Mèsi paske ou te vizite Nature.com. Vèsyon navigatè w ap itilize a pa gen sipò limite pou CSS. Pou pi bon eksperyans lan, nou rekòmande pou w itilize yon navigatè ki ajou (oswa dezaktive mòd konpatibilite nan Internet Explorer). Antretan, pou asire sipò kontinyèl, nou pral montre sit la san estil ak JavaScript.
Vektè jèn pou tretman maladi poumon ki gen fibwoz sistik ta dwe vize pasaj lè kondiktè yo paske transdiksyon poumon periferik la pa bay benefis terapetik. Efikasite transdiksyon viral la dirèkteman gen rapò ak tan rezidans vektè a. Sepandan, likid livrezon tankou transpòtè jèn yo difize natirèlman nan alveoli yo pandan enspirasyon, epi patikil terapetik nenpòt fòm yo rapidman elimine pa transpò mukosiliyè. Pwolonje tan rezidans transpòtè jèn yo nan pasaj lè yo enpòtan men li difisil pou reyalize. Patikil mayetik konjige ak transpòtè jèn ki ka dirije sou sifas pasaj lè yo ka amelyore sib rejyonal la. Akòz defi vizyalizasyon in vivo, konpòtman ti patikil mayetik sa yo sou sifas pasaj lè a an prezans yon chan mayetik aplike pa byen konprann. Objektif etid sa a se te sèvi ak imaj senkrotron pou vizyalize mouvman in vivo yon seri patikil mayetik nan trache rat anestezye pou egzamine dinamik ak modèl konpòtman patikil endividyèl ak an gwo in vivo. Lè sa a, nou te evalye tou si livrezon patikil mayetik lentiviral an prezans yon chan mayetik ta ogmante efikasite transdiksyon nan trache rat la. Senkrotron Imajri radyografi revele konpòtman patikil mayetik yo nan chan mayetik estasyonè ak an mouvman in vitro ak in vivo. Patikil yo pa fasil pou trennen sou sifas pasaj lè vivan an ak leman, men pandan transpò a, depo yo konsantre nan chan vizyon an kote chan mayetik la pi fò. Efikasite transdiksyon an te ogmante sis fwa tou lè patikil mayetik lentiviral yo te delivre an prezans yon chan mayetik. Ansanm, rezilta sa yo sijere ke patikil mayetik lentiviral ak chan mayetik yo ka apwòch enpòtan pou amelyore siblaj vektè jèn epi ogmante nivo transdiksyon nan pasaj lè kondiktè in vivo.
Fibwoz sistik (CF) koze pa varyasyon nan yon sèl jèn yo rele regilatè kondiktans transmembran CF (CFTR). Pwoteyin CFTR a se yon kanal iyon ki prezan nan anpil selil epitelyal nan tout kò a, tankou pasaj lè kondiktè yo, yon sit enpòtan nan patogenez CF. Defo CFTR yo mennen nan transpò dlo anòmal, dezidrate sifas pasaj lè a epi diminye pwofondè kouch likid sifas pasaj lè a (ASL). Sa afekte tou kapasite sistèm transpò mukosiliyè (MCT) a pou retire patikil ak patojèn yo respire nan pasaj lè yo. Objektif nou se devlope yon terapi jèn lentiviral (LV) pou delivre kopi kòrèk jèn CFTR la epi amelyore sante ASL, MCT ak poumon, epi kontinye devlope nouvo teknoloji ki kapab mezire paramèt sa yo in vivo1.
Vektè LV yo se youn nan kandida prensipal yo pou terapi jèn pou respiratwa CF, sitou paske yo ka entegre jèn ki ka geri a pou tout tan nan selil bazal respiratwa yo (selil souch respiratwa). Sa enpòtan paske yo ka retabli idratasyon nòmal ak netwayaj mikis lè yo diferansye an selil sifas respiratwa ki asosye ak CF ki korije pa jèn fonksyonèl, sa ki lakòz benefis pou tout lavi. Vektè LV yo ta dwe dirije kont respiratwa kondiktè a, paske se la maladi poumon CF a kòmanse. Livrezon vektè a pi fon nan poumon an ka lakòz transdiksyon alveolè, men sa pa gen okenn benefis terapetik nan CF. Sepandan, likid tankou transpòtè jèn yo imigre natirèlman nan alveoli yo lè yo enspire apre livrezon3,4 epi patikil terapetik yo rapidman elimine nan kavite oral la pa MCT. Efikasite transdiksyon LV a dirèkteman gen rapò ak dire tan vektè a rete akote selil sib yo pou pèmèt absòpsyon selilè a - "tan rezidans"5 - ki fasil pou redwi pa sikilasyon lè rejyonal tipik la ansanm ak kaptire mikis patikil kowòdone ak MCT. Pou CF, kapasite pou pwolonje tan rezidans LV a nan respiratwa a enpòtan pou reyalize nivo transdiksyon ki wo nan rejyon sa a, men jiskaprezan li te difisil.
