Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com webhelyet. Az Ön által használt böngészőverzió korlátozottan támogatja a CSS-t. A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy kapcsolja ki a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Addig is a folyamatos támogatás érdekében a webhelyet stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg.
A humán bélmorfogenezis létrehozza a 3D epiteliális mikroarchitektúra és a térbeli szerveződés kriptabolyhos jellemzőit. Ez az egyedülálló szerkezet szükséges a bél homeosztázisának fenntartásához azáltal, hogy megvédi a bazális kriptában lévő őssejt rést az exogén mikrobiális antigénektől és metabolitjaitól. Ezenkívül a bélben lévő bélbolyhok funkcionális védőgátja és a test felszínén lévő különböző nyálkahártya szekréciója a hámsejtekben található. .Ezért a 3D hámszerkezetek újraalkotása kulcsfontosságú az in vitro bélmodellek felépítéséhez. Nevezetesen, a szerves mimetikus bél-chipen spontán 3D morfogenezist indukálhat a bélhám fokozott fiziológiai funkcióival és biomechanikájával. t mikrofluidikus chipen, valamint Transwell beágyazott hibrid chipben. Részletes módszereket írunk le eszközgyártásra, Caco-2 vagy intestinalis organoid hámsejtek tenyésztésére hagyományos körülmények között, valamint mikrofluidikus platformon, 3D morfogenezis indukálására és a kialakult 3D-s epitéliumok funkcionális prototípusainak jellemzésére. Többszörös leképezési képalkotó képalkotás segítségével érhető el a funkcionális 3D-s epitéliumok jellemzése. folyadékáramlás 5 napig. In vitro morfogenezis módszerünk fiziológiailag releváns nyírófeszültséget és mechanikai mozgást alkalmaz, és nem igényel bonyolult sejttervezést vagy -manipulációt, amely felülmúlhatja a többi meglévő technikát. Úgy gondoljuk, hogy javasolt protokollunk széles körű hatással lehet az orvosbiológiai kutatói közösségre, módszert biztosítva a 3D-s bélhám regenerálására, klinikai, in vitro és gyógyszerészeti biomedicinális alkalmazásokhoz.
Kísérletek azt mutatják, hogy a bélhám Caco-2 sejtek, amelyeket bélen-chipben1, 2, 3, 4, 5-ben vagy kétrétegű mikrofluidikus eszközökben6,7 tenyésztettek, spontán 3D-morfogenezisen mennek keresztül in vitro anélkül, hogy tisztában lenne a mögöttes mechanizmussal. Legutóbbi vizsgálatunkban azt találtuk, hogy a bazogén és oldalsó antagonisták eltávolítása szükséges a morphogén eszközökből3. esis in vitro, amit a Caco-2 és a betegektől származó bélorganoidok igazoltak.A hámsejteket validáltuk. Ebben a vizsgálatban kifejezetten egy erős Wnt antagonista, a Dickkopf-1 (DKK-1) sejttermelésére és koncentráció-eloszlására összpontosítottunk a bélen-chipben és a „Hibrid Chip”-nek nevezett Transwell-betéteket tartalmazó módosított mikrofluid eszközökben. Kimutattuk, hogy exogén Wnt-rokon antagonisták hozzáadása (például Wnt-, DKK-1, vagy DKK-1nt, refrizzled protein-1, vagy DKK-1nt, refrizz). oggy-1) a chipen lévő bélbe gátolja a morfogenezist vagy megbontja az előre strukturált 3D epiteliális réteget, ami arra utal, hogy a tenyésztés során fellépő antagonista stressz felelős a bélmorfogenezisért in vitro. Ezért a gyakorlati megközelítés a robusztus morfogenezis eléréséhez az epiteliális határfelületen az, hogy eltávolítjuk vagy minimálisan fenntartjuk a basszus oldali antagonista hatást -on-a-chip vagy hibrid-on-a-chip platformok) vagy diffúziós .Bazolaterális közegek (pl. Transwell betétekből a kutak nagy bazolaterális tartályaiba).
Ebben a protokollban részletes módszert adunk a chipen bélelhető mikroeszközök és Transwell-beilleszthető hibrid chipek előállítására (1-5. lépések) bélhámsejtek tenyésztéséhez polidimetil-sziloxán (PDMS) alapú porózus membránokon (6A, 7A, 8, 9 lépések) vagy poliészter membránok (7, 6 inszert, 7, B, 8 lépésben) 3D morfogenezis in vitro (10. lépés). A szövetspecifikus hisztogenezisre és a leszármazási függő sejtdifferenciálódásra utaló sejtes és molekuláris jellemzőket is azonosítottunk többféle képalkotó módszer alkalmazásával (11-24. lépések). Morfogenezist indukálunk humán bélhámsejtek felhasználásával, vagy membrán felületi tenyészetekkel2, mint például a membrán felületi módosulása, beleértve a kalcium-kétszert. s, 2D monolayers létrehozása, valamint bél biokémiai és A biomechanikai mikrokörnyezet reprodukálása.in vitro.A 2D epiteliális egyrétegű rétegek 3D morfogenezisének indukálásához mindkét tenyésztett formából eltávolítottuk a morfogén antagonistákat úgy, hogy a táptalajt a bazolaterális rekeszbe áramoltattuk, amely a tenyésztés egyik használt rétegének regenerálódását jelenti. morfogénfüggő hámnövekedés, longitudinális gazda-mikrobióm társkultúrák, kórokozó fertőzés, gyulladásos sérülés, hámgát diszfunkció és probiotikus alapú terápiák modellezésére Példa.befolyásolják.
