Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com oldalt.Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik.A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben).Addig is a folyamatos támogatás érdekében a webhelyet stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg.
A mikrobiális paraziták evolúciója magában foglalja a természetes szelekció, amely a paraziták javulását okozza, és a genetikai sodródás között, amely a paraziták génjeit veszítik el, és káros mutációkat halmoznak fel.Annak érdekében, hogy megértsük, hogyan történik ez az ellenhatás egyetlen makromolekula léptékében, leírjuk az Encephalitozoon cuniculi riboszómájának krio-EM szerkezetét, amely egy eukarióta szervezet, amely a természetben az egyik legkisebb genommal rendelkezik.Az rRNS extrém csökkenése az E. cuniculi riboszómákban példátlan szerkezeti változásokkal jár együtt, mint például a korábban ismeretlen fuzionált rRNS linkerek és kidudorodások nélküli rRNS evolúciója.Ezen túlmenően, az E. cuniculi riboszóma túlélte az rRNS-fragmensek és fehérjék elvesztését azáltal, hogy kifejlesztette a képességét, hogy kis molekulákat lebontott rRNS-fragmensek és fehérjék szerkezeti mimikájaként használjon.Összességében azt mutatjuk be, hogy a régóta redukáltnak, degeneráltnak és legyengítő mutációknak kitett molekuláris struktúrák számos kompenzációs mechanizmussal rendelkeznek, amelyek az extrém molekulaösszehúzódások ellenére is aktívak maradnak.
Mivel a mikrobiális paraziták legtöbb csoportja egyedi molekuláris eszközökkel rendelkezik gazdáik kiaknázására, gyakran különböző terápiákat kell kifejlesztenünk a paraziták különböző csoportjai számára1,2.Az új bizonyítékok azonban azt sugallják, hogy a parazita evolúció egyes aspektusai konvergensek és nagymértékben megjósolhatók, ami potenciális alapot jelent a mikrobiális parazitákkal kapcsolatos széles körű terápiás beavatkozásokhoz3,4,5,6,7,8,9.
A korábbi munkák egy közös evolúciós tendenciát azonosítottak a mikrobiális parazitákban, amelyeket genomcsökkentésnek vagy genomdecaynak neveznek10, 11, 12, 13.A jelenlegi kutatások azt mutatják, hogy amikor a mikroorganizmusok feladják szabadon élő életmódjukat, és intracelluláris parazitákká (vagy endoszimbiontákká) válnak, genomjuk lassú, de csodálatos metamorfózisokon megy keresztül évmilliók alatt9,11.A genompusztulásnak nevezett folyamat során a mikrobiális paraziták káros mutációkat halmoznak fel, amelyek számos korábban fontos gént pszeudogénné változtatnak, ami fokozatos génvesztéshez és mutációs összeomláshoz vezet14,15.Ez az összeomlás a legrégebbi intracelluláris organizmusok génjeinek akár 95%-át is elpusztíthatja, összehasonlítva a közeli rokon, szabadon élő fajokkal.Így az intracelluláris paraziták evolúciója huzavona két ellentétes erő között: a darwini természetes szelekció, amely a paraziták javulásához vezet, és a genom összeomlása, ami a parazitákat a feledés homályába veti.Továbbra sem világos, hogy a parazita hogyan tudott kikerülni ebből a huzavonaból és megőrizni molekuláris szerkezetének aktivitását.
Noha a genomlebomlás mechanizmusa nem teljesen ismert, úgy tűnik, hogy főként a gyakori genetikai sodródás miatt következik be.Mivel a paraziták kicsi, ivartalan és genetikailag korlátozott populációkban élnek, nem tudják hatékonyan kiküszöbölni a káros mutációkat, amelyek néha a DNS-replikáció során fordulnak elő.Ez a káros mutációk visszafordíthatatlan felhalmozódásához és a parazita genom csökkenéséhez vezet.Ennek eredményeként a parazita nemcsak olyan géneket veszít el, amelyek már nem szükségesek a túléléshez az intracelluláris környezetben.A parazitapopulációk képtelenek hatékonyan kiküszöbölni a szórványos káros mutációkat, ami miatt ezek a mutációk felhalmozódnak a genomban, beleértve a legfontosabb géneiket is.
A genomcsökkentésről alkotott jelenlegi ismereteink nagy része kizárólag a genomszekvenciák összehasonlításán alapul, kevesebb figyelmet fordítva a tényleges molekulák változásaira, amelyek háztartási funkciókat látnak el, és potenciális gyógyszercélpontként szolgálnak.Összehasonlító vizsgálatok kimutatták, hogy a káros intracelluláris mikrobiális mutációk okozta teher hajlamosítja a fehérjéket és a nukleinsavakat téves feltekeredésre és aggregációra, ezáltal chaperonfüggőbbek és túlérzékenyek a hőre19, 20, 21, 22, 23.Ezenkívül a különböző paraziták – a független evolúció során néha akár 2,5 milliárd év is eltávolodott egymástól – hasonló minőség-ellenőrzési központok elvesztését tapasztalták fehérjeszintézisükben5,6 és DNS-javító mechanizmusaikban24.Keveset tudunk azonban az intracelluláris életmódnak a sejten belüli makromolekulák összes többi tulajdonságára gyakorolt ​​hatásáról, beleértve a molekuláris alkalmazkodást a káros mutációk növekvő terhéhez.
Ebben a munkában az intracelluláris mikroorganizmusok fehérjéinek és nukleinsavainak evolúciójának jobb megértése érdekében meghatároztuk az intracelluláris parazita Encephalitozoon cuniculi riboszómáinak szerkezetét.Az E. cuniculi egy gombaszerű szervezet, amely a parazita mikrosporidiumok csoportjába tartozik, amelyek szokatlanul kicsi eukarióta genomokkal rendelkeznek, és ezért modellszervezetként használják a genom bomlásának tanulmányozására25, 26, 27, 28, 29, 30.A közelmúltban krio-EM riboszóma szerkezetet határoztak meg a Microsporidia, Paranosema locustae és Vairimorpha necatrix31,32 mérsékelten redukált genomjaira (~3,2 Mb genom).Ezek a struktúrák arra utalnak, hogy az rRNS-amplifikáció bizonyos mértékű elvesztését kompenzálja a szomszédos riboszómális fehérjék közötti új kapcsolatok kialakulása vagy új msL131,32 riboszomális fehérjék megszerzése.Az Encephalitozoon fajok (genom körülbelül 2,5 millió bp) és legközelebbi rokon ordospóra, az eukarióták genomcsökkenésének végső fokát demonstrálják – kevesebb mint 2000 fehérjét kódoló gént tartalmaznak, és várhatóan riboszómáik nem csak rRNS-tágító fragmenseket tartalmaznak (a riboszóma négy rRNS-riboszóma-fragmentuma megkülönbözteti a baktériumoktól). mal fehérjék az E. cuniculi genomban való homológ hiánya miatt26,27,28.Ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy az E. cuniculi riboszóma korábban ismeretlen stratégiákat tárhat fel a genomromláshoz való molekuláris alkalmazkodásra.