Pou simonte obstak sa a, nou sijere ke patikil mayetik LV (MP) yo ka ede nan de fason konplemantè. Premyèman, yo ka gide mayetikman sou sifas pasaj lè a pou amelyore sib la epi ede patikil transpòtè jèn yo rete nan rejyon pasaj lè a vle a; ak ASL) pou deplase nan kouch selilè 6. MP yo te lajman itilize kòm veyikil livrezon dwòg sible lè yo mare ak antikò, dwòg chimyoterapik, oswa lòt ti molekil ki tache ak manbràn selilè oswa mare ak reseptè sifas selilè ki enpòtan epi akimile nan sit timè an prezans elektrisite estatik. Chan mayetik pou tretman kansè 7. Gen lòt teknik "ipètèmal" ki vize chofe MP yo lè yo ekspoze a chan mayetik osilan, kidonk detwi selil timè yo. Prensip transfeksyon mayetik la, kote yo itilize yon chan mayetik kòm yon ajan transfeksyon pou amelyore transfè ADN nan selil yo, souvan itilize in vitro lè l sèvi avèk yon seri vektè jèn ki pa viral ak viral pou liy selil ki difisil pou transdui. Yo te etabli efikasite mayetotransfeksyon LV a, avèk livrezon in vitro LV-MP nan yon liy selil epitelyal bwonch imen an prezans yon chan mayetik estatik, ogmante efikasite transdiksyon an pa 186 fwa konpare ak vektè LV a sèlman. Yo te aplike LV-MP tou nan yon modèl CF in vitro, kote transfeksyon mayetik ogmante transdiksyon LV nan kilti entèfas lè-likid pa 20 fwa an prezans krache CF10. Sepandan, mayetotransfeksyon ògàn in vivo yo te resevwa relativman ti atansyon epi yo te evalye l sèlman nan kèk etid sou bèt11,12,13,14,15, espesyalman nan poumon16,17. Malgre sa, opòtinite pou transfeksyon mayetik nan terapi poumon CF yo klè. Tan et al. (2020) te deklare ke "yon etid prèv-de-konsèp sou administrasyon poumon nanopartikil mayetik efikas pral louvri chemen pou estrateji respirasyon CFTR nan lavni pou amelyore rezilta klinik nan pasyan CF"6.
Konpòtman ti patikil mayetik sou sifas pasaj lè yo an prezans yon chan mayetik aplike difisil pou vizyalize ak etidye, kidonk li pa byen konprann. Nan lòt etid, nou te devlope yon metòd imajri radyografi kontras faz ki baze sou pwopagasyon senkrotron (PB-PCXI) pou vizyalize ak quantifye ti chanjman in vivo nan pwofondè ASL18 ak konpòtman MCT19,20 yon fason ki pa anvayisan pou mezire dirèkteman idratasyon sifas Kanal gaz epi itilize li kòm yon endikatè bonè nan efikasite tretman an. Anplis de sa, metòd evalyasyon MCT nou an itilize patikil ki gen yon dyamèt 10-35 µm ki konpoze de aliminyòm oswa vè ki gen yon endis refraksyon ki wo kòm makè MCT vizib lè l sèvi avèk PB-PCXI21. Tou de teknik yo apwopriye pou vizyalize yon seri kalite patikil, tankou MP.
Akòz gwo rezolisyon espasyal ak tanporèl li, teknik analiz ASL ak MCT nou yo ki baze sou PB-PCXI byen adapte pou egzamine dinamik ak modèl konpòtman patikil endividyèl ak an gwo in vivo pou ede nou konprann ak optimize teknik livrezon jèn MP yo. Apwòch nou itilize isit la soti nan etid nou yo lè l sèvi avèk liy gwo bout bwa SPring-8 BL20B2 la, kote nou te vizyalize mouvman likid apre livrezon dòz vektè fo nan pasaj lè nazal ak poumon sourit yo pou ede eksplike modèl ekspresyon jèn ki pa inifòm nou yo obsève nan etid bèt nou yo sou dòz transpòtè jèn 3,4.
Objektif etid sa a se te pou itilize senkrotron PB-PCXI a pou vizyalize mouvman in vivo yon seri MP nan trache rat vivan. Etid imaj PB-PCXI sa yo te fèt pou teste yon seri MP, fòs chan mayetik, ak kote pou detèmine efè yo sou mouvman MP. Nou te fè ipotèz ke yon chan mayetik aplike ekstènman ta ede MP ki delivre a rete oswa deplase nan zòn sib la. Etid sa yo te pèmèt nou idantifye konfigirasyon leman ki maksimize kantite patikil ki rete nan trache a apre depo. Nan yon dezyèm seri etid, nou te chèche itilize konfigirasyon optimal sa a pou demontre modèl transdiksyon ki soti nan livrezon in vivo LV-MP nan pasaj lè rat la, ki baze sou sipozisyon ke livrezon LV-MP nan kontèks siblaj pasaj lè a ta lakòz yon amelyorasyon nan efikasite transdiksyon LV.
Tout etid sou bèt yo te fèt dapre pwotokòl Inivèsite Adelaide la te apwouve (M-2019-060 ak M-2020-022) ansanm ak Komite Etik Animal Synchrotron SPring-8 la. Eksperyans yo te fèt dapre direktiv ARRIVE yo.
Tout imaj radyografi yo te fèt nan liy gwo bout bwa BL20XU nan senkrotron SPring-8 nan Japon, lè l sèvi avèk yon konfigirasyon menm jan ak sa ki te dekri deja21,22. An brèf, bwat eksperimantal la te sitiye a 245 m de bag depo senkrotron an. Yo itilize yon distans echantiyon-detektè 0.6 m pou etid imaj patikil ak 0.3 m pou etid imaj in vivo pou jenere efè kontras faz. Yo te itilize yon enèji gwo bout bwa monokromatik 25 keV. Yo te kaptire imaj yo lè l sèvi avèk yon konvètisè radyografi wo rezolisyon (SPring-8 BM3) ki konekte ak yon detektè sCMOS. Konvètisè a konvèti radyografi yo an limyè vizib lè l sèvi avèk yon sintilatè 10 µm epesè (Gd3Al2Ga3O12), ki Lè sa a, dirije nan yon detèktè sCMOS lè l sèvi avèk yon objektif mikwoskòp × 10 (NA 0.3). Detektè sCMOS la te Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japon) ak yon gwosè etalaj 2048 × 2048 piksèl ak yon gwosè piksèl brit 6.5 × 6.5 µm. Konfigirasyon sa a bay yon gwosè piksèl izotropik efektif 0.51 µm ak yon chan vizyon apeprè 1.1 mm × 1.1 mm. Yo te chwazi yon longè ekspozisyon 100 ms pou maksimize rapò siyal-bri patikil mayetik yo andedan ak deyò pasaj lè a pandan y ap minimize atifak mouvman pwovoke pa respirasyon. Pou etid in vivo, yo te mete yon obturatè reyon X rapid nan chemen reyon X la pou limite dòz radyasyon an lè yo bloke gwo bout reyon X la ant ekspozisyon yo.