Protokollunk tudósok széles köre számára hasznos lehet az alapkutatásban (pl. bélnyálkahártya biológiájában, őssejtbiológiájában és fejlődésbiológiájában) és alkalmazott kutatásban (pl. preklinikai gyógyszerteszt, betegségmodellezés, szövetsebészet és gasztroenterológia). Protokollunk reprodukálhatósága és robusztussága miatt in vitro indukálható epizódlátás, mi lehet a 3D-s morfológiai látás technikai stratégiája. terjesztik a sejtjelátvitel dinamikáját tanulmányozó közönség számára a bélfejlődés, regeneráció vagy homeosztázis során. Ezen túlmenően protokollunk hasznos a különböző fertőző ágensek, például a Norovirus 8, a Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), a Clostridium Vibrphimurium, Salmonella9choraere által okozott fertőzések lekérdezésére.A betegség patológiájának és patogenezisének közönsége is hasznos.Az on-chip bélmikrofiziológiai rendszer alkalmazása lehetővé teheti a longitudinális együtttenyésztést 10 és a gazdaszervezet védekezésének, az immunválaszok és a kórokozókkal kapcsolatos sérülések helyreállításának későbbi értékelését a gastrointestinalis (GI) traktusban. A képes bélszindróma szimulálható, ha 3D bélhámrétegeket készítenek a páciens 3D bélhámrétegeinek felhasználásával, ezek a betegségek közé tartozik a boholysorvadás, a kripta rövidülése, a nyálkahártya károsodása vagy a károsodott epiteliális gát. Biopszia vagy őssejt eredetű bélbetegség, jobban megfontolják a környezeti betegségek komplexitását12. hangyasejt-típusok, például páciensek perifériás vérének mononukleáris sejtjei (PBMC), 3D bélbolyhos-kripta mikroarchitektúrákat tartalmazó modellekhez.szövetspecifikus immunsejtek, 5.
Mivel a 3D-s epiteliális mikrostruktúra szeletelési folyamat nélkül rögzíthető és megjeleníthető, a térbeli transzkriptomikával és a nagyfelbontású vagy szuperfelbontású képalkotással foglalkozó nézők érdeklődhetnek a gének és fehérjék térbeli és időbeli dinamikájának feltérképezése iránt az epiteliális réseken.Érdekel a technológia.Válasz mikrobiális vagy immunstimulusokra.Továbbá a bél homeosztázisát koordináló longitudinális gazda-mikrobióm áthallás 10, 14 a 3D bélnyálkahártya rétegben különböző mikrobiális fajok, mikrobiális közösségek vagy fekáliás mikro-biogut-on együtt tenyésztésével hozható létre.a platformon.Ez a megközelítés különösen vonzó a nyálkahártya immunológiát, gasztroenterológiát, humán mikrobiomot, kulturomikát és klinikai mikrobiológiát tanulmányozó közönség számára, akik korábban kulturálatlan bélmikrobiótát kívánnak tenyészteni a laboratóriumban.Ha az in vitro morfogenezis protokollunk skálázható tenyésztési formátumokhoz igazítható, mint például a folyamatos alaplemezes tányérokba vagy a folyamatos alaplemezekbe A protokoll a gyógyszeripari, orvosbiológiai vagy nagy áteresztőképességű szűrési vagy validációs platformokat fejlesztők számára is terjeszthető az élelmiszeripar számára. Az elv bizonyításaként nemrégiben bemutattuk egy 24 lyukú lemezformátumra méretezhető, multiplex, nagy áteresztőképességű morfogenezis rendszer megvalósíthatóságát. Az in vitro morfogenezis módszerünk felgyorsítható és potenciálisan alkalmazható számos kutatólaboratóriumban, iparban vagy kormányzati és szabályozó ügynökségben, hogy megértsék az in vitro bélmorfogenezis sejtes átprogramozását transzkriptomikus szinten gyógyszerek vagy bioterápiás szerek tesztelése céljából. bél morfogenezis folyamata.
Korlátozott számú, humán vonatkozású kísérleti modellt alkalmaztak a bélhám morfogenezisének tanulmányozására, főként a 3D morfogenezis in vitro indukálására alkalmas protokollok hiánya miatt. Valójában a bélmorfogenezissel kapcsolatos jelenlegi ismeretek nagy része állatkísérleteken alapul (pl. zebrahal20, egerek21, és költségigényesek,21 vagy csirkék). és ami a legfontosabb, nem határozzák meg pontosan az emberi fejlődési folyamatokat.Ezek a modellek nagyon korlátozottak a többféle módon skálázható tesztelhetőség tekintetében is. Ezért a 3D szöveti struktúrák in vitro regenerálására szolgáló protokollunk felülmúlja az in vivo állatmodelleket, valamint más hagyományos statikus 2D sejttenyésztési modelleket. Amint azt korábban leírtuk, a 3D-s kriptográfiai lokális tengelyirányú sejtek különböző struktúráinak felhasználásával lehetséges különböző nyálkahártya- vagy immuningerekre adott válaszként. A 3D epiteliális rétegek teret biztosíthatnak annak tanulmányozására, hogy a mikrobiális sejtek versengenek a térbeli rések kialakításáért, valamint az ökológiai evolúció a gazdatényezőkre adott válaszként (pl. belső és külső nyálkarétegek, IgA és antimikrobiális peptidek szekréciója). Továbbá a 3D-s mikrobiológiai szintológia lehetővé teszi a hámszövet és a mortalitás biológiai szerkezetének megértését. ergisztikusan termel mikrobiális metabolitokat (pl. rövid szénláncú zsírsavakat), amelyek sejtszerveződést és őssejt-réseket alakítanak ki a bazális kriptákban. Ezek a tulajdonságok csak akkor mutathatók ki, ha in vitro 3D hámrétegeket hoznak létre.
A 3D-s bélhámszerkezetek létrehozására szolgáló módszerünkön kívül számos in vitro módszer létezik. A bélorganioid tenyésztés a bélrendszeri őssejtek specifikus morfogén körülmények között történő tenyésztésére épülő legmodernebb szövettechnológiai technika23,24,25.A 3D-s organoid modellek használata azonban a transzport-elemzésben vagy a ko-tesztelésben gyakran a gazda-tesztelési kromatográfiában. az organoidba zárva van, és ezért a luminális komponensek, például mikrobiális sejtek vagy exogén antigének bejuttatása korlátozott.Az organoid lumenekhez való hozzáférés mikroinjektorral javítható,26,27, de ez a módszer invazív és munkaigényes, és speciális ismereteket igényel a végrehajtása. Ezenkívül a hidrogél állványzatban statikus körülmények között tartott hagyományos organoid kultúrák nem tükrözik pontosan az aktív in vivo biomechanikát.