Krio-EM szerkezetünk a legkisebb jellemezhető eukarióta citoplazmatikus riboszóma, és betekintést nyújt abba, hogy a genomredukció végső foka hogyan befolyásolja a sejt szerves részét képező molekuláris gépezet szerkezetét, összeállítását és fejlődését.Megállapítottuk, hogy az E. cuniculi riboszóma megsérti az RNS feltekeredésének és riboszóma-összeállításának számos, széles körben konzervált elvét, és felfedeztünk egy új, korábban ismeretlen riboszomális fehérjét.Egészen váratlanul megmutatjuk, hogy a mikrosporidia riboszómák kifejlesztették a kis molekulák megkötésének képességét, és feltételezzük, hogy az rRNS és a fehérjék csonkolása olyan evolúciós újításokat indít el, amelyek végső soron hasznos tulajdonságokkal ruházhatják fel a riboszómát.
Annak érdekében, hogy jobban megértsük a fehérjék és nukleinsavak evolúcióját az intracelluláris szervezetekben, úgy döntöttünk, hogy E. cuniculi spórákat izolálunk fertőzött emlőssejtek tenyészeteiből, hogy megtisztítsuk riboszómáikat és meghatározzuk e riboszómák szerkezetét.Nehéz nagyszámú parazita mikrosporidia beszerzése, mivel a mikrosporidiumokat nem lehet tápközegben tenyészteni.Ehelyett csak a gazdasejtben nőnek és szaporodnak.Ezért, hogy E. cuniculi biomasszát nyerjünk a riboszóma tisztításhoz, megfertőztük az emlős RK13 vese-sejtvonalat E. cuniculi spórákkal, és ezeket a fertőzött sejteket több hétig tenyésztettük, hogy lehetővé tegyük az E. cuniculi növekedését és szaporodását.Egy körülbelül fél négyzetméteres fertőzött sejt egyrétegű réteg felhasználásával körülbelül 300 mg Microsporidia spórát tudtunk megtisztítani és felhasználni riboszómák izolálására.Ezután a tisztított spórákat üveggyöngyökkel roncsoltuk, és a nyers riboszómákat izoláltuk a lizátumok fokozatos polietilénglikolos frakcionálásával.Ez lehetővé tette, hogy körülbelül 300 µg nyers E. cuniculi riboszómát kapjunk szerkezeti elemzéshez.
Ezután a kapott riboszóma minták felhasználásával krio-EM képeket gyűjtöttünk, és ezeket a képeket a nagy riboszóma alegységnek, a kis alegység fejnek és a kis alegységnek megfelelő maszkok segítségével dolgoztuk fel.A folyamat során körülbelül 108 000 riboszomális részecske képét gyűjtöttük össze, és 2,7 Å felbontású krio-EM képeket készítettünk (1-3. kiegészítő ábra).Ezután cryoEM képeket használtunk az rRNS, a riboszómális fehérje és az E. cuniculi riboszómákkal kapcsolatos Mdf1 hibernációs faktor modellezésére (1a, b ábra).
az E. cuniculi riboszóma szerkezete az Mdf1 hibernációs faktorral komplexben (pdb id 7QEP).b Az E. cuniculi riboszómához kapcsolódó Mdf1 hibernációs faktor térképe.c Másodlagos szerkezeti térkép, amely összehasonlítja a Microsporidian fajokban visszanyert rRNS-t ismert riboszómális szerkezetekkel.A panelek az amplifikált rRNS-fragmensek (ES) és a riboszóma aktív helyek elhelyezkedését mutatják, beleértve a dekódoló helyet (DC), a szarcinicin hurkot (SRL) és a peptidil-transzferáz központot (PTC).d Az E. cuniculi riboszóma peptidil-transzferáz centrumának megfelelő elektronsűrűség arra utal, hogy ez a katalitikus hely azonos szerkezettel rendelkezik az E. cuniculi parazitában és gazdáiban, beleértve a H. sapiens-t is.e, f A dekódoló centrum megfelelő elektronsűrűsége (e) és a dekódoló központ sematikus felépítése (f) azt jelzi, hogy az E. cuniculiban sok más eukarióta A1491 helyett U1491 (E. coli számozás) található.Ez a változás arra utal, hogy az E. cuniculi érzékeny lehet azokra az antibiotikumokra, amelyek ezt az aktív helyet célozzák.
Ellentétben a V. necatrix és a P. locustae riboszómák korábban megállapított szerkezetével (mindkét struktúra ugyanazt a Nosematidae microsporidia családot képviseli, és nagyon hasonlóak egymáshoz), a 31,32 E. cuniculi riboszómák számos rRNS- és fehérje fragmentációs folyamaton mennek keresztül.További denaturálás (4-6. kiegészítő ábrák).Az rRNS-ben a legszembetűnőbb változások közé tartozott az amplifikált ES12L 25S rRNS-fragmens teljes elvesztése, valamint a h39, h41 és H18 hélixek részleges degenerációja (1c. ábra, 4. kiegészítő ábra).A riboszómális fehérjék közül a legszembetűnőbb változások az eS30 fehérje teljes elvesztése és az eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 és eS7 fehérjék rövidülése volt (4, uS17 és eS7 kiegészítő fehérjék).