Yo pa t itilize transpòtè LV a nan okenn etid imaj SPring-8 PB-PCXI paske chanm imaj BL20XU a pa sètifye Biosafety Nivo 2. Olye de sa, nou te chwazi yon seri MP byen karakterize nan men de founisè komèsyal—ki kouvri yon seri gwosè, materyèl, konsantrasyon fè, ak aplikasyon—premye pou konprann kijan chan mayetik yo afekte mouvman MP nan kapilè an vè, epi answit nan pasaj lè vivan. sou sifas la. MP yo varye nan gwosè soti nan 0.25 a 18 μm epi yo fèt ak yon varyete materyèl (gade Tablo 1), men konpozisyon chak echantiyon, ki gen ladan gwosè patikil mayetik yo nan MP a, se enkoni. Baze sou etid MCT vaste nou yo 19, 20, 21, 23, 24, nou espere ke MP osi piti ke 5 μm ka wè sou sifas pasaj lè tracheal la, pa egzanp lè w soustrè imaj youn apre lòt pou wè yon vizibilite amelyore nan mouvman MP a. Yon sèl MP ki gen gwosè 0.25 μm pi piti pase rezolisyon aparèy imaj la, men PB-PCXI espere detekte kontras volim yo ak mouvman likid sifas kote yo depoze apre depo a.
Yo te prepare echantiyon pou chak MP nan Tablo 1 nan kapilè an vè 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) ak yon dyamèt enteryè 0.63 mm. Patikil korpuskilè yo disponib nan dlo, alòske patikil CombiMag yo disponib nan likid propriétaires manifakti a. Chak tib mwatye plen ak likid (apeprè 11 μl) epi yo mete l sou pòt echantiyon an (gade Figi 1). Yo te mete kapilè an vè yo orizontalman sou platfòm echantiyon an nan bwat imaj la, respektivman, epi yo te pozisyone l sou kwen likid la. Yo te tache yon leman koki nikèl 19 mm dyamèt (28 mm longè) neyodim fè bor (NdFeB) (N35, nimewo katalòg LM1652, Jaycar Electronics, Ostrali) ak yon mayetizasyon rezidyèl 1.17 Tesla sou yon platfòm translasyon apa pou reyalize Chanje pozisyon li a distans pandan imaj la. Akizisyon imaj radyografi a kòmanse lè leman an pozisyone apeprè 30 mm anlè echantiyon an, epi imaj yo akeri nan yon vitès 4 imaj pa segonn. Pandan imaj la, yo te pote leman an pre tib kapilè an vè a (apeprè 1 mm lwen) epi answit deplase sou tib la pou evalye efè fòs chan an ak pozisyon an.
Sistèm imaj in vitro ki gen echantiyon MP nan kapilè an vè sou etap translasyon xy echantiyon an. Chemen reyon X la make ak yon liy wouj tire.
Yon fwa yo te etabli vizibilite in vitro MP yo, yo te teste yon sougwoup ladan yo in vivo nan rat albino Wistar femèl tip sovaj (~12 semèn, ~200 g). 0.24 mg/kg medetomidin (Domitor®, Zenoaq, Japon), 3.2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japon) ak 4 mg/kg butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika) Yo te anestezye rat yo ak yon melanj Pharma), Japon) pa enjeksyon intraperitoneal. Apre anestezi a, yo te prepare yo pou imajri lè yo te retire fouri ki te ozalantou trache a, mete yon tib andotracheal (ET; 16 Ga iv kanil, Terumo BCT) epi imobilize yo kouche sou yon plak imajri ki fèt espesyalman ki gen yon sak tèmik pou kenbe tanperati kò a 22. Lè sa a, yo te tache plak imajri a ak etap translasyon echantiyon an nan bwat imajri a nan yon ti ang pou aliyen trache a orizontalman nan imaj radyografi a, jan yo montre nan Figi a. 2a.
(a) Konfigirasyon imaj in vivo nan bwat imaj SPring-8 la, chemen reyon X la make ak yon liy wouj tire. (b,c) Lokalizasyon leman sou trache a te fèt a distans lè l sèvi avèk de kamera IP monte ortogonalman. Sou bò gòch imaj ekran an, yo ka wè bouk fil ki kenbe tèt la, ak kanil livrezon an an plas nan tib ET la.
Yon sistèm ponp sereng kontwole a distans (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) ki itilize yon sereng an vè 100 μl te konekte ak yon tib PE10 (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) atravè yon zegwi 30 Ga. Make tib la pou asire ke pwent lan nan bon pozisyon nan trache a lè w ap mete tib ET a. Lè l sèvi avèk mikwoponp lan, yo te retire piston sereng lan pandan y ap plonje pwent tib la nan echantiyon MP ki pral delivre a. Lè sa a, yo te mete tib livrezon chaje a nan tib andotracheal la, mete pwent lan nan pati ki pi fò nan chan mayetik aplike nou te espere a. Akizisyon imaj la te kontwole lè l sèvi avèk yon detektè respirasyon ki konekte ak bwat distribisyon Arduino nou an, epi tout siyal yo (pa egzanp tanperati, respirasyon, ouvèti/fèmti vole ak akizisyon imaj) te anrejistre lè l sèvi avèk Powerlab ak LabChart (AD Instruments, Sydney, Ostrali) 22. Lè w ap pran imaj la, lè patiraj la pa t aksesib, de kamera IP (Panasonic BB-SC382) te pozisyone apeprè 90° youn ak lòt epi yo te itilize pou kontwole pozisyon leman an relatif. nan trache a pandan imajri a (Fig. 2b,c). Pou minimize atifak mouvman, yo te pran yon imaj pou chak respirasyon pandan plato koule nan fen mare a.
