Mèsi paske ou te vizite Nature.com. Vèsyon navigatè w ap itilize a pa gen sipò limite pou CSS. Pou pi bon eksperyans lan, nou rekòmande pou w itilize yon navigatè ki ajou (oswa dezaktive mòd konpatibilite nan Internet Explorer). Antretan, pou asire sipò kontinyèl, nou pral montre sit la san estil ak JavaScript.
Patikil silica pore yo te prepare pa yon metòd sol-jèl avèk kèk modifikasyon pou jwenn patikil makroporeu. Patikil sa yo te derive pa polimerizasyon transfè chèn fragmentasyon adisyon revèsib (RAFT) avèk N-fenilmaleimid-metilvinilizocyanat (PMI) ak styrene pou prepare entèkalasyon N-fenilmaleimid nan faz estasyonè polistyrene (PMP). Kolòn asye pur etwat (100 × 1.8 mm id) yo te chaje pa anbalaj sispansyon. Evalye separasyon kolòn PMP yon melanj peptid ki gen senk peptid (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, lesin enkefalin) pèfòmans kromatografik) ak dijesyon tripsin nan albumin serik imen (HAS). Anba kondisyon elisyon optimal, konte plak teorik melanj peptid la rive jiska 280,000 plak/m². Konpare pèfòmans separasyon kolòn devlope a ak komèsyal la Nan kolòn Ascentis Express RP-Amid la, yo te obsève ke pèfòmans separasyon kolòn PMP a te siperyè kolòn komèsyal la an tèm de efikasite separasyon ak rezolisyon.
Nan dènye ane sa yo, endistri byofamasetik la vin tounen yon mache mondyal k ap agrandi ak yon ogmantasyon sibstansyèl nan pati nan mache a. Avèk kwasans eksplozif endistri byofamasetik la1,2,3, analiz peptid ak pwoteyin yo trè dezirab. Anplis peptid sib la, plizyè enpurte pwodui pandan sentèz peptid la, kidonk li mande pou pirifikasyon kromatografik pou jwenn peptid ki gen pite ki nesesè a. Analiz ak karakterizasyon pwoteyin nan likid kòporèl, tisi ak selil se yon travay ki trè difisil akòz gwo kantite espès ki ka detekte nan yon sèl echantiyon. Malgre ke espektwometri mas se yon zouti efikas pou sekans peptid ak pwoteyin, si echantiyon sa yo enjekte nan espektwomèt mas la nan yon sèl pas, separasyon an pap ideyal. Pwoblèm sa a ka diminye lè yo aplike separasyon kromatografi likid (LC) anvan analiz MS, ki pral diminye kantite analit k ap antre nan espektwomèt mas la nan yon moman bay4,5,6. Anplis de sa, pandan separasyon faz likid, analit yo ka konsantre nan rejyon etwat, kidonk konsantre analit sa yo epi amelyore sansiblite deteksyon MS. Kromatografi likid (LC) te avanse anpil pandan dènye deseni a epi li te vin tounen yon teknik popilè nan analiz pwoteyomik7,8,9,10.
