Mèsi paske ou te vizite Nature.com. Vèsyon navigatè w ap itilize a gen yon sipò CSS limite. Pou pi bon eksperyans lan, nou rekòmande pou w itilize yon navigatè ki ajou (oswa dezaktive Mòd Konpatibilite nan Internet Explorer). Antretan, pou asire sipò kontinyèl, nou pral rann sit la san estil ak JavaScript.
Evolisyon parazit mikwòb yo enplike yon kontraksyon ant seleksyon natirèl, ki lakòz parazit yo amelyore, ak derive jenetik, ki lakòz parazit yo pèdi jèn epi akimile mitasyon danjere. La a, pou nou konprann kijan kontraksyon sa a rive sou echèl yon sèl makromolekil, nou dekri estrikti kriyo-EM ribozòm Encephalitozoon cuniculi a, yon òganis ekaryotik ki gen youn nan pi piti jenòm nan lanati. Rediksyon ekstrèm rRNA nan ribozòm E. cuniculi a akonpaye pa chanjman estriktirèl san parèy, tankou evolisyon lyen rRNA fizyone ki pa t konnen anvan ak rRNA san gonfleman. Anplis de sa, ribozòm E. cuniculi a te siviv pèt fragman ak pwoteyin rRNA yo lè li te devlope kapasite pou itilize ti molekil kòm imitasyon estriktirèl fragman ak pwoteyin rRNA degrade. An jeneral, nou montre ke estrikti molekilè yo te panse depi lontan te redwi, dejenere, epi sijè a mitasyon feblisan yo gen yon kantite mekanis konpansatwa ki kenbe yo aktif malgre kontraksyon molekilè ekstrèm yo.
Paske pifò gwoup parazit mikwòb yo gen zouti molekilè inik pou eksplwate lame yo, nou souvan oblije devlope diferan terapi pou diferan gwoup parazit1,2. Sepandan, nouvo prèv sijere ke kèk aspè nan evolisyon parazit la konvèjan e lajman previzib, sa ki endike yon baz potansyèl pou entèvansyon terapetik laj nan parazit mikwòb3,4,5,6,7,8,9.
Travay anvan yo te idantifye yon tandans evolisyonè komen nan parazit mikwòb yo rele rediksyon jenòm oswa dezentegrasyon jenòm10,11,12,13. Rechèch aktyèl yo montre ke lè mikwo-òganis abandone fòm vi lib yo epi yo vin parazit entraselulè (oswa andosimbyon), jenòm yo sibi metamorfoz dousman men etonan pandan plizyè milyon ane9,11. Nan yon pwosesis ke yo rekonèt kòm dezentegrasyon jenòm, parazit mikwòb yo akimile mitasyon danjere ki transfòme anpil jèn ki te enpòtan anvan an pseudojèn, sa ki mennen nan pèt jèn gradyèl ak efondreman mitasyonèl14,15. Efondreman sa a ka detwi jiska 95% nan jèn ki nan pi ansyen òganis entraselulè yo konpare ak espès ki vivan lib ki gen rapò sere. Kidonk, evolisyon parazit entraselulè yo se yon tire-d'œil ant de fòs opoze: seleksyon natirèl Darwinyen, ki mennen nan amelyorasyon parazit yo, ak efondreman jenòm nan, ki voye parazit yo nan oubli. Kijan parazit la te reyisi sòti nan tire-d'œil sa a epi kenbe aktivite estrikti molekilè li a rete enkoni.
Malgre ke mekanis dekonpozisyon jenòm lan poko byen konprann, li sanble rive sitou akòz derive jenetik souvan. Paske parazit yo ap viv nan ti popilasyon aseksyèl, epi jenetikman limite, yo pa ka elimine efektivman mitasyon danjere ki pafwa rive pandan replikasyon ADN. Sa mennen nan yon akimilasyon ireversibl mitasyon danjere ak yon rediksyon nan jenòm parazit la. Kòm rezilta, parazit la pa sèlman pèdi jèn ki pa nesesè ankò pou siviv li nan anviwònman entraselulè a. Se enkapasite popilasyon parazit yo pou elimine efektivman mitasyon danjere sporadik ki lakòz mitasyon sa yo akimile nan tout jenòm lan, ki gen ladan jèn ki pi enpòtan yo.
An jeneral, anpil nan konpreyansyon nou genyen sou rediksyon jenòm lan baze sèlman sou konparezon sekans jenòm yo, epi nou mwens peye atansyon sou chanjman nan molekil reyèl ki fè fonksyon antretyen epi ki sèvi kòm sib potansyèl pou dwòg. Etid konparatif yo montre ke chay mitasyon mikwòb entraselulè danjere yo sanble predispoze pwoteyin ak asid nikleyik yo pou yo mal pliye epi rasanble, sa ki fè yo plis depandan sou chaperon epi ipèrsansib a chalè19,20,21,22,23. Anplis de sa, divès parazit—evolisyon endepandan pafwa separe pa jiska 2.5 milya ane—te fè eksperyans yon pèt menm jan an nan sant kontwòl kalite nan sentèz pwoteyin yo5,6 ak mekanis reparasyon ADN24. Sepandan, nou pa konnen anpil sou enpak fòm vi entraselulè a ​​sou tout lòt pwopriyete makromolekil selilè yo, tankou adaptasyon molekilè a yon chay k ap ogmante nan mitasyon danjere.