Így az Encephalotozoon/Ordospora fajok genomjának szélsőséges csökkenése riboszómaszerkezetükben is megmutatkozik: az E. cuniculi riboszómák a legdrámaibb fehérjetartalom-csökkenést a szerkezeti jellemzésnek alávetett eukarióta citoplazmatikus riboszómákban élik át, és nem is rendelkeznek azzal az rRNS-sel és fehérjefragmenssel, amelyek az élet doménjében is széles körben konzerváltak.Az E. cuniculi riboszóma szerkezete adja az első molekuláris modellt ezekhez a változásokhoz, és olyan evolúciós eseményeket tár fel, amelyeket mind az összehasonlító genomika, mind az intracelluláris biomolekuláris szerkezet vizsgálata figyelmen kívül hagyott (7. kiegészítő ábra).Az alábbiakban leírjuk ezeket az eseményeket, valamint azok valószínű evolúciós eredetét és a riboszóma működésére gyakorolt ​​​​potenciális hatásukat.
Ezután azt találtuk, hogy a nagy rRNS csonkolások mellett az E. cuniculi riboszómák egyik aktív helyén rRNS-variációk is vannak.Bár az E. cuniculi riboszóma peptidil-transzferáz centruma szerkezete megegyezik a többi eukarióta riboszómáéval (1d. ábra), a dekódoló központ az 1491. nukleotid szekvenciavariációja miatt különbözik (E. coli számozás, 1e, f ábra).Ez a megfigyelés azért fontos, mert az eukarióta riboszómák dekódoló helye jellemzően G1408 és A1491 aminosavakat tartalmaz, összehasonlítva a bakteriális típusú A1408 és G1491 csoportokkal.Ez a változatosság a bakteriális és eukarióta riboszómák eltérő érzékenysége a riboszomális antibiotikumok aminoglikozid családjával és más kis molekulákkal szemben, amelyek a dekódoló helyet célozzák.Az E. cuniculi riboszóma dekódoló helyén az A1491-et U1491-gyel helyettesítették, potenciálisan egyedi kötőfelületet teremtve az ezt az aktív helyet megcélzó kis molekulák számára.Ugyanez az A14901 változat más mikrosporidiumokban is megtalálható, mint például a P. locustae és a V. necatrix, ami arra utal, hogy széles körben elterjedt a microsporidia fajok között (1f. ábra).
Mivel E. cuniculi riboszóma mintáinkat metabolikusan inaktív spórákból izoláltuk, teszteltük az E. cuniculi krio-EM térképét a korábban leírt riboszóma kötődésre stressz vagy éhezés mellett.Hibernációs faktorok 31, 32, 36, 37, 38. A hibernált riboszóma korábban megállapított szerkezetét egyeztettük az E. cuniculi riboszóma krio-EM térképével.A dokkoláshoz S. cerevisiae riboszómákat használtunk az Stm138 hibernációs faktorral, a sáska riboszómákat Lso232 faktorral komplexben, valamint a V. necatrix riboszómákat Mdf1 és Mdf231 faktorokkal komplexben.Ugyanakkor az Mdf1 nyugalmi faktornak megfelelő krio-EM sűrűséget találtunk.Hasonlóan az Mdf1-hez a V. necatrix riboszómához, az Mdf1 az E. cuniculi riboszómához is kötődik, ahol blokkolja a riboszóma E helyét, esetleg elősegítve a riboszómák elérhetővé tételét, amikor a parazita spórák metabolikusan inaktívvá válnak a test inaktiválásakor (2. ábra).).
Az Mdf1 blokkolja a riboszóma E-helyét, amely úgy tűnik, hogy segít inaktiválni a riboszómát, amikor a parazita spórák metabolikusan inaktívvá válnak.Az E. cuniculi riboszóma szerkezetében azt találtuk, hogy az Mdf1 korábban ismeretlen kontaktust képez az L1 riboszóma szárral, a riboszóma azon részével, amely elősegíti a deacilált tRNS felszabadulását a riboszómából a fehérjeszintézis során.Ezek az érintkezések arra utalnak, hogy az Mdf1 ugyanazt a mechanizmust alkalmazva disszociál a riboszómáról, mint a dezacetilezett tRNS, ami egy lehetséges magyarázatot ad arra, hogy a riboszóma hogyan távolítja el az Mdf1-et a fehérjeszintézis újraaktiválásához.
Szerkezetünk azonban ismeretlen kapcsolatot tárt fel az Mdf1 és az L1 riboszóma láb között (a riboszóma azon része, amely segít a deacilált tRNS-nek a riboszómából a fehérjeszintézis során).Közelebbről, az Mdf1 ugyanazokat az érintkezőket használja, mint a deacilezett tRNS-molekula könyökrésze (2. ábra).Ez a korábban ismeretlen molekuláris modellezés azt mutatta, hogy az Mdf1 ugyanazzal a mechanizmussal disszociál a riboszómától, mint a deacetilált tRNS, ami megmagyarázza, hogy a riboszóma hogyan távolítja el ezt a hibernációs faktort, hogy újraaktiválja a fehérjeszintézist.
Az rRNS modell megalkotása során azt találtuk, hogy az E. cuniculi riboszómában rendellenesen feltekeredő rRNS fragmentumok találhatók, amelyeket fuzionált rRNS-nek neveztünk (3. ábra).Az élet három doménjét átívelő riboszómákban az rRNS olyan struktúrákká redukálódik, amelyekben a legtöbb rRNS-bázis vagy bázispárosodik, és összehajt egymással, vagy kölcsönhatásba lép a riboszómális fehérjékkel38, 39, 40.Az E. cuniculi riboszómákban azonban úgy tűnik, hogy az rRNS-ek megsértik ezt a hajtogatási elvet azáltal, hogy egyes hélixeiket kibontott rRNS-régiókká alakítják.
A H18 25S rRNS hélix szerkezete S. cerevisiae, V. necatrix és E. cuniculi törzsekben.Jellemzően a három életdomént átívelő riboszómákban ez a linker egy 24-34 aminosavból álló RNS-spirálba tekercselődik.Ezzel szemben a Microsporidia-ban ez az rRNS-linker fokozatosan két egyszálú, uridinben gazdag linkerré redukálódik, amelyek mindössze 12 csoportot tartalmaznak.Ezeknek a maradékoknak a legtöbbje oldószereknek van kitéve.Az ábrán látható, hogy a parazita mikrosporidiumok megsértik az rRNS-folding általános elveit, ahol az rRNS-bázisok általában más bázisokhoz kapcsolódnak, vagy részt vesznek az rRNS-fehérje kölcsönhatásokban.A microsporidiumokban egyes rRNS-fragmensek kedvezőtlen redőt vesznek fel, amelyben a korábbi rRNS-hélix egyszálú, csaknem egyenes vonalban megnyúlt fragmentummá válik.Ezeknek a szokatlan régióknak a jelenléte lehetővé teszi a microsporidia rRNS számára, hogy távoli rRNS-fragmensekhez kötődjön minimális számú RNS-bázis felhasználásával.
