Mèsi paske w vizite Nature.com.Vèsyon navigatè w ap itilize a gen sipò CSS limite.Pou pi bon eksperyans, nou rekòmande pou w sèvi ak yon navigatè ki ajou (oswa enfim mòd konpatibilite nan Internet Explorer).Antretan, pou asire sipò kontinye, nou pral rann sit la san estil ak JavaScript.
Gen yon bezwen pou yon sistèm serye in vitro ki ka byen repwodui anviwònman fizyolojik kè a pou tès dwòg.Disponibilite limite nan sistèm kilti tisi kè moun te mennen nan entèpretasyon kòrèk nan efè dwòg kadyak.Isit la, nou te devlope yon modèl kilti tisi kadyak (CTCM) ki electromechanically stimul tranch kè ak sibi detire fizyolojik pandan faz yo sistolik ak dyastolik nan sik la kadyak.Apre 12 jou nan kilti, apwòch sa a pasyèlman amelyore viabilite nan seksyon kè, men li pa t 'konplètman prezève entegrite estriktirèl yo.Se poutèt sa, apre tès depistaj ti molekil, nou te jwenn ke adisyon a nan 100 nM triyodotironin (T3) ak 1 μM dexamethasone (Dex) nan mwayen nou an kenbe mikrostruktur nan seksyon yo pou 12 jou.Nan konbinezon ak tretman T3/Dex, sistèm CTCM kenbe pwofil transcription, viabilite, aktivite metabolik, ak entegrite estriktirèl nan menm nivo ak tisi kè fre pou 12 jou.Anplis de sa, twòp etann nan tisi kadyak nan kilti pwovoke siyal kadyak ipètrofik, bay prèv pou kapasite CTCM nan imite kondisyon ipètrofik pwovoke pa detire kadyak.An konklizyon, CTCM ka modèl fizyoloji ak fizyopatoloji kè a nan kilti pandan peryòd tan ki long, sa ki pèmèt tès depistaj dwòg serye.
Anvan rechèch klinik yo, yo bezwen sistèm serye in vitro ki ka repwodui avèk presizyon anviwònman fizyolojik kè imen an.Sistèm sa yo ta dwe imite chanjman mekanik detire, batman kè, ak pwopriyete elektwofizyolojik.Modèl bèt yo souvan itilize kòm yon platfòm tès depistaj pou fizyoloji kadyak ak fyab limite nan reflete efè yo nan dwòg nan kè imen an1,2.Alafen, Modèl Eksperimantal Kilti Tisi Kadyak Ideyal (CTCM) se yon modèl ki trè sansib ak espesifik pou divès entèvansyon terapetik ak famasi, ki repwodui avèk presizyon fizyoloji ak fizyoloji kè imen an3.Absans yon sistèm konsa limite dekouvèt nouvo tretman pou ensifizans kadyak4,5 e li te mennen nan kadyotoksisite dwòg kòm yon gwo rezon pou sòti nan mache a.
Pandan dènye deseni ki sot pase yo, uit dwòg ki pa kadyovaskilè yo te retire nan itilizasyon klinik paske yo lakòz pwolonje entèval QT ki mennen nan aritmi ventrikulè ak lanmò toudenkou7.Kidonk, gen yon bezwen ogmante pou estrateji depistaj preklinik serye pou evalye efikasite kadyovaskilè ak toksisite.Dènye itilizasyon kardyomyosit selil souch pluripotent ki soti nan imen (hiPS-CM) nan tès depistaj dwòg ak tès toksisite bay yon solisyon pasyèl pou pwoblèm sa a.Sepandan, nati frelikè hiPS-CMs ak mank de konpleksite miltiselilè nan tisi kadyak yo se gwo limit nan metòd sa a.Dènye etid yo te montre ke limitasyon sa a ka an pati simonte lè w itilize hiPS-CM bonè pou fòme idrojèl tisi kadyak yon ti tan apre aparisyon kontraksyon espontane yo ak piti piti ogmante eksitasyon elektrik sou tan.Sepandan, microtissus hiPS-CM sa yo manke pwopriyete matirite elektwofizyolojik ak kontraktil nan myokad adilt la.Anplis de sa, tisi kadyak imen gen yon estrikti ki pi konplèks, ki fòme ak yon melanj etewojèn nan diferan kalite selil, ki gen ladan selil andotelyal, newòn, ak fibroblast stromal, ki konekte pa seri espesifik nan pwoteyin matris ekstraselilè.Eterojenite sa a nan popilasyon ki pa kardyomyosit11,12,13 nan kè mamifè adilt la se yon gwo baryè pou modèl tisi kadyak lè l sèvi avèk kalite selil endividyèl yo.Gwo limit sa yo mete aksan sou enpòtans pou devlope metòd pou kiltive tisi myokad entak nan kondisyon fizyolojik ak patolojik.
Kiltive mens (300 µm) seksyon nan kè imen an pwouve yo se yon modèl pwomèt nan myokad imen entak.Metòd sa a bay aksè a yon sistèm miltiselilè 3D konplè ki sanble ak tisi kè moun.Sepandan, jiska 2019, itilizasyon seksyon kè kiltive yo te limite pa siviv kilti kout (24 h).Sa a se akòz yon kantite faktè ki gen ladan mank de detire fizik-mekanik, koòdone lè-likid, ak itilizasyon medya senp ki pa sipòte bezwen tisi kadyak.Nan 2019, plizyè gwoup rechèch te demontre ke enkòpore faktè mekanik nan sistèm kilti tisi kadyak ka pwolonje lavi kilti, amelyore ekspresyon kadyak, ak imite patoloji kadyak.De etid elegant 17 ak 18 montre ke loading mekanik uniaxial gen yon efè pozitif sou fenotip kadyak pandan kilti.Sepandan, etid sa yo pa t 'sèvi ak dinamik ki genyen twa dimansyon fizik-mekanik chaj sik kadyak la, depi seksyon kè yo te chaje ak swa izometrik fòs rupture 17 oswa lineyè auxotonic loading 18 .Metòd sa yo nan etann tisi yo te lakòz represyon anpil jèn kadyak oswa ekspresyon jèn ki asosye ak repons detire nòmal.Miyò, Pitoulis et al.19 devlope yon beny kilti tranch kè dinamik pou rekonstriksyon sik kadyak lè l sèvi avèk fidbak transducer fòs ak kondui tansyon.Malgre ke sistèm sa a pèmèt pou modèl sik kadyak in vitro pi egzak, konpleksite ak debi ki ba nan metòd la limite aplikasyon an nan sistèm sa a.Laboratwa nou an dènyèman devlope yon sistèm kilti senplifye lè l sèvi avèk eksitasyon elektrik ak yon mwayen optimize pou kenbe rantabilite nan seksyon nan tisi porsin ak kè imen pou jiska 6 jou20,21.
Nan maniskri aktyèl la, nou dekri yon modèl kilti tisi kadyak (CTCM) lè l sèvi avèk seksyon kè kochon an ki enkòpore siyal umoral pou refè fizyoloji kadyak ki genyen twa dimansyon ak distension fizyolojik pandan sik kadyak la.CTCM sa a ka ogmante presizyon prediksyon dwòg pre-klinik nan yon nivo pa janm te rive reyalize lè li bay yon sistèm kadyak pri-efikas, mitan-debi ki imite fizyoloji / fizyoloji kè mamifè a pou tès dwòg pre-klinik.
Siyal mekanik emodinamik jwe yon wòl enpòtan nan kenbe fonksyon cardiomyocyte nan vitro 22,23,24.Nan maniskri aktyèl la, nou te devlope yon CTCM (Figi 1a) ki ka imite anviwònman kadyak granmoun lè yo pwovoke tou de eksitasyon elektrik ak mekanik nan frekans fizyolojik (1.2 Hz, 72 bat pou chak minit).Pou evite twòp detire tisi pandan dyastole, yo te itilize yon aparèy enprime 3D pou ogmante gwosè tisi pa 25% (Fig. 1b).Sistèm C-PACE te pwovoke ritm elektrik pou kòmanse 100 ms anvan sistòl lè l sèvi avèk yon sistèm akizisyon done pou repwodui konplètman sik kadyak la.Sistèm kilti tisi a sèvi ak yon actuator pneumatik pwogramasyon (LB Jeni, Almay) pou siklikman elaji yon manbràn silikon fleksib pou lakòz ekspansyon tranch kè yo nan chanm anwo a.Sistèm nan te konekte ak yon liy lè ekstèn atravè yon transducer presyon, sa ki te fè li posib ajiste avèk presizyon presyon an (± 1 mmHg) ak tan (± 1 ms) (figi 1c).
a Tache seksyon tisi a nan bag sipò 7 mm, ki montre an ble, andedan chanm kilti aparèy la.Chanm kilti a separe de chanm lè a pa yon mens manbràn silikon fleksib.Mete yon garnitur ant chak chanm pou anpeche koule.Kouvèti aparèy la gen elektwòd grafit ki bay eksitasyon elektrik.b Reprezantasyon chematik gwo aparèy tisi a, bag gid ak bag sipò.Seksyon tisi yo (mawon) yo mete sou aparèy la gqo ak bag gid la mete nan Groove a sou kwen an deyò nan aparèy la.Sèvi ak gid la, ak anpil atansyon mete bag sipò a kouvwi ak tisi Acrylic adezif sou seksyon an nan tisi kadyak.c Grafik ki montre tan an nan eksitasyon elektrik kòm yon fonksyon nan presyon chanm lè kontwole pa yon actuator pneumatik pwogramasyon (PPD).Yo te itilize yon aparèy akizisyon done pou senkronize eksitasyon elektrik lè l sèvi avèk detèktè presyon.Lè presyon nan chanm kilti a rive nan papòt la fikse, yo voye yon siyal batman kè bay C-PACE-EM pou deklanche eksitasyon elektrik.d Imaj kat CTCM yo mete sou yon etajè enkibatè.Kat aparèy yo konekte ak yon PPD atravè yon kous pneumatik, ak detèktè presyon yo mete nan tiyo emostatik la pou kontwole presyon an nan kous la pneumatic.Chak aparèy gen sis seksyon tisi.