Kromatografi likid faz envèse (RP-LC) lajman itilize pou pirifikasyon ak separasyon melanj peptid lè l sèvi avèk silica modifye ak oktadesil (ODS) kòm faz estasyonè11,12,13. Sepandan, faz estasyonè RP yo pa bay yon separasyon satisfezan pou peptid ak pwoteyin akòz estrikti konplèks yo ak nati anfifilik yo 14,15. Se poutèt sa, faz estasyonè ki fèt espesyalman yo nesesè pou analize peptid ak pwoteyin ki gen pati polè ak non polè pou kominike avèk analit sa yo epi kenbe yo16. Kromatografi mòd melanje, ki bay entèraksyon multimodal, kapab yon altènativ a RP-LC pou separasyon peptid, pwoteyin, ak lòt melanj konplèks. Plizyè faz estasyonè mòd melanje yo te prepare, epi kolòn ki chaje ak faz sa yo te itilize pou separasyon peptid ak pwoteyin17,18,19,20,21. Faz estasyonè mòd melanje (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, entèkalasyon polè/RPLC) yo apwopriye pou separasyon peptid ak pwoteyin akòz prezans tou de faz polè ak non polè. gwoup22,23,24,25,26,27,28. Menm jan an tou, faz estasyonè entèkalan polè ak gwoup polè ki lye kovalan montre bon pouvwa separasyon ak selektivite inik pou analit polè ak non-polè, paske separasyon depann de entèraksyon ki genyen ant analit la ak faz estasyonè a. Entèraksyon multimodal 29, 30, 31, 32. Dènyèman, Zhang et al. 30 te prepare yon faz estasyonè poliamin ki fini ak dodecyl epi yo te separe avèk siksè idrokarbur, antidepresè, flavonoid, nikleyozid, estwojèn, ak plizyè lòt analit. Entèkalatè polè a gen tou de gwoup polè ak non-polè, kidonk li ka itilize pou separe peptid ak pwoteyin ki gen tou de pati idrofob ak idrofil. Kolòn polè entegre (pa egzanp, kolòn C18 entegre ak amid) disponib nan komès anba non komèsyal kolòn Ascentis Express RP-Amide, men kolòn sa yo itilize sèlman pou analiz amin 33.
Nan etid aktyèl la, yo te prepare epi evalye yon faz estasyonè polè entegre (polistirèn polè entegre ak N-fenilmaleimid) pou separasyon peptid ak dijesyon tripsin HSA. Yo te prepare faz estasyonè a lè l sèvi avèk estrateji sa a. Yo te prepare patikil silica pore yo dapre pwosedi ki te bay nan piblikasyon anvan nou an avèk kèk modifikasyon nan pwotokòl preparasyon an. Yo te ajiste rapò ure, poliglikòl polietilèn (PEG), TMOS, dlo ak asid asetik pou prepare patikil silica ki gen gwo gwosè pò. Dezyèmman, yo te sentetize yon nouvo ligand, fenilmaleimid-metil vinil izosyanat, epi yo te itilize li pou derive patikil silica pou prepare yon faz estasyonè polè entegre. Yo te chaje faz estasyonè ki te sòti a nan yon kolòn asye pur (100 × 1.8 mm id) lè l sèvi avèk konplo anbalaj optimize a. Anbalaj kolòn nan ede ak vibrasyon mekanik pou asire yon kabann omojèn fòme nan kolòn nan. Evalye separasyon kolòn ranpli melanj peptid ki gen senk peptid; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Lesin Enkefalin) ak dijèsyon tripsin nan albumin serik imen (HAS). Yo te obsève melanj peptid la ak dijèsyon tripsin HSA a separe avèk bon rezolisyon ak efikasite. Yo te konpare pèfòmans separasyon kolòn PMP a ak pèfòmans separasyon kolòn Ascentis Express RP-Amide la. Yo te obsève ke tou de peptid yo ak pwoteyin yo te byen rezolisyon ak efikas sou kolòn PMP a, ki te pi efikas pase kolòn Ascentis Express RP-Amide la.
PEG (Polietilèn Glikòl), Ure, Asid Asetik, Trimetoksi Ortosilikat (TMOS), Trimetil Klorosilan (TMCS), Tripsin, Albumin Serik Imen (HSA), Klori Amonyòm, Ure, Hexane Metildisilazan (HMDS), Klori Metakriloil (MC), Stirene, 4-Idroksi-TEMPO, Pèwoksid Benzoil (BPO), Asetonitril Kalite HPLC (ACN), Metanol, 2-Propanol, ak Asetòn Achte nan men Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Etazini).