Ennek az evolúciós átmenetnek a legszembetűnőbb példája a H18 25S rRNS hélixben figyelhető meg (3. ábra).Az E. colitól az emberig terjedő fajokban ennek az rRNS-hélixnek az alapjai 24-32 nukleotidot tartalmaznak, és kissé szabálytalan hélixet alkotnak.A korábban azonosított V. necatrix és P. locustae31,32 riboszóma struktúrákban a H18 hélix bázisai részben felcsavarodottak, de a nukleotid bázispárosodás megmarad.Azonban az E. cuniculi-ban ez az rRNS-fragmens lesz a legrövidebb linker, 228UUUGU232 és 301UUUUUUUUUU307.A tipikus rRNS-fragmensekkel ellentétben ezek az uridinben gazdag linkerek nem tekerednek fel, és nem lépnek érintkezésbe riboszomális fehérjékkel.Ehelyett oldószerrel nyitott és teljesen kibontott struktúrákat alkalmaznak, amelyekben az rRNS-szálak majdnem egyenesen megnyúlnak.Ez a megnyúlt konformáció megmagyarázza, hogy az E. cuniculi csak 12 RNS bázist használ a H16 és H18 rRNS hélixek közötti 33 Å rés kitöltésére, míg más fajok legalább kétszer annyi rRNS bázist igényelnek a rés kitöltéséhez.
Így kimutathatjuk, hogy az energetikailag kedvezőtlen hajtogatás révén a parazita mikrosporidiumok olyan stratégiát fejlesztettek ki, amellyel még azokat az rRNS-szegmenseket is összehúzhatják, amelyek az élet három tartományában nagyjából konzerváltak maradnak a fajok között.Nyilvánvalóan az rRNS hélixeket rövid poli-U linkerekké alakító mutációk felhalmozásával az E. cuniculi szokatlan rRNS-fragmenseket tud létrehozni, amelyek a lehető legkevesebb nukleotidot tartalmazzák a távoli rRNS-fragmensek ligálásához.Ez segít megmagyarázni, hogy a microsporidia hogyan érte el alapvető molekulaszerkezetük drámai csökkenését anélkül, hogy elveszítette volna szerkezeti és funkcionális integritását.
Az E. cuniculi rRNS másik szokatlan jellemzője az rRNS megjelenése megvastagodás nélkül (4. ábra).A kidudorodások olyan bázispárok nélküli nukleotidok, amelyek kicsavarnak az RNS-hélixből, ahelyett, hogy belebújnának.A legtöbb rRNS kiemelkedés molekuláris ragasztóként működik, segítve a szomszédos riboszómális fehérjék vagy más rRNS-fragmensek megkötését.Egyes dudorok csuklóként működnek, lehetővé téve az rRNS-hélix optimális hajlítását és hajtogatását a produktív fehérjeszintézishez41.
a Az rRNS-nyúlvány (S. cerevisiae számozás) hiányzik az E. cuniculi riboszóma szerkezetéből, de jelen van a legtöbb más eukarióta b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens és E. cuniculi belső riboszómáiban.a parazitákból hiányzik sok az ősi, erősen konzervált rRNS-dudor.Ezek a megvastagodások stabilizálják a riboszóma szerkezetét;ezért ezek hiánya a mikrosporidiumokban az rRNS feltekeredésének csökkent stabilitását jelzi microsporidia parazitákban.A P szárral (L7/L12 törzs a baktériumokban) való összehasonlítás azt mutatja, hogy az rRNS-dudorok elvesztése néha egybeesik az elveszett dudorok mellett új dudorok megjelenésével.A 23S/28S rRNS-ben található H42 hélix egy ősi dudorral rendelkezik (U1206 a Saccharomyces cerevisiae-ben), amely a becslések szerint legalább 3,5 milliárd éves, köszönhetően az élet három területének védelmének.A microsporidia esetében ez a dudor megszűnik.Az elveszett dudor mellett azonban új dudor jelent meg (A1306 in E. cuniculi).
Meglepő módon azt találtuk, hogy az E. cuniculi riboszómákból hiányzik a többi fajban található rRNS-dudorok többsége, köztük több mint 30, más eukariótákban konzervált dudor (4a. ábra).Ez a veszteség sok érintkezést kiküszöböl a riboszómális alegységek és a szomszédos rRNS hélixek között, néha nagy üreges üregeket hozva létre a riboszómán belül, ami az E. cuniculi riboszómát porózusabbá teszi a hagyományos riboszómákhoz képest (4b. ábra).Nevezetesen azt találtuk, hogy ezen dudorok többsége a korábban azonosított V. necatrix és P. locustae riboszóma struktúrákban is elveszett, amit a korábbi szerkezeti elemzések figyelmen kívül hagytak31,32.
Néha az rRNS-dudorok elvesztése az elveszett dudor mellett újabb dudorok kialakulásával jár együtt.Például a riboszómális P-szár egy U1208 dudort tartalmaz (Saccharomyces cerevisiae-ben), amely az E. coli-ból emberre is túlélt, ezért a becslések szerint 3,5 milliárd éves.A fehérjeszintézis során ez a dudor segíti a P szárat a nyitott és zárt konformációk közötti mozgásban, így a riboszóma transzlációs faktorokat tud toborozni, és azokat az aktív helyre szállítani.Az E. cuniculi riboszómákban ez a megvastagodás hiányzik;egy új, csak három bázispárban elhelyezkedő vastagítás (G883) azonban hozzájárulhat a P szár optimális rugalmasságának helyreállításához (4c. ábra).
A kidudorodások nélküli rRNS-re vonatkozó adataink arra utalnak, hogy az rRNS minimalizálása nem korlátozódik a riboszóma felszínén lévő rRNS-elemek elvesztésére, hanem a riboszómamagot is érintheti, így olyan parazita-specifikus molekuláris defektus jön létre, amelyet szabadon élő sejtekben nem írtak le.élő fajokat figyelnek meg.
