Mèsi paske ou te vizite Nature.com. W ap itilize yon vèsyon navigatè ki gen sipò CSS limite. Pou pi bon eksperyans lan, nou rekòmande pou ou itilize yon navigatè ki ajou (oswa dezaktive Mòd Konpatibilite nan Internet Explorer). Anplis de sa, pou asire sipò kontinyèl, nou montre sit la san estil ak JavaScript.
Montre yon karousel twa diapozitiv alafwa. Sèvi ak bouton Presedan ak Pwochen yo pou deplase nan twa diapozitiv alafwa, oubyen sèvi ak bouton kurseur yo nan fen an pou deplase nan twa diapozitiv alafwa.
Baryè san-sèvo a ak baryè san-sèvo a anpeche ajan byoterapik yo rive nan sib yo nan sistèm nève santral la, kidonk anpeche tretman efikas maladi newolojik yo. Pou nou dekouvri nouvo transpòtè nan sèvo in vivo, nou te entwodui yon bibliyotèk peptid faj T7 epi nou te kolekte san ak likid sefalorakin (LCR) an seri lè l sèvi avèk yon modèl gwo pisin rat konsyan kanile. Klon faj espesifik yo te trè anrichi nan LCR apre kat seri seleksyon. Tès peptid kandida endividyèl yo te revele yon anrichisman plis pase 1000 fwa nan LCR. Bioaktivite livrezon medyatè peptid la nan sèvo a te konfime pa yon rediksyon 40% nan nivo amiloyid-β nan likid sefalorakin an lè l sèvi avèk yon inibitè peptid BACE1 ki lye ak nouvo peptid transpò idantifye a. Rezilta sa yo sijere ke peptid yo idantifye pa metòd seleksyon faj in vivo yo ka veyikil itil pou livrezon sistemik makromolekil nan sèvo a ak yon efè terapetik.
Rechèch sou terapi sible sistèm nève santral la (SNC) te sitou konsantre sou idantifye medikaman ak ajan optimize ki montre pwopriyete vize SNC, ak mwens efò pou dekouvri mekanis ki kondwi livrezon aktif medikaman nan sèvo a. Sa a kòmanse chanje kounye a kòm livrezon medikaman, espesyalman gwo molekil, se yon pati entegral nan devlopman medikaman newosyans modèn. Anviwònman sistèm nève santral la byen pwoteje pa sistèm baryè serebrovaskilè a, ki konpoze de baryè san-sèvo (BBB) ​​ak baryè san-sèvo (BCBB)1, sa ki fè li difisil pou delivre medikaman nan sèvo a1,2. Yo estime ke prèske tout medikaman gwo molekil ak plis pase 98% nan medikaman ti molekil yo elimine nan sèvo a3. Se poutèt sa li trè enpòtan pou idantifye nouvo sistèm transpò nan sèvo ki bay livrezon efikas ak espesifik nan medikaman terapetik nan SNC 4,5. Sepandan, BBB ak BCSFB prezante tou yon ekselan opòtinite pou livrezon medikaman pandan y ap penetre epi antre nan tout estrikti sèvo a atravè vaskilatè vaste li a. Kidonk, efò aktyèl yo pou itilize metòd livrezon ki pa anvayisan nan sèvo a baze lajman sou mekanis transpò medyatè pa reseptè (PMT) lè l sèvi avèk reseptè andojèn BBB6 la. Malgre dènye avansman kle yo lè l sèvi avèk chemen reseptè transferin lan7,8, plis devlopman nouvo sistèm livrezon ak pwopriyete amelyore nesesè. Pou sa, objektif nou sete idantifye peptid ki kapab medyatè transpò CSF, paske yo te ka an prensip itilize pou delivre makromolekil nan CNS la oswa pou louvri nouvo chemen reseptè. An patikilye, reseptè espesifik ak transpòtè nan sistèm serebrovaskilè a (BBB ak BSCFB) ka sèvi kòm sib potansyèl pou livrezon aktif ak espesifik nan dwòg byoterapik. Likid serebrospinal (CSF) se yon pwodwi sekresyon nan pleksis koroyid la (CS) epi li an kontak dirèk ak likid entèstisyèl sèvo a atravè espas subaraknoyid la ak espas ventrikilè a4. Dènyèman, yo te montre ke likid serebrospinal subaraknoyid la difize twòp nan entèstisyòm sèvo a9. Nou espere jwenn aksè nan espas parenchimal la lè nou itilize aparèy antre subaraknoidyen sa a oswa dirèkteman atravè BBB a. Pou reyalize sa, nou aplike yon estrateji seleksyon faj in vivo solid ki ideyalman idantifye peptid ki transpòte pa youn nan de chemen distenk sa yo.
Kounye a, nou dekri yon metòd tès depistaj faj sekansyèl in vivo ak echantiyonaj LCR makonnen ak sekansaj gwo debi (HTS) pou kontwole premye seri seleksyon yo ak pi gwo divèsite bibliyotèk la. Tès depistaj la te fèt sou rat konsyan ak yon kanil gwo sistèn (CM) enplante pèmanan pou evite kontaminasyon san. Sa ki enpòtan, apwòch sa a chwazi tou de sib sèvo ak peptid ki gen aktivite transpò atravè baryè serebrovaskilè a. Nou te itilize faj T7 akòz ti gwosè yo (~60 nm)10 epi nou te sijere ke yo apwopriye pou transpò vesikil ki pèmèt travèse transselilè baryè andotelyal ak/oswa epitelyal-medula a. Apre kat seri seleksyon, popilasyon faj yo te izole ki montre yon gwo anrichisman LCR in vivo ak yon asosyasyon mikwoveso serebral. Sa ki enpòtan, nou te kapab konfime rezilta nou yo lè nou demontre ke pi bon peptid kandida yo pi pito ak sentetize chimikman yo kapab transpòte kago pwoteyin nan likid serebrospinal la. Premyèman, efè farmakodinamik CNS yo te etabli lè yo te konbine yon peptid transpò dirijan ak yon inibitè peptid BACE1 la. Anplis demontre ke estrateji tès depistaj fonksyonèl in vivo ka idantifye nouvo peptid transpò nan sèvo kòm transpòtè kago pwoteyin efikas, nou espere apwòch seleksyon fonksyonèl menm jan an vin enpòtan tou nan idantifye nouvo chemen transpò nan sèvo.
Baze sou inite ki fòme plak (PFU), apre etap anbalaj faj la, yo te desine epi kreye yon bibliyotèk peptid faj T7 lineyè 12-mè o aza ak yon divèsite apeprè 109 (gade Materyèl ak Metòd). Li enpòtan pou note ke nou te analize bibliyotèk sa a ak anpil atansyon anvan panning in vivo. Anplifikasyon PCR echantiyon bibliyotèk faj yo lè l sèvi avèk amorseur modifye te pwodui amplikon ki te dirèkteman aplikab a HTS (Fig. Siplemantè 1a). Akòz a) erè sekans HTS11, b) enpak sou kalite amorseur (NNK)1-12 yo, ak c) prezans faj sovaj (wt) (fouye skelèt) nan bibliyotèk sibstiti a, yo te aplike yon pwosedi filtraj sekans pou ekstrè sèlman enfòmasyon sekans verifye (Fig. Siplemantè 1b). Etap filtraj sa yo aplike a tout bibliyotèk sekans HTS yo. Pou bibliyotèk estanda a, yo te jwenn yon total 233,868 lekti, pami yo 39% te pase kritè filtraj yo epi yo te itilize pou analiz ak seleksyon bibliyotèk pou tou ki vin apre yo (Figi Siplemantè 1c-e). Lekti yo te sitou miltip de 3 pè baz nan longè ak yon pik nan 36 nikleotid (Fig. Siplemantè 1c), sa ki konfime konsepsyon bibliyotèk la (NNK) 1-12. Li enpòtan pou note ke apeprè 11% nan manm bibliyotèk la te genyen yon insert PAGISRELVDKL 12 dimansyon tip sovaj (wt) kòm baz prensipal, epi prèske mwatye nan sekans yo (49%) te genyen insert oswa sipresyon. HTS bibliyotèk la te konfime gwo divèsite peptid ki nan bibliyotèk la: plis pase 81% nan sekans peptid yo te jwenn yon sèl fwa epi sèlman 1.5% te rive nan ≥4 kopi (Fig. Siplemantè 2a). Frekans asid amine (aa) nan tout 12 pozisyon yo nan repètwa a te byen korele ak frekans yo te espere pou kantite kodon ki te pwodui pa repètwa NKK dejenere a (Fig. Siplemantè 2b). Frekans rezidi aa yo ki te kode pa insert sa yo te byen korele ak frekans yo te kalkile a (r = 0.893) (Fig. Siplemantè 2c). Preparasyon bibliyotèk faj pou enjeksyon an gen ladan etap anplifikasyon ak retire andotoksin. Sa te deja montre ke li potansyèlman diminye divèsite bibliyotèk faj yo12,13. Se poutèt sa, nou te sekansye yon bibliyotèk faj anplifye sou plak ki te sibi retire andotoksin epi nou te konpare l ak bibliyotèk orijinal la pou estime frekans AA a. Yo te obsève yon korelasyon solid (r = 0.995) ant pisin orijinal la ak pisin anplifye ak pirifye a (Fig. Siplemantè 2d), ki endike ke konpetisyon ant klon anplifye sou plak lè l sèvi avèk faj T7 pa t lakòz gwo patipri. Konparezon sa a baze sou frekans motif tripeptid nan chak bibliyotèk, piske divèsite bibliyotèk yo (~109) pa ka kaptire nèt menm avèk HTS. Analiz frekans aa nan chak pozisyon te revele yon ti patipri depandan pozisyon nan twa dènye pozisyon repètwa ki te antre a (Fig. Siplemantè 2e). Pou konkli, nou te konkli ke kalite ak divèsite bibliyotèk la te akseptab epi se sèlman ti chanjman nan divèsite yo te obsève akòz anplifikasyon ak preparasyon bibliyotèk faj ant plizyè seri seleksyon.
