A tápanyagfelvétel és -elosztás integrálja a rovarok táplálkozási és életciklus-jellemzőit. Az egyes tápanyagok hiányának kompenzálására a különböző életszakaszokban a rovarok kiegészítő táplálékkal juthatnak hozzá ezekhez a tápanyagokhoz, például gerincesek váladékával táplálkozva egy tócsáknak nevezett folyamat során. Az Anopheles arabiani szúnyog alultápláltnak tűnik, ezért tápanyagokra van szüksége mind az anyagcseréhez, mind a szaporodáshoz. E tanulmány célja annak felmérése volt, hogy az An. arabiensis tehénvizeletének tápanyagfelvétel céljából történő keverése javítja-e az életciklus-jellemzőket.
Győződjön meg róla, hogy biztonságos. Az arabiensis szúnyogokat a friss, 24, 72 és 168 órás tehénvizelet illata vonzotta, a gazdaállatot kereső és vérrel etetett (48 órával a véradás után) nőstényeket pedig Y-csöves olfaktométerrel mérték, a vemhes nőstényeket pedig ívási teszt céljából értékelték. Ezután kombinált kémiai és elektrofiziológiai analízist alkalmaztak a tehénvizeletben lévő bioaktív vegyületek azonosítására mind a négy korosztályban. A bioaktív vegyületek szintetikus keverékeit Y-csöves és terepi kísérletekben értékelték. A tehénvizelet és annak fő nitrogéntartalmú vegyülete, a karbamid, mint a malária vektorok potenciális kiegészítő étrendjének vizsgálatához etetési paramétereket és életciklus-jellemzőket mértek. A nőstény szúnyogok arányát, valamint a felszívódott tehénvizelet és karbamid mennyiségét értékelték. Az etetés után a nőstényeket túlélés, kötött repülés és szaporodás szempontjából értékelték.
A gazdaszervezet vérének és táplálékának keresése. Laboratóriumi és terepi vizsgálatokban az arabokat a friss és érlelt tehénvizelet természetes és szintetikus illata vonzotta. A vemhes nőstények közömbösek voltak a tehénvizeletre adott reakciókkal szemben az ívási helyeken. A gazdaszervezetet kereső és vérszívó nőstények aktívan felszívják a tehénvizeletet és a karbamidot, és ezeket az erőforrásokat az életciklus kompromisszumai szerint osztják el, a repülés, a túlélés vagy a szaporodás fiziológiai állapotának függvényében.
Az Anopheles arabinis tehénvizelet-gyűjtése és -elosztása a jobb életciklus-jellemzők érdekében. A tehénvizelet kiegészítő etetése közvetlenül befolyásolja a vektorkapacitást a napi túlélés és a vektorsűrűség növelésével, valamint közvetve a repülési aktivitás megváltoztatásával, ezért a jövőbeli modellekben figyelembe kell venni.
A tápanyagok megszerzése és elosztása integrálja a rovarok táplálkozási és életciklus jellemzőit [1,2,3]. A rovarok képesek a táplálék kiválasztására és megszerzésére, valamint a kompenzáló táplálkozásra a táplálék elérhetősége és a tápanyagigény alapján [1, 3]. A tápanyagok eloszlása ​​az életciklus folyamatától függ, és a rovarok különböző életszakaszaiban eltérő követelményeket eredményezhet az étrend minőségével és mennyiségével kapcsolatban [1, 2]. Az egyes tápanyagok hiányának kompenzálására a rovarok kiegészítő táplálkozással juthatnak hozzá ezekhez a tápanyagokhoz, például sárral, gerincesek különféle ürülékével és váladékával, valamint döggel, ezt a folyamatot tócsáknak nevezik [2]. Bár elsősorban számos pillangó- és molyfajt írtak le, más rovarrendekben is előfordulnak itatóhelyek, és az ilyen típusú erőforrásokhoz való vonzódás és az azokkal való táplálkozás jelentős hatással lehet az egészségre és más életciklus jellemzőkre [2, 4, 5, 6],7]. A maláriaszúnyog, az Anopheles gambiae sensu lato (sl) „alultáplált” kifejlett egyedként jelenik meg [8], így az öntözés fontos szerepet játszhat életciklus jellemzőiben, de ezt a viselkedést eddig elhanyagolták. A rázás alkalmazása a tápanyagbevitel növelésére ebben a fontos vivőanyagban figyelmet érdemel, mivel ennek jelentős epidemiológiai következményei lehetnek.
