Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazivat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Nove imunološke i masene spektrometrijske metode za kompleksnu analizu perzistentnih oligosaharida u kukuruznim sjemenkama prethodno tretiranim AFEX-om. Lignocelulozna biomasa je održiva alternativa fosilnim gorivima i široko se koristi za razvoj biotehnologija za proizvodnju proizvoda poput hrane, stočne hrane, goriva i kemikalija. Ključ ovih tehnologija je razvoj cjenovno konkurentnih procesa za pretvaranje složenih ugljikohidrata prisutnih u staničnim stijenkama biljaka u jednostavne šećere poput glukoze, ksiloze i arabinoze. Budući da je lignocelulozna biomasa vrlo tvrdoglava, mora se podvrgnuti termokemijskim tretmanima (npr. eksfolijacija amonijevih vlakana (AFEX), razrijeđene kiseline (DA), ionske tekućine (IL)) i biološkim tretmanima (npr. enzimska hidroliza i mikrobna fermentacija) u kombinaciji kako bi se dobio željeni produkt. Međutim, kada se komercijalni gljivični enzimi koriste u procesu hidrolize, samo 75-85% nastalih topljivih šećera su monosaharidi, a preostalih 15-25% su topljivi, neobradivi oligosaharidi, koji nisu uvijek dostupni mikroorganizmima. Prethodno smo uspješno izolirali i pročistili topljive tvrdoglave oligosaharide koristeći kombinaciju separacije ugljika i dijatomejske zemlje te kromatografije isključivanja po veličini, a također smo istražili njihova inhibitorna svojstva enzima. Otkrili smo da je oligosaharide koji sadrže metilirane uronske kiselinske supstitucije s višim stupnjem polimerizacije (DP) teže obraditi komercijalnim mješavinama enzima nego oligosaharide s niskim DP-om i neutralne oligosaharide. Ovdje izvještavamo o korištenju nekoliko dodatnih metoda, uključujući profiliranje glikana korištenjem monoklonskih antitijela (mAb) specifičnih za glikane biljne biomase za karakterizaciju glikanskih veza u staničnim stijenkama biljaka i enzimskim hidrolizatima, ionizaciju laserskom desorpcijom uz pomoć matrice, masenu spektrometriju s vremenom leta. MALDI-TOF-MS) koristi strukturno informativne dijagnostičke vrhove dobivene spektroskopijom nakon sekundarnog raspada negativnih iona, plinsku kromatografiju i masenu spektrometriju (GC-MS) za karakterizaciju oligosaharidnih veza sa i bez derivatizacije. Zbog male veličine oligosaharida (DP 4-20), ove molekule je teško koristiti za vezanje i karakterizaciju mAb. Kako bismo prevladali ovaj problem, primijenili smo novu metodu imobilizacije oligosaharida temeljenu na konjugaciji biotina koja je uspješno obilježila većinu oligosaharida topljivih s niskim DP-om na površini mikroploče, koja je zatim korištena u visokopropusnom mAb sustavu za specifičnu analizu ligacije. Ova nova metoda olakšat će razvoj naprednijih visokopropusnih glikomskih testova u budućnosti koji se mogu koristiti za izolaciju i karakterizaciju oligosaharida prisutnih u biomarkerima u dijagnostičke svrhe.
Lignocelulozna biomasa, sastavljena od poljoprivrednih, šumarskih, travnatih i drvenastih materijala, potencijalna je sirovina za proizvodnju bioproizvoda, uključujući hranu, stočnu hranu, gorivo i kemijske prekursore za proizvodnju proizvoda veće vrijednosti1. Ugljikohidrati (poput celuloze i hemiceluloze) prisutni u staničnim stijenkama biljaka depolimeriziraju se u monosaharide kemijskom obradom i biotransformacijom (poput enzimske hidrolize i mikrobne fermentacije). Uobičajene predobrade uključuju ekspanziju amonijačnih vlakana (AFEX), razrijeđenu kiselinu (DA), ionsku tekućinu (IL) i eksploziju pare (SE), koje koriste kombinaciju kemikalija i topline za smanjenje proizvodnje lignoceluloze otvaranjem staničnih stijenki biljaka3,4. tvrdokornost tvari, 5. Enzimska hidroliza provodi se pri visokom opterećenju krutim tvarima korištenjem komercijalnih enzima koji sadrže aktivne ugljikohidrate (CAZymes) i mikrobne fermentacije korištenjem transgenih kvasaca ili bakterija za proizvodnju biogoriva i kemikalija 6.
CAZimi u komercijalnim enzimima sastavljeni su od složene mješavine enzima koji sinergijski cijepaju složene veze ugljikohidrata i šećera kako bi formirali monosaharide2,7. Kao što smo ranije izvijestili, složena mreža aromatskih polimera lignina s ugljikohidratima čini ih vrlo teško obrađenima, što dovodi do nepotpune pretvorbe šećera, akumulirajući 15-25% spolnih oligosaharida koji se ne proizvode tijekom enzimske hidrolize prethodno obrađene biomase. Ovo je čest problem s raznim metodama prethodne obrade biomase. Neki od razloga za ovo usko grlo uključuju inhibiciju enzima tijekom hidrolize ili odsutnost ili niske razine esencijalnih enzima koji su potrebni za razbijanje šećernih veza u biljnoj biomasi. Razumijevanje sastava i strukturnih karakteristika šećera, poput šećernih veza u oligosaharidima, pomoći će nam da poboljšamo pretvorbu šećera tijekom hidrolize, čineći biotehnološke procese konkurentnima s proizvodima dobivenim iz nafte.