Más megközelítések, amelyeket számos kutatócsoport alkalmaz, előre strukturált 3D hidrogél állványokat használnak a bélhám szerkezetének utánzására, izolált emberi bélsejtek tenyésztésével a gél felületén. Hidrogél állványok készítése 3D-nyomtatott, mikroőrölt vagy litográfiailag előállított penészgombák segítségével. Ez a módszer az izolált morfiogenizált sejtek önmagukat tartalmazó morfiogenizált elrendezését mutatja be. s, nagy méretarányú hámszerkezetet és stroma-epiteliális áthallást hoznak létre a stromasejtek vázba való bevonásával. Az előre strukturált állványok természete azonban megakadályozhatja magának a spontán morfogenetikai folyamatnak a megjelenését. Ezek a modellek sem biztosítanak dinamikus luminális vagy intersticiális áramlást, mivel hiányzik a testfolyadék fiziológiai feszültsége. egyik közelmúltbeli tanulmány sem használt hidrogél állványokat mikrofluidikus platformban és mintázott bélhámszerkezeteket lézeres maratási technikák segítségével. Az egérbél organoidjai maratott mintákat követve bélcső alakú struktúrákat alkotnak, és az intraluminális folyadékáramlás mikrofluidikai modul segítségével összefoglalható. Ez a morfogenikus modell azonban nem spontán mechanikus mozgást nem mutat. Az ugyanabból a csoportból származó 3D nyomtatási technikákkal spontán morfogenetikai folyamatokkal tudták létrehozni miniatűr bélcsöveket.A tubuson belüli különböző bélszakaszok összetett gyártása ellenére ebből a modellből hiányzik a luminális folyadékáramlás és a mechanikai deformáció sem. Ezen túlmenően a modell működőképessége korlátozott lehet, különösen a bionyomtatási folyamat befejeződése után, vagy zavaró sejt-spontogén interakciós kísérleti körülményeket biztosít. ézis, fiziológiailag releváns nyírófeszültség, bélmozgást utánzó biomechanika, független apikális és bazolaterális kompartmentek hozzáférhetősége, valamint komplex, modularitású biológiai mikrokörnyezetek újrateremtése. Ezért az in vitro 3D morfogenezis protokollunk kiegészítő megközelítést kínálhat a meglévő módszerek kihívásainak leküzdésére.
Protokollunk teljes mértékben a 3D epiteliális morfogenezisre összpontosít, csak hámsejtek vannak a tenyészetben, és nincsenek más típusú környező sejtek, mint például mezenchimális sejtek, endoteliális sejtek és immunsejtek. Amint azt korábban leírtuk, protokollunk lényege az epiteliális morfogenezis indukálása azáltal, hogy eltávolítjuk a morfogén-inhibitorokat, amelyek a bejuttatott tápközegben szekretálódnak. Az a-chip és a hibrid-a-chipen lehetővé teszi számunkra, hogy újra létrehozzuk a hullámzó 3D hámréteget, további biológiai komplexitásokat, például epiteliális-mezenchimális kölcsönhatásokat33,34, extracelluláris mátrix (ECM) lerakódást 35, és modellünkben a kripta-bolyhos jellemzőket, amelyek továbbítják a kripta-bolyhos jellemzőket (a kripta-bolyhos sejtek továbbítják a fibroblasztot, és a mestroegchy-ben további őssejt-rések maradnak a bassenchymalisban). kulcsszerepet játszok az ECM fehérjék termelésében és a bélmorfogenezis in vivo szabályozásában35,37,38.A mesenchymalis sejtek hozzáadása a modellünkhöz javította a morfogenetikai folyamatot és a sejttapadás hatékonyságát. Az endothel réteg (azaz a kapillárisok vagy a nyirokerek) fontos szerepet játszik a molekuláris sejttranszport szabályozásában, az immunrendszeri erek helyreállításában és az immunrendszeri gyulladás szabályozásában. A szövetmodellek között összekapcsolható kultúrakomponensek előfeltételei, ha a szövetmodelleket több szerv közötti interakciók demonstrálására tervezték. Ezért előfordulhat, hogy endothel sejteket kell bevonni a pontosabb fiziológiai jellemzők modellezéséhez szervi szintű felbontással. A páciensből származó immunsejtek szintén nélkülözhetetlenek a veleszületett immunválaszok megjelenítéséhez, az antigénprezentációhoz, a veleszületett adaptív immunbetegséghez és a szöveti keresztspecifikus immunitás vizsgálatához.
A hibrid chipek használata egyszerűbb, mint a gut-on-a-chipen, mivel az eszköz beállítása egyszerűbb, a Transwell betétek használata pedig lehetővé teszi a bélhám méretezhető tenyésztését. A kereskedelemben kapható poliészter membránokkal ellátott Transwell betétek azonban nem rugalmasak, és nem szimulálják a perisztaltikus-szerű mozgásokat. Továbbá a transzwell communis apicalis oldalsó feszültségében megmaradt a hibrid lapkarész. .Egyértelmű, hogy az apikális rekesz statikus tulajdonságai ritkán teszik lehetővé a hosszú távú bakteriális együtttenyésztést hibrid chipekben. Miközben a hibrid chipek használatakor erőteljesen indukálhatunk 3D morfogenezist a Transwell betétekben, a fiziológiailag releváns biomechanika és az apikális folyadékáramlás hiánya korlátozhatja a hibrid chip platformok lehetséges alkalmazási lehetőségeit.