Yo tache yon leman ak yon dezyèm etap ke yo ka lokalize adistans deyò bwat imaj la. Yo te teste plizyè pozisyon ak konfigirasyon leman, tankou: Yo te monte l nan yon ang apeprè 30° anlè trache a (konfigirasyon yo montre nan Figi 2a ak 3a); yon leman anlè bèt la ak lòt la anba, ak poto yo mete pou atire (Figi 3b); yon leman anlè bèt la ak lòt la anba, ak poto yo mete pou repouse (Figi 3c); ak yon leman anlè epi pèpandikilè ak trache a (Figi 3d). Yon fwa bèt la ak leman an fin konfigire epi yo chaje MP ki pral teste a nan ponp sereng lan, bay yon dòz 50 μl nan yon vitès 4 μl/seg pandan y ap pran imaj yo. Apre sa, yo deplase leman an ale vini sou oswa lateralman atravè trache a pandan y ap kontinye pran imaj yo.
Konfigirasyon leman pou imaj in vivo (a) yon sèl leman anlè trache a nan yon ang apeprè 30°, (b) de leman ki fikse pou atire, (c) de leman ki fikse pou repouse, (d) yon sèl leman anlè epi pèpandikilè nan trache a. Obsèvatè a te gade anba soti nan bouch la rive nan poumon yo atravè trache a, epi reyon X la te pase nan bò gòch rat la epi li te soti nan bò dwat la. Leman an swa deplase sou longè pasaj lè a oswa agoch ​​ak adwat anlè trache a nan direksyon reyon X la.
Nou te chache tou detèmine vizibilite ak konpòtman patikil yo nan pasaj lè yo san konfizyon sou respirasyon ak mouvman kadyak. Se poutèt sa, nan fen peryòd imajri a, yo te touye bèt yo yon fason imen pou surdozaj pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip). Yo te kite kèk bèt sou platfòm imajri a, epi yon fwa respirasyon ak batman kè yo te sispann, yo te repete pwosesis imajri a, yo te ajoute yon lòt dòz MP si pa t gen okenn MP vizib sou sifas pasaj lè a.
Imaj yo te pran yo te korije pou chan plat ak chan nwa, epi answit yo te rasanble yo nan yon fim (20 imaj pa segonn; 15-25 × vitès nòmal selon vitès respirasyon an) lè l sèvi avèk yon script koutim ki ekri nan MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Tout etid sou livrezon vektè jèn LV yo te fèt nan Sant Rechèch Laboratwa sou Animal nan Inivèsite Adelaide epi yo te vize pou itilize rezilta eksperyans SPring-8 la pou evalye si livrezon LV-MP an prezans yon chan mayetik te kapab amelyore transfè jèn in vivo. Pou evalye efè MP ak chan mayetik la, yo te trete de gwoup bèt: yo te bay yon gwoup LV-MP ak yon leman, epi lòt gwoup la te resevwa yon gwoup kontwòl ak LV-MP san leman.
Yo te pwodui vektè jèn LV yo lè l sèvi avèk metòd ki te dekri deja 25, 26. Vektè LacZ la eksprime jèn beta-galaktozidaz lokalize nan nikleyè a ki kondwi pa pwomotè MPSV konstititif la (LV-LacZ), ki pwodui yon pwodui reyaksyon ble nan selil transdisyone yo, vizib nan fron tisi poumon ak seksyon tisi yo. Yo te fè titrasyon nan kilti selilè yo lè yo te konte manyèlman kantite selil LacZ pozitif yo ak yon emositomèt pou kalkile tit la an TU/ml. Yo kriyoprezève vektè yo a -80 °C, yo dekonjle yo anvan yo itilize yo, epi yo lye ak CombiMag lè yo melanje yo nan yon rapò 1:1 epi yo enkube yo sou glas pou omwen 30 minit anvan yo delivre yo.
Rat Sprague Dawley nòmal (n = 3/gwoup, ~2-3 te anestezi intraperitonealman ak yon melanj 0.4 mg/kg medetomidin (Domitor, Ilium, Ostrali) ak 60 mg/kg ketamin (Ilium, Ostrali) (ki gen yon mwa) ip) ak kanilasyon oral ki pa chirijikal ak yon kanil iv 16 Ga. Pou asire ke tisi pasaj lè trake a resevwa transdiksyon LV, li te kondisyone lè l sèvi avèk pwotokòl perturbasyon mekanik nou te dekri deja a, nan ki sifas pasaj lè trake a te fwote axialman ak yon panyen fil fè (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28. Administrasyon trake LV-MP te fèt nan yon kabinèt sekirite byolojik apeprè 10 minit apre perturbasyon an.
Yo te konfigire chan mayetik yo te itilize nan eksperyans sa a menm jan ak etid imaj radyografi in vivo a, avèk menm leman yo te kenbe anlè trache a lè l sèvi avèk klip stent distilasyon (Figi 4). Yo te delivre yon volim 50 μl (2 × 25 μl alikòt) LV-MP nan trache a (n = 3 bèt) lè l sèvi avèk yon pipèt ki gen yon pwent jèl jan yo te dekri deja. Yon gwoup kontwòl (n = 3 bèt) te resevwa menm LV-MP yo san yo pa itilize yon leman. Apre yo fin fè perfusion an, yo retire kanil la nan tib ET a epi yo ekstube bèt la. Leman an rete an plas pandan 10 minit, apre sa yo retire li. Rat yo te resevwa yon dòz meloxicam soukutane (1 ml/kg) (Ilium, Ostrali) ki te swiv pa ranvèsman anestezi a pa enjeksyon ip 1 mg/kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Ostrali). Yo te kenbe rat yo cho epi yo te siveye yo jiskaske yo te refè nèt apre anestezi a.