Određivanje strukture ugljikohidrata je izazovno i zahtijeva kombinaciju metoda kao što su tekućinska kromatografija (LC)11,12, spektroskopija nuklearne magnetske rezonancije (NMR)13, kapilarna elektroforeza (CE)14,15,16 i masena spektrometrija (MS)17. ,osamnaest. MS metode kao što je masena spektrometrija s vremenskim mjerenjem leta s laserskom desorpcijom i ionizacijom pomoću matrice (MALDI-TOF-MS) svestrana su metoda za identifikaciju struktura ugljikohidrata. Nedavno se tandem MS s kolizijskom induciranom disocijacijom (CID) adukata natrijevih iona najčešće koristi za identifikaciju otisaka prstiju koji odgovaraju položajima vezanja oligosaharida, anomernim konfiguracijama, sekvencama i položajima grananja 20, 21.
Analiza glikana izvrstan je alat za dubinsku identifikaciju ugljikohidratnih veza22. Ova metoda koristi monoklonska antitijela (mAb) usmjerena na glikan stanične stijenke biljaka kao sonde za razumijevanje složenih ugljikohidratnih veza. Više od 250 mAb dostupno je diljem svijeta, dizajniranih protiv različitih linearnih i razgranatih oligosaharida korištenjem različitih saharida24. Nekoliko mAb se široko koristi za karakterizaciju strukture, sastava i modifikacija stanične stijenke biljaka, budući da postoje značajne razlike ovisno o vrsti biljne stanice, organu, dobi, razvojnom stadiju i okruženju rasta25,26. U novije vrijeme ova se metoda koristi za razumijevanje populacija vezikula u biljnim i životinjskim sustavima i njihovih odgovarajućih uloga u transportu glikana, određenih subcelularni markerima, razvojnim stadijima ili podražajima iz okoliša, te za određivanje enzimske aktivnosti. Neke od različitih struktura glikana i ksilana koje su identificirane uključuju pektin (P), ksilan (X), manan (M), ksiloglukane (XylG), glukane s miješanim vezama (MLG), arabinoksilan (ArbX), galaktomanan (GalG), glukuronsku kiselinu-arabinoksilan (GArbX) i arabino-galaktan (ArbG)29.
Međutim, unatoč svim tim istraživačkim naporima, samo se nekoliko studija usredotočilo na prirodu akumulacije oligosaharida tijekom hidrolize s visokim udjelom krutih tvari (HSL), uključujući oslobađanje oligosaharida, promjene duljine oligomernog lanca tijekom hidrolize, različite polimere s niskim DP-om i njihove krivulje distribucije 30,31,32. U međuvremenu, iako se analiza glikana pokazala kao koristan alat za sveobuhvatnu analizu strukture glikana, teško je procijeniti vodotopive oligosaharide s niskim DP-om korištenjem metoda s antitijelima. Manji DP oligosaharidi s molekularnom težinom manjom od 5-10 kDa ne vežu se na ELISA ploče 33, 34 i ispiru se prije dodavanja antitijela.
Ovdje prvi put demonstriramo ELISA test na pločama obloženim avidinom korištenjem monoklonskih antitijela, kombinirajući jednostepeni postupak biotinilacije za topljive refraktorne oligosaharide s analizom glikoma. Naš pristup analizi glikoma validiran je analizom komplementarnih oligosaharidnih veza temeljenom na MALDI-TOF-MS i GC-MS metodama korištenjem derivatizacije hidroliziranih šećernih sastava trimetilsililom (TMS). Ovaj inovativni pristup može se u budućnosti razviti kao visokoučinkovita metoda i pronaći širu primjenu u biomedicinskim istraživanjima35.
Posttranslacijske modifikacije enzima i antitijela, poput glikozilacije,36 utječu na njihovu biološku aktivnost. Na primjer, promjene u glikozilaciji serumskih proteina igraju važnu ulogu u upalnom artritisu, a promjene u glikozilaciji koriste se kao dijagnostički markeri37. U literaturi je zabilježeno da se različiti glikani lako pojavljuju u raznim bolestima, uključujući kronične upalne bolesti gastrointestinalnog trakta i jetre, virusne infekcije, rak jajnika, dojke i prostate38,39,40. Razumijevanje strukture glikana korištenjem ELISA metoda za glikane temeljenih na antitijelima pružit će dodatno povjerenje u dijagnozu bolesti bez upotrebe složenih MS metoda.
Naša prethodna studija pokazala je da tvrdokorni oligosaharidi ostaju nehidrolizirani nakon prethodne obrade i enzimske hidrolize (Slika 1). U našem prethodno objavljenom radu razvili smo metodu ekstrakcije aktivnim ugljenom na čvrstoj fazi za izolaciju oligosaharida iz hidrolizata kukuruzne sjemenke (ACSH)8 prethodno obrađenog AFEX-om. Nakon početne ekstrakcije i odvajanja, oligosaharidi su dalje frakcionirani kromatografijom isključivanja veličine (SEC) i prikupljeni prema redoslijedu molekularne težine. Monomeri i oligomeri šećera oslobođeni iz različitih predobrada analizirani su analizom sastava šećera. Pri usporedbi sadržaja šećernih oligomera dobivenih različitim metodama prethodne obrade, prisutnost tvrdokornih oligosaharida čest je problem u pretvorbi biomase u monosaharide i može dovesti do smanjenja prinosa šećera za najmanje 10-15%, pa čak i do 18%. Ova se metoda koristi za daljnju proizvodnju oligosaharidnih frakcija velikih razmjera. Dobiveni ACH i njegove naknadne frakcije s različitim molekularnim težinama korištene su kao eksperimentalni materijal za karakterizaciju oligosaharida u ovom radu.
Nakon prethodne obrade i enzimske hidrolize, perzistentni oligosaharidi ostali su nehidrolizirani. Ovdje (A) je metoda odvajanja oligosaharida u kojoj se oligosaharidi izoliraju iz hidrolizata kukuruznih sjemenki prethodno obrađenih AFEX-om (ACSH) korištenjem pakiranog sloja aktivnog ugljena i dijatomejske zemlje; (B) Metoda za odvajanje oligosaharida. Oligosaharidi su dalje odvojeni kromatografijom isključivanja veličine (SEC); (C) Monomeri i oligomeri saharida oslobođeni iz različitih prethodnih obrada (razrijeđena kiselina: DA, ionska tekućina: IL i AFEX). Uvjeti enzimske hidrolize: visoko punjenje krutih tvari od 25% (w/w) (približno 8% punjenje glukanom), 96 sati hidrolize, punjenje komercijalnim enzimom od 20 mg/g (omjer Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) i (D) Monomeri i oligomeri šećera oslobođeni iz kukuruznih sjemenki prethodno obrađenih AFEX-om (ACS).
Analiza glikana pokazala se korisnim alatom za sveobuhvatnu strukturnu analizu glikana u ekstraktima izoliranim iz ostataka čvrste biomase. Međutim, saharidi topljivi u vodi nedovoljno su zastupljeni korištenjem ove tradicionalne metode41 jer je oligosaharide niske molekularne težine teško imobilizirati na ELISA pločama i ispiru se prije dodavanja antitijela. Stoga je za vezanje i karakterizaciju antitijela korištena metoda jednostepene biotinilacije za premazivanje topljivih, neusklađenih oligosaharida na ELISA ploče obložene avidinom. Ova metoda je testirana korištenjem našeg prethodno proizvedenog ACSH-a i frakcije na temelju njegove molekularne težine (ili stupnja polimerizacije, DP). Jednostepena biotinilacija korištena je za povećanje afiniteta vezanja oligosaharida dodavanjem biotin-LC-hidrazida na redukcijski kraj ugljikohidrata (slika 2). U otopini, hemiacetalna skupina na redukcijskom kraju reagira s hidrazidnom skupinom biotin-LC-hidrazida i tvori hidrazonsku vezu. U prisutnosti redukcijskog sredstva NaCNBH3, hidrazonska veza se reducira u stabilan biotinilirani krajnji produkt. Modifikacijom kraja koji reducira šećer, postalo je moguće vezanje oligosaharida s niskim DP-om na ELISA ploče, a u našoj studiji to je učinjeno na pločama obloženim avidinom korištenjem mAb-ova usmjerenih na glikan.
Probir monoklonskih antitijela temeljen na ELISA testu za biotinilirane oligosaharide. Ovdje (A) kombinirana biotinilacija oligosaharida i naknadni ELISA probir s mAb-ima usmjerenim na glikan na pločama obloženim NeutrAvidinom, a (B) prikazuje jednostepeni postupak za biotinilaciju reakcijskih produkata.
Ploče obložene avidinom s oligosaharid-konjugiranim antitijelima zatim su dodane primarnim i sekundarnim antitijelima te isprane u mediju osjetljivom na svjetlost i vrijeme. Nakon što je vezanje antitijela završeno, doda se TMB supstrat za inkubaciju ploče. Reakcija je konačno zaustavljena sumpornom kiselinom. Inkubirane ploče analizirane su pomoću ELISA čitača kako bi se odredila jačina vezanja svakog antitijela za detekciju umrežavanja specifičnog za antitijelo. Za detalje i parametre eksperimenta pogledajte odgovarajući odjeljak „Materijali i metode“.
Demonstriramo korisnost ove novo razvijene metode za specifične primjene karakterizacijom topljivih oligosaharida prisutnih u ACSH-u, kao i u sirovim i pročišćenim oligosaharidnim frakcijama izoliranim iz lignoceluloznih hidrolizata. Kao što je prikazano na slici 3, najčešći epitopom supstituirani ksilani identificirani u ACSH-u korištenjem metoda ispitivanja bioaciliranog glikoma obično su uronski (U) ili metiluronski (MeU) i pektinski arabinogalaktani. Većina njih pronađena je i u našoj prethodnoj studiji o analizi glikana nehidroliziranih čvrstih tvari (UHS)43.
Detekcija rekalcitrantnih oligosaharidnih epitopa pomoću monoklonskog antitijela usmjerenog na glikan stanične stijenke. „Neutralna“ frakcija je ACN frakcija, a „kisela“ frakcija je FA frakcija. Svjetlije crvene boje na toplinskoj karti označavaju veći sadržaj epitopa, a svjetlije plave označavaju praznu pozadinu. Vrijednosti boja na skali temelje se na sirovim OD vrijednostima za formulacije N=2. Glavni epitopi koje prepoznaju antitijela prikazani su s desne strane.
Ove necelulozne strukture nisu mogle cijepati najčešće celulaze i hemicelulaze u testiranoj komercijalnoj smjesi enzima, koja uključuje najčešće korištene komercijalne enzime. Stoga su za njihovu hidrolizu potrebni novi pomoćni enzimi. Bez potrebnih neceluloznih pomoćnih enzima, ove necelulozne veze sprječavaju potpunu pretvorbu u monosaharide, čak i ako se njihovi matični šećerni polimeri opsežno hidroliziraju u kraće fragmente i otope korištenjem komercijalnih smjesa enzima.
Daljnja istraživanja distribucije signala i njegove jačine vezanja pokazala su da su epitopi za vezanje bili niži u frakcijama šećera s visokim DP (A, B, C, DP do 20+) nego u frakcijama s niskim DP (D, E, F, DP) u dimerima) (slika 1). Kiseli fragmenti su češći u neceluloznim epitopima nego u neutralnim fragmentima. Ove pojave su u skladu s obrascem uočenim u našoj prethodnoj studiji, gdje su visoki DP i kiseli dijelovi bili otporniji na enzimsku hidrolizu. Stoga, prisutnost neceluloznih glikanskih epitopa i U i MeU supstitucija može uvelike doprinijeti stabilnosti oligosaharida. Treba napomenuti da učinkovitost vezanja i detekcije može biti problematična za oligosaharide s niskim DP, posebno ako je epitop dimerni ili trimerni oligosaharid. To se može testirati korištenjem komercijalnih oligosaharida različitih duljina, od kojih svaki sadrži samo jedan epitop koji se veže na specifično mAb.
Dakle, korištenje strukturno specifičnih antitijela otkrilo je određene vrste rekalcitrantnih veza. Ovisno o vrsti korištenog antitijela, odgovarajućem obrascu ligacije i jačini signala koji proizvodi (najviše i najmanje zastupljen), novi enzimi mogu se identificirati i polukvantitativno dodati smjesi enzima za potpuniju glikokonverziju. Uzimajući analizu ACSH oligosaharida kao primjer, možemo stvoriti bazu podataka glikanskih veza za svaki biomasni materijal. Ovdje treba napomenuti da treba uzeti u obzir različit afinitet antitijela, a ako je njihov afinitet nepoznat, to će stvoriti određene poteškoće pri usporedbi signala različitih antitijela. Osim toga, usporedba glikanskih veza može najbolje funkcionirati između uzoraka za isto antitijelo. Ove tvrdokorne veze zatim se mogu povezati s CAZyme bazom podataka, iz koje možemo identificirati enzime, odabrati kandidate za enzime i testirati enzime koji kidaju veze ili razviti mikrobne sustave za ekspresiju ovih enzima za upotrebu u biorafinerijama44.
Kako bismo procijenili kako imunološke metode nadopunjuju alternativne metode za karakterizaciju oligosaharida niske molekularne težine prisutnih u lignoceluloznim hidrolizatima, proveli smo MALDI (slika 4, S1-S8) i analizu saharida dobivenih TMS-om na temelju GC-MS na istom panelu (slika 5) oligosaharidnog dijela. MALDI se koristi za usporedbu odgovara li raspodjela mase molekula oligosaharida predviđenoj strukturi. Na slici 4 prikazan je MS neutralnih komponenti ACN-A i ACN-B. Analiza ACN-A potvrdila je raspon pentoznih šećera u rasponu od DP 4-8 (slika 4) do DP 22 (slika S1), čije težine odgovaraju MeU-ksilanskim oligosaharidima. Analiza ACN-B potvrdila je niz pentoza i gluoksilana s DP 8-15. U dodatnim materijalima kao što je slika S3, karte raspodjele mase kiselih dijelova FA-C pokazuju niz (Me)U supstituiranih pentoznih šećera s DP od 8-15 koji su u skladu sa supstituiranim ksilanima pronađenim u ELISA-baziranom mAb probiru. Epitopi su u skladu.
