Mèsi paske w vizite Nature.com.Vèsyon navigatè w ap itilize a gen sipò CSS limite.Pou pi bon eksperyans, nou rekòmande pou w sèvi ak yon navigatè ki ajou (oswa enfim mòd konpatibilite nan Internet Explorer).Antretan, pou asire sipò kontinye, nou pral rann sit la san estil ak JavaScript.
Evolisyon parazit mikwòb yo enplike yon kontreksyon ant seleksyon natirèl, ki lakòz parazit amelyore, ak flote jenetik, ki lakòz parazit pèdi jèn ak akimile mitasyon danjere.Isit la, nan lòd yo konprann ki jan kontreksyon sa a rive sou echèl la nan yon makromolekil sèl, nou dekri estrikti kriyo-EM nan ribozom nan Encephalitozoon cuniculi, yon òganis ekaryotik ki gen youn nan pi piti jenom nan lanati.Rediksyon ekstrèm nan rRNA nan ribosome E. cuniculi akonpaye pa chanjman estriktirèl san parèy, tankou evolisyon nan lye rRNA ki te deja enkoni ak rRNA san bulges.Anplis de sa, E. cuniculi ribosome a te siviv pèt fragman rRNA ak pwoteyin nan devlope kapasite nan sèvi ak molekil ti kòm mimik estriktirèl nan fragman rRNA degrade ak pwoteyin.An jeneral, nou montre ke estrikti molekilè depi lontan te panse yo dwe redwi, dejenere, ak sijè a mitasyon feblès gen yon kantite mekanis konpansatwa ki kenbe yo aktif malgre ekstrèm kontraksyon molekilè.
Paske pifò gwoup parazit mikwòb yo gen zouti molekilè inik pou eksplwate lame yo, nou souvan gen pou devlope diferan terapetik pou diferan gwoup parazit1,2.Sepandan, nouvo prèv sijere ke kèk aspè nan evolisyon parazit yo konvèjan ak lajman previzib, ki endike yon baz potansyèl pou entèvansyon laj terapetik nan parazit mikwòb3,4,5,6,7,8,9.
Travay anvan yo te idantifye yon tandans komen evolisyonè nan parazit mikwòb yo rele rediksyon genòm oswa dezentegrasyon genòm10,11,12,13.Rechèch aktyèl yo montre ke lè mikwo-òganis yo abandone mòd vi gratis yo epi yo vin parazit entraselilè (oswa endosymbiont), genòm yo sibi metamòfoz dousman men etonan pandan plizyè milyon ane9,11.Nan yon pwosesis ke yo rekonèt kòm dezentegrasyon genòm, parazit mikwòb akimile mitasyon danjere ki fè anpil jèn deja enpòtan nan pseudogenes, ki mennen nan pèt jèn gradyèl ak efondreman mitasyon14,15.Efondreman sa a ka detwi jiska 95% nan jèn yo nan pi ansyen òganis entraselilè yo konpare ak espès k ap viv gratis.Kidonk, evolisyon parazit entraselilè yo se yon kochon nan lagè ant de fòs opoze: seleksyon natirèl Darwinian, ki mennen nan amelyorasyon nan parazit, ak efondreman nan genòm nan, voye parazit nan oubli.Ki jan parazit la jere soti nan sa a tug-of-war epi kenbe aktivite a nan estrikti molekilè li yo rete klè.
Malgre ke mekanis nan pouri anba tè genomic pa konprann konplètman, li sanble rive sitou akòz souvan drift jenetik.Paske parazit ap viv nan ti popilasyon, aseksyèl, ak jenetikman limite, yo pa ka efektivman elimine mitasyon danjere ki pafwa rive pandan replikasyon ADN.Sa a mennen nan akimilasyon irevokabl nan mitasyon danjere ak rediksyon nan genòm nan parazit.Kòm yon rezilta, parazit la pa sèlman pèdi jèn ki pa nesesè ankò pou siviv li nan anviwònman entraselilè a.Se enkapasite popilasyon parazit yo pou elimine efektivman mitasyon delete sporadik ki lakòz mitasyon sa yo akimile nan tout genòm nan, ki gen ladan jèn ki pi enpòtan yo.
Anpil nan konpreyansyon aktyèl nou an sou rediksyon genòm baze sèlman sou konparezon nan sekans genomic, ak mwens atansyon sou chanjman nan molekil aktyèl ki fè fonksyon antretyen ak sèvi kòm sib potansyèl dwòg.Etid konparatif yo te montre ke chay la nan mitasyon mikwòb entraselilè danjere parèt predispose pwoteyin ak asid nikleyik nan misfold ak total, fè yo plis chaperone depandan ak ipèrsansibilite nan chalè19,20,21,22,23.Anplis de sa, divès parazit—evolisyon endepandan pafwa separe pa otan ke 2.5 milya ane—fè eksperyans yon pèt menm jan an nan sant kontwòl kalite nan sentèz pwoteyin yo5,6 ak mekanis reparasyon ADN24.Sepandan, yo konnen ti kras sou enpak la nan fòm entraselilè sou tout lòt pwopriyete nan makromolekil selilè, ki gen ladan adaptasyon molekilè nan yon fado ogmante nan mitasyon danjere.