Yo ka fè echantiyonaj likid sefalorakinyèl an seri lè yo enplante yon kanil chirijikalman nan machwè rat ki konsyan pou fasilite idantifikasyon faj T7 ki te enjekte entravenozman (iv) atravè BBB ak/oswa BCSFB (Fig. 1a-b). Nou te itilize de bra seleksyon endepandan (bra A ak B) nan twa premye tou seleksyon in vivo yo (Fig. 1c). Nou te ogmante sevè seleksyon an piti piti lè nou te diminye kantite total faj ki te entwodui nan twa premye tou seleksyon yo. Pou katriyèm tou seleksyon an, nou te konbine echantiyon ki soti nan branch A ak B epi nou te fè twa lòt seleksyon endepandan. Pou etidye pwopriyete in vivo patikil faj T7 yo nan modèl sa a, yo te enjekte faj tip sovaj (insert mèt PAGISRELVDKL) nan rat atravè venn ke a. Rekiperasyon faj yo nan likid sefalorakinyèl ak san nan diferan moman te montre ke faj ikosaedrik T7 relativman piti yo te gen yon faz eliminasyon inisyal rapid nan konpatiman san an (Fig. Siplemantè 3). Baze sou tit yo administre yo ak volim san rat yo, nou te kalkile ke se sèlman apeprè 1% nan pwa faj nan dòz yo administre a ki te detekte nan san an 10 minit apre enjeksyon entravenoz la. Apre premye bès rapid sa a, yo te mezire yon eliminasyon prensipal ki pi dousman ak yon mwatye lavi 27.7 minit. Sa ki enpòtan, se sèlman yon ti kantite faj ki te rekipere nan konpatiman LCR a, sa ki endike yon background ki ba pou migrasyon faj tip sovaj nan konpatiman LCR a (Fig. Siplemantè 3). An mwayèn, se sèlman apeprè 1 x 10-3% tit faj T7 nan san an ak 4 x 10-8% nan faj ki te enfuze okòmansman yo te detekte nan likid sefalorakinèl la pandan tout peryòd echantiyonaj la (0-250 min). Li enpòtan pou note ke mwatye lavi (25.7 min) faj tip sovaj nan likid sefalorakinèl la te sanble ak sa yo obsève nan san an. Done sa yo demontre ke baryè ki separe konpatiman LCR a ak san an rete entak nan rat ki gen kanil CM, sa ki pèmèt seleksyon in vivo bibliyotèk faj yo pou idantifye klon ki fasil pou transpòte soti nan san an nan konpatiman LCR a.
(a) Mete an plas yon metòd pou re-echantiyonaj likid sefalorakin (CSF) nan yon gwo pisin. (b) Dyagram ki montre kote selilè baryè sistèm nève santral la (CNS) ak estrateji seleksyon ki itilize pou idantifye peptid ki travèse baryè san-sèvo a (BBB) ​​ak baryè san-sèvo a. (c) Dyagram òganigram tès depistaj ekspozisyon faj in vivo. Nan chak wonn seleksyon, faj yo (idantifikatè bèt ki anndan flèch yo) te enjekte nan venn. De branch altènatif endepandan (A, B) yo kenbe separeman jiska 4yèm wonn seleksyon an. Pou wonn seleksyon 3 ak 4, chak klon faj ki te ekstrè nan CSF te sekansye manyèlman. (d) Sinetik faj izole nan san (sèk wouj) ak likid sefalorakin (triyang vèt) pandan premye wonn seleksyon an nan de rat kanile apre enjeksyon venn nan bibliyotèk peptid T7 la (2 x 1012 faj/bèt). Kare ble yo endike konsantrasyon inisyal mwayèn faj nan san an, kalkile apati kantite faj ki enjekte a, pran an kont volim total san an. Kare nwa yo endike pwen entèseksyon liy y la ekstrapole apati konsantrasyon faj nan san an. (e,f) Prezante frekans relatif ak distribisyon tout motif tripeptid ki sipèpoze posib yo jwenn nan peptid la. Yo montre kantite motif yo jwenn nan 1000 lekti yo. Motif ki rich an siyifikatif (p < 0.001) yo make ak pwen wouj. (e) Dyagram dispèsyon korelasyon ki konpare frekans relatif motif tripeptid bibliyotèk ki enjekte a ak faj ki sòti nan san nan bèt #1.1 ak #1.2. (f) Dyagram dispèsyon korelasyon ki konpare frekans relatif motif tripeptid faj bèt #1.1 ak #1.2 izole nan san ak likid sefalorakenyen. (g, h) Reprezantasyon ID sekans faj ki rich nan san (g) kont bibliyotèk ki enjekte yo ak faj ki rich nan LCR (h) kont san apre yon seri seleksyon in vivo nan tou de bèt yo. Gwosè kòd yon sèl lèt la endike konbyen fwa asid amine sa a parèt nan pozisyon sa a. Vèt = polè, mov = net, ble = bazik, wouj = asidik ak nwa = asid amine idrofob. Figi 1a, b te desine epi pwodui pa Eduard Urich.
Nou te enjekte yon bibliyotèk peptid faj nan de rat enstriman CM (klad A ak B) epi nou te izole faj nan likid sefalorak ak san (Figi 1d). Premye eliminasyon rapid bibliyotèk la te mwens pwononse konpare ak faj tip sovaj la. Mwatye lavi mwayèn bibliyotèk ki te enjekte a nan tou de bèt yo te 24.8 minit nan san, menm jan ak faj tip sovaj la, ak 38.5 minit nan likid sefalorak. Echantiyon faj san ak likid sefalorak ki soti nan chak bèt te sibi HTS epi tout peptid idantifye yo te analize pou prezans yon motif tripeptid kout. Motif tripeptid yo te chwazi paske yo bay yon baz minimòm pou fòmasyon estrikti ak entèraksyon peptid-pwoteyin14,15. Nou te jwenn yon bon korelasyon nan distribisyon motif ant bibliyotèk faj ki te enjekte a ak klon ki te ekstrè nan san tou de bèt yo (Fig. 1e). Done yo endike ke konpozisyon bibliyotèk la sèlman anrichi yon ti kras nan konpatiman san an. Frekans asid amine ak sekans konsansis yo te analize plis nan chak pozisyon lè l sèvi avèk yon adaptasyon lojisyèl Weblogo16 la. Sa ki enteresan, nou te jwenn yon gwo anrichisman nan rezidi glisin nan san (Fig. 1g). Lè yo te konpare san an ak klon yo te chwazi nan CSF a, yo te obsève yon gwo seleksyon ak kèk deseleksyon motif (Fig. 1f), epi sèten asid amine te prezan preferansyèlman nan pozisyon predetèmine nan 12 manm yo (Fig. 1h). Li enpòtan pou note ke chak bèt te diferan anpil nan likid sefalorakinèl la, alòske yo te obsève yon anrichisman glisin nan san nan tou de bèt yo (Fig. siplemantè 4a-j). Apre yon filtraj sekans done yo nan likid sefalorakinèl bèt #1.1 ak #1.2 yo, yo te jwenn yon total 964 ak 420 peptid 12-mè inik (Fig. siplemantè 1d-e). Klon faj izole yo te anplifye epi yo te sibi yon dezyèm tou seleksyon in vivo. Faj ki te ekstrè nan dezyèm tou seleksyon an te sibi HTS nan chak bèt epi tout peptid yo idantifye yo te itilize kòm done antre nan yon pwogram rekonesans motif pou analize ensidans motif tripeptid yo (Fig. 2a, b, ef). Konpare ak premye sik faj ki te rekipere nan CSF la, nou te obsève plis seleksyon ak dezeleksyon anpil motif nan CSF nan branch A ak B (Fig. 2). Yo te aplike yon algorithm idantifikasyon rezo pou detèmine si yo te reprezante diferan modèl sekans konsistan. Yo te obsève yon resanblans klè ant sekans 12-dimansyonèl yo ke CSF te rekipere nan klad altènatif A (Fig. 2c, d) ak klad B (Fig. 2g, h). Analiz gwoupe a nan chak branch te revele diferan pwofil seleksyon pou peptid 12-mè yo (Fig. siplemantè 5c, d) ak yon ogmantasyon nan rapò tit CSF/san an sou tan pou klon gwoupe yo apre dezyèm tou seleksyon an konpare ak premye tou seleksyon an (Fig. siplemantè 5e).
Anrichisman motif ak peptid nan likid sefalorakinèl pa de seri seleksyon ekspozisyon faj fonksyonèl in vivo youn apre lòt.
Tout faj likid sefalorakadyen yo te rekipere nan premye tou chak bèt (bèt #1.1 ak #1.2) yo te rasanble, anplifye, sekansye HT epi reenjekte ansanm (2 x 1010 faj/bèt) 2 rat kanile SM (#1.1 → #). 2.1 ak 2.2, 1.2 → 2.3 ak 2.4). (a,b,e,f) Dyagram dispèsyon korelasyon ki konpare frekans relatif motif tripeptid tout faj ki sòti nan CSF nan premye ak dezyèm tou seleksyon yo. Frekans relatif ak distribisyon motif ki reprezante tout tripeptid sipèpoze posib yo jwenn nan peptid nan tou de oryantasyon yo. Yo montre kantite motif yo te jwenn nan 1000 lekti yo. Motif ki te chwazi oswa eskli yon fason siyifikatif (p < 0.001) nan youn nan bibliyotèk konpare yo make ak pwen wouj. (c, d, g, h) Reprezantasyon logo sekans tout sekans long 12 asid amine ki rich an CSF ki baze sou wonn 2 ak 1 seleksyon in vivo. Gwosè kòd yon sèl lèt la endike konbyen fwa asid amine sa a parèt nan pozisyon sa a. Pou reprezante logo a, yo konpare frekans sekans CSF yo ekstrè nan chak bèt ant de wonn seleksyon epi yo montre sekans anrichi yo nan dezyèm wonn nan: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ak (h) #1.2–#2.4. Asid amine ki pi anrichi yo nan yon pozisyon bay nan (c, d) bèt nimewo 2.1 ak nimewo 2.2 oswa (g, h) nan bèt nimewo 2.3 ak nimewo 2.4 yo montre an koulè. Vèt = polè, koulè wouj violèt = net, ble = bazik, wouj = asid ak nwa = asid amine idrofob.
Apre twazyèm tou seleksyon an, nou te idantifye 124 sekans peptid inik (#3.1 ak #3.2) ki soti nan 332 klon faj rekonstitye ak CSF ki te izole nan de bèt (Fig. Siplemantè 6a). Sekans LGSVS (18.7%) te gen pi gwo pwopòsyon relatif la, ki te swiv pa insert tip sovaj PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), ak SARGSWREIVSLS (2.2%). Nan katriyèm tou final la, nou te rasanble de branch chwazi endepandamman nan twa bèt separe (Fig. 1c). Nan 925 klon faj sekansye yo ki te rekipere nan CSF, nan katriyèm tou a nou te jwenn 64 sekans peptid inik (Fig. Siplemantè 6b), pami yo pwopòsyon relatif faj tip sovaj la te desann a 0.8%. Klon CSF ki pi komen nan katriyèm tou an se te LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) ak RLSSVDSDLSGC (3.2%). ) Longè peptid yo chwazi yo se akòz ensèsyon/sipresyon nikleyotid oswa kodon arè twò bonè nan amòs bibliyotèk yo lè w ap itilize kodon dejenere pou konsepsyon bibliyotèk NNK. Kodon arè twò bonè yo pwodui peptid ki pi kout epi yo chwazi paske yo genyen motif aa favorab la. Peptid ki pi long yo ka soti nan ensèsyon/sipresyon nan amòs bibliyotèk sentetik yo. Sa a pozisyone kodon arè ki te fèt la deyò kad la epi li li jiskaske yon nouvo kodon arè parèt an aval. An jeneral, nou te kalkile faktè anrichisman pou tout kat tou seleksyon yo lè nou konpare done antre yo ak done sòti echantiyon an. Pou premye tou tès depistaj la, nou te itilize tit faj tip sovaj kòm yon referans background ki pa espesifik. Sa ki enteresan, seleksyon faj negatif la te trè fò nan premye sik LCR a, men pa nan san an (Fig. 3a), sa ki ka akòz pwobabilite ki ba pou difizyon pasif pifò manm bibliyotèk peptid la nan konpatiman LCR a oswa faj relatif yo gen tandans pou yo rete oswa retire pi efikasman nan san an pase bakteriofaj yo. Sepandan, nan dezyèm tou seleksyon an, yo te obsève yon seleksyon fò faj nan LCR nan tou de klad yo, sa ki sijere ke tou anvan an te anrichi nan faj ki montre peptid ki ankouraje absòpsyon LCR (Fig. 3a). Yon fwa ankò, san anrichisman san siyifikatif. Epitou nan twazyèm ak katriyèm tou yo, klon faj yo te anrichi anpil nan LCR. Lè nou konpare frekans relatif chak sekans peptid inik ant de dènye tou seleksyon yo, nou te jwenn ke sekans yo te menm plis anrichi nan katriyèm tou seleksyon an (Fig. 3b). Yo te ekstrè yon total 931 motif tripeptid nan tout 64 sekans peptid inik yo lè l sèvi avèk tou de oryantasyon peptid yo. Yo te egzamine motif ki te pi rich yo nan katriyèm tou an pi byen pou pwofil anrichisman yo atravè tout tou yo konpare ak bibliyotèk ki te enjekte a (limit: 10% anrichisman) (Fig. Siplemantè 6c). Modèl jeneral seleksyon yo te montre ke pifò nan motif etidye yo te rich nan tout tou anvan yo nan tou de branch seleksyon yo. Sepandan, gen kèk motif (pa egzanp SGL, VSG, LGS GSV) ki te soti prensipalman nan klad altènatif A, pandan ke lòt (pa egzanp FGW, RTN, WGF, NTR) te rich nan klad altènatif B.
Validasyon transpò CSF nan peptid ki prezante ak faj ki rich ak CSF ak peptid lidè biotinile konjige ak chaj streptavidin.
(a) Rapò anrichisman yo kalkile nan tout kat tou yo (R1-R4) ki baze sou tit faj (PFU) ki enjekte (antre = I) ak tit faj LCR detèmine (rezilta = O). Faktè anrichisman pou twa dènye tou yo (R2-R4) te kalkile an konparezon ak tou anvan an ak premye tou an (R1) ak done pwa. Ba ouvè yo se likid sefalorakrenyen, ba ki gen koulè yo se plasma. (***p<0.001, ki baze sou tès t Student la). (b) Lis peptid faj ki pi abondan yo, klase selon pwopòsyon relatif yo ak tout faj ki kolekte nan LCR apre tou 4 nan seleksyon an. Sis klon faj ki pi komen yo make an koulè, nimewote ak faktè anrichisman yo ant tou 3 ak 4 nan seleksyon an (ankadreman). (c,d) Sis klon faj ki pi rich yo, faj vid yo ak bibliyotèk peptid faj paran yo nan tou 4 te analize endividyèlman nan yon modèl echantiyonaj LCR. Yo te kolekte echantiyon LCR ak san nan moman yo te endike yo. (c) Kantite egal 6 klon faj kandida (2 x 1010 faj/bèt), faj vid (#1779) (2 x 1010 faj/bèt) ak bibliyotèk peptid faj stock (2 x 1012 faj/bèt). Enjekte omwen 3 CM epi administre bay bèt ki kanile a separeman atravè venn ke a. Yo montre farmakokinetik LCR pou chak klon faj ak bibliyotèk peptid faj ki enjekte sou tan. (d) montre rapò mwayèn LCR/san pou tout faj/mL refè sou tan echantiyon an. (e) Kat peptid lidè sentetik ak yon kontwòl melanje te lye ak biotin ak streptavidin atravè N-tèminal yo (ekspozisyon tetramè) epi apre sa yo te enjekte (venn ke iv, 10 mg streptavidin/kg). Omwen twa rat entube (N = 3). ). Yo te kolekte echantiyon LCR nan moman yo te endike yo epi yo te mezire konsantrasyon streptavidin yo pa ELISA anti-streptavidin LCR (nd = pa detekte). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ki baze sou tès ANOVA). (f) Konparezon sekans asid amine klon peptid faj ki pi rich la #2002 (vyolèt) ak lòt klon peptid faj ki te chwazi nan 4yèm tou seleksyon an. Fragman asid amine idantik ak sanblab yo make ak koulè.
Nan tout faj anrichi nan katriyèm tou an (Fig. 3b), yo te chwazi sis klon kandida pou plis analiz endividyèl nan modèl echantiyonaj CSF la. Yo te enjekte menm kantite sis faj kandida, faj vid (pa gen insert) ak bibliyotèk peptid profaj nan twa bèt CM kanile, epi yo te detèmine farmakokinetik nan tès CSF (Fig. 3c) ak san (Fig. Siplemantè 7). Tout klon faj yo te teste yo te vize konpatiman CSF la nan yon nivo 10-1000 fwa pi wo pase sa ki nan faj kontwòl vid la (#1779). Pa egzanp, klon #2020 ak #2077 yo te gen tit CSF anviwon 1000 fwa pi wo pase faj kontwòl la. Pwofil farmakokinetik chak peptid chwazi a diferan, men yo tout gen yon kapasite CSF ki wo pou retounen lakay yo. Nou obsève yon diminisyon konstan sou tan pou klon #1903 ak #2011 yo, alòske pou klon #2077, #2002 ak #2009 yon ogmantasyon pandan premye 10 minit yo ta ka endike transpò aktif men li bezwen verifye. Klon #2020, #2002, ak #2077 yo te estabilize nan nivo ki wo, alòske konsantrasyon CSF klon #2009 la te diminye dousman apre ogmantasyon inisyal la. Apre sa, nou te konpare frekans relatif chak kandida CSF ak konsantrasyon san li (Fig. 3d). Korelasyon tit mwayèn chak kandida CSF ak tit san li nan tout moman echantiyonaj yo te montre ke twa nan sis kandida yo te anrichi anpil nan CSF nan san. Sa ki enteresan, klon #2077 la te montre yon pi gwo estabilite san (Figi Siplemantè 7). Pou konfime ke peptid yo tèt yo kapab transpòte aktivman kago lòt pase patikil faj nan konpatiman CSF la, nou te sentetize kat peptid lidè ki te derive ak byotin nan N-tèminal la kote peptid yo tache ak patikil faj la. Peptid byotinile (no 2002, 2009, 2020 ak 2077) te konjige avèk streptavidin (SA) pou jwenn fòm miltimerik ki imite yon ti jan jeyometri faj la. Fòma sa a te pèmèt nou tou mezire ekspozisyon SA nan san ak likid sefaloraken kòm peptid pwoteyin ki transpòte kago. Sa ki enpòtan, done faj yo te kapab souvan repwodui lè peptid sentetik yo te administre nan fòma SA-konjige sa a (Fig. 3e). Peptid melanje yo te gen mwens ekspozisyon inisyal ak yon eliminasyon CSF pi rapid ak nivo ki pa detektab nan 48 èdtan. Pou nou te ka konprann chemen livrezon klon faj peptid sa yo nan espas CSF la, nou te analize lokalizasyon chak peptid faj lè nou te itilize imunoistochimi (IHC) pou detekte patikil faj yo dirèkteman 1 èdtan apre enjeksyon entravenoz in vivo. Li enpòtan pou note ke klon #2002, #2077, ak #2009 yo te kapab detekte grasa yon gwo koloran nan kapilè nan sèvo a, alòske faj kontwòl la (#1779) ak klon #2020 pa te detekte (Figi Siplemantè 8). Sa sijere ke peptid sa yo kontribye nan efè a sou sèvo a jisteman lè yo travèse BBB a. Li nesesè pou fè plis analiz detaye pou teste ipotèz sa a, paske wout BSCFB a ka enplike tou. Lè nou konpare sekans asid amine klon ki pi rich la (#2002) ak lòt peptid yo chwazi, nou te note ke kèk nan yo gen ekstansyon asid amine menm jan an, sa ki ka endike yon mekanis transpò menm jan an (Fig. 3f).
Akòz pwofil plasma inik li ak ogmantasyon siyifikatif li nan CSF sou tan, klon ekspozisyon faj #2077 la te eksplore plis sou yon peryòd 48 èdtan ki pi long epi li te kapab repwodui ogmantasyon rapid nan CSF ki obsève an asosyasyon avèk nivo SA soutni (Fig. 4a). Konsènan lòt klon faj idantifye yo, #2077 te kolore fòtman pou kapilè nan sèvo epi li te montre yon kolokalizasyon siyifikatif ak lektin makè kapilè lè yo gade l nan yon rezolisyon ki pi wo e petèt kèk kolorasyon nan espas parenchimal la (Figi 4b). Pou envestige si efè famakolojik medyatè peptid yo te ka jwenn nan CNS la, nou te fè yon eksperyans kote vèsyon biotinile nan i) peptid tranzit #2077 la ak ii) peptid inibitè BACE1 la te melanje ak SA nan de rapò diferan. Pou yon konbinezon nou te itilize sèlman inibitè peptid BACE1 la epi pou lòt la nou te itilize yon rapò 1:3 nan inibitè peptid BACE1 ak peptid #2077. Yo te administre toulede echantiyon yo pa venn epi yo te mezire nivo beta-amiloyid peptid 40 (Abeta40) nan san ak likid sefalorakèn sou tan. Yo te mezire Abeta40 nan likid sefalorakèn-rachidyen an (LCR) paske li reflete inibisyon BACE1 nan parenchim sèvo a. Jan yo te prevwa a, toulede konplèks yo te redwi nivo Abeta40 nan san an yon fason siyifikatif (Fig. 4c, d). Sepandan, se sèlman echantiyon ki gen yon melanj peptid nimewo 2077 ak yon inibitè peptid BACE1 konjige ak SA ki te lakòz yon diminisyon siyifikatif nan Abeta40 nan likid sefalorakèn nan (Fig. 4c). Done yo montre ke peptid nimewo 2077 la kapab transpòte pwoteyin SA 60 kDa a nan sistèm nève santral la epi li pwovoke tou efè famakolojik ak inibitè peptid BACE1 konjige ak SA.
(a) Enjeksyon klonal (2 × 10 faj/animal) faj T7 ki montre pwofil farmakokinetik alontèm peptid CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) ak faj kontwòl ki pa enjekte (#1779) nan omwen twa rat ki te entube ak CM. (b) Imaj mikwoskopik konfokal mikwoveso kortikal reprezantatif nan rat ki te enjekte ak faj (2 × 10 10 faj/animal) ki montre kont-kolorasyon peptid #2077 ak veso yo (lektin). Yo te administre klon faj sa yo bay 3 rat epi yo te kite yo sikile pandan 1 èdtan anvan pèfizyon. Yo te koupe sèvo yo epi yo te kolore yo ak antikò poliklonal make ak FITC kont kapsid faj T7 la. Dis minit anvan pèfizyon an ak fiksasyon ki vin apre a, yo te administre lektin make ak DyLight594 nan venn. Imaj fliyoresan ki montre koloran lektin (wouj) bò luminal mikwoveso yo ak faj yo (vèt) nan lumen kapilè yo ak tisi perivaskilè nan sèvo. Ba echèl la koresponn ak 10 µm. (c, d) Peptid inibitè BACE1 biotinile a, poukont li oswa an konbinezon ak peptid tranzit biotinile #2077 la, te makonnen ak streptavidin, epi apre sa, yo te enjekte omwen twa rat CM kanile pa venn (10 mg streptavidin/kg). Rediksyon Aβ40 ki te medyatè pa inibitè peptid BACE1 la te mezire pa ELISA Aβ1-40 nan san (wouj) ak likid sefaloraken (zoranj) nan pwen tan ki endike yo. Pou pi bon klarite, yo trase yon liy pwentiye sou graf la nan yon echèl 100%. (c) Pousantaj rediksyon nan Aβ40 nan san (triyang wouj) ak likid sefalorakin (triyang zoranj) nan rat trete ak streptavidin konjige ak peptid tranzit #2077 ak peptid inibitè BACE1 nan yon rapò 3:1. (d) Pousantaj rediksyon nan san Aβ40 (sèk wouj) ak likid sefalorakin (sèk zoranj) nan rat trete ak streptavidin makonnen ak yon peptid inibitè BACE1 sèlman. Konsantrasyon Aβ nan kontwòl la te 420 pg/ml (devyasyon estanda = 101 pg/ml).
Yo te aplike avèk siksè ekspozisyon faj nan plizyè domèn rechèch byomedikal17. Yo te itilize metòd sa a pou etid divèsite vaskilè in vivo18,19 ansanm ak etid ki vize veso serebral yo20,21,22,23,24,25,26. Nan etid sa a, nou te pwolonje aplikasyon metòd seleksyon sa a non sèlman pou idantifikasyon dirèk peptid ki vize veso serebral yo, men tou pou dekouvèt kandida ki gen pwopriyete transpò aktif pou travèse baryè san-sèvo a. Kounye a, nou dekri devlopman yon pwosedi seleksyon in vivo nan rat ki te entube nan CM epi nou demontre potansyèl li pou idantifye peptid ki gen pwopriyete lakay CSF. Lè nou itilize faj T7 ki montre yon bibliyotèk peptid o aza 12-mer, nou te kapab demontre ke faj T7 la ase piti (apeprè 60 nm an dyamèt)10 pou l adapte ak baryè san-sèvo a, kidonk li travèse dirèkteman baryè san-sèvo a oswa pleksis koroyid la. Nou te obsève ke rekòlte LCR nan rat CM kanile se te yon metòd tès depistaj fonksyonèl in vivo byen kontwole, epi ke faj ki te ekstrè a pa sèlman lye ak vaskilati a, men li te fonksyone tou kòm yon transpòtè atravè baryè san-sèvo a. Anplis de sa, lè nou te kolekte san an menm tan epi nou te aplike HTS nan LCR ak faj ki sòti nan san, nou te konfime ke chwa LCR nou an pa te enfliyanse pa anrichisman san oswa kapasite pou ekspansyon ant wonn seleksyon yo. Sepandan, konpatiman san an fè pati pwosedi seleksyon an, piske faj ki kapab rive nan konpatiman LCR a dwe siviv epi sikile nan san an ase lontan pou anrichi tèt yo nan sèvo a. Pou nou te kapab ekstrè enfòmasyon sekans serye nan done HTS brit yo, nou te aplike filtè adapte ak erè sekans espesifik platfòm nan workflow analiz la. Lè nou te enkòpore paramèt sinetik nan metòd tès depistaj la, nou te konfime farmakokinetik rapid faj T7 tip sovaj yo (t½ ~ 28 min) nan san24, 27, 28 epi nou te detèmine tou mwatye lavi yo nan likid sefalorakinèl (t½ ~ 26 min) pa minit). Malgre pwofil farmakokinetik ki sanble nan san ak likid sefalo-rachidyen (LSR), se sèlman 0.001% nan konsantrasyon faj nan san an ki te ka detekte nan LSR, sa ki endike yon mobilite background ki ba nan faj T7 tip sovaj atravè baryè san-sèvo a. Travay sa a mete aksan sou enpòtans premye tou seleksyon an lè w ap itilize estrateji seleksyon in vivo, espesyalman pou sistèm faj ki elimine rapidman nan sikilasyon an, paske se kèk klon ki kapab rive nan konpatiman sistèm nève santral la. Kidonk, nan premye tou an, rediksyon nan divèsite bibliyotèk la te trè gwo, paske se sèlman yon kantite limite klon ki te finalman kolekte nan modèl LSR trè strik sa a. Estrateji seleksyon in vivo sa a te gen ladan plizyè etap seleksyon tankou akimilasyon aktif nan konpatiman LSR a, siviv klon nan konpatiman san an, ak retire rapid klon faj T7 yo nan san an nan premye 10 minit yo (Fig. 1d ak Fig. Siplemantè 4M). Kidonk, apre premye tou an, yo te idantifye diferan klon faj nan LSR, byenke yo te itilize menm pisin inisyal la pou chak bèt. Sa sijere ke plizyè etap seleksyon strik pou bibliyotèk sous ki gen yon gwo kantite manm bibliyotèk lakòz yon rediksyon siyifikatif nan divèsite. Se poutèt sa, evènman o aza yo pral vin yon pati entegral nan pwosesis seleksyon inisyal la, sa ki pral enfliyanse rezilta a anpil. Li pwobab ke anpil nan klon yo nan bibliyotèk orijinal la te gen yon tandans anrichisman CSF ki sanble anpil. Sepandan, menm nan menm kondisyon eksperimantal yo, rezilta seleksyon yo ka diferan akòz ti kantite chak klon patikilye nan pisin inisyal la.
Motif ki rich nan likid sefalo-rachidyen (LCR) yo diferan de sa ki nan san an. Sa ki enteresan, nou te note premye chanjman an nan direksyon peptid ki rich an glisin nan san bèt endividyèl yo. (Fig. 1g, Fig. Siplemantè 4e, 4f). Faj ki gen peptid glisin yo ka pi estab epi mwens chans pou yo retire yo nan sikilasyon an. Sepandan, peptid ki rich an glisin sa yo pa te detekte nan echantiyon likid sefalo-rachidyen yo, sa ki sijere ke bibliyotèk ki te òganize yo te pase nan de etap seleksyon diferan: youn nan san an ak yon lòt ki te kite akimile nan likid sefalo-rachidyen an. Klon ki rich an LCR ki soti nan katriyèm tou seleksyon an te sibi tès an pwofondè. Prèske tout klon ki te teste endividyèlman yo te konfime ke yo te rich nan LCR konpare ak faj kontwòl vid la. Yo te egzamine yon peptid ki te jwenn (#2077) an plis detay. Li te montre yon mwatye lavi plasma ki pi long konpare ak lòt rezilta yo (Figi 3d ak Figi Siplemantè 7), epi sa ki enteresan, peptid sa a te genyen yon rezidi sistin nan C-tèminal la. Dènyèman, yo montre ke adisyon sistin nan peptid yo ka amelyore pwopriyete farmakokinetik yo lè yo mare ak albumin 29. Sa a poko konnen kounye a pou peptid #2077 la epi li mande plis etid. Gen kèk peptid ki te montre yon depandans valans nan anrichisman CSF (done yo pa montre), ki ka gen rapò ak jeyometri sifas kapsid T7 la ki parèt. Sistèm T7 nou te itilize a te montre 5-15 kopi chak peptid pou chak patikil faj. IHC te fèt sou klon faj kandida prensipal yo te enjekte entravenezman nan kòtèks serebral rat yo (Figi siplemantè 8). Done yo te montre ke omwen twa klon (No 2002, No 2009 ak No 2077) te kominike avèk BBB a. Li rete pou detèmine si entèraksyon BBB sa a lakòz akimilasyon CSF oswa mouvman klon sa yo dirèkteman nan BCSFB a. Sa ki enpòtan, nou montre ke peptid yo chwazi yo kenbe kapasite transpò CSF yo lè yo sentetize epi mare ak kago pwoteyin lan. Lyezon peptid biotinile N-terminal yo ak SA esansyèlman repete rezilta yo jwenn ak klon faj respektif yo nan san ak likid sefalorakinèl (Fig. 3e). Finalman, nou montre ke peptid prensipal #2077 la kapab ankouraje aksyon nan sèvo yon inibitè peptid biotinile BACE1 konjige ak SA, sa ki lakòz efè farmakodinamik pwononse nan CNS la lè li diminye anpil nivo Abeta40 nan CSF (Fig. 4). Nou pa t kapab idantifye okenn omolog nan baz done a lè nou te fè yon rechèch omoloji sekans peptid pou tout rezilta yo. Li enpòtan pou note ke gwosè bibliyotèk T7 la se apeprè 109, alòske gwosè bibliyotèk teyorik la pou 12-mè yo se 4 x 1015. Se poutèt sa, nou te sèlman chwazi yon ti fraksyon nan espas divèsite bibliyotèk peptid 12-mè a, ki ka vle di ke nou ka idantifye peptid ki pi optimize lè nou evalye espas sekans adjasan rezilta sa yo idantifye. Ipotetikman, youn nan rezon ki fè nou pa jwenn okenn omolog natirèl nan peptid sa yo ta ka deseleksyon pandan evolisyon pou anpeche antre san kontwòl sèten motif peptid nan sèvo a.
Ansanm, rezilta nou yo bay yon baz pou travay nan lavni pou idantifye ak karakterize sistèm transpò baryè serebrovaskilè a in vivo an plis detay. Konfigirasyon debaz metòd sa a baze sou yon estrateji seleksyon fonksyonèl ki pa sèlman idantifye klon ki gen pwopriyete lyezon vaskilè serebral, men ki gen ladan tou yon etap kritik kote klon ki reyisi yo gen aktivite intrinsèque pou travèse baryè byolojik in vivo nan konpatiman CNS la. Objektif la se klarifye mekanis transpò peptid sa yo ak preferans yo pou lyezon ak mikwovaskilati espesifik nan rejyon sèvo a. Sa ka mennen nan dekouvèt nouvo chemen pou transpò BBB a ak reseptè yo. Nou espere ke peptid yo idantifye yo ka lye dirèkteman ak reseptè serebrovaskilè yo oswa ak ligand sikile ki transpòte nan BBB a oswa BCSFB a. Vektè peptid ki gen aktivite transpò CSF yo dekouvri nan travay sa a pral plis envestige. Kounye a, n ap envestige espesifikite sèvo peptid sa yo pou kapasite yo pou travèse BBB a ak/oswa BCSFB a. Nouvo peptid sa yo pral zouti ki gen anpil valè pou dekouvèt potansyèl nouvo reseptè oswa chemen epi pou devlopman nouvo platfòm trè efikas pou livrezon makromolekil, tankou pwodui byolojik, nan sèvo a.
Kanile gwo sistèn nan (CM) lè l sèvi avèk yon modifikasyon nan metòd ki te dekri deja a. Yo te monte rat Wistar anestezi (200-350 g) sou yon aparèy estereyotaksik epi yo te fè yon ensizyon medyàn sou po tèt la ki te raze epi ki te prepare aseptikman pou ekspoze zo bwa tèt la. Yo te fè de twou nan zòn sentiwon anwo a epi yo te sere vis fiksasyon yo nan twou yo. Yo te fè yon lòt twou nan krèt oksipital lateral la pou gide estereyotaksik yon kanil asye pur nan CM a. Yo te aplike siman dantè alantou kanil la epi sere l ak vis. Apre foto-gerisman ak siman an te fin redi, yo te fèmen blesi po a ak yon sutur supramid 4/0. Yo te konfime bon plasman kanil la pa flit espontane likid sefaloraksèn (LSR). Retire rat la nan aparèy estereyotaksik la, resevwa swen postoperatwa ak jesyon doulè ki apwopriye, epi kite l refè pou omwen yon semèn jiskaske yo obsève siy san nan likid sefaloraksèn an. Yo te jwenn rat Wistar (Crl:WI/Han) nan Charles River (Frans). Yo te kenbe tout rat yo nan kondisyon espesifik san patojèn. Tout eksperyans sou bèt yo te apwouve pa Biwo Veterinè Vil Basel, Swis, epi yo te fèt an akò ak Lisans Animal No 2474 (Evalyasyon Transpò Aktif nan Sèvo a pa Mezire Nivo Kandida Terapetik nan Likid Sefalorakin ak Sèvo Rat).
Dousman kenbe rat la konsyan avèk kanil CM a nan men l. Retire Datura a nan kanil la epi kolekte 10 µl likid sefalorakèn ki koule espontaneman. Piske ouvèti kanil la te finalman konpwomèt, se sèlman echantiyon likid sefalorakèn klè ki pa gen okenn prèv kontaminasyon san oswa dekolorasyon yo te enkli nan etid sa a. An paralèl, apeprè 10-20 μl san te pran nan yon ti ensizyon nan pwent ke a nan tib ki gen eparin (Sigma-Aldrich). CSF ak san te kolekte nan divès moman apre enjeksyon venn faj T7 la. Apeprè 5-10 μl likid te jete anvan yo te kolekte chak echantiyon CSF, ki koresponn ak volim mò katetè a.
Yo te pwodui bibliyotèk yo lè l sèvi avèk vektè T7Select 10-3b la jan sa dekri nan manyèl sistèm T7Select la (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). An brèf, yo te sentetize yon insert ADN 12-mer o aza nan fòma sa a:
Yo te itilize kodon NNK a pou evite doub kodon stop ak surekspresyon asid amine nan insert la. N se yon rapò ekimolè melanje manyèlman pou chak nikleotid, epi K se yon rapò ekimolè melanje manyèlman pou nikleotid adenin ak sitozin. Rejyon yon sèl branch yo te konvèti an ADN doub branch pa plis enkubasyon ak dNTP (Novagen) ak anzim Klenow (New England Biolabs) nan tanpon Klenow (New England Biolabs) pandan 3 èdtan a 37°C. Apre reyaksyon an, yo te refè ADN doub branch lan pa presipitasyon EtOH. ADN ki te sòti a te dijere ak anzim restriksyon EcoRI ak HindIII (toulede soti nan Roche). Insert ki te fann epi pirifye (QIAquick, Qiagen) (ligaz T4, New England Biolabs) te lye nan kad la nan yon vektè T7 pre-fann apre asid amine 348 nan jèn kapsid 10B la. Reyaksyon ligasyon yo te enkube a 16°C pandan 18 èdtan anvan anbalaj in vitro. Anbalaj faj in vitro a te fèt dapre enstriksyon ki te vini ak twous klonaj T7Select 10-3b la (Novagen) epi solisyon anbalaj la te anplifye yon fwa jiska liz lè l sèvi avèk Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Liza yo te santrifije, titre epi konjele a -80° C kòm yon solisyon stock gliseròl.