MALDI-MS spektar topljivih neusklađenih oligosaharida prisutnih u ACS-u. Ovdje su (A) ACN-A frakcije niskog raspona težine koje sadrže metiliranu uronsku kiselinu (DP 4-8) supstituirane glukuroksilanskim oligosaharidom i (B) ACN-B ksilan i metilirani uronski kiselinski oligosaharidi supstituirani glukuroksilanom (DP 8-15).
Analiza sastava glikanskog ostatka refraktornih oligosaharida. Ovdje (A) Sastav TMS saharida različitih frakcija oligosaharida dobivenih GC-MS analizom. (B) Strukture različitih šećera dobivenih iz TMS-a prisutnih u oligosaharidima. ACN – frakcija acetonitrila koja sadrži neutralne oligosaharide i FA – frakcija ferulinske kiseline koja sadrži kisele oligosaharide.
Još jedan zanimljiv zaključak izveden je iz LC-MS analize oligosaharidne frakcije, kao što je prikazano na slici S9 (metode se mogu vidjeti u elektroničkom dodatnom materijalu). Fragmenti heksoznih i -OAc skupina više su puta uočeni tijekom ligacije ACN-B frakcije. Ovo otkriće ne samo da potvrđuje fragmentaciju uočenu u glikomu i MALDI-TOF analizi, već i pruža nove informacije o potencijalnim derivatima ugljikohidrata u prethodno obrađenoj lignoceluloznoj biomasi.
Također smo proveli analizu sastava glikana oligosaharidnih frakcija korištenjem TMS derivatizacije glikana. Pomoću GC-MS-a odredili smo sastav neutralnih (nederiviranih) i kiselih šećera (GluA i GalA) u oligosaharidnoj frakciji (slika 5). Glukuronska kiselina se nalazi u kiselim komponentama C i D, dok se galakturonska kiselina nalazi u kiselim komponentama A i B, koje su obje komponente s visokim DP-om kiselih šećera. Ovi rezultati ne samo da potvrđuju naše ELISA i MALDI podatke, već su i u skladu s našim prethodnim studijama akumulacije oligosaharida. Stoga vjerujemo da su moderne imunološke metode koje koriste biotinilaciju oligosaharida i naknadno ELISA testiranje dovoljne za detekciju topljivih rekalcitantnih oligosaharida u različitim biološkim uzorcima.
Budući da su metode probira mAb-a temeljene na ELISA-i validirane pomoću nekoliko različitih metoda, željeli smo dalje istražiti potencijal ove nove kvantitativne metode. Dva komercijalna oligosaharida, ksiloheksasaharid oligosaharid (XHE) i 23-α-L-arabinofuranozil-ksilotrioza (A2XX), kupljena su i testirana korištenjem novog pristupa mAb-a usmjerenog na glikan stanične stijenke. Slika 6 prikazuje linearnu korelaciju između signala vezanja biotinila i logaritamske koncentracije oligosaharida, što sugerira mogući Langmuirov model adsorpcije. Među mAb-ovima, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 i CCRC-M151 korelirali su s XHE, a CCRC-M108, CCRC-M109 i LM11 korelirali su s A2XX u rasponu od 1 nm do 100 nano. Zbog ograničene dostupnosti antitijela tijekom eksperimenta, provedeni su ograničeni eksperimenti sa svakom koncentracijom oligosaharida. Ovdje treba napomenuti da neka antitijela reagiraju vrlo različito na isti oligosaharid kao supstrat, vjerojatno zato što se vežu na neznatno različite epitope i mogu imati vrlo različite afinitete vezanja. Mehanizmi i implikacije točne identifikacije epitopa bit će mnogo složeniji kada se novi pristup mAb primijeni na stvarne uzorke.
Dva komercijalna oligosaharida korištena su za određivanje raspona detekcije različitih monoklonskih protutijela koja ciljaju glikane. Ovdje linearne korelacije s logaritamskom koncentracijom oligosaharida ukazuju na Langmuirove obrasce adsorpcije za (A) XHE s mAb i (B) A2XX s mAb. Odgovarajući epitopi označavaju strukture komercijalnih oligosaharida korištenih kao supstrati u testu.
Upotreba monoklonskih antitijela usmjerenih na glikane (glikomska analiza ili ELISA-bazirani mAb probir) moćan je alat za dubinsku karakterizaciju većine glavnih glikana stanične stijenke koji čine biljnu biomasu. Međutim, klasična analiza glikana karakterizira samo veće glikane stanične stijenke, budući da većina oligosaharida nije učinkovito imobilizirana na ELISA pločama. U ovoj studiji, kukuruzna slamka prethodno tretirana AFEX-om enzimski je hidrolizirana pri visokom udjelu krutih tvari. Analiza šećera korištena je za određivanje sastava rekalcitrantnih ugljikohidrata stanične stijenke u hidrolizatu. Međutim, mAb analiza manjih oligosaharida u hidrolizatima je podcijenjena i potrebni su dodatni alati za učinkovitu imobilizaciju oligosaharida na ELISA pločama.
Ovdje izvještavamo o novoj i učinkovitoj metodi imobilizacije oligosaharida za probir monoklonskih protutijela kombiniranjem biotinilacije oligosaharida nakon čega slijedi ELISA probir na pločama obloženim NeutrAvidin™. Imobilizirani biotinilirani oligosaharidi pokazali su dovoljan afinitet za antitijelo kako bi se omogućilo brzo i učinkovito otkrivanje rekalcitrantnih oligosaharida. Analiza sastava ovih tvrdoglavih oligosaharida na temelju masene spektrometrije potvrdila je rezultate ovog novog pristupa imunoprobiru. Dakle, ove studije pokazuju da se kombinacija biotinilacije oligosaharida i ELISA probira s monoklonskim antitijelima usmjerenim na glikan može koristiti za otkrivanje umrežavanja u oligosaharidima i može se široko primjenjivati ​​u drugim biokemijskim studijama koje karakteriziraju strukturu oligosaharida.
Ova metoda profiliranja glikana na bazi biotina prvo je izvješće koje može istražiti rekalcitrantne ugljikohidratne veze topljivih oligosaharida u biljnoj biomasi. To pomaže razumjeti zašto su neki dijelovi biomase toliko tvrdoglavi kada je u pitanju proizvodnja biogoriva. Ova metoda popunjava važnu prazninu u metodama analize glikoma i proširuje njezinu primjenu na širi raspon supstrata osim biljnih oligosaharida. U budućnosti bismo mogli koristiti robotiku za biotinilaciju i koristiti metodu koju smo razvili za visokopropusnu analizu uzoraka pomoću ELISA testa.
Kukuruzna slama (CS) uzgojena iz hibridnog sjemena Pioneer 33A14 ubrana je 2010. godine na farmi Kramer u Rayu, Colorado. Uz dopuštenje vlasnika zemljišta, ova biomasa može se koristiti za istraživanje. Uzorci su pohranjeni suhi < 6% vlage u vrećicama sa zatvaračem na sobnoj temperaturi. Uzorci su pohranjeni suhi < 6% vlage u vrećicama sa zatvaračem na sobnoj temperaturi. Obrazci su bili suhi pri vlažnosti < 6% u paketima sa zastežkoj-molnijom pri sobnoj temperaturi. Uzorci su pohranjeni suhi pri vlažnosti <6% u vrećicama s patentnim zatvaračem na sobnoj temperaturi.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Obrazac hrane u paketu sa zastežkoj-molnijem pri sobnoj temperaturi s vlagom < 6%. Uzorci se čuvaju u vrećicama sa zatvaračem na sobnoj temperaturi s vlagom < 6%.Studija je provedena u skladu s lokalnim i nacionalnim smjernicama. Analiza sastava provedena je korištenjem NREL protokola. Utvrđeno je da sastav sadrži 31,4% glukana, 18,7% ksilana, 3,3% arabinana, 1,2% galaktana, 2,2% acetila, 14,3% lignina, 1,7% proteina i 13,4% pepela.
Cellic® CTec2 (138 mg proteina/ml, lot VCNI 0001) je složena smjesa celulaze, β-glukozidaze i Cellic® HTec2 (157 mg proteina/ml, lot VHN00001) tvrtke Novozymes (Franklinton, NC, SAD). Multifect Pectinase® (72 mg proteina/ml), složena smjesa enzima za razgradnju pektina, donirala je tvrtka DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, SAD). Koncentracije proteina enzima određene su procjenom sadržaja proteina (i oduzimanjem doprinosa neproteinskog dušika) korištenjem Kjeldahl analize dušika (AOAC metoda 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, SAD). Dijatomejska zemlja 545 kupljena je od tvrtke EMD Millipore (Billerica, MA). Aktivni ugljen (DARCO, granule od 100 mesh), Avicel (PH-101), bukov ksilan i sve ostale kemikalije kupljene su od tvrtke Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
AFEX predobrada provedena je u GLBRC-u (Laboratorij za istraživanje konverzije biomase, MSU, Lansing, MI, SAD). Prethodna obrada provedena je na 140°C tijekom 15 minuta. Vrijeme zadržavanja od 46 sekundi pri omjeru 1:1 bezvodnog amonijaka i biomase uz 60% (w/w) punjenja u stolnom reaktoru od nehrđajućeg čelika (Parr Instruments Company). Trajalo je 30 minuta. Reaktor je zagrijan na 140°C i amonijak se brzo oslobodio, omogućujući biomasi da se brzo vrati na sobnu temperaturu. Sastav AFEX-om prethodno obrađene kukuruzne ploče (ACS) bio je sličan sastavu netretirane kukuruzne ploče (UT-CS).