Az emberi kriptaboholy tengelyének teljes körű rekonstrukciói bél epitéliumon és chipen hibrid tenyészetekben még nem teljesen ismertek. Mivel a morfogenezis egy epiteliális egyrétegű rétegből indul ki, a 3D mikroarchitektúrák nem feltétlenül biztosítanak morfológiai hasonlóságot a kriptákhoz in vivo. Noha a sejtburjánzó sejtpopulációt jellemeztük3 a bázistartomány közelében. a kripta és a bolyhos régiók nem határoltak el egyértelműen. Bár a chip magasabb felső csatornái a mikromérnöki hám növekedéséhez vezetnek, a maximális magasság még mindig ~300-400 µm-re korlátozódik. Az emberi bélkripták tényleges mélysége a vékony- és vastagbélben ~135 µm, a vékonybélben pedig ~400 µm, a vékonybél magassága pedig ~400 µm m41.
Képalkotási szempontból a 3D mikroarchitektúrák in situ szuperfelbontású képalkotása a bélre korlátozódhat egy chipen, mivel az objektívlencséktől a hámrétegig tartó szükséges munkatávolság néhány milliméter nagyságrendű. A probléma megoldásához távoli objektívre lehet szükség. Ezenkívül a vékony metszetek elkészítése a nagy rugalmasságú képalkotáshoz, mivel a PDMS-re vonatkozó előkészületeket igényel. a bél rétegenkénti mikrogyártása egy chipen az egyes rétegek közötti állandó tapadást jelenti, rendkívül nagy kihívást jelent a felső réteg kinyitása vagy eltávolítása a hámréteg felszíni szerkezetének vizsgálatához. Például pásztázó elektronmikroszkóp (SEM) segítségével.
A PDMS hidrofóbsága korlátozó tényező volt a hidrofób kis molekulákkal foglalkozó mikrofluidikai alapú vizsgálatokban, mivel a PDMS nem specifikusan képes adszorbeálni az ilyen hidrofób molekulákat. A PDMS alternatívái más polimer anyagokkal is megfontolhatók. hidrofób molekulák.
Végezetül, módszerünket nem jellemezték jól a nagy áteresztőképességű szűrés vagy az „egy méretben” felhasználóbarát kísérleti platform biztosítása szempontjából. A jelenlegi protokoll mikroeszközönként fecskendős pumpát igényel, amely helyet foglal egy CO2 inkubátorban, és megakadályozza a nagyszabású kísérleteket. Ezt a korlátot jelentősen javíthatja az innovatív tenyésztési formátumok méretezhetősége (pl. amelyek lehetővé teszik a bazolaterális tápközeg folyamatos feltöltését és eltávolítását).
Az emberi bélhám 3D-s morfogenezisének in vitro indukálására egy mikrofluidikus chip intestinalis eszközt használtunk, amely két párhuzamos mikrocsatornát és egy rugalmas porózus membránt tartalmazott a lumen-kapilláris interfész létrehozására. Bemutatjuk egy egycsatornás mikrofluidikus eszköz (hibrid chip) használatát is, amely folyamatos bazolaterális áramlást biztosít mindkét platformon. különböző humán bélhámsejtekből áll, az áramlás irányított manipulálásával demonstrálható, hogy a morfogén antagonistákat eltávolítsuk a bazolaterális kompartmentből. A teljes kísérleti eljárás (1. ábra) öt részből áll: (i) a bélchip vagy a Transwell behelyezhető hibrid chip mikrogyártása (1-5. lépés; 1. doboz) a humán epitesztiális sejtek előkészítése, (2) organoidok;2-5. doboz), (iii) bélhámsejtek tenyésztése bélchipen vagy hibrid chipen (6-9. lépés), (iv) 3D morfogenezis in vitro indukálása (10. lépés) és (v) lépés) a 3D-s epiteliális mikrostruktúra jellemzésére (11-24. lépések). az epiteliális morfogenezist a térbeli, időbeli, feltételes vagy eljárási kontrollokkal összehasonlítva.
Két különböző tenyésztési platformot használtunk: gut-on-a-chip egyenes csatornákkal vagy nemlineáris csavart csatornákkal, vagy Transwell (TW) betéteket tartalmazó hibrid chipeket egy mikrofluidikus eszközben, amelyet az 1. dobozban leírtak szerint gyártottak, és az 1-5. hereorganoidok) és az ebben a protokollban használt tenyésztési eljárás."In vitro morfogenezis" bemutatja azokat az átfogó lépéseket, amelyekben a Caco-2-t vagy az organoid eredetű hámsejteket intestinalis chipen vagy hibrid chip Transwell inszertjein tenyésztik, majd 3D morfogenezis indukálása és egy jellemzett epiteliális szerkezet kialakítása következik. al rétegek használhatók például a sejtdifferenciálódás jellemzésében, a bélfiziológiai vizsgálatokban, a gazda-mikrobióm ökoszisztémák kialakításában és a betegségek modellezésében. Immunofluoreszcenciás képek a „Sejtdifferenciáció”-ban, amelyek a 3D Caco-2-ben expresszált MUC2-t mutatják. s. A bélfiziológiában készült fluoreszcens képek sziálsav- és N-acetil-glükózamin-maradékok fluoreszcens búzacsíra-agglutininnel történő festésével termelődő nyálkát mutatják. A „Host-Microbe Co-Cultures” című képen látható két átfedő képen látható a zöld fehérje expressziós fehérje expressziója a co-kultúrában. (GFP) mikromérnöki 3D Caco-2 hámsejtekkel. A jobb oldali panel a 3D Caco-2 hámsejtekkel együtt tenyésztett GFP E. coli lokalizációját mutatja, amelyet immunfluoreszcens festés követ F-aktinnal (piros) és sejtmagokkal (kék). A betegség modellezése az egészségeseket illusztrálja, a baktériumok ellen a szivárgó gyulladásos gyulladást. accharid, LPS) és immunsejtek (pl. PBMC;zöld).Caco-2 sejteket tenyésztettünk a 3D hámréteg kialakítása érdekében.Scale bar, 50 µm.A képek az alsó sorban: „A sejtek differenciálása” a hivatkozás engedélyével adaptálva.2.Oxford University Press;Reprodukálva a Ref.5 engedélyével.NAS;„Host-Microbe Co-Culture” a ref.3 engedélyével adaptálva.NAS;hivatkozásból engedéllyel adaptálva „Betegségmodellezés”.5.NAS.