Aparèy administrasyon LV-MP nan yon kabinè sekirite byolojik. Ou ka wè manch Luer gri klè tib ET a k ap soti nan bouch la epi yo mete pwent jèl pipèt ki nan foto a nan tib ET a rive nan pwofondè yo vle a nan trache a.
Yon semèn apre pwosedi dòz LV-MP a, yo te touye bèt yo yon fason imen avèk 100% inalasyon CO2 epi yo te evalye ekspresyon LacZ la lè l sèvi avèk tretman estanda X-gal nou an. Yo te retire twa bag ki pi kartilajinè yo nan kodal la pou asire ke nenpòt domaj mekanik oswa retansyon likid ki soti nan plasman tib endotracheal la pa t enkli nan analiz la. Yo te koupe chak trache longitudinalman pou kreye de mwatye pou analiz, epi yo te monte yo nan yon plat ki gen kawoutchou silikon (Sylgard, Dow Inc) lè l sèvi avèk yon zegwi Minutien (Fine Science Tools) pou vizyalize sifas luminal la. Yo te konfime distribisyon ak modèl selil transdi yo pa fotografi frontal lè l sèvi avèk yon mikwoskòp Nikon (SMZ1500) ak yon kamera DigiLite ak lojisyèl TCapture (Tucsen Photonics, Lachin). Yo te pran imaj yo nan yon agrandisman 20x (ki gen ladan pi gwo paramèt pou tout lajè trache a), ak tout longè trache a imaje etap pa etap, asire ase sipèpoze ant chak imaj pou pèmèt "koud" imaj la. Apre sa, yo te rasanble imaj ki soti nan chak trache. an yon sèl imaj konpoze lè l sèvi avèk Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) ki itilize yon algorithm mouvman planè. Zòn ekspresyon LacZ nan imaj konpoze trache chak bèt yo te quantifié lè l sèvi avèk yon script MATLAB otomatik (R2020a, MathWorks) jan sa te dekri deja, lè l sèvi avèk paramèt 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, ak Valè < 0.7. Lè yo trase kontou tisi a, yo te pwodui yon mask manyèlman nan GIMP v2.10.24 pou chak imaj konpoze pou idantifye zòn tisi a epi anpeche nenpòt fo deteksyon ki soti deyò tisi trache a. Zòn ki tache nan tout imaj konpoze chak bèt yo te adisyone pou jenere zòn total ki tache pou bèt sa a. Lè sa a, yo te divize zòn ki tache a pa zòn total mask la pou jenere zòn nòmalize a.
Yo te mete chak trache nan parafin epi yo te koupe seksyon 5 μm. Yo te kolore seksyon yo ak wouj vit net pandan 5 minit epi yo te pran imaj yo lè l sèvi avèk yon mikwoskòp Nikon Eclipse E400, yon kamera DS-Fi3 ak yon lojisyèl kaptire eleman NIS (vèsyon 5.20.00).
Tout analiz estatistik yo te fèt nan GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Yo te fikse siyifikasyon estatistik la nan p ≤ 0.05. Yo te verifye nòmalite a lè l sèvi avèk tès Shapiro-Wilk la, epi yo te evalye diferans ki genyen nan koloran LacZ yo lè l sèvi avèk tès t ki pa pè a.
Yo te egzamine sis MP yo ki dekri nan Tablo 1 an lè l sèvi avèk PCXI, epi vizibilite a dekri nan Tablo 2. De MP polistirèn (MP1 ak MP2; 18 μm ak 0.25 μm, respektivman) pa t vizib anba PCXI, men rès echantiyon yo te idantifyab (egzanp yo montre nan Figi 5). MP3 ak MP4 (10-15% Fe3O4; 0.25 μm ak 0.9 μm, respektivman) yo yon ti jan vizib. Malgre ke li gen kèk nan pi piti patikil yo teste yo, MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) te pi pwononse a. Pwodwi CombiMag MP6 la difisil pou wè. Nan tout ka yo, kapasite nou pou detekte MP te amelyore anpil lè nou te translase leman an ale vini paralèl ak kapilè a. Lè leman yo te deplase lwen kapilè a, patikil yo te pwolonje nan fil long, men pandan leman yo te pwoche pi pre epi fòs chan mayetik la te ogmante, fil patikil yo te vin pi kout pandan patikil yo te imigre nan direksyon sifas anwo kapilè a (gade Videyo Siplemantè a). S1: MP4), sa ki ogmante dansite patikil sifas la. Okontrè, lè yo retire leman an nan kapilè a, fòs chan mayetik la diminye epi MP yo rearanje an fil long ki soti nan sifas anwo kapilè a (gade Videyo Siplemantè S2:MP4). Apre leman an sispann deplase, patikil yo kontinye deplase pou yon ti tan apre yo fin rive nan pozisyon ekilib la. Pandan MP a ap deplase an direksyon epi lwen sifas anwo kapilè a, patikil mayetik yo tipikman trennen debri yo nan likid la.
Vizibilite MP anba PCXI a varye anpil ant echantiyon yo. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ak (d) MP6. Tout imaj yo montre la a te pran ak yon leman ki sitiye apeprè 10 mm dirèkteman anlè kapilè a. Gwo sèk aparan yo se bul lè ki bloke nan kapilè yo, ki montre klèman karakteristik kwen nwa ak blan nan imaj kontras faz. Bwat wouj la gen agrandisman ki amelyore kontras la. Remake byen ke dyamèt chema leman yo nan tout figi yo pa nan echèl epi yo apeprè 100 fwa pi gwo pase sa yo montre a.