ACSH s visokim udjelom krutih tvari 25% (w/w) (približno 8% dekstrana) pripremljen je kao početni materijal za proizvodnju oligosaharida u velikim razmjerima. Enzimska hidroliza ACS-a provedena je korištenjem komercijalne smjese enzima koja uključuje Cellic® Ctec2 10 mg proteina/g glukana (u prethodno obrađenoj biomasi), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteina/g glukana i Multifect Pectinase (Genencor Inc, SAD). ). ), 5 mg proteina/g dekstrana. Enzimska hidroliza provedena je u bioreaktoru od 5 litara s radnim volumenom od 3 litre, pH 4,8, 50°C i 250 rpm. Nakon hidrolize tijekom 96 sati, hidrolizat je sakupljen centrifugiranjem pri 6000 rpm tijekom 30 minuta, a zatim pri 14000 rpm tijekom 30 minuta kako bi se uklonile nehidrolizirane krute tvari. Hidrolizat je zatim podvrgnut sterilnoj filtraciji kroz filter čašu od 0,22 mm. Filtrirani hidrolizat je pohranjen u sterilnim bocama na 4°C, a zatim frakcioniran na ugljenu.
Analiza sastava uzoraka biomase na bazi ekstrakta prema NREL laboratorijskim postupcima analize: priprema uzoraka za analizu sastava (NREL/TP-510-42620) i određivanje strukturnih ugljikohidrata i lignina u biomasi (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analiza oligosaharida u hidrolizatnom toku provedena je na skali od 2 ml korištenjem metode kisele hidrolize u autoklavu. Uzorak hidrolizata pomiješajte sa 69,7 µl 72%-tne sumporne kiseline u epruveti za kulturu s navojnim čepom od 10 ml i inkubirajte 1 sat na radnom stolu na 121 °C, ohladite na ledu i filtrirajte u bočicu za visokoučinkovitu tekućinsku kromatografiju (HPLC). Koncentracija oligosaharida određena je oduzimanjem koncentracije monosaharida u nehidroliziranom uzorku od ukupne koncentracije šećera u kiselinom hidroliziranom uzorku.
Koncentracije glukoze, ksiloze i arabinoze u kiselo hidroliziranoj biomasi analizirane su pomoću Shimadzu HPLC sustava opremljenog automatskim uzorkivačem, grijačem kolone, izokratskom pumpom i detektorom indeksa loma na Bio-Rad Aminex HPX-87H koloni. Kolona je održavana na 50°C i eluirana s protokom 5 mM H2SO4 u vodi od 0,6 ml/min.
Supernatant hidrolizata je razrijeđen i analiziran na sadržaj monomera i oligosaharida. Monomerni šećeri dobiveni nakon enzimske hidrolize analizirani su HPLC-om opremljenim Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P kolonom i kolonom za zaštitu od pepela. Temperatura kolone održavana je na 80 °C, a voda je korištena kao mobilna faza s brzinom protoka od 0,6 ml/min. Oligosaharidi su određeni hidrolizom u razrijeđenoj kiselini na 121 °C prema metodama opisanim u referencama 41, 48, 49.
Analiza saharida provedena je na sirovim, AFEX-om prethodno obrađenim i svim nehidroliziranim ostacima biomase (uključujući proizvodnju serijskih ekstrakata staničnih stijenki i njihov probir na mAb) korištenjem prethodno opisanih postupaka 27, 43, 50, 51. Za analizu glikoma, ostaci materijala biljnih staničnih stijenki netopljivi u alkoholu pripremaju se iz ostataka biomase i podvrgavaju serijskoj ekstrakciji sa sve agresivnijim reagensima kao što su amonijev oksalat (50 mM), natrijev karbonat (50 mM i 0,5% w/v), CON. (1M i 4M, oba s 1% w/v natrijevog borohidrida) i kiseli klorit kao što je prethodno opisano 52,53. Ekstrakti su zatim podvrgnuti ELISA testu na složenom panelu mAb50 usmjerenih na glikan stanične stijenke, a reakcije vezanja mAb prikazane su kao toplinska karta. mAb koji ciljaju glikan biljnih staničnih stijenki kupljeni su iz laboratorijskih zaliha (CCRC, JIM i MAC serije).
Jednostupanjska biotinilacija oligosaharida. Konjugacija ugljikohidrata s biotin-LC-hidrazidom provedena je sljedećim postupkom. Biotin-LC-hidrazid (4,6 mg/12 μmol) otopljen je u dimetil sulfoksidu (DMSO, 70 μl) snažnim miješanjem i zagrijavanjem na 65 °C tijekom 1 minute. Dodana je ledena octena kiselina (30 µl) i smjesa je izlivena na natrijev cijanoborohidrid (6,4 mg/100 µmol) te potpuno otopljena nakon zagrijavanja na 65 °C tijekom oko 1 minute. Zatim je od 5 do 8 μl reakcijske smjese dodano osušenom oligosaharidu (1-100 nmol) kako bi se dobio 10-struki ili veći molarni višak oznake u odnosu na reducirajući kraj. Reakcija je provedena na 65 °C tijekom 2 sata, nakon čega su uzorci odmah pročišćeni. U eksperimentima označavanja bez redukcije nije korišten natrijev cijanoborohidrid, a uzorci su reagirali na 65 °C tijekom 2,5 sata.