Nan travay sa a, pou nou ka pi byen konprann evolisyon pwoteyin ak asid nikleyik mikwo-òganis entraselulè yo, nou te detèmine estrikti ribozòm parazit entraselulè Encephalitozoon cuniculi a. E. cuniculi se yon òganis ki sanble ak yon chanpiyon ki fè pati yon gwoup mikrosporidi parazit ki gen jènòm ekaryotik ki piti anpil e poutèt sa yo itilize kòm òganis modèl pou etidye dezentegrasyon jènòm25,26,27,28,29,30. Dènyèman, yo te detèmine estrikti ribozòm kriyo-EM pou jènòm Microsporidi, Paranosema locustae, ak Vairimorpha necatrix31,32 ki modere redwi (jenòm ~3.2 Mb). Estrikti sa yo sijere ke yon pati nan anplifikasyon rRNA konpanse pa devlopman nouvo kontak ant pwoteyin ribozomal vwazen oswa akizisyon nouvo pwoteyin ribozomal msL131,32. Espès Encephalitozoon (jenòm ~2.5 milyon bp), ansanm ak fanmi ki pi pre yo a, Ordospora, demontre degre rediksyon jenòm final la nan ekaryot yo - yo gen mwens pase 2000 jèn ki kode pwoteyin, epi yo espere ke ribozòm yo pa sèlman pa gen fragman ekspansyon rRNA (fragman rRNA ki distenge ribozòm ekaryotik yo ak ribozòm bakteri yo) men yo genyen tou kat pwoteyin ribozomal akòz mank omolog yo nan jenòm E. cuniculi a26,27,28. Se poutèt sa, nou te konkli ke ribozòm E. cuniculi a ka revele estrateji ki te enkoni anvan pou adaptasyon molekilè nan pouri jenòm.
Estrikti cryo-EM nou an reprezante pi piti ribozòm sitoplasmik ekaryotik ki te karakterize a epi li bay yon apèsi sou kijan degre final rediksyon jenòm lan afekte estrikti, asanblaj, ak evolisyon machin molekilè ki entegral nan selil la. Nou te jwenn ke ribozòm E. cuniculi a vyole anpil nan prensip lajman konsève plisman ARN ak asanblaj ribozòm, epi nou te dekouvri yon nouvo pwoteyin ribozomal ki te enkoni anvan. Sanzatann, nou montre ke ribozòm mikrosporidi yo te evolye kapasite pou mare ti molekil, epi nou fè ipotèz ke tronkasyon nan ARNr ak pwoteyin yo deklanche inovasyon evolisyonè ki ka finalman konfere kalite itil sou ribozòm nan.
Pou amelyore konpreyansyon nou sou evolisyon pwoteyin ak asid nikleyik nan òganis entraselulè yo, nou te deside izole espò E. cuniculi yo nan kilti selil mamifè enfekte yo pou nou te ka pirifye ribozòm yo epi detèmine estrikti ribozòm sa yo. Li difisil pou jwenn yon gwo kantite mikrosporidi parazit paske mikrosporidi yo pa ka kiltive nan yon mwayen eleman nitritif. Okontrè, yo grandi epi repwodui sèlman andedan selil lame a. Se poutèt sa, pou nou jwenn byomas E. cuniculi pou pirifikasyon ribozòm, nou te enfekte liy selil ren mamifè RK13 la ak espò E. cuniculi epi nou te kiltive selil enfekte sa yo pandan plizyè semèn pou pèmèt E. cuniculi grandi epi miltipliye. Lè nou te itilize yon monokouch selil enfekte ki gen anviwon mwatye yon mèt kare, nou te kapab pirifye anviwon 300 mg espò Mikrosporidi epi itilize yo pou izole ribozòm. Apre sa, nou te deranje espò pirifye yo ak pèl an vè epi nou te izole ribozòm brit yo lè nou te itilize fraksyonasyon etap pa etap poliglikòl liza yo. Sa te pèmèt nou jwenn apeprè 300 µg ribozòm E. cuniculi kri pou analiz estriktirèl.
Apre sa, nou te kolekte imaj cryo-EM lè l sèvi avèk echantiyon ribozòm yo epi nou te trete imaj sa yo lè l sèvi avèk mask ki koresponn ak gwo sou-inite ribozomal la, ti tèt sou-inite a, ak ti sou-inite a. Pandan pwosesis sa a, nou te kolekte imaj anviwon 108,000 patikil ribozomal epi nou te kalkile imaj cryo-EM ak yon rezolisyon 2.7 Å (Figi Siplemantè 1-3). Apre sa, nou te itilize imaj cryoEM pou modle rRNA, pwoteyin ribozomal, ak faktè ibènasyon Mdf1 ki asosye avèk ribozòm E. cuniculi (Fig. 1a, b).
a Estrikti ribozòm E. cuniculi a an konplèks avèk faktè ibènasyon Mdf1 (pdb id 7QEP). b Kat faktè ibènasyon Mdf1 ki asosye avèk ribozòm E. cuniculi a. c Kat estrikti segondè ki konpare ARNr refè nan espès Mikrosporidyen yo ak estrikti ribozomal li te ye. Panno yo montre kote fragman ARNr anplifye yo (ES) ak sit aktif ribozòm yo, ki gen ladan sit dekodaj la (DC), bouk sarsinisin lan (SRL), ak sant peptidil transfèraz la (PTC). d Dansite elektwon ki koresponn ak sant peptidil transfèraz ribozòm E. cuniculi a sijere ke sit katalitik sa a gen menm estrikti a nan parazit E. cuniculi a ak lame li yo, ki gen ladan H. sapiens. e, f Dansite elektwon ki koresponn ak sant dekodaj la (e) ak estrikti eskematik sant dekodaj la (f) endike ke E. cuniculi gen rezidi U1491 olye de A1491 (nimero E. coli) nan anpil lòt eukaryot. Chanjman sa a sijere ke E. cuniculi ka sansib a antibyotik ki vize sit aktif sa a.
Kontrèman ak estrikti ribozòm V. necatrix ak P. locustae yo te deja etabli (tou de estrikti yo reprezante menm fanmi mikrosporidy Nosematidae a epi yo trè menm jan youn ak lòt), 31,32 ribozòm E. cuniculi sibi plizyè pwosesis fragmentasyon ARNr ak pwoteyin. Plis denaturasyon (Figi Siplemantè 4-6). Nan ARNr, chanjman ki pi frapan yo te enkli pèt konplè fragman ARNr 25S anplifye ES12L la ak dejenerasyon pasyèl elis h39, h41, ak H18 yo (Fig. 1c, Fig. Siplemantè 4). Pami pwoteyin ribozomal yo, chanjman ki pi frapan yo te enkli pèt konplè pwoteyin eS30 la ak rakoursisman pwoteyin eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17, ak eS7 yo (Figi Siplemantè 4, 5).