Sèvi ak yon sèl actuator pneumatic, nou te kapab kontwole 4 aparèy CTCM, chak nan yo ki te kapab kenbe 6 seksyon tisi (Fig. 1d).Nan CTCM, presyon lè a nan chanm lè a konvèti nan presyon synchrone nan chanm likid la epi li pwovoke ekspansyon fizyolojik nan tranch kè a (Figi 2a ak fim siplemantè 1).Evalyasyon detire tisi nan 80 mm Hg.Atizay.te montre etann nan seksyon tisi pa 25% (Fig. 2b).Yo montre pousantaj detire sa a koresponn ak yon longè sarkomè fizyolojik 2.2-2.3 µm pou kontraktilite nòmal seksyon kadyak17,19,25.Mouvman tisi yo te evalye lè l sèvi avèk anviwònman kamera koutim (figi siplemantè 1).Anplitid la ak vitès mouvman tisi (figi 2c, d) koresponn ak detire pandan sik kadyak la ak tan pandan sistòl ak dyastole (figi 2b).Detire ak vitès tisi kadyak pandan kontraksyon ak detant rete konstan pou 12 jou nan kilti (Fig. 2f).Pou evalye efè eksitasyon elektrik sou kontraktilite pandan kilti, nou devlope yon metòd pou detèmine defòmite aktif lè l sèvi avèk yon algorithm lonbraj (figi siplemantè 2a, b) epi nou te kapab fè distenksyon ant defòmasyon ak ak san eksitasyon elektrik.Menm seksyon kè a (figi 2f).Nan rejyon an mobil nan koupe a (R6-9), vòltaj la pandan eksitasyon elektrik te 20% pi wo pase nan absans eksitasyon elektrik, ki endike kontribisyon nan eksitasyon elektrik nan fonksyon kontraktil.
Reprezantan tras presyon chanm lè a, presyon chanm likid, ak mezi mouvman tisi konfime ke presyon chanm chanje presyon chanm likid, sa ki lakòz yon mouvman korespondan nan tranch tisi a.b Tras reprezantatif detire pousan (ble) nan seksyon tisi ki koresponn ak detire pousan (zoranj).c Mouvman mezire tranch kadyak la konsistan avèk vitès mouvman yo mezire.(d) Trajectory reprezantatif mouvman siklik (liy ble) ak vitès (liy pwentiye zoranj) nan yon tranch kè a.e Quantification tan sik (n = 19 tranch pou chak gwoup, ki soti nan kochon diferan), tan kontraksyon (n = 19 tranch pou chak gwoup), tan detant (n = 19 tranch pou chak gwoup, ki soti nan kochon diferan), mouvman tisi (n = 25).tranch) / gwoup soti nan kochon diferan), vitès pik sistolik (n = 24 (D0), 25 (D12) tranch / gwoup soti nan kochon diferan) ak to detant pik (n = 24 (D0), 25 (D12) tranch / gwoup soti nan kochon diferan).Egzamen t Elèv de-ke pa montre okenn diferans enpòtan nan okenn paramèt.f Reprezantan souch analiz tras nan seksyon tisi ak (wouj) ak san (ble) eksitasyon elektrik, dis zòn rejyonal nan seksyon tisi ki soti nan menm seksyon an.Panno anba yo montre quantification pousantaj diferans nan souch nan seksyon tisi ak ak san eksitasyon elektrik nan dis zòn ki soti nan diferan seksyon. (n = 8 tranch/gwoup ki soti nan kochon diferan, De-tailed Student t-tès fèt; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 tranch/gwoup ki soti nan kochon diferan, De-tailed Student t-tès fèt; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; *****p<0,1,00,<0,0,**p<0,0,**p). (n = 8 seksyon/gwoup ki soti nan kochon diferan, tès t Elèv de-ke; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.01，*p < 0.0001， （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.01，*p < 0.0001， (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *5). (n = 8 seksyon/gwoup, ki soti nan kochon diferan, tès t Elèv de-ke; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Ba erè reprezante mwayèn ± devyasyon estanda.
Nan sistèm kiltirèl estatik biomimetic kè nou an [20, 21], nou te kenbe viabilite, fonksyon, ak entegrite estriktirèl nan tranch kè pou 6 jou lè nou aplike eksitasyon elektrik ak optimize konpozisyon mwayen an.Sepandan, apre 10 jou, figi sa yo tonbe sevè.Nou pral refere a seksyon kiltive nan sistèm estatik biomimetic kilti anvan nou an 20, 21 kondisyon kontwòl (Ctrl) epi nou pral sèvi ak medyòm deja optimize nou an kòm kondisyon MC ak kilti anba similtane eksitasyon mekanik ak elektrik (CTCM).rele.Premyèman, nou te detèmine ke eksitasyon mekanik san eksitasyon elektrik te ensifizan pou kenbe viabilite tisi pou 6 jou (Siplemantè Figi 3a, b).Enteresan, ak entwodiksyon de eksitasyon fizyo-mekanik ak elektrik lè l sèvi avèk STCM, viabilite nan seksyon kè 12-jou rete menm jan ak nan seksyon kè fre nan kondisyon MS, men se pa anba kondisyon Ctrl, jan yo montre nan analiz MTT (Fig. 1).3a).Sa a sijere ke eksitasyon mekanik ak simulation nan sik la kadyak ka kenbe seksyon tisi solid pou de fwa osi lontan ke yo rapòte nan sistèm kilti estatik anvan nou an.Sepandan, evalyasyon entegrite estriktirèl nan seksyon tisi pa imunolabeling nan kadyak troponin T ak connexin 43 te montre ke ekspresyon connexin 43 te siyifikativman pi wo nan tisi MC nan jou 12 pase nan kontwòl nan menm jou a.Sepandan, ekspresyon inifòm connexin 43 ak fòmasyon Z-disk pa te konplètman konsève (figi 3b).Nou itilize yon kad entèlijans atifisyèl (AI) pou quantifier entegrite estriktirèl tisi26, yon tiyo aprantisaj pwofon ki baze sou imaj ki baze sou troponin-T ak tach konnexin43 pou otomatikman quantifier entegrite estriktirèl ak fliyoresans tranch kè an tèm de fòs lokalizasyon.Metòd sa a sèvi ak yon Rezo Neural Convolutional (CNN) ak yon kad aprantisaj pwofon pou byen mezire entegrite estriktirèl tisi kadyak nan yon fason otomatize ak san patipri, jan sa dekri nan referans la.26. Tisi MC te montre resanblans estriktirèl amelyore ak jou 0 konpare ak seksyon kontwòl estatik.Anplis de sa, tach trikrom Masson a revele yon pousantaj siyifikativman pi ba nan fibwoz nan kondisyon MS konpare ak kondisyon kontwòl nan jou 12 nan kilti (Fig. 3c).Pandan ke CTCM ogmante viabilite nan seksyon tisi kè nan jou 12 nan yon nivo ki sanble ak sa yo ki nan tisi kè fre, li pa t 'amelyore entegrite estriktirèl nan seksyon kè yo.
