Mèsi paske w te vizite Nature.com.Vèsyon navigatè w ap itilize a gen yon sipò limite pou CSS.Pou pi bon eksperyans, nou rekòmande pou w itilize yon navigatè ki ajou (oswa fèmen mòd konpatibilite nan Internet Explorer). Antretan, pou asire sipò kontinye, nou pral montre sit la san estil ak JavaScript.
Mòfojenèz zantray imen etabli karakteristik kript-villus nan mikrochitekti epitelyal 3D ak òganizasyon espasyal. Se estrikti inik sa a oblije kenbe omeyostazi zantray pa pwoteje nich selil souch la nan kripte fondamantal la soti nan antijèn mikwòb ekzojèn ak metabolites yo. Estrikti D epitelyal enpòtan anpil pou konstriksyon modèl zantray in vitro. Notamman, òganik mimetik zantray-sou-yon-chip la ka pwovoke morfogenesis espontane 3D epitelyal entesten ak fonksyon fizyolojik ak byomekanik amelyore. Isit la, nou bay yon pwotokòl repwodiktif pou pwovoke fòtman mòfogenesis entesten nan aparèy entesten an ak yon metòd ibrid transfòmasyon byen dekri nan chip transfè a. , kiltive nan Caco-2 oswa entesten selil epitelyal organoid nan anviwònman konvansyonèl kòm byen ke sou yon platfòm mikrofluidik, endiksyon nan 3D morphogenesis, ak karakterizasyon nan etabli epitheli 3D lè l sèvi avèk plizyè mòd D '. Pwotokòl sa a reyalize rejenerasyon nan mikrochitekti entesten fonksyonèl pa kontwole koule likid basolateral pou 5 d. mande pou jeni selil konplèks oswa manipilasyon, ki ka depase lòt teknik ki egziste deja.Nou anvizaje ke pwotokòl pwopoze nou an ta ka gen gwo enplikasyon pou kominote rechèch byomedikal la, bay yon metòd rejenere kouch epitelyal 3D entesten an vitro pou aplikasyon byomedikal, klinik, ak pharmaceutique.
Eksperyans yo demontre ke selil epitelyal entesten Caco-2 kiltive nan zantray-sou-yon-chip1,2,3,4,5 oswa aparèy mikwofluid bikouch6,7 ka sibi mòfogenesis espontane 3D an vitro san yo pa yon konpreyansyon klè sou mekanis ki kache a. morphogenesis nan vitro, ki te demontre pa Caco-2 ak pasyan ki sòti nan entesten organoids.Selil epitelyal yo te valide.Nan etid sa a, nou espesyalman konsantre sou pwodiksyon selil ak distribisyon konsantrasyon yon antagonist Wnt ki pisan, Dickkopf-1 (DKK-1), nan aparèy mikwofluidik gut-on-a-chip ak modifye ki gen transwell, ki rele "Hybrid Chip". -pwoteyin ki gen rapò 1, oswa Soggy-1) nan zantray la sou-chip inibit morphogenesis oswa deranje kouch nan epitelyal 3D prestriktire, sijere ke estrès antagonis pandan kilti se responsab pou morfogenesis entesten in vitro.Se poutèt sa, yon apwòch pratik yo reyalize morphogenesis gaya nan epithelial la koòdone se nan nivo aktif nan epithelial koòdone nan retire aktif nan koòdone aktif. (egzanp, nan tribin-sou-yon-chip oswa ibrid-sou-yon-chip platfòm) oswa difizyon .Medya basolateral (egzanp, soti nan foure Transwell nan gwo rezèvwa basolateral nan pwi).
Nan pwotokòl sa a, nou bay yon metòd detaye pou fabrike gut-on-a-chip microdevices ak Transwell-insertable chips ibrid (etap 1-5) pou kiltive selil epitelyal entesten yo sou manbràn pore ki baze sou polydimethylsiloxane (PDMS) (etap 6A, 7A, 8, 9) oswa polyestè manbràn Transwell, 36B, enduit (7ps , 36B) morphogenesis in vitro (etap 10). Nou idantifye tou karakteristik selilè ak molekilè ki endike histogenesis espesifik tisi yo ak diferansyasyon selilè depandan filiaj lè nou aplike plizyè mòd D '(etap 11-24). Nou pwovoke mòfogenez lè l sèvi avèk selil epitelyal entesten imen, tankou Caco-2 oswa entesten organoids, nan de fòma kiltirèl, modifikasyon sifas entesten ak manbràn byochimik repwodiksyon ak detay teknik. nan microenvironment la biomechanical.in vitro.Pou pwovoke 3D morphogenesis soti nan 2D epitelyal monokouch, nou retire antagonist morphogen nan tou de fòm kiltive pa koule mwayen an nan lòj la basolateral nan kilti a.Finalman, nou bay yon reprezantasyon nan sèvis piblik la nan yon rejenerabl 3D epithelial epithelial kouch kwasans-depandan hôte ki ka itilize komodèl epitelyal-depandan hôte. -kilti, enfeksyon patojèn, blesi enflamatwa, malfonksyònman baryè epitelyal, ak terapi ki baze sou probyotik Egzanp.enfliyans.