Kidonk, rediksyon ekstrèm nan jenòm espès Encephalotozoon/Ordospora yo reflete nan estrikti ribozòm yo: ribozòm E. cuniculi yo fè eksperyans pèt ki pi dramatik nan kontni pwoteyin nan ribozòm sitoplasmik ekaryotik ki sijè a karakterizasyon estriktirèl, epi yo pa menm gen rRNA ak fragman pwoteyin sa yo ki lajman konsève pa sèlman nan ekaryot yo, men tou nan twa domèn lavi yo. Estrikti ribozòm E. cuniculi a bay premye modèl molekilè pou chanjman sa yo epi li revele evènman evolisyonè ke tou de jenomik konparatif ak etid sou estrikti byomolekilè entraselulè te neglije (Fig. Siplemantè 7). Anba a, nou dekri chak nan evènman sa yo ansanm ak orijin evolisyonè pwobab yo ak enpak potansyèl yo sou fonksyon ribozòm.
Apre sa, nou te jwenn ke, anplis gwo tronkasyon rRNA yo, ribozòm E. cuniculi yo gen varyasyon rRNA nan youn nan sit aktif yo. Malgre ke sant peptidil transferaz ribozòm E. cuniculi a gen menm estrikti ak lòt ribozòm eukaryotik yo (Fig. 1d), sant dekodaj la diferan akòz varyasyon sekans nan nikleotid 1491 (nimero E. coli, Fig. 1e, f). Obsèvasyon sa a enpòtan paske sit dekodaj ribozòm eukaryotik yo tipikman gen rezidi G1408 ak A1491 konpare ak rezidi tip bakteri A1408 ak G1491. Varyasyon sa a souliye sansiblite diferan ribozòm bakteri ak eukaryotik yo anvè fanmi aminoglikozid antibyotik ribozomal yo ak lòt ti molekil ki vize sit dekodaj la. Nan sit dekodaj ribozòm E. cuniculi a, rezidi A1491 te ranplase ak U1491, sa ki potansyèlman kreye yon koòdone lyezon inik pou ti molekil ki vize sit aktif sa a. Menm varyant A14901 la prezan tou nan lòt mikrosporidi tankou P. locustae ak V. necatrix, sa ki sijere ke li gaye anpil pami espès mikrosporidi yo (Fig. 1f).
Paske echantiyon ribozòm E. cuniculi nou yo te izole nan espò ki inaktif metabolikman, nou te teste kat kriyo-EM E. cuniculi a pou lyezon ribozòm ki te dekri deja anba kondisyon estrès oswa grangou. Faktè ibènasyon 31,32,36,37, 38. Nou te matche estrikti ribozòm ibènasyon an ki te etabli deja a ak kat kriyo-EM ribozòm E. cuniculi a. Pou akoplaj, nou te itilize ribozòm S. cerevisiae an konplèks ak faktè ibènasyon Stm138, ribozòm krikèt an konplèks ak faktè Lso232, ak ribozòm V. necatrix an konplèks ak faktè Mdf1 ak Mdf231. An menm tan, nou te jwenn dansite kriyo-EM ki koresponn ak faktè repo Mdf1 la. Menm jan ak Mdf1 ki mare ak ribozòm V. necatrix la, Mdf1 mare tou ak ribozòm E. cuniculi a, kote li bloke sit E ribozòm nan, sa ki petèt ede fè ribozòm yo disponib lè espò parazit yo vin inaktif metabolikman lè kò a inaktive (Figi 2).
Mdf1 bloke sit E ribozòm nan, ki sanble ede inaktive ribozòm nan lè espò parazit yo vin inaktif metabolikman. Nan estrikti ribozòm E. cuniculi a, nou te jwenn ke Mdf1 fòme yon kontak nou pa t konnen anvan ak tij ribozòm L1 la, pati ribozòm nan ki fasilite liberasyon ARNt deasetile a nan ribozòm nan pandan sentèz pwoteyin. Kontak sa yo sijere ke Mdf1 disosye ak ribozòm nan lè l sèvi avèk menm mekanis ak ARNt deasetile a, sa ki bay yon posib eksplikasyon sou fason ribozòm nan retire Mdf1 pou reaktive sentèz pwoteyin.
Sepandan, estrikti nou an te revele yon kontak enkoni ant Mdf1 ak janm ribozòm L1 la (pati ribozòm nan ki ede libere ARNt deasetile a nan ribozòm nan pandan sentèz pwoteyin). An patikilye, Mdf1 itilize menm kontak yo ak segman koud molekil ARNt deasetile a (Fig. 2). Modèl molekilè sa a, ki te enkoni anvan, te montre ke Mdf1 disosye ak ribozòm nan lè l sèvi avèk menm mekanis ak ARNt deasetile a, sa ki eksplike kijan ribozòm nan retire faktè ibènasyon sa a pou reaktive sentèz pwoteyin.
Lè nou t ap konstwi modèl rRNA a, nou te jwenn ke ribozòm E. cuniculi a gen fragman rRNA ki pliye yon fason anòmal, ke nou te rele rRNA fusionné (Fig. 3). Nan ribozòm ki kouvri twa domèn lavi yo, rRNA pliye nan estrikti kote pifò baz rRNA swa pè baz epi pliye youn ak lòt oswa kominike avèk pwoteyin ribozomal38,39,40. Sepandan, nan ribozòm E. cuniculi, rRNA yo sanble vyole prensip plisman sa a lè yo konvèti kèk nan elis yo an rejyon rRNA ki pa pliye.
Estrikti eliks rRNA H18 25S nan S. cerevisiae, V. necatrix, ak E. cuniculi. Tipikman, nan ribozòm ki kouvri twa domèn lavi yo, lyezon sa a vlope nan yon eliks ARN ki gen 24 a 34 rezidi. Nan Microsporidi, okontrè, lyezon rRNA sa a piti piti redwi a de lyezon rich an uridin yon sèl fil ki gen sèlman 12 rezidi. Pifò nan rezidi sa yo ekspoze a solvan. Figi a montre ke mikrosporidi parazit yo sanble vyole prensip jeneral plisman rRNA yo, kote baz rRNA yo anjeneral makonnen ak lòt baz oswa enplike nan entèraksyon rRNA-pwoteyin. Nan mikrosporidi, kèk fragman rRNA pran yon pli defavorab, kote ansyen eliks rRNA a vin tounen yon fragman yon sèl fil ki lonje prèske nan yon liy dwat. Prezans rejyon dwòl sa yo pèmèt mikrosporidi rRNA mare fragman rRNA ki lwen lè l sèvi avèk yon kantite minimòm baz ARN.
