Mèsi paske ou te vizite Nature.com. Vèsyon navigatè w ap itilize a pa gen sipò limite pou CSS. Pou pi bon eksperyans lan, nou rekòmande pou w itilize yon navigatè ki ajou (oswa dezaktive mòd konpatibilite nan Internet Explorer). Antretan, pou asire sipò kontinyèl, nou pral montre sit la san estil ak JavaScript.
Mòfojènèz entesten imen an etabli karakteristik kript-vilis nan mikwoachitekti epitelyal 3D ak òganizasyon espasyal. Estrikti inik sa a nesesè pou kenbe omeyostazi entesten an lè li pwoteje nich selil souch nan kript bazal la kont antijèn mikwòb ekzojèn ak metabolit yo. Anplis de sa, viliz entesten yo ak larim sekrete yo prezante selil epitelyal diferansye fonksyonèlman ak yon baryè pwoteksyon sou sifas mikez entesten an. Se poutèt sa, rkree estrikti epitelyal 3D yo enpòtan anpil pou konstriksyon modèl entesten in vitro. Li enpòtan pou note ke òganik mimetik entesten-sou-yon-chip la ka pwovoke mòfojènèz 3D espontane nan epitelyòm entesten an ak fonksyon fizyolojik ak byomekanik amelyore. Isit la, nou bay yon pwotokòl repwodibl pou pwovoke mòfojènèz entesten an yon fason solid nan entesten an sou yon chip mikrofluidik osi byen ke nan yon chip ibrid Transwell entegre. Nou dekri metòd detaye pou fabrikasyon aparèy, kiltivasyon selil epitelyal organoid Caco-2 oswa entesten nan anviwònman konvansyonèl osi byen ke sou yon platfòm mikrofluidik, endiksyon mòfojènèz 3D, ak karakterizasyon epitelyal 3D etabli yo. lè l sèvi avèk plizyè modalite imaj. Pwotokòl sa a reyalize rejenerasyon mikwoachitekti entesten fonksyonèl la lè li kontwole koule likid bazolateral la pandan 5 jou. Metòd morfogenèz in vitro nou an itilize estrès tayisman ak mouvman mekanik ki enpòtan nan nivo fizyolojik epi li pa mande pou jeni selilè konplèks oswa manipilasyon, ki ka depase lòt teknik ki deja egziste yo. Nou prevwa ke pwotokòl nou pwopoze a ta ka gen gwo enplikasyon pou kominote rechèch byomedikal la, bay yon metòd pou rejenerasyon kouch epitelyal entesten 3D in vitro pou aplikasyon byomedikal, klinik ak famasetik.
Eksperyans yo demontre ke selil epitelyal entesten Caco-2 ki kiltive nan gut-on-a-chip1,2,3,4,5 oubyen aparèy mikrofluidik bikouch6,7 ka sibi mòfojènèz 3D espontane in vitro san yon konpreyansyon klè sou mekanis ki kache a. Nan etid resan nou an, nou te jwenn ke retire antagonis mòfojèn ki sekrete bazolateralman nan aparèy kilti yo nesesè e sifizan pou pwovoke mòfojènèz epitelyal 3D in vitro, sa ki te demontre pa Caco-2 ak òganoid entesten ki sòti nan pasyan yo. Selil epitelyal yo te valide. Nan etid sa a, nou te konsantre espesyalman sou pwodiksyon selilè ak distribisyon konsantrasyon yon antagonis Wnt pisan, Dickkopf-1 (DKK-1), nan trip-sou-yon-chip ak aparèy mikwofluidik modifye ki gen insert Transwell, yo rele "Chip Ibrid". Nou demontre ke adisyon antagonis Wnt ekzojèn (tankou DKK-1, represor Wnt 1, pwoteyin frizzled ki gen rapò ak sekrete 1, oswa Soggy-1) nan trip sou chip la anpeche mòfojènèz oswa deranje kouch epitelyal 3D pre-estriktire a, ki sijere ke estrès antagonis pandan kilti responsab pou mòfojènèz entestinal in vitro. Se poutèt sa, yon apwòch pratik pou reyalize mòfojènèz solid nan koòdone epitelyal la se retire oswa kenbe minimòm nivo antagonis Wnt yo nan konpatiman bazolateral la pa yon lave aktif (pa egzanp, nan platfòm trip-sou-yon-chip oswa ibrid-sou-yon-chip) oswa difizyon. Medya bazolateral (pa egzanp, soti nan insert Transwell nan gwo rezèvwa bazolateral nan pi).
Nan pwotokòl sa a, nou bay yon metòd detaye pou fabrike mikwoaparèy trip-sou-yon-chip ak chip ibrid Transwell-insertable (etap 1-5) pou kiltive selil epitelyal entesten sou manbràn pore ki baze sou polidimetilsiloksan (PDMS) (etap 6A, 7A, 8, 9) oswa manbràn polyester nan insert Transwell (etap 6B, 7B, 8, 9) ak morfogenèz 3D pwovoke in vitro (etap 10). Nou te idantifye tou karakteristik selilè ak molekilè ki endike istogenèz espesifik nan tisi ak diferansyasyon selilè ki depann de liyaj lè nou aplike plizyè modalite imaj (etap 11-24). Nou pwovoke morfogenèz lè nou itilize selil epitelyal entesten imen, tankou Caco-2 oswa òganoid entesten, nan de fòma kilti ak detay teknik ki gen ladan modifikasyon sifas manbràn pore, kreyasyon monokouch 2D, ak byochimik entesten ak repwodiksyon mikwoanviwònman byomekanik in vitro. Pou pwovoke morfogenèz 3D soti nan monokouch epitelyal 2D, nou te retire antagonis morfogenèz nan tou de kiltive yo. fòme lè medyòm nan koule nan konpatiman bazolateral kilti a. Finalman, nou bay yon reprezantasyon itilite yon kouch epitelyal 3D rejenerab ki ka itilize pou modle kwasans epitelyal ki depann sou mòfojèn, ko-kilti longitudinal lame-mikwobyòm, enfeksyon patojèn, blesi enflamatwa, disfonksyon baryè epitelyal, ak terapi ki baze sou probyotik Egzanp.enfliyans.