Pandan leman an ap deplase agoch ​​ak adwat sou tèt kapilè a, ang fisèl MP a chanje pou l aliyen ak leman an (gade Figi 6), kidonk li trase liy chan mayetik yo. Pou MP3-5, apre kòd la rive nan yon ang papòt, patikil yo trennen sou sifas anwo kapilè a. Sa souvan lakòz MP yo rasanble an gwoup ki pi gwo toupre kote chan mayetik la pi fò a (gade Videyo Siplemantè S3:MP5). Sa a patikilyèman evidan tou lè w ap pran imaj toupre fen kapilè a, sa ki lakòz MP yo rasanble epi konsantre nan koòdone likid-lè a. Patikil nan MP6, ki te pi difisil pou distenge pase MP3-5, pa t trennen pandan leman an t ap deplase sou kapilè a, men fisèl MP yo te disosye, kite patikil yo nan chan vizyon an (gade Videyo Siplemantè S4:MP6). Nan kèk ka, lè chan mayetik ki te aplike a te redwi lè yo te deplase leman an yon gwo distans soti nan kote yo te pran imaj la, nenpòt MP ki te rete te desann dousman nan sifas anba tib la pa gravite pandan yo te rete nan fisèl la (gade Videyo Siplemantè S5: MP3).
Ang fisèl MP a chanje pandan leman an ap deplase adwat anlè kapilè a. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ak (d) MP6. Bwat wouj la gen agrandisman pou amelyore kontras la. Remake byen ke videyo siplemantè yo enfòmatif paske yo revele estrikti patikil enpòtan ak enfòmasyon dinamik ke yo pa ka vizyalize nan imaj estatik sa yo.
Tès nou yo te montre ke deplase leman an dousman ale vini sou trache a fasilite vizyalizasyon MP nan kontèks mouvman konplèks in vivo. Tès in vivo pa te fèt paske pèl polistirèn yo (MP1 ak MP2) pa te vizib nan kapilè a. Chak nan kat MP ki rete yo te teste in vivo ak aks long leman an configuré anlè trache a nan yon ang apeprè 30° ak vètikal la (gade Figi 2b ak 3a), paske sa te lakòz chenn MP ki pi long epi li te pi efikas pase konfigirasyon leman an ki te fini. MP3, MP4 ak MP6 pa te detekte nan trache okenn bèt vivan. Lè yo te pran imaj pasaj lè rat yo apre yo te touye bèt yo yon fason imen, patikil yo te rete envizib menm lè yo te ajoute plis volim lè l sèvi avèk yon ponp sereng. MP5 te gen pi gwo kontni oksid fè epi li te sèl patikil vizib la, e pakonsekan yo te itilize li pou evalye ak karakterize konpòtman MP in vivo.
Lè yo te mete leman an sou trache a pandan livrezon MP a, sa te lakòz anpil MP, men se pa tout, te konsantre nan chan vizyon an. Patikil ki antre nan trache a yo pi byen obsève nan bèt yo sakrifye san imen. Figi 7 ak Videyo Siplemantè S6: MP5 montre kaptire mayetik rapid ak aliyman patikil yo sou sifas trache ventral la, sa ki endike ke MP yo ka dirije nan rejyon vle nan trache a. Lè yo t ap chèche pi distalman sou trache a apre livrezon MP a, yo te jwenn kèk MP pi pre karina a, sa ki sijere ke fòs chan mayetik la pa t ase pou kolekte epi kenbe tout MP yo, paske yo te delivre nan rejyon maksimòm fòs chan mayetik la pandan pwosesis likid la. Malgre sa, konsantrasyon MP apre akouchman yo te pi wo alantou zòn imaj la, sa ki sijere ke anpil MP te rete nan rejyon respiratwa yo kote fòs chan mayetik aplike a te pi wo a.
Imaj (a) anvan ak (b) apre yo fin bay MP5 nan trache yon rat ki fèk mouri ak leman an pozisyone dirèkteman anlè zòn imaj la. Zòn imaj la sitiye ant de bag katilaj yo. Anvan yo bay MP, gen kèk likid nan pasaj lè a. Bwat wouj la gen agrandisman pou amelyore kontras la. Imaj sa yo soti nan videyo ki montre nan Videyo Siplemantè S6:MP5 la.
Translasyon leman an sou trache a in vivo te lakòz chèn MP a chanje ang nan sifas pasaj lè a nan yon fason ki sanble ak sa yo wè nan kapilè yo (gade Figi 8 ak Videyo Siplemantè S7:MP5). Sepandan, nan etid nou an, MP yo pa t ka trennen sou sifas pasaj lè vivan an jan yo te kapab ak kapilè yo. Nan kèk ka, chèn MP a ap vin pi long pandan leman an ap deplase agoch ​​ak adwat. Sa ki enteresan, nou te jwenn tou ke fisèl patikil la sanble chanje pwofondè kouch likid sifas la lè leman an deplase longitudinalman sou trache a, epi li elaji lè leman an deplase dirèkteman anlè tèt li epi fisèl patikil la Thorne nan yon pozisyon vètikal (gade Videyo Siplemantè S7). MP5 a 0:09, anba adwat). Modèl mouvman karakteristik la te chanje lè leman an te deplase lateralman sou tèt trache a (sa vle di, sou bò gòch oswa adwat bèt la olye ke sou longè trache a). Patikil yo te toujou vizib klèman pandan y ap deplase, men lè leman an te retire nan trache a, pwent fisèl patikil yo te vin vizib (gade Videyo Siplemantè S8:MP5, kòmanse a 0:08). Sa a konsistan avèk konpòtman MP nou te obsève anba yon chan mayetik aplike nan yon kapilè an vè.
Egzanp imaj ki montre MP5 nan trache yon rat anestezye vivan. (a) Yo itilize leman an pou pran imaj anlè e sou bò gòch trache a, answit (b) apre yo fin deplase leman an adwat. Bwat wouj la gen agrandisman pou amelyore kontras la. Imaj sa yo soti nan videyo ki montre nan Videyo Siplemantè S7:MP5 la.