Mind a gut-on-chip, mind a hibrid chipek PDMS replikákkal készültek, amelyeket szilíciumformákból bontottak ki lágy litográfiával1,44, és SU-8-mal mintázták meg. Az egyes chipek mikrocsatornáinak kialakítását a hidrodinamika, például a nyírófeszültség és a hidrodinamikai nyomás figyelembevétele határozza meg1,4,12.Az eredeti gut-chip-kialakítás, amely a két darabból áll. ed párhuzamos egyenes mikrocsatornákat, összetett bél-on-a-chipen fejlődött ki (bővített adatok, 1b. ábra), amely egy pár ívelt mikrocsatornát tartalmaz a megnövekedett folyadék tartózkodási idő, a nemlineáris áramlási minták és a tenyésztett sejtek többtengelyű deformációjának indukálására (2a-f ábra), összetettebb biomechanikai szükségletek komplexálása. Kimutattuk, hogy a tekercselt Gut-Chip erősen indukálja a 3D morfogenezist hasonló időkeretben, hasonló mértékű hámnövekedéssel az eredeti Gut-Chiphez képest, függetlenül a tenyésztett sejttípustól. Ezért a 3D morfogenezis indukálásához lineáris és komplex, moláris SUPD-s repliced ​​designs on-chipconigensing on-chipcongues. -8 minta negatív tulajdonságokkal rendelkezik a szétszerelés után (ábra).2a). A bél chipen történő előállításához az előkészített felső PDMS-réteget egymás után egy porózus PDMS-fóliához erősítették, majd koronakezelő segítségével irreverzibilis kötéssel igazították az alsó PDMS-réteghez (2b–f. ábra). A hibrid chipek előállításához kikeményített PDMS-replikákat végeztek mikrofluidálisan transzformáló, transzformatív üveglemezekhez köthető eszközökkel. 2h és Extended Data 2. ábra).A kötési folyamat a PDMS replika és az üveg felületének oxigénplazmával vagy koronakezeléssel történő kezelésével történik.A szilikoncsőhöz rögzített mikrogyártott eszköz sterilizálása után az eszközbeállítás készen állt a bélhám 3D morfogenezisének elvégzésére2g (ábra).
a, A PDMS alkatrészek SU-8 mintázatú szilíciumformákból való előállításának sematikus illusztrációja.A kikeményítetlen PDMS-oldatot szilíciumformába öntöttük (balra), 60 °C-on (középen) kikeményítettük, majd a formából kibontottuk (jobbra).A formából bontott PDMS-t darabokra vágtuk, és további felhasználáshoz megtisztították.b, Fénykép a PDMS-ről a felső réteg elkészítéséhez. d, a PDMS porózus membrán előállításához használt.d, Fényképsorozat a felső és alsó PDMS komponensekről, valamint az összeszerelt chipen lévő béleszközről.e, A felső, a membrán és az alsó PDMS komponensek egymáshoz igazításának vázlata. Minden réteg visszafordíthatatlanul össze van kötve plazma- vagy koronakezeléssel.f, A mikrocsatornásan gyártott szupercukor-impregnált eszköz vázlata. um chambers.g, Setup of gut-on-a-chip for microfluidic cell culture.A gyártott bél egy chipen összeállított szilikon csővel és fecskendővel került egy fedőlemezre.A chip eszközt egy 150 mm-es Petri-csésze fedelére helyeztük feldolgozás céljából.A kötőanyagot használjuk a szilikoncsöves szövet chipogenációs és szövetchip-shotális cső lezárására. A bélhámsejtek 2D-s monorétegeinek tenyésztéséhez függetlenül elkészített Transwell inszerteket a hibrid chipbe helyeztük a bél 3D morfogenezisének indukálására. A táptalajt mikrocsatornákon keresztül perfundáljuk a Transwell inszerten kialakított sejtréteg alatt. Skálasáv, 1 cm.h Újranyomva a 4. hivatkozás engedélyével.Elsevier.
Ebben a protokollban a Caco-2 sejtvonalat és az intestinalis organoidokat használtuk hámforrásként (3a. ábra). Mindkét sejttípust egymástól függetlenül tenyésztettük (2. és 5. doboz), és az on-chip bél vagy Transwell sejtek ECM-bevonatú mikrocsatornáinak beoltására használtuk. Amikor a sejtek konfluensek (a sejtek konfluensek (>9%) hu 10. és 50. passzázst) T-lombikban gyűjtik össze, hogy tripszinező folyadékkal disszociált sejtszuszpenziókat állítsanak elő (2. rovat). A bélbiopsziákból vagy sebészeti reszekciókból származó humán bélorganoidokat W Matrigel állványkupolákban tenyésztjük 24 lyukú, morfogént, nospondiumot és nospondiumot tartalmazó lemezeken. ggin) és a 3. dobozban leírtak szerint elkészített növekedési faktorokat minden második napon kiegészítettük, amíg az organoidok átmérője ~500 µm-re nem nőtt. A teljesen kifejlett organoidokat összegyűjtik, és egyetlen sejtekké disszociálják, hogy a bélbe vagy a chipen lévő Transwell inzertekre ültessék (5. doboz). Amint arról már korábban beszámoltunk, megkülönböztethető a rák típusa szerint, colitisalis, colorectan13 betegség. vagy normál donor), a lézió helye (pl. a lézió a nem sérült területhez képest) és a gyomor-bél traktus helye (pl. duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon vagy rectum). Az 5. dobozban optimalizált protokollt biztosítunk a vastagbél organoidjainak (koloidjainak) tenyésztéséhez, amelyek általában magasabb mortogén-szervkoncentrációt igényelnek a testben.