Pwotokòl nou an ka itil pou yon pakèt syantis nan rechèch debaz (pa egzanp, byoloji mikez entesten, byoloji selil souch, ak byoloji devlopman) ak rechèch aplike (pa egzanp, tès dwòg preklinik, modèl maladi, jeni tisi, ak gastroenteroloji) ki gen yon gwo enpak. Akòz repwodiktibilite ak robustès pwotokòl nou an pou pwovoke morfogenèz 3D nan epitelyòm entesten an in vitro, nou prevwa ke estrateji teknik nou an ka gaye bay odyans k ap etidye dinamik siyalizasyon selilè pandan devlopman entesten, rejenerasyon oswa omeyostazi. Anplis de sa, pwotokòl nou an itil pou kesyone enfeksyon anba divès ajan enfeksyon tankou Norovirus 8, Sendwòm Respiratwa Egi Grav Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 oswa Vibrio cholerae. Odyans patoloji maladi ak patogenez yo itil tou. Itilizasyon yon sistèm mikwofizyoloji entesten sou chip ka pèmèt ko-kilti longitudinal 10 ak evalyasyon ki vin apre sou defans lame a, repons iminitè yo ak reparasyon blesi ki gen rapò ak patojèn nan aparèy dijestif la (GI) 11. Lòt maladi GI ki asosye ak sendwòm entesten ki koule, maladi selyak, maladi Crohn, kolit ilsèratif, poukit, oswa sendwòm entesten iritab ka simile lè kouch epitelyal entesten 3D yo prepare lè l sèvi avèk kouch epitelyal entesten 3D pasyan an, maladi sa yo gen ladan atrofi viloz, rakoursisman kript, domaj mikez, oswa baryè epitelyal ki gen pwoblèm. Byopsi oswa òganoid entesten ki sòti nan selil souch 12,13. Pou pi byen modle konpleksite ki pi wo nan anviwònman maladi a, lektè yo ka konsidere ajoute kalite selil ki enpòtan pou maladi a, tankou selil mononikleyè san periferik pasyan (PBMC), nan modèl ki gen mikwoachitekti viloz-kript entesten 3D. selil iminitè espesifik tisi, 5.
Piske mikwoestrikti epitelyal 3D a ka fiks epi vizyalize san pwosesis seksyon an, telespektatè k ap travay sou transkriptomik espasyal ak imaj wo rezolisyon oswa super rezolisyon ka enterese nan kartografi nou fè sou dinamik espasyotanporèl jèn ak pwoteyin sou nich epitelyal yo. Enterese nan teknoloji. Repons a stimuli mikwòb oswa iminitè. Anplis de sa, diafoni longitudinal lame-mikwobyòm 10, 14 ki kowòdone omeyostazi entesten an ka etabli nan kouch mikwòb entesten 3D a lè yo kiltive divès espès mikwòb, kominote mikwòb oswa mikwobyota fekal, espesyalman nan trip-sou-yon-chip la. nan platfòm nan. Apwòch sa a patikilyèman atiran pou odyans k ap etidye iminoloji mikez, gastroenteroloji, mikwobyòm imen, kiltiromik ak mikwobyoloji klinik k ap chèche kiltive mikwobyota entesten ki pa t kiltive anvan nan laboratwa a. Si pwotokòl mòfojènèz in vitro nou an ka adapte ak fòma kilti évolutif, tankou insert milti-pi nan plak 24, 96 oswa 384 pi ki kontinyèlman ranpli konpatiman bazolateral yo, pwotokòl la kapab tou distribye bay moun k ap devlope platfòm famasetik, byomedikal oswa tès depistaj oswa validasyon wo-debi pou endistri alimantè a. Kòm yon prèv prensip, nou te fèk demontre posibilite yon sistèm mòfojènèz miltiplex wo-debi évolutif nan yon fòma plak 24-pi. Anplis de sa, plizyè pwodwi ògàn-sou-yon-chip te komèsyalize16,17,18. Se poutèt sa, validasyon metòd mòfojènèz in vitro nou an ka akselere epi potansyèlman adopte pa anpil laboratwa rechèch, endistri oswa ajans gouvènman ak regilasyon pou konprann reprogramasyon selilè mòfojènèz entesten in vitro nan nivo transkriptomik pou teste dwòg oswa byoterapi Yo te evalye absòpsyon ak transpò kandida dwòg yo lè l sèvi avèk ranplasan entesten 3D oswa lè l sèvi avèk modèl ògàn sou yon chip koutim oswa komèsyal pou evalye repwodiktibilite pwosesis mòfojènèz entesten an.
Yo te itilize yon kantite limite modèl eksperimantal ki enpòtan pou moun pou etidye mòfojèn epitelyal entesten an, sitou akòz mank pwotokòl ki ka aplike pou pwovoke mòfojèn 3D in vitro. Anfèt, anpil nan konesans aktyèl sou mòfojèn entesten an baze sou etid sou bèt (pa egzanp, pwason zebra20, sourit21 oswa poul22). Sepandan, yo mande anpil travay ak anpil lajan, yo ka kesyonab sou plan etik, epi sa ki pi enpòtan, yo pa detèmine avèk presizyon pwosesis devlopman imen yo. Modèl sa yo tou trè limite nan kapasite yo pou yo teste nan yon fason ki ka chanje plizyè fason. Se poutèt sa, pwotokòl nou an pou rejenerasyon estrikti tisi 3D in vitro depase modèl bèt in vivo ansanm ak lòt modèl kilti selil 2D estatik tradisyonèl yo. Jan nou te dekri deja, itilizasyon estrikti epitelyal 3D yo te pèmèt nou egzamine lokalizasyon espasyal selil diferansye yo nan aks kript-vilis an repons a divès estimilis mikez oswa iminitè. Kouch epitelyal 3D yo ka bay yon espas pou etidye kijan selil mikwòb yo fè konpetisyon pou fòme nich espasyal ak evolisyon ekolojik an repons a faktè lame yo (pa egzanp, kouch mikis entèn kont ekstèn, sekresyon nan IgA ak peptid antimikwòb). Anplis de sa, mòfoloji epitelyal 3D ka pèmèt nou konprann kijan mikwobyota entesten an estriktire kominote li yo epi pwodui metabolit mikwòb yo yon fason sinèjik (pa egzanp, asid gra chèn kout) ki fòme òganizasyon selilè ak nich selil souch nan kript bazal yo. Karakteristik sa yo ka sèlman demontre lè kouch epitelyal 3D yo etabli in vitro.