Yon graf Bar montre quantification de viabilité MTT nan tranch kè fre (D0) oswa kilti tranch kè pou 12 jou swa nan kilti estatik (D12 Ctrl) oswa nan CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC / MC, se yon fason diferan de A## tès yo fè yon fason diferan; 0.0001 konpare ak D0 ak **p <0.01 konpare ak D12 Ctrl). Yon graf Bar montre quantification de viabilité MTT nan tranch kè fre (D0) oswa kilti tranch kè pou 12 jou swa nan kilti estatik (D12 Ctrl) oswa nan CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl MC, se yon fason diferan de tès NOVA, yon fason diferan de # pilices/gwoup NOVA) <0.0001 konpare ak D0 ak **p <0.01 konpare ak D12 Ctrl).istogram la montre quantification de viabilité de seksyon kè fre MTT (D0) oswa kilti nan seksyon kè pou 12 jou nan swa kilti estatik (D12 kontwòl) oswa CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontwòl).####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 konpare ak D0 ak **p <0.01 konpare ak D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏刿切爇爇切爇切切牄养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测#0.#0 测踕#0. 001，与D12 Ctrl 相比，**p <0.01)。 yon 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏刪窇)新鲜心脏刪窇片切)的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl ，**比。istogram ki montre quantification nan viabilite MTT nan seksyon kè fre (D0) oswa seksyon kè kiltive pou 12 jou nan kilti estatik (D12 kontwòl) oswa CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontwòl)), 12 (D12 MC) seksyon/gwoup ki soti nan diferan kochon tès ANOVA;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 konpare ak D0, **p <0.01 konpare ak D12 Ctrl).b Troponin-T (vèt), connexin 43 (wouj) ak DAPI (ble) nan seksyon kè frèch izole (D0) oswa seksyon kè kiltive nan kondisyon estatik (Ctrl) oswa kondisyon CTCM (MC) pou 12 jou) nan imaj iminofluoresan reprezantan (echèl vid = 100 µm). Kantifikasyon entèlijans atifisyèl nan entegrite estriktirèl tisi kè a (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranch / gwoup chak soti nan kochon diferan, tès ANOVA yon sèl-fason fèt; ####p <0.0001 konpare ak D0 ak ****p <0.0012 konpare ak D). Kantifikasyon entèlijans atifisyèl nan entegrite estriktirèl tisi kè a (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranch / gwoup chak soti nan kochon diferan, tès ANOVA yon sèl-fason fèt; ####p <0.0001 konpare ak D0 ak ****p <0.001 C konpare). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектой целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n) , (n = 177) (D1), (n = 177) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравненей, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравненится однофакторный тест ANOVA; ию с D12 Ctrl). Kantifikasyon entegrite estriktirèl tisi kadyak pa entèlijans atifisyèl (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seksyon / gwoup ki soti nan kochon diferan, yon sèl-fason ANOVA tès fèt; ####p <0.0001 vs ak D0 ak ****p <0.0001 C konpare).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranch/gwoup chak kochon diferan, yon sèl-fason ANOVA tès <1 0 且 盔#0#0p0 ; ，****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranch/gwoup chak nan diferan kochon, yon sèl-fason tès ANOVA 0 0. ，****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткан (D12), =77н (D12), (D12), MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs D0 Для сран0вне1 сран0вне1 с D12 Ctrl). Atifisyèl entèlijans pou quantifier entegrite estriktirèl tisi kadyak (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seksyon/gwoup chak kochon diferan, yon sèl-fason tès ANOVA; ####p<0.0001 vs .D0 Pou konparezon ****p <0.0001 C konpare ak D). c Imaj reprezantatif (agòch) ak quantification (adwat) pou tranch kè tache ak tach trikrom Masson a (echèl bare = 500 µm) (n = 10 tranch/gwoup chak soti nan diferan kochon, tès ANOVA yon sèl-fason fèt; ####p <0.0001 konpare ak D0 ak D0.101. c Imaj reprezantatif (agòch) ak quantification (adwat) pou tranch kè ki tache ak tach trikrom Masson a (echèl bare = 500 µm) (n = 10 tranch/gwoup chak soti nan diferan kochon, tès ANOVA yon sèl-fason fèt; #### p <0.0001 konpare ak D0 ak D0.10. c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окличественная оценка (справа) срезов сердца, окрамынца сителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свинтей покрытия, вестонод ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Imaj reprezantatif (gòch) ak quantification (adwat) nan seksyon kè tache ak tach trichrome Masson a (echèl san kouvwi = 500 µm) (n = 10 seksyon/gwoup ki soti nan diferan kochon, yon sèl-fason tès ANOVA fèt; #### p <0.0001 konpare ak D0 ak ***02 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸將的代表性图像（左）和量化（右）（裸尪（裸尪（10µ=（裸尪（10µ=切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比 与D0 相比 与D0 相比，D***0，，***0） ，D ４1 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 尺 度 尺 度度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 浛#0#0 浛#0.相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окличественный анализ (справа) срезов сердца, онкрамы сителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, просод свиньи, просод проснь факторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению Crсl). c Imaj reprezantatif (agòch) ak kantite (adwat) nan seksyon kè tache ak tach trikrom Masson a (vid = 500 µm) (n = 10 seksyon/gwoup, yo chak soti nan yon kochon diferan, teste pa yon sèl-fason analiz de divèjans ;### # p <0.0001 konpare ak D0, ***0 p < 0.0001 konpare ak D0, *** 0.Ba erè reprezante mwayèn ± devyasyon estanda.
Nou te sipoze ke lè nou ajoute ti molekil nan mwayen kilti a, entegrite cardiomyocyte ta ka amelyore ak devlopman fibwoz redwi pandan kilti CTCM.Se poutèt sa, nou te fè tès depistaj pou ti molekil lè l sèvi avèk kilti kontwòl estatik nou yo20,21 akòz ti kantite faktè konfonn.Dexamethasone (Dex), triyodothyronine (T3), ak SB431542 (SB) yo te chwazi pou ekran sa a.Ti molekil sa yo te deja itilize nan kilti hiPSC-CM pou pwovoke spirasyon kardyomyosit lè yo ogmante longè sarcomè, tubul T, ak vitès kondiksyon.Anplis de sa, tou de Dex (yon glucocorticoid) ak SB yo konnen yo siprime enflamasyon29,30.Se poutèt sa, nou teste si enklizyon de youn oswa yon konbinezon de molekil ti sa yo ta amelyore entegrite estriktirèl nan seksyon kè.Pou tès depistaj inisyal, yo te chwazi dòz la nan chak konpoze ki baze sou konsantrasyon yo souvan itilize nan modèl kilti selil (1 μM Dex27, 100 nM T327, ak 2.5 μM SB31).Apre 12 jou kilti, konbinezon T3 ak Dex te lakòz entegrite estriktirèl cardiomyocyte optimal ak renovasyon fib minimòm (Figi Siplemantè 4 ak 5).Anplis de sa, itilizasyon doub oswa doub konsantrasyon sa yo nan T3 ak Dex pwodui efè danjere konpare ak konsantrasyon nòmal (Siplemantè Figi 6a, b).
Apre premye tès depistaj, nou te fè yon konparezon tèt-a-tèt nan 4 kondisyon kilti (Figi 4a): Ctrl: seksyon kè kiltive nan kilti estatik nou te dekri deja lè l sèvi avèk mwayen optimize nou an;20.21 TD: T3 ak Ctrl te ajoute Dex nan Mèkredi;MC: seksyon kè kiltive nan CTCM lè l sèvi avèk mwayen nou deja optimize;ak MT: CTCM ak T3 ak Dex ajoute nan mwayen an.Apre 12 jou kiltivasyon, rantabilite MS ak tisi MT yo rete menm jan ak tisi fre evalye pa tès MTT (Fig. 4b).Enteresan, adisyon a nan T3 ak Dex nan kilti transwell (TD) pa te lakòz yon amelyorasyon siyifikatif nan viabilite konpare ak kondisyon Ctrl, ki endike yon wòl enpòtan nan eksitasyon mekanik nan kenbe viabilite nan seksyon kè.
yon dyagram konsepsyon eksperimantal ki dekri kat kondisyon kilti yo itilize pou evalye efè eksitasyon mekanik ak sipleman T3/Dex sou mwayen pou 12 jou. b Grafik ba montre quantification nan viabilite 12 jou apre kilti nan tout kondisyon kilti 4 (Ctrl, TD, MC, ak MT) konpare ak tranch kè fre (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ak D12 MT), 12 (D12 MC, ak MT) se yon fason diferan fè tès NOVA; 0.0001, ###p <0.001 konpare ak D0 ak **p <0.01 konpare ak D12 Ctrl). b Grafik ba montre quantification nan viabilite 12 jou apre kilti nan tout kondisyon kilti 4 (Ctrl, TD, MC, ak MT) konpare ak tranch kè fre (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ak D12 MT), 12 (D12 MC, ak MT) se yon fason diferan fè tès NOVA; 0.0001, ###p <0.001 konpare ak D0 ak **p <0.01 konpare ak D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после венную оценку жизнеспособности через 12 дней после венную кусроьво ви4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (D01, D18) (D01, D18 = D18) 12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 со,###p < 0,00001 со, #0# D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Grafik ba a montre quantification nan viabilite nan 12 jou apre kilti nan tout kondisyon kilti 4 (kontwòl, TD, MC, ak MT) konpare ak seksyon kè fre (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, ak D12 MT), 12 (D12 MC, MC, ak MT) seksyon tès / #p00100; 1, ###p <0.001 kont D0 ak **p <0.01 pa konpare ak D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D150)、D12 (D12)、D12和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.0001，，#0#0. 缌#.**#0. 01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнения сравнения сравнения сравнения сравнения ца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, одноппа, односторо,##0носторо,##00 p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Istogram ki montre tout 4 kondisyon kilti (kontwòl, TD, MC ak MT) konpare ak seksyon kè fre (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ak D12 MT), ki soti nan diferan kochon 12 (D12 MC) seksyon/gwoup, yon sèl-fason ANOVA tès <, ####0. **p<0.01 kont kontwòl D12). c Bar graf montre quantification flux glikoz 12 jou apre kilti nan tout kondisyon kilti 4 (Ctrl, TD, MC, ak MT) konpare ak tranch kè fre (D0) (n = 6 tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, tès ANOVA yon sèl-fason fèt; ###p <0.001, konpare ak ***01 D0, konpare ak D0. c Bar graf montre quantification flux glikoz 12 jou apre kilti nan tout kondisyon kilti 4 (Ctrl, TD, MC, ak MT) konpare ak tranch kè fre (D0) (n = 6 tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, tès ANOVA yon sèl-fason fèt; ###p <0.001, konpare ak ***01 D0, konpare ak D0. c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после кулхную оценку потока глюкозы через 12 дней после кулхную кульвстани овиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 правнению свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению C D0). c Istogram montre quantification flux glikoz 12 jou apre kilti anba tout kondisyon kilti 4 (kontwòl, TD, MC ak MT) konpare ak seksyon kè fre (D0) (n = 6 seksyon/gwoup ki soti nan kochon diferan, yon sèl-fason tès ANOVA fèt; ###p <0.001 konpare ak D0 ak ***p < 0.001 konpare ak D02). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 盌柯1＄囌柩厔兼糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 ，与D0 ， ， ， ， ， D0 ， ， ， ， ， ， l 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片片 切片后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 定量 ， A试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней послед венную оценку 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0)/по сравнению со свежими срезами сердца (D0)/пра сравнению со свежими срезами сердца (D0) ных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 псо нию с D0, ***p < 0,001 по сниро псо ни 2). c Istogram ki montre quantification flux glikoz nan 12 jou apre kilti pou tout kondisyon kilti 4 (kontwòl, TD, MC, ak MT) konpare ak seksyon kè fre (D0) (n = 6 seksyon/gwoup, ki soti nan kochon diferan, inilateral Te ANOVA tès yo te fèt, ###p <0.001 konpare ak D0, 10.001p <kontwòl) (D0.d Trase analiz souch nan tisi fre (ble), jou 12 MC (vèt), ak jou 12 MT (wouj) tisi nan dis pwen seksyon tisi rejyonal yo (n = 4 tranch/gwoup, tès ANOVA yon sèl-fason; pa te gen okenn diferans enpòtan ant gwoup yo).e Trase Volcano ki montre jèn ki eksprime diferan nan seksyon kè fre (D0) konpare ak seksyon kè ki kiltive nan kondisyon estatik (Ctrl) oswa nan kondisyon MT (MT) pou 10-12 jou.f Heatmap jèn sarkomè pou seksyon kè yo kiltive anba chak kondisyon kilti.Ba erè reprezante mwayèn ± devyasyon estanda.
Depandans metabolik sou chanjman ki soti nan oksidasyon asid gra nan glikoliz se yon karakteristik dedifferentiation kardyomyosit.Cardiomyocytes ki pa gen matirite yo itilize prensipalman glikoz pou pwodiksyon ATP epi yo gen mitokondri ipoplastik ak kèk kristae5,32.Analiz itilizasyon glikoz te montre ke nan kondisyon MC ak MT, itilizasyon glikoz te sanble ak sa nan tisi jou 0 (Figi 4c).Sepandan, echantiyon Ctrl te montre yon ogmantasyon siyifikatif nan itilizasyon glikoz konpare ak tisi fre.Sa a endike ke konbinezon an nan CTCM ak T3/Dex amelyore viabilite tisi ak prezève fenotip metabolik nan seksyon kè kiltive 12 jou.Anplis de sa, analiz souch te montre ke nivo souch rete menm jan ak nan tisi kè fre pou 12 jou anba MT ak MS kondisyon (Fig. 4d).
Pou analize enpak jeneral CTCM ak T3/Dex sou peyizaj transkripsyon mondyal la nan tisi tranch kadyak, nou te fè RNAseq sou tranch kadyak nan tout kat kondisyon kilti diferan (Done siplemantè 1).Enteresan, seksyon MT yo te montre gwo resanblans transkripsyon ak tisi kè fre, ak sèlman 16 diferan eksprime soti nan 13,642 jèn.Sepandan, jan nou te montre pi bonè, tranch Ctrl parèt 1229 diferan eksprime jèn apre 10-12 jou nan kilti (Fig. 4e).Done sa yo te konfime pa qRT-PCR nan kè ak jèn fibroblast (Siplemantè Fig. 7a-c).Enteresan, seksyon Ctrl yo te montre downregulation nan jèn kadyak ak sik selilè ak aktivasyon nan pwogram jèn enflamatwa.Done sa yo sijere ke dedifferentiation, ki nòmalman rive apre kilti alontèm, konplètman atenye anba kondisyon MT (Siplemantè Figi 8a, b).Etid ak anpil atansyon sou jèn sarcomere yo te montre ke sèlman nan kondisyon MT yo se jèn yo ki kode sarcomere a (figi 4f) ak chanèl ion (figi siplemantè 9) konsève, pwoteje yo kont repwesyon anba kondisyon Ctrl, TD, ak MC.Done sa yo demontre ke ak yon konbinezon de eksitasyon mekanik ak umoral (T3/Dex), transcriptome tranch kè a ka rete menm jan ak tranch kè fre apre 12 jou nan kilti.
Rezilta transkripsyon sa yo sipòte pa lefèt ke entegrite estriktirèl cardiomyocytes nan seksyon kè pi byen konsève anba kondisyon MT pou 12 jou, jan yo montre pa entak ak lokalize connexin 43 (Fig. 5a).Anplis de sa, fibwoz nan seksyon kè anba kondisyon MT yo te siyifikativman redwi konpare ak Ctrl ak menm jan ak seksyon kè fre (figi 5b).Done sa yo demontre ke konbinezon an nan eksitasyon mekanik ak tretman T3/Dex efektivman prezève estrikti kadyak nan seksyon kè nan kilti.
a Reprezantan imaj imunofluoresan troponin-T (vèt), connexin 43 (wouj), ak DAPI (ble) nan seksyon kè ki fèk izole (D0) oswa kiltive pou 12 jou nan tout kat kondisyon kilti seksyon kè (ba echèl = 100 µm).). Kantifikasyon entèlijans atifisyèl nan entegrite estriktirèl tisi kè a (n = 7 (D0 ak D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ak D12 MT) tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, yo fè tès ANOVA yon sèl-fason; ####p <0.0001 konpare ak D0.0.00.00.00.00.00.00.00.00. trl). Kantifikasyon entèlijans atifisyèl nan entegrite estriktirèl tisi kè a (n = 7 (D0 ak D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ak D12 MT) tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, tès ANOVA yon sèl-fason fèt; #### p <0.0001 konpare ak D0.0.0001 konpare ak D0. trl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного = инт12), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### срезов/группу от разных свиней; 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kwantifikasyon nan entegrite nan estriktirèl nan tisi kè lè l sèvi avèk entèlijans atifisyèl (n = 7 (D0 ak D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ak D12 MT) seksyon/gwoup soti nan kochon diferan, yon sèl-fason ANOVA tès;对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和/D12 和 和 廿 建 MT工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p 或****p < 0,00001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,00001 或****p对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc （12 mc （ 和 d12 ）智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相 戸0.相比）。Kantifikasyon entegrite estriktirèl tisi kadyak lè l sèvi avèk entèlijans atifisyèl nan kochon diferan (n = 7 (D0 ak D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ak D12 MT) seksyon / gwoup) ak yon tès ANOVA yon sèl-fason;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0.0001 konpare ak D0 ak *p <0.05 oswa ****p <0.0001 konpare ak D12 Ctrl). b Imaj reprezantatif ak quantification pou tranch kè ki tache ak tach trikrom Masson a (ba echèl = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ak D12 MC), 9 (D12 MT) tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, yon sèl-fason tès ANOVA ##0 fè konparezon ***0#0p0. <0.001, oswa ****p <0.0001 konpare ak D12 Ctrl). b Imaj reprezantatif ak quantification pou tranch kè ki tache ak tach trikrom Masson a (ba echèl = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ak D12 MC), 9 (D12 MT) tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, yon sèl-fason tès ANOVA ##0 fè konparezon ***0#0p0. <0.001, oswa ****p <0.0001 konpare ak D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных трашенных трашенных трашенных траственная оценка срезов сердца а (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от раныно ныт разнод сторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению сl D12 Ct). b Imaj reprezantatif ak quantification nan seksyon kè tache ak tach trichrome Masson a (ba echèl = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ak D12 MC), 9 (D12 MT) seksyon/gwoup ki soti nan diferan kochon, fè yon sèl-fason ANOVA ; #0##0.0. ****p <0.0001 kont D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）㼈D12010）㼈D1201010（D12010和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； 个 析； 个 析； 析； 析； 析； 01 析； 切 0. 0.001，或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm（ 10 µm （ 10 （ （ 0 （ 1 （ （ 1 （ 1 （ 1 （ 1 （ rl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 不同 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析， 析， 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析， 析， 攸#0p01 攸#0p01 <0.001，或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных трашеных ая линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / групиней / групиней / групиней / групиней / групиней / групипы,#0; 01 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Imaj reprezantatif ak quantification nan seksyon kè tache ak trichrome Masson a (ba echèl = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ak D12 MC), 9 (D12 MT) seksyon ki soti nan diferan kochon/gwoup, yon metòd ANOVA; ####00, 1 < 0, 1 < 0, 1 < 0, 1 < 0, 1 < 0, 1 < 0, 1 < 0, 1 < 0, 1. 0.0001 konpare ak D12 Ctrl).Ba erè reprezante mwayèn ± devyasyon estanda.
Finalman, kapasite CTCM pou imite ipètrofi kadyak yo te evalye lè yo ogmante detire tisi kadyak.Nan CTCM, pik presyon chanm lè ogmante soti nan 80 mmHg a 80 mmHg.Atizay.(detire nòmal) jiska 140 mmHg Atizay.(Fig. 6a).Sa a koresponn ak yon ogmantasyon 32% nan detire (figi 6b), ki te deja montre kòm detire pousantaj ki koresponn ki nesesè pou seksyon kè yo reyalize yon longè sarcomere ki sanble ak sa yo wè nan ipètrofi.Detire ak vitès tisi kadyak pandan kontraksyon ak detant te rete konstan pandan sis jou kilti (figi 6c).Tisi kadyak ki soti nan kondisyon MT yo te sibi detire nòmal (MT (Nòmal)) oswa kondisyon overstretch (MT (OS)) pou sis jou.Deja apre kat jou nan kilti, biomarker ipètrofik NT-ProBNP te siyifikativman elve nan mwayen an anba kondisyon MT (OS) konpare ak kondisyon MT (nòmal) (Fig. 7a).Anplis de sa, apre sis jou nan kilti, gwosè selil la nan MT (OS) (figi 7b) siyifikativman ogmante konpare ak seksyon nan kè MT (nòmal).Anplis de sa, translokasyon nikleyè NFATC4 te siyifikativman ogmante nan tisi overstretched (figi 7c).Rezilta sa yo montre devlopman pwogresif nan renovasyon patolojik apre hyperdistension epi sipòte konsèp ke aparèy CTCM a ka itilize kòm yon platfòm pou etidye siyal ipètrofi kadyak detire.