A kanonikus riboszomális fehérjék és az rRNS modellezése után azt találtuk, hogy a hagyományos riboszomális komponensek nem magyarázzák a krio-EM kép három részét.E töredékek közül kettő kis molekula méretű (5. ábra, 8. kiegészítő ábra).Az első szegmens az uL15 és eL18 riboszomális fehérjék között helyezkedik el, általában az eL18 C-terminálisa által elfoglalt helyzetben, amely az E. cuniculiban lerövidül.Bár ennek a molekulának az azonosságát nem tudjuk meghatározni, ennek a sűrűségszigetnek a méretét és alakját jól magyarázza a spermidin molekulák jelenléte.A riboszómához való kötődését az uL15 fehérjék (Asp51 és Arg56) mikrosporidia-specifikus mutációi stabilizálják, amelyek úgy tűnik, hogy növelik a riboszóma affinitását ehhez a kis molekulához, mivel lehetővé teszik az uL15 számára, hogy a kis molekulát riboszomális szerkezetbe burkolja.Kiegészítő 2. ábra).8, további adatok 1, 2).
Cryo-EM képalkotás, amely az E. cuniculi riboszómához kötött ribózon kívüli nukleotidok jelenlétét mutatja.Az E. cuniculi riboszómában ez a nukleotid ugyanazt a helyet foglalja el, mint a 25S rRNS A3186 nukleotid (Saccharomyces cerevisiae számozás) a legtöbb más eukarióta riboszómában.b Az E. cuniculi riboszóma szerkezetében ez a nukleotid az uL9 és eL20 riboszómális fehérjék között helyezkedik el, ezáltal stabilizálja a két fehérje közötti érintkezést.cd eL20 szekvencia konzervációs elemzés a microsporidia fajok között.A Microsporidia fajok filogenetikai fája (c) és az eL20 fehérje többszörös szekvencia-illesztése (d) azt mutatja, hogy az F170 és K172 nukleotidkötő oldalláncok a legtöbb tipikus Microsporidiaban konzerváltak, kivéve a S. lophii-t, kivéve a korai elágazó Microsporidia-t, amely megtartotta az ES39L kiterjesztését.Ez az ábra azt mutatja, hogy az F170 és K172 nukleotidkötő maradékok csak az erősen redukált microsporidia genom eL20-ában vannak jelen, más eukariótákban azonban nem.Összességében ezek az adatok arra utalnak, hogy a Microsporidian riboszómák kialakítottak egy nukleotidkötő helyet, amely úgy tűnik, hogy megköti az AMP-molekulákat, és ezeket a fehérje-fehérje kölcsönhatások stabilizálására használja a riboszómális szerkezetben.Ennek a kötőhelynek a magas konzervációja a Microsporidia-ban és hiánya más eukariótákban arra utal, hogy ez a hely szelektív túlélési előnyt jelenthet a Microsporidia számára.Így a microsporidia riboszómában lévő nukleotidkötő zseb nem tűnik az rRNS lebomlásának degenerált jellemzőjének vagy végformájának, mint azt korábban leírtuk, hanem inkább egy hasznos evolúciós újításnak, amely lehetővé teszi, hogy a mikrosporidia riboszóma közvetlenül kötődjön kis molekulákhoz, és azokat molekuláris építőelemként használja.riboszómák építőkövei.Ez a felfedezés a microsporidia riboszómát teszi az egyetlen riboszómává, amely egyetlen nukleotidot használ szerkezeti építőelemként.f Nukleotidkötésből származó hipotetikus evolúciós út.
A második alacsony molekulatömegű sűrűség az uL9 és eL30 riboszomális fehérjék határfelületén található (5a. ábra).Ezt a határfelületet korábban a Saccharomyces cerevisiae riboszóma szerkezetében írták le, mint az A3186 rRNS 25S nukleotidjának kötőhelyét (az ES39L rRNS kiterjesztésének része)38.Kimutatták, hogy a degenerált P. locustae ES39L riboszómákban ez a határfelület egy ismeretlen egyetlen 31-es nukleotidhoz kötődik, és feltételezhető, hogy ez a nukleotid az rRNS redukált végső formája, amelyben az rRNS hossza ~130-230 bázis.Az ES39L egyetlen 32.43 nukleotidra redukálódik.Krio-EM képeink alátámasztják azt az elképzelést, hogy a sűrűség nukleotidokkal magyarázható.Szerkezetünk nagyobb felbontása azonban azt mutatta, hogy ez a nukleotid egy extrariboszómális molekula, esetleg AMP (5a, b ábra).
Ezután megkérdeztük, hogy a nukleotidkötő hely megjelent-e az E. cuniculi riboszómában, vagy létezett-e korábban.Mivel a nukleotid kötődést főként az eL30 riboszomális fehérjében lévő Phe170 és Lys172 aminosavak közvetítik, 4396 reprezentatív eukarióta esetében értékeltük ezeknek a maradékoknak a konzerválódását.A fenti uL15-höz hasonlóan azt találtuk, hogy a Phe170 és Lys172 maradékok erősen konzerváltak csak a tipikus Microsporidia-ban, de hiányoznak más eukariótákban, beleértve az atipikus Microsporidia Mitosporidiumot és Amphiamblys-t, amelyekben az ES39L rRNS fragmentuma nem redukálódik (4Fig,46c).-e).
Összességében ezek az adatok alátámasztják azt az elképzelést, hogy az E. cuniculi és esetleg más kanonikus mikrosporidiumok olyan képességet fejlesztettek ki, hogy hatékonyan megragadják a riboszóma szerkezetében lévő nagyszámú kis metabolitot, hogy kompenzálják az rRNS- és fehérjeszintek csökkenését.Ennek során egyedülálló képességet fejlesztettek ki a riboszómán kívüli nukleotidok megkötésére, ami azt mutatja, hogy a parazita molekuláris szerkezetek kompenzálják a bőséges kis metabolitok befogását, és a lebomlott RNS- és fehérjefragmensek szerkezeti mimikájaként használják őket..