Pwotokòl nou an ka itil nan yon pakèt syantis nan rechèch debaz (egzanp, biyoloji mukozal entesten, byoloji selil souch, ak byoloji devlopman) ak rechèch aplike (egzanp, tès preklinik dwòg, modèl maladi, jeni tisi, ak gastroenteroloji) gwo enpak. s etidye dinamik siyal selil yo pandan devlopman entesten, rejenerasyon oswa omeyostaz .Anplis de sa, pwotokòl nou an itil pou entewogasyon enfeksyon anba plizyè ajan enfektye tankou Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 oswa Vibrio cholerae.Odyans nan patoloji maladi ak patojèn yo itil tou. Itilizasyon yon sistèm mikwofizyoloji zantray sou chip ka pèmèt ko-kilti longitudinal 10 ak evalyasyon ki vin apre nan defans lame, repons iminitè ak reparasyon blesi ki gen rapò ak patojèn nan aparèy la gastwoentestinal (GI) 11 .Lòt maladi GI ki asosye ak maladi kwosil, maladi kwochitis, maladi entesten, maladi kwochitis, maladi kwochitis, maladi kwochitis, maladi kwochitis. oswa sendwòm entesten chimerik ka simulation lè kouch epitelyal 3D entesten yo prepare lè l sèvi avèk kouch epitelyal 3D entesten pasyan an, maladi sa yo gen ladan atrofi vilous, mantèg kript, domaj mukozal, oswa andikape baryè epitelyal. kalite, tankou selil mononikleyè san periferik pasyan yo (PBMCs), nan modèl ki gen mikrochitekti 3D villus-kript entesten.selil iminitè espesifik tisi yo, 5.
Depi mikwostrikti epitelyal 3D yo ka fiks ak vizyalize san pwosesis seksyon an, telespektatè k ap travay sou transcriptomics espasyal ak imaj segondè-rezolisyon oswa super-rezolisyon ka enterese nan kat nou an nan dinamik spatiotemporal jèn ak pwoteyin sou nich epitelyal.Entèrese nan teknoloji.Repons nan stimuli mikwòb oswa iminitè.Anplis de sa, diafonik lame-mikwobym longitudinal 10, 14 ki kowòdone omeyostaz zantray ka etabli nan kouch mukozal entesten 3D nan ko-kilti divès espès mikwòb, kominote mikwòb oswa mikrobyota fekal, espesyalman nan zantray-on-a-chip la.nan platfòm la.Apwòch sa a se patikilyèman atire odyans ki etidye iminoloji mukozal, gastroenteroloji, mikrobyom imen, kiltiwomik ak mikrobyoloji klinik k ap chèche kiltive mikrobyota nan zantray ki pa kiltive deja nan laboratwa a. Pwotokòl la kapab tou gaye bay moun ki devlope pharmaceutique, byomedikal Oswa segondè-debi tès depistaj oswa validation platfòm pou endistri a manje.Kòm yon prèv-of-prensip, nou dènyèman demontre posibilite a nan yon multiplex-wo-debi sistèm morphogenesis évolutive nan yon fòma plak 24-byen. metòd mòfogenesis ka akselere ak potansyèlman adopte pa anpil laboratwa rechèch, endistri oswa gouvènman ak ajans regilasyon yo konprann repwogram selilè nan mòfogenesis zantray in vitro nan nivo transcriptomic pou teste dwòg oswa biotherapeutics Absòbsyon ak transpò kandida dwòg yo te evalye lè l sèvi avèk ranplasan zantray 3D oswa lè l sèvi avèk koutim oswa modèl komèsyal ògàn-sou-a-pwosesis repwodiksyon nan repwodiksyon gut.
Yo te itilize yon kantite limite nan modèl eksperimantal moun ki enpòtan pou etidye mòfojenèz epitelyal entesten, sitou akòz mank de pwotokòl aplike pou pwovoke mòfojenèz 3D an vitro. Detèmine pwosesis devlopman imen. Modèl sa yo tou limite anpil nan kapasite yo pou yo teste nan yon fason milti-fason évolutive. Se poutèt sa, pwotokòl nou an pou rejenerasyon estrikti tisi 3D an vitro depase modèl bèt in vivo ansanm ak lòt modèl kilti selil 2D tradisyonèl estatik. mukozal oswa stimuli iminitè. Kouch epitelyal 3D ka bay yon espas pou etidye ki jan selil mikwòb yo fè konpetisyon pou fòme nich espasyal ak evolisyon ekolojik an repons a faktè lame (egzanp, kouch larim anndan ak ekstèn, sekresyon IgA ak peptides antimikwòb). egzanp, asid gra chèn kout) ki fòme òganizasyon selilè ak nich selil souch nan kript fondamantal yo. Karakteristik sa yo ka sèlman demontre lè kouch epitelyal 3D yo etabli an vitro.