Reprezantan tras presyon chanm lè a, presyon chanm likid, ak mezi mouvman tisi konfime ke presyon chanm chanje presyon chanm likid, sa ki lakòz yon mouvman korespondan nan tranch tisi a.b Pousantaj detire reprezantatif ak koub pousantaj detire pou seksyon tisi nòmalman lonje (zoranj) ak overstretched (ble).c Grafik ba ki montre tan sik (n = 19 tranch pou chak gwoup, ki soti nan kochon diferan), tan kontraksyon (n = 18-19 tranch pou chak gwoup, ki soti nan kochon diferan), tan detant (n = 19 tranch pou chak gwoup, ki soti nan kochon diferan)), anplitid mouvman tisi (n = 14 tranch / gwoup), (n = 14 tranch / gwoup vitès), (peak = 14 tranch / gwoup vitès, 1 vitès = 1/gwoup). soti nan kochon diferan) ak to pik detant (n = 14 (D0), 15 (D6) ) seksyon / gwoup) soti nan kochon diferan), de-tailed Student's t-test te montre pa gen okenn diferans enpòtan nan nenpòt paramèt, ki endike ke paramèt sa yo rete konstan pandan 6 jou nan kilti ak ovèrvoltaj.Ba erè reprezante mwayèn ± devyasyon estanda.
Yon graf Bar quantification de konsantrasyon NT-ProBNP nan medya kilti soti nan tranch kè kiltive anba MT nòmal detire (Norm) oswa overstretching (OS) kondisyon (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ak D4 MTOS) tranch/gwoup ki soti nan kochon diferan, De-fason ANOVA se fè konpare ak 0 nòmal; **1p. Yon graf Bar quantification nan konsantrasyon NT-ProBNP nan medya kilti soti nan tranch kè kiltive anba MT nòmal detire (Norm) oswa overstretching (OS) kondisyon (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ak D4 MTOS) tranch/gwoup ki soti nan kochon diferan, De-fason ANOVA konpare ak nòmal 0.**1p.Istogram kantitatif nan konsantrasyon NT-ProBNP nan mwayen kilti soti nan tranch kè kiltive nan kondisyon nan nòmal MT detire (nòm) oswa overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ak D4).MTOS) tranch / gwoup soti nan kochon diferan, analiz de faktè divèjans fèt;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 konpare ak detire nòmal). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓坡度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓坡培养的心脏(D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析方差分析）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；丣析）攸中攛攸攛攛0.01）。 a Quantification nan konsantrasyon NT-ProBNP nan tranch kè kiltive nan kondisyon MT nòmal detire (Norm) oswa overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) ki soti nan diferan 猪的切片/组切片/组，可䐑奏叹抏**叹叹; pare ak etann nòmal, p <0.01).Istogram Kantifikasyon nan konsantrasyon NT-ProBNP nan tranch kè kiltive nan kondisyon nòmal MT detire (nòm) oswa overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) ak D4 MTOS) tranch / gwoup ki soti nan kochon diferan, analiz de divèjans;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 konpare ak detire nòmal). b Imaj reprezantatif pou tranch kè tache ak troponin-T ak WGA (agòch) ak kantite selil gwosè (adwat) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) selil/gwoup ki soti nan 10 tranch diferan soti nan kochon diferan, De-tailed Student t-tès fèt; ****0 p <1 0 konpare ak nòmal). b Imaj reprezantatif pou tranch kè tache ak troponin-T ak WGA (agòch) ak kantite gwosè selil (adwat) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) selil/gwoup ki soti nan 10 tranch diferan ki soti nan kochon diferan, tès t Elèv de-tail fèt; ****0 p <10 konpare ak nòmal. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестова) срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестова). ения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезных срезов от срезов от срезов от веры тся хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Imaj reprezantatif nan seksyon kè tache ak troponin-T ak AZP (agòch) ak kantite gwosè selil (adwat) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) selil/gwoup ki soti nan 10 seksyon diferan soti nan kochon diferan, yo te fè tès t Student de-tailed; ****p <1 konpare ak nòmal. b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表切的代表性30（（30 ，来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生有尾学生切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生有尾学生有尾学生切片的369 ，****p <0.0001）。 b Imaj reprezantatif tranch kè ki tache ak kalcarein-T ak WGA (agòch) ak gwosè selil (adwat) (n = 330 (D6 MTOS), 369 soti nan 10 tranch diferan (D6 MTNorm)) Selil/组，两方法有尾学尾学甛0010ppare ak tès nòmal. ). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестов сердца) размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свируней пи, Клих свируней пи критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Imaj reprezantatif nan seksyon kè tache ak troponin-T ak AZP (gòch) ak quantification nan gwosè selil (adwat) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) soti nan 10 seksyon diferan soti nan kochon diferan) Selil/gwoup, kritè de keu Elèv la;****p <0.0001 konpare ak souch nòmal). c Imaj reprezantatif pou tranch kè MTOS jou 0 ak jou 6 immunolabeled pou troponin-T ak NFATC4 ak quantification de translocation NFATC4 nan nwayo CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranch/gwoup ki soti nan kochon diferan, De-tailed Student t-test <p> fè.005). c Imaj reprezantatif pou tranch kè MTOS jou 0 ak jou 6 immunolabeled pou troponin-T ak NFATC4 ak quantification de translocation de NFATC4 nan nwayo CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranch/gwoup ki soti nan kochon diferan, * De-tailed Student t-p test fè). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, имуномеченых для тропон и трозент, трозентативные для срезов сердца енная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу срезов/группу срезов/группу оны нырнозных клеток я двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Imaj reprezantatif pou seksyon kè nan 0 ak 6 jou MTOS, imunolabeled pou troponin-T ak NFATC4, ak quantification nan NFATC4 translokasyon nan nwayo a nan selil kavènèz (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon) fè de-tès elèv la;*p <0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表怏性囌标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表怏囌标记的第的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学的量化) <0. c Imaj reprezantatif kalcanin-T ak NFATC4 imunolabeling 第0天和第6天MTOS tranch kè, ak NFATC4 ki soti nan diferan NFATC4 易位至CM nwayo selil 的kantite化 (n = 4 (D0), 3 (D6 天和第6天天天 MTOS,)学生et 电影；*p <0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тромповки тром поТи тром поТи 4 енная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два-статры свиней юдента; *p <0,05). c Imaj reprezantatif nan tranch kè MTOS nan jou 0 ak jou 6 pou troponin-T ak NFATC4 imunolabeling ak quantification nan NFATC4 translokasyon nan nwayo a nan CM soti nan kochon diferan (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranch/gwoup, de-tailed t -criterion Student's.;05).Ba erè reprezante mwayen ± devyasyon estanda.
Rechèch kadyovaskilè tradiksyon mande modèl selilè ki repwodui avèk presizyon anviwònman kadyak la.Nan etid sa a, yo te devlope ak karakterize yon aparèy CTCM ki ka ankouraje seksyon ultramens nan kè a.Sistèm CTCM a gen ladan eksitasyon elektwomekanik senkronize fizyolojik ak anrichisman likid T3 ak Dex.Lè seksyon kè kochon yo te ekspoze a faktè sa yo, viabilite yo, entegrite estriktirèl, aktivite metabolik, ak ekspresyon transcriptional rete menm jan ak nan tisi kè fre apre 12 jou nan kilti.Anplis de sa, twòp etann nan tisi kadyak ka lakòz ipètrofi nan kè a ki te koze pa hyperextension.An jeneral, rezilta sa yo sipòte wòl enpòtan nan kondisyon kilti fizyolojik nan kenbe yon fenotip kadyak nòmal epi yo bay yon platfòm pou tès depistaj dwòg.
Anpil faktè kontribye nan kreye yon anviwònman optimal pou fonksyone ak siviv nan kadyomiosit.Ki pi evidan nan faktè sa yo ki gen rapò ak (1) entèraksyon entèselilè, (2) eksitasyon elektwomekanik, (3) faktè umoral, ak (4) substrats metabolik.Entèaksyon fizyolojik selil-a-selil mande pou rezo konplèks twa dimansyon nan plizyè kalite selil ki sipòte pa yon matris ekstraselilè.Konplèks entèraksyon selilè sa yo difisil pou rekonstwi nan vitro pa ko-kilti nan kalite selil endividyèl, men yo ka fasil reyalize lè l sèvi avèk nati a organotypic nan seksyon kè.
Detire mekanik ak eksitasyon elektrik nan kardyomyosit yo kritik pou kenbe fenotip kadyak33,34,35.Pandan ke eksitasyon mekanik yo te lajman itilize pou kondisyone hiPSC-CM ak spirasyon, plizyè etid elegant te fèk eseye eksitasyon mekanik nan tranch kè nan kilti lè l sèvi avèk loading uniaxial.Etid sa yo montre ke 2D uniaxial mekanik chaje gen yon efè pozitif sou fenotip kè a pandan kilti.Nan etid sa yo, seksyon kè yo te swa chaje ak fòs tensile izometrik17, lineyè auxotonic loading18, oswa sik kadyak la te rkree lè l sèvi avèk fidbak transducer fòs ak kondui tansyon.Sepandan, metòd sa yo sèvi ak detire tisi uniaxial san optimize anviwònman an, sa ki lakòz represyon anpil jèn kadyak oswa ekspresyon jèn ki asosye ak repons detire nòmal.CTCM ki dekri isit la bay yon estimilis elektwomekanik 3D ki imite sik natirèl kadyak an tèm de tan sik ak detire fizyolojik (25% detire, 40% sistòl, 60% dyastole, ak 72 bat pou chak minit).Malgre ke eksitasyon mekanik ki genyen twa dimansyon sa a pou kont li pa ase pou kenbe entegrite tisi yo, yon konbinezon de eksitasyon umoral ak mekanik lè l sèvi avèk T3/Dex oblije byen kenbe viabilite tisi, fonksyon, ak entegrite.