Nan travay sa a, yo nan lòd yo pi byen konprann evolisyon nan pwoteyin ak asid nikleyik nan mikwo-òganis entraselilè, nou detèmine estrikti nan ribosome nan parazit entraselilè Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi se yon òganis ki sanble ak yon chanpiyon ki fè pati yon gwoup microsporidia parazit ki gen yon ti jenomik ekaryotik ki pa nòmal epi yo itilize kòm òganis modèl pou etidye dezentegrasyon genòm25,26,27,28,29,30.Dènyèman, yo te detèmine estrikti ribozom cryo-EM pou jenom ki redwi modere nan Microsporidia, Paranosema locustae, ak Vairimorpha necatrix31,32 (~3.2 Mb genòm).Estrikti sa yo sijere ke kèk pèt nan anplifikasyon rRNA konpanse pa devlopman nan nouvo kontak ant pwoteyin ribosomal vwazen oswa akizisyon de nouvo pwoteyin ribozomal msL131,32.Espès Encephalitozoon (genom ~ 2.5 milyon bp), ansanm ak fanmi ki pi pre yo Ordospora, demontre degre ultim nan rediksyon genòm nan ekaryot - yo gen mwens pase 2000 jèn kode pwoteyin, epi li espere ke ribosome yo pa sèlman san fragman ekspansyon rRNA (rRNA nan fragman pwoteyin eukaryot) ki gen tou distenge bakteri ribosome ribosome ki soti nan fragman ribosome. s akòz mank de homologues nan E. cuniculi genome26,27,28.Se poutèt sa, nou konkli ke ribozom nan E. cuniculi ka revele estrateji deja enkoni pou adaptasyon molekilè nan pouri anba tè genomic.
Estrikti kriyo-EM nou an reprezante pi piti ribozom sitoplasmik ekaryotik pou karakterize epi li bay yon apèsi sou fason dènye degre rediksyon genòm yo afekte estrikti, asanble, ak evolisyon machin molekilè ki entegral nan selil la.Nou te jwenn ke E. cuniculi ribozom nan vyole anpil nan prensip yo lajman konsève nan plisman RNA ak asanble ribozom, epi dekouvri yon nouvo, ki te deja enkoni pwoteyin ribozomal.Byen sanzatann, nou montre ke microsporidia ribosomes yo te evolye kapasite nan mare molekil ti, ak ipotèz ke tronkasyon nan rRNA ak pwoteyin deklanche inovasyon evolisyonè ki ka finalman bay kalite itil sou ribosome la.
Pou amelyore konpreyansyon nou sou evolisyon pwoteyin ak asid nikleyik nan òganis entraselilè, nou deside izole espò E. cuniculi nan kilti selil mamifè ki enfekte yo nan lòd yo pirifye ribosome yo epi detèmine estrikti ribosome sa yo.Li difisil pou jwenn yon gwo kantite microsporidia parazit paske microsporidia pa ka kiltive nan yon mwayen eleman nitritif.Olye de sa, yo grandi ak repwodui sèlman andedan selil lame a.Se poutèt sa, pou jwenn E. cuniculi byomass pou pirifye ribosome, nou enfekte liy selil mamifè ren RK13 ak espò E. cuniculi epi kiltive selil ki enfekte sa yo pandan plizyè semèn pou pèmèt E. cuniculi grandi ak miltipliye.Sèvi ak yon monokouch selil ki enfekte apeprè mwatye yon mèt kare, nou te kapab pirifye apeprè 300 mg nan espò Microsporidia epi sèvi ak yo izole ribosomes.Lè sa a, nou deranje espò yo pirifye ak pèl an vè ak izole ribosomes yo brit lè l sèvi avèk etap pa etap polietilèn glycol fraksyon nan lysates yo.Sa te pèmèt nou jwenn apeprè 300 µg ribosome kri E. cuniculi pou analiz estriktirèl.
Lè sa a, nou kolekte imaj kriyo-EM lè l sèvi avèk echantiyon ribozom ki te lakòz yo epi trete imaj sa yo lè l sèvi avèk mask ki koresponn ak gwo subunite ribozomal, ti tèt subunit, ak ti subunite.Pandan pwosesis sa a, nou kolekte imaj apeprè 108,000 patikil ribosomal ak imaj kryo-EM kalkile ak yon rezolisyon 2.7 Å (Figi Siplemantè 1-3).Lè sa a, nou itilize imaj cryoEM pou modèl rRNA, pwoteyin ribosomal, ak faktè ibènasyon Mdf1 ki asosye ak E. cuniculi ribosomes (Fig. 1a, b).
yon Estrikti nan E. cuniculi ribosome nan konplèks ak faktè ibènasyon Mdf1 (pdb id 7QEP).b Kat faktè ibènasyon Mdf1 ki asosye ak ribozom E. cuniculi.c Kat estrikti segondè ki konpare rRNA refè nan espès Microsporidian ak estrikti ribozomal li te ye.Panno yo montre kote fragman rRNA anplifye (ES) ak sit aktif ribozom yo, ki gen ladan sit dekodaj (DC), riban sarcinicin (SRL), ak sant peptidil transferaz (PTC).d Dansite elèktron ki koresponn ak sant peptidil transferaz ribozom E. cuniculi a sijere ke sit katalitik sa a gen menm estrikti nan parazit E. cuniculi ak lame li yo, tankou H. sapiens.e, f Dansite elèktron ki koresponn nan sant dekodaj la (e) ak estrikti nan chema nan sant dekodaj la (f) endike ke E. cuniculi gen résidus U1491 olye pou yo A1491 (E. coli nimero) nan anpil lòt eukaryotes.Chanjman sa a sijere ke E. cuniculi ka sansib a antibyotik ki vize sit aktif sa a.
Kontrèman ak estrikti ribosome V. necatrix ak P. locustae ki te etabli yo (tou de estrikti reprezante menm fanmi Nosematidae microsporidia e yo sanble anpil youn ak lòt), 31,32 E. cuniculi ribosomes sibi anpil pwosesis rRNA ak fwagmantasyon pwoteyin.Pli lwen denaturasyon (Figi Siplemantè 4-6).Nan rRNA, chanjman ki pi frape yo enkli pèt konplè nan fragman anplifye 25S rRNA ES12L ak koripsyon pasyèl nan elis h39, h41, ak H18 (figi 1c, Figi siplemantè 4).Pami pwoteyin ribosomal, chanjman ki pi frape yo enkli pèt konplè nan pwoteyin eS30 ak mantèg eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17, ak pwoteyin eS7 (figi siplemantè 4, 5).