a, Workflow for the induction of gut morphogenesis in the gut chip.Caco-2 humán bélhám és bélorganoidok ebben a protokollban a 3D morfogenezis demonstrálására szolgálnak.Az izolált hámsejteket beoltottuk az előkészített gut-on-a-chip eszközbe (chip-preparátum).A PD membránra csatolva (Onceedattad cell) látható. (D0), apikális (AP) áramlás indul be és tart fenn az első 2 napban (flow, AP, D0-D2).A bazolaterális (BL) áramlás is megindul a ciklikus nyújtó mozdulatokkal (nyújtás, áramlás, AP és BL) együtt, amikor teljes 2D egyrétegű réteg képződik. Bél 3D morfogenezis mikrofluogenezis után 5 nappal spontán spontán bekövetkezett P, 5 nappal. a képek a Caco-2 sejtek reprezentatív morfológiáját mutatják minden kísérleti lépésben vagy időpontban (oszlopdiagram, 100 µm).Négy sematikus diagram, amely a bélmorfogenezis megfelelő kaszkádjait szemlélteti (jobbra fent). A szaggatott nyilak a vázlaton a folyadékáramlás irányát jelzik.b, SEM-kép, amely a kialakított 3D-s epizódfelület felszíni topológiáját mutatja. ) mutatja a regenerált mikrobolyhokat a 3D Caco-2 rétegen (jobbra).c, A kialakult Caco-2 3D vízszintes elölnézete, a claudin (ZO-1, piros) és az F-aktin (zöld) feliratú folyamatos ecsetszegély membránok és a magok (kék) Immunofluorescence konfokális vizualizáció jelzi az epithelialis chipek középső síkjának elhelyezkedését. fokális nézet.d, fáziskontrasztmikroszkóppal nyert chipen tenyésztett organoidok morfológiai változásainak időbeli lefolyása a 3., 7., 9., 11. és 13. napon. A beillesztés (jobbra fent) a rendelkezésre álló kép nagy nagyítását mutatja. 5;bíbor), serlegsejtek (MUC2; zöld), F-aktin (szürke) és sejtmagok (cián) 3 napig (balra) és 13 napos (középső) organoidokon nőttek a hámrétegen. Lásd még a 3. ábrát, amely kiemeli az LGR5 jelátvitelt, anélkül, hogy a MUC2 jelképeit mikrostrukturálnák3. a bélben a plazmamembrán CellMask festékkel (jobbra) történő megfestésével chipen létesült hám a tenyésztés 13. napján.A skálasáv 50 μm, hacsak másképp nem jelezzük.b Referencia alapján újranyomva engedéllyel.2.Oxford University Press;c Referencia engedélyével adaptálva.2.Oxford University Press;e és f hivatkozással engedéllyel adaptálva.12 Creative Commons License CC BY 4.0.
A bélben egy chipen a PDMS porózus membrán hidrofób felületének módosítása szükséges a sikeres ECM bevonathoz. Ebben a protokollban két különböző módszert alkalmazunk a PDMS membránok hidrofóbságának módosítására. A Caco-2 sejtek tenyésztéséhez az UV/ózon kezeléssel végzett felületaktiválás önmagában elegendő volt ahhoz, hogy csökkentse az ECM membrán felületének, a Coatco- MS sejtek coatco-MS sejtek hidrofóbiitását, coatco-MS sejtek kötődését. Az organoid epitélium mikrofluidikus tenyésztéséhez kémiai alapú felületi funkcionalizálás szükséges az ECM fehérjék hatékony lerakódásához, polietilénimin (PEI) és glutáraldehid szekvenciális felvitelével a PDMS mikrocsatornákra. A felület módosítása után ECM fehérjéket raktak le a funkcionalizált PDMS felület lefedésére, majd az izolált mikrofluidikus sejttenyészetbe juttatták be, és csak a mikrofluidális sejttenyészethez kapcsolódnak a perfusionális sejtek. a felső mikrocsatornát egészen addig, amíg a sejtek egy teljes egyrétegű réteget nem alkotnak, míg az alsó mikrocsatorna fenntartja a statikus feltételeket. Ez a felületaktiválásra és ECM bevonásra optimalizált módszer lehetővé teszi az organoid epitélium rögzítését, hogy 3D morfogenezist indukáljon a PDMS felületén.
A Transwell tenyészetekhez ECM bevonat is szükséges a sejtoltás előtt;A Transwell tenyészetek azonban nem igényelnek bonyolult előkezelési lépéseket a porózus inszertek felületének aktiválásához. A Caco-2 sejtek Transwell inszerteken történő tenyésztéséhez a porózus inszertek ECM bevonata felgyorsítja a disszociált Caco-2 sejtek megtapadását (< 1 óra) és a szoros kapcsolódási gát kialakulását (<1-2 nap). A transzwell organoidok tenyésztéséhez a Transwell felszínén lévő organoidok a membránon vannak rögzítve, az inszerteket h3 lásd. addig tartjuk, amíg az organoidok egy teljes, gát integritással rendelkező egyrétegű réteget alkotnak. A transzwell tenyészeteket 24 lyukú lemezeken végezzük hibrid chipek használata nélkül.
Az in vitro 3D morfogenezis elindítható folyadékáramlás alkalmazásával a kialakult epiteliális réteg bazolaterális aspektusára. A bélben egy chipen az epiteliális morfogenezis akkor kezdődött, amikor a táptalajt a felső és az alsó mikrocsatornákba perfundáltuk (3a. ábra). A korábban leírtak szerint kritikus fontosságú a folyadékáramlás bevezetése a folyamatos szekréciós gátló irányban az inferiorba (basamentolateralis morphogenesis)com. tápanyagokat és szérumot a porózus membránokon kötött sejtekhez, és luminális nyírófeszültséget generálnak, jellemzően kettős áramlást alkalmazunk a bélben egy chipen.A hibrid chipekben epiteliális monorétegeket tartalmazó Transwell betéteket helyeztek a hibrid chipekbe.Ezután a táptalajt a porózus Transwell tenyésztő betét bazolaterális oldala alá alkalmaztuk a mikrocsatornán keresztül.Béloldali áramlási platformon keresztül mindkét oldalon morfogenezisben fordult elő5 nappal.
