorio spoj ljubičastog formazana.Zamijenite otopinu MTT s 1 ml DMSO-a i inkubirajte na 37 °C 15 minuta kako biste ekstrahirali ljubičasti formazan iz dijelova srca.Uzorci su razrijeđeni 1:10 u DMSO-u u pločama s prozirnim dnom s 96 jažica i intenzitet ljubičaste boje izmjeren je na 570 nm pomoću čitača ploča Cytation (BioTek).Očitavanja su normalizirana na težinu svakog dijela srca.
Medij presjeka srca zamijenjen je medijem koji sadrži 1 μCi/ml [5-3H]-glukoze (Moravek Biochemicals, Brea, CA, SAD) za ispitivanje iskorištenja glukoze kao što je prethodno opisano.Nakon 4 sata inkubacije, dodajte 100 µl medija u otvorenu epruvetu mikrocentrifuge koja sadrži 100 µl 0,2 N HCl.Zatim je epruveta stavljena u scintilacijsku epruvetu koja sadrži 500 μl dH2O da ispari [3H]2O 72 sata na 37°C.Zatim uklonite epruvetu mikrocentrifuge iz scintilacijske epruvete i dodajte 10 ml scintilacijske tekućine.Scintilacijsko brojanje provedeno je pomoću Tri-Carb 2900TR tekućeg scintilacijskog analizatora (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, SAD).Iskorištenje glukoze je zatim izračunato uzimajući u obzir specifičnu aktivnost [5-3H]-glukoze, nepotpunu ravnotežu i pozadinu, razrjeđenje [5-3H]-u neobilježenu glukozu i učinkovitost scintilacijskog brojača.Podaci su normalizirani na masu dijelova srca.
Nakon homogenizacije tkiva u Trizolu, RNA je izolirana iz dijelova srca pomoću Qiagen miRNeasy Micro Kita #210874 prema protokolu proizvođača.Priprema RNAsec knjižnice, sekvenciranje i analiza podataka provedeni su na sljedeći način:
Kao početni materijal za pripremu biblioteke RNA korišten je 1 μg RNA po uzorku.Biblioteke sekvenciranja generirane su uporabom NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit za Illumina (NEB, SAD) prema preporukama proizvođača, a indeksni kodovi dodani su sekvencama atributa za svaki uzorak.Ukratko, mRNA je pročišćena od ukupne RNA upotrebom magnetskih kuglica pričvršćenih poli-T oligonukleotidima.Fragmentacija se provodi upotrebom dvovalentnih kationa na visokoj temperaturi u NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).Prvi lanac cDNA sintetiziran je korištenjem slučajnih heksamernih početnica i M-MuLV reverzne transkriptaze (RNase H-).Drugi lanac cDNA zatim se sintetizira korištenjem DNA polimeraze I i RNaze H. Preostali rubovi se pretvaraju u tupe krajeve pomoću aktivnosti egzonukleaze/polimeraze.Nakon adenilacije 3′ kraja fragmenta DNA, na njega se pričvršćuje NEBNext adapter sa strukturom petlje ukosnice kako bi se pripremio za hibridizaciju.Za odabir cDNA fragmenata poželjne duljine 150-200 bp.fragmenti biblioteke pročišćeni su pomoću sustava AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, SAD).Zatim je korišteno 3 μl enzima USER (NEB, SAD) s odabranom veličinom cDNA vezanom s adapterom 15 minuta na 37°C, a zatim 5 minuta na 95°C prije PCR-a.Zatim je proveden PCR pomoću Phusion High-Fidelity DNA polimeraze, univerzalnih PCR početnica i Index (X) početnica.Konačno, PCR proizvodi su pročišćeni (AMPure XP sustav), a kvaliteta biblioteke procijenjena na Agilent Bioanalyzer 2100 sustavu.Knjižnica cDNA je zatim sekvencirana korištenjem Novaseq sekvencera.Neobrađene slikovne datoteke iz Illumine pretvorene su u neobrađene očitane pomoću CASAVA Base Callinga.Neobrađeni podaci pohranjuju se u datoteke formata FASTQ(fq) koje sadrže sekvence čitanja i odgovarajuće osnovne kvalitete.Odaberite HISAT2 za podudaranje filtriranih očitavanja sekvenciranja s referentnim genomom Sscrofa11.1.Općenito, HISAT2 podržava genome bilo koje veličine, uključujući genome veće od 4 milijarde baza, a zadane vrijednosti postavljene su za većinu parametara.Spajanje čitanja iz RNA Seq podataka može se učinkovito uskladiti korištenjem HISAT2, najbržeg trenutno dostupnog sustava, s istom ili boljom točnošću od bilo koje druge metode.
Obilje transkripata izravno odražava razinu ekspresije gena.Razine ekspresije gena procjenjuju se obiljem transkripata (broj sekvenciranja) povezanih s genomom ili egzonima.Broj očitavanja proporcionalan je razinama ekspresije gena, duljini gena i dubini sekvenciranja.FPKM (fragmenti na tisuću parova baza transkripta sekvenciranih na milijun parova baza) su izračunati i P-vrijednosti diferencijalne ekspresije određene su korištenjem DESeq2 paketa.Zatim smo izračunali stopu lažnog otkrivanja (FDR) za svaku P vrijednost koristeći Benjamini-Hochberg metodu9 temeljenu na ugrađenoj R-funkciji "p.adjust".