Kidonk, rediksyon ekstrèm nan genòm espès Encephalotozoon/Ordospora reflete nan estrikti ribozom yo: E. cuniculi ribosomes fè eksperyans pèt ki pi dramatik nan kontni pwoteyin nan ribozom cytoplasmic eukaryotic sijè a karakterizasyon estriktirèl, epi yo pa menm genyen sa yo rRNA ak pwoteyin fragman ki pa sèlman nan ekaryot yo, men tou se lajman konsève nan domèn nan lavi.Estrikti ribozom E. cuniculi a bay premye modèl molekilè pou chanjman sa yo epi li revele evènman evolisyonè ki te neglije pa genomik konparatif ak etid estrikti biomolekilè entraselilè (figi siplemantè 7).Anba a, nou dekri chak evènman sa yo ansanm ak posiblite orijin evolisyonè yo ak enpak potansyèl yo sou fonksyon ribosome.
Lè sa a, nou te jwenn ke, anplis gwo tronkasyon rRNA, E. cuniculi ribosomes gen varyasyon rRNA nan youn nan sit aktif yo.Malgre ke sant peptidil transferaz ribozom E. cuniculi a gen menm estrikti ak lòt ribozom ekaryotik (Fig. 1d), sant dekodaj la diferan akòz varyasyon sekans nan nukleotid 1491 (E. coli nimero, Fig. 1e, f).Obsèvasyon sa a enpòtan paske sit la dekode nan ribosome ekaryotic tipikman gen résidus G1408 ak A1491 konpare ak résidus ki kalite bakteri A1408 ak G1491.Varyasyon sa a anba sansiblite diferan nan ribosome bakteri ak ekaryotik nan fanmi an aminoglikozid nan antibyotik ribosomal ak lòt molekil ti ki vize sit la dekode.Nan sit la dekode nan E. cuniculi ribosome a, rezidi A1491 te ranplase ak U1491, potansyèlman kreye yon koòdone inik obligatwa pou ti molekil vize sit aktif sa a.Menm Variant A14901 la tou prezan nan lòt microsporidia tankou P. locustae ak V. necatrix, sijere ke li gaye toupatou nan mitan espès microsporidia (Fig. 1f).
Paske echantiyon ribozom E. cuniculi nou yo te izole nan espò metabolik inaktif, nou teste kat jeyografik kriyo-EM nan E. cuniculi pou lyezon ribozom ki te dekri deja anba kondisyon estrès oswa grangou.Faktè ibènasyon 31,32,36,37, 38. Nou matche estrikti ribozòm ibènasyon an te etabli anvan ak kat kriyo-EM ribozom E. cuniculi.Pou debakadè, S. cerevisiae ribosomes yo te itilize nan konplèks ak faktè ibènasyon Stm138, ribosome krikèt nan konplèks ak faktè Lso232, ak V. necatrix ribosomes nan konplèks ak faktè Mdf1 ak Mdf231.An menm tan an, nou jwenn dansite cryo-EM ki koresponn ak faktè rès Mdf1 la.Menm jan ak Mdf1 obligatwa ak ribozòm V. necatrix la, Mdf1 mare tou ak ribozòm E. cuniculi, kote li bloke sit E ribozom nan, pètèt ede fè ribosomes disponib lè espò parazit yo vin metabolik inaktif sou inaktivasyon kò a (Figi 2).).
Mdf1 bloke sit E ribosome a, ki parèt ede inaktive ribosome a lè espò parazit yo vin metabolik inaktif.Nan estrikti ribozom E. cuniculi a, nou te jwenn ke Mdf1 fòme yon kontak deja enkoni ak tij ribozom L1 la, pati nan ribozom nan ki fasilite liberasyon tRNA deacylate nan ribozom nan pandan sentèz pwoteyin.Kontak sa yo sijere ke Mdf1 dissociate de ribosome a lè l sèvi avèk mekanis nan menm jan ak tRNA deacetylated, bay yon eksplikasyon posib pou kijan ribosome a retire Mdf1 pou reaktive sentèz pwoteyin.
Sepandan, estrikti nou an te revele yon kontak enkoni ant Mdf1 ak janm ribozòm L1 (pati nan ribosome ki ede lage tRNA deacylate nan ribozom nan pandan sentèz pwoteyin).An patikilye, Mdf1 sèvi ak kontak yo menm jan ak segman koud nan molekil tRNA deacylate (figi 2).Modèl molekilè sa a te enkoni deja te montre ke Mdf1 dissociates de ribosome a lè l sèvi avèk menm mekanis ak tRNA deacetylated, ki eksplike kijan ribosome a retire faktè ibènasyon sa a pou reaktive sentèz pwoteyin.
Lè nou konstwi modèl rRNA a, nou te jwenn ke E. cuniculi ribosome a gen fragman rRNA ki pa nòmal ki pliye, ke nou te rele rRNA fusion (figi 3).Nan ribosomes ki kouvri twa domèn lavi yo, rRNA pliye nan estrikti kote pifò rRNA baz swa pè baz ak pliye youn ak lòt oswa kominike avèk pwoteyin ribozomal38,39,40.Sepandan, nan E. cuniculi ribosomes, rRNA yo sanble vyole prensip sa a plisman lè yo konvèti kèk nan elis yo nan rejyon rRNA depliye.
Estrikti helix rRNA H18 25S nan S. cerevisiae, V. necatrix, ak E. cuniculi.Tipikman, nan ribosomes ki kouvri twa domèn lavi yo, linker sa a anroule nan yon helix RNA ki gen 24 a 34 résidus.Nan Microsporidia, Kontrèman, linker rRNA sa a piti piti redwi a de linkers ki gen yon sèl uridine ki gen sèlman 12 résidus.Pifò nan résidus sa yo ekspoze a solvang.Figi a montre ke microsporidia parazit parèt vyole prensip jeneral yo nan pliye rRNA, kote baz rRNA yo anjeneral makonnen ak lòt baz oswa patisipe nan entèraksyon rRNA-pwoteyin.Nan microsporidia, kèk fragman rRNA pran yon pli favorab, nan ki ansyen helix rRNA a vin tounen yon fragman yon sèl-cheche long prèske nan yon liy dwat.Prezans nan rejyon sa yo etranj pèmèt microsporidia rRNA mare fragman rRNA byen lwen lè l sèvi avèk yon kantite minimòm de baz RNA.