Anplis de sa nan metòd nou an pou kreye estrikti 3D epitelyal entesten, gen plizyè metòd in vitro. Kilti òganoid entestinal se yon teknik jeni tisi dènye kri ki baze sou kiltivasyon selil souch entesten nan kondisyon morfojèn espesifik23,24,25.Sepandan, itilizasyon modèl òganoyid 3D pou analiz transpò oswa hôte-kilti òganis se souvan nan intestins la se mikwo-kilti. Se poutèt sa, entwodiksyon konpozan luminal tankou selil mikwòb oswa antijèn ekzojèn limite.Aksè nan lumèn organoid ka amelyore lè l sèvi avèk yon mikroinjector,26,27 men metòd sa a se pwogrese ak travay-entansif epi li mande konesans espesyalize yo fè.Anplis de sa, kilti organoid tradisyonèl kenbe nan echafodaj idwojèl nan kondisyon estatik pa byen reflete aktif nan biomekanik vivo.
Lòt apwòch anplwaye plizyè gwoup rechèch itilize echafodaj idwojèl 3D prestriktire pou imite estrikti epitelyal zantray la nan kiltive selil entesten imen izole sou sifas jèl la. Fabrike echafodaj idwojèl lè l sèvi avèk moule 3D enprime, mikwo-frelen oswa lithografik. ing yon gwo rapò aspè estrikti epitelyal ak stroma-epithelial crosstalk lè yo enkli selil stromal nan echafodaj la.Sepandan, nati a nan echafodaj prestriktire ka anpeche ekspozisyon an nan pwosesis la mòfogenetik espontane tèt li.Modèl sa yo tou pa bay dinamik luminal oswa entèrstisyèl koule, manke likid taye estrès la ki taye likid ki te itilize nan fonksyònman selil entesten yo te itilize nan etid morfogenesis resan yo. yon platfòm mikwofluidik ak estrikti epitelyal entesten modele lè l sèvi avèk teknik lazè-grave.Òganoid entesten sourit swiv modèl grave yo fòme estrikti tubulèr entesten, ak koule likid intraluminal ka recapitule lè l sèvi avèk yon modil mikrofluidik. tic pwosesis.Malgre fabrikasyon konplèks nan diferan segman zantray nan tib la, modèl sa a tou manke koule likid luminal ak deformation mekanik.Anplis de sa, operasyon modèl yo ka limite, espesyalman apre pwosesis la bioprinting fini, twoublan kondisyon eksperimantal oswa entèraksyon selil-a-selil. tments, ak re-kreyasyon mikwo-anviwònman byolojik konplèks nan modilarite.Se poutèt sa, pwotokòl mòfogenesis 3D in vitro nou an ka bay yon apwòch konplemantè simonte defi yo nan metòd ki egziste deja.
Pwotokòl nou an se antyèman konsantre sou 3D epitelyal morphogenesis, ak selil epitelyal sèlman nan kilti ak pa gen okenn lòt kalite selil ki antoure tankou selil mesenchymal, selil endothelial, ak selil iminitè. on-a-chip and hybrid-on-a-chip pèmèt nou rkree kouch epitelyal 3D ondulant la, konpleksite byolojik adisyonèl tankou entèraksyon epitelyal-mesenchymal33,34, depo matris ekstraselilè (ECM) 35 ak, nan modèl nou an, karakteristik kript-villus ki transmèt nich selil souch yo (egzanp selil souch yo konsidere kòm nich fibwostè yo nan pli lwen). chyme jwe yon wòl kle nan pwodiksyon an nan pwoteyin ECM ak règleman nan morfogenesis entesten nan vivo35,37,38.Adisyon nan selil mesenchymal nan modèl nou an amelyore pwosesis la mòfojenetik ak efikasite atachman selil. Kouch endothelial la (sa vle di, kapilè oswa lenfatik) jwe yon wòl enpòtan nan reglemante transpò selilè, micro-immune nan eleman molekilè 39 ak iminitè. yo ka konekte ant modèl tisi yo se yon avantou lè modèl tisi yo fèt pou demontre entèraksyon milti-ògàn. Se poutèt sa, selil endothelial yo ka bezwen enkli nan modèl karakteristik fizyolojik ki pi egzak ak rezolisyon nivo ògàn. Selil iminitè ki sòti nan pasyan yo esansyèl tou pou montre repons iminitè natirèl, prezantasyon antijèn, kontèks iminitè iminitè, iminitè iminitè espesifik ak kontèks iminitè entesten. maladi.
Itilizasyon chips ibrid yo pi senp pase gut-on-a-chip paske konfigirasyon aparèy la pi senp epi sèvi ak transwell insert pèmèt pou kilti évolutive nan epithelium zantray.Sepandan, foure Transwell ki disponib nan komès ak manbràn polyester yo pa elastik epi yo pa ka similye mouvman ki sanble ak peristaltik. arly, pwopriyete yo estatik nan lòj la apical raman pèmèt alontèm bakteri ko-kilti nan chips ibrid. Pandan ke nou ka solidman pwovoke 3D morphogenesis nan foure Transwell lè w ap itilize chips ibrid, mank nan byomekanik ki enpòtan fizyolojik ak koule likid apical ka limite posibilite nan platfòm chip ibrid pou aplikasyon potansyèl yo.