Egzanp ki pi frapan nan tranzisyon evolisyonè sa a ka obsève nan eliks rRNA 25S H18 la (Fig. 3). Nan espès soti nan E. coli rive nan moun, baz eliks rRNA sa a genyen 24-32 nikleotid, ki fòme yon eliks yon ti jan iregilye. Nan estrikti ribozomal idantifye deja nan V. necatrix ak P. locustae,31,32 baz eliks H18 la pasyèlman dewoule, men pè baz nikleotid yo konsève. Sepandan, nan E. cuniculi fragman rRNA sa a vin lyezon ki pi kout yo 228UUUGU232 ak 301UUUUUUUUUU307. Kontrèman ak fragman rRNA tipik yo, lyezon ki rich an uridin sa yo pa vlope oswa fè kontak pwolonje ak pwoteyin ribozomal yo. Okontrè, yo adopte estrikti ouvè pou sòlvan ak konplètman dewoule kote seksyon rRNA yo pwolonje prèske dwat. Konformasyon lonje sa a eksplike kijan E. cuniculi itilize sèlman 12 baz ARN pou ranpli espas 33 Å ki genyen ant elis ARNr H16 ak H18 yo, alòske lòt espès yo bezwen omwen de fwa plis baz ARNr pou ranpli espas la.
Kidonk, nou ka demontre ke, atravè plisman enèjikman defavorab, mikrosporidi parazit yo te devlope yon estrateji pou kontra menm segman rRNA sa yo ki rete lajman konsève atravè espès yo nan twa domèn lavi yo. Aparamman, lè yo akimile mitasyon ki transfòme elis rRNA an ti lyezon poli-U, E. cuniculi ka fòme fragman rRNA dwòl ki gen mwens nikleotid ke posib pou ligasyon fragman rRNA distal yo. Sa ede eksplike kijan mikrosporidi yo te reyalize yon rediksyon dramatik nan estrikti molekilè debaz yo san yo pa pèdi entegrite estriktirèl ak fonksyonèl yo.
Yon lòt karakteristik dwòl nan ARNr E. cuniculi a se aparans ARNr a san epesman (Fig. 4). Anfleman yo se nikleyotid san pè baz ki tòde soti nan eliks ARNr a olye pou yo kache ladan l. Pifò pwotizyon ARNr yo aji kòm adezif molekilè, ede mare pwoteyin ribozomal adjasan yo oswa lòt fragman ARNr. Gen kèk nan anfleman yo aji kòm gon, sa ki pèmèt eliks ARNr a flechi epi pliye yon fason optimal pou yon sentèz pwoteyin pwodiktif 41.
a Yon pwotizyon rRNA (nimero S. cerevisiae) absan nan estrikti ribozòm E. cuniculi a, men li prezan nan pifò lòt eukaryot yo b Ribozòm entèn E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens, ak E. cuniculi. Parazit yo manke anpil nan ansyen gonfleman rRNA ki trè konsève yo. Epesman sa yo estabilize estrikti ribozòm nan; kidonk, absans yo nan mikrosporidi endike yon estabilite redwi nan plisman rRNA nan parazit mikrosporidi yo. Konparezon ak tij P (tij L7/L12 nan bakteri) montre ke pèt boul rRNA yo pafwa koresponn ak aparans nouvo boul akote boul ki pèdi yo. Eliks H42 nan rRNA 23S/28S la gen yon gonfleman ansyen (U1206 nan Saccharomyces cerevisiae) yo estime ki gen omwen 3.5 milya ane akòz pwoteksyon li nan twa domèn lavi. Nan mikrosporidi, gonfleman sa a elimine. Sepandan, yon nouvo gonfleman te parèt akote gonfleman ki te pèdi a (A1306 nan E. cuniculi).
Se yon bagay ki frapan, nou te jwenn ke ribozòm E. cuniculi yo pa gen pifò nan gonfleman rRNA yo jwenn nan lòt espès yo, tankou plis pase 30 gonfleman konsève nan lòt eukaryot yo (Fig. 4a). Pèt sa a elimine anpil kontak ant sou-inite ribozomal yo ak elis rRNA adjasan yo, pafwa sa kreye gwo vid kre nan ribozòm nan, sa ki fè ribozòm E. cuniculi a pi pore konpare ak ribozòm ki pi tradisyonèl yo (Fig. 4b). Li enpòtan pou note ke nou te jwenn ke pifò nan gonfleman sa yo te pèdi tou nan estrikti ribozòm V. necatrix ak P. locustae yo te idantifye deja, ki pa t remake nan analiz estriktirèl anvan yo31,32.
Pafwa pèt anfleman rRNA yo akonpaye pa devlopman nouvo anfleman akote anfleman ki pèdi a. Pa egzanp, tij P ribozomal la gen yon anfleman U1208 (nan Saccharomyces cerevisiae) ki te siviv soti nan E. coli rive nan moun e pakonsekan yo estime li gen 3.5 milya ane. Pandan sentèz pwoteyin, anfleman sa a ede tij P a deplase ant konformasyon ouvè ak fèmen pou ribozòm nan ka rekrite faktè tradiksyon epi delivre yo nan sit aktif la. Nan ribozòm E. cuniculi yo, epesman sa a absan; sepandan, yon nouvo epesman (G883) ki sitiye sèlman nan twa pè baz ka kontribye nan restorasyon fleksibilite optimal tij P a (Fig. 4c).
Done nou yo sou ARNr san anfleman sijere ke minimizasyon ARNr a pa limite a pèt eleman ARNr sou sifas ribozòm nan, men li ka enplike tou nwayo ribozòm nan, sa ki kreye yon domaj molekilè espesifik parazit la ki pa ko dekri nan selil ki vivan lib. Yo obsève espès vivan.