Krio-EM térképünk harmadik nem szimulált része, amely a nagy riboszomális alegységben található.Térképünk viszonylag nagy felbontása (2,6 Å) arra utal, hogy ez a sűrűség a nagy oldallánc-maradékok egyedi kombinációit tartalmazó fehérjékhez tartozik, ami lehetővé tette számunkra, hogy ezt a sűrűséget egy korábban ismeretlen riboszomális fehérjeként azonosítsuk, amelyet msL2-nek (Microsporidia-specific protein L2) neveztünk el (módszerek, 6. ábra).Homológiai kutatásunk azt mutatta, hogy az msL2 konzervált az Encephaliter és Orosporidium nemzetség Microsporidia kládjában, de nincs jelen más fajokban, beleértve a többi Microsporidia-t is.A riboszómális szerkezetben az msL2 egy rést foglal el, amelyet a kiterjesztett ES31L rRNS elvesztése okoz.Ebben az űrben az msL2 segít stabilizálni az rRNS feltekeredését, és kompenzálhatja az ES31L elvesztését (6. ábra).
az E. cuniculi riboszómákban található Microsporidia-specifikus riboszomális fehérje msL2 elektronsűrűsége és modellje.b A legtöbb eukarióta riboszómában, beleértve a Saccharomyces cerevisiae 80S riboszómáját, az ES19L rRNS amplifikációja a legtöbb Microsporidian fajban elveszett.A V. necatrix microsporidia riboszóma korábban megállapított szerkezete arra utal, hogy az ES19L elvesztését ezekben a parazitákban az új msL1 riboszomális fehérje evolúciója kompenzálja.Ebben a tanulmányban azt találtuk, hogy az E. cuniculi riboszóma egy további riboszomális RNS-utánzó fehérjét is kifejlesztett az ES19L elvesztésének látszólagos kompenzációjaként.Azonban az msL2 (jelenleg hipotetikus ECU06_1135 fehérjeként jelölve) és az msL1 eltérő szerkezeti és evolúciós eredetű.c Az evolúciós szempontból nem rokon msL1 és msL2 riboszómális fehérjék keletkezésének felfedezése arra utal, hogy ha a riboszómák káros mutációkat halmoznak fel rRNS-ükben, akkor a összetételükben soha nem látott mértékű diverzitást érhetnek el még a közeli rokon fajok egy kis részében is.Ez a felfedezés segíthet tisztázni a mitokondriális riboszóma eredetét és evolúcióját, amely nagymértékben csökkent rRNS-éről és a fehérjeösszetétel fajok közötti abnormális változatosságáról ismert.
Ezután összehasonlítottuk az msL2 fehérjét a korábban leírt msL1 fehérjével, amely az egyetlen ismert mikrosporidia-specifikus riboszómális fehérje, amely a V. necatrix riboszómában található.Azt akartuk tesztelni, hogy az msL1 és az msL2 evolúciós kapcsolatban állnak-e egymással.Elemzésünk kimutatta, hogy az msL1 és msL2 ugyanazt az üreget foglalja el a riboszóma szerkezetében, de eltérő primer és harmadlagos szerkezettel rendelkeznek, ami független evolúciós eredetüket jelzi (6. ábra).Így az msL2 felfedezése bizonyítékot szolgáltat arra, hogy a kompakt eukarióta fajok csoportjai egymástól függetlenül képesek strukturálisan eltérő riboszómális fehérjéket fejleszteni, hogy kompenzálják az rRNS-fragmensek elvesztését.Ez a megállapítás figyelemre méltó abban, hogy a legtöbb citoplazmatikus eukarióta riboszóma invariáns fehérjét tartalmaz, beleértve ugyanazt a 81 riboszómális fehérjéből álló családot.Az msL1 és msL2 megjelenése a mikrosporidiumok különböző kládjaiban, válaszul a kiterjesztett rRNS-szegmensek elvesztésére, arra utal, hogy a parazita molekuláris felépítésének degradációja arra készteti a parazitákat, hogy kompenzációs mutációkat keressenek, ami végül a különböző parazitapopulációkban való megszerzéséhez vezethet.szerkezetek.
Végül, amikor a modellünk elkészült, összehasonlítottuk az E. cuniculi riboszóma összetételét a genomszekvencia alapján előrejelzett összetétellel.Számos riboszómális fehérjét, köztük az eL14-et, eL38-at, eL41-et és eS30-at korábban úgy gondolták, hogy hiányoznak az E. cuniculi genomból, mivel homológjaik nyilvánvalóan hiányoznak az E. cuniculi genomból.Számos riboszómális fehérje elvesztését jósolják a legtöbb más erősen redukált intracelluláris parazita és endoszimbionta esetében is.Például, bár a legtöbb szabadon élő baktérium ugyanazt az 54 riboszomális fehérjéből álló családot tartalmazza, e fehérjecsaládok közül csak 11-nek van kimutatható homológja a gazdaszervezet által korlátozott baktériumok minden egyes elemzett genomjában.Ennek alátámasztására kísérletileg riboszómális fehérjék elvesztését figyelték meg V. necatrix és P. locustae microsporidia esetében, amelyekből hiányzik az eL38 és eL4131,32 fehérjék.
Struktúráink azonban azt mutatják, hogy valójában csak az eL38, eL41 és eS30 veszett el az E. cuniculi riboszómában.Az eL14 fehérje konzervált volt, és szerkezetünk megmutatta, hogy ez a fehérje miért nem található meg a homológia keresésben (7. ábra).Az E. cuniculi riboszómákban az eL14 kötőhely nagy része elveszik az rRNS-sel amplifikált ES39L lebomlása miatt.ES39L hiányában az eL14 elvesztette másodlagos szerkezetének nagy részét, és az eL14 szekvenciának csak 18%-a volt azonos E. cuniculi és S. cerevisiae esetében.Ez a rossz szekvencia megőrzés azért figyelemre méltó, mert még a Saccharomyces cerevisiae és a Homo sapiens – olyan organizmusok, amelyek 1,5 milliárd év különbséggel fejlődtek ki – az eL14-ben ugyanazon maradványok több mint 51%-át osztják meg.Ez a rendellenes konzerválási veszteség megmagyarázza, hogy az E. cuniculi eL14-et jelenleg feltételezett M970_061160 fehérjeként, és nem eL1427 riboszomális fehérjeként jelölik.