Faktè imoral jwe yon wòl enpòtan nan modulation fenotip kè granmoun.Sa a te make nan etid HiPS-CM kote yo te ajoute T3 ak Dex nan medya kilti pou akselere spirasyon selil yo.T3 ka enfliyanse transpò asid amine, sik ak kalsyòm atravè manbràn selilè36.Anplis de sa, T3 ankouraje ekspresyon MHC-α ak downregulation MHC-β, fè pwomosyon fòmasyon nan myofibrils twitch rapid nan kadyomiosit ki gen matirite konpare ak myofibrils twitch ralanti nan fetis la CM.Defisi T3 nan pasyan ipotiwoyid lakòz pèt bann myofibrillar ak yon to redwi nan devlopman ton37.Dex aji sou reseptè glikokortikoyid epi yo montre li ogmante kontraktilite myokad nan kè ki perfuze izole;38 amelyorasyon sa a gen rapò ak efè sou kalsyòm depo-kondwi antre (SOCE) 39,40.Anplis de sa, Dex mare nan reseptè li yo, sa ki lakòz yon gwo repons entraselilè ki siprime fonksyon iminitè ak enflamasyon30.
Rezilta nou yo endike ke eksitasyon fizik mekanik (MS) amelyore pèfòmans jeneral kilti konpare ak Ctrl, men li echwe pou pou kenbe viabilite, entegrite estriktirèl, ak ekspresyon kadyak sou 12 jou nan kilti.Konpare ak Ctrl, adisyon T3 ak Dex nan kilti CTCM (MT) amelyore viabilite epi kenbe pwofil transkripsyon menm jan an, entegrite estriktirèl, ak aktivite metabolik ak tisi kè fre pou 12 jou.Anplis de sa, lè w kontwole degre detire tisi a, yo te kreye yon modèl ipètrofi kadyak pwovoke ipèektansyon lè l sèvi avèk STCM, ki montre adaptabilite sistèm STCM la.Li ta dwe remake ke byenke renovasyon kadyak ak fibwoz anjeneral enplike ògàn entak ki gen selil sikile yo ka bay sitokin ki apwopriye yo kòm byen ke fagositoz ak lòt faktè renovasyon, seksyon nan kè a ka toujou imite pwosesis fibrotik la an repons a estrès ak chòk.nan myofibroblasts.Sa a te deja evalye nan modèl sa a tranch kadyak.Li ta dwe remake ke paramèt CTCM yo ka modile pa chanje presyon / anplitid elektrik ak frekans pou simulation anpil kondisyon tankou takikardya, bradycardia, ak sipò mekanik sikilasyon (mekanik dechaje kè).Sa fè sistèm nan yon debi mwayen pou tès dwòg.Kapasite CTCM nan modèl ipèrtrofi kadyak ki lakòz twòp efò ouvri wout la pou teste sistèm sa a pou terapi pèsonalize.An konklizyon, etid prezan an demontre ke detire mekanik ak eksitasyon umoral yo kritik pou kenbe kilti a nan seksyon tisi kadyak.
Malgre ke done yo prezante isit la sijere ke CTCM se yon platfòm trè pwomèt pou modèl myokad entak, metòd kilti sa a gen kèk limit.Limit prensipal kilti CTCM se ke li enpoze estrès mekanik dinamik kontinyèl sou tranch yo, ki anpeche kapasite pou kontwole aktivman kontraksyon tranch kadyak pandan chak sik.Anplis de sa, akòz ti gwosè a nan seksyon kadyak (7 mm), kapasite nan evalye fonksyon sistolik deyò nan sistèm kilti lè l sèvi avèk detèktè fòs tradisyonèl yo limite.Nan maniskri aktyèl la, nou pasyèlman simonte limit sa a lè nou evalye vòltaj optik kòm yon endikatè nan fonksyon kontraktil.Sepandan, limit sa a pral mande pou plis travay epi yo ka adrese nan lavni an pa entwodwi metòd pou siveyans optik nan fonksyon an nan tranch kè nan kilti, tankou kat optik lè l sèvi avèk kalsyòm ak koloran vòltaj-sansib.Yon lòt limit nan CTCM se ke modèl k ap travay la pa manipile estrès fizyolojik (prechaj ak apre chaj).Nan CTCM, yo te pwovoke presyon nan direksyon opoze pou repwodui 25% detire fizyolojik nan dyastole (detire konplè) ak sistòl (longè kontraksyon pandan eksitasyon elektrik) nan tisi gwo anpil.Limit sa a ta dwe retire nan konsepsyon CTCM nan lavni pa bon jan presyon sou tisi kadyak la soti nan tou de bò ak nan aplike relasyon yo egzak presyon-volim ki rive nan chanm yo nan kè a.
Remodelajman ki pwovoke overstretch rapòte nan maniskri sa a limite a imite siyal hypertrophic hyperstretch.Kidonk, modèl sa a ka ede nan etid siyal ipètrofik pwovoke detire san yo pa bezwen faktè umoral oswa neral (ki pa egziste nan sistèm sa a).Plis etid yo bezwen ogmante miltiplisite nan CTCM, pou egzanp, ko-kilti ak selil iminitè, sikile plasma faktè umoral, ak innervation lè ko-kilti ak selil newòn yo pral amelyore posiblite yo nan modèl maladi ak CTCM.
Trèz kochon yo te itilize nan etid sa a.Tout pwosedi bèt yo te fèt an akò ak direktiv enstitisyonèl epi yo te apwouve pa Komite Enstitisyonèl Swen ak Itilizasyon Animal University of Louisville.Yo te sere vout aortik la epi yo te fè kè a plen ak 1 L kadyopleji esteril (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U / mL eparin, pH jiska 7.4); kè yo te konsève nan glas-frèt solisyon cardioplegic jiskaske transpòte nan laboratwa a sou glas ki se nòmalman <10 min. kè yo te konsève nan glas-frèt solisyon cardioplegic jiskaske transpòte nan laboratwa a sou glas ki se nòmalman <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на, лчдию на, лчдон на ет <10 мин. kè yo te estoke nan glas frèt solisyon cardioplegic jiskaske transpò nan laboratwa a sou glas, ki anjeneral pran <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10. Kenbe kè sou glas cardiopleji jiskaske transpòte nan laboratwa a sou glas, anjeneral <10 min.
Aparèy CTCM a te devlope nan lojisyèl SolidWorks konsepsyon asistans òdinatè (CAD).Chanm kilti yo, divizyon ak chanm lè yo te fè nan plastik CNC klè Acrylic.Se bag back-up 7mm dyamèt la te fè nan polyethylene segondè dansite (HDPE) nan sant la e li gen yon groove o-bag pou akomode o-bag silikon yo itilize pou sele medya yo anba.Yon manbràn silica mens separe chanm kilti a ak plak separasyon an.Manbràn silikone a koupe lazè soti nan fèy silikon epè 0.02″ e li gen yon dite 35A.Joint silicone anba ak anwo yo koupe lazè nan fèy silikon epè 1/16″ epi yo gen yon dite 50A.Vis asye pur 316L ak nwa zèl yo itilize pou fikse blòk la ak kreye yon sele ki byen fèmen.
Yon tablo sikwi enprime dedye (PCB) fèt pou entegre ak sistèm C-PACE-EM.Sockets connecteur machin Swis yo sou PCB yo konekte ak elektwòd grafit pa fil kwiv ajan plake ak vis an kwiv 0-60 vis nan elektwòd yo.Se tablo sikwi enprime a mete nan kouvèti a nan enprimant 3D la.
Aparèy CTCM a kontwole pa yon actuator pneumatik pwogramasyon (PPD) ki kreye yon presyon sikilasyon kontwole ki sanble ak yon sik kadyak.Kòm presyon an andedan chanm lè a ogmante, manbràn silikon fleksib la elaji anwo, fòse mwayen an anba sit la tisi.Lè sa a, zòn nan nan tisi yo pral lonje pa ekspilsyon sa a nan likid, imite ekspansyon fizyolojik nan kè a pandan dyastole.Nan pikwa detant, eksitasyon elektrik te aplike nan elektwòd grafit, ki te redwi presyon an nan chanm lè a ak lakòz kontraksyon nan seksyon tisi.Anndan tiyo a se yon tiyo emostatik ak yon Capteur presyon yo detekte presyon an nan sistèm lè a.Presyon an santi pa Capteur presyon an aplike nan yon pèseptè done ki konekte ak laptop la.Sa a pèmèt siveyans kontinyèl nan presyon an andedan chanm gaz la.Lè presyon chanm maksimòm lan te rive jwenn (estanda 80 mmHg, 140 mmHg OS), yo te bay lòd pou aparèy akizisyon done voye yon siyal nan sistèm C-PACE-EM pou jenere yon siyal vòltaj bifaz pou 2 ms, mete nan 4 V.
Seksyon kè yo te jwenn ak kondisyon kilti nan 6 pwi yo te fèt jan sa a: Transfere kè yo rekòlte nan veso transfè a nan yon plato ki gen frèt (4 ° C.) cardiopleji.Yo te izole vantrikul gòch la ak yon lam esteril epi koupe an moso 1-2 cm3.Blòk tisi sa yo te tache ak sipò tisi ak adezif tisi epi yo mete yo nan yon beny tisi mikrotom vibran ki gen solisyon Tyrode a ak oksijene kontinyèlman (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g). ), (6 mM . ), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M solisyon), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M solisyon), jiska 1 L ddH2O).Mikwotom vibre a te mete koupe 300 µm tranch epè nan yon frekans 80 Hz, yon anplitid Vibration orizontal nan 2 mm, ak yon pousantaj davans nan 0.03 mm / s.Te benyen nan tisi ki te antoure pa glas pou kenbe solisyon an fre epi yo te kenbe tanperati a nan 4 ° C.Transfere seksyon tisi ki soti nan beny mikrotom nan yon beny enkubasyon ki gen solisyon Tyrode kontinyèlman oksijene sou glas jiskaske yo jwenn ase seksyon pou yon plak kilti.Pou kilti transwell, seksyon tisi yo te tache ak sipò an poliyiretàn esteril 6 mm lajè epi yo mete yo nan 6 ml mwayen optimize (199 mwayen, 1x sipleman ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalin ak 2X antibyotik-antifonjik).Eksitasyon elektrik (10 V, frekans 1.2 Hz) te aplike nan seksyon tisi yo atravè C-Pace la.Pou kondisyon TD, yo te ajoute fre T3 ak Dex nan 100 nM ak 1 μM nan chak chanjman mwayen.Mwayen an satire ak oksijèn anvan ranplasman 3 fwa pa jou.Seksyon tisi yo te kiltive nan yon enkibatè nan 37 ° C ak 5% CO2.
Pou kilti CTCM, seksyon tisi yo te mete sou yon enprimant 3D koutim nan yon plat Petri ki gen solisyon Tyrode modifye.Aparèy la fèt pou ogmante gwosè tranch kè a pa 25% nan zòn nan bag sipò.Sa a se fè pou seksyon yo nan kè a pa detire apre yo te transfere soti nan solisyon Tyrode a nan mwayen an ak pandan dyastole.Sèvi ak lakòl histoacrylic, seksyon 300 µm epè yo te fiks sou yon bag sipò 7 mm an dyamèt.Apre ou fin atache seksyon tisi yo nan bag sipò a, koupe seksyon tisi ki depase yo epi mete seksyon tisi ki tache yo tounen nan beny solisyon Tyrode la sou glas (4 ° C) jiskaske ase seksyon yo te prepare pou yon aparèy.Tan an total pwosesis pou tout aparèy pa ta dwe depase 2 èdtan.Apre 6 seksyon tisi yo te tache ak bag sipò yo, yo te rasanble aparèy CTCM la.Chanm kilti CTCM pre-plen ak 21 ml mwayen pre-oksijene.Transfere seksyon tisi yo nan chanm kilti a epi ak anpil atansyon retire nenpòt bul lè ak yon pipèt.Lè sa a, seksyon an tisi gide nan twou a epi dousman bourade an plas.Finalman, mete bouchon elektwòd la sou aparèy la epi transfere aparèy la nan kouveuz la.Lè sa a, konekte CTCM a tib lè a ak sistèm C-PACE-EM la.Aktuateur pneumatik la louvri ak valv lè a louvri CTCM la.Sistèm C-PACE-EM te configuré pou delivre 4 V nan 1.2 Hz pandan ritm bifaz pou 2 ms.Mwayen an te chanje de fwa pa jou epi elektwòd yo te chanje yon fwa pa jou pou evite akimilasyon grafit sou elektwòd yo.Si sa nesesè, seksyon tisi yo ka retire nan pwi kilti yo pou chase nenpòt bul lè ki ka tonbe anba yo.Pou kondisyon tretman MT, yo te ajoute T3/Dex fre ak chak chanjman mwayen ak 100 nM T3 ak 1 μM Dex.Aparèy CTCM yo te kiltive nan yon enkibatè nan 37 ° C ak 5% CO2.
Pou jwenn trajectoire lonje nan tranch kè, yo te devlope yon sistèm kamera espesyal.Yo te itilize yon kamera SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japon) ak yon lantiy macro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA).Vizyalizasyon te fèt nan tanperati chanm apre ranplase mwayen an ak mwayen fre.Kamera a pozisyone nan yon ang 51 ° ak videyo anrejistre nan 30 ankadreman pou chak segonn.Premyèman, yo te itilize lojisyèl sous louvri (MUSCLEMOTION43) ak Image-J pou quantifier mouvman tranch kè yo.Mask la te kreye lè l sèvi avèk MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) pou defini rejyon ki enterese pou bat tranch kè pou evite bri.Manyèlman segman mask yo aplike nan tout imaj nan yon sekans ankadreman ak Lè sa a, pase nan plug-in nan MUSCLEMOTION.Mouvman nan misk sèvi ak entansite mwayèn piksèl yo nan chak ankadreman pou quantifier mouvman li yo parapò ak ankadreman referans la.Done yo te anrejistre, filtre ak itilize pou quantifier tan sik ak evalye tisi detire pandan sik kadyak la.Videyo anrejistre a te post-trete lè l sèvi avèk yon premye lòd zewo-faz filtre dijital.Pou quantifier detire tisi (pik-a-pik), yo te fè analiz pik-a-pik yo fè distenksyon ant pik ak depresyon nan siyal la anrejistre.Anplis de sa, detrending fèt lè l sèvi avèk yon polinòm 6yèm lòd pou elimine drift siyal.Kòd pwogram lan te devlope nan MATLAB pou detèmine mouvman tisi mondyal, tan sik, tan detant, ak tan kontraksyon (Kòd Pwogram Siplemantè 44).
Pou analiz souch, lè l sèvi avèk menm videyo yo kreye pou evalyasyon detire mekanik, nou premye trase de imaj ki reprezante pik mouvman (pi wo (anwo) ak pi ba (pi ba) pwen nan mouvman) dapre lojisyèl an MUSCLEMOTION.Lè sa a, nou segmante rejyon tisi yo epi aplike yon fòm algorithm lonbraj nan tisi a segmenté (figi siplemantè 2a).Lè sa a, tisi a segmenté te divize an dis soutèr, ak estrès la sou chak sifas yo te kalkile lè l sèvi avèk ekwasyon sa a: Souch = (Sup-Sdown) / Sdown, kote Sup ak Sdown se distans yo nan fòm nan soti nan lonbraj yo anwo ak anba nan twal la, respektivman (Siplemantè Fig. .2b).
Seksyon kè yo te fiks nan 4% paraformaldehyde pou 48 èdtan.Tisi fiks yo te dezidrate nan 10% ak 20% sikwoz pou 1 èdtan, Lè sa a, nan 30% sikwoz lannwit lan.Lè sa a, seksyon yo te entegre nan pi gwo konpoze tanperati koupe (konpoze OCT) epi piti piti jele nan yon beny izopentane / glas sèk.Sere OCT blòk anglobe nan -80 °C jiskaske separasyon.Glisad yo te prepare kòm seksyon ak yon epesè 8 μm.
Pou retire OCT nan seksyon kè, chofe glisad yo sou yon blòk chofaj nan 95 °C pou 5 min.Ajoute 1 ml PBS nan chak glisad epi enkube pou 30 minit nan tanperati chanm, Lè sa a, pénétrer seksyon yo pa mete 0.1% Triton-X nan PBS pou 15 minit nan tanperati chanm.Pou anpeche antikò ki pa espesifik kole ak echantiyon an, ajoute 1 ml solisyon 3% BSA nan glisad epi enkube pou 1 èdtan nan tanperati chanm.Lè sa a, BSA a te retire epi glisad yo te lave ak PBS.Make chak echantiyon ak yon kreyon.Antikò prensipal (dilye 1:200 nan 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) ak troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) yo te ajoute plis pase 90 minit, Lè sa a, segondè nan antikò 11820: Flux20: (Thermo Scientific; #A16079), kont lapen Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) pou yon lòt 90 minit Lave 3 fwa ak PBS Pou distenge tach sib de background, nou te itilize sèlman antikò segondè a kòm yon kontwòl. Finalman, tach DAPI yo te ajoute ak glisad yo te plase nan yon mayifik laboratwa ak sektè nikleyè. ak mikwoskòp Keyence ak agrandisman 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) nan 5 μg / ml nan PBS te itilize pou WGA tach epi aplike nan seksyon fiks pou 30 minit nan tanperati chanm.Lè sa a, glisad yo te lave ak PBS ak Soudan nwa yo te ajoute nan chak glisad ak enkube pou 30 minit.Lè sa a, glisad yo te lave ak PBS epi yo te ajoute mwayen vectashield embedding.Slides yo te vizyalize sou yon mikwoskòp Keyence nan agrandisman 40x.
Yo te retire OCT nan echantiyon yo jan sa dekri pi wo a.Apre w fin retire OCT a, plonje glisad yo nan solisyon Bouin lannwit lan.Lè sa a, glisad yo te rense ak dlo distile pou 1 èdtan ak Lè sa a, mete yo nan yon solisyon Bibrich aloès asid fuchsin pou 10 minit.Lè sa a, glisad yo te lave ak dlo distile epi yo mete yo nan yon solisyon 5% fosfomolibdèn / 5% asid fosfotungstik pou 10 minit.San yo pa rense, transfere glisad yo dirèkteman nan solisyon an anilin ble pou 15 minit.Lè sa a, glisad yo te lave ak dlo distile epi yo mete yo nan yon solisyon 1% asid acetic pou 2 minit.Glisad yo te cheche nan etanòl 200 N epi yo transfere nan xylene.Tache glisad yo te vizyalize lè l sèvi avèk yon mikwoskòp Keyence ak yon objektif 10x.Pousantaj zòn fibwoz la te mezire lè l sèvi avèk lojisyèl Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), nimewo katalòg V13154, dapre pwotokòl manifakti a ak kèk modifikasyon.An patikilye, yo te itilize yon kout pyen chirijikal ak yon dyamèt 6 mm pou asire gwosè tisi inifòm pandan analiz MTT.Tisi yo te plake endividyèlman nan pwi yo nan yon plak 12-pi ki gen substra MTT dapre pwotokòl manifakti a.Seksyon yo enkube nan 37 ° C. pou 3 èdtan ak tisi vivan an metabolize substra MTT a pou fòme yon konpoze formazan koulè wouj violèt.Ranplase solisyon MTT la ak 1 ml DMSO epi enkube a 37 °C pou 15 minit pou ekstrè formazan koulè wouj violèt nan seksyon kè yo.Echantiyon yo te dilye 1:10 nan DMSO nan plak anba 96-byen klè ak entansite koulè wouj violèt mezire nan 570 nm lè l sèvi avèk yon lektè plak Cytation (BioTek).Lekti yo te nòmalize nan pwa chak tranch nan kè a.