ELISA premazivanje i ispiranje uzoraka biotiniliranih oligosaharida. U svaku jažicu ploče obložene avidinom dodano je 25 μl biotiniliranih uzoraka (100 μl svakog koncentriranog uzorka razrijeđenog u 5 ml 0,1 M Tris puferske otopine (TBS)). Kontrolne jažice obložene su s 50 μl biotina u koncentraciji od 10 μg/ml u 0,1 M TBS. Deionizirana voda korištena je kao premaz za slijepa mjerenja. Tableta je inkubirana 2 sata na sobnoj temperaturi u mraku. Ploču isperite 3 puta s 0,1% obranog mlijeka u 0,1 M TBS koristeći program br. 11 za Grenier flat 3A.
Dodavanje i ispiranje primarnih antitijela. U svaku jažicu dodajte 40 µl primarnog antitijela. Inkubirajte mikroploču 1 sat na sobnoj temperaturi u mraku. Ploče su zatim isprane 3 puta s 0,1% mlijeka u 0,1 M TBS koristeći program pranja #11 za Grenier Flat 3A.
Dodajte sekundarno antitijelo i isperite. U svaku jažicu dodajte 50 µl sekundarnog mišjeg/štakorskog antitijela (razrijeđenog 1:5000 u 0,1% mlijeku u 0,1 M TBS). Inkubirajte mikroploču 1 sat na sobnoj temperaturi u mraku. Mikroploče su zatim isprane 5 puta s 0,1% mlijeka u 0,1 M TBS koristeći program pranja ploča Grenier Flat 5A #12.
Dodavanje supstrata. Dodajte 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) osnovnom supstratu (dodavanjem 2 kapi pufera, 3 kapi TMB-a, 2 kapi vodikovog peroksida u 15 ml deionizirane vode). Pripremite TMB supstrat i promiješajte na vrtlogu prije upotrebe. Inkubirajte mikroploču na sobnoj temperaturi 30 minuta. U mraku.
Dovršite korak i očitajte tabletu. U svaku jažicu dodajte 50 µl 1 N sumporne kiseline i zabilježite apsorbanciju od 450 do 655 nm pomoću ELISA čitača.
Pripremite otopine od 1 mg/ml ovih analita u deioniziranoj vodi: arabinoza, ramnoza, fukoza, ksiloza, galakturonska kiselina (GalA), glukuronska kiselina (GlcA), manoza, glukoza, galaktoza, laktoza, N-acetilmanozamin (manNAc), N-acetilglukozamin (glcNAc), N-acetilgalaktozamin (galNAc), inozitol (unutarnji standard). Dva standarda pripremljena su dodavanjem otopina šećera od 1 mg/ml prikazanih u Tablici 1. Uzorci se zamrzavaju i liofiliziraju na -80°C dok se ne ukloni sva voda (obično oko 12-18 sati).
U epruvete s navojnim čepom na analitičkoj vagi dodajte 100–500 µg uzorka. Zabilježite dodanu količinu. Najbolje je otopiti uzorak u određenoj koncentraciji otapala i dodati ga u epruvetu kao tekući alikvot. Za svaku epruvetu s uzorkom upotrijebite 20 µl inozitola koncentracije 1 mg/ml kao unutarnji standard. Količina unutarnjeg standarda dodanog uzorku mora biti jednaka količini unutarnjeg standarda dodanog u standardnu ​​epruvetu.
U bočicu s navojnim čepom dodajte 8 ml bezvodnog metanola. Zatim dodajte 4 ml 3 N metanolne otopine HCl, zatvorite čepom i protresite. U ovom postupku se ne koristi voda.
Uzorcima oligosaharida i standardnim TMS epruvetama dodajte 500 µl 1 M otopine HCl u metanolu. Uzorci su inkubirani preko noći (168 sati) na 80°C u termalnom bloku. Produkt metanolize osušite na sobnoj temperaturi pomoću razvodnika za sušenje. Dodajte 200 µl MeOH i ponovno osušite. Ovaj se postupak ponavlja dva puta. Uzorku dodajte 200 µl metanola, 100 µl piridina i 100 µl octenog anhidrida i dobro promiješajte. Uzorke inkubirajte na sobnoj temperaturi 30 minuta. Dodajte 200 µl metanola i ponovno osušite.
Dodajte 200 µl Tri-Sila i zagrijavajte zatvorenu epruvetu 20 minuta. 80°C, zatim ohladite na sobnu temperaturu. Koristite razvodnik za sušenje kako biste dodatno osušili uzorak do volumena od približno 50 µl. Važno je napomenuti da nismo dopustili da se uzorci potpuno osuše.
Dodajte 2 ml heksana i dobro promiješajte vrtloženjem. Napunite vrhove Pasteurovih pipeta (5-8 mm) komadićem staklene vune umetanjem staklene vune na vrh pipete promjera 5-3/4 inča. Uzorci su centrifugirani na 3000 g tijekom 2 minute. Svi netopljivi ostaci su istaloženi. Osušite uzorak na 100-150 µl. Volumen od približno 1 μl ubrizgan je u GC-MS pri početnoj temperaturi od 80 °C i početnom vremenu od 2,0 minute (Tablica 2).