Yo te brase yon melanj ure (8 g), poliglikòl etilèn (8 g), ak 8 mL asid asetik 0.01 N pandan 10 minit, epi answit yo te ajoute 24 mL TMOS anba kondisyon glas. Yo te chofe melanj reyaksyon an a 40°C pandan 6 èdtan epi answit a 120°C pandan 8 èdtan nan yon otoklav asye pur. Yo te vide dlo a epi yo te seche materyèl ki te rete a a 70°C pandan 12 èdtan. Yo te moulen mas mou ki te seche a nan yon fou epi yo te kalsine l a 550°C pandan 12 èdtan. Yo te prepare epi karakterize twa pakèt pou egzamine repwodiktibilite nan gwosè patikil, gwosè pò ak sifas.
Pa modifikasyon sifas patikil silica yo ak yon ligand fenilmaleimid-metilvinilizocyanat (PCMP) pre-sentetize ki te swiv pa yon polimerizasyon radyal ak styrene, yo te prepare yon konpoze ki gen gwoup polè. Faz estasyonè pou agregat ak chenn polistyrene. Pwosesis preparasyon an dekri anba a.
Yo te fonn N-fenilmaleimid (200 mg) ak metil vinil izosyanat (100 mg) nan toluèn sèk, epi yo te ajoute 0.1 mL 2,2′-azoizobutironitril (AIBN) nan flakon reyaksyon an pou prepare kopolime fenilmaleimid-metil vinil izosyanat (PMCP). Yo te chofe melanj lan a 60°C pandan 3 èdtan, yo te filtre l epi yo te seche l nan yon fou a 40°C pandan 3 èdtan.
Patikil silica sèch yo (2 g) te dispèse nan toluèn sèch (100 mL), yo te brase epi sonike nan yon flakon wonn 500 mL pandan 10 min. PMCP (10 mg) te fonn nan toluèn epi ajoute gout pa gout nan flakon reyaksyon an atravè yon antonwa degoute. Melanj lan te refli nan 100°C pandan 8 èdtan, filtre epi lave ak asetòn epi seche nan 60°C pandan 3 èdtan. Apre sa, patikil silica lye ak PMCP (100 g) te fonn nan toluèn (200 ml) epi yo te ajoute 4-idwoksi-TEMPO (2 mL) an prezans 100 µL dibutiltin dilaurat kòm yon katalis. Melanj lan te brase nan 50°C pandan 8 èdtan, filtre epi seche nan 50°C pandan 3 èdtan.
Stirene (1 mL), peroksid benzoil BPO (0.5 mL), ak patikil silica tache ak TEMPO-PMCP (1.5 g) te dispèse nan toluèn epi yo te pirifye ak azòt. Polimerizasyon stirene a te fèt a 100°C pandan 12 èdtan. Pwodwi ki te sòti a te lave ak metanòl epi seche a 60°C pandan tout lannwit lan. Figi 1 montre schèma reyaksyon jeneral la.
Yo te degaze echantiyon yo a 393 K pandan 1 èdtan pou jwenn yon presyon rezidyèl mwens pase 10-3 Torr. Yo te itilize kantite N2 ki te adsorbe a yon presyon relatif P/P0 = 0.99 pou detèmine volim total pò a. Yo te egzamine mòfoloji patikil silica toutouni ak patikil silica ki lye ak ligand ak mikwoskòp elektwonik optik (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japon). Yo te mete echantiyon seche yo (silica toutouni ak patikil silica ki lye ak ligand) sou yon kolòn aliminyòm lè l sèvi avèk tep kabòn adezif. Yo te plake lò sou echantiyon yo lè l sèvi avèk yon kouch pulverizasyon Q150T, epi yo te depoze yon kouch Au 5 nm sou echantiyon yo. Sa amelyore efikasite pwosesis la lè l sèvi avèk vòltaj ki ba epi li bay grenn amann, pulverizasyon frèt. Yo te itilize yon analizè elemantè Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 pou analiz elemantè. Yo te itilize yon analizè gwosè patikil Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 pou jwenn distribisyon gwosè patikil la. Patikil silica toutouni ak Patikil silica ki lye ak ligand (5 mg chak) te dispèse nan 5 mL izopropanol, sonike pandan 10 minit, vortexed pandan 5 minit, epi mete sou ban optik Mastersizer la. Analiz tèmogravimetrik la te fèt nan yon vitès 5 °C pa minit sou yon seri tanperati 30 a 800 °C.