Anplis metòd nou itilize pou kreye estrikti epitelyal entesten 3D yo, gen plizyè metòd in vitro. Kilti òganoid entesten an se yon teknik jeni tisi dènye kri ki baze sou kiltivasyon selil souch entesten anba kondisyon mòfojèn espesifik23,24,25. Sepandan, itilizasyon modèl òganoid 3D pou analiz transpò oswa ko-kilti lame-mikwobyòm souvan difisil paske limen entesten an fèmen andedan òganoid la e, kidonk, entwodiksyon konpozan luminal tankou selil mikwòb oswa antijèn ekzojèn limite. Aksè a limen òganoid yo ka amelyore lè l sèvi avèk yon mikwoenjektè,26,27 men metòd sa a pwogrese e li mande anpil travay epi li mande konesans espesyalize pou fèt. Anplis de sa, kilti òganoid tradisyonèl yo kenbe nan echafodaj idwojèl anba kondisyon estatik pa reflete byomekanik aktif in vivo a avèk presizyon.
Gen lòt apwòch plizyè gwoup rechèch itilize echafodaj idrojel 3D pre-estriktire pou imite estrikti epitelyal entesten an lè yo kiltive selil entesten imen izole sou sifas jèl la. Fabrike echafodaj idrojel lè l sèvi avèk mwazi enprime 3D, mikwo-fraize, oswa fabrike litografikman. Metòd sa a montre aranjman oto-òganize selil epitelyal izole in vitro ak gradyan mòfojèn fizyolojikman enpòtan, etabli yon estrikti epitelyal ak yon rapò aspè ki wo ak yon entèraksyon stroma-epitelyal lè yo enkli selil stromal nan echafodaj la. Sepandan, nati echafodaj pre-estriktire yo ka anpeche ekspozisyon pwosesis mòfojenetik espontane a li menm. Modèl sa yo pa bay tou koule limyè oswa entèstisyèl dinamik, yo manke estrès tayisman likid ke selil entesten yo bezwen pou sibi mòfojènèz epi jwenn fonksyon fizyolojik. Yon lòt etid resan te itilize echafodaj idrojel nan yon platfòm mikwofluidik epi li te modele estrikti epitelyal entesten yo lè l sèvi avèk teknik grave lazè. Organoid entesten sourit yo swiv modèl grave pou fòme estrikti tibilè entesten yo, epi koule likid entraluminal la ka rekapitulatif lè l sèvi avèk yon modil mikwofluidik. Sepandan, modèl sa a ni... Pa montre pwosesis mòfojenèz espontane ni li pa gen ladan mouvman mekanobyolojik nan trip yo. Teknik enprime 3D ki soti nan menm gwoup la te kapab kreye tib entesten miniature ak pwosesis mòfojenèz espontane. Malgre fabrikasyon konplèks diferan segman entesten nan tib la, modèl sa a manke tou koule likid luminal ak defòmasyon mekanik. Anplis de sa, operablite modèl la ka limite, sitou apre pwosesis byoenprime a fini, sa ki deranje kondisyon eksperimantal yo oswa entèraksyon selil-a-selil yo. Olye de sa, pwotokòl nou pwopoze a bay mòfojenèz entesten espontane, estrès tayisman fizyolojikman enpòtan, byomekanik ki imite mobilite entesten, aksè a konpatiman apikal ak bazolateral endepandan, ak rekreyasyon mikwoanviwònman byolojik konplèks nan modilarite. Se poutèt sa, pwotokòl mòfojenèz 3D in vitro nou an ka bay yon apwòch konplemantè pou simonte defi metòd ki deja egziste yo.
Pwotokòl nou an konsantre antyèman sou morfogenèz epitelyal 3D, sèlman ak selil epitelyal an kilti epi san lòt kalite selil ki antoure tankou selil mezenkimal, selil andotelyal, ak selil iminitè. Jan nou te dekri deja, nwayo pwotokòl nou an se endiksyon morfogenèz epitelyal lè nou retire inibitè morfogenèz ki sekrete nan bò bazolateral medyòm ki entwodui a. Pandan ke modilarite solid gut-on-a-chip ak ibrid-on-a-chip nou an pèmèt nou rkree kouch epitelyal 3D ondile a, lòt konpleksite byolojik tankou entèraksyon epitelyal-mezenkimal33,34, depo Matris ekstraselilè (ECM)35 epi, nan modèl nou an, karakteristik kript-vilis ki transmèt nich selil souch nan kript bazal yo rete pou nou konsidere pi lwen. Selil estwomal yo (pa egzanp, fibroblas) nan mezenkim nan jwe yon wòl kle nan pwodiksyon pwoteyin ECM yo ak règleman morfogenèz entestinal in vivo35,37,38. Ajout selil mezenkimal nan modèl nou an amelyore pwosesis morfogenetik la. ak efikasite atachman selilè. Kouch andotelyal la (sa vle di, kapilè oswa lenfatik) jwe yon wòl enpòtan nan reglemante transpò molekilè39 ak rekritman selil iminitè40 nan mikwoanviwònman entesten an. Anplis de sa, konpozan vaskilatwa ki ka konekte ant modèl tisi yo se yon prerekizit lè modèl tisi yo fèt pou demontre entèraksyon plizyè ògàn. Se poutèt sa, selil andotelyal yo ka bezwen enkli pou modle karakteristik fizyolojik ki pi egzak ak rezolisyon nivo ògàn. Selil iminitè ki sòti nan pasyan yo esansyèl tou pou montre repons iminitè natirèl, prezantasyon antijèn, diafoni iminitè adaptatif natirèl, ak iminite espesifik tisi nan kontèks imite maladi entesten.
Itilizasyon chip ibrid yo pi senp pase gut-on-a-chip paske konfigirasyon aparèy la pi senp epi itilizasyon foure Transwell pèmèt kilti epitelyòm entesten an ki ka grandi. Sepandan, foure Transwell ki disponib nan komès ak manbràn Polyester yo pa elastik epi yo pa ka simile mouvman peristaltik. Anplis de sa, konpatiman apikal foure Transwell ki mete nan chip ibrid la te rete estasyonè san okenn estrès tayisman sou bò apikal la. Li klè ke pwopriyete estatik ki nan konpatiman apikal la raman pèmèt ko-kilti bakteri alontèm nan chip ibrid yo. Pandan ke nou ka pwovoke morfogenèz 3D avèk fòs nan foure Transwell lè w ap itilize chip ibrid, mank byomekanik fizyolojikman enpòtan ak koule likid apikal ka limite posibilite platfòm chip ibrid yo pou aplikasyon potansyèl yo.