Lè de poto yo te konfigire nan yon oryantasyon nò-sid anwo ak anba trache a (sa vle di atire; Fig. 3b), kòd MP yo te parèt pi long epi yo te sitiye sou miray lateral trache a olye ke sou sifas dorsal trache a (gade Videyo Siplemantè S9:MP5). Sepandan, yo pa t detekte gwo konsantrasyon patikil nan yon sèl kote (sa vle di, sifas dorsal trache a) apre livrezon likid lè yo te itilize yon aparèy doub-leman, ki tipikman rive lè yo itilize yon aparèy yon sèl-leman. Lè sa a, lè yo te konfigire yon leman pou repouse poto yo ranvèse (Fig. 3c), kantite patikil vizib nan chan vizyon an pa t sanble ogmante apre livrezon an. Konfigirasyon tou de konfigirasyon doub-leman yo difisil akòz gwo fòs chan mayetik ki rale oswa pouse leman yo, respektivman. Lè sa a, yo te chanje konfigirasyon an nan yon sèl leman paralèl ak pasaj lè a men ki pase nan pasaj lè a a 90 degre pou liy chan yo te travèse miray trache a ortogonalman (Fig. 3d), yon oryantasyon ki fèt pou detèmine si yo te ka obsève agregasyon patikil sou miray lateral la. Sepandan, nan sa a Nan konfigirasyon an, pa te gen okenn mouvman idantifyab nan akimilasyon MP oswa mouvman leman. Baze sou tout rezilta sa yo, yo te chwazi yon konfigirasyon oryantasyon 30 degre ak yon sèl leman (Figi 3a) pou etid transpòtè jèn in vivo.
Lè yo te pran imaj bèt la plizyè fwa touswit apre yo te fin touye l san touye l, absans mouvman tisi ki te ka konfonn li te vle di ke yo te ka disène liy patikil ki pi fen e ki pi kout nan chan entèkondral klè a, ki "tranble" an liy ak mouvman translasyon leman an. Malgre sa, yo toujou pa ka wè prezans ak mouvman patikil MP6 yo klèman.
Tit LV-LacZ la te 1.8 × 108 TU/ml, epi apre melanj 1:1 ak CombiMag MP (MP6), bèt yo te resevwa yon dòz tracheal 50 μl 9 × 107 TU/ml veyikil LV (sa vle di 4.5 × 106 TU/rat). Nan etid sa yo, olye pou nou deplase leman an pandan akouchman an, nou te fikse leman an nan yon pozisyon pou detèmine si transdiksyon LV (a) te kapab amelyore konpare ak livrezon vektè san yon chan mayetik, epi (b) te kapab konsantre. Selil pasaj lè yo transdi nan rejyon sib mayetik nan pasaj lè siperyè a.
Prezans leman yo ak itilizasyon CombiMag konbine avèk vektè LV yo pa t sanble gen efè negatif sou sante bèt yo, menm jan ak pwotokòl livrezon vektè LV estanda nou an. Imaj frontal rejyon tracheal ki te sibi perturbasyon mekanik (Fig. 1 siplemantè) te endike ke te gen nivo transdiksyon siyifikativman pi wo nan gwoup bèt ki te trete ak LV-MP lè leman an te prezan (Fig. 9a). Se sèlman yon ti kantite koloran ble LacZ ki te prezan nan gwoup kontwòl la (Fig. 9b). Kantifikasyon zòn ki te kolore ak X-Gal nòmalize yo te montre ke administrasyon LV-MP an prezans yon chan mayetik te pwodui yon amelyorasyon apeprè 6 fwa plis (Fig. 9c).
Egzanp imaj konpoze ki montre transdiksyon tracheal pa LV-MP (a) an prezans yon chan mayetik ak (b) an absans yon leman. (c) Amelyorasyon estatistikman siyifikatif nan zòn transdiksyon LacZ normalized nan trache a lè w ap itilize leman an (*p = 0.029, t-test, n = 3 pa gwoup, mwayèn ± SEM).
Seksyon ki gen koulè wouj net rapid (egzanp ki montre nan Figi Siplemantè 2) te montre selil ki gen koulè LacZ ki prezan nan yon modèl ak yon kote menm jan ak sa ki te rapòte deja.
Yon defi kle pou terapi jèn nan pasaj lè yo rete lokalizasyon egzak patikil transpòtè yo nan rejyon enterè yo epi reyalize nivo efikasite transdiksyon ki wo nan poumon k ap deplase a an prezans sikilasyon lè ak netwayaj aktif larim. Pou transpòtè LV ki fèt pou trete maladi pasaj lè CF, ogmante tan rezidans patikil transpòtè yo nan pasaj lè kondiktè yo te yon objektif ki difisil pou atenn jiskaprezan. Jan Castellani et al. te fè remake sa, itilizasyon chan mayetik pou amelyore transdiksyon an gen avantaj konpare ak lòt metòd livrezon jèn tankou elektroporasyon, paske li ka konbine senplisite, pri-efikasite, lokalizasyon livrezon, ogmantasyon efikasite, ak tan enkubasyon ki pi kout, e petèt yon dòz transpòtè ki pi piti10. Sepandan, yo pa janm dekri depo ak konpòtman patikil mayetik in vivo nan pasaj lè yo anba enfliyans fòs mayetik ekstèn, ni yo pa janm demontre posibilite metòd sa a in vivo pou amelyore nivo ekspresyon jèn nan pasaj lè vivan ki entak.