Yo te chaje kolòn etwat an asye pur ki gen dimansyon (100 × 1.8 mm id) ak revètman an vè, lè l sèvi avèk metòd anbalaj sispansyon an, an aplikasyon menm pwosedi ki te itilize nan Ref. 31. Yon kolòn asye pur (ak yon kouch vè, 100 × 1.8 mm id) ak yon ekipman sòti ki gen yon frit 1 µm te konekte ak yon pake lasi (Alltech Deerfield, IL, USA). Prepare yon lasi faz estasyonè lè w sispann 150 mg faz estasyonè nan 1.2 mL metanòl epi voye l nan kolòn depo a. Metanòl te itilize kòm solvan lasi a ansanm ak solvan pou pwopilsyon an. Ranpli kolòn nan sekansyèlman lè w aplike presyon 100 MP pandan 10 minit, 80 MP pandan 15 minit, ak 60 MP pandan 30 minit. Pandan pake a, yo te aplike vibrasyon mekanik ak de ajitatè kolòn GC (Alltech, Deerfield, IL, USA) pou asire yon pake inifòm nan kolòn nan. Fèmen pake lasi a epi lage presyon an dousman pou anpeche nenpòt domaj nan kolòn nan. Dekonekte kolòn nan nan inite pake lasi a epi konekte yon lòt ekipman nan antre a ak nan sistèm LC a pou tcheke pèfòmans li.
Yo te konstwi yon ponp LC (10AD Shimadzu, Japon), yon enjektè (Valco (USA) C14 W.05) ak yon bouk enjeksyon 50nL, yon degazeur manbràn (Shimadzu DGU-14A), yon fenèt kapilè UV-VIS. Yo te itilize yon detektè aparèy µLC espesyal (UV-2075) ak mikwokolòn aliyen ak vè. Yo te itilize tib koneksyon trè etwat ak kout pou minimize efè elajisman bann kolòn siplemantè a. Apre anbalaj la, yo te enstale kapilè (50 μm id 365) ak kapilè inyon redwi (50 μm) nan sòti 1/16″ inyon redwi a. Yo te kolekte done ak trete kwomatografik la lè l sèvi avèk lojisyèl Multichro 2000. Siveyans nan 254 nm. Yo te teste analit yo pou absòbans UV. OriginPro8 (Northampton, MA) te analize done kwomatografik yo.
Albumin ki soti nan sewòm imen, poud liofilize, ≥ 96% (elektroforèz jèl agaroz) 3 mg melanje ak tripsin (1.5 mg), 4.0 M ure (1 mL), ak 0.2 M bikabonat amonyòm (1 mL). Solisyon an te brase pandan 10 minit epi li te kenbe nan yon beny dlo a 37°C pandan 6 èdtan, answit li te tranpe ak 1 mL 0.1% TFA. Filtre solisyon an epi estoke anba 4 °C.
Yo te evalye separasyon melanj peptid yo ak dijesyon tripsin HSA yo separeman sou kolòn PMP yo. Tcheke separasyon melanj peptid la ak dijesyon tripsin HSA a pa kolòn PMP a epi konpare rezilta yo ak kolòn Ascentis Express RP-Amide la. Yo kalkile nimewo plak teorik la jan sa a:
Imaj SEM patikil silica toutouni ak patikil silica ki lye ak ligand yo montre nan FIG. 2. Imaj SEM patikil silica toutouni (A, B) yo montre ke, kontrèman ak etid anvan nou yo, patikil sa yo esferik kote patikil yo long oswa gen simetri iregilye. Sifas patikil silica ki lye ak ligand yo (C, D) pi lis pase sa ki nan patikil silica toutouni yo, sa ki ka akòz kouch chenn polistirèn sou sifas patikil silica yo.