A felnőtt nőstény Anopheles szúnyogok nitrogénbevitele korlátozott a lárvaállapotból származó alacsony kalóriatartalékok és a vérliszt nem hatékony felhasználása miatt [9]. A nőstény Ann.gambiae sl jellemzően kiegészítő vérlével kompenzálja ezt [10, 11], ezáltal több embert tesz ki a betegség elkapásának kockázatának, és a szúnyogokat nagyobb ragadozási kockázatnak teszi ki. Alternatív megoldásként a szúnyogok gerincesek ürülékének kiegészítő táplálásával nitrogéntartalmú vegyületekhez juthatnak, amelyek fokozzák az alkalmazkodást és a repülési manőverezhetőséget, ahogyan azt más rovarok is bizonyították [2]. E tekintetben érdekes az egyik testvérfaj erős és határozott vonzereje az An-on belül. A gambiai sl fajkomplexumban az Anopheles arabinis friss és érlelt tehénvizelet [12,13,14]. Az Anopheles arabinis opportunista a gazdapreferenciáiban, és ismert, hogy szarvasmarhákkal társul és táplálkozik velük. A tehénvizelet nitrogéntartalmú vegyületekben gazdag erőforrás, a karbamid a friss vizeletben lévő összes nitrogén 50-95%-át teszi ki [15, 16]. Ahogy a tehénvizelet A mikroorganizmusok ezeket az erőforrásokat használják fel a nitrogénvegyületek komplexitásának 24 órán belüli csökkentésére [15]. Az ammónia gyors növekedésével, amely a szerves nitrogén csökkenésével jár, az alkalofil mikroorganizmusok (amelyek közül sok a szúnyogokra mérgező vegyületeket termel) szaporodnak [15], amelyek lehetnek nőstények. Az Ann. arabiensis előnyben részesíti a 24 órás vagy annál rövidebb vizeletet [13, 14].
Ebben a tanulmányban gazdaszervezetben és vérrel táplált An-okat kerestek. Első gonadotropin ciklusa során az arabiensis-t nitrogénvegyületek, köztük karbamid vizelet-keveréssel történő felvételére értékelték. Ezután kísérletsorozatot végeztek annak felmérésére, hogy a nőstény szúnyogok hogyan osztják el ezt a potenciális tápanyagforrást a jobb túlélés, szaporodás és további táplálékkeresés érdekében. Végül a friss és érlelt tehénvizelet illatát értékelték annak megállapítására, hogy ezek megbízható nyomokat szolgáltatnak-e a gazdaszervezetben és a vérrel táplált An-ra vonatkozóan. E potenciális tápanyagforrás keresése során az arabiensis kémiai összefüggéseket fedezett fel a megfigyelt eltérő vonzerő mögött. A 24 órás érlelt vizeletben azonosított illékony szerves vegyületek (VOC) szintetikus szagkeverékeit terepi körülmények között tovább értékelték, kiterjesztve a laboratóriumi körülmények között kapott eredményeket, és bemutatva a szarvasmarha vizelet szagának hatását a különböző fiziológiai állapotokra. Szúnyogvonzás. A kapott eredmények megerősítik, hogy az An. arabiensis a gerinces vizeletben található nitrogénvegyületeket felveszi és elosztja, hogy befolyásolja az életciklus jellemzőit. Ezeket az eredményeket a lehetséges epidemiológiai következmények és a vektorok megfigyelésére és ellenőrzésére való felhasználásuk kontextusában tárgyaljuk.
Az Anopheles arabicans-t (Dongola törzs) 25 ± 2 °C-on, 65 ± 5% relatív páratartalom mellett és 12:12 órás fény:sötétség ciklusban tartottuk. A lárvákat desztillált vízzel töltött műanyag tálcákban (20 cm × 18 cm × 7 cm) neveltük, és Tetramin® haltáppal etettük (Tetra Werke, Melle, Németország). A bábokat 30 ml-es csészékbe (Nolato Hertila, Åstorp, SE) gyűjtöttük, majd Bugdorm ketrecekbe (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Tajvan) helyeztük át, hogy lehetővé tegyük a kifejlett egyedek kikelését. A kifejlett egyedek a kikelés utáni 4. napig szabadon fogyaszthattak 10%-os szacharózoldatot, ekkor a gazdaállatot kereső nőstényeknek közvetlenül a kísérlet előtt táplálékot kínáltunk, vagy a kísérlet előtt egy éjszakán át desztillált vízzel éheztettük őket, az alábbiakban leírtak szerint. A repülőcső-kísérletekhez használt nőstényeket csak 4-6 órán át éheztettük... víz ad libitum. A vérszívó szúnyogok későbbi biotesztekre való előkészítéséhez 4 dpe nőstényt defibrotikus juhvérrel (Håtunalab, Bro, SE) láttak el membrános etetőrendszer (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, Egyesült Királyság) segítségével. A teljesen túlzsúfolt nőstényeket ezután egyedi ketrecekbe helyezték át, és közvetlenül, az alábbiakban leírtak szerint táplálták őket, vagy 10% szacharózt ad libitum 3 napig az alább leírt kísérletek előtt. Az utóbbi nőstényeket repülőcsöves biotesztekhez használták, és laboratóriumba szállították, majd a kísérlet előtt 4-6 órán át ad libitum desztillált vizet kaptak.
Táplálkozási vizsgálatokat alkalmaztak a vizelet- és karbamidfogyasztás mennyiségi meghatározására felnőtt An.Arab nőstényeknél. A gazdaállatot kereső és vérrel etetett nőstények 48 órán át 1% hígított friss és érlelt tehénvizeletet, különböző karbamidkoncentrációkat és két kontrollt (10% szacharóz és víz) tartalmazó étrendet kaptak. Ezenkívül ételfestéket (1 mg ml-1 xilol-cianid FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) adtak az étrendhez, és 4 × 4-es mátrixban, 250 µl-es mikrocentrifuga csövekben (Axygen Scientific, Union City, CA, US; 1A. ábra) adagolták. A csöveket széléig töltötték (~300 µl). A szúnyogok közötti versengés és a festékszín lehetséges hatásainak elkerülése érdekében helyeztek 10 szúnyogot egy nagy Petri-csészébe (12 cm átmérőjű és 6 cm magas; Semadeni, Ostermundigen, CH; 1A. ábra) teljes sötétségben, 25 ± 2 cm °C-on és 65 ± 5% relatív páratartalom mellett. Ezeket a kísérleteket 5-10 napon át megismételték. alkalommal. Az étrendnek való kitettség után a szúnyogokat -20 °C-on tartottuk a további elemzésig.
Vizsgáljuk meg a gazdaszervezet és a vérszívó nőstény Anopheles arabianus által felszívott szarvasmarha vizeletet és karbamidot. Az etetési kísérletben (A) a nőstény szúnyogok friss és érlelt tehén vizeletet, különböző koncentrációjú karbamidot, szacharózt (10%) és desztillált vizet (H2O) kaptak. A gazdaszervezetet kereső (B) és a vérrel etetett (C) nőstények több szacharózt szívtak fel, mint bármely más tesztelt étrend. Megjegyzendő, hogy a gazdaszervezetet kereső nőstények kevesebbet szívtak fel 72 órás tehén vizeletből, mint 168 órás tehén vizeletből (B). A vizelet átlagos teljes nitrogéntartalma (± szórás) a betétben látható. A gazdaszervezetet kereső (D, F) és a vérszívó (E, G) nőstények dózisfüggő módon veszik fel a karbamidot. A különböző betűvel jelölt átlagos belélegzett térfogatok (D, E) szignifikánsan különböztek egymástól (egyutas ANOVA Tukey-féle post hoc analízissel; p < 0,05). A hibasávok az átlag standard hibáját (BE) jelölik. Az egyenes szaggatott vonal a log-lineáris regressziós egyenest jelöli (F, G).
Az elnyelt táplálék felszabadításához a szúnyogokat egyenként 1,5 ml-es, 230 µl desztillált vizet tartalmazó mikrocentrifuga csövekbe helyezték, és a szövetet eldobható mozsártörővel és akkus motorral (VWR International, Lund, SE) roncsolták, majd 10 percig 10 krpm sebességgel centrifugálták. A felülúszót (200 µl) egy 96 lyukú mikrotiterlemezre (Sigma-Aldrich) vitték át, és az abszorbanciát (λ620) spektrofotométer alapú mikrotiterlemez-leolvasóval (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) határozták meg nm-en. Alternatív megoldásként a szúnyogokat 1 ml desztillált vízben őrölték, amelynek 900 µl-ét küvettába vitték át spektrofotometriás analízishez (λ620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Az étrendi bevitel számszerűsítéséhez standard görbét készítettek sorozathígítással, így 0,2 µl és 2,4 µl közötti mennyiségű 1 mg ml-1 xilol-cianidot kaptak. Ezután az ismert festék optikai sűrűségét... A koncentrációkat használták az egyes szúnyogok által elfogyasztott táplálék mennyiségének meghatározására.
A térfogati adatokat egyutas varianciaanalízissel (ANOVA) elemeztük, majd Tukey-féle post hoc páros összehasonlításokkal (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, US, 1989–2007). A lineáris regresszióanalízisek a koncentrációfüggő karbamidbevitelt írták le, és összehasonlították a gazdaszervezetet kereső és a vérszívó szúnyogok válaszait (GraphPad Prism v8.0.0 for Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, US).
Korcsoportonként körülbelül 20 µl vizeletmintát kötöttek Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) gyantára, és ónkapszulákba (8 mm × 5 mm) zárták. A kapszulákat egy CHNS/O analizátor (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) égésterébe helyezték, hogy a gyártó protokollja szerint meghatározzák a friss és az érlelt vizelet nitrogéntartalmát. A teljes nitrogént (g N l-1) a standardként használt ismert karbamidkoncentrációk alapján határozták meg.
A gazdaállat-kereső és vérszívó nőstények túlélésére gyakorolt ​​étrend hatásának felmérésére a szúnyogokat egyenként nagy Petri-csészékbe (12 cm átmérőjű és 6 cm magas; Semadeni) helyezték, amelyek fedelén egy hálóval fedett lyuk (3 cm átmérőjű) volt a szellőzés és a táplálékellátás érdekében. A takarmányt közvetlenül 4 napos kor után adták be, és 1%-os hígítású friss és érlelt tehénvizeletet, négyféle karbamidkoncentrációt és két kontrollt, 10%-os szacharózt és vizet tartalmazott. Minden takarmányt egy fogászati ​​tamponra (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) pipettáztak, amelyet egy 5 ml-es fecskendőbe (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, SE) helyeztek, a dugattyút eltávolították, és egy Petri-csészébe helyezték (1. ábra). 1A). Változtassa az étrendjét minden nap. Tartsa karban a laboratóriumot a fent leírtak szerint. A túlélő szúnyogokat naponta kétszer számolták, míg az elpusztult szúnyogokat az utolsó szúnyog elpusztulásáig dobták ki (n = 40 kezelésenként). A különböző étrenden etetett szúnyogok túlélését statisztikailag Kaplan-Meyer túlélési görbékkel és log-rank tesztekkel elemezték a túlélési eloszlás összehasonlítására. étrendek összehasonlítása (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Egyedi szúnyogrepülő malom Attisano és munkatársai [17] alapján, 5 mm vastag, átlátszó akril panelekből (10 cm széles x 10 cm hosszú x 10 cm magas) elő- és hátlap nélkül (3. ábra: felül). Egy forgó szerelvény egy függőleges csővel, amely egy gázkromatográfiás oszlopból (0,25 mm belső átmérő; 7,5 cm hosszú) készült, amelynek végei egy rovartűhöz vannak ragasztva, amely egy pár neodímium mágnes között függ 9 cm távolságra egymástól. Egy ugyanebből az anyagból készült vízszintes cső (6,5 cm hosszú) kettéosztotta a függőleges csövet, így egy rögzített kart és egy másik kart alkotott, amely egy kis darab alumíniumfóliát hordozott fénymegszakító jelként.
A 24 órán át éheztetett nőstényeket 30 percig a fenti étrenddel etették a lefogás előtt. A jóllakott nőstény szúnyogokat ezután egyenként 2-3 percig jégen altatták, majd méhviasszal (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) rovarcsapokra rögzítették, és a vízszintes csövek karjaihoz kötötték. Repülő malom. A repülésenkénti fordulatszámokat egy egyedi gyártású adatrögzítővel rögzítették, majd a PC-Lab 2000™ szoftverrel (v4.01; Velleman, Gavere, BE) tárolták és jelenítették meg. A repülő malom egy klimatizált helyiségben helyezkedett el (12 óra:12 óra, világos: sötét, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% relatív páratartalom).
A repülési aktivitás mintázatának vizualizálásához 24 órás időszak alatt óránként kiszámították a teljes repült távolságot (m) és az egymást követő repülési tevékenységek teljes számát. Ezenkívül az egyes nőstények által repült átlagos távolságokat összehasonlították a kezelések között, és egyutas ANOVA-val és Tukey post hoc analízisével (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.) elemezték, ahol az átlagos távolságot függő változónak, míg a kezelést független tényezőnek tekintették. Ezenkívül az átlagos repülések számát 10 perces lépésekben számították ki.
Az étrend An.arabiensis reprodukciós teljesítményére gyakorolt ​​hatásának felméréséhez hat nőstényt (4 ivarérett nőstény) vérvétel után közvetlenül Bugdorm ketrecekbe (30 cm × 30 cm × 30 cm) helyeztek át, majd 48 órán át a fent leírt kísérleti takarmányt kapták. Ezután a takarmányt eltávolították, és a harmadik napon 20 ml desztillált vízzel töltött ívócsészéket (30 ml; Nolato Hertila) biztosítottak 48 órán át, 24 óránként cserélve. Minden etetési rendet 20-50 alkalommal ismételtek meg. Az ikrák számát minden kísérleti ketrecben megszámolták és feljegyezték. Az ikrák részmintáit használták az egyes ikrák átlagos méretének és hosszváltozásának felmérésére (n ≥ 200 takarmányonként) Dialux-20 mikroszkóp (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, Németország) segítségével, Leica Camera (DFC) 320 R2 készülékkel felszerelve. Leica Microsystems Ltd., Németország). A maradék petéket 24 órán át klímavezérelt helyiségben, standard nevelési körülmények között tartottuk, és a nemrég kikelt első stádiumú lárvák egy részmintáját (n ≥ 200 étrendenként) a fent leírtak szerint mértük. A peték számát, valamint a peték és a lárvák méretét a kezelések között, egyutas ANOVA-val és Tukey-féle post hoc analízissel (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.) hasonlítottuk össze.
A zebu és arsi fajták friss (1 órával a mintavétel után), 24 órás, 72 órás és 168 órás érlelésű vizeletéből vettünk headspace illékony anyagokat. Az egyszerűség kedvéért a vizeletmintákat kora reggel gyűjtöttük, amikor a tehenek még az istállóban voltak. Tíz egyedtől gyűjtöttünk vizeletmintákat, és mintánként 100-200 ml-t helyeztünk át egyedi poliamid sütőzacskókba (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, Németország) 3 literes, fedeles poliamidból és vinil-klorid műanyag dobozokban. Az egyes szarvasmarha vizeletminták headspace illékony anyagait közvetlenül (frissen) vagy szobahőmérsékleten 24, 72 és 168 órán át tartó érlelés után gyűjtöttük, azaz minden vizeletminta reprezentatív volt az egyes korcsoportokra.
A headspace illékony anyagok gyűjtéséhez zárt hurkú rendszert alkalmaztak, amely egy poliamid zsákon keresztül, membrános vákuumszivattyú (KNF Neuberger, Freiburg, Németország) segítségével 2,5 órán át aktív szénnel szűrt gázáramot (100 ml perc-1) keringtetett az adszorpciós oszlopba. Kontrollként a headspace gyűjtést egy üres poliamid zsákból végezték. Az adszorpciós oszlop teflon csőből (5,5 cm x 3 mm belső átmérő) készült, amely 35 mg Porapak Q-t (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, USA) tartalmazott üveggyapot dugók között. Használat előtt az oszlopot 1 ml újradesztillált n-hexánnal (Merck, Darmstadt, Németország) és 1 ml pentánnal (99,0%-os tisztaságú oldószer GC minőségű, Sigma Aldrich) öblítették át. Az adszorbeált illékony anyagokat 400 μl pentánnal eluálták. A headspace gyűjtéseket összegyűjtötték, majd -20°C-on tárolták a további elemzésig.
Gazdaállat-kereső és vérevő An viselkedési válaszai. Friss, 24, 72 és 168 órán át érlelt vizeletből gyűjtött Headspace illékony kivonatokat elemeztek Arabidopsis szúnyogok illékony kivonataira egyenes üvegcsöves olfaktométerrel [18]. A kísérleteket ZT 13-15 alatt, az An otthonkereső aktivitásának csúcsidőszakában végezték. Arab [19]. Egy üvegcsöves olfaktométert (80 cm × 9,5 cm belső átmérőjű) 3 ± 1 lx vörös fénnyel világítottak meg felülről. Szénsavas szűrésű és párásított levegőáram (25 ± 2 °C, 65 ± 2% relatív páratartalom) 30 cm s-1 sebességgel haladt át a bioassay-n. A levegőt rozsdamentes acélháló-sorozaton vezették át, lamináris áramlást és egyenletes füstszerkezetet hozva létre. Fogászati ​​tamponadagoló (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), az olfaktométer szél felőli végén egy 5 cm-es tekercsről felfüggesztve, stimulátorral. 5 percenként változik. Az elemzéshez minden egyes headspace-kivonat 10 μl-ét, 1:10 arányban hígítva használtuk stimulusként. Kontrollként azonos mennyiségű pentánt használtunk. Az egyes gazdaállatot kereső vagy vérszívó szúnyogokat 2-3 órával a kísérlet megkezdése előtt egyedi kibocsátó ketrecekbe helyeztük. A kibocsátó ketrecet az olfaktométer szél felőli oldalán helyeztük el, és a szúnyogokat 1 percig hagytuk akklimatizálódni, majd a ketrec pillangószelepét kinyitottuk a kibocsátáshoz. A kezeléshez vagy kontrollhoz való vonzódást a forrással 5 percen belül érintkezésbe kerülő szúnyogok arányaként elemeztük. Minden headspace-illó kivonatot és kontrollt legalább 30-szor megismételtünk, és bármely nap hatásainak elkerülése érdekében minden kísérleti napon ugyanannyi kezelést és kontrollt teszteltünk. A gazdaállat és a vérrel etetett Ans.Arabic és a headspace-készletek keresési válaszait nominális logisztikus regresszióval elemeztük, majd páronkénti összehasonlításokat végeztünk a páratlan arányok meghatározására (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
An ívási reakciója. Friss és érlelt tehénvizeletből származó fejtér-kivonatokat elemeztek Bugdorm ketrecekben (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Az ívási szubsztrátot 20 ml desztillált vízzel töltött műanyag poharak (30 ml; Nolato Hertila) biztosították, amelyeket a ketrec ellentétes sarkaiban helyeztek el, 24 cm távolságra egymástól. A kezelőpoharakba 10 μl-t adagoltak mindkét fejtér-kivonatból 1:10 hígításban. A kontrollpohár beállításához azonos mennyiségű pentánt használtak. A kezelési és a kontrollpoharakat minden kísérlet között cserélték a pozícióhatások ellenőrzése érdekében. Tíz vérrel etetett nőstényt helyeztek el a kísérleti ketrecekben a 9-11. ivási időpontban, és a poharakban lévő ikrákat 24 órával később számolták. Az ívási index kiszámításának képlete: (a kezelőpohárba rakott peték száma - a kontrollpohárba rakott peték száma) / (a ​​lerakott peték teljes száma). Minden kezelést 8-szor megismételtek.
A nőstény An.arabiensis fajok gázkromatográfiás és elektronantenna-mintázatdetektálásos (GC-EAD) elemzését a korábban leírtak szerint végeztük [20]. Röviden, a friss headspace illékony kivonatokat egy Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, US) készülékkel választottuk el, amely egy HP-5 oszloppal (30 m × 0,25 mm belső átmérő, 0,25 μm filmvastagság, Agilent Technologies) volt felszerelve. és öregedő vizelet. Mobil fázisként hidrogént használtunk, 45 cm/s átlagos lineáris áramlási sebességgel. Minden mintát (2 μl) 30 másodpercig injektáltunk osztott üzemmódban, 225 °C bemeneti hőmérsékleten. A GC kemence hőmérsékletét 35 °C-ról (3 perc tartás) 300 °C-ra (10 perc tartás) programoztuk 10 °C/perc sebességgel. A GC effluens elválasztójába 4 psi nitrogént adtunk hozzá, és 1:1 arányban osztottuk el egy Gerstel 3D/2 kis holttérfogatú keresztben (Gerstel, Mülheim, Németország) a lángionizációs detektor és az EAD között. Az EAD-hez használt GC effluens kapillárist egy Gerstel ODP-2 átvezető csövön keresztül vezettük, amely a GC kemence hőmérsékletét +5 °C-on követi nyomon, egy üvegcsőbe (10 cm × 8 mm) vezettük, ahol szénszűrős, párásított levegővel kevertük (1,5 l/perc). Az antennát 0,5 cm-re helyeztük a cső kimenetétől. Minden egyes szúnyogot figyelembe vettünk egy ismétlés esetén, gazdaszervezetet kereső szúnyogok esetén pedig legalább három ismétlést végeztek minden korosztály vizeletmintáin.
Bioaktív vegyületek azonosítása friss és érlelt szarvasmarha vizeletminta headspace-gyűjteményeiben kombinált GC és tömegspektrométerrel (GC-MS; 6890 GC és 5975 MS; Agilent Technologies) antennális válaszok kiváltására GC-EAD analízis során, elektronütközéses ionizációs módban, 70 eV-on. A GC-t HP-5MS UI-bevonatú, olvasztott szilícium-dioxid kapilláris oszloppal (60 m × 0,25 mm belső átmérő, 0,25 μm filmvastagság) szereltük fel, héliumot használva mozgófázisként, 35 cm/s átlagos lineáris áramlási sebességgel. 2 μl-es mintát injektáltunk ugyanazokkal az injektorbeállításokkal és kemencehőmérséklettel, mint a GC-EAD analízisnél. A vegyületeket retenciós idejük (Kovát-index) és tömegspektrumuk alapján azonosítottuk, összehasonlítva az egyéni könyvtárral és a NIST14 könyvtárral (Agilent). Az azonosított vegyületeket autentikus standardok injektálásával igazoltuk (1. kiegészítő fájl: S2. táblázat). A mennyiségi meghatározáshoz heptil-acetátot (10 ng, 99,8%-os kémiai tisztaság, Aldrich) használtunk. külső standardként injektálva.
Egy friss és érlelt vizeletben azonosított bioaktív vegyületekből álló szintetikus illatkeverék hatékonyságának értékelése a gazdaszúnyogok kereső és vérszívó Ans.arabiensis vonzására, ugyanazon olfaktométer és protokoll alkalmazásával, mint fent. A szintetikus keverékek utánozták a vegyületek összetételét és arányait friss, 24 órás, 48 ​​órás, 72 órás és 168 órás érlelt vizelet vegyes headspace illékony kivonataiban (5D-G. ábra; 1. kiegészítő fájl: S2. táblázat). Az elemzéshez a teljesen szintetikus keverék 10 μl-ét használtuk 1:100 hígításban, a teljes felszabadulási sebesség körülbelül 140-2400 ng h-1 között, a gazdaszúnyogok és a vérszívó szúnyogok vonzerejének felmérésére. Ezt követően a tesztet teljes keverékeken végeztük, amelyekből a teljes keverék egyes vegyületeinek szubtraktív keverékeit eltávolítottuk. A gazdaszúnyogok és a vérrel etetett Ans.Arab vs. szintetikus és szubtraktív keverékek keresési válaszait nominális logisztikus regresszióval elemeztük, majd páronkénti összehasonlításokat végeztünk a páratlan arányok (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Annak felmérésére, hogy a tehénvizelet szolgálhat-e gazda élőhelyének jelzésére a maláriaszúnyogok számára, a fent leírtak szerint gyűjtött friss és érlelt tehénvizeletet és vizet 3 literes, hálós vödrökbe (100 ml) helyeztek, és gazdacsapdákba helