Mèsi paske w vizite Nature.com.W ap itilize yon vèsyon navigatè ak sipò CSS limite.Pou pi bon eksperyans, nou rekòmande pou w sèvi ak yon navigatè ki ajou (oswa enfim mòd konpatibilite nan Internet Explorer).Anplis de sa, asire sipò kontinyèl, nou montre sit la san estil ak JavaScript.
Montre yon Carousel twa glisad alafwa.Sèvi ak bouton Previous ak Next pou deplase nan twa glisad alafwa, oswa itilize bouton kurseur nan fen a pou w deplase nan twa glisad nan yon moman.
Baryè san-sèvo ak baryè san-sèvo anpeche ajan byoterapi yo rive nan objektif yo nan sistèm nève santral la, kidonk anpeche tretman efikas nan maladi newolojik.Pou dekouvri nouvo transpòtè nan sèvo an vivo, nou te entwodwi yon bibliyotèk peptide phage T7 ak seri kolekte san ak likid serebrospinal (CSF) lè l sèvi avèk yon modèl gwo pisin konsyan canulated rat.Klon phage espesifik yo te trè rich nan CSF apre kat jij nan seleksyon.Tès peptides kandida endividyèl yo te revele plis pase 1000 fwa anrichisman nan CSF.Byoaktivite livrezon peptide medyatè nan sèvo a te konfime pa yon rediksyon 40% nan nivo amyloid-β nan likid serebrospinal la lè l sèvi avèk yon inibitè peptide BACE1 ki lye ak peptide transpò piblik la idantifye.Rezilta sa yo sijere ke peptides yo idantifye pa metòd seleksyon phage in vivo yo ka machin itil pou livrezon sistemik nan makromolekil nan sèvo a ak yon efè terapetik.
Rechèch terapi vize sistèm nève santral (CNS) te konsantre lajman sou idantifye dwòg optimize ak ajan ki montre pwopriyete vize CNS, ak mwens efò pou dekouvri mekanis ki mennen nan livrezon dwòg aktif nan sèvo a.Sa a ap kòmanse chanje kounye a kòm livrezon dwòg, espesyalman gwo molekil, se yon pati entegral nan devlopman modèn nerosyans dwòg.Anviwònman sistèm nève santral la byen pwoteje pa sistèm baryè serebrovaskilè, ki gen ladan baryè san-sèvo (BBB) ​​ak baryè san-sèvo (BCBB)1, sa ki fè li difisil pou bay dwòg nan sèvo1,2.Yo estime ke prèske tout gwo molekil dwòg ak plis pase 98% nan ti molekil dwòg yo elimine nan sèvo a3.Se poutèt sa li enpòtan anpil pou idantifye nouvo sistèm transpò nan sèvo ki bay livrezon efikas ak espesifik nan dwòg ki ka geri nan CNS 4,5.Sepandan, BBB ak BCSFB prezante tou yon opòtinite ekselan pou livrezon dwòg pandan y ap antre nan tout estrikti nan sèvo a atravè vaskilè vaste li yo.Kidonk, efò aktyèl yo pou sèvi ak metòd ki pa pwogrese pou livrezon nan sèvo a se lajman ki baze sou mekanis transpò medyatè reseptè (PMT) lè l sèvi avèk reseptè BBB6 andojèn.Malgre dènye pwogrè kle yo itilize chemen reseptè transferrin 7,8, plis devlopman nan nouvo sistèm livrezon ak pwopriyete amelyore yo nesesè.Pou sa ka fèt, objektif nou se te idantifye peptides ki kapab medyatè transpò CSF, menm jan yo ta ka nan prensip dwe itilize yo delivre makromolekil nan CNS la oswa yo louvri nouvo chemen reseptè yo.An patikilye, reseptè espesifik ak transpòtè nan sistèm serebral la (BBB ak BSCFB) ka sèvi kòm sib potansyèl pou livrezon aktif ak espesifik nan dwòg byoterapi.Likid serebrospinal (CSF) se yon pwodwi sekretè nan plexus choroid (CS) epi li an kontak dirèk ak likid entèrstisyèl nan sèvo a atravè espas subarachnoid la ak espas ventrikulè4.Dènyèman, li te montre ke likid serebrospinal subarachnoid difize twòp nan entèstisyòm nan sèvo a.Nou espere jwenn aksè nan espas parenchymal la lè l sèvi avèk aparèy aflu subarachnoid sa a oswa dirèkteman atravè BBB la.Pou reyalize sa, nou aplike yon estrateji seleksyon phage gaya nan vivo ki depreferans idantifye peptides transpòte pa youn nan de wout distenk sa yo.
Koulye a, nou dekri yon metòd tès depistaj ekspozisyon phage sekans nan vivo ak echantiyon CSF makonnen ak sekans debi segondè (HTS) pou kontwole premye jij seleksyon ak divèsite bibliyotèk ki pi wo a.Yo te fè tès depistaj sou rat konsyan ak yon kanul gwo sitèn (CM) enplante pou tout tan pou evite kontaminasyon san.Sa ki enpòtan, apwòch sa a chwazi tou de vize nan sèvo ak peptides ak aktivite transpò atravè baryè serebwo vaskilè a.Nou te itilize phages T7 akòz ti gwosè yo (~ 60 nm)10 epi sijere ke yo apwopriye pou transpò vesik ki pèmèt travèse transselilè nan baryè endothelial ak / oswa epithelial-medula.Apre kat jij panoramique, popilasyon faj yo te izole ki montre fò anrichisman CSF in vivo ak asosyasyon microvessel serebral.Sa ki enpòtan, nou te kapab konfime rezilta nou yo lè nou demontre ke pi bon peptides kandida yo pi pito ak chimikman sentèz yo kapab transpòte kago pwoteyin nan likid serebrospinal la.Premyèman, efè farmakodinamik CNS yo te etabli lè yo konbine yon peptide transpò dirijan ak yon inibitè nan peptide BACE1 la.Anplis de demontre ke estrateji tès depistaj fonksyonèl nan vivo ka idantifye nouvo peptides transpò nan sèvo kòm transpòtè kago pwoteyin efikas, nou espere apwòch seleksyon fonksyonèl menm jan an tou vin enpòtan nan idantifye nouvo chemen transpò nan sèvo.
Ki baze sou inite ki fòme plak (PFU), apre etap anbalaj faj la, yo te fèt ak kreye yon bibliyotèk o aza 12-mer lineyè T7 peptides phage ak yon divèsite apeprè 109 (gade Materyèl ak Metòd).Li enpòtan sonje ke nou ak anpil atansyon analize bibliyotèk sa a anvan panoramique nan vivo.Anplifikasyon PCR nan echantiyon bibliyotèk faj lè l sèvi avèk primè modifye te pwodwi anplikon ki te aplikab dirèkteman nan HTS (Siplemantè Fig. 1a).Akòz a) erè sekans HTS11, b) enpak sou bon jan kalite a nan primè (NNK) 1-12, ak c) prezans nan kalite sovaj (wt) phage (four kilè eskèlèt) nan bibliyotèk ki sibstiti a, yo te aplike yon pwosedi filtraj sekans pou ekstrè sèlman enfòmasyon sekans verifye (figi siplemantè 1b).Etap filtre sa yo aplike nan tout bibliyotèk sekans HTS.Pou bibliyotèk estanda a, yo te jwenn yon total de 233,868 lekti, nan ki 39% te pase kritè filtre yo epi yo te itilize pou analiz bibliyotèk ak seleksyon pou jij ki vin apre yo (Figi siplemantè 1c-e).Lekti yo te sitou miltip 3 pè baz nan longè ak yon pik nan 36 nukleotid (figi siplemantè 1c), ki konfime konsepsyon bibliyotèk la (NNK) 1-12.Miyò, apeprè 11% nan manm bibliyotèk yo te genyen yon 12 dimansyon sovaj-tip (wt) zo rèl do PAGISRELVDKL insert, ak prèske mwatye nan sekans yo (49%) genyen ensèsyon oswa efase.HTS bibliyotèk la konfime divèsite segondè nan peptides nan bibliyotèk la: yo te jwenn plis pase 81% nan sekans peptide sèlman yon fwa epi sèlman 1.5% ki te fèt nan ≥4 kopi (Siplemantè Fig. 2a).Frekans asid amine (aa) nan tout pozisyon 12 nan repètwa a byen korelasyon ak frekans yo espere pou kantite kodon ki te pwodwi pa repètwa NKK dejenere (figi siplemantè 2b).Frekans yo obsève nan résidus aa kode pa foure sa yo korelasyon byen ak frekans lan kalkile (r = 0.893) (Siplemantè Fig. 2c).Preparasyon bibliyotèk phage pou piki gen ladan etap anplifikasyon ak retire endotoxin.Sa a te deja montre potansyèlman diminye divèsite bibliyotèk faj yo12,13.Se poutèt sa, nou sekans yon bibliyotèk phage plak-amplifye ki te sibi retire endotoxin epi konpare li ak bibliyotèk orijinal la pou estime frekans AA.Yon korelasyon fò (r = 0.995) te obsève ant pisin orijinal la ak pisin anplifye ak pirifye (figi siplemantè 2d), ki endike ke konpetisyon ant klon anplifye sou plak lè l sèvi avèk phage T7 pa t lakòz gwo patipri.Konparezon sa a baze sou frekans motif tripeptide nan chak bibliyotèk, paske divèsite bibliyotèk (~109) pa ka totalman kaptire menm avèk HTS.Analiz frekans aa nan chak pozisyon revele yon ti patipri ki depann de pozisyon nan twa dènye pozisyon yo nan repètwa ki te antre a (figi siplemantè 2e).An konklizyon, nou te konkli ke bon jan kalite a ak divèsite nan bibliyotèk la te akseptab epi sèlman ti chanjman nan divèsite yo te obsève akòz anplifikasyon ak preparasyon nan bibliyotèk phage ant plizyè wonn nan seleksyon.
Serial echantiyon likid serebrospinal yo ka fèt pa enplantasyon chirijikal yon kanul nan CM nan rat konsyan pou fasilite idantifikasyon T7 phage enjekte nan venn (iv) atravè BBB a ak / oswa BCSFB (Fig. 1a-b).Nou te itilize de bra seleksyon endepandan (bra A ak B) nan twa premye jij yo nan seleksyon in vivo (Fig. 1c).Nou piti piti ogmante sevè seleksyon an lè nou diminye kantite total faj ki te prezante nan twa premye tou seleksyon yo.Pou katriyèm wonn nan panoramique, nou konbine echantiyon ki soti nan branch A ak B epi fè twa seleksyon endepandan adisyonèl.Pou etidye pwopriyete in vivo nan patikil phage T7 nan modèl sa a, yo te enjekte phage sovaj (PAGISRELVDKL mèt insert) nan rat atravè venn ke.Rekiperasyon phages nan likid serebrospinal ak san nan diferan pwen tan te montre ke relativman ti faj icosahedral T7 te gen yon faz rapid clearance inisyal nan lòj san an (Siplemantè Fig. 3).Baze sou tit yo administre ak volim san rat yo, nou kalkile ke sèlman apeprè 1% wt.faj ki soti nan dòz la administre te detekte nan san an 10 minit apre piki nan venn.Apre premye n bès rapid sa a, yo te mezire yon clearance prensipal pi dousman ak yon mwatye lavi 27.7 minit.Sa ki enpòtan, se sèlman trè kèk faj yo te rekipere nan lòj la CSF, ki endike yon background ki ba pou migrasyon faj sovaj nan lòj la CSF (Siplemantè Fig. 3).An mwayèn, sèlman apeprè 1 x 10-3% tit nan phage T7 nan san an ak 4 x 10-8% nan faj okòmansman enfuze yo te detekte nan likid serebrospinal la pandan tout peryòd echantiyon an (0-250 min).Miyò, mwatye lavi a (25.7 min) nan phage sovaj nan likid serebrospinal te menm jan ak sa yo obsève nan san.Done sa yo demontre ke baryè ki separe lòj CSF a ak san an se entak nan rat CM-canulated, sa ki pèmèt seleksyon in vivo nan bibliyotèk faj yo idantifye klon ki fasil transpòte soti nan san an nan lòj la CSF.
(a) Mete kanpe yon metòd pou re-echantiyon likid serebrospinal (CSF) nan yon gwo pisin.(b) Dyagram ki montre kote selilè baryè sistèm nève santral la (CNS) ak estrateji seleksyon yo itilize pou idantifye peptides ki travèse baryè san-sèvo (BBB) ​​ak baryè san-sèvo.(c) Organigram tès depistaj nan vivo phage.Nan chak seri seleksyon, phages (idantifyan bèt andedan flèch yo) yo te enjekte nan venn.De branch altènatif endepandan (A, B) yo kenbe separeman jiskaske 4yèm tou seleksyon an.Pou seleksyon jij 3 ak 4, chak script phage ekstrè nan CSF te sekans manyèlman.(d) Sinetik faj izole nan san (sèk wouj) ak likid serebrospinal (triyang vèt) pandan premye tou seleksyon an nan de rat canulated apre piki nan venn nan bibliyotèk la peptide T7 (2 x 1012 faj / bèt).Kare ble yo endike konsantrasyon mwayèn inisyal phage nan san an, kalkile apati kantite faj enjekte, pran an kont volim total san an.Kare nwa yo endike pwen entèseksyon liy y ki soti nan konsantrasyon faj san yo.(e,f) Prezante frekans relatif ak distribisyon tout motif tripeptide ki sipèpoze yo jwenn nan peptide a.Yo montre kantite motif yo jwenn nan 1000 lekti.Siyifikativman (p <0.001) motif anrichi yo make ak pwen wouj.(e) Korelation scatterplot konpare frekans relatif nan motif tripeptide nan bibliyotèk la sou fòm piki a ak faj san ki sòti nan bèt #1.1 ak #1.2.(f) Korelation scatterplot konpare frekans relatif yo nan bèt phage tripeptide motif #1.1 ak #1.2 izole nan san ak likid cerebrospinal.(g, h) Sekans ID reprezantasyon nan faj rich nan san (g) kont bibliyotèk enjekte ak faj rich nan CSF (h) kont san apre yon wonn nan seleksyon in vivo nan tou de bèt yo.Gwosè kòd yon sèl lèt la endike konbyen fwa asid amine sa a rive nan pozisyon sa a.Vèt = polè, koulè wouj violèt = net, ble = debaz, wouj = asid ak nwa = asid amine idrofob.Figi 1a, b te fèt ak pwodwi pa Eduard Urich.
Nou enjekte yon bibliyotèk peptide phage nan de rat enstriman CM (klad A ak B) ak phage izole nan likid serebrospinal ak san (Figi 1d).Inisyal rapid clearance nan bibliyotèk la te mwens pwononse konpare ak phage nan kalite sovaj.Mwatye lavi an mwayèn nan bibliyotèk la sou fòm piki a nan tou de bèt yo te 24.8 minit nan san, menm jan ak phage-tip sovaj, ak 38.5 minit nan CSF.Echantiyon phage san ak likid serebrospinal ki soti nan chak bèt yo te sibi HTS ak tout peptides idantifye yo te analize pou prezans nan yon motif tripeptide kout.Motif Tripeptide yo te chwazi paske yo bay yon baz minim pou fòmasyon estrikti ak entèraksyon peptide-pwoteyin14,15.Nou te jwenn yon bon korelasyon nan distribisyon an nan motif ant bibliyotèk la faj enjekte ak klon ekstrè soti nan san an nan tou de bèt (Fig. 1e).Done yo endike ke konpozisyon bibliyotèk la sèlman majinalman anrichi nan lòj san an.Frekans asid amine ak sekans konsansis yo te analize plis nan chak pozisyon lè l sèvi avèk yon adaptasyon nan lojisyèl an Weblogo16.Enteresan, nou te jwenn yon anrichisman fò nan résidus glisin san (figi 1g).Lè yo te konpare san ak klon yo chwazi nan CSF, yo te obsève seleksyon fò ak kèk deseleksyon nan motif (Fig. 1f), ak sèten asid amine yo te preferans prezan nan pozisyon predetèmine nan 12-manm nan (Fig. 1h).Miyò, bèt endividyèl yo te diferan anpil nan likid serebrospinal, tandiske anrichisman glisin san yo te obsève nan tou de bèt yo (figi siplemantè 4a-j).Apre filtraj sevè nan done sekans nan likid serebrospinal bèt #1.1 ak #1.2, yo te jwenn yon total de 964 ak 420 inik peptides 12-mer (figi siplemantè 1d-e).Klon phage izole yo te anplifye epi yo te sibi yon dezyèm tou seleksyon an vivo.Phage ekstrè soti nan dezyèm tou seleksyon an te sibi HTS nan chak bèt ak tout peptides idantifye yo te itilize kòm opinyon nan yon pwogram rekonesans motif analize ensidan an nan motif tripeptide (Fig. 2a, b, ef).Konpare ak premye sik la nan faj la refè nan CSF, nou obsève seleksyon plis ak deselection nan anpil motif nan CSF nan branch A ak B (Fig. 2).Yo te aplike yon algorithm idantifikasyon rezo pou detèmine si yo reprezante diferan modèl sekans ki konsistan.Yo te obsève yon resanblans klè ant sekans 12 dimansyon yo refè pa CSF nan altènatif clade A (figi 2c, d) ak clade B (figi 2g, h).Analiz la pisin nan chak branch revele pwofil seleksyon diferan pou peptides 12-mer (Siplemantè Fig. 5c, d) ak yon ogmantasyon nan rapò a tit CSF / san sou tan pou klon pisin apre dezyèm tou seleksyon an konpare ak premye tou seleksyon an (Siplemantè Fig. 5e).).
Anrichisman nan motif ak peptides nan likid serebrospinal pa de jij siksesif nan seleksyon an vivo fonksyonèl ekspozisyon faj.
Tout faj likid serebrospinal yo te refè nan premye tou chak bèt (bèt #1.1 ak #1.2) yo te pisin, anplifye, HT-sekans ak re-enjekte ansanm (2 x 1010 faj/bèt) 2 SM rat canulated (#1.1 → #).2.1 ak 2.2, 1.2 → 2.3 ak 2.4).(a,b,e,f) Korelation scatterplots konpare frekans relatif nan motif tripeptide nan tout faj ki sòti nan CSF nan premye ak dezyèm seleksyon yo.Frekans relatif ak distribisyon motif ki reprezante tout tripeptides sipèpoze posib yo jwenn nan peptides nan tou de oryantasyon yo.Yo montre kantite motif yo jwenn nan 1000 lekti.Motif ki te siyifikativman (p < 0.001) chwazi oswa eskli nan youn nan bibliyotèk yo konpare yo make ak pwen wouj.(c, d, g, h) Sekans logo reprezantasyon tout CSF ki rich 12 asid amine sekans long ki baze sou jij 2 ak 1 nan seleksyon in vivo.Gwosè kòd yon sèl lèt la endike konbyen fwa asid amine sa a rive nan pozisyon sa a.Pou reprezante logo la, yo konpare frekans sekans CSF ki soti nan bèt endividyèl ant de wonn seleksyon yo epi yo montre sekans anrichi nan dezyèm tou: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ak (h) #1.2–#2.4.Asid amine ki pi anrichi nan yon pozisyon bay nan (c, d) bèt non.2.1 ak non.2.2 oswa (g, h) nan bèt pa gen okenn.2.3 ak non.2.4 yo montre nan koulè.Vèt = polè, koulè wouj violèt = net, ble = debaz, wouj = asid ak nwa = asid amine idrofob.
Apre twazyèm wonn seleksyon an, nou idantifye 124 sekans peptide inik (# 3.1 ak # 3.2) ki soti nan 332 klon faj rekonstitye CSF ki izole nan de bèt (figi siplemantè 6a).Sekans LGSVS (18.7%) te gen pwopòsyon relatif ki pi wo a, ki te swiv pa foure nan kalite sovaj PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), ak SARGSWREIVSLS (2.2%).Nan katriyèm wonn final la, nou mete de branch endepandan chwazi nan twa bèt separe (Fig. 1c).Nan 925 klon phage sekans yo te refè nan CSF, nan katriyèm wonn nou te jwenn 64 sekans peptide inik (Siplemantè Fig. 6b), nan mitan ki pwopòsyon relatif nan phage sovaj-kalite tonbe a 0.8%.Klon CSF ki pi komen nan katriyèm wonn lan te LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) ak RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Ranje longè peptides yo chwazi yo se akòz ensèsyon / efase nukleotid oswa kodon sispann twò bonè nan primè bibliyotèk yo lè w ap itilize kodon dejenere pou konsepsyon bibliyotèk NNK.Kodon sispann prematire jenere peptides ki pi kout epi yo chwazi yo paske yo genyen motif favorab aa.Peptid ki pi long yo ka soti nan ensèsyon/deleksyon nan primè bibliyotèk sentetik yo.Sa a pozisyon kodon arè ki fèt deyò ankadreman an epi li li jiskaske yon nouvo kodon sispann parèt en.An jeneral, nou kalkile faktè anrichisman pou tout kat jij seleksyon yo lè nou konpare done opinyon yo ak done echantiyon pwodiksyon an.Pou premye seri tès depistaj la, nou te itilize tit phage sovaj kòm yon referans background ki pa espesifik.Enteresan, seleksyon phage negatif te trè fò nan premye sik CSF la, men se pa nan san (Fig. 3a), ki ka akòz pwobabilite ki ba nan difizyon pasif nan pifò manm nan bibliyotèk la peptide nan lòj la CSF oswa phages relatif yo gen tandans yo dwe pi efikasman kenbe oswa retire nan san an pase bakteriofaj.Sepandan, nan dezyèm tou nan panoramique, seleksyon fò nan phages nan CSF yo te obsève nan tou de klad, sijere ke wonn anvan an te rich nan faj ki montre peptides ki ankouraje absorption CSF (Fig. 3a).Ankò, san anrichisman san enpòtan.Epitou nan twazyèm ak katriyèm wonn yo, klon faj yo te siyifikativman rich nan CSF.Konpare frekans relatif chak sekans peptide inik ant de dènye jij seleksyon yo, nou te jwenn ke sekans yo te menm plis rich nan katriyèm wonn seleksyon an (figi 3b).Yon total de 931 motif tripeptide yo te ekstrè nan tout 64 sekans peptide inik lè l sèvi avèk tou de oryantasyon peptide.Motif ki pi anrichi nan katriyèm wonn lan te egzamine pi byen pou pwofil anrichisman yo atravè tout wonn yo konpare ak bibliyotèk ki sou fòm piki a (koupe: 10% anrichisman) (figi siplemantè 6c).Modèl jeneral seleksyon yo te montre ke pi fò nan motif yo etidye yo te rich nan tout jij anvan yo nan tou de branch seleksyon yo.Sepandan, kèk motif (eg SGL, VSG, LGS GSV) te majorite soti nan altènatif clade A, pandan ke lòt moun (egzanp FGW, RTN, WGF, NTR) te rich nan altènatif clade B.
Validasyon nan transpò CSF nan CSF-anrichi phage-montre peptides ak peptides lidè biotinylate konjige ak charj streptavidin.
(a) Rapò anrichisman yo kalkile nan tout kat jij (R1-R4) ki baze sou tit phage (PFU) ki enjekte (antre = I) ak tit phage CSF detèmine (pwodiksyon = O).Faktè anrichisman pou twa dènye wonn yo (R2-R4) yo te kalkile pa konparezon ak wonn anvan an ak premye tou (R1) ak done pwa.Ba louvri yo se likid serebrospinal, ba lonbraj yo se plasma.(***p<0.001, ki baze sou tès t Elèv la).(b) Lis peptides faj ki pi abondan yo, klase selon pwopòsyon relatif yo ak tout faj yo kolekte nan CSF apre wonn 4 seleksyon an.Sis klon faj ki pi komen yo make nan koulè, nimewote ak faktè anrichisman yo ant wonn 3 ak 4 nan seleksyon (enkadre).(c, d) Sis klon faj ki pi rich yo, faj vid ak bibliyotèk peptide phage paran ki soti nan wonn 4 yo te analize endividyèlman nan yon modèl echantiyon CSF.CSF ak echantiyon san yo te kolekte nan pwen tan ki endike yo.(c) Kantite egal 6 klon faj kandida (2 x 1010 faj / bèt), faj vid (#1779) (2 x 1010 faj / bèt) ak bibliyotèk peptide faj stock (2 x 1012 faj / bèt).Famakokinetik CSF chak klonaj faj ki enjekte ak bibliyotèk peptide faj sou tan yo montre.(d) montre rapò mwayèn CSF/san pou tout faj refè/mL pandan tan echantiyon an.(e) Kat peptides lidè sentetik ak yon sèl kontwòl grenpe yo te lye ak biotin nan streptavidin nan N-tèminal yo (ekspozisyon tetramer) ki te swiv pa piki (venn ke iv, 10 mg streptavidin / kg).Omwen twa rat entube (N = 3).).Echantiyon CSF yo te kolekte nan pwen tan ki endike yo ak konsantrasyon streptavidin yo te mezire pa CSF anti-streptavidin ELISA (nd = pa detekte).(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ki baze sou tès ANOVA).(f) Konparezon sekans asid amine klon peptide faj #2002 ki pi anrichi (koulè wouj violèt) ak lòt klon peptide faj ki chwazi nan 4yèm tou seleksyon an.Fragman asid amine ki idantik ak menm jan yo kode koulè.
Nan tout faj rich nan katriyèm wonn lan (Fig. 3b), yo te chwazi sis klon kandida pou plis analiz endividyèl nan modèl echantiyon CSF la.Kantite egal sis phage kandida, phage vid (pa gen okenn insert) ak bibliyotèk peptide pwofaj yo te sou fòm piki nan twa bèt CM canulated, ak farmakokinetik yo te detèmine nan CSF (figi 3c) ak san (figi siplemantè 7).Tout klon faj yo teste vize lòj CSF a nan yon nivo 10-1000 fwa pi wo pase sa ki nan faj kontwòl vid la (#1779).Pou egzanp, klon #2020 ak #2077 te gen apeprè 1000 fwa pi wo tit CSF pase faj kontwòl.Pwofil farmakokinetik chak peptide chwazi diferan, men yo tout gen yon gwo kapasite CSF homing.Nou te obsève yon diminisyon konstan sou tan pou klon #1903 ak #2011, alòske pou klon #2077, #2002 ak #2009 yon ogmantasyon pandan 10 premye minit yo ta ka endike transpò aktif men yo bezwen verifye.Klon #2020, #2002, ak #2077 estabilize nan nivo segondè, pandan y ap konsantrasyon CSF nan klonaj #2009 dousman diminye apre ogmantasyon inisyal la.Lè sa a, nou konpare frekans relatif chak kandida CSF ak konsantrasyon san li yo (figi 3d).Korelasyon nan tit mwayèn nan chak kandida CSF ak tit san li yo nan tout tan echantiyon yo te montre ke twa nan sis kandida yo te siyifikativman rich nan san CSF.Enteresan, script #2077 te montre pi wo estabilite san (figi siplemantè 7).Pou konfime ke peptides yo menm yo kapab aktivman transpòte kago lòt pase patikil phage nan lòj CSF la, nou sentèz kat peptides lidè derivatize ak biotin nan N-tèminal kote peptides yo tache ak patikil phage la.Peptides biotinylated (nèb 2002, 2009, 2020 ak 2077) te konjige ak streptavidin (SA) pou jwenn fòm multimeric yon ti jan imite jeyometri phage.Fòma sa a te pèmèt nou tou mezire ekspoze SA nan san ak likid serebrospinal kòm peptides pwoteyin kago-transpòte.Sa ki enpòtan, done phage ta ka souvan repwodui lè peptides sentetik yo te administre nan fòma SA-konjige sa a (Fig. 3e).Peptid grenpe yo te gen mwens ekspoze inisyal ak pi vit clearance CSF ak nivo endeslabl nan 48 èdtan.Pou jwenn yon insight sou chemen livrezon sa yo klon faj peptide nan espas CSF la, nou analize lokalizasyon frape peptide faj endividyèl lè l sèvi avèk imunohistochimi (IHC) dirèkteman detekte patikil faj 1 èdtan apre piki nan venn nan vivo.Miyò, klonaj #2002, #2077, ak #2009 ta ka detekte pa tach fò nan kapilè nan sèvo, pandan y ap pa detekte faj kontwòl (#1779) ak klonaj #2020 (figi siplemantè 8).Sa a sijere ke peptides sa yo kontribye nan efè a sou sèvo a jisteman lè yo travèse BBB la.Plis analiz detaye obligatwa pou teste ipotèz sa a, paske wout BSCFB a ka patisipe tou.Lè w konpare sekans asid amine nan script ki pi rich (#2002) ak lòt peptides chwazi, li te note ke kèk nan yo gen ekstansyon asid amine ki sanble, ki ka endike yon mekanis transpò menm jan an (figi 3f).
Akòz pwofil plasma inik li yo ak ogmantasyon siyifikatif nan CSF sou tan, klonaj ekspozisyon faj #2077 te eksplore plis sou yon peryòd 48 èdtan ki pi long epi li te kapab repwodui ogmantasyon rapid nan CSF obsève an asosyasyon ak nivo SA soutni (figi 4a).Konsènan lòt klon faj idantifye, # 2077 tache fòtman pou kapilè nan sèvo epi li te montre kolokalizasyon enpòtan ak lektin makè kapilè lè yo wè yo nan pi wo rezolisyon ak pètèt kèk tach nan espas parenchymal la (Figi 4b).Pou mennen ankèt sou si wi ou non efè farmakolojik peptide-medyatè yo ta ka jwenn nan CNS la, nou te fè yon eksperyans nan ki vèsyon biotinylate nan i) peptide transpò #2077 la ak ii) peptide inibitè BACE1 la te melanje ak SA nan de rapò diferan.Pou yon konbinezon nou te itilize sèlman BACE1 peptide inibitè a ak pou lòt la nou te itilize yon rapò 1: 3 nan BACE1 peptide inibitè a #2077 peptide.Tou de echantiyon yo te administre nan venn epi yo te mezire nivo likid serebrospinal beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) sou tan.Abeta40 te mezire nan CSF kòm li reflete anpèchman BACE1 nan parenchyma nan sèvo.Kòm espere, tou de konplèks siyifikativman redwi nivo san nan Abeta40 (figi 4c, d).Sepandan, sèlman echantiyon ki gen yon melanj de peptide non.2077 ak yon inibitè nan peptide BACE1 konjige ak SA te lakòz yon diminisyon enpòtan nan Abeta40 nan likid serebrospinal la (Fig. 4c).Done yo montre ke peptide pa gen okenn.2077 se kapab transpòte pwoteyin 60 kDa SA nan CNS la epi tou li pwovoke efè famasi ak inibitè SA-konjige nan peptide BACE1 la.
(a) Piki klonal (2 × 10 faj / bèt) nan faj T7 ki montre pwofil farmakokinetik alontèm nan CSF peptide #2077 (RLSSVDSDLSGC) ak faj kontwòl san enjekte (#1779) nan omwen twa rat CM-entube.(b) Imaj mikwoskopik konfokal nan mikrovessels cortical reprezantan nan rat phage-enjekte (2 × 10 10 phages / bèt) ki montre kontre nan peptide #2077 ak veso (lectin).Klon faj sa yo te administre 3 rat epi yo te pèmèt yo sikile pou 1 èdtan anvan perfusion.Sèvo yo te seksyone ak tache ak antikò poliklonal ki make FITC kont T7 phage capsid la.Dis minit anvan perfusion ak fiksasyon ki vin apre yo, yo te administre lektin ki make DyLight594 nan venn.Imaj fliyoresan ki montre tach lektin (wouj) nan bò luminal mikwo veso ak faj (vèt) nan lumèn nan kapilè ak tisi sèvo perivaskilè.Ba echèl la koresponn ak 10 µm.(c, d) Biotinylated BACE1 inhibitory peptide pou kont li oswa nan konbinezon ak biotinylated transit peptide #2077 te makonnen ak streptavidin ki te swiv pa piki nan venn nan omwen twa rat CM canulated (10 mg streptavidin / kg).BACE1 peptide inhibitor-medyatè rediksyon nan Aβ40 te mezire pa Aβ1-40 ELISA nan san (wouj) ak likid cerebrospinal (zoranj) nan pwen yo endike.Pou pi byen klè, yo trase yon liy pwentiye sou graf la nan yon echèl 100%.(c) Pousantaj rediksyon nan Aβ40 nan san (triyang wouj) ak likid serebrospinal (triyang zoranj) nan rat trete ak streptavidin konjige ak peptide transpò piblik #2077 ak BACE1 inhibitory peptide nan yon rapò 3: 1.(d) Rediksyon pousantaj nan san Aβ40 (sèk wouj) ak likid serebrospinal (sèk zoranj) nan rat trete ak streptavidin makonnen ak yon peptide inhibiteur BACE1 sèlman.Konsantrasyon Aβ nan kontwòl la te 420 pg / ml (devyasyon estanda = 101 pg / ml).
Phage ekspozisyon te aplike avèk siksè nan plizyè domèn rechèch byomedikal17.Metòd sa a te itilize pou etid divèsite vaskilè in vivo18,19 osi byen ke etid ki vize veso serebral20,21,22,23,24,25,26.Nan etid sa a, nou pwolonje aplikasyon an nan metòd seleksyon sa a pa sèlman nan idantifikasyon dirèk nan peptides vize veso serebral, men tou, nan dekouvèt kandida ki gen pwopriyete transpò aktif pou travèse baryè san-sèvo.Koulye a, nou dekri devlopman yon pwosedi seleksyon in vivo nan rat entubate CM epi demontre potansyèl li pou idantifye peptides ak pwopriyete homing CSF.Sèvi ak phage T7 ki montre yon bibliyotèk 12-mer peptides o aza, nou te kapab demontre ke phage T7 la piti ase (apeprè 60 nm an dyamèt)10 pou adapte yo ak baryè san-sèvo a, kidonk travèse dirèkteman baryè san-sèvo oswa plexus choroid.Nou te obsève ke CSF rekòlte soti nan rat CM canulated se te yon metòd tès depistaj fonksyonèl in vivo ki byen kontwole, e ke faj la ekstrè pa sèlman mare nan vaskilè a, men tou te fonksyone kòm yon transpòtè atravè baryè a san-sèvo.Anplis de sa, lè nou kolekte san ansanm ak aplike HTS nan CSF ​​ak faj ki sòti nan san, nou konfime ke chwa nou an nan CSF pa te enfliyanse pa anrichisman san oswa kapasite pou ekspansyon ant jij seleksyon yo.Sepandan, lòj san an se yon pati nan pwosedi seleksyon an, depi faj ki kapab rive nan lòj CSF la dwe siviv ak sikile nan san an ase lontan pou anrichi tèt yo nan sèvo a.Yo nan lòd yo ekstrè enfòmasyon serye sekans soti nan done HTS anvan tout koreksyon, nou aplike filtè adapte ak erè sekans platfòm espesifik nan workflow analiz la.Lè nou enkòpore paramèt sinetik nan metòd tès depistaj la, nou konfime famakokinetik rapid nan faj T7 sovaj (t½ ~ 28 min) nan san24, 27, 28 epi tou nou detèmine mwatye lavi yo nan likid cerebrospinal (t½ ~ 26 min) pou chak minit).Malgre pwofil pharmacokinetic menm jan an nan san ak CSF, sèlman 0.001% nan konsantrasyon nan san nan phage te kapab detekte nan CSF, ki endike ba mobilite background nan sovaj-tip T7 faj atravè baryè a san-sèvo.Travay sa a mete aksan sou enpòtans premye tou seleksyon an lè w ap itilize estrateji panoramique in vivo, espesyalman pou sistèm faj ki rapidman efase nan sikilasyon an, paske kèk klon yo kapab rive nan lòj CNS la.Kidonk, nan premye tou an, rediksyon nan divèsite bibliyotèk la te gwo anpil, paske se sèlman yon kantite limite klon yo te finalman kolekte nan modèl CSF trè strik sa a.Estrateji panoramique nan vivo sa a enkli plizyè etap seleksyon tankou akimilasyon aktif nan lòj CSF, siviv klonaj nan lòj san an, ak rapid retire klonaj phage T7 nan san an nan premye 10 minit yo (figi 1d ak Figi siplemantè 4M).).Kidonk, apre premye tou an, diferan klon faj yo te idantifye nan CSF, byenke menm pisin inisyal la te itilize pou bèt endividyèl yo.Sa a sijere ke plizyè etap seleksyon strik pou bibliyotèk sous ak yon gwo kantite manm bibliyotèk lakòz yon rediksyon enpòtan nan divèsite.Se poutèt sa, evènman o aza yo pral vin yon pati entegral nan pwosesis seleksyon inisyal la, anpil enfliyanse rezilta a.Li posib ke anpil nan klon yo nan bibliyotèk orijinal la te gen yon tandans anrichisman CSF ki sanble anpil.Sepandan, menm nan menm kondisyon eksperimantal yo, rezilta seleksyon yo ka diferan akòz ti kantite chak script patikilye nan pisin inisyal la.
Motif yo anrichi nan CSF diferan de sa yo ki nan san an.Enteresan, nou te note premye chanjman anvè peptides ki rich nan glisin nan san bèt endividyèl yo.(Fig. 1g, Fig. Siplemantè 4e, 4f).Faj ki gen peptides glisin ka pi estab ak mwens chans pou yo retire nan sikilasyon.Sepandan, peptides ki rich ak glisin sa yo pa te detekte nan echantiyon likid serebrospinal yo, sa ki sijere ke bibliyotèk yo òganize yo te ale nan de etap seleksyon diferan: youn nan san an ak yon lòt pèmèt yo akimile nan likid serebrospinal la.Klon ki rich ak CSF ki soti nan katriyèm tou seleksyon an te teste anpil.Prèske tout klon yo teste endividyèlman yo te konfime yo dwe rich nan CSF konpare ak faj kontwòl vid.Yon frape peptide (#2077) te egzamine an plis detay.Li te montre yon mwatye lavi plasma ki pi long konpare ak lòt frape (Figi 3d ak Figi Siplemantè 7), ak enteresan, peptide sa a te genyen yon rezidi sistein nan C-tèminal la.Li te dènyèman te montre ke adisyon nan sistein nan peptides ka amelyore pwopriyete famakokinetik yo lè yo lye ak albumin 29 .Sa a se kounye a enkoni pou peptide #2077 epi li mande plis etid.Gen kèk peptides ki montre yon depandans valens nan anrichisman CSF (done yo pa montre), ki ka gen rapò ak jeyometri sifas ki parèt nan kapsid T7 la.Sistèm T7 nou itilize a te montre 5-15 kopi chak peptide pou chak patikil faj.IHC te fèt sou kandida klon phage plon sou fòm piki nan venn nan cortical serebral rat (Siplemantè Fig. 8).Done yo te montre ke omwen twa klon (No 2002, No 2009 ak No 2077) te reyaji ak BBB la.Li rete pou detèmine si entèraksyon BBB sa a rezilta nan akimilasyon CSF oswa mouvman klon sa yo dirèkteman nan BCSFB la.Sa ki enpòtan, nou montre ke peptides yo chwazi kenbe kapasite transpò CSF yo lè yo sentetize ak mare nan kago pwoteyin lan.Liaison de peptides biotinylated N-terminal pou SA esansyèlman repete rezilta yo te jwenn ak klon phage respectifs yo nan san ak likid cerebrospinal (Fig. 3e).Finalman, nou montre ke peptide plon # 2077 kapab ankouraje aksyon an nan sèvo nan yon inibitè peptide biotinylate nan BACE1 konjige ak SA, sa ki lakòz efè famasi pwononse nan CNS la pa siyifikativman diminye nivo Abeta40 nan CSF (Fig. 4).Nou pa t 'kapab idantifye okenn omologues nan baz done a lè nou fè yon rechèch omoloji sekans peptide nan tout frape.Li enpòtan sonje ke gwosè bibliyotèk T7 a se apeprè 109, pandan ke gwosè bibliyotèk teyorik la pou 12-mers se 4 x 1015. Se poutèt sa, nou sèlman chwazi yon ti fraksyon nan espas divèsite bibliyotèk peptide 12-mer, ki ka vle di ke plis optimize peptides ka idantifye lè yo evalye espas sekans adjasan sa yo idantifye.Ipotetikman, youn nan rezon ki fè nou pa jwenn okenn omològ natirèl nan peptides sa yo ka deseleksyon pandan evolisyon pou anpeche antre san kontwòl sèten motif peptide nan sèvo a.