Rekonstriksyon konplè aks kript-villus imen an nan kilti zantray-sou-yon-chip ak ibrid-sou-yon-chip pa te konplètman etabli.Depi mòfogenesis kòmanse nan yon monokouch epitelyal, mikwo-achitekti 3D pa nesesèman bay resanblans mòfolojik ak kript nan vivo. Kripte a ak rejyon vil yo pa t klèman delimite. Malgre ke pi wo chanèl anwo sou chip la mennen nan ogmante wotè nan epithelium nan mikro-engineered, se wotè maksimòm nan toujou limite a ~ 300-400 µm. Pwofondè aktyèl la nan kript entesten imen an nan ti ak gwo trip yo se ~ 135 µm ak ~ 400 µm ak ~ 400 µm µm, ak ~ 400 µm, µm 6.
Soti nan yon pwendvi D, D in situ super-rezolisyon nan mikwo-achitekti 3D ka limite a sa sèlman zantray la sou yon chip, depi distans ki nesesè k ap travay soti nan lantiy la objektif ak kouch epitelyal la se sou lòd nan kèk milimèt. Pou simonte pwoblèm sa a, yo ka bezwen yon objektif byen lwen. mikrofabrikasyon nan zantray la sou yon chip enplike adezyon pèmanan ant chak kouch, li trè difisil yo louvri oswa retire kouch siperyè a egzamine estrikti nan sifas nan kouch epitelyal la.
Idrofobisite PDMS a se yon faktè limite nan etid ki baze sou mikwofluid ki fè fas ak ti molekil idrofob, depi PDMS ka adsorbe molekil idrofob sa yo. Altènativ a PDMS yo ka konsidere ak lòt materyèl polymère. Altènativman, modifikasyon sifas PDMS (egzanp, kouch ak materyèl lipofil yo ka minimize 42 glycol) molekil fobik.
Finalman, metòd nou an pa te byen karakterize an tèm de bay yon tès depistaj wo-debi oswa "yon sèl-gwosè-adapte-tout" platfòm eksperimantal itilizatè-zanmitay. Pwotokòl aktyèl la mande pou yon ponp sereng pou chak mikwo-aparèy, ki pran espas nan yon enkibatè CO2 epi anpeche eksperyans gwo echèl. ki pèmèt kontinyèl renouvèlman ak retire medya basolateral).
Pou pwovoke 3D morphogenesis nan epithelium entesten imen an vitro, nou te itilize yon aparèy entesten chip microfluidic ki gen de mikwochanèl paralèl ak yon manbràn pore elastik nan mitan yo kreye yon koòdone lumèn-kapilè. Nou demontre tou itilize nan yon sèl-chanèl aparèy mikwofluidik (yon chip ibrid) ki bay koule kontinyèl basolateral anba transwelling epitheliens insérer divès kalite entesten transwellogenes epitheli nan divès kalite transwellogenes. selil epitelyal yo ka demontre lè w aplike manipilasyon direksyon nan koule pou retire antagonist morfojèn nan lòj basolateral la. Tout pwosedi eksperimantal la (Figi 1) konsiste de senk pati: (i) mikrofabrikasyon nan chip zantray la oswa Transwell insertable chip hybrid (etap 1-5; Bwat 1), (ii) preparasyon nan selil entesten epithelial oswa selil entesten imen;bwat 2-5), (iii) kilti selil epitelyal entesten sou chips entesten oswa chips ibrid (etap 6-9), (iv) endiksyon 3D morphogenesis in vitro (etap 10) ak (v)) pou karakterize mikwostrikti epitelyal 3D la (etap 11-24). morfogenesis telyal nan kontwòl espasyal, tanporèl, kondisyonèl, oswa pwosedi.
Nou te itilize de platfòm kilti diferan: gut-on-a-chip with straight channels or nonlineary convoluted channels, or hybrid chips which hybrid transwell (TW) inserts in a microfluidic device, fabrike jan sa dekri nan Bwat 1, ak etap 1-5 "Device Fabrication" montre etap prensipal yo nan fè yon sèl chip oswa yon chip ibrid nan selil enteslin imen. ) ak pwosedi kilti yo itilize nan pwotokòl sa a "Mòfojenèz in vitro" montre etap jeneral kote Caco-2 oswa selil epitelyal ki sòti nan organoid yo kiltive sou yon chip entesten oswa sou foure Transwell nan yon chip ibrid, ki te swiv pa endiksyon morfogenesis 3D ak fòmasyon nan yon estrikti epitelyal karakterize. nan karakterizasyon diferansyasyon selilè, syans fizyoloji zantray, etablisman ekosistèm lame-mikwobyom, ak modèl maladi.Imunofluorescence imaj nan "Cell Differentiation" ki montre nwayo, F-aktin ak MUC2 eksprime nan kouch epitelyal 3D Caco-2 ki te pwodwi sou chip zantray la. Fizyoloji montre larim ki te pwodwi pa tach pou asid sialik ak N-acetylglucosamine résidus lè l sèvi avèk agglutinin jèm ble fliyoresan. lial cells.The dwat panèl montre lokalizasyon GFP E. coli ko-kilti ak 3D Caco-2 selil epitelyal, ki te swiv pa tach imunofluoresans ak F-aktin (wouj) ak nwayo (ble). selil (egzanp, PBMC;vèt).Selil Caco-2 yo te kiltive pou etabli yon kouch epitelyal 3D.Ba echèl, 50 µm.Imaj nan ranje anba a: "Diferansyasyon selil" adapte ak pèmisyon nan referans.2.Oxford University Press;Repwodwi avèk pèmisyon nan Ref.5.NAS;"Host-Microbe Ko-Kilti" adapte ak pèmisyon nan ref.3.NAS;"Modelaj Maladi" adapte ak pèmisyon nan referans.5.NAS.