Egzanp ki pi frape nan tranzisyon evolisyonè sa a ka obsève nan helix rRNA H18 25S (figi 3).Nan espès ki soti nan E. coli rive nan moun, baz helix rRNA sa a gen 24-32 nukleotid, ki fòme yon helix yon ti kras iregilye.Nan estrikti ribosomal ki te idantifye deja nan V. necatrix ak P. locustae,31,32 baz helix H18 yo pasyèlman dewoule, men pèman baz nukleotid yo konsève.Sepandan, nan E. cuniculi fragman rRNA sa a vin pi kout linkers 228UUUUUU232 ak 301UUUUUUUU307.Kontrèman ak fragman rRNA tipik, linkers sa yo ki rich ak uridin pa bobin oswa fè kontak anpil ak pwoteyin ribosomal.Olye de sa, yo adopte estrikti sòlvan-louvri ak konplètman depliye nan ki seksyon rRNA yo pwolonje prèske dwat.Konfòmasyon lonje sa a eksplike kijan E. cuniculi itilize sèlman 12 baz RNA pou ranpli espas sa a 33 Å ant elis rRNA H16 ak H18, pandan ke lòt espès mande pou omwen de fwa plis baz rRNA pou ranpli espas sa a.
Kidonk, nou ka demontre ke, atravè plisman enèjik favorab, microsporidia parazit yo te devlope yon estrateji pou kontra menm segman rRNA sa yo ki rete lajman konsève atravè espès nan twa domèn lavi yo.Aparamman, lè yo akimile mitasyon ki transfòme elis rRNA an lyetè poly-U kout, E. cuniculi ka fòme fragman rRNA etranj ki gen mwens nukleotid ke posib pou ligasyon nan fragman rRNA distal.Sa a ede eksplike kijan microsporidia reyalize yon rediksyon dramatik nan estrikti molekilè debaz yo san yo pa pèdi entegrite estriktirèl ak fonksyonèl yo.
Yon lòt karakteristik etranj nan E. cuniculi rRNA se aparans nan rRNA san epesman (Fig. 4).Bulges yo se nukleotid san pè baz ki tòde soti nan helix RNA a olye pou yo kache ladan l.Pifò protrusions rRNA aji kòm adezif molekilè, ede mare pwoteyin ribosomal adjasan oswa lòt fragman rRNA.Gen kèk nan bulges yo aji kòm gon, sa ki pèmèt helix rRNA a flechi ak pliye parfètman pou sentèz pwoteyin pwodiktif 41 .
a Yon pwotrusion rRNA (S. cerevisiae nimero) absan nan estrikti ribozom E. cuniculi, men prezan nan pifò lòt ekaryot b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens, ak E. cuniculi ribosome entèn yo.parazit yo manke anpil nan rRNA ansyen, ki trè konsève.Epesman sa yo estabilize estrikti nan ribozom;Se poutèt sa, absans yo nan microsporidia endike yon estabilite redwi nan plisman rRNA nan parazit microsporidia.Konparezon ak tij P (tij L7/L12 nan bakteri) montre ke pèt monte desann rRNA pafwa kowenside ak aparans nan nouvo monte desann bò kote monte desann yo pèdi.Helix H42 nan rRNA 23S/28S la gen yon ansyen bulge (U1206 nan Saccharomyces cerevisiae) ki estime li gen omwen 3.5 milya ane akòz pwoteksyon li nan twa domèn lavi.Nan microsporidia, bonbe sa a elimine.Sepandan, yon nouvo bulge parèt akote bulge pèdi a (A1306 nan E. cuniculi).
Sezisman, nou te jwenn ke E. cuniculi ribosomes manke pi fò nan rRNA bulges yo te jwenn nan lòt espès, ki gen ladan plis pase 30 bulges konsève nan lòt ekaryot (Fig. 4a).Pèt sa a elimine anpil kontak ant subinite ribosomal yo ak elis rRNA adjasan yo, pafwa kreye gwo twou vid nan ribozom nan, ki fè E. cuniculi ribozom nan pi pore konpare ak ribosome ki pi tradisyonèl yo (Fig. 4b).Miyò, nou te jwenn ke pi fò nan bulges sa yo te tou pèdi nan estrikti yo te deja idantifye V. necatrix ak P. locustae ribosome, ki te neglije pa analiz estriktirèl anvan yo31,32.
Pafwa pèt rRNA bulges akonpaye pa devlopman nouvo bulges akote bulge pèdi a.Pou egzanp, P-tij ribozomal la gen yon bulge U1208 (nan Saccharomyces cerevisiae) ki te siviv soti nan E. coli nan imen e se poutèt sa estime li gen 3.5 milya ane fin vye granmoun.Pandan sentèz pwoteyin, bulge sa a ede tij P deplase ant konformasyon ouvè ak fèmen pou ribozom nan ka rekrite faktè tradiksyon epi delivre yo nan sit aktif la.Nan E. cuniculi ribosomes, epesman sa a absan;sepandan, yon nouvo epesman (G883) ki sitiye sèlman nan twa pè baz ka kontribye nan restorasyon nan fleksibilite nan pi bon nan tij la P (figi 4c).
Done nou yo sou rRNA san bulges sijere ke rRNA minimize se pa sa sèlman pèt la nan eleman rRNA sou sifas la nan ribozom nan, men yo ka enplike tou nwayo a ribosome, kreye yon defo molekilè espesifik parazit ki pa te dekri nan selil k ap viv gratis.yo obsève espès vivan yo.