és A Microsporidia riboszóma elvesztette az ES39L rRNS kiterjesztését, ami részben megszüntette az eL14 riboszomális fehérje kötőhelyét.ES39L hiányában az eL14 mikrospóra fehérje másodlagos szerkezetének elvesztésével jár, amelyben a korábbi rRNS-kötő α-hélix minimális hosszúságú hurokká degenerálódik.b A többszörös szekvencia-illesztés azt mutatja, hogy az eL14 fehérje erősen konzervált eukarióta fajokban (57%-os szekvenciaazonosság az élesztő és a humán homológok között), de gyengén konzervált és divergens a mikrosporidiumokban (amelyekben a maradékok legfeljebb 24%-a azonos az eL14 homológgal).S. cerevisiae vagy H. sapiens).Ez a gyenge szekvencia konzerváció és másodlagos szerkezeti változatosság megmagyarázza, hogy az eL14 homológot miért nem találták meg soha az E. cuniculiban, és miért gondolják, hogy ez a fehérje elveszett az E. cuniculiban.Ezzel szemben az E. cuniculi eL14-et korábban feltételezett M970_061160 fehérjeként jelölték meg.Ez a megfigyelés arra utal, hogy a mikrosporidiumok genomdiverzitása jelenleg túlbecsült: néhány jelenleg elveszettnek vélt gén a microsporidiumokban valójában megmaradt, jóllehet erősen differenciált formákban;ehelyett úgy gondolják, hogy egyesek mikrosporidia géneket kódolnak a féregspecifikus fehérjékhez (pl. az M970_061160 hipotetikus fehérje) valójában a más eukariótákban található nagyon változatos fehérjéket kódolja.
Ez a megállapítás arra utal, hogy az rRNS denaturációja a szekvencia konzerválásának drámai elvesztéséhez vezethet a szomszédos riboszómális fehérjékben, így ezek a fehérjék nem mutathatók ki a homológia-kutatás során.Így túlbecsülhetjük a molekuláris degradáció tényleges mértékét a kis genomban élő szervezetekben, mivel egyes elveszettnek vélt fehérjék valóban fennmaradnak, jóllehet erősen megváltozott formákban.
Hogyan tudják a paraziták megőrizni molekuláris gépeik funkcióját extrém genomcsökkentési körülmények között?Tanulmányunk erre a kérdésre az egyik legkisebb eukarióta genommal rendelkező szervezet, az E. cuniculi összetett molekuláris szerkezetének (riboszómának) leírásával ad választ.
Közel két évtizede ismert, hogy a mikrobiális paraziták fehérje- és RNS-molekulái gyakran különböznek a szabadon élő fajok homológ molekuláitól, mert hiányoznak a minőség-ellenőrző központok, a szabadon élő mikrobákban méretük 50%-ára csökkentek stb.sok legyengítő mutáció, amelyek rontják a hajtogatást és a működést.Például a kis genom élőlények riboszómáiból, beleértve számos intracelluláris parazitát és endoszimbiontát, várhatóan több riboszómális fehérje és az rRNS nukleotidok egyharmada hiányzik a szabadon élő 27., 29., 30., 49. fajokhoz képest. Azonban ezeknek a molekuláknak a működése főként a parazitákon keresztül megmaradt.
Tanulmányunk azt mutatja, hogy a makromolekulák szerkezete feltárhatja az evolúció számos olyan aspektusát, amelyet nehéz kivonni az intracelluláris paraziták és más gazdaszervezet által korlátozott szervezetek hagyományos összehasonlító genomikai vizsgálataiból (7. kiegészítő ábra).Például az eL14 fehérje példája azt mutatja, hogy túlbecsülhetjük a molekuláris apparátus tényleges lebomlásának mértékét parazita fajokban.Úgy gondolják, hogy az agyvelőgyulladásos paraziták több száz mikrosporidia-specifikus gént tartalmaznak.Eredményeink azonban azt mutatják, hogy e látszólag specifikus gének némelyike ​​valójában csak nagyon különböző génváltozatok, amelyek más eukariótákban gyakoriak.Sőt, az msL2 fehérje példája azt mutatja, hogy figyelmen kívül hagyjuk az új riboszómális fehérjéket, és alábecsüljük a parazita molekuláris gépek tartalmát.A kis molekulák példája megmutatja, hogyan hagyhatjuk figyelmen kívül a parazita molekulaszerkezetek legzseniálisabb újításait, amelyek új biológiai aktivitást adhatnak nekik.
Összességében ezek az eredmények javítják a gazdaszervezet által korlátozott szervezetek és a szabadon élő szervezetekben élő társaik molekuláris szerkezete közötti különbségek megértését.Megmutatjuk, hogy a molekuláris gépek, amelyeket régóta redukáltnak, degeneráltnak és különféle legyengítő mutációknak kitettnek hittek, ehelyett szisztematikusan figyelmen kívül hagyott szokatlan szerkezeti jellemzőkkel rendelkeznek.
Másrészt az E. cuniculi riboszómáiban talált nem terjedelmes rRNS fragmentumok és fuzionált fragmentumok arra utalnak, hogy a genom redukciója az alapvető molekuláris gépezetnek még azokat a részeit is megváltoztathatja, amelyek az élet három tartományában megmaradtak – csaknem 3,5 milliárd év után.a fajok független evolúciója.
Az E. cuniculi riboszómák kidudorodó és fuzionált rRNS-fragmensei különösen érdekesek az RNS-molekulák endoszimbiotikus baktériumokban végzett korábbi vizsgálatai fényében.Például a Buchnera aphidicola levéltetű endoszimbiontában az rRNS és tRNS molekulák hőmérséklet-érzékeny szerkezettel rendelkeznek az A+T összetétel torzítása és a nem kanonikus bázispárok nagy aránya miatt20,50.Úgy gondolják, hogy ezek az RNS-változások, valamint a fehérjemolekulák változásai felelősek az endoszimbionták partnerektől való túlzott függéséért, valamint azért, mert az endoszimbionták nem képesek hőátadni 21, 23 .Bár a parazita microsporidia rRNS szerkezetileg eltérő változásokkal rendelkezik, ezeknek a változásoknak a természete arra utal, hogy a csökkent hőstabilitás és a chaperon fehérjéktől való nagyobb függés az RNS-molekulák közös jellemzője lehet csökkent genomjú szervezetekben.