Rekonstriksyon aks kript-vilis imen an nan kilti trip-sou-yon-chip ak ibrid-sou-yon-chip poko byen etabli. Piske mòfojènèz kòmanse apati yon monokouch epitelyal, mikwoachitekti 3D yo pa nesesèman bay yon resanblans mòfolojik ak kript in vivo. Malgre ke nou te karakterize popilasyon selil k ap pwolifere toupre domèn kript bazal la nan epitelyòm 3D mikwo-enjenyè a, rejyon kript ak vilis yo pa te byen delimite. Malgre ke chanèl anwo ki pi wo sou chip la mennen nan yon ogmantasyon nan wotè epitelyòm mikwo-enjenyè a, wotè maksimòm lan toujou limite a ~300-400 µm. Pwofondè reyèl kript entesten imen yo nan ti ak gwo trip yo se ~135 µm ak ~400 µm, respektivman, epi wotè ti vilis entesten yo se ~600 µm41.
Nan pwen de vi imajri, imajri super-rezolisyon in situ nan mikwoachitekti 3D yo ka limite a trip la sou yon chip, piske distans travay ki nesesè ant lantiy objektif la ak kouch epitelyal la se nan lòd kèk milimèt. Pou simonte pwoblèm sa a, yon objektif ki lwen ka nesesè. Anplis de sa, fè seksyon mens pou preparasyon echantiyon imajri se yon defi akòz gwo elastisite PDMS la. Anplis de sa, piske mikwofabrikasyon kouch pa kouch trip la sou yon chip enplike adezyon pèmanan ant chak kouch, li trè difisil pou ouvri oswa retire kouch siperyè a pou egzamine estrikti sifas kouch epitelyal la. Pa egzanp, lè l sèvi avèk yon mikwoskòp elektwonik optik (SEM).
Idrofobisite PDMS la te yon faktè limitatif nan etid ki baze sou mikwofluidik ki gen rapò ak ti molekil idrofob, piske PDMS ka adsorbe molekil idrofob sa yo yon fason ki pa espesifik. Yo ka konsidere altènativ a PDMS ak lòt materyèl polimerik. Yon lòt opsyon, yo ka konsidere modifikasyon sifas PDMS (pa egzanp, kouch ak materyèl lipofilik 42 oswa poli(etilen glikòl) 43) pou minimize adsorpsyon molekil idrofob yo.
Finalman, metòd nou an pa byen karakterize an tèm de bay yon tès depistaj wo-debi oswa yon platfòm eksperimantal "yon sèl gwosè pou tout moun" ki fasil pou itilize. Pwotokòl aktyèl la mande yon ponp sereng pou chak mikwoaparèy, ki pran espas nan yon enkibatè CO2 epi ki anpeche eksperyans sou gwo echèl. Limitasyon sa a ka amelyore anpil grasa évolutivité fòma kilti inovatè yo (pa egzanp, foure pore 24-pi, 96-pi, oswa 384-pi ki pèmèt renouvèlman kontinyèl ak retire medya bazolateral yo).
Pou pwovoke mòfojènèz 3D nan epitelyòm entesten imen an in vitro, nou te itilize yon aparèy entesten chip mikrofluidik ki gen de mikrokanal paralèl ak yon manbràn pore elastik nan mitan pou kreye yon koòdone lumen-kapilè. Nou demontre tou itilizasyon yon aparèy mikrofluidik yon sèl kanal (yon chip ibrid) ki bay yon koule bazolateral kontinyèl anba kouch epitelyal polarize ki grandi sou foure Transwell. Nan tou de platfòm yo, mòfojènèz divès selil epitelyal entesten imen yo ka demontre lè yo aplike manipilasyon direksyonèl nan koule a pou retire antagonis mòfojèn yo nan konpatiman bazolateral la. Pwosedi eksperimantal la an antye (Figi 1) konsiste de senk pati: (i) mikwofabrikasyon chip entesten an oswa chip ibrid Transwell ki ka foure (etap 1-5; Bwat 1), (ii) preparasyon selil epitelyal entesten (selil Caco-2) oswa òganoid entesten imen; bwat 2-5), (iii) kilti selil epitelyal entesten sou chip entesten oswa chip ibrid (etap 6-9), (iv) endiksyon morfogenèz 3D in vitro (etap 10) ak (v)) pou karakterize mikwoestrikti epitelyal 3D a (etap 11-24). Finalman, yo te kreye yon gwoup kontwòl apwopriye (ki diskite pi lwen anba a) pou valide efikasite morfogenèz in vitro a lè yo konpare morfogenèz epitelyal la ak kontwòl espasyal, tanporèl, kondisyonèl oswa pwosediral.
Nou te itilize de platfòm kilti diferan: trip-sou-yon-chip ak chanèl dwat oswa chanèl konplike non lineyè, oswa chip ibrid ki gen foure Transwell (TW) nan yon aparèy mikwofluidik, fabrike jan sa dekri nan Kare 1, ak etap 1-5. "Fabrikasyon Aparèy" montre etap prensipal yo nan fè yon sèl chip oswa yon chip ibrid. "Kilti Selil Epitelyal Entesten Imen" eksplike sous selil la (Caco-2 oswa òganoid entesten imen) ak pwosedi kilti ki itilize nan pwotokòl sa a. "Mofòjenèz in vitro" montre etap jeneral yo nan ki selil epitelyal Caco-2 oswa sòti nan òganoid yo kiltive sou yon chip entesten oswa sou foure Transwell nan yon chip ibrid, ki te swiv pa endiksyon mòfòjenèz 3D ak fòmasyon yon estrikti epitelyal karakterize. Nimewo etap pwogram nan oswa nimewo kare a parèt anba chak flèch. Aplikasyon an bay egzanp sou kijan kouch epitelyal entesten etabli yo ka itilize, pa egzanp, nan karakterizasyon diferansyasyon selilè, etid fizyoloji entesten, etablisman ekosistèm mikwobyòm lame, ak modèl maladi. Imaj imunofluoresans nan "Selil "Diferansyasyon" ki montre nwayo, F-aktin ak MUC2 ki eksprime nan kouch epitelyal 3D Caco-2 ki pwodui sou chip trip la. Siyalizasyon MUC2 prezan nan selil kalicin ak larim ki sekrete nan sifas mikez yo. Imaj fliyoresan nan Fizyoloji Entesten yo montre larim ki pwodui pa koloran pou asid sialik ak rezidi N-asetilglukozamin lè l sèvi avèk aglutinin jèm ble fliyoresan. De imaj ki sipèpoze nan "Ko-Kilti Mikwòb Lame" yo montre ko-kilti mikwobyòm lame reprezantatif nan trip la sou yon chip. Panèl gòch la montre ko-kilti E. coli ki eksprime pwoteyin fliyoresan vèt (GFP) ak selil epitelyal 3D Caco-2 mikwo-enjenyè. Panèl dwat la montre lokalizasyon GFP E. coli ko-kiltive ak selil epitelyal 3D Caco-2, ki te swiv pa koloran imunofluoresans ak F-aktin (wouj) ak nwayo (ble). Modèl maladi a ilistre trip ki an sante kont trip ki koule nan chip enflamasyon trip anba defi fizyolojik ak antijèn bakteri (pa egzanp, lipopolisakarid, LPS) ak selil iminitè (pa egzanp, PBMC; vèt). Selil Caco-2 yo te kiltive pou etabli yon kouch epitelyal 3D. Ba echèl, 50 µm. Imaj nan ranje anba a: "Diferansyasyon selil yo" adapte avèk pèmisyon nan referans lan.2. Oxford University Press; Repwodui avèk pèmisyon nan Ref.5. NAS; "Ko-Kilti Mikwòb Lame a" adapte avèk pèmisyon nan ref.3. NAS; "Modèl Maladi" adapte avèk pèmisyon nan referans lan.5. NAS.