Imaj mikwoskòp elektwonik optik ki montre patikil silica toutouni (A, B) ak patikil silica ki lye ak ligand (C, D).
Distribisyon gwosè patikil patikil silica toutouni ak patikil silica ki lye ak ligand yo montre nan Figi 3(A). Koub distribisyon gwosè patikil ki baze sou volim yo te montre ke gwosè patikil silica yo te ogmante apre modifikasyon chimik la (Fig. 3A). Done distribisyon gwosè patikil patikil silica yo nan etid aktyèl la ak etid anvan an yo konpare nan Tablo 1(A). Gwosè patikil ki baze sou volim, d(0.5), nan PMP se 3.36 μm, konpare ak etid anvan nou an ak valè ad(0.5) 3.05 μm (patikil silica ki lye ak polistirèn)34. Pakèt sa a te gen yon distribisyon gwosè patikil ki pi etwat konpare ak etid anvan nou an akòz rapò varyab PEG, ure, TMOS, ak asid asetik nan melanj reyaksyon an. Gwosè patikil faz PMP a yon ti kras pi gwo pase sa ki nan faz patikil silica ki lye ak polistirèn nou te etidye anvan an. Sa vle di ke fonksyonalizasyon sifas patikil silica ak stirèn sèlman depoze yon kouch polistirèn (0.97 µm) sou sifas silica a, tandiske nan faz PMP a Epesè kouch la te 1.38 µm.
Distribisyon gwosè patikil (A) ak distribisyon gwosè pò (B) patikil silica toutouni ak patikil silica lye ak ligand.
Gwosè pò, volim pò ak sifas patikil silica etid aktyèl la yo bay nan Tablo 1(B). Pwofil PSD patikil silica toutouni yo ak patikil silica ki lye ak ligand yo montre nan Figi 3(B). Rezilta yo konparab ak etid anvan nou an. Gwosè pò patikil silica toutouni yo ak patikil silica ki lye ak ligand yo se 310 ak 241, respektivman, ki endike ke gwosè pò a diminye pa 69 apre modifikasyon chimik, jan yo montre nan Tablo 1(B), epi chanjman koub la montre nan Fig. 3(B). Menm jan an tou, volim pò patikil silica yo diminye soti nan 0.67 a 0.58 cm3/g apre modifikasyon chimik la. Sifas espesifik patikil silica ki etidye kounye a se 116 m2/g, ki konparab ak etid anvan nou an (124 m2/g). Jan yo montre nan Tablo 1(B), sifas (m2/g) patikil silica yo diminye tou soti nan 116 m2/g a 105 m2/g apre modifikasyon chimik la. modifikasyon.
Rezilta analiz elemantè faz estasyonè a yo montre nan Tablo 2. Chaj kabòn faz estasyonè aktyèl la se 6.35%, ki pi ba pase chaj kabòn etid anvan nou an (patikil silica lye ak polystyrène, 7.93%35 ak 10.21%, respektivman) 42. Chaj kabòn faz estasyonè aktyèl la ba, paske nan preparasyon SP aktyèl la, anplis styrene, yo te itilize kèk ligand polè tankou fenilmaleimid-metilvinilizocyanate (PCMP) ak 4-idroksi-TEMPO. Pousantaj pwa azòt faz estasyonè aktyèl la se 2.21%, konpare ak 0.1735 ak 0.85% pa pwa azòt nan etid anvan yo, respektivman. Sa vle di ke pousantaj pwa azòt la pi wo nan faz estasyonè aktyèl la akòz fenilmaleimid. Menm jan an tou, chaj kabòn pwodwi (4) ak (5) yo te 2.7% ak 2.9%, respektivman, pandan ke chaj kabòn nan final la Pwodui (6) la te 6.35%, jan yo montre nan Tablo 2. Yo te verifye pèt pwa a avèk faz estasyonè PMP, epi koub TGA a montre nan Figi 4. Koub TGA a montre yon pèt pwa 8.6%, ki an bon akò avèk chaj kabòn nan (6.35%) paske ligand yo pa sèlman genyen C men tou N, O, ak H.
Yo te chwazi ligand fenilmaleimid-metilvinilizosyanat la pou modifikasyon sifas patikil silica paske li gen gwoup fenilmaleimid polè ak gwoup vinilisyanat. Gwoup izosyanat vinil yo ka reyaji plis ak stirenn pa polimerizasyon radikal vivan. Dezyèm rezon an se pou mete yon gwoup ki gen yon entèraksyon modere ak analit la epi ki pa gen okenn entèraksyon elektwostatik fò ant analit la ak faz estasyonè a, piske pati fenilmaleimid la pa gen okenn chaj vityèl nan pH nòmal. Polarite faz estasyonè a ka kontwole pa kantite optimal stirenn ak tan reyaksyon polimerizasyon radikal lib la. Dènye etap reyaksyon an (polimerizasyon radikal lib) enpòtan epi li ka chanje polarite faz estasyonè a. Yo te fè analiz elemantè pou tcheke chaj kabòn faz estasyonè sa yo. Yo te obsève ke ogmante kantite stirenn ak tan reyaksyon an ogmante chaj kabòn faz estasyonè a epi vis vèsa. SP ki prepare ak diferan konsantrasyon stirenn gen diferan chaj kabòn. Yon fwa ankò, chaje faz estasyonè sa yo nan kolòn asye pur epi tcheke kwomatografi yo. pèfòmans (selektivite, rezolisyon, valè N, elatriye). Baze sou eksperyans sa yo, yo te chwazi yon fòmilasyon optimize pou prepare faz estasyonè PMP a pou asire polarite kontwole ak bon retansyon analit la.
Yo te evalye senk melanj peptid (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, lesin enkefalin) tou lè l sèvi avèk yon kolòn PMP ki te itilize yon faz mobil; 60/40 (v/v) asetonitril/dlo (0.1% TFA) nan yon vitès koule 80 μL/min. Anba kondisyon elisyon optimal, nimewo plak teorik (N) pou chak kolòn (100 × 1.8 mm id) se 20,000 ± 100 (200,000 plak/m²). Tablo 3 bay valè N pou twa kolòn PMP yo epi kwomatogram yo montre nan Figi 5A. Analiz rapid sou yon kolòn PMP nan yon vitès koule ki wo (700 μL/min), senk peptid te elye nan yon minit, valè N yo te trè bon, 13,500 ± 330 pou chak kolòn (100 × 1.8 mm id), Koresponn ak 135,000 plak/m (Figi 5B). Twa kolòn ki gen menm gwosè (100 × 1.8 mm id) te chaje ak twa diferan pakèt faz estasyonè PMP pou tcheke repwodiktibilite. Yo te anrejistre konsantrasyon analit pou chak kolòn lè l sèvi avèk kondisyon elisyon optimal yo ak kantite plak teyorik N ansanm ak tan retansyon pou separe menm melanj tès la sou chak kolòn. Done reproduktibilite pou kolòn PMP yo montre nan Tablo 4. Reproduktibilite kolòn PMP a korele byen ak valè %RSD ki trè ba, jan yo montre nan Tablo 3.
Separasyon melanj peptid sou kolòn PMP (B) ak kolòn Ascentis Express RP-Amide (A); faz mobil 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), dimansyon kolòn PMP (100 × 1.8 mm id); analitik Lòd elisyon konpoze yo: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ak 5 (lesin) asid ansèfalin).
Yo te evalye yon kolòn PMP (100 × 1.8 mm id) pou separasyon dijesyon triptik albumin serik imen nan kromatografi likid pèfòmans segondè. Kromatogram nan Figi 6 montre ke echantiyon an byen separe epi rezolisyon an trè bon. Yo te analize dijesyon HSA yo lè l sèvi avèk yon to koule 100 µL/min, faz mobil 70/30 asetonitril/dlo ak 0.1% TFA. Jan yo montre nan kromatogram nan (Figi 6), yo te divize dijesyon HSA a an 17 pik ki koresponn ak 17 peptid. Yo te kalkile efikasite separasyon chak pik nan dijesyon HSA a epi valè yo bay nan Tablo 5.