Tou de zantray-sou-chip ak ibrid chips yo te fabrike lè l sèvi avèk PDMS kopi ki te demolded soti nan mwazi Silisyòm pa lithography mou1,44 ak modele ak SU-8.The konsepsyon mikwochanèl yo nan chak chip yo detèmine lè w konsidere idrodinamik tankou estrès taye taye ak presyon idrodinamik 1,4,12.Orijinal gut-on-a-chip designs of the microchannels. , te evolye nan yon konplèks gut-on-a-chip (Done pwolonje Fig. 1b) ki gen ladan yon pè nan mikwochanèl koube pwovoke Ogmante tan rezidans likid, modèl koule nonlineyè, ak deformation miltiaksyal nan selil kiltive (Fig. 2a-f) 12.Lè plis konplèks entesten yo bezwen yo dwe rekreye byomekanik yo, nou bezwen konplèks gut yo dwe rekreye-a-chip yo. voluted Gut-Chip tou fòtman pwovoke 3D mòfogenesis nan yon tan ki sanble ak yon degre menm jan an nan kwasans epitelyal konpare ak Gut-Chip orijinal la, kèlkeswa kalite selil kiltive a.2a) .Pou fabrike zantray la sou yon chip, yo te prepare kouch PDMS anwo a sekansyalman kole ak yon fim PDMS ki mouye epi li aliye ak kouch PDMS ki pi ba a pa lyezon irevokabl lè l sèvi avèk yon trete korona (Fig. 2b-f). Done pwolonje Fig. 2). Pwosesis lyezon an fèt pa trete sifas kopi PDMS ak vè ak plasma oksijèn oswa tretman corona.Apre esterilizasyon aparèy mikwofabrike ki tache ak tib silikone a, konfigirasyon aparèy la te pare pou fè 3D morphogenesis epitelyal entesten an (Figi 2g).
a, Ilistrasyon chematik preparasyon pati PDMS ki soti nan mwazi silikon SU-8 modele. Solisyon PDMS ki pa geri a te vide sou yon mwazi Silisyòm (agòch), geri nan 60 °C (midwayen) ak demouled (adwat).PDMS demolded la te koupe an moso epi netwaye pou plis itilize. d, Yon seri de foto konpozan PDMS anwo ak pi ba yo ak aparèy entesten yo rasanble sou chip.e, Chema aliyman anwo, manbràn, ak pi ba konpozan PDMS.Chak kouch se irevokabl estokaj pa plasma oswa tretman corona.f, Chema nan aparèy la fabrike gut-on-a-chip ak supèrpoz, microchannel-up-chambers. Kilti idik selil yo.Te fabrike zantray la sou yon chip reyini ak yon tib silikon ak sereng mete sou yon kouvèti. Yo te mete aparèy la chip sou kouvèti a nan yon plat Petri 150 mm pou trete.Se lyan an itilize yo fèmen tib la silikon. ed nan chip ibrid la pou pwovoke mòfogenesis entesten 3D.Mwayen an gaye nan mikwochanèl anba kouch selil ki etabli sou insert Transwell la.Ba echèl, 1 cm.h Reenprime ak pèmisyon nan referans.4.Elsevier.
Nan pwotokòl sa a, liy selil Caco-2 ak òganoid entesten yo te itilize kòm sous epitelyal (figi 3a). Tou de kalite selil yo te kiltive poukont yo (Bwat 2 ak Bwat 5) epi yo te itilize pou simen microchannels ECM-kouvwi nan zantray sou-chip oswa Transwell foure. 50) nan T-flakon yo rekòlte yo prepare sispansyon selil dissociated pa likid trypsinization (bwat 2).Organoid entesten imen ki soti nan byopsi entesten oswa reseksyon chirijikal yo te kiltive nan bòl echafodaj Matrigel nan plak 24-byen pou sipòte mikro-anviwònman estriktirèl la. te konplete chak jou jou jiskaske organoids yo te grandi a ~ 500 µm an dyamèt. Organoids ki te grandi yo rekòlte ak disoye nan selil sèl pou simen sou zantray oswa foure Transwell sou yon chip (Bwat 5). blesi kont zòn ki pa blese) ak kote gastwoentestinal nan aparèy la (egzanp, duodenum, jejunum, ileum, secum, kolon, oswa rèktòm).Nou bay yon pwotokòl optimize nan Bwat 5 pou kiltive òganoid kolon (koloid) ki tipikman mande pou pi gwo konsantrasyon nan morfojèn pase ti organoid entesten.