Apre modèl pwoteyin ribozomal kanonik ak rRNA, nou te jwenn ke konpozan ribozomal konvansyonèl yo pa ka eksplike twa pati yo nan imaj la cryo-EM.De nan fragman sa yo se ti molekil nan gwosè (figi 5, Figi siplemantè 8).Premye segman an sandwich ant pwoteyin ribosomal uL15 ak eL18 nan yon pozisyon anjeneral okipe pa tèminal C nan eL18, ki pi kout nan E. cuniculi.Malgre ke nou pa ka detèmine idantite molekil sa a, gwosè ak fòm zile sa a dansite byen eksplike pa prezans molekil espèmidin.Liaison li pou ribosome a estabilize pa microsporidia-espesifik mitasyon nan pwoteyin uL15 (Asp51 ak Arg56), ki sanble ogmante afinite nan ribozom nan pou ti molekil sa a, menm jan yo pèmèt uL15 vlope ti molekil la nan yon estrikti ribozomal.Figi siplemantè 2).8, done adisyonèl 1, 2).
D 'Cryo-EM ki montre prezans nukleotid deyò riboz la mare nan ribozòm E. cuniculi.Nan ribozom E. cuniculi a, nukleotid sa a okipe menm kote ak nukleotid 25S rRNA A3186 (Saccharomyces cerevisiae nimero) nan pifò lòt ribozom ekaryotik.b Nan estrikti ribosomal E. cuniculi, nukleotid sa a sitiye ant pwoteyin ribosomal uL9 ak eL20, kidonk estabilize kontak ant de pwoteyin yo.cd eL20 analiz konsèvasyon sekans nan mitan espès microsporidia.Pyebwa filojenetik espès Microsporidia (c) ak aliyman sekans miltip nan pwoteyin eL20 (d) montre ke rezidi nukleotid-obligatwa F170 ak K172 yo konsève nan Microsporidia ki pi tipik, ak eksepsyon de S. lophii, ak eksepsyon de branch byen bonè Microsporidia a, ki te kenbe ekstansyon ES39L la.e Figi sa a montre ke rezidi ki gen fòs nikleotid F170 ak K172 yo prezan sèlman nan eL20 nan genòm microsporidia ki trè redwi, men se pa nan lòt ekaryot.An jeneral, done sa yo sijere ke Microsporidian ribosomes yo te devlope yon sit obligatwa nukleotid ki parèt mare molekil AMP epi sèvi ak yo pou estabilize entèraksyon pwoteyin-pwoteyin nan estrikti ribosomal la.Konsèvasyon segondè nan sit sa a obligatwa nan Microsporidia ak absans li nan lòt ekaryot sijere ke sit sa a ka bay yon avantaj siviv selektif pou Microsporidia.Kidonk, pòch nukleotid-obligatwa nan ribosome microsporidia a pa parèt yo dwe yon karakteristik dejenere oswa yon fòm fen nan degradasyon rRNA jan sa deja dekri, men pito yon inovasyon evolisyonè itil ki pèmèt ribosome nan microsporidia dirèkteman mare ti molekil, lè l sèvi avèk yo kòm blòk bilding molekilè.blòk bilding pou ribosomes.Dekouvèt sa a fè ribozom microsporidia a sèlman ribozom li te ye pou sèvi ak yon sèl nukleotid kòm blòk bilding estriktirèl li yo.f Ipotetik chemen evolisyonè ki sòti nan lyezon nukleotid.
Dezyèm dansite pwa molekilè ki ba a sitiye nan koòdone ant pwoteyin ribosomal uL9 ak eL30 (figi 5a).Koòdone sa a te deja dekri nan estrikti a nan ribozom Saccharomyces cerevisiae kòm yon sit obligatwa pou nukleotid 25S nan rRNA A3186 (yon pati nan ekstansyon rRNA ES39L)38.Li te montre ke nan dejenere P. locustae ES39L ribosomes, koòdone sa a mare yon sèl nukleotid enkoni 31, epi li sipoze ke nukleotid sa a se yon fòm final redwi nan rRNA, nan ki longè rRNA se ~ 130-230 baz.ES39L redwi a yon sèl nukleotid 32.43.Imaj kriyo-EM nou yo sipòte lide ke dansite ka eksplike pa nukleotid.Sepandan, rezolisyon ki pi wo nan estrikti nou an te montre ke nukleotid sa a se yon molekil ekstraribosomal, petèt AMP (Fig. 5a, b).
Lè sa a, nou te mande si sit la obligatwa nukleotid parèt nan E. cuniculi ribosome a oswa si li te egziste deja.Piske ligasyon nukleotid sitou medyatè pa rezidi Phe170 ak Lys172 nan pwoteyin ribozomal eL30 la, nou te evalye konsèvasyon rezidi sa yo nan 4396 ekaryot reprezantan.Kòm nan ka a nan uL15 pi wo a, nou te jwenn ke Phe170 ak Lys172 résidus yo trè konsève sèlman nan Microsporidia tipik, men absan nan lòt eukaryot, ki gen ladan atipik Microsporidia Mitosporidium ak Amphiamblys, nan ki fragman ES39L rRNA a pa redwi 44, 44, 4546 (Fig.-e).
Ansanm, done sa yo sipòte lide ke E. cuniculi ak pètèt lòt microsporidia kanonik te evolye kapasite pou yo kaptire avèk efikasite gwo kantite ti metabolit nan estrikti ribozom nan pou konpanse n bès nan nivo rRNA ak pwoteyin.Nan fè sa, yo te devlope yon kapasite inik pou mare nukleotid deyò ribozom nan, ki montre ke estrikti molekilè parazit konpanse lè yo kaptire abondan metabolit ti epi sèvi ak yo kòm mimik estriktirèl nan RNA degrade ak fragman pwoteyin..