A mikromérnöki tervezésű 3D epiteliális rétegek morfológiai jellemzői különféle képalkotó módszerek alkalmazásával elemezhetők, beleértve a fáziskontraszt mikroszkópot, a differenciális interferencia-kontraszt (DIC) mikroszkópot, a SEM-et vagy az immunfluoreszcens konfokális mikroszkópot (3. és 4. ábra). A fáziskontraszt vagy DIC képalkotás a tenyésztés során a protrusuális réteg bármely időpontjában és alakjában könnyen monitorozható. A PDMS és a poliészter fóliák optikai átlátszósága érdekében mind a gut-on-a-chip, mind a hibrid chip platformok valós idejű in situ képalkotást biztosítanak anélkül, hogy az eszközt metszeni kellene vagy szétszerelni. Immunfluoreszcens képalkotás során (1., 3c, f és 4b, c ábra), a sejtek jellemzően az XFA-t követve fixálódnak (/-vel) 100 és 2% (wt/v) ) szarvasmarha szérum albumin (BSA), sorrendben. A sejttípustól függően különböző fixálók, permeabilizátorok és blokkoló szerek használhatók. A vonalfüggő sejt- vagy régiómarkereket célzó elsődleges antitestek segítségével kiemelik az in situ immobilizált sejteket a chipen (vagy másodlagos antibo, vagy 4, majd egy antibo, vagy másodlagos antibo, vagy négy -diamidino-2-fenilén) indol, DAPI) vagy F-aktin (pl. fluoreszcensen jelölt falloidin). Fluoreszcencia alapú élő képalkotás is végezhető in situ a nyálkaképződés kimutatására (1. ábra).1, „Sejtdifferenciáció” és „Bélfiziológia”), a mikrobiális sejtek véletlenszerű kolonizációja (1. ábra, „Gazdagazda-mikroba ko-kultúra”), az immunsejtek toborzása (1. ábra, „Betegségmodellezés”) vagy a 3D-s epiteliális morfológia körvonalai, szétválasztják, módosítják és módosítják a 3. ábrát. Amint a 2. ábrán látható, a 3D-s epiteliális morfológia, valamint az apikális ecsetszegélyen lévő mikrobolyhok SEM-rel megjeleníthetők (3b. ábra). A differenciálódási markerek expressziója kvantitatív PCR5 vagy egysejtrétegű RNS-szekvenciák epitélium-szekvenciájában történő vizsgálatával értékelhető. A hibrid chipeket tripszinezéssel gyűjtik be, majd molekuláris vagy genetikai elemzésre használják fel.
a, Munkafolyamat intesztinális morfogenezis indukciójához hibrid chipben. Ebben a protokollban a Caco-2-t és az intestinalis organoidokat használjuk a 3D morfogenezis bemutatására hibrid chip platformon. A disszociált hámsejteket előkészített Transwell inszertekbe oltottuk (TW prep; lásd az alábbi ábrát). Miután a sejteket transzwell statikus membránba ültettük, és az összes sejtet beoltották (poliészter T-be oltották). A W-tenyészet). 7 nap elteltével egyetlen Transwell inszertet, amely 2D-s egyrétegű hámsejteket tartalmazott, egy hibrid chipbe integráltunk, hogy bejusson egy bazolaterális áramlást (Flow, BL), ami végül egy 3D-s epiteliális réteg kialakulásához vezetett (morfogenezis). Fáziskontrasztos mikrográfok, amelyek az emberi szervhámsejtek morfológiai jellemzőit mutatják az egyes donorok sémapontjaiban (Ccenlonal3 kísérleti szakaszban) s a felső rétegekben az egyes lépések kísérleti konfigurációját szemlélteti.b, Hibrid chipek (bal oldali vázlat) organoid epiteliális sejtek 3D-s morfogeneziséhez vezethetnek felülről lefelé konfokális mikroszkópos nézetekkel, amelyek különböző Z pozíciókban (felső, középső és alsó;lásd a jobb oldali vázlatot és a megfelelő pontozott vonalakat).nyilvánvaló morfológiai jellemzőket mutatott.F-aktin (cián), mag (szürke).c, Statikus Transwell-ben tenyésztett organoid eredetű hámsejtek fluoreszcens konfokális mikrográfiája (TW; beillesztés a fehér szaggatott mezőbe) versus hibrid chip (legnagyobb teljes felvétel) összehasonlítva a 2D morfológiát (a megfelelő 2D-s morfológiát a 3D keresztezéssel, a 3D-s morfológiával. a jobb felső sarokban; „XZ”) 2D-s és 3D-s jellemzőket is mutat.Skála, 100 µm.c Referencia engedélyével újranyomva.4.Elsevier.
A kontrollokat úgy lehet előállítani, hogy ugyanazokat a sejteket (Caco-2 vagy bél organoid epiteliális sejteket) kétdimenziós egyrétegűké tenyésztik hagyományos statikus tenyésztési körülmények között. Nem feltétlenül a tápanyag-kimerülés a mikrocsatornák korlátozott térfogatkapacitásának következménye lehet (azaz a bazsalányok előtti bazsalabumok előtti alkalmazást követõen az előző morfológia (azaz 4 µl a felső csatornán.
A lágy litográfiás eljárást tiszta helyiségben kell elvégezni. A chip minden egyes rétegéhez (felső és alsó rétegek és membránok) és hibrid chipekhez különböző fotomaszkokat használtak és külön szilícium ostyákon készítettek, mert a mikrocsatornák magassága eltérő volt. A chipen lévő bél felső és alsó mikrocsatornáinak célmagassága 500 µm, a chip csatornájának célmagassága 200 µm, illetve µm200m. µm.
Helyezzen egy 3 hüvelykes szilícium ostyát egy acetonos edénybe. Óvatosan forgassa a lemezt 30 másodpercig, majd szárítsa meg levegőn. Tegye át az ostyát egy IPA-t tartalmazó tányérra, majd 30 másodpercig forgassa a lemezt a tisztításhoz.