Apre nou fin modèl pwoteyin ribozomal kanonik yo ak rRNA a, nou te jwenn ke konpozan ribozomal konvansyonèl yo pa ka eksplike twa pati imaj cryo-EM lan. De nan fragman sa yo se ti molekil nan gwosè (Fig. 5, Fig. Siplemantè 8). Premye segman an antre nan mitan pwoteyin ribozomal uL15 ak eL18 yo nan yon pozisyon ki anjeneral okipe pa C-tèminal eL18 la, ki pi kout nan E. cuniculi. Malgre ke nou pa ka detèmine idantite molekil sa a, gwosè ak fòm zile dansite sa a byen eksplike pa prezans molekil espèmidin yo. Lyezon li ak ribozòm nan estabilize pa mitasyon espesifik mikrosporidi nan pwoteyin uL15 yo (Asp51 ak Arg56), ki sanble ogmante afinite ribozòm nan pou ti molekil sa a, paske yo pèmèt uL15 vlope ti molekil la nan yon estrikti ribozomal. Figi Siplemantè 2). 8, done adisyonèl 1, 2).
Imaj kriyo-EM ki montre prezans nikleyotid deyò riboz ki lye ak ribozòm E. cuniculi a. Nan ribozòm E. cuniculi a, nikleyotid sa a okipe menm plas ak nikleyotid 25S rRNA A3186 la (nimero Saccharomyces cerevisiae) nan pifò lòt ribozòm ekaryotik yo. b Nan estrikti ribozomal E. cuniculi a, nikleyotid sa a sitiye ant pwoteyin ribozomal uL9 ak eL20 yo, kidonk li estabilize kontak ant de pwoteyin yo. cd Analiz konsèvasyon sekans eL20 pami espès mikrosporidi yo. Pye bwa filojenetik espès Mikrosporidi yo (c) ak aliyman sekans miltip pwoteyin eL20 la (d) montre ke rezidi ki mare nikleyotid yo F170 ak K172 yo konsève nan pifò Mikrosporidi tipik yo, eksepte S. lophii, eksepte Mikrosporidi ki fèk ramifye yo, ki te kenbe ekstansyon rRNA ES39L la. e Figi sa a montre ke rezidi F170 ak K172 ki mare nikleotid yo prezan sèlman nan eL20 nan jenòm mikrosporidi ki trè redwi a, men pa nan lòt eukaryot yo. An jeneral, done sa yo sijere ke ribozòm Mikrosporidi yo te devlope yon sit mare nikleotid ki sanble mare molekil AMP epi sèvi ak yo pou estabilize entèraksyon pwoteyin-pwoteyin nan estrikti ribozomal la. Gwo konsèvasyon sit mare sa a nan Mikrosporidi yo ak absans li nan lòt eukaryot yo sijere ke sit sa a ka bay yon avantaj siviv selektif pou Mikrosporidi yo. Kidonk, pòch mare nikleotid nan ribozòm mikrosporidi a pa sanble yon karakteristik dejenere oswa yon fòm final degradasyon rRNA jan yo te dekri deja, men pito yon inovasyon evolisyonè itil ki pèmèt ribozòm mikrosporidi a mare dirèkteman ti molekil yo, lè l sèvi avèk yo kòm blòk konstriksyon molekilè pou ribozòm yo. Dekouvèt sa a fè ribozòm mikrosporidi a sèl ribozòm ke yo konnen ki itilize yon sèl nikleotid kòm blòk konstriksyon estriktirèl li. f Chemen evolisyonè ipotetik ki sòti nan mare nikleotid.
Dezyèm dansite pwa molekilè ki ba a sitiye nan entèfas ant pwoteyin ribozomal uL9 ak eL30 (Fig. 5a). Yo te deja dekri entèfas sa a nan estrikti ribozòm Saccharomyces cerevisiae kòm yon sit lyezon pou nikleotid 25S rRNA A3186 la (yon pati nan ekstansyon rRNA ES39L la)38. Yo te montre ke nan ribozòm dejenere P. locustae ES39L yo, entèfas sa a lye ak yon sèl nikleotid enkoni 31, epi yo sipoze ke nikleotid sa a se yon fòm final redwi nan rRNA, kote longè rRNA a se ~130-230 baz. ES39L redwi a yon sèl nikleotid 32.43. Imaj kriyo-EM nou yo sipòte lide ke dansite ka eksplike pa nikleotid. Sepandan, rezolisyon ki pi wo nan estrikti nou an te montre ke nikleotid sa a se yon molekil èkstraribozomal, petèt AMP (Fig. 5a, b).
Apre sa, nou te mande si sit lyezon nikleotid la te parèt nan ribozòm E. cuniculi a oswa si li te egziste deja. Piske lyezon nikleotid la sitou medyatè pa rezidi Phe170 ak Lys172 nan pwoteyin ribozomal eL30 la, nou te evalye konsèvasyon rezidi sa yo nan 4396 eukaryot reprezantatif. Menm jan ak nan ka uL15 pi wo a, nou te jwenn ke rezidi Phe170 ak Lys172 yo trè konsève sèlman nan Microsporidia tipik yo, men yo absan nan lòt eukaryot yo, tankou Microsporidia atipik Mitosporidium ak Amphiamblys, kote fragman rRNA ES39L la pa redwi 44, 45, 46 (Fig. 5c). -e).
Lè nou pran tout done sa yo ansanm, yo sipòte lide ke E. cuniculi e petèt lòt mikrosporidi kanonik yo te devlope kapasite pou kaptire yon gwo kantite ti metabolit nan estrikti ribozòm nan avèk efikasite pou konpanse pou bès nan nivo ARNr ak pwoteyin. Lè yo fè sa, yo te devlope yon kapasite inik pou mare nikleotid deyò ribozòm nan, sa ki montre ke estrikti molekilè parazit yo konpanse lè yo kaptire anpil ti metabolit epi itilize yo kòm imitasyon estriktirèl fragman ARN ak pwoteyin degrade.