Yo te fabrike tou de chip trip-sou-chip ak ibrid yo lè l sèvi avèk replik PDMS ki te demoule nan mwazi silikon pa litografi mou1,44 epi yo te modle ak SU-8. Yo detèmine konsepsyon mikrokanal yo nan chak chip lè yo konsidere idrodinamik tankou estrès tayisman ak presyon idrodinamik1,4,12. Konsepsyon orijinal trip-sou-a-chip la (Done Pwolonje Fig. 1a), ki te konsiste de de mikrokanal paralèl dwat jikstapoze, te evolye nan yon konplèks trip-sou-a-chip (Done Pwolonje Fig. 1b) ki gen ladan yon pè mikrokanal koube pou pwovoke yon tan rezidans likid ki ogmante, modèl koule non lineyè, ak defòmasyon milti-aksyal nan selil kiltive yo (Fig. 2a-f) 12. Lè yo bezwen rkree byomekanik trip ki pi konplèks, yo ka chwazi konplèks trip-sou-a-chip. Nou te demontre ke Gut-Chip konplike a pwovoke tou fòtman morfogenèz 3D nan yon delè menm jan an ak yon degre kwasans epitelyal menm jan an konpare ak orijinal la. Gut-Chip, kèlkeswa kalite selil kiltive a. Se poutèt sa, pou pwovoke morfogenèz 3D, desen entesten lineyè ak konplèks sou chip yo ka ranplase youn ak lòt. Replik PDMS ki te geri sou mwazi silikon ak modèl SU-8 yo te bay karakteristik negatif apre yo te fin demoule (Fig. 2a). Pou fabrike entesten an sou yon chip, kouch PDMS anwo ki te prepare a te kole youn apre lòt sou yon fim PDMS pore epi answit li te aliyen ak kouch PDMS ki anba a pa yon lyezon ireversib lè l sèvi avèk yon tretman corona (Fig. 2b-f). Pou fabrike chip ibrid yo, replik PDMS ki te geri yo te kole sou lam vè pou kreye aparèy mikwofluidik yon sèl kanal ki te kapab akomode foure Transwell (Fig. 2h ak Done Pwolonje Fig. 2). Pwosesis lyezon an fèt lè yo trete sifas replik PDMS la ak vè a ak plasma oksijèn oswa tretman corona. Apre esterilizasyon aparèy mikwofabrike ki te tache ak tib silikon an, konfigirasyon aparèy la te pare pou fè morfogenèz 3D nan epitelyòm entesten an (Figi 2g).
a, Ilistrasyon eskematik preparasyon pati PDMS yo soti nan mwazi silikon ki gen modèl SU-8. Solisyon PDMS ki pa t geri a te vide sou yon mwazi silikon (agoch), li te geri a 60 °C (mitan) epi li te demoule (adwat). PDMS demoule a te koupe an moso epi netwaye pou plis itilizasyon. b, Foto mwazi silikon ki te itilize pou prepare kouch siperyè PDMS la. c, Foto mwazi silikon ki te itilize pou fabrike manbràn pore PDMS la. d, Yon seri foto konpozan PDMS anwo ak anba yo ak aparèy entesten sou chip ki te reyini an. e, Eskematik aliyman konpozan PDMS anwo, manbràn ak anba yo. Chak kouch lye irevèsibman pa tretman plasma oswa korona. f, Eskematik aparèy trip-sou-yon-chip ki te fabrike a ak mikwochanèl konvolute sipèpoze ak chanm vakyòm. g, Enstalasyon trip-sou-yon-chip pou kilti selil mikwofluidik. Trip sou yon chip ki te fabrike a ki te reyini ak yon tib silikon ak yon sereng te mete sou yon kouvèti. Aparèy chip la te mete sou kouvèti yon plat Petri 150 mm pou pwosesis la. Yo itilize lyan an pou fèmen tib silikon an.h, Imaj vizyèl fabrikasyon chip ibrid ak morfojenèz 3D lè l sèvi avèk chip ibrid. Yo te mete foure Transwell yo poukont yo pou kiltive monokouch 2D selil epitelyal entesten yo nan chip ibrid la pou pwovoke morfojenèz 3D entesten an. Yo pase mwayen an nan mikwochanèl anba kouch selilè ki etabli sou foure Transwell la. Ba echèl, 1 cm.h Reenprime avèk pèmisyon referans lan.4. Elsevier.
Nan pwotokòl sa a, liy selil Caco-2 la ak òganoid entesten yo te itilize kòm sous epitelyal (Fig. 3a). Tou de kalite selil yo te kiltive endepandamman (Bwat 2 ak Bwat 5) epi yo te itilize yo pou simen mikrochanèl ECM ki kouvri ak trip sou chip la oswa insert Transwell yo. Lè selil yo konfluan (plis pase 95% pwoteksyon nan flakon yo), selil Caco-2 ki kiltive regilyèman (ant pasaj 10 ak 50) nan flakon T yo rekòlte pou prepare sispansyon selil disosye pa likid tripsinizasyon (bwat 2). Yo te kiltive òganoid entesten imen ki soti nan byopsi entesten oswa rezeksyon chirijikal nan dòm echafodaj Matrigel nan plak 24-pi pou sipòte mikwoanviwònman estriktirèl la. Yo te ajoute yon sipleman nan mwayen ki gen mòfojèn esansyèl (tankou Wnt, R-spondin, ak Noggin) ak faktè kwasans ki prepare jan sa dekri nan Bwat 3 chak de jou jiskaske òganoid yo te grandi rive nan ~500 µm an dyamèt. Yo rekòlte òganoid ki byen grandi yo epi yo disosye yo an selil endividyèl pou simen sou... Ensèk trip oswa Transwell sou yon chip (Bwat 5). Jan nou te rapòte deja, li ka diferansye selon kalite maladi a12,13 (pa egzanp, kolit ilsèratif, maladi Crohn, kansè kolorektal, oswa donatè nòmal), sit lezyon an (pa egzanp, lezyon kont zòn ki pa lezyone) ak kote gastwoentestinal nan aparèy la (pa egzanp, duodenum, jejunum, ileum, sekom, kolon, oswa rektòm). Nou bay yon pwotokòl optimize nan Bwat 5 pou kiltive òganoid kolonik (koloid) ki tipikman mande pi gwo konsantrasyon mòfojèn pase òganoid ti entesten yo.