Adott esetben piranha oldat (hidrogén-peroxid és tömény kénsav keveréke, 1:3 (térf/térf.)) használható a szerves maradványok szilíciumlapka felületéről való maximális eltávolítására.
A Piranha oldat rendkívül korrozív és hőt termel.További biztonsági óvintézkedésekre van szükség.A hulladékkezeléshez hagyja lehűlni az oldatot, és helyezze át egy tiszta, száraz hulladéktartályba.Használjon másodlagos tartályokat, és megfelelően címkézze fel a hulladéktartályokat. Kérjük, kövesse a létesítmény biztonsági irányelveit a részletesebb eljárásokhoz.
Dehidratálja az ostyákat úgy, hogy 200 °C-os főzőlapra helyezi 10 percre. Dehidratálás után az ostyát ötször ráztuk levegőn, hogy lehűljön.
Öntsön ~10 g fotoreziszt SU-8 2100-at a megtisztított szilícium ostya közepére.Használjon csipeszt a fotoreziszt egyenletes eloszlatásához az ostyán. Időnként helyezze az ostyát 65°C-os főzőlapra, hogy a fotoreziszt kevésbé ragadjon és könnyebben kenhető legyen.Ne helyezze az ostyát közvetlenül a főzőlapra.
Az SU-8 egyenletesen oszlik el az ostyán a centrifugálási bevonattal. Programozza be az SU-8 bejövő forgását 5–10 másodpercre, hogy 500 fordulat/perc sebességgel terjedjen 100 rpm/s gyorsulással. Állítsa be a fő centrifugálást 200 µm vastagság mintázattal 1500 µm-re, 50ma magasságra 1500 µm20m. a bél felső rétegéhez a chipen; lásd alább a „Kritikus lépések” című részt) 300 rpm/s 30 másodperc 1200 ford./perc sebességre állítva.
A fő centrifugálási sebesség a szilícium lapkán lévő SU-8 minta célvastagságának megfelelően állítható be.
Ahhoz, hogy 500 µm magasságú SU-8 mintákat készítsünk a bél felső rétegéhez a chipen, ennek a doboznak a centrifugálási és lágysütési lépéseit (7. és 8. lépés) egymás után megismételtük (lásd a 9. lépést), így két réteg 250 µm vastagságú SU-8-as réteget kapunk, amely 1 µm-es réteggel rétegezhető és 5 0 µm-es UV-sugárzással rétegezhető. .
Az SU-8 bevonatú ostyákat puhára sütjük úgy, hogy az ostyákat óvatosan 65 °C-os főzőlapra helyezzük 5 percre, majd kapcsoljuk a beállítást 95 °C-ra, és további 40 percig inkubáljuk.
Az SU-8 minta 500 μm-es magasságának eléréséhez a felső mikrocsatornában ismételje meg a 7. és 8. lépést két 250 μm vastag SU-8 réteg létrehozásához.
Az UV Mask Aligner segítségével végezzen lámpatesztet a gyártó utasításai szerint, hogy kiszámítsa az ostya expozíciós idejét. (expozíciós idő, ms) = (expozíciós dózis, mJ/cm2)/(lámpa teljesítménye, mW/cm2).
Az expozíciós idő meghatározása után helyezze a fotomaszkot az UV maszk igazító maszktartójára, és helyezze a fotómaszkot az SU-8 bevonatú ostyára.
Helyezze a fotómaszk nyomtatott felületét közvetlenül a szilícium lapka SU-8 bevonatú oldalára, hogy minimalizálja az UV-diszperziót.
Tegye ki az SU-8 bevonatú ostyát és a fotómaszkot függőlegesen 260 mJ/cm2 UV fénynek az előre meghatározott expozíciós időre (lásd a keret 10. lépését).
UV-sugárzás után az SU-8 bevonatú szilícium ostyákat 65 °C-on 5 percig és 95 °C-on 15 percig sütöttük minden főzőlapon, hogy 200 µm magasságú mintákat készítsünk. Növelje meg az utósütési időt 95 °C-on 30 percre, hogy 500 µm magasságú mintákat készítsen.
Az előhívót üvegedénybe öntjük, és az edénybe helyezzük a megsült ostyát.Az SU-8 előhívó térfogata az üveglap méretétől függően változhat. Ügyeljen arra, hogy elegendő SU-8 előhívót használjon a nem exponált SU-8 teljes eltávolításához. Ha például egy 150 mm átmérőjű, 1 literes előhívó kapacitású, 150 mm átmérőjű üvegtálat használ, kb. forgatás.
Öblítse le az előhívott formát ~10 ml friss előhívóval, majd IPA-val, pipettával permetezve az oldatot.
Helyezze az ostyát egy plazmatisztítóba, és tegye ki 1,5 percig oxigénplazma hatásának (atmoszférikus gáz, célnyomás 1 × 10-5 Torr, teljesítmény 125 W).
Helyezze az ostyát vákuum-exszikkátorba, benne üveglemezzel.Otyák és tárgylemezek egymás mellé helyezhetők.Ha a vákuum-exszikkátort egy lemez több rétegre osztja, helyezze a tárgylemezeket az alsó kamrába, az ostyákat pedig a felső kamrába. Csepegtessen rá 100 μL triklór-,-,-,-,-,-,- és fluor-üveg-oldatot. alkalmazzon vákuumot a szilanizáláshoz.
Olvasszuk fel a fagyasztott Caco-2 sejteket tartalmazó fiolát 37 °C-os vízfürdőben, majd vigyük át a felolvasztott sejteket egy T75-ös lombikba, amely 15 ml 37 °C-os előmelegített Caco-2 táptalajt tartalmaz.
A Caco-2 sejtek kb. 90%-os konfluenciájú átjutásához először melegítse fel a Caco-2 táptalajt, PBS-t és 0,25% tripszin/1 mM EDTA-t 37 °C-os vízfürdőben.
Szívja le a táptalajt vákuum-leszívással. Mossa meg a sejteket kétszer 5 ml meleg PBS-sel a vákuumszívás megismétlésével és friss PBS hozzáadásával.