a, Workflow pou endiksyon nan mòfogenesis zantray nan chip nan zantray.Caco-2 imen entesten epitelyal ak organoid entesten yo te itilize nan pwotokòl sa a demontre 3D morphogenesis.The izole selil epitelyal yo te simen nan aparèy la gut-on-a-chip prepare (preparasyon chip). se koule ikal (AP) inisye epi konsève pou 2 premye jou yo (koule, AP, D0-D2). Se koule basolateral (BL) tou inisye ansanm ak mouvman etann siklik (detire, koule, AP ak BL) lè yon monokouch 2D konplè fòme. chak etap eksperimantal oswa pwen tan (graf ba, 100 µm). Kat dyagram chema yo ilistre kaskad ki koresponn nan mòfogenesis zantray (anwo adwat). Flèch tirè yo nan chema a reprezante direksyon koule likid la. kouch (adwat).c, orizontal View frontal nan etabli Caco-2 3D, claudin (ZO-1, wouj) ak manbràn fwontyè bwòs kontinyèl ki make F-aktin (vèt) ak nwayo (ble) Immunofluorescence konfokal vizyalizasyon nan selil epitelyal sou chips entesten. d sou yon chip yo te jwenn pa mikwoskospi kontras faz nan jou 3, 7, 9, 11, ak 13. Ankadreman an (anwo adwat) montre gwo agrandisman imaj yo bay la.e, fotomikrograf DIC nan epiteli 3D organoyid ki tabli nan zantray la sou tranch yo te pran nan jou 7.f, Kovèti imunofluoresans pou imaj selil STGR5;magenta), selil goblet (MUC2; vèt), F-aktin (gri) ak nwayo (cyan) grandi sou bato zantray pou 3 jou, respektivman (Goch) ak 13 jou (mitwayen) organoid sou kouch epitelyal la. epithelium id etabli nan zantray la sou yon chip pa tach manbràn plasma a ak lank CellMask (adwat) nan jou 13 nan kilti. Ba echèl se 50 μm sof si otreman endike.b Reenprime ak pèmisyon nan referans.2.Oxford University Press;c Adapte avèk pèmisyon Reference.2.Oxford University Press;e ak f adapte ak pèmisyon pa referans.12 Dapre Creative Commons License CC BY 4.0.
Nan zantray la sou yon chip, li nesesè modifye sifas la idrofob nan manbràn pore PDMS la pou siksè ECM kouch. Nan pwotokòl sa a, nou aplike de metòd diferan pou modifye idrofobisite nan manbràn PDMS. Kilti idik nan epithelium organoid mande pou fonksyonalizasyon sifas ki baze sou chimik pou reyalize depo efikas nan pwoteyin ECM pa sekans aplike polyethyleneimine (PEI) ak glutaraldehyde nan PDMS microchannels.Apre modifikasyon sifas yo, pwoteyin ECM yo te depoze yo kouvri sifas la fonksyonalize PDMS ak Lè sa a, prezante nan selil yo izole epitelimin yo, selil yo kòmanse pa selil yo. mwayen an nan microchannel anwo a jiskaske selil yo fòme yon monokouch konplè, pandan y ap microchannel ki pi ba a kenbe kondisyon estatik.Metòd optimize sa a pou deklanchman sifas ak kouch ECM pèmèt atachman nan epitelyal òganoid pwovoke 3D morphogenesis sou sifas la PDMS.
Kilti Transwell yo mande tou kouch ECM anvan simen selil;sepandan, kilti Transwell pa mande pou etap konplèks pretreatman aktive sifas la nan foure pore.Pou grandi selil Caco-2 sou foure Transwell, ECM kouch sou foure pore akselere atachman nan selil Caco-2 disoye (<1 èdtan) ak fòmasyon baryè junction sere (<1-2 jou). sifas manbràn (<3 h) epi konsève jiskaske organoid yo fòme yon monokouch konplè ak entegrite baryè .Kilti Transwell yo fèt nan plak 24-byen san yo pa itilize chip ibrid.
In vitro 3D morphogenesis ka inisye lè w aplike likid koule nan aspè basolateral nan yon kouch epitelyal etabli.Nan zantray la sou yon chip, morphogenesis epitelyal te kòmanse lè mwayen an te perfused nan microchannels anwo ak pi ba yo (figi. 3a).Kòm deja dekri, li enpòtan pou prezante koule likid nan enferyè a (direksyon morphogenes kontinyèl) enferyè. eleman nitritif ak serom nan selil ki mare sou manbràn pore ak jenere estrès taye luminal, nou tipikman aplike doub koule nan zantray la sou yon chip.Nan chip ibrid, foure Transwell ki gen monokouch epitelyal yo te mete nan chips yo ibrid. Lè sa a, yo te mwayen an aplike anba bò basolateral transwell insert nan mikwochannel la.