Twazyèm pati ensimule nan kat jeyografik kriyo-EM nou an, yo jwenn nan gwo subunite ribozomal la.Rezolisyon an relativman wo (2.6 Å) nan kat jeyografik nou an sijere ke dansite sa a fè pati pwoteyin ak konbinezon inik nan gwo rezidi chèn bò, ki te pèmèt nou idantifye dansite sa a kòm yon pwoteyin ribozomal deja enkoni ke nou te idantifye kòm li te rele msL2 (Microsporidia-specific protein L2) (metòd, figi 6).Rechèch omoloji nou an te montre ke msL2 konsève nan clade Microsporidia nan genus Encephaliter ak Orosporidium, men absan nan lòt espès, ki gen ladan lòt Microsporidia.Nan estrikti ribosomal la, msL2 okipe yon espas ki te fòme pa pèt rRNA ES31L pwolonje a.Nan vid sa a, msL2 ede estabilize plisman rRNA epi li ka konpanse pou pèt ES31L (Figi 6).
a Dansite elèktron ak modèl pwoteyin ribozomal ki espesifik nan Microsporidia msL2 yo jwenn nan ribosome E. cuniculi.b Pifò ribosome ekaryotik, ki gen ladan ribosome 80S Saccharomyces cerevisiae, gen anplifikasyon ES19L rRNA pèdi nan pifò espès Microsporidian.Estrikti ribozom V. necatrix microsporidia ki te deja etabli a sijere ke pèt ES19L nan parazit sa yo konpanse pa evolisyon nouvo pwoteyin ribozomal msL1 la.Nan etid sa a, nou te jwenn ke E. cuniculi ribozom nan tou devlope yon adisyonèl ribosomal RNA imite pwoteyin kòm yon konpansasyon aparan pou pèt la nan ES19L.Sepandan, msL2 (aktyèlman anote kòm ipotetik pwoteyin ECU06_1135) ak msL1 gen diferan orijin estriktirèl ak evolisyonè.c Dekouvèt sa a nan jenerasyon pwoteyin ribosomal msL1 ak msL2 ki pa gen rapò evolisyonè sijere ke si ribosomes akimile mitasyon prejidis nan rRNA yo, yo ka reyalize nivo divèsite konpozisyon san parèy nan menm yon ti sou-ansanm espès ki byen gen rapò.Dekouvèt sa a ta ka ede klarifye orijin ak evolisyon ribosome mitokondriyo a, ki se li te ye pou rRNA trè redwi li yo ak varyasyon nòmal nan konpozisyon pwoteyin atravè espès yo.
Lè sa a, nou te konpare pwoteyin msL2 ak pwoteyin msL1 ki te dekri anvan an, se sèlman pwoteyin ribozomal microsporidia espesifik yo te jwenn nan ribozom V. necatrix la.Nou te vle teste si msL1 ak msL2 gen rapò evolisyonè.Analiz nou an te montre ke msL1 ak msL2 okipe menm kavite nan estrikti ribosomal la, men yo gen diferan estrikti prensipal ak siperyè, ki endike orijin endepandan evolisyonè yo (Fig. 6).Kidonk, dekouvèt nou an nan msL2 bay prèv ke gwoup espès ekaryotik kontra enfòmèl ant ka evolye poukont li estriktirèl distenk pwoteyin ribosomal pou konpanse pèt fragman rRNA.Konklizyon sa a se remakab nan ke pifò ribosome cytoplasmic eukaryotic gen yon pwoteyin invariant, ki gen ladan menm fanmi an nan 81 pwoteyin ribozomal.Aparans msL1 ak msL2 nan divès kalite microsporidia an repons a pèt segman rRNA pwolonje sijere ke degradasyon nan achitekti molekilè parazit la lakòz parazit yo chèche mitasyon konpansatwa, ki ka evantyèlman mennen nan akizisyon yo nan diferan popilasyon parazit.estrikti.
Finalman, lè modèl nou an te fini, nou konpare konpozisyon ribozom E. cuniculi a ak sa ki prevwa nan sekans genomic a.Plizyè pwoteyin ribosomal, ki gen ladan eL14, eL38, eL41, ak eS30, te deja panse ke yo te manke nan genòm nan E. cuniculi akòz absans la aparan nan omològ yo nan genòm nan E. cuniculi.Pèt anpil pwoteyin ribozomal yo prevwa tou nan pifò lòt parazit intraselilè trè redwi ak endosymbiont.Pa egzanp, byenke pifò bakteri k ap viv gratis genyen menm fanmi 54 pwoteyin ribozomal, sèlman 11 nan fanmi pwoteyin sa yo gen omologues detektab nan chak genòm analize nan bakteri lame ki limite.Pou sipòte nosyon sa a, yo te obsève eksperimantal yon pèt nan pwoteyin ribosomal nan V. necatrix ak P. locustae microsporidia, ki manke pwoteyin eL38 ak eL4131,32.
Sepandan, estrikti nou yo montre ke sèlman eL38, eL41, ak eS30 aktyèlman pèdi nan ribosome E. cuniculi.Pwoteyin eL14 te konsève ak estrikti nou an te montre poukisa pwoteyin sa a pa t 'kapab jwenn nan rechèch la omoloji (Fig. 7).Nan E. cuniculi ribosomes, pi fò nan sit la obligatwa eL14 pèdi akòz degradasyon nan rRNA-anplifye ES39L la.Nan absans ES39L, eL14 pèdi pi fò nan estrikti segondè li yo, epi sèlman 18% nan sekans eL14 te idantik nan E. cuniculi ak S. cerevisiae.Konsèvasyon sekans pòv sa a remakab paske menm Saccharomyces cerevisiae ak Homo sapiens—òganis ki te evolye 1.5 milya ane apa—pataje plis pase 51% nan menm rezidi yo nan eL14.Pèt konsèvasyon anòmal sa a eksplike poukisa E. cuniculi eL14 kounye a anote kòm pwoteyin M970_061160 putatif la epi li pa kòm pwoteyin ribozomal eL1427.