Yo te separe yon dijèsyon triptik HSA (100 × 1.8 mm id) sou yon kolòn PMP; vitès koule (100 µL/min), faz mobil 60/40 asetonitril/dlo ak 0.1% TFA.
Kote L se longè kolòn nan, η se viskozite faz mobil lan, ΔP se presyon dèyè kolòn nan, epi u se vitès lineyè faz mobil lan. Pèmeyabilite kolòn PMP a te 2.5 × 10-14 m2, to koule a te 25 μL/min, epi yo te itilize 60/40 v/v ACN/dlo. Pèmeyabilite kolòn PMP a (100 × 1.8 mm id) te sanble ak sa ki nan etid anvan nou an Ref.34. Pèmeyabilite kolòn ki chaje ak patikil pore sifasyalman an se: 1.7 × 10-15 pou patikil 1.3 μm, 3.1 × 10-15 pou patikil 1.7 μm, 5.2 × 10-15 ak 2.5 × 10-14 m2 pou patikil 2.6 μm Pou patikil 5 μm 43. Se poutèt sa, pèmeyabilite faz PMP a sanble ak sa ki nan patikil nwayo-kokiy 5 μm.
Kote Wx se pwa kolòn ki chaje ak klorofòm, Wy se pwa kolòn ki chaje ak metanòl, epi ρ se dansite solvan an. Dansite metanòl (ρ = 0.7866) ak klorofòm (ρ = 1.484). Porosit total kolòn SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1.8 mm id) 34 ak kolòn C18-Urea 31 ke nou te etidye deja te 0.63 ak 0.55, respektivman. Sa vle di ke prezans ligand urea yo diminye pèmeyabilite faz estasyonè a. Nan lòt men an, porosit total kolòn PMP a (100 × 1.8 mm id) se 0.60. Pèmeyabilite kolòn PMP yo pi ba pase sa ki nan kolòn ki chaje ak patikil silica ki lye ak C18 paske nan faz estasyonè tip C18 ligand C18 yo tache ak patikil silica yo kòm chenn lineyè, pandan ke nan faz estasyonè tip polistirèn, kouch polimè relativman epè A a se fòme otou li. Nan yon eksperyans tipik, yo kalkile porosit kolòn nan kòm:
Figi 7A,B montre kolòn PMP a (100 × 1.8 mm id) ak kolòn Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 mm id) lè l sèvi avèk menm kondisyon elisyon yo (sa vle di, 60/40 ACN/H2O ak 0.1% TFA). ) nan graf van Deemter la. Yo te prepare melanj peptid yo chwazi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) nan 20 µL/ Debi minimòm pou tou de kolòn yo se 800 µL/min. Valè HETP minimòm yo nan debi optimal la (80 µL/min) pou kolòn PMP a ak kolòn Ascentis Express RP-Amide la te 2.6 µm ak 3.9 µm, respektivman. Valè HETP yo endike ke efikasite separasyon kolòn PMP a (100 × 1.8 mm id) pi bon pase kolòn Ascentis Express RP-Amide ki disponib nan komès la (100 × 1.8 mm id). Graf van Deemter nan Fig. 7(A) montre ke diminisyon nan valè N ak ogmantasyon debi a pa siyifikatif konpare ak etid anvan nou an. Pi gwo efikasite separasyon kolòn PMP a (100 × 1.8 mm id) konpare pou kolòn Ascentis Express RP-Amid la baze sou amelyorasyon nan fòm patikil, gwosè, ak pwosedi konplèks anbalaj kolòn yo itilize nan travay aktyèl la34.