a, Pwosesis travay pou endiksyon morfogenèz entesten nan chip entesten an. Epitelyòm entesten imen Caco-2 ak òganoid entesten yo itilize nan pwotokòl sa a pou demontre morfogenèz 3D. Selil epitelyal izole yo te simen nan aparèy entesten-sou-yon-chip ki te prepare a (preparasyon chip). Yon fwa selil yo simen (simen) epi tache (tache) ak manbràn pore PDMS la nan jou 0 (D0), koule apikal (AP) la kòmanse epi konsève pandan 2 premye jou yo (koule, AP, D0-D2). Koule bazolateral (BL) la kòmanse tou ansanm ak mouvman etannman siklik (etannman, koule, AP ak BL) lè yon monokouch 2D konplè fòme. Morfojèn entesten 3D la te fèt espontane apre 5 jou kilti mikrofluidik (morfogenèz, D5). Imaj kontras faz yo montre mòfoloji reprezantatif selil Caco-2 yo nan chak etap eksperimantal oswa pwen tan (graf ba, 100 µm). Kat dyagram eskematik ki ilistre kaskad korespondan nan morfogenèz entesten (anlè adwat). Flèch tire yo Nan chema a, reprezante direksyon koule likid la.b, Imaj SEM ki montre topoloji sifas epitelyòm 3D Caco-2 etabli a (agoch). Imaj anndan an ki mete aksan sou zòn agrandi a (bwat blan tire) montre mikwovili rejenerasyon yo sou kouch 3D Caco-2 a (adwat).c, Vi frontal orizontal Caco-2 3D etabli a, kladin (ZO-1, wouj) ak manbràn fwontyè bwòs kontinyèl ki make F-aktin (vèt) ak nwayo (ble) Vizyalizasyon konfokal imunofluoresans selil epitelyal sou chip entesten yo.Flèch ki montre chema mitan an endike kote plan fokal la ye pou chak vi konfokal.d, Evolisyon tan chanjman mòfolojik nan òganoid kiltive sou yon chip ki jwenn pa mikwoskòp kontras faz nan jou 3, 7, 9, 11, ak 13. Imaj anndan an (anlè adwat) montre gwo agrandisman imaj yo bay la.e, Fotomikwograf DIC nan epitelyòm 3D òganoid etabli nan trip la sou tranch ki te pran nan jou 7.f, Sipèpoze Imaj imunofluoresans ki montre makè pou selil souch (LGR5; magenta), selil kalicin (MUC2; vèt), F-aktin (gri) ak nwayo (syan) ki grandi sou chip entesten pandan 3 jou, respektivman (Agoch) ak òganoid 13 jou (mitan) sou kouch epitelyal la. Gade tou Figi Done Ekstansyon 3, ki mete aksan sou siyalizasyon LGR5 san siyalizasyon MUC2. Imaj fluoresans ki montre mikwoestrikti epitelyal la (adwat) nan epitelyòm òganoid 3D ki etabli nan entesten an sou yon chip lè yo te kolore manbràn plasma a ak lank CellMask (adwat) nan jou 13 kilti a. Ba echèl la se 50 μm sof si yo endike otreman. b Reenprime avèk pèmisyon referans. 2. Oxford University Press; c Adapte avèk pèmisyon Referans. 2. Oxford University Press; e ak f adapte avèk pèmisyon referans. 12 Anba Lisans Creative Commons CC BY 4.0.
Nan trip sou yon chip, li nesesè pou modifye sifas idrofob manbràn pore PDMS la pou yon kouch ECM reyisi. Nan pwotokòl sa a, nou aplike de metòd diferan pou modifye idrofobisite manbràn PDMS yo. Pou kiltive selil Caco-2 yo, aktivasyon sifas pa tretman UV/ozòn poukont li te sifi pou diminye idrofobisite sifas PDMS la, kouvri ECM la epi tache selil Caco-2 yo sou manbràn PDMS la. Sepandan, kilti mikrofluidik epitelyòm òganoid la mande pou fonksyonalizasyon sifas ki baze sou pwodui chimik pou reyalize yon depo efikas pwoteyin ECM yo lè yo aplike polietilenimin (PEI) ak glutaraldeyid youn apre lòt sou mikwochanèl PDMS yo. Apre modifikasyon sifas la, pwoteyin ECM yo te depoze pou kouvri sifas PDMS fonksyonalize a epi answit yo te entwodui yo nan epitelyòm òganoid izole a. Apre selil yo tache, kilti selil mikrofluidik la kòmanse pa pèfize sèlman medyòm nan nan mikwochanèl anwo a jiskaske selil yo fòme yon monokouch konplè, pandan ke mikwochanèl anba a kenbe kondisyon estatik. Metòd optimize sa a pou aktivasyon sifas ak kouch ECM pèmèt atachman òganoid yo. epitelyòm pou pwovoke morfogenèz 3D sou sifas PDMS la.
Kilti Transwell yo bezwen tou yon kouch ECM anvan simen selil yo; sepandan, kilti Transwell yo pa bezwen etap pretretman konplèks pou aktive sifas insert pore yo. Pou kiltive selil Caco-2 sou insert Transwell, kouch ECM sou insert pore yo akselere atachman selil Caco-2 disosye yo (<1 èdtan) ak fòmasyon baryè jonksyon sere (<1-2 jou). Pou kiltive òganoid sou insert Transwell, yo simen òganoid izole yo sou insert kouvri ak ECM, yo tache ak sifas manbràn lan (<3 èdtan) epi yo kenbe yo jiskaske òganoid yo fòme yon monokouch konplè ak entegrite baryè a. Kilti Transwell yo fèt nan plak 24-pi san yo pa itilize chip ibrid.