Medya tranch kè yo te ranplase ak medya ki gen 1 μCi/ml [5-3H]-glikoz (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) pou tès itilizasyon glikoz jan sa dekri deja.Apre 4 èdtan nan enkubasyon, ajoute 100 µl mwayen nan yon tib mikwosantrifij louvri ki gen 100 µl 0.2 N HCl.Lè sa a, yo te mete tib la nan yon tib scintillation ki gen 500 μl dH2O pou evapore [3H]2O pou 72 èdtan nan 37 ° C.Lè sa a, retire tib mikrosantrifij la nan tib scintillation a epi ajoute 10 ml likid scintillation.Konte scintillation yo te fèt lè l sèvi avèk yon analizeur scintillation likid Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).Lè sa a, itilizasyon glikoz te kalkile pran an kont [5-3H]-glikoz aktivite espesifik, ekilib enkonplè ak background, dilution nan [5-3H]-a glikoz ki pa make, ak efikasite kontwa scintillation.Done yo nòmalize nan mas la nan seksyon nan kè a.
Apre homogenization tisi nan Trizol, RNA te izole nan seksyon kè lè l sèvi avèk Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 selon pwotokòl manifakti a.Preparasyon bibliyotèk RNAsec, sekans ak analiz done yo te fèt jan sa a:
Yo te itilize 1 μg RNA pou chak echantiyon kòm materyèl kòmanse pou preparasyon bibliyotèk RNA a.Bibliyotèk sekans yo te pwodwi lè l sèvi avèk Twous Preparasyon Bibliyotèk NEBNext UltraTM RNA pou Illumina (NEB, USA) swiv rekòmandasyon manifakti a, epi kòd endèks yo te ajoute nan sekans atribi pou chak echantiyon.Yon ti tan, mRNA te pirifye soti nan RNA total lè l sèvi avèk pèl mayetik tache ak oligonukleotid poly-T.Fragmantasyon fèt lè l sèvi avèk kasyon divalan nan tanperati ki wo nan NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).Premye strand cDNA te sentèz lè l sèvi avèk primè hexamer o aza ak transkriptaz ranvèse M-MuLV (RNase H-).Se dezyèm strand cDNA a Lè sa a, se sentetize lè l sèvi avèk ADN polymerase I ak RNase H. Surpands ki rete yo konvèti nan bout blunt pa aktivite exonuclease / polymerase.Apre adenilation nan fen 3′ fragman ADN la, yon adaptè NEBNext ak yon estrikti bouk epengl tache ak li pou prepare li pou ibridizasyon.Pou seleksyon fragman cDNA nan longè pi pito 150-200 bp.fragman bibliyotèk yo te pirifye lè l sèvi avèk sistèm AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA).Lè sa a, 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) ak gwosè-seleksyon cDNA ligated ak yon adaptè yo te itilize pou 15 minit nan 37 ° C ak Lè sa a, pou 5 minit nan 95 ° C anvan PCR.Lè sa a, PCR te fèt lè l sèvi avèk Phusion High-Fidelity DNA polymerase, primè PCR inivèsèl, ak primè Index (X).Finalman, pwodwi PCR yo te pirifye (sistèm AMPure XP) ak bon jan kalite bibliyotèk yo te evalye sou yon sistèm Agilent Bioanalyzer 2100.Lè sa a, bibliyotèk cDNA te sekans lè l sèvi avèk yon sekansè Novaseq.Fichye imaj kri soti nan Illumina yo te konvèti nan lekti anvan tout koreksyon lè l sèvi avèk CASAVA Base Calling.Done kri yo estoke nan dosye fòma FASTQ(fq) ki gen sekans li ak kalite baz korespondan.Chwazi HISAT2 pou matche lekti sekans filtre yo ak jenom referans Sscrofa11.1.An jeneral, HISAT2 sipòte jenom nenpòt gwosè, ki gen ladan jenom ki pi gwo pase 4 milya baz, ak valè default yo mete pou pifò paramèt.Splicing lekti ki soti nan done RNA Seq yo ka aliman avèk efikasite lè l sèvi avèk HISAT2, sistèm ki pi rapid ki disponib kounye a, ak menm presizyon oswa pi bon presizyon pase nenpòt lòt metòd.
Abondans nan transkripsyon dirèkteman reflete nivo ekspresyon jèn yo.Nivo ekspresyon jèn yo evalye pa abondans transkripsyon (konte sekans) ki asosye ak genòm oswa ekson yo.Kantite lekti yo pwopòsyonèl ak nivo ekspresyon jèn yo, longè jèn yo ak pwofondè sekans yo.FPKM (fragman pou chak mil pè baz transkripsyon sekans pou chak milyon pè baz) yo te kalkile epi yo te detèmine valè P nan ekspresyon diferans lè l sèvi avèk pake DESeq2 la.Lè sa a, nou te kalkile pousantaj dekouvèt fo (FDR) pou chak valè P lè l sèvi avèk metòd Benjamini-Hochberg9 ki baze sou fonksyon R ki entegre "p.adjust".
RNA izole nan seksyon kè yo te konvèti nan cDNA nan yon konsantrasyon 200 ng/μl lè l sèvi avèk SuperScript IV Vilo Master melanj nan Thermo (Thermo, cat. No. 11756050).Quantitative RT-PCR te fèt lè l sèvi avèk yon Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-byen transparan plak reyaksyon (Thermo, cat. No. 4483319) ak microamp optik adezif (Thermo, Cat. No. 4311971).Melanj reyaksyon an fèt nan 5 µl Taqman Fast Advanced Master melanj (Thermo, chat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer ak 3.5 µl H2O melanje pou chak pwi.Sik qPCR estanda yo te kouri ak valè CT yo te mezire lè l sèvi avèk yon enstriman PCR an tan reyèl Applied Biosystems Quantstudio 5 (modil 384-byen; pwodwi # A28135).Jadendanfan Taqman yo te achte nan men Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06908795_m1), RGL1 (Ss06908795_m1), _ACTN06860800 (Ss06903874_m1), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) yo te nòmalize nan tout echantiyon yo genyen nan CTDH yo.
Yo te evalye lage medya NT-ProBNP lè l sèvi avèk twous NT-ProBNP (kochon) (No Cat. MBS2086979, MyBioSource) dapre pwotokòl manifakti a.Yon ti tan, yo te ajoute 250 µl nan chak echantiyon ak estanda an kopi nan chak pi.Touswit apre w fin ajoute echantiyon an, ajoute 50 µl Reyaktif Test A nan chak pi.Dousman souke plak la epi sele ak sele.Lè sa a, tablèt yo te enkube a 37 ° C pou 1 èdtan.Lè sa a, aspire solisyon an epi lave pwi yo 4 fwa ak 350 µl nan solisyon lave 1X, enkubasyon solisyon lave a pou 1-2 minit chak fwa.Apre sa, ajoute 100 µl Reyaktif Esay B pou chak pi epi sele ak sele plak.Te tablèt la dousman souke ak enkubate nan 37 ° C pou 30 minit.Aspire solisyon an epi lave pwi yo 5 fwa ak 350 µl solisyon lave 1X.Ajoute 90 µl solisyon substrate nan chak pi epi sele plak la.Enkube plak la nan 37 ° C pou 10-20 minit.Ajoute 50 µl Stop Solution nan chak pi.Plak la te imedyatman mezire lè l sèvi avèk yon lektè plak Cytation (BioTek) mete nan 450 nm.
Analiz pouvwa yo te fèt pou chwazi gwosè gwoup yo ki pral bay > 80% pouvwa pou detekte yon chanjman absoli 10% nan paramèt la ak yon pousantaj erè tip I 5%. Analiz pouvwa yo te fèt pou chwazi gwosè gwoup yo ki pral bay > 80% pouvwa pou detekte yon chanjman absoli 10% nan paramèt la ak yon pousantaj erè tip I 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощнос ти1 бора групп солютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Yo te fè analiz pouvwa pou chwazi gwosè gwoup ki ta bay >80% pouvwa pou detekte 10% chanjman absoli paramèt ak yon pousantaj erè tip I 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％的型和5％的垯玥检测参数中10进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％的型和5％的垯玥检测参数中10 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мобора группы абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Yo te fè yon analiz pouvwa pou chwazi yon gwosè gwoup ki ta bay >80% pouvwa pou detekte 10% chanjman paramèt absoli ak 5% pousantaj erè tip I.Seksyon tisi yo te chwazi owaza anvan eksperyans lan.Tout analiz yo te avèg nan kondisyon ak echantiyon yo te dekode sèlman apre tout done yo te analize.Lojisyèl GraphPad Prism (San Diego, CA) te itilize pou fè tout analiz estatistik. Pou tout estatistik, p-valè yo te konsidere kòm enpòtan nan valè <0.05. Pou tout estatistik, p-valè yo te konsidere kòm enpòtan nan valè <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Pou tout estatistik, p-valè yo te konsidere kòm enpòtan nan valè <0.05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Pou tout estatistik, p-valè yo te konsidere kòm enpòtan nan valè <0.05.Yo te fè tès t Elèv de-ke sou done yo ak sèlman 2 konparezon.Yo te itilize ANOVA yon sèl-fason oswa de-fason pou detèmine siyifikasyon ant plizyè gwoup.Lè w ap fè tès post hoc, yo te aplike koreksyon Tukey pou fè plizyè konparezon.Done RNAsec gen konsiderasyon estatistik espesyal lè w ap kalkile FDR ak p.adjust jan sa dekri nan seksyon Metòd yo.
Pou plis enfòmasyon sou konsepsyon etid, gade abstrè Rapò rechèch la nati ki lye nan atik sa a.