Twazyèm pati ki pa simile nan kat kriyo-EM nou an, yo jwenn li nan gwo sou-inite ribozomal la. Rezolisyon relativman wo (2.6 Å) nan kat nou an sijere ke dansite sa a fè pati pwoteyin ki gen konbinezon inik rezidi gwo chèn lateral, sa ki pèmèt nou idantifye dansite sa a kòm yon pwoteyin ribozomal nou pa t konnen anvan ke nou te idantifye kòm li te rele msL2 (pwoteyin espesifik Microsporidia L2) (metòd, figi 6). Rechèch omoloji nou an te montre ke msL2 konsève nan klad Microsporidia nan genus Encephaliter ak Orosporidium, men absan nan lòt espès, ki gen ladan lòt Microsporidia. Nan estrikti ribozomal la, msL2 okipe yon espas ki fòme pa pèt rRNA pwolonje ES31L la. Nan vid sa a, msL2 ede estabilize pliye rRNA a epi li ka konpanse pou pèt ES31L la (Figi 6).
a Dansite elektwon ak modèl pwoteyin ribozomal espesifik pou Microsporidia msL2 ki jwenn nan ribozòm E. cuniculi. b Pifò ribozòm ekaryotik yo, tankou ribozòm 80S Saccharomyces cerevisiae a, gen anplifikasyon rRNA ES19L ki pèdi nan pifò espès Microsporidian yo. Estrikti ribozòm microsporidia V. necatrix ki te etabli deja a sijere ke pèt ES19L nan parazit sa yo konpanse pa evolisyon nouvo pwoteyin ribozomal msL1 la. Nan etid sa a, nou te jwenn ke ribozòm E. cuniculi a te devlope tou yon lòt pwoteyin ki imite ARN ribozomal kòm yon konpansasyon aparan pou pèt ES19L la. Sepandan, msL2 (kounye a anote kòm pwoteyin ipotetik ECU06_1135 la) ak msL1 gen orijin estriktirèl ak evolisyonè diferan. c Dekouvèt sa a sou jenerasyon pwoteyin ribozomal msL1 ak msL2 ki pa gen rapò evolisyonèman sijere ke si ribozòm yo akimile mitasyon danjere nan rRNA yo, yo ka rive nan nivo divèsite konpozisyonèl san parèy menm nan yon ti gwoup espès ki gen rapò sere. Dekouvèt sa a ta ka ede klarifye orijin ak evolisyon ribozòm mitokondriyal la, ki li te ye pou rRNA trè redwi li yo ak varyabilite anòmal nan konpozisyon pwoteyin atravè espès yo.
Apre sa, nou te konpare pwoteyin msL2 la ak pwoteyin msL1 ki te dekri deja a, sèl pwoteyin ribozomal espesifik pou mikrosporidi yo ke yo te jwenn nan ribozòm V. necatrix la. Nou te vle teste si msL1 ak msL2 yo gen rapò evolisyonè. Analiz nou an te montre ke msL1 ak msL2 okipe menm kavite nan estrikti ribozomal la, men yo gen diferan estrikti primè ak tèsyè, sa ki endike orijin evolisyonè endepandan yo (Fig. 6). Kidonk, dekouvèt msL2 nou an bay prèv ke gwoup espès ekaryotik kontra enfòmèl ant yo ka evolye pwoteyin ribozomal estriktirèlman diferan pou konpanse pèt fragman rRNA yo. Dekouvèt sa a remakab paske pifò ribozòm ekaryotik sitoplasmik yo genyen yon pwoteyin envaryan, ki gen ladan menm fanmi 81 pwoteyin ribozomal yo. Aparisyon msL1 ak msL2 nan divès klad mikrosporidi an repons a pèt segman rRNA pwolonje yo sijere ke degradasyon achitekti molekilè parazit la lakòz parazit yo chèche mitasyon konpansatwa, sa ki ka evantyèlman mennen nan akizisyon yo nan diferan popilasyon parazit yo. estrikti.
Finalman, lè modèl nou an te fini, nou te konpare konpozisyon ribozòm E. cuniculi a ak sa ki te predi nan sekans jenòm lan. Anvan sa, yo te panse plizyè pwoteyin ribozomal, tankou eL14, eL38, eL41, ak eS30, te manke nan jenòm E. cuniculi a akòz absans aparan omolog yo nan jenòm E. cuniculi a. Yo predi pèt anpil pwoteyin ribozomal tou nan pifò lòt parazit entraselulè ak andosimbyon ki trè redwi. Pa egzanp, byenke pifò bakteri ki vivan lib yo gen menm fanmi 54 pwoteyin ribozomal yo, se sèlman 11 nan fanmi pwoteyin sa yo ki gen omolog detektab nan chak jenòm bakteri ki gen restriksyon sou lame a ki te analize. Pou sipòte nosyon sa a, yo te obsève yon pèt pwoteyin ribozomal eksperimantalman nan mikrosporidi V. necatrix ak P. locustae, ki pa gen pwoteyin eL38 ak eL4131,32 yo.
Sepandan, estrikti nou yo montre ke se sèlman eL38, eL41, ak eS30 ki aktyèlman pèdi nan ribozòm E. cuniculi a. Pwoteyin eL14 la te konsève epi estrikti nou an te montre poukisa pwoteyin sa a pa t ka jwenn nan rechèch omoloji a (Fig. 7). Nan ribozòm E. cuniculi yo, pifò nan sit lyezon eL14 la pèdi akòz degradasyon ES39L ki anplifye pa rRNA a. Nan absans ES39L, eL14 te pèdi pifò nan estrikti segondè li, epi sèlman 18% nan sekans eL14 la te idantik nan E. cuniculi ak S. cerevisiae. Prezèvasyon sekans pòv sa a remakab paske menm Saccharomyces cerevisiae ak Homo sapiens—òganis ki te evolye 1.5 milya ane apa—pataje plis pase 51% nan menm rezidi yo nan eL14. Pèt konsèvasyon anomali sa a eksplike poukisa E. cuniculi eL14 aktyèlman klase kòm pwoteyin M970_061160 swadizan an epi non pa kòm pwoteyin ribozomal eL1427 la.