Eksperyans in vitro synchrotron PCXI nou yo te montre ke tout patikil nou te teste yo, eksepte polystyrene MP, te vizib nan konfigirasyon imaj nou te itilize a. An prezans yon chan mayetik, MP yo fòme fisèl ki gen longè ki gen rapò ak kalite patikil la ak fòs chan mayetik la (sa vle di pwòksimite ak mouvman leman an). Jan yo montre nan Figi 10, fisèl nou obsève yo fòme akòz chak patikil endividyèl ki mayetize epi ki pwovoke pwòp chan mayetik lokal li. Chan separe sa yo lakòz lòt patikil menm jan an rasanble epi konekte, ak mouvman tankou fisèl gwoup akòz fòs lokal ki soti nan fòs atire ak repouse lokal lòt patikil yo.
Schema ki montre (a,b) tren patikil ki pwodui andedan kapilè ki plen likid ak (c,d) trache ki plen lè. Remake byen ke kapilè yo ak trache a pa trase nan echèl. Panèl (a) a genyen tou yon deskripsyon MP a, ki gen patikil Fe3O4 ki ranje an fisèl.
Lè yo te deplase leman an anlè kapilè a, ang fisèl patikil la te rive nan yon papòt kritik pou MP3-5 ki gen Fe3O4, apre sa fisèl patikil la pa t rete nan pozisyon orijinal la ankò, men li te deplase sou sifas leman an nan yon nouvo pozisyon. Efè sa a gen anpil chans rive paske sifas kapilè an vè a ase lis pou pèmèt mouvman sa a rive. Sa ki enteresan, MP6 (CombiMag) pa t konpòte l konsa, petèt paske patikil yo te pi piti, yo te gen diferan kouch oswa chaj sifas, oswa yon likid transpòtè propriétaires te afekte kapasite yo pou yo deplase. Kontras imaj patikil CombiMag yo pi fèb tou, sa ki sijere ke likid la ak patikil yo ka gen dansite menm jan an e pakonsekan yo pa fasil pou deplase youn anvè lòt. Patikil yo kapab kole tou si leman an deplase twò vit, sa ki endike ke fòs chan mayetik la pa ka toujou simonte friksyon ki genyen ant patikil yo nan likid la, sa ki sijere ke petèt li pa etonan ke fòs chan mayetik la ak distans ki genyen ant leman an ak zòn sib la trè enpòtan. Lè nou pran tout ansanm, rezilta sa yo sijere tou ke, pandan ke leman yo ka kaptire anpil MP ki koule nan zòn sib la, li pa fasil pou yo ka konte sou leman pou yo deplase. Patikil CombiMag yo sou sifas trache a. Se poutèt sa, nou konkli ke etid LV-MP in vivo yo ta dwe itilize chan mayetik estatik pou vize fizikman rejyon espesifik nan pyebwa pasaj lè a.
Lè patikil yo antre nan kò a, li difisil pou idantifye nan kontèks tisi kòporèl konplèks k ap deplase, men kapasite pou detekte yo te amelyore lè yo te translase leman an orizontalman anlè trache a pou "branche" fil MP yo. Malgre ke imaj an dirèk posib, li pi fasil pou disène mouvman patikil la yon fwa yo te touye bèt la yon fason imen. Konsantrasyon MP yo te jeneralman pi wo nan kote sa a lè leman an te pozisyone anlè zòn imaj la, byenke yo te anjeneral jwenn kèk patikil pi lwen sou trache a. Kontrèman ak etid in vitro, patikil yo pa ka trennen sou trache a lè yo translase leman an. Rezilta sa a konsistan avèk fason larim ki kouvri sifas trache a tipikman trete patikil yo respire yo, li pyèje yo nan larim nan epi answit li netwaye yo pa mekanis netwayaj mukosiliyè a.
Nou te fè ipotèz ke itilizasyon leman pou atraksyon anlè ak anba trache a (Fig. 3b) ta ka lakòz yon chan mayetik ki pi inifòm, olye de yon chan mayetik ki trè konsantre nan yon pwen, sa ki ka mennen nan yon distribisyon patikil ki pi inifòm. Sepandan, etid preliminè nou an pa t jwenn prèv klè pou sipòte ipotèz sa a. Menm jan an tou, konfigirasyon yon pè leman pou repouse (Fig. 3c) pa t lakòz plis depo patikil nan zòn imaj la. De rezilta sa yo demontre ke konfigirasyon doub leman an pa amelyore kontwòl lokal siblaj MP a anpil, epi ke fòs mayetik fò ki soti ladan yo difisil pou konfigire, sa ki fè apwòch sa a mwens pratik. Menm jan an tou, oryante leman anlè ak atravè trache a (Fig. 3d) pa t ogmante kantite patikil ki rete nan zòn imaj la tou. Gen kèk nan konfigirasyon altènatif sa yo ki ka pa reyisi paske yo lakòz pi ba fòs chan mayetik nan zòn depo a. Se poutèt sa, konfigirasyon leman ang 30 degre sèl la (Figi 3a) konsidere kòm metòd ki pi fasil ak pi efikas pou tès in vivo.
Etid LV-MP a te montre ke lè vektè LV yo te konbine avèk CombiMag epi yo te delivre apre yon perturbasyon fizik an prezans yon chan mayetik, nivo transdiksyon yo te ogmante siyifikativman nan trache a konpare ak kontwòl yo. Baze sou etid imaj senkrotron yo ak rezilta LacZ yo, chan mayetik la te aparamman kapab prezève LV a nan trache a epi redwi kantite patikil vektè ki te penetre fon nan poumon an imedyatman. Amelyorasyon sib sa yo ka mennen nan pi gwo efikasite pandan y ap diminye tit delivre yo, transdiksyon ki pa sib, efè segondè enflamatwa ak iminitè, ak depans transpòtè jèn. Sa ki enpòtan, dapre manifakti a, CombiMag ka itilize ansanm ak lòt metòd transfè jèn, tankou ak lòt vektè viral (tankou AAV) ak asid nikleyik.