Másrészt szerkezeteink azt mutatják, hogy a parazita mikrosporidiumok egyedülálló képességet fejlesztettek ki, hogy ellenálljanak a széles körben konzervált rRNS- és fehérjefragmenseknek, és kifejlesztették azt a képességet, hogy bőséges és könnyen elérhető kis metabolitokat használjanak degenerált rRNS- és fehérjefragmensek szerkezeti utánzóiként.Molekulaszerkezet degradáció..Ezt a véleményt támasztja alá az a tény, hogy az E. cuniculi rRNS-ében és riboszómáiban a fehérjefragmensek elvesztését kompenzáló kis molekulák az uL15 és eL30 fehérjékben található mikrosporidia-specifikus maradékokhoz kötődnek.Ez arra utal, hogy a kis molekulák riboszómákhoz való kötődése pozitív szelekció eredménye lehet, amelyben a riboszómális fehérjék Microsporidia-specifikus mutációit választották ki, mivel képesek növelni a riboszómák affinitását kis molekulákhoz, ami hatékonyabb riboszómális organizmusokhoz vezethet.A felfedezés egy intelligens innovációt tár fel a mikrobiális paraziták molekuláris szerkezetében, és jobb megértést ad nekünk arról, hogy a paraziták molekuláris szerkezetei hogyan tartják meg funkcióikat a reduktív evolúció ellenére.
Jelenleg ezeknek a kis molekuláknak az azonosítása tisztázatlan.Nem világos, hogy ezeknek a kis molekuláknak a riboszómaszerkezetben való megjelenése miért különbözik a mikrosporidia fajok között.Különösen nem világos, hogy miért figyelhető meg nukleotidkötés az E. cuniculi és P. locustae riboszómáiban, és nem a V. necatrix riboszómáiban, annak ellenére, hogy a V. necatrix eL20 és K172 fehérjéiben megtalálható az F170 maradék.Ezt a deléciót a 43 uL6 aminosav okozhatja (a nukleotidkötő zseb mellett található), amely a V. necatrixban tirozin, az E. cuniculi és a P. locustae esetében nem treonin.A Tyr43 terjedelmes aromás oldallánca megzavarhatja a nukleotidkötést a sztérikus átfedés miatt.Alternatív megoldásként a látszólagos nukleotid-deléció oka lehet a krio-EM képalkotás alacsony felbontása, ami akadályozza a V. necatrix riboszomális fragmentumok modellezését.
Másrészt munkánk azt sugallja, hogy a genom bomlásának folyamata feltaláló erő lehet.Különösen az E. cuniculi riboszóma szerkezete arra utal, hogy a microsporidia riboszómában az rRNS és a fehérje fragmentumok elvesztése olyan evolúciós nyomást hoz létre, amely elősegíti a riboszóma szerkezetének változását.Ezek a változatok a riboszóma aktív helyétől távol fordulnak elő, és úgy tűnik, hogy segítenek fenntartani (vagy helyreállítani) az optimális riboszóma-összeállítást, amelyet egyébként megzavarna a redukált rRNS.Ez azt sugallja, hogy a mikrosporidia riboszóma egyik fő újítása a génsodródás pufferelésének szükségességévé fejlődött.
Ezt talán legjobban a nukleotid-kötés szemlélteti, amit eddig más élőlényeknél soha nem figyeltek meg.Az a tény, hogy a nukleotidkötő maradékok jelen vannak a tipikus mikrosporidiumokban, de más eukariótákban nem, azt sugallja, hogy a nukleotidkötő helyek nem csupán eltűnésre váró relikviák, vagy az rRNS végső helye, amely egyedi nukleotidok formájába állítódik vissza.Ehelyett ez az oldal hasznos funkciónak tűnik, amely több pozitív kiválasztás során is fejlődhetett.A nukleotidkötő helyek a természetes szelekció melléktermékei lehetnek: ha az ES39L lebomlik, a mikrosporidiumok kénytelenek kompenzációt keresni az optimális riboszóma biogenezis helyreállítása érdekében ES39L hiányában.Mivel ez a nukleotid képes utánozni az A3186 nukleotid molekuláris kontaktusait az ES39L-ben, a nukleotid molekula a riboszóma építőkövévé válik, amelynek kötődését az eL30 szekvencia mutációja tovább javítja.
Az intracelluláris paraziták molekuláris evolúciójával kapcsolatban vizsgálatunk azt mutatja, hogy a darwini természetes szelekció és a genomromlás genetikai sodródásának erői nem párhuzamosan működnek, hanem oszcillálnak.Először is, a genetikai sodródás kiküszöböli a biomolekulák fontos jellemzőit, ezért nagyon szükséges a kompenzáció.Csak akkor, ha a paraziták kielégítik ezt az igényt a darwini természetes szelekció révén, makromolekuláiknak lesz esélyük arra, hogy kifejlesszék leglenyűgözőbb és leginnovatívabb tulajdonságaikat.Fontos, hogy az E. cuniculi riboszómában a nukleotidkötő helyek evolúciója azt sugallja, hogy a molekuláris evolúciónak ez a veszteséges mintája nemcsak a káros mutációkat amortizálja, hanem néha teljesen új funkciókat is ruház a parazita makromolekulákra.
Ez az elképzelés összhangban van Sewell Wright mozgó egyensúlyi elméletével, amely szerint a természetes szelekció szigorú rendszere korlátozza az organizmusok innovációs képességét51,52,53.Ha azonban a genetikai sodródás megzavarja a természetes szelekciót, ezek a sodródások olyan változásokat idézhetnek elő, amelyek önmagukban nem adaptívak (vagy akár károsak), de további változásokhoz vezetnek, amelyek magasabb alkalmasságot vagy új biológiai aktivitást biztosítanak.Keretrendszerünk alátámasztja ezt az elképzelést azzal, hogy szemlélteti, hogy ugyanaz a típusú mutáció, amely csökkenti a biomolekula redőzését és működését, a fő kiváltó tényező a biomolekula javításában.A win-win evolúciós modellnek megfelelően tanulmányunk azt mutatja, hogy a hagyományosan degeneratív folyamatnak tekintett genomlebomlás az innováció egyik fő mozgatórugója is, néha és talán gyakran lehetővé teszi a makromolekulák számára, hogy új parazita tevékenységekre tegyenek szert.tudja használni őket.