(A) graf van Deemter (HETP kont vitès lineyè faz mobil) jwenn lè l sèvi avèk yon kolòn PMP (100 × 1.8 mm id) nan 60/40 ACN/H2O ak 0.1% TFA.(B) graf van Deemter (HETP kont vitès lineyè faz mobil) jwenn lè l sèvi avèk yon kolòn Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 mm id) nan 60/40 ACN/H2O ak 0.1% TFA.
Yo te prepare epi evalye yon faz estasyonè polistirèn entegre ak polè pou separasyon melanj peptid sentetik ak dijesyon tripsin nan albumin serik imen (HAS) nan kromatografi likid pèfòmans segondè. Pèfòmans kromatografik kolòn PMP yo pou melanj peptid yo ekselan nan efikasite ak rezolisyon separasyon. Pèfòmans separasyon amelyore kolòn PMP yo akòz yon varyete de rezon, tankou gwosè patikil ak gwosè pò patikil silica yo, sentèz kontwole nan faz estasyonè a, ak anbalaj kolòn konplèks. Anplis efikasite separasyon segondè, presyon kolòn ki ba nan gwo to koule se yon lòt avantaj nan faz estasyonè sa a. Kolòn PMP yo montre bon repwodiktibilite epi yo ka itilize pou analiz melanj peptid ak dijesyon tripsin nan divès pwoteyin. Nou gen entansyon itilize kolòn sa a pou separasyon pwodwi natirèl, konpoze byoaktif ki soti nan plant medsin ak ekstrè chanpiyon nan kromatografi likid. Nan lavni, kolòn PMP yo pral evalye tou pou separasyon pwoteyin ak antikò monoklonal.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Rechèch sou Sistèm Separasyon Peptid pa Kromatografi Faz Envèse Pati I: Devlopman yon Pwotokòl Karakterizasyon Kolòn.J. Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Peptid aktif amelyore ki fèt pou tretman maladi enfeksyon yo. Biotechnology. Advanced. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. ak Khrestchatisky, M. Peptid terapetik sentetik: syans ak mache a. Dekouvèt dwòg. 15 (1-2) jodi a, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD ak Shen, Y. Kromatografi Likid Pwoteyomik Avanse. J. Kromatografi. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Kromatografi likid avanse-espektrometri mas pèmèt enkòporasyon metabolomik ak pwoteyomik ki sib yon gwo kantite moun. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM ak Salisbury, JJ Wòl UHPLC nan devlopman dwòg. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Aspè fondamantal ak pratik kromatografi likid anba presyon ultra wo pou separasyon rapid. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Aplikasyon kromatografi likid pèfòmans ultra-wo nan devlopman dwòg.J. Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Idwojèl makroporè monolitik prepare ak emilsyon faz entèn segondè lwil-nan-dlo pou pirifikasyon efikas enterovirus yo. Chemical. Britain. J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Wòl kromatografi likid nan pwoteyomik. J. Kromatografi. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. ak Guillarme, D. Tandans émergentes nan separasyon kromatografi likid faz envèse nan peptid ak pwoteyin terapetik: teyori ak aplikasyon. J. Pharmacy. Biomedical Science. anus. 69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Separasyon peptid bidimensyonèl lè l sèvi avèk yon sistèm RP-RP-HPLC ki itilize diferan valè pH nan premye ak dezyèm dimansyon separasyon yo. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Yo te envestige karakteristik transfè mas ak pèfòmans sinetik kolòn kromatografik ki gen gwo efikasite ki chaje ak patikil C18 sub-2 μm ki pore nèt ak sifasyalman. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Tandans resan ak defi analiz nan izolasyon, idantifikasyon ak validasyon peptid byoaktif plant yo. anus. anus biolojik. Chimik. 410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Peyizaj pwoteyomik wayòm lavi a. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Pwosesis aval peptid terapetik yo pa kromatografi likid preparatif. Molecule (Basel, Swis) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografi mòd melanje ak aplikasyon li nan byopolimè. J. Kromatografi. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. ak Sun, Y. Ligand pou kromatografi pwoteyin mòd melanje: prensip, karakterizasyon, ak konsepsyon. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).