RNA izolirana iz dijelova srca pretvorena je u cDNA u koncentraciji od 200 ng/μl korištenjem SuperScript IV Vilo Master mješavine tvrtke Thermo (Thermo, kat. br. 11756050).Kvantitativna RT-PCR provedena je upotrebom prozirne reakcijske ploče Applied Biosystems Endura Plate Microamp s 384 jažice (Thermo, kat. br. 4483319) i mikroamp optičkog ljepila (Thermo, kat. br. 4311971).Reakcijska smjesa sastojala se od 5 µl Taqman Fast Advanced Master mješavine (Thermo, cat # 4444557), 0,5 µl Taqman Primera i 3,5 µl H2O pomiješanih po jažici.Provedeni su standardni qPCR ciklusi i izmjerene su CT vrijednosti pomoću Applied Biosystems Quantstudio 5 PCR instrumenta u stvarnom vremenu (modul s 384 jažice; proizvod # A28135).Taqman primeri su kupljeni od Therma (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_m) H), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) CT vrijednosti svih uzoraka normalizirane su na kućni gen GAPDH.
Otpuštanje NT-ProBNP-a u medije procijenjeno je korištenjem kompleta NT-ProBNP (prase) (kat. br. MBS2086979, MyBioSource) u skladu s protokolom proizvođača.Ukratko, 250 µl svakog uzorka i standarda dodano je u duplikatu u svaku jažicu.Odmah nakon dodavanja uzorka, dodajte 50 µl testnog reagensa A u svaku jažicu.Lagano protresite ploču i zatvorite brtvilom.Zatim su tablete inkubirane na 37°C 1 sat.Zatim aspirirajte otopinu i isperite jažice 4 puta s 350 µl 1X otopine za ispiranje, inkubirajući otopinu za ispiranje svaki put 1-2 minute.Zatim dodajte 100 µl testnog reagensa B po jažici i zatvorite pločicu brtvilom.Tableta je lagano protresena i inkubirana na 37°C 30 minuta.Aspirirajte otopinu i isperite jažice 5 puta s 350 µl 1X otopine za ispiranje.Dodajte 90 µl otopine supstrata u svaku jažicu i zatvorite ploču.Inkubirajte ploču na 37°C 10-20 minuta.Dodajte 50 µl stop otopine u svaku jažicu.Ploča je odmah izmjerena korištenjem Cytation (BioTek) čitača ploča postavljenog na 450 nm.
Provedene su analize snage kako bi se odabrale veličine grupa koje će osigurati >80% snage za otkrivanje 10% apsolutne promjene parametra s 5% stopom pogreške tipa I. Provedene su analize snage kako bi se odabrale veličine grupa koje će osigurati >80% snage za otkrivanje 10% apsolutne promjene parametra s 5% stopom pogreške tipa I. Analiza snage je provedena za odabir veličine skupine, koja osigurava >80% snage za otkrivanje promjena 10% apsolutnog parametra s 5% frekvencije pogreške tipa I. Provedena je analiza snage kako bi se odabrale veličine grupa koje bi osigurale >80% snage za otkrivanje 10% apsolutne promjene parametra s 5% stopom pogreške tipa I.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Provedena je analiza snage za odabir veličine skupine, koja je osigurala > 80% snage za otkrivanje 10% apsolutnih promjena parametara i 5% frekvencije pogreške tipa I. Provedena je analiza snage kako bi se odabrala veličina grupe koja bi osigurala >80% snage za otkrivanje 10% apsolutne promjene parametra i 5% stope pogreške tipa I.Dijelovi tkiva nasumično su odabrani prije eksperimenta.Sve analize bile su slijepe, a uzorci su dekodirani tek nakon što su svi podaci analizirani.Za izvođenje svih statističkih analiza korišten je softver GraphPad Prism (San Diego, CA). Za sve statistike, p-vrijednosti su se smatrale značajnim pri vrijednostima <0,05. Za sve statistike, p-vrijednosti su se smatrale značajnim pri vrijednostima <0,05. Za cijelu statistiku p-značenje smatralo se značajnim pri značenjima <0,05. Za sve statistike, p-vrijednosti su se smatrale značajnim pri vrijednostima <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Za cijelu statistiku p-značenje smatralo se značajnim pri značenjima <0,05. Za sve statistike, p-vrijednosti su se smatrale značajnim pri vrijednostima <0,05.Dvostrani Studentov t-test proveden je na podacima sa samo 2 usporedbe.Jednosmjerna ili dvosmjerna ANOVA korištena je za određivanje značajnosti između više skupina.Prilikom izvođenja post hoc testova, primijenjena je Tukeyeva korekcija kako bi se uzele u obzir višestruke usporedbe.RNAsec podaci imaju posebna statistička razmatranja kada se izračunavaju FDR i p.adjust kao što je opisano u odjeljku Metode.
Za više informacija o dizajnu studije pogledajte sažetak Izvješća o istraživanju prirode povezan s ovim člankom.