Ansanm, rezilta nou yo bay yon baz pou travay nan lavni pou idantifye ak karakterize sistèm transpò baryè serebwo vaskilè a nan vivo an plis detay.Se konfigirasyon debaz metòd sa a ki baze sou yon estrateji seleksyon fonksyonèl ki pa sèlman idantifye klon ak pwopriyete vaskilè serebral obligatwa, men tou gen ladan yon etap kritik nan ki klon siksè gen aktivite intrinsèque travèse baryè byolojik nan vivo nan lòj CNS la.se pou elicide mekanis transpò peptides sa yo ak preferans yo pou Liaison microvasculature espesifik pou rejyon sèvo an.Sa a ka mennen nan dekouvèt nouvo chemen pou transpò BBB ak reseptè yo.Nou espere ke peptides yo idantifye ka dirèkteman mare nan reseptè serebwo vaskilè oswa nan ligand sikile transpòte nan BBB oswa BCSFB.Vektè peptide yo ak aktivite transpò CSF dekouvri nan travay sa a pral plis envestige.Kounye a nou ap mennen ankèt sou espesifik nan sèvo peptides sa yo pou kapasite yo pou travèse BBB ak/oswa BCSFB.Nouvo peptides sa yo pral zouti ki gen anpil valè pou dekouvèt potansyèl nouvo reseptè oswa chemen ak pou devlopman nouvo platfòm trè efikas pou livrezon makromolekil, tankou byolojik, nan sèvo a.
Kanul la gwo sitèn (CM) lè l sèvi avèk yon modifikasyon nan metòd ki dekri deja.Rat Wistar anestezi (200-350 g) yo te monte sou yon aparèy estereyotaksik epi yo te fè yon ensizyon medyàn sou po tèt kale ak aseptik prepare pou ekspoze zo bwa tèt la.Fè de twou nan zòn anwo sentiwon an epi tache vis fikse yo nan twou yo.Yon twou adisyonèl te komanse fouye nan krèt oksipital lateral la pou gidans estereyotaktik nan yon kanul asye pur nan CM la.Aplike siman dantè alantou kanul la epi an sekirite ak vis.Apre foto-geri ak siman redi, blesi po a te fèmen ak 4/0 suture supramid.Bon plasman nan kanul la konfime pa flit espontane nan likid serebrospinal (CSF).Retire rat la nan aparèy estereyotaksik la, resevwa swen apre operasyon apwopriye ak jesyon doulè, epi pèmèt li refè pou omwen yon semèn jiskaske yo obsève siy san nan likid serebrospinal la.Rat Wistar (Crl:WI/Han) yo te jwenn nan Charles River (Frans).Tout rat yo te kenbe nan kondisyon espesifik san patojèn.Tout eksperyans bèt yo te apwouve pa Biwo Veterinè Vil Basel, Swis, epi yo te fèt an akò ak Animal License No 2474 (Evalyasyon Transpò aktif nan sèvo pa mezire nivo kandida ki ka geri nan likid serebrospinal ak sèvo rat).
Dousman kenbe rat la konsyan ak kanul CM a nan men.Retire Datura nan kanul la epi kolekte 10 µl likid serebrospinal ki ap koule tankou dlo.Depi patant la nan kanul la finalman konpwomèt, sèlman echantiyon klè serebrospinal likid ki pa gen okenn prèv nan kontaminasyon san oswa dekolorasyon yo te enkli nan etid sa a.Nan paralèl, yo te pran apeprè 10-20 μl san nan yon ti ensizyon nan pwent ke a nan tib ak eparin (Sigma-Aldrich).CSF ak san yo te kolekte nan plizyè moman apre piki nan venn nan faj T7.Apeprè 5-10 μl likid yo te jete anvan chak echantiyon CSF yo te kolekte, ki koresponn ak volim ki mouri nan katetè a.
Bibliyotèk yo te pwodwi lè l sèvi avèk vektè T7Select 10-3b jan sa dekri nan manyèl sistèm T7Select la (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Yon ti tan, yo te sentetize yon insert ADN 12-mer o aza nan fòma sa a:
Kodon NNK te itilize pou evite doub kodon sispann ak ekspresyon asid amine nan insert la.N se yon rapò ekimolè manyèlman melanje nan chak nukleotid, ak K se yon rapò ekimolè manyèlman melanje nan adenine ak cytosine nukleotid.Rejyon sèl bloke yo te konvèti nan doub ADN bloke pa plis enkubasyon ak dNTP (Novagen) ak anzim Klenow (New England Biolabs) nan tanpon Klenow (New England Biolabs) pou 3 èdtan nan 37 ° C.Apre reyaksyon an, ADN doub-cheche te refè pa presipitasyon EtOH.ADN ki kapab lakòz yo te dijere ak anzim restriksyon EcoRI ak HindIII (tou de soti nan Roche).Lè sa a, te klive ak pirifye (QIAquick, Qiagen) insert (T4 ligase, New England Biolabs) Lè sa a, ligated nan-ankadreman nan yon vektè T7 pre-cleaved apre asid amine 348 nan jèn nan kapsid 10B.Reyaksyon ligasyon yo te enkube nan 16 ° C pou 18 èdtan anvan anbalaj in vitro.Anbalaj phage nan vitro yo te fèt dapre enstriksyon yo bay ak twous klonaj T7Select 10-3b (Novagen) epi yo te anplifye solisyon anbalaj yon fwa nan lysis lè l sèvi avèk Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Lysates yo te santrifuje, titre ak jele nan -80 ° C kòm yon solisyon stock nan gliserin.
Anplifikasyon dirèk PCR nan rejyon varyab faj yo anplifye nan bouyon oswa plak lè l sèvi avèk primè fizyon propriétaires 454/Roche-amplicon.Jadendanfan fizyon pi devan an gen sekans ki antoure rejyon varyab (NNK) 12 (modèl espesifik), GS FLX Titanium Adapter A, ak yon sekans kle bibliyotèk kat baz (TCAG) (figi siplemantè 1a):
Jadendanfan fizyon ranvèse a gen ladan tou biotin tache ak pèl kaptire ak GS FLX Titanium Adapter B ki nesesè pou anplifikasyon klonal pandan PCR emulsyon:
Lè sa a, anplikon yo te sibi 454/Roche pyrosequencing dapre 454 GS-FLX Titàn pwotokòl la.Pou sekans Sanger manyèl (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), T7 phage DNA te anplifye pa PCR epi sekans ak pè jadendanfan sa yo:
Insert ki soti nan plak endividyèl yo te sibi anplifikasyon PCR lè l sèvi avèk Roche Fast Start DNA Polymerase Twous (dapre enstriksyon manifakti a).Fè yon demaraj cho (10 min nan 95 °C) ak 35 sik ranfòse (50 s nan 95 °C, 1 min nan 50 °C, ak 1 min nan 72 °C).
Faj ki soti nan bibliyotèk, faj sovaj, faj sove nan CSF ak san, oswa klon endividyèl yo te anplifye nan Escherichia coli BL5615 nan bouyon TB (Sigma Aldrich) oswa nan asyèt 500 cm2 (Thermo Scientific) pou 4 èdtan nan 37 ° C.Phage yo te ekstrè soti nan plak yo lè yo rense plak yo ak tanpon Tris-EDTA (Fluka Analytical) oswa pa kolekte plak yo ak pwent pipèt esteril.Phage yo te izole nan sipènatant kilti oswa tanpon ekstraksyon ak yon sèl wonn nan polyethylene glycol (PEG 8000) presipitasyon (Promega) ak resuspend nan tanpon Tris-EDTA.
Faj anplifye a te sibi 2-3 jij nan retire endotoxin lè l sèvi avèk pèl retire endotoxin (Miltenyi Biotec) anvan piki nan venn (IV) (500 μl / bèt).Nan premye tou an, 2 × 1012 faj yo te prezante;nan dezyèm lan, 2 × 1010 faj;nan twazyèm ak katriyèm jij seleksyon yo, 2 × 109 faj pou chak bèt.Kontni faj nan CSF ak echantiyon san yo kolekte nan pwen tan endike yo te detèmine pa konte plak dapre enstriksyon manifakti a (manyèl sistèm T7Select).Seleksyon phage te fèt pa piki nan venn bibliyotèk pirifye nan venn ke a oswa pa re-piki phage ekstrè soti nan CSF nan wonn seleksyon anvan an, ak rekòt ki vin apre yo te fèt nan 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, ak 240 min CSF ak echantiyon san respektivman.Yon total de kat jij nan panoramique in vivo yo te fèt kote de branch yo chwazi yo te separeman estoke ak analize pandan twa premye jij yo nan seleksyon an.Tout foure phage ekstrè soti nan CSF nan de premye jij seleksyon yo te sibi 454/Roche pyrosequencing, pandan y ap tout klon ekstrè soti nan CSF nan de dènye jij seleksyon yo te manyèlman sekans.Tout faj san ki soti nan premye tou seleksyon an te sibi tou 454/Roche pyrosequencing.Pou piki klon phage, phages chwazi yo te anplifye nan E. coli (BL5615) sou plak 500 cm2 nan 37 ° C pou 4 èdtan.Endividyèlman chwazi ak manyèlman klon sekans yo te pwopaje nan mwayen TB.Apre ekstraksyon phage, pirifikasyon ak retire endotoxin (jan sa dekri pi wo a), 2 × 1010 phages / bèt nan 300 μl yo te enjekte nan venn nan yon sèl venn ke.
Preprocessing ak filtraj kalitatif nan done sekans.Done kri 454/Roche te konvèti soti nan yon fòma kat jeyografik estanda binè (sff) nan yon fòma Pearson moun lizib (fasta) lè l sèvi avèk lojisyèl vandè.Pwosesis plis nan sekans nukleotid la te fèt lè l sèvi avèk pwogram C propriétaires ak scripts (pake lojisyèl ki pa pibliye) jan sa dekri anba a.Analiz done prensipal yo gen ladan pwosedi filtraj strik milti-etap.Pou filtre soti lekti ki pa t gen yon sekans ADN insert 12mer ki valab, lekti yo te sekans aliman pou kòmanse etikèt (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), etikèt sispann (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ak insert background (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) lè l sèvi avèk Needleman-Wunsch global la.aliyman ki pèmèt jiska 2 enkonsistans pou chak aliyman31.Kidonk, yo te retire nan bibliyotèk lekti ki pa gen etikèt kòmanse ak sispann ak lekti ki gen ladann background, sa vle di, aliyman ki depase kantite dezakò ki pèmèt yo.Kòm pou lekti ki rete yo, sekans ADN N-mer ki pwolonje soti nan mak kòmansman an epi ki fini anvan yo te retire mak arè a nan sekans lekti orijinal la epi yo te trete plis (apwe sa yo rele "insert").Apre tradiksyon insert la, pòsyon apre premye kodon sispann nan fen 5′ nan primè a retire nan insert la.Anplis de sa, nukleotid ki mennen nan kodon enkonplè nan fen 3′ nan Jadendanfan an te tou retire.Pou eskli foure ki gen sèlman sekans background, yo te retire foure tradui ki kòmanse ak modèl asid amine "PAG".Peptides ki gen yon longè apre-tradiksyon ki mwens pase 3 asid amine yo te retire nan bibliyotèk la.Finalman, retire redondance nan pisin insert an epi detèmine frekans chak insert inik.Rezilta analiz sa a enkli yon lis sekans nukleotid (four) ak frekans yo (li) (figi siplemantè 1c ak 2).
Gwoup N-mer ADN foure pa resanblans sekans: Pou elimine 454/Roche-espesifik erè sekans (tankou pwoblèm ak sekans ekstansyon omopolymer) epi retire mwens enpòtan redondances, deja filtre N-mer ADN sekans foure (insert) yo klase pa resanblans.ensèsyon (jiska 2 baz ki pa matche yo pèmèt) lè l sèvi avèk yon algorithm iteratif ki defini jan sa a: ensèsyon yo klase an premye pa frekans yo (pi wo a pi ba), epi si yo se menm bagay la, dapre sòt segondè yo pa longè (pi long rive pi kout) ).Kidonk, ensèsyon ki pi souvan ak pi long yo defini premye "gwoup".Se frekans gwoup la mete nan frekans kle a.Lè sa a, chak ensèsyon ki rete nan lis la klase yo te eseye ajoute nan gwoup la pa aliyman Needleman-Wunsch par.Si kantite dezakò, ensèsyon, oswa efase nan yon aliyman pa depase yon papòt 2, yo ajoute yon ensèsyon nan gwoup la, epi frekans gwoup la an jeneral ogmante pa konbyen fwa yo te ajoute ensèsyon an.Insert ki ajoute nan yon gwoup yo make kòm itilize ak eskli nan plis pwosesis.Si sekans insert la pa ka ajoute nan yon gwoup ki deja egziste, se sekans insert la itilize pou kreye yon nouvo gwoup ak frekans insert ki apwopriye a epi make kòm itilize.Iterasyon an fini lè chak sekans ensèsyon swa yo te itilize pou fòme yon nouvo gwoup oswa yo ka enkli nan yon gwoup ki deja egziste.Apre yo tout, foure gwoupe ki gen ladan nukleotid yo evantyèlman tradui nan sekans peptide (bibliotèk peptide).Rezilta analiz sa a se yon seri ensèsyon ak frekans korespondan yo ki fè kantite lekti youn apre lòt (figi siplemantè 2).
Motif Jenerasyon: Baze sou yon lis peptides inik, yo te kreye yon bibliyotèk ki gen tout modèl asid amine posib (aa) jan yo montre anba a.Chak modèl posib nan longè 3 te ekstrè soti nan peptide a ak modèl envès li yo te ajoute ansanm ak yon bibliyotèk motif komen ki gen tout modèl (tripeptides).Bibliyotèk nan motif trè repetitif yo te sekans ak èkse retire.Lè sa a, pou chak tripeptide nan bibliyotèk motif la, nou tcheke pou prezans li nan bibliyotèk la lè l sèvi avèk zouti enfòmatik.Nan ka sa a, yo ajoute frekans nan peptide ki gen tripeptide motif yo jwenn epi yo asiyen nan motif la nan bibliyotèk motif ("kantite motif").Rezilta jenerasyon motif se yon etalaj ki genyen de dimansyon ki genyen tout ensidan tripeptides (motif) ak valè respektif yo, ki se kantite lekti sekans ki lakòz motif korespondan lè lekti yo filtre, gwoupe, ak tradui.Metrics jan sa dekri an detay pi wo a.
Nòmalizasyon kantite motif ak dispèsyon korespondan yo: Yo te nòmalize kantite motif pou chak echantiyon lè l sèvi avèk
kote ni se kantite lekti ki genyen sijè i.Kidonk, vi reprezante pousantaj frekans lekti (oswa peptides) ki gen motif i nan echantiyon an.P-valè pou kantite motif ki pa nòmalize yo te kalkile lè l sèvi avèk tès egzak Fisher la.Konsènan korelogram kantite motif yo, yo te kalkile korelasyon Spearman yo lè l sèvi avèk kantite motif nòmalize ak R.
Pou vizyalize kontni asid amine nan chak pozisyon nan bibliyotèk peptides la, yo te kreye logogram sou entènèt 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).Premyèman, kontni asid amine nan chak pozisyon nan peptide 12-mer yo estoke nan yon matris 20 × 12.Lè sa a, yon seri 1000 peptides ki genyen menm kontni relatif asid amine nan chak pozisyon yo pwodwi nan fòma fasta-sekans epi yo bay kòm opinyon nan web-logo 3, ki jenere yon reprezantasyon grafik nan kontni an asid amine relatif nan chak pozisyon.pou yon bibliyotèk peptide bay yo.Pou vizyalize datasets miltidimansyon, yo te kreye kat chalè lè l sèvi avèk yon zouti ki devlope entèn nan R (biosHeatmap, yon pake R ki poko pibliye).Dendrogram yo prezante nan kat chalè yo te kalkile lè l sèvi avèk metòd yerarchize clustering Ward la ak metrik distans Euclidean la.Pou analiz estatistik done ki fè nòt motif yo, yo te kalkile valè P pou nòt ki pa nòmal lè l sèvi avèk tès egzak Fisher la.P-valè pou lòt done yo te kalkile nan R lè l sèvi avèk T-tès Elèv la oswa ANOVA.
Chwazi klon phages ak phages san foure yo te enjekte nan venn atravè venn nan ke (2 × 1010 phages / bèt nan 300 μl PBS).Dis minit anvan perfusion ak fiksasyon ki vin apre yo, yo te enjekte menm bèt yo nan venn ak 100 μl lektin ki gen etikèt DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minit apre piki phage, rat yo te perfused nan kè a ak 50 ml PBS ki te swiv pa 50 ml 4% PFA / PBS.Echantiyon sèvo yo te anplis fikse lannwit lan nan 4% PFA/PBS epi tranpe nan 30% sikwoz lannwit lan nan 4 ° C.Echantiyon yo flash jele nan melanj OCT la.Yo te fè analiz imunohistochimik echantiyon nan frizè nan tanperati chanm sou 30 µm kryoseksyon bloke ak 1% BSA ak enkubasyon ak antikò poliklonal ki make FITC kont faj T7 (Novus NB 600-376A) nan 4 °C.Enkube lannwit lan.Finalman, seksyon yo te lave 3 fwa ak PBS epi egzamine ak yon mikwoskòp lazè konfokal (Leica TCS SP5).
GenScript USA te sentetize tout peptides ki gen yon pite minimòm de 98%, biotinyl ak lyofilize.Biotin mare atravè yon espas trip glisin adisyonèl nan N-tèminal la.Tcheke tout peptides lè l sèvi avèk espektrometri mas.
Streptavidin (Sigma S0677) te melanje ak yon eksè 5-pliye ekivalan nan peptide biotinylate, peptide inhibiteur BACE1 biotinylate, oswa yon konbinezon (rapò 3: 1) nan peptide inhibitor BACE1 biotinylate ak peptide inhibiteur BACE1 nan 5-10% DMSO / enkubasyon nan PBS.1 èdtan nan tanperati chanm anvan piki.Streptavidin-konjige peptides yo te enjekte nan venn nan yon dòz 10 mg / kg nan youn nan venn ke yo nan rat ak yon kavite serebral.
Konsantrasyon konplèks streptavidin-peptide te evalye pa ELISA.Nunc Maxisorp plak mikrotiter (Sigma) yo te kouvwi lannwit lan nan 4 ° C ak 1.5 μg / ml sourit anti-streptavidin antikò (Thermo, MA1-20011).Apre bloke (tanpon bloke: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% jelatin, 1% BSA) nan tanperati chanm pou 2 èdtan, lave plak la ak 0.05% Tween-20/PBS (tanpon lave) pou 3 Dezyèm, CSF ak echantiyon plasma yo te ajoute: CSF 1:115).Lè sa a, plak la te enkube lannwit lan nan 4 ° C ak antikò deteksyon (1 μg / ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Apre twa etap lave, streptavidin te detekte pa enkubasyon nan solisyon substra TMB (Roche) pou jiska 20 min.Apre w fin sispann devlopman koulè ak 1M H2SO4, mezire absòbe a nan 450 nm.
Fonksyon an nan konplèks inibitè streptavidin-peptide-BACE1 te evalye pa Aβ (1-40) ELISA dapre pwotokòl manifakti a (Wako, 294-64701).Yon ti tan, echantiyon CSF yo te dilye nan dilyan estanda (1:23) ak enkubasyon lannwit lan nan 4 ° C nan plak 96-byen kouvwi ak antikò kaptire BNT77.Apre senk etap lave, yo te ajoute antikò BA27 HRP-konjige epi enkube pou 2 èdtan nan 4 ° C, ki te swiv pa senk etap lave.Aβ (1-40) te detekte pa enkubasyon nan solisyon TMB pou 30 minit nan tanperati chanm.Apre devlopman koulè yo te sispann ak solisyon sispann, mezire absòbe a nan 450 nm.Echantiyon Plasma yo te sibi ekstraksyon faz solid anvan Aβ(1-40) ELISA.Plasma te ajoute nan 0.2% DEA (Sigma) nan plak 96-byen epi enkube nan tanperati chanm pou 30 minit.Apre siksesif lave plak SPE yo (Oasis, 186000679) ak dlo ak 100% metanol, echantiyon plasma yo te ajoute nan plak SPE yo epi yo te retire tout likid.Echantiyon yo te lave (premye ak 5% metanol Lè sa a, 30% metanol) epi elite ak 2% NH4OH / 90% metanol.Apre siye eluate a nan 55 ° C pou 99 min nan konstan N2 aktyèl, echantiyon yo te redwi nan diluants estanda ak Aβ (1-40) te mezire jan sa dekri pi wo a.
Ki jan yo site atik sa a: Urich, E. et al.Livrezon kago nan sèvo a lè l sèvi avèk peptides transpò yo idantifye nan vivo.syans la.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB ak Moos T. Livrezon dwòg makromolekilè nan sèvo a lè l sèvi avèk terapi vize.Journal of Neurochemistry 113, 1-13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., ak Martinez-Martinez, P. Livrezon peptide ak pwoteyin dwòg atravè baryè san-sèvo.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Baryè san-sèvo a: yon bouche nan devlopman dwòg nan sèvo.NeuroRx 2, 3-14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, ak Byrd, A. Pwospektiv pou amelyore livrezon dwòg ak vize nan sèvo a atravè chemen choroid plexus-CSF.Rechèch famasetik 22, 1011-1037, 10.1007 / s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modènizasyon biopharmaceutique ak chwal Trojan molekilè pou livrezon sèvo.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021 / bc800148t (2008).
Pardridge, WM reseptè-medyatè peptides transpò atravè baryè a san-sèvo.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Ogmante pénétration nan sèvo ak efikasite nan antikò terapetik lè l sèvi avèk navèt molekilè monovalan.Neuron 81, 49-60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Transpò reseptè transferrin (TfR) detèmine absorption nan sèvo nan varyant afinite nan antikò TfR.J Exp Med 211, 233-244, 10.1084/jem.20131660 (2014).