Epi Ribozòm Microsporidi a te pèdi ekstansyon rRNA ES39L la, ki te elimine an pati sit lyezon pwoteyin ribozomal eL14 la. Nan absans ES39L, pwoteyin mikwospò eL14 la sibi yon pèt estrikti segondè, kote ansyen α-eliks ki mare rRNA a dejenere an yon bouk longè minimòm. b Aliyman sekans miltip montre ke pwoteyin eL14 la trè konsève nan espès ekaryotik yo (57% idantite sekans ant omolog ledven ak imen), men li mal konsève ak divèjan nan mikwosporidi (kote pa plis pase 24% nan rezidi yo idantik ak omolog eL14 la). soti nan S. cerevisiae oswa H. sapiens). Konsèvasyon sekans pòv sa a ak varyabilite estrikti segondè a eksplike poukisa yo pa janm jwenn omolog eL14 la nan E. cuniculi e poukisa yo panse pwoteyin sa a te pèdi nan E. cuniculi. Okontrè, yo te deja anote eL14 nan E. cuniculi kòm yon swadizan pwoteyin M970_061160. Obsèvasyon sa a sijere ke divèsite jenòm mikrosporidi yo souzestime kounye a: kèk jèn yo panse kounye a ki pèdi nan mikrosporidi yo an reyalite konsève, byenke nan fòm trè diferansye; okontrè, yo panse gen kèk ki kode pou jèn mikrosporidi pou pwoteyin espesifik vè (pa egzanp, pwoteyin ipotetik M970_061160 la an reyalite kode pou pwoteyin trè divès yo jwenn nan lòt eukaryot yo.
Dekouvèt sa a sijere ke denaturasyon ARNr ka mennen nan yon pèt dramatik nan konsèvasyon sekans nan pwoteyin ribozomal adjasan yo, sa ki fè pwoteyin sa yo pa detektab pou rechèch omoloji. Kidonk, nou ka twò estime degre reyèl degradasyon molekilè nan ti òganis jenòm yo, piske gen kèk pwoteyin yo te panse ki pèdi ki aktyèlman pèsiste, byenke nan fòm trè modifye.
Kijan parazit yo ka kenbe fonksyon machin molekilè yo nan kondisyon rediksyon ekstrèm nan jenòm? Etid nou an reponn kesyon sa a lè li dekri estrikti molekilè konplèks la (ribozòm) E. cuniculi, yon òganis ki gen youn nan pi piti jenòm ekaryotik yo.
Li konnen depi prèske de deseni ke molekil pwoteyin ak ARN nan parazit mikwòb yo souvan diferan de molekil omolog yo nan espès ki vivan lib paske yo manke sant kontwòl kalite, yo redwi a 50% nan gwosè yo nan mikwòb ki vivan lib, elatriye. anpil mitasyon febli ki afekte plisman ak fonksyon. Pa egzanp, ribozòm òganis ki gen ti jenòm yo, ki gen ladan anpil parazit entraselulè ak andosimbyon, yo espere manke plizyè pwoteyin ribozomal ak jiska yon tyè nan nikleotid ARNr konpare ak espès ki vivan lib 27, 29, 30, 49. Sepandan, fason molekil sa yo fonksyone nan parazit rete lajman yon mistè, etidye sitou atravè jenomik konparatif.
Etid nou an montre ke estrikti makromolekil yo ka revele anpil aspè nan evolisyon ki difisil pou ekstrè nan etid jenomik konparatif tradisyonèl sou parazit entraselulè ak lòt òganis ki gen restriksyon sou lame a (Fig. Siplemantè 7). Pa egzanp, egzanp pwoteyin eL14 la montre ke nou ka souzestime degre degradasyon reyèl aparèy molekilè a nan espès parazit yo. Kounye a, yo kwè parazit ansefalitik yo gen dè santèn de jèn espesifik pou mikrosporidi. Sepandan, rezilta nou yo montre ke kèk nan jèn sa yo ki sanble espesifik yo an reyalite se jis varyant trè diferan nan jèn ki komen nan lòt eukaryot yo. Anplis de sa, egzanp pwoteyin msL2 la montre kijan nou neglije nouvo pwoteyin ribozomal yo epi nou souzestime kontni machin molekilè parazit yo. Egzanp ti molekil yo montre kijan nou ka neglije inovasyon ki pi enjenyeu nan estrikti molekilè parazit yo ki ka ba yo nouvo aktivite byolojik.
Lè nou pran tout rezilta sa yo ansanm, nou amelyore konpreyansyon nou sou diferans ki genyen ant estrikti molekilè òganis ki gen restriksyon sou lame a ak tokay yo nan òganis ki vivan lib. Nou montre ke machin molekilè yo, ke yo te panse depi lontan te redwi, dejenere, epi sijè a divès mitasyon feblizan, okontrè gen yon seri karakteristik estriktirèl dwòl ke yo te neglije sistematikman.
Yon lòt bò, fragman rRNA ki pa ankonbran ak fragman fizyone nou te jwenn nan ribozòm E. cuniculi yo sijere ke rediksyon jenòm lan ka chanje menm pati nan machin molekilè debaz la ki konsève nan twa domèn lavi yo – apre prèske 3.5 milya ane - evolisyon endepandan espès yo.
Fragman ARNr ki pa gen anfle e ki kole nan ribozòm E. cuniculi yo patikilyèman enteresan nan limyè etid anvan yo sou molekil ARN nan bakteri andosinbyotik. Pa egzanp, nan andosinbyon afid Buchnera aphidicola a, molekil ARNr ak ARNt yo te montre yo gen estrikti sansib a tanperati akòz patipri konpozisyon A+T ak yon gwo pwopòsyon pè baz ki pa kanonik20,50. Chanjman sa yo nan ARN, ansanm ak chanjman nan molekil pwoteyin, yo kounye a panse ki responsab pou twòp depandans andosinbyon yo sou patnè yo ak enkapasite andosinbyon yo pou transfere chalè21, 23. Malgre ke ARNr mikrosporidi parazit la gen chanjman estriktirèlman distenk, nati chanjman sa yo sijere ke yon rediksyon nan estabilite tèmik ak yon pi gwo depandans sou pwoteyin chaperon yo ka karakteristik komen nan molekil ARN nan òganis ki gen jenòm redwi.