Karakteristik mòfolojik nan kouch epitelyal 3D mikwo-engineered yo ka analize lè w aplike divès kalite D ', ki gen ladan mikwoskospi kontras faz, diferans entèferans kontras (DIC) mikwoskòp, SEM, oswa imunofluoresan mikwoskòp konfokal (Figi 3 ak 4). e nan transparans optik nan PDMS ak fim Polyester, tou de tribin yo trip-on-a-chip ak ibrid chip tribin yo ka bay an tan reyèl D 'in situ san yo pa bezwen an pou seksyon oswa demonte aparèy la. -100 ak 2% (wt/vol) ) albumin serom bovin (BSA), nan lòd. Tou depan de kalite selil la, yo ka itilize diferan fiksatif, pèmeabilizan, ak ajan bloke. Yo itilize antikò prensipal ki vize selil ki depann de liyaj oswa makè rejyon yo pou mete aksan sou selil ki imobilize in situ sou chip la, ki te swiv pa antikò segondè yo ansanm ak sib nwayo 4-midi, sib, swa. -phenylene) indole, DAPI) oswa F-aktin (egzanp, phaloidin ki gen etikèt fluorescent).Yo ka fè D 'vivan ki baze sou fliyoresans tou in situ pou detekte pwodiksyon larim (Fig.1, "Diferansasyon selilè" ak "Fizyoloji zantray"), kolonizasyon owaza nan selil mikwòb (Fig. 1, "Ko-kilti lame-mikwòb"), rekritman selil iminitè (Fig. 1, 'Modèl maladi') oswa kontou mòfoloji epitelyal 3D (Fig. 3c, fig. pi ba kouch mikwochanèl, jan sa dekri nan ref.Kòm yo montre nan Fig. 2, mòfoloji epitelyal 3D la ak mikwovilli yo sou fwontyè bwòs apik la ka vizyalize pa SEM (Fig. 3b).Ou ka evalye ekspresyon makè diferansyasyon yo lè w fè PCR5 quantitative oswa yon sèl selil RNA sekans. trypsinization ak Lè sa a, itilize pou analiz molekilè oswa jenetik.
a, Workflow pou endiksyon mòfojenèz entesten nan yon chip ibrid. Kako-2 ak òganoid entesten yo itilize nan pwotokòl sa a pou demontre mòfojenèz 3D nan yon platfòm chip ibrid. Selil epitelyal dissociated yo te simen nan foure Transwell prepare (Preparasyon TW; gade figi ki anba a). Yon fwa selil yo te simen (semenn) epi yo te mete tout selil transstatik nan kondisyon transstatik. W kilti).Apre 7 jou, yon sèl transwell insert ki gen yon monokouch 2D nan selil epitelyal yo te entegre nan yon chip ibrid prezante yon koule basolateral (Flow, BL), ki finalman mennen nan jenerasyon an nan yon kouch epitelyal 3D (mòfogenesis). .Schéma yo nan kouch anwo yo ilistre konfigirasyon eksperimantal la pou chak etap.b, Chips Hybrid (skematik gòch) ka mennen nan 3D morphogenesis nan selil epitelyal organoid ak tèt-desann opinyon mikwoskòp konfokal yo pran nan diferan pozisyon Z (anwo, mitan, ak pi ba;gade dwat chematik ak liy pwenti ki koresponn yo).te montre evidan karakteristik mòfolojik.F-aktin (cyan), nwayo (gri).c, Mikrografi konfokal Fluorescence (3D angle View) nan selil epitelyal òganoid ki sòti nan kiltivasyon nan Transwell estatik (TW; inset nan bwat tirè blan) kont chip ibrid (pi gwo piki konplè) konpare 2D ak mòfoloji 3D a, respektivman nan 3D vètikal. pper kwen dwat; "XZ") montre tou karakteristik 2D ak 3D.Ba echèl, 100 µm.c Reenprime ak pèmisyon nan referans.4.Elsevier.
Kontwòl yo ka prepare pa kiltive selil yo menm (Caco-2 oswa selil epitelyal organoid entesten) nan monokouch ki genyen de dimansyon anba kondisyon kilti konvansyonèl estatik. Miyò, rediksyon eleman nitritif ka lakòz akòz kapasite volim limite mikwo-chanèl yo (sa vle di ~ 4 µL nan kanal siperyè a sou konsepsyon orijinal la zantray-chip).
Pwosesis litografi mou yo ta dwe fèt nan yon chanm pwòp. Pou chak kouch sou chip la (anwo ak pi ba kouch ak manbràn) ak chip ibrid, yo te itilize diferan fotomask ak fabrike sou wafers Silisyòm separe paske wotè mikwo-chanèl yo te diferan. µm.
Mete yon wafer Silisyòm 3-pous nan yon plat ak asetòn. Dousman toubiyon plak la pou 30 segonn, Lè sa a, lè sèk wafer la.Transfere wafer la nan yon plak ki gen IPA, Lè sa a, vire plak la pou 30 s pou netwaye.
Yon solisyon piranha (melanj oksijene idwojèn ak asid silfirik konsantre, 1:3 (vol/vol)) ka opsyonèlman itilize pou maksimize retire résidus òganik nan sifas wafer Silisyòm lan.