Mòfojènèz 3D in vitro ka inisye lè yo aplike koule likid sou aspè bazolateral yon kouch epitelyal etabli. Nan trip sou yon chip, mòfojènèz epitelyal la te kòmanse lè yo te pèfize medyòm nan nan mikrokanal anwo ak anba yo (Fig. 3a). Jan sa te dekri deja, li enpòtan pou entwodui koule likid nan konpatiman enferyè (bazolateral) la pou retire kontinyèl inibitè mòfojèn sekrete direksyonèl yo. Pou bay ase eleman nitritif ak serom pou selil ki lye sou manbràn pore yo epi jenere estrès tayisman luminal, nou tipikman aplike doub koule nan trip sou yon chip. Nan chip ibrid yo, yo te mete foure Transwell ki gen monokouch epitelyal nan chip ibrid yo. Apre sa, yo te aplike medyòm nan anba bò bazolateral foure Transwell pore a atravè mikrokanal la. Mòfojènèz entestinal la te fèt 3-5 jou apre inisyasyon koule bazolateral nan tou de platfòm kilti yo.
Yo ka analize karakteristik mòfolojik kouch epitelyal 3D mikwo-enjenyè yo lè yo aplike divès modalite imaj, tankou mikwoskòp kontras faz, mikwoskòp kontras entèferans diferans (DIC), SEM, oswa mikwoskòp konfokal imunofluoresans (Figi 3 ak 4). Yo ka fasilman fè imaj kontras faz oswa DIC nenpòt ki lè pandan kilti a pou kontwole fòm ak pwotizyon kouch epitelyal 3D yo. Akòz transparans optik PDMS ak fim polyester yo, tou de platfòm chip trip-sou-yon-chip ak ibrid yo ka bay imaj in situ an tan reyèl san yo pa bezwen seksyone oswa demonte aparèy la. Lè w ap fè imaj imunofluoresans (Figi 1, 3c, f ak 4b, c), selil yo tipikman fikse ak 4% (pwa/vol) paraformaldeyid (PFA), ki te swiv pa Triton X-100 ak 2% (pwa/vol) albumin serik bovin (BSA), nan lòd sa a. Selon kalite selil la, yo ka itilize diferan fiksatif, pèmeyabilizatè, ak ajan blokaj. Prensipal Yo itilize antikò ki vize makè selil oswa rejyon ki depann sou liyaj pou mete aksan sou selil ki imobilize in situ sou chip la, epi apre sa, yo itilize antikò segondè ansanm ak yon lank kont-koloryasyon ki vize swa nwayo a (pa egzanp, 4′,6-diamidino-2-fenilèn) indol, DAPI) oswa F-aktin (pa egzanp, faloidin ki make ak fliyoresans). Yo kapab fè imaj an dirèk ki baze sou fliyoresans tou in situ pou detekte pwodiksyon larim (Fig. 1, "Diferansyasyon selilè" ak "Fizyoloji trip"), kolonizasyon o aza selil mikwòb yo (Fig. 1, "Ko-kilti mikwòb lame"), rekritman selil iminitè yo (Fig. 1, 'Modèl Maladi') oswa kontou mòfoloji epitelyal 3D a (Fig. 3c,f ak 4b,c). Lè w ap modifye trip la sou chip la pou separe kouch siperyè a ak kouch mikwokanal ki pi ba a, jan sa dekri nan ref. Jan yo montre nan Fig. 2, yo ka vizyalize mòfoloji epitelyal 3D a ansanm ak mikwovili yo sou fwontyè bwòs apikal la pa SEM (Fig. 3b). Yo ka evalye ekspresyon makè diferansyasyon yo lè yo fè PCR5 kantitatif oswa sekans ARN yon sèl selil. Nan ka sa a, yo rekòlte kouch 3D selil epitelyal yo grandi nan chip entesten oswa chip ibrid pa tripsinizasyon epi answit yo itilize yo pou analiz molekilè oswa jenetik.
a, Pwosesis travay pou endiksyon morfogenèz entesten nan yon chip ibrid. Caco-2 ak òganoid entesten yo itilize nan pwotokòl sa a pou demontre morfogenèz 3D nan yon platfòm chip ibrid. Selil epitelyal disosye yo te simen nan insert Transwell prepare (preparasyon TW; gade figi ki anba a). Yon fwa selil yo te simen (simen) epi tache ak manbràn Polyester nan insert Transwell, tout selil yo te kiltive anba kondisyon estatik (kilti TW). Apre 7 jou, yon sèl insert Transwell ki gen yon monokouch 2D selil epitelyal te entegre nan yon chip ibrid pou entwodui yon koule bazolateral (Flow, BL), ki finalman mennen nan jenerasyon yon kouch epitelyal 3D (morfogenèz). Mikwograf kontras faz ki montre karakteristik mòfolojik selil epitelyal ògàn imen ki sòti nan kolon asandan donatè nòmal (liy C103) nan chak etap eksperimantal oswa pwen tan. Schema ki nan kouch anwo yo ilistre konfigirasyon eksperimantal pou chak etap. b, Chip ibrid (schema agoch) ka mennen nan morfogenèz 3D selil epitelyal òganoid ak vi mikwoskopi konfokal anwo-anba. pran nan diferan pozisyon Z (anwo, mitan, ak anba; gade chema adwat la ak liy pwentiye korespondan yo). te montre karakteristik mòfolojik evidan. F-aktin (syan), nwayo (gri). c, Mikwograf konfokal fliyoresans (vi anglè 3D) nan selil epitelyal ki sòti nan òganoid kiltive nan Transwell estatik (TW; mete nan kare tire blan) kont chip ibrid (pi gwo imaj konplè) konpare mòfoloji 2D kont 3D, respektivman. Yon pè vi koupe kwa vètikal 2D (mete nan kwen anwo dwat la; "XZ") montre tou karakteristik 2D ak 3D. Ba echèl, 100 µm. c Reenprime avèk pèmisyon referans lan. 4. Elsevier.
Yo ka prepare kontwòl yo lè yo kiltive menm selil yo (Caco-2 oswa selil epitelyal organoid entesten) an monokouch bidimensyonèl anba kondisyon kilti estatik konvansyonèl yo. Li enpòtan pou note ke eleman nitritif yo ka diminye akòz kapasite volim limite mikwochanèl yo (sa vle di ~4 µL nan chanèl anwo a sou konsepsyon orijinal chip trip la). Se poutèt sa, yo ka konpare tou mòfoloji epitelyal anvan ak apre aplikasyon koule bazolateral la.
Pwosesis litografi mou a ta dwe fèt nan yon chanm pwòp. Pou chak kouch sou chip la (kouch anwo ak anba ak manbràn) ak chip ibrid yo, yo te itilize diferan fotomask epi yo te fabrike yo sou waf silikon separe paske wotè mikrochanèl yo te diferan. Wotè sib mikrochanèl anwo ak anba trip yo sou chip la se 500 µm ak 200 µm, respektivman. Wotè sib chanèl chip ibrid la se 200 µm.
Mete yon waf silikon 3 pous nan yon plat ak asetòn. Brase plak la dousman pandan 30 segonn, apresa seche waf la nan lè a. Transfere waf la nan yon plat ak IPA, apresa vire plak la pandan 30 segonn pou netwaye li.
Ou ka itilize yon solisyon piranha (yon melanj de oksijene idwojèn ak asid silfirik konsantre, 1:3 (vol/vol)) pou maksimize retire résidus òganik yo sou sifas waf silikon an.
Solisyon Piranha a trè koroziv epi li pwodui chalè. Li nesesè pou pran plis prekosyon sekirite. Pou jete fatra, kite solisyon an refwadi epi transfere li nan yon veso pwòp epi sèk. Sèvi ak veso segondè yo epi byen mete etikèt sou veso fatra yo. Tanpri swiv direktiv sekirite etablisman an pou plis pwosedi detaye.
Dezidrate wafer yo lè w mete yo sou yon plak cho 200 °C pandan 10 minit. Apre dezidratasyon an, ou te souke wafer la senk fwa nan lè a pou l refwadi.
Vide ~10 g fotorezistan SU-8 2100 nan sant waf silikon netwaye a. Sèvi ak yon pensèt pou gaye fotorezistan an respire sou waf la. Detanzantan mete waf la sou yon plak cho a 65 °C pou fè fotorezistan an mwens kolan epi pi fasil pou gaye. Pa mete waf la dirèkteman sou plak cho a.
Yo te distribye SU-8 la respèktivman sou waf la grasa yon pwosesis kouch wotasyon (spin coating). Pwograme yon wotasyon SU-8 la k ap vini pandan 5-10 segonn pou l pwopaje a 500 rpm ak yon akselerasyon 100 rpm/s. Mete wotasyon prensipal la pou yon modèl epesè 200 µm a 1,500 rpm, oubyen reyalize yon epesè 250 µm (sa vle di yon wotè 500 µm pou kouch siperyè trip la sou chip la; gade "Etap kritik" anba a) mete l a yon akselerasyon 300 rpm/s pandan 30 segonn a 1,200 rpm.
Yo ka ajiste vitès wotasyon prensipal la selon epesè sib modèl SU-8 la sou waf Silisyòm lan.
Pou fabrike modèl SU-8 ki gen yon wotè 500 µm pou kouch siperyè trip la sou chip la, etap "spin coating" ak "soft bake" nan bwat sa a (etap 7 ak 8) te repete youn apre lòt (gade etap 9) pou pwodui de kouch SU-8 ki gen yon epesè 250 µm, ke ou ka mete an kouch epi kole pa ekspozisyon UV nan etap 12 nan bwat sa a, pou fè yon kouch ki gen yon wotè 500 µm.
Kwit gaufret ki kouvri ak SU-8 yo dousman lè w mete gaufret yo ak anpil atansyon sou yon plak cho a 65 °C pandan 5 minit, apresa chanje anviwònman an a 95 °C epi enkube pou yon lòt 40 minit.
Pou reyalize yon wotè 500 μm nan modèl SU-8 la nan mikrokanal anwo a, repete etap 7 ak 8 yo pou jenere de kouch SU-8 ki gen 250 μm epesè.
Sèvi ak aparèy aliyman mask UV a, fè yon tès lanp dapre enstriksyon manifakti a pou kalkile tan ekspozisyon waf la. (tan ekspozisyon, ms) = (dòz ekspozisyon, mJ/cm2)/(puisans lanp, mW/cm2).
Apre ou fin detèmine tan ekspozisyon an, mete fotomask la sou pòtmask aliyman mask UV a epi mete fotomask la sou waf la ki kouvri ak SU-8 la.
Mete sifas enprime fotomask la dirèkteman sou bò ki kouvri ak SU-8 la nan wafer silikon an pou minimize dispèsyon UV a.
Ekspoze waf ki kouvri ak SU-8 la ak fotomask la vètikalman a 260 mJ/cm2 limyè UV pandan tan ekspozisyon ki te predetèmine a (gade etap 10 nan kare sa a).
Apre ekspozisyon UV, plak silikon kouvri ak SU-8 yo te kwit nan 65 °C pandan 5 minit ak 95 °C pandan 15 minit sou chak plak cho pou fabrike modèl ki gen yon wotè 200 μm. Pwolonje tan apre kwit nan 95 °C a 30 minit pou fabrike modèl ki gen yon wotè 500 µm.
Yo vide devlopè a nan yon plat an vè, epi yo mete waf kwit la nan plat la. Volim devlopè SU-8 la ka varye selon gwosè plak an vè a. Asire w ou itilize ase devlopè SU-8 pou retire nèt SU-8 ki pa ekspoze a. Pa egzanp, lè w ap itilize yon plat an vè ki gen yon dyamèt 150 mm ak yon kapasite 1 L, itilize ~300 mL devlopè SU-8. Devlope mwazi an pandan 25 minit avèk yon wotasyon dousman detanzantan.
Rense mwazi ki devlope a avèk ~10 mL devlopè fre, epi answit ajoute IPA lè w flite solisyon an avèk yon pipèt.
Mete waf la nan yon netwayè plasma epi ekspoze li a plasma oksijèn (gaz atmosferik, presyon sib 1 × 10−5 Torr, puisans 125 W) pandan 1.5 minit.
Mete waf la nan yon desikatè vakyòm avèk yon lam vè anndan. Ou ka mete waf yo ak lam yo kòt a kòt. Si desikatè vakyòm nan divize an plizyè kouch pa yon plak, mete lam yo nan chanm ki pi ba a epi waf yo nan chanm ki pi wo a. Depoze 100 μL solisyon trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktil)silan sou yon lam vè epi aplike vakyòm pou silanizasyon.
Dekonjle yon ti boutèy selil Caco-2 konjele nan yon beny dlo 37°C, apresa transfere selil ki dekonjle yo nan yon flakon T75 ki gen 15 mL medyòm Caco-2 prechofe a 37°C.
Pou fè selil Caco-2 yo pase a ~90% konfluyans, premyèman chofe medyòm Caco-2 a, PBS, ak 0.25% tripsin/1 mM EDTA nan yon beny dlo 37°C.
Aspire medyòm nan pa aspirasyon vakyòm. Lave selil yo de fwa avèk 5 mL PBS tyèd lè w repete aspirasyon vakyòm nan epi ajoute PBS fre.