Anplifikasyon PCR dirèk rejyon varyab faj yo anplifye nan bouyon oswa plak lè l sèvi avèk amorseur fizyon propriétaires 454/Roche-amplicon. Amorseur fizyon pou pi devan an gen sekans ki flanke rejyon varyab la (NNK) 12 (espesifik pou modèl), Adaptè Titanium GS FLX A, ak yon sekans kle bibliyotèk kat baz (TCAG) (Figi Siplemantè 1a):
Primè fizyon envès la genyen tou biotin ki tache ak pèl kaptire yo ak Adaptè B Titanium GS FLX ki nesesè pou anplifikasyon klonal pandan PCR emilsyon an:
Apre sa, anplikon yo te sibi pirosekansman 454/Roche dapre pwotokòl 454 GS-FLX Titanium lan. Pou sekansman Sanger manyèl (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), ADN faj T7 la te anplifye pa PCR epi sekansye ak pè amorseur sa yo:
Yo te sibi anplifikasyon PCR nan insert ki soti nan plak endividyèl yo lè l sèvi avèk Roche Fast Start DNA Polymerase Kit la (dapre enstriksyon manifakti a). Fè yon demaraj a cho (10 min a 95 °C) ak 35 sik boost (50 s a 95 °C, 1 min a 50 °C, ak 1 min a 72 °C).
Faj ki soti nan bibliyotèk yo, faj tip sovaj la, faj ki te sove nan likid sekretè likid (LCR) ak san an, oswa klon endividyèl yo te anplifye nan Escherichia coli BL5615 nan bouyon TB (Sigma Aldrich) oswa nan asyèt 500 cm2 (Thermo Scientific) pandan 4 èdtan a 37°C. Yo te ekstrè faj yo nan plak yo lè yo rense plak yo ak yon solisyon tampon Tris-EDTA (Fluka Analytical) oswa lè yo kolekte plak yo ak pwent pipèt esteril. Yo te izole faj yo nan sipènatant kilti a oswa nan solisyon tampon ekstraksyon an ak yon sèl seri presipitasyon poliglikòl etilèn (PEG 8000) (Promega) epi yo te resispann yo nan solisyon tampon Tris-EDTA.
Yo te sibi 2-3 seri retire andotoksin faj ki te anplifye a avèk pèl retire andotoksin (Miltenyi Biotec) anvan yo te ba li enjeksyon venn (IV) (500 μl/animal). Nan premye seri a, yo te entwodui 2×1012 faj; nan dezyèm lan, 2×1010 faj; nan twazyèm ak katriyèm seri seleksyon yo, 2×109 faj pou chak animal. Yo te detèmine kontni faj nan echantiyon LCR ak san yo te kolekte nan moman yo te endike yo pa kontaj plak dapre enstriksyon manifakti a (manyèl sistèm T7Select). Yo te fè seleksyon faj la pa enjeksyon venn bibliyotèk pirifye nan venn ke a oswa pa re-enjeksyon faj ki te ekstrè nan LCR nan seri seleksyon anvan an, epi yo te fè rekòt ki vin apre yo nan 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, ak 240 min respektivman pou echantiyon LCR ak san. Yo te fè yon total kat seri seleksyon in vivo kote yo te estoke epi analize de branch yo te chwazi yo separeman pandan twa premye seri seleksyon yo. Tout insert faj yo te ekstrè nan CSF nan de premye seri seleksyon yo te sibi pirosekansman 454/Roche, alòske tout klon yo te ekstrè nan CSF nan de dènye seri seleksyon yo te sekansye manyèlman. Tout faj san yo nan premye seri seleksyon an te sibi tou pirosekansman 454/Roche. Pou enjeksyon klon faj yo, faj yo te chwazi yo te anplifye nan E. coli (BL5615) sou plak 500 cm2 a 37°C pandan 4 èdtan. Klon yo te chwazi endividyèlman epi sekansye manyèlman yo te miltipliye nan medyòm TB. Apre ekstraksyon faj, pirifikasyon ak retire andotoksin (jan sa dekri pi wo a), yo te enjekte 2×1010 faj/animal nan 300 μl nan yon venn ke.
Pretretman ak filtraj kalitatif done sekans yo. Done 454/Roche kri yo te konvèti soti nan yon fòma kat jeyografik binè estanda (sff) nan yon fòma Pearson lizib pa moun (fasta) lè l sèvi avèk lojisyèl vandè a. Plis tretman sekans nikleotid la te fèt lè l sèvi avèk pwogram ak script C propriétaires (pakè lojisyèl ki pa pibliye) jan sa dekri anba a. Analiz done prensipal yo gen ladan pwosedi filtraj milti-etap strik. Pou filtre lekti ki pa t genyen yon sekans ADN insert 12mer valab, lekti yo te aliyen sekansyèlman ak etikèt kòmansman (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), etikèt arè (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ak insert background (CCCTGCAGGGATATCCCCGGGAGCTCGTCGAC) lè l sèvi avèk tès Needleman-Wunsch mondyal la. Aliyman ki pèmèt jiska 2 enkonsistans pou chak aliyman31. Se poutèt sa, lekti san etikèt kòmansman ak arè ak lekti ki genyen insert background, sa vle di, aliyman ki depase kantite matche ki otorize yo, yo te retire nan bibliyotèk la. Pou lekti ki rete yo, sekans ADN N-mer ki soti nan mak kòmansman an epi ki fini anvan mak arè a te retire nan sekans lekti orijinal la epi trete li pi lwen (apre sa yo rele "insert"). Apre tradiksyon insert la, pòsyon ki apre premye kodon arè a nan fen 5′ amorseur a te retire nan insert la. Anplis de sa, nikleotid ki mennen nan kodon enkonplè nan fen 3′ amorseur a te retire tou. Pou eskli insert ki gen sèlman sekans background, insert tradui ki kòmanse ak modèl asid amine "PAG" la te retire tou. Peptid ki gen yon longè pòs-tradiksyon mwens pase 3 asid amine yo te retire nan bibliyotèk la. Finalman, retire redondans nan pisin insert la epi detèmine frekans chak insert inik. Rezilta analiz sa a te gen ladan yon lis sekans nikleotid (inserts) ak frekans (lekti) yo (Figi Siplemantè 1c ak 2).
Gwoupe insert ADN N-mer yo pa resanblans sekans: Pou elimine erè sekans espesifik 454/Roche (tankou pwoblèm ak sekans ekstansyon omopolimè) epi retire redondans ki mwens enpòtan yo, insert sekans ADN N-mer ki te filtre anvan yo klase pa resanblans. insert (jiska 2 baz ki pa matche pèmèt) lè l sèvi avèk yon algorithm iteratif defini jan sa a: insert yo klase an premye pa frekans yo (pi wo a pi ba), epi si yo menm, pa dezyèm klasman yo pa longè (pi long a pi kout)). Kidonk, insert ki pi souvan ak pi long yo defini premye "gwoup" la. Frekans gwoup la fikse sou frekans kle a. Apre sa, chak insert ki rete nan lis klase a te eseye ajoute nan gwoup la pa aliyman Needleman-Wunsch pa pè. Si kantite matche, insert, oswa sipresyon nan yon aliyman pa depase yon papòt 2, yo ajoute yon insert nan gwoup la, epi frekans gwoup jeneral la ogmante pa konbyen fwa insert la te ajoute. Insert ki ajoute nan yon gwoup yo make kòm itilize epi yo eskli nan plis pwosesis. Si sekans insert la pa ka ajoute nan yon gwoup ki deja egziste, sekans insert la itilize pou kreye yon nouvo gwoup ak frekans insert ki apwopriye a epi make kòm itilize. Iterasyon an fini lè chak sekans insert swa itilize pou fòme yon nouvo gwoup oswa ka enkli nan yon gwoup ki deja egziste. Apre tou, insert gwoupe ki fèt ak nikleotid yo finalman tradui an sekans peptid (bibliyotèk peptid). Rezilta analiz sa a se yon seri insert ak frekans korespondan yo ki fòme kantite lekti konsekitif (Fig. Siplemantè 2).
Jenerasyon Motif: Baze sou yon lis peptid inik, yo te kreye yon bibliyotèk ki gen tout modèl asid amine posib (aa) jan yo montre anba a. Yo te ekstrè chak modèl posib ki gen longè 3 nan peptid la epi yo te ajoute modèl envès li ansanm ak yon bibliyotèk motif komen ki gen tout modèl yo (tripeptid). Yo te sekansye bibliyotèk motif ki trè repetitif yo epi yo te retire redondans lan. Apre sa, pou chak tripeptid nan bibliyotèk motif la, nou te verifye prezans li nan bibliyotèk la lè l sèvi avèk zouti enfòmatik. Nan ka sa a, yo ajoute frekans peptid ki gen tripeptid motif yo jwenn nan epi yo plase l nan motif la nan bibliyotèk motif la ("kantite motif"). Rezilta jenerasyon motif la se yon etalaj bidimansyonèl ki gen tout aparisyon tripeptid yo (motif) ak valè respektif yo, ki se kantite lekti sekans ki lakòz motif korespondan an lè lekti yo filtre, gwoupe, epi tradui. Metrik jan sa dekri an detay pi wo a.