Solisyon Piranha trè korozif epi li jenere chalè.Li nesesè prekosyon sekirite adisyonèl.Pou jete fatra a, kite solisyon an refwadi epi transfere nan yon veso pou fatra pwòp e sèk.Sèvi ak veso segondè yo epi byen make veso fatra yo.Tanpri swiv direktiv sekirite etablisman an pou plis detay pwosedi yo.
Dezidrate gaufre yo lè w mete yo sou yon plak cho 200 °C pou 10 min.Apre dezidratasyon, yo te souke wafer la senk fwa nan lè a refwadi.
Vide ~ 10 g nan fotorezist SU-8 2100 sou sant la nan wafer nan Silisyòm netwaye.Sèvi ak Pensèt gaye fotorezist la respire sou wafer la.Okazyonèlman mete wafer la sou yon plak cho 65 ° C fè photoresist la mwens kolan ak pi fasil yo gaye. Pa mete wafer a dirèkteman sou plak la cho.
SU-8 te distribye egalman sou wafer la pa kouri vire kouch. Pwograme yon wotasyon fèk ap rantre nan SU-8 pou 5-10 s pou difize nan 500 rpm nan yon akselerasyon 100 rpm / s.Mete vire prensipal la pou 200 µm epesè modèl nan 1,500 rpm, oswa reyalize yon µm epesè 5 250 µm yer nan zantray la sou chip la; gade "Etap kritik" anba a) mete nan yon akselerasyon 300 rpm / s 30 segonn nan 1,200 rpm.
Vitès vire prensipal la ka ajiste selon epesè sib modèl SU-8 sou wafer Silisyòm lan.
Pou fabrike modèl SU-8 ki gen 500 µm wotè pou kouch siperyè zantray la sou chip la, yo te repete kouch vire ak etap mou k ap kwit nan bwat sa a (etap 7 ak 8) an sekans (gade etap 9) pou pwodui de kouch 250 µm. .
Mou kwit wafers SU-8 kouvwi yo ak anpil atansyon mete wafers yo sou yon plak cho nan 65 °C pou 5 min, Lè sa a, chanje anviwònman an a 95 °C ak enkube pou yon lòt 40 min.
Pou reyalize yon wotè 500 μm nan modèl SU-8 nan mikwochanèl anwo a, repete etap 7 ak 8 pou jenere de kouch SU-8 250 μm epè.
Sèvi ak UV Mask Aligner, fè yon tès lanp selon enstriksyon manifakti a pou kalkile tan ekspoze wafer la.(tan ekspoze, ms) = (dòz ekspoze, mJ/cm2)/(pouvwa lanp, mW/cm2).
Apre w fin detèmine tan ekspoze a, mete fotomask la sou detantè mask UV mask la epi mete fotomask la sou wafer kouvwi SU-8 la.
Mete sifas enprime fotomask la dirèkteman sou bò kouvwi SU-8 wafer Silisyòm pou minimize dispèsyon UV.
Ekspoze wafer kouvwi SU-8 ak fotomask vètikal a 260 mJ/cm2 nan limyè UV pou tan an ekspoze predetèmine (gade etap 10 nan bwat sa a).
Apre ekspoze UV, yo te kwit gauf Silisyòm SU-8-kouvwi nan 65 ° C pou 5 min ak 95 ° C pou 15 min sou chak plak cho pou fabrike modèl ak yon wotè 200 μm. Pwolonje tan an apre kwit nan 95 ° C a 30 min pou fabrike modèl ak yon wotè 500 μm.
Se pwomotè a vide nan yon plat an vè, epi li se wafer nan kwit nan fou yo mete nan plat la.
Rense mwazi an devlope ak ~ 10 mL devlopè fre ki te swiv pa IPA pa flite solisyon an lè l sèvi avèk yon pipèt.
Mete wafer la nan yon pwodui netwayaj plasma epi ekspoze a plasma oksijèn (gaz atmosferik, presyon sib 1 × 10−5 Torr, pouvwa 125 W) pou 1.5 min.
Mete wafer la nan yon desiccator vakyòm ak yon glisad an vè andedan.Obwalèt ak glisad yo ka mete kòt a kòt.Si se desiccator a vakyòm divize an plizyè kouch pa yon plak, mete glisad yo nan chanm ki pi ba a ak gaufr yo nan chanm anwo a. epi aplike vakyòm pou silanizasyon.
Deglase yon flakon selil Caco-2 jele nan yon beny dlo a 37°C, apresa transfere selil yo dekonjle nan yon flacon T75 ki gen 15 mL mwayen Caco-2 prechofe 37°C.
Pou pase selil Caco-2 nan ~ 90% konfluyans, premye chofe mwayen Caco-2, PBS, ak 0.25% trypsin / 1 mM EDTA nan yon beny dlo 37 ° C.
Aspire mwayen an pa aspirasyon vakyòm. Lave selil yo de fwa ak 5 mL PBS cho lè w repete aspirasyon vakyòm epi ajoute PBS fre.