ak Microsporidia ribosome a pèdi ekstansyon ES39L rRNA, ki pasyèlman elimine sit obligatwa eL14 nan pwoteyin ribozomal.Nan absans ES39L, pwoteyin microspore eL14 sibi yon pèt nan estrikti segondè, kote ansyen rRNA-obligatwa α-helix la dejenere nan yon bouk longè minimòm.b Aliyman sekans miltip montre ke pwoteyin eL14 la trè konsève nan espès ekaryotik (57% idantite sekans ant ledven ak omològ imen), men mal konsève ak divèjan nan mikrosporidya (nan ki pa plis pase 24% nan rezidi yo idantik ak omològ eL14 la).soti nan S. cerevisiae oswa H. sapiens).Konsèvasyon sekans pòv sa a ak varyasyon estrikti segondè eksplike poukisa omològ eL14 la pa janm te jwenn nan E. cuniculi e poukisa yo panse pwoteyin sa a te pèdi nan E. cuniculi.Kontrèman, E. cuniculi eL14 te deja anote kòm yon pwoteyin M970_061160 putatif.Obsèvasyon sa a sijere ke divèsite genòm microsporidia se kounye a surestime: gen kèk jèn kounye a panse yo dwe pèdi nan mikrosporidia yo an reyalite konsève, byenke nan fòm trè différenciés;olye de sa, gen kèk yo panse yo kode pou jèn mikrosporidia pou pwoteyin espesifik vè k'ap manje kadav (pa egzanp, pwoteyin ipotetik M970_061160) aktyèlman kòd pou pwoteyin ki trè divès yo jwenn nan lòt ekaryot.
Konklizyon sa a sijere ke denaturasyon rRNA ka mennen nan yon pèt dramatik nan konsèvasyon sekans nan pwoteyin ribosomal adjasan, rann pwoteyin sa yo endeslabl pou rechèch omoloji.Kidonk, nou ka surestimate degre aktyèl la nan degradasyon molekilè nan ti òganis genomic, paske gen kèk pwoteyin ki te panse yo dwe pèdi aktyèlman pèsiste, byenke nan fòm trè chanje.
Ki jan parazit yo ka kenbe fonksyon machin molekilè yo nan kondisyon rediksyon genòm ekstrèm?Etid nou an reponn kesyon sa a lè li dekri estrikti molekilè konplèks (ribozòm) E. cuniculi, yon òganis ki gen youn nan pi piti jenom ekaryotik yo.
Li te konnen pou prèske de deseni ke molekil pwoteyin ak RNA nan parazit mikwòb yo souvan diferan de molekil omològ yo nan espès k ap viv gratis paske yo manke sant kontwòl kalite, yo redwi a 50% nan gwosè yo nan mikwòb k ap viv gratis, elatriye.anpil mitasyon feblès ki afekte plisman ak fonksyon.Pou egzanp, ribosomes yo nan ti òganis genomic, ki gen ladan anpil parazit intraselilè ak endosymbiont, yo espere manke plizyè pwoteyin ribosom ak jiska yon tyè nan nukleotid rRNA konpare ak espès k ap viv gratis 27, 29, 30, 49. Sepandan, fason molekil sa yo fonksyone nan parazit yo rete comparativement yon gwo parazit nan parazit yo, ki rete comparativement gwo.
Etid nou an montre ke estrikti makromolekil yo ka revele anpil aspè nan evolisyon ki difisil pou ekstrè nan etid tradisyonèl konparatif jenomik parazit intraselilè ak lòt òganis ki gen restriksyon sou lame (figi siplemantè 7).Pou egzanp, egzanp lan nan pwoteyin eL14 montre ke nou ka ègzajere degre aktyèl la nan degradasyon nan aparèy la molekilè nan espès parazit.Yo kwè kounye a parazit ansefalitik yo gen dè santèn de jèn mikrosporidi espesifik.Sepandan, rezilta nou yo montre ke kèk nan jèn sa yo w pèdi espesifik yo se aktyèlman jis varyant trè diferan nan jèn ki komen nan lòt ekaryot.Anplis de sa, egzanp pwoteyin msL2 la montre kouman nou neglije nouvo pwoteyin ribozomal ak souzèstime kontni machin molekilè parazit yo.Egzanp molekil ti montre kijan nou ka neglije inovasyon ki pi enjenyeu nan estrikti molekilè parazit ki ka ba yo nouvo aktivite byolojik.
Ansanm, rezilta sa yo amelyore konpreyansyon nou sou diferans ki genyen ant estrikti molekilè òganis ki gen restriksyon pou lame yo ak tokay yo nan òganis k ap viv gratis.Nou montre ke machin molekilè, depi lontan te panse yo dwe redwi, dejenere, ak sijè a divès kalite mitasyon feblès, olye yo gen yon seri karakteristik estriktirèl dwòl neglije sistematik.
Nan lòt men an, fragman rRNA ki pa ankonbran ak fragman fusion ke nou te jwenn nan ribosomes yo nan E. cuniculi sijere ke rediksyon genòm ka chanje menm pati sa yo nan machin nan molekilè debaz ki konsève nan twa domèn yo nan lavi - apre prèske 3.5 milya ane.evolisyon endepandan nan espès yo.
Fragman rRNA ki pa gonfle ak fusion nan ribosome E. cuniculi yo gen yon enterè patikilye nan limyè de etid anvan yo sou molekil RNA nan bakteri endosymbiotic.Pou egzanp, nan afid endosymbiont Buchnera aphidicola, rRNA ak tRNA molekil yo te montre yo gen estrikti tanperati-sansib akòz patipri konpozisyon A + T ak yon gwo pwopòsyon nan pè baz ki pa canonical20,50.Chanjman sa yo nan RNA, osi byen ke chanjman nan molekil pwoteyin, kounye a yo panse yo dwe responsab pou twòp depandans nan endosymbionts sou patnè yo ak enkapasite nan endosymbionts yo transfere chalè 21, 23.Malgre ke parazit microsporidia rRNA gen chanjman estriktirèl diferan, nati a nan chanjman sa yo sijere ke redwi estabilite tèmik ak pi wo depandans sou pwoteyin chaperon yo ka karakteristik komen nan molekil RNA nan òganis ki gen jenom redwi.