Normalizasyon kantite motif ak dyagram dispèsyon korespondan yo: Yo te normalize kantite motif pou chak echantiyon lè l sèvi avèk
Kote ni se kantite lekti ki genyen sijè i a. Kidonk, vi reprezante pousantaj frekans lekti (oswa peptid) ki genyen motif i nan echantiyon an. Valè P pou kantite motif ki pa nòmalize yo te kalkile lè l sèvi avèk tès egzak Fisher a. Konsènan korelasyon kantite motif yo, korelasyon Spearman yo te kalkile lè l sèvi avèk kantite motif nòmalize ak R.
Pou vizyalize kontni asid amine yo nan chak pozisyon nan bibliyotèk peptid la, yo te kreye logogram entènèt 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Premyèman, yo estoke kontni asid amine yo nan chak pozisyon peptid 12-mè a nan yon matris 20×12. Apre sa, yo jenere yon seri 1000 peptid ki gen menm kontni relatif asid amine nan chak pozisyon nan fòma fasta-sekans epi yo bay li kòm opinyon pou web-logo 3, ki jenere yon reprezantasyon grafik kontni relatif asid amine nan chak pozisyon pou yon bibliyotèk peptid bay. Pou vizyalize ansanm done miltidimansyonèl, yo te kreye kat chalè lè l sèvi avèk yon zouti ki devlope entènman nan R (biosHeatmap, yon pake R ki poko pibliye). Yo te kalkile dendrogram yo prezante nan kat chalè yo lè l sèvi avèk metòd gwoupman yerarchize Ward la ak metrik distans euclidian an. Pou analiz estatistik done nòt motif yo, yo te kalkile valè P pou nòt ki pa nòmalize yo lè l sèvi avèk tès egzak Fisher la. Yo te kalkile valè P pou lòt ansanm done yo nan R lè l sèvi avèk tès t Student la oswa ANOVA.
Yo te enjekte klon faj yo te chwazi yo ak faj san insert yo pa venn nan venn ke a (2×1010 faj/animal nan 300 μl PBS). Dis minit anvan pèfizyon an ak fiksasyon ki vin apre a, yo te enjekte menm bèt yo pa venn ak 100 μl lektin make ak DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minit apre enjeksyon faj la, yo te fè pèfizyon nan kè rat yo ak 50 ml PBS epi apre sa 50 ml 4% PFA/PBS. Anplis de sa, yo te fikse echantiyon sèvo yo pandan lannwit nan 4% PFA/PBS epi yo te tranpe yo nan 30% sikwoz pandan lannwit nan 4°C. Yo te konjele echantiyon yo rapidman nan melanj OCT la. Yo te fè analiz imunoistochimik echantiyon konjele yo nan tanperati chanm sou kriyoseksyon 30 µm bloke ak 1% BSA epi enkube ak antikò poliklonal make ak FITC kont faj T7 (Novus NB 600-376A) a 4 °C. Enkube pandan tout lannwit lan. Finalman, yo te lave seksyon yo 3 fwa ak PBS epi yo te egzamine yo ak yon mikwoskòp lazè konfokal (Leica TCS SP5).
GenScript USA te sentetize tout peptid ki gen yon pite minimòm 98%, yo te biotinile yo epi liofilize yo. Biotin lye atravè yon lòt espasyè trip glisin nan N-tèminal la. Tcheke tout peptid yo lè l sèvi avèk espektwometri mas.
Yo te melanje Streptavidin (Sigma S0677) avèk yon eksè ekimolè 5 fwa peptid biotinile, peptid inibitè BACE1 biotinile, oubyen yon konbinezon (rapò 3:1) peptid inibitè BACE1 biotinile ak peptid inibitè BACE1 nan 5-10% DMSO/enkube nan PBS. 1 èdtan nan tanperati chanm anvan enjeksyon an. Yo te enjekte peptid konjige ak Streptavidin yo pa venn nan yon dòz 10 mg/kg nan youn nan venn ke rat ki gen yon kavite serebral.
Yo te evalye konsantrasyon konplèks streptavidin-peptid yo pa ELISA. Yo te kouvri plak mikrotitrasyon Nunc Maxisorp (Sigma) yo pandan lannwit nan 4°C ak 1.5 μg/ml antikò sourit anti-streptavidin (Thermo, MA1-20011). Apre blokaj (tanpon blokaj: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% jelatin, 1% BSA) nan tanperati chanm pandan 2 èdtan, lave plak la ak 0.05% Tween-20/PBS (tanpon lave) pandan 3 segonn, yo te ajoute echantiyon CSF ak plasma nan pi yo te dilye ak tanpon blokaj (plasma 1:10,000, CSF 1:115). Apre sa, yo te enkube plak la pandan lannwit nan 4°C ak antikò deteksyon (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Apre twa etap lavaj, yo te detekte streptavidin pa enkubasyon nan solisyon substrat TMB (Roche) pou jiska 20 minit. Apre yo fin sispann devlopman koulè a ​​ak 1M H2SO4, mezire absòbans lan nan 450 nm.
Yo te evalye fonksyon konplèks inibitè streptavidin-peptid-BACE1 la pa ELISA Aβ(1-40) dapre pwotokòl manifakti a (Wako, 294-64701). An brèf, echantiyon CSF yo te delye nan diluan estanda (1:23) epi yo te enkube yo pandan tout lannwit nan 4°C nan plak 96-pi ki kouvri ak antikò kaptire BNT77. Apre senk etap lave, yo te ajoute antikò BA27 konjige ak HRP epi yo te enkube yo pandan 2 èdtan nan 4°C, epi apre sa te gen senk etap lave. Yo te detekte Aβ(1–40) pa enkubasyon nan solisyon TMB pandan 30 minit nan tanperati chanm. Apre yo fin sispann devlopman koulè a ​​ak solisyon arè a, mezire absòbans lan nan 450 nm. Echantiyon plasma yo te sibi ekstraksyon faz solid anvan ELISA Aβ(1–40). Yo te ajoute plasma a nan 0.2% DEA (Sigma) nan plak 96-pi epi yo te enkube yo nan tanperati chanm pandan 30 minit. Apre yo te fin lave plak SPE yo youn apre lòt (Oasis, 186000679) avèk dlo ak 100% metanòl, yo te ajoute echantiyon plasma yo nan plak SPE yo epi yo te retire tout likid la. Yo te lave echantiyon yo (premye avèk 5% metanòl answit 30% metanòl) epi yo te elye avèk 2% NH4OH/90% metanòl. Apre yo te fin seche elye a nan 55°C pandan 99 minit nan yon kouran N2 konstan, yo te redwi echantiyon yo nan diluan estanda epi yo te mezire Aβ(1–40) jan sa dekri pi wo a.
Kijan pou site atik sa a: Urich, E. et al. Livrezon kago nan sèvo a lè l sèvi avèk peptid tranzit idantifye in vivo. Syans lan. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB ak Moos T. Administrasyon dwòg makromolekilè nan sèvo a lè l sèvi avèk terapi sib. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., ak Martinez-Martinez, P. Administrasyon dwòg peptidik ak pwoteyin atravè baryè san-sèvo a. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Baryè san-sèvo a: yon blokaj nan devlopman medikaman pou sèvo. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, ak Byrd, A. Pèspektiv pou amelyore administrasyon dwòg ak siblaj nan sèvo a atravè chemen koryoyid plexus-CSF la. Rechèch famasetik 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modènizasyon byofamasetik ak chwal Trojan molekilè pou livrezon nan sèvo. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, Transpò peptid medyatè pa reseptè WM atravè baryè san-sèvo a. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Ogmante pénétration nan sèvo ak efikasite antikò terapetik yo lè l sèvi avèk navèt molekilè monovalan. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Transpò reseptè transferrin (TfR) detèmine absòpsyon nan sèvo varyant afinite antikò TfR yo. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).