Yon lòt bò, estrikti nou yo montre ke mikrosporidi parazit yo te devlope yon kapasite inik pou reziste rRNA ak fragman pwoteyin ki lajman konsève, devlope kapasite pou itilize ti metabolit abondan e fasil pou jwenn kòm imitasyon estriktirèl rRNA ak fragman pwoteyin dejenere. Degradasyon estrikti molekilè. . Opinyon sa a sipòte pa lefèt ke ti molekil ki konpanse pou pèt fragman pwoteyin nan rRNA ak ribozòm E. cuniculi mare ak rezidi espesifik mikrosporidi nan pwoteyin uL15 ak eL30 yo. Sa sijere ke lyezon ti molekil ak ribozòm yo ka yon pwodwi seleksyon pozitif, kote mitasyon espesifik Mikrosporidi nan pwoteyin ribozomal yo te chwazi pou kapasite yo pou ogmante afinite ribozòm pou ti molekil, sa ki ka mennen nan òganis ribozomal ki pi efikas. Dekouvèt la revele yon inovasyon entelijan nan estrikti molekilè parazit mikwòb yo epi li ban nou yon pi bon konpreyansyon sou kijan estrikti molekilè parazit yo kenbe fonksyon yo malgre evolisyon rediksyon an.
Kounye a, idantifikasyon ti molekil sa yo rete enkoni. Li pa klè poukisa aparans ti molekil sa yo nan estrikti ribozomal la diferan ant espès mikrosporidi yo. An patikilye, li pa klè poukisa yo obsève lyezon nikleotid nan ribozòm E. cuniculi ak P. locustae, epi non pa nan ribozòm V. necatrix, malgre prezans rezidi F170 nan pwoteyin eL20 ak K172 V. necatrix yo. Sipresyon sa a ka koze pa rezidi 43 uL6 (ki sitiye adjasan a pòch lyezon nikleotid la), ki se tirozin nan V. necatrix epi non pa treonin nan E. cuniculi ak P. locustae. Chèn lateral aromatik ankonbran Tyr43 la ka entèfere ak lyezon nikleotid akòz sipèpoze sterik. Altènativman, sipresyon nikleotid aparan an ka akòz rezolisyon ki ba nan imaj kriyo-EM, ki anpeche modèl fragman ribozomal V. necatrix yo.
Yon lòt bò, travay nou an sijere ke pwosesis pouri jenòm lan kapab yon fòs envantif. An patikilye, estrikti ribozòm E. cuniculi a sijere ke pèt ARNr ak fragman pwoteyin nan ribozòm mikrosporidi a kreye yon presyon evolisyonè ki ankouraje chanjman nan estrikti ribozòm. Varyant sa yo rive lwen sit aktif ribozòm nan epi yo sanble ede kenbe (oswa retabli) asanblaj ribozòm optimal ki ta otreman deranje pa ARNr redwi. Sa sijere ke yon gwo inovasyon nan ribozòm mikrosporidi a sanble te evolye nan yon bezwen pou tanpon derive jèn.
Petèt sa pi byen ilistre pa lyezon nikleotid, ki pa janm obsève nan lòt òganis jiskaprezan. Lefèt ke rezidi lyezon nikleotid yo prezan nan mikrosporidi tipik yo, men pa nan lòt eukaryot yo, sijere ke sit lyezon nikleotid yo pa jis debri k ap tann pou disparèt, oubyen sit final la pou ARNr retabli nan fòm nikleotid endividyèl yo. Okontrè, sit sa a sanble yon karakteristik itil ki te ka evolye sou plizyè seri seleksyon pozitif. Sit lyezon nikleotid yo ka yon sou-pwodwi seleksyon natirèl: yon fwa ES39L degrade, mikrosporidi yo oblije chèche konpansasyon pou retabli byojenèz ribozòm optimal nan absans ES39L. Piske nikleotid sa a ka imite kontak molekilè nikleotid A3186 la nan ES39L, molekil nikleotid la vin tounen yon blòk konstriksyon ribozòm nan, lyezon li amelyore plis toujou pa mitasyon sekans eL30 la.
Anrapò ak evolisyon molekilè parazit entraselulè yo, etid nou an montre ke fòs seleksyon natirèl Darwinyen an ak derive jenetik pouri jenòm nan pa opere an paralèl, men yo varye. Premyèman, derive jenetik la elimine karakteristik enpòtan nan byomolekil yo, sa ki fè konpansasyon an vrèman nesesè. Se sèlman lè parazit yo satisfè bezwen sa a atravè seleksyon natirèl Darwinyen an makromolekil yo ap gen yon chans pou devlope karakteristik ki pi enpresyonan ak inovatè yo. Sa ki enpòtan, evolisyon sit lyezon nikleotid nan ribozòm E. cuniculi a sijere ke modèl pèt-pou-genyen evolisyon molekilè sa a pa sèlman amorti mitasyon danjere, men pafwa li konfere fonksyon konplètman nouvo sou makromolekil parazit yo.
Lide sa a konsistan avèk teyori ekilib mobil Sewell Wright la, ki deklare ke yon sistèm seleksyon natirèl strik limite kapasite òganis yo pou inove51,52,53. Sepandan, si derive jenetik la deranje seleksyon natirèl la, derive sa yo ka pwodui chanjman ki pa adaptatif an tèt yo (oswa menm danjere) men ki mennen nan plis chanjman ki bay pi bon kapasite fizik oswa nouvo aktivite byolojik. Kad nou an sipòte lide sa a lè li montre ke menm kalite mitasyon ki diminye pliye ak fonksyon yon byomolekil sanble se prensipal deklanchè pou amelyorasyon li. An akò ak modèl evolisyonè gagnan-gagnan an, etid nou an montre ke dekonpozisyon jenòm, tradisyonèlman konsidere kòm yon pwosesis dejeneratif, se tou yon gwo motè inovasyon, pafwa e petèt menm souvan ki pèmèt makromolekil yo akeri nouvo aktivite parazit. yo ka itilize yo.