Nan lòt men an, estrikti nou yo montre ke microsporidia parazit yo te evolye yon kapasite inik pou reziste rRNA lajman konsève ak fragman pwoteyin, devlope kapasite nan sèvi ak metabolit abondan ak fasilman disponib kòm mime estriktirèl nan rRNA dejenere ak fragman pwoteyin.Degradasyon estrikti molekilè..Opinyon sa a sipòte pa lefèt ke ti molekil ki konpanse pou pèt fragman pwoteyin nan rRNA a ak ribosomes nan E. cuniculi mare nan microsporidia-espesifik résidus nan pwoteyin uL15 ak eL30.Sa a sijere ke obligatwa nan molekil ti ribosome yo ka yon pwodwi nan seleksyon pozitif, nan ki Mikrosporidia-espesifik mitasyon nan pwoteyin ribosomal yo te chwazi pou kapasite yo ogmante afinite nan ribozom pou ti molekil, ki ka mennen nan òganis ribosom pi efikas.Dekouvèt la revele yon inovasyon entelijan nan estrikti molekilè parazit mikwòb yo epi li ban nou yon pi bon konpreyansyon sou fason estrikti molekilè parazit yo kenbe fonksyon yo malgre evolisyon rediksyon.
Kounye a, idantifikasyon ti molekil sa yo pa klè.Li pa klè poukisa aparans ti molekil sa yo nan estrikti ribozomal la diferan ant espès microsporidia.An patikilye, li pa klè poukisa yo obsève lyezon nukleotid nan ribosomes yo nan E. cuniculi ak P. locustae, epi yo pa nan ribosomes yo nan V. necatrix, malgre prezans nan rezidi nan F170 nan pwoteyin eL20 ak K172 nan V. necatrix.Sipresyon sa a ka koze pa rezidi 43 uL6 (ki sitiye adjasan a pòch la obligatwa nukleotid), ki se tirozin nan V. necatrix epi yo pa threonine nan E. cuniculi ak P. locustae.Chèn bò kote aromat ki ankonbran Tyr43 ka entèfere ak lyezon nukleotid akòz sipèpoze esterik.Altènativman, sipresyon an nukleotid aparan ka akòz rezolisyon ki ba nan D 'cryo-EM, ki anpeche modèl la nan V. necatrix fragman ribozomal.
Nan lòt men an, travay nou an sijere ke pwosesis la nan pouri anba tè genomik ka yon fòs envante.An patikilye, estrikti ribozom E. cuniculi a sijere ke pèt rRNA ak fragman pwoteyin nan ribosome microsporidia a kreye presyon evolisyonè ki ankouraje chanjman nan estrikti ribosome.Variant sa yo rive lwen sit aktif ribozom nan epi yo sanble ede kenbe (oswa retabli) asanble ribosome optimal ki ta deranje pa rRNA redwi.Sa a sijere ke yon gwo inovasyon nan ribozom nan mikrosporidia parèt yo te evolye nan yon bezwen tanpon drift jèn.
Petèt sa a pi byen ilistre pa obligatwa nukleotid, ki pa janm te obsève nan lòt òganis byen lwen tèlman.Lefèt ke rezidi nukleotid-obligatwa yo prezan nan microsporidia tipik, men se pa nan lòt ekaryot, sijere ke sit nukleotid-obligatwa yo se pa sèlman rlik k ap tann yo disparèt, oswa sit final la pou rRNA yo dwe retabli nan fòm nan nukleotid endividyèl.Olye de sa, sit sa a sanble tankou yon karakteristik itil ki ta ka evolye sou plizyè jij nan seleksyon pozitif.Sit obligatwa nukleotid yo ka yon sous-pwodwi seleksyon natirèl: yon fwa ES39L degrade, microsporidia yo oblije chèche konpansasyon pou retabli pi bon byogenesis ribozom nan absans ES39L.Piske nukleotid sa a ka imite kontak molekilè nukleotid A3186 nan ES39L, molekil nukleotid la vin tounen yon blòk bilding ribozom nan, li ki pi plis amelyore pa mitasyon sekans eL30 la.
Konsènan evolisyon molekilè parazit intraselilè, etid nou an montre ke fòs seleksyon natirèl Darwinian ak drift jenetik dezentegrasyon genòm pa opere an paralèl, men osile.Premyèman, drift jenetik elimine karakteristik enpòtan nan byomolekil, sa ki fè konpansasyon gwo bezwen.Se sèlman lè parazit satisfè bezwen sa a atravè seleksyon natirèl Darwinian yo pral makromolekil yo gen yon chans yo devlope karakteristik ki pi enpresyonan ak inovatè yo.Sa ki enpòtan, evolisyon nan sit obligatwa nukleotid nan E. cuniculi ribosome a sijere ke modèl pèt-a-gain nan evolisyon molekilè sa a pa sèlman amortize mitasyon danjere, men pafwa konfere totalman nouvo fonksyon sou makromolekil parazit.
Lide sa a konsistan avèk teyori ekilib k ap deplase Sewell Wright a, ki di yon sistèm seleksyon natirèl strik limite kapasite òganis yo pou yo inove51,52,53.Sepandan, si drift jenetik deranje seleksyon natirèl, drift sa yo ka pwodwi chanjman ki pa nan tèt yo adaptasyon (oswa menm prejidis) men mennen nan plis chanjman ki bay pi wo kapasite oswa nouvo aktivite byolojik.Fondasyon nou an sipòte lide sa a nan ilistre ke menm kalite mitasyon ki diminye pliye ak fonksyon yon biomolekil parèt kòm deklanche prensipal la pou amelyorasyon li yo.Nan liy ak modèl evolisyonè genyen-genyen an, etid nou an montre ke dekonpozisyon genomic, tradisyonèlman konsidere kòm yon pwosesis dejeneratif, se tou yon gwo chofè inovasyon, pafwa e petèt menm souvan ki pèmèt makromolekil jwenn nouvo aktivite parazit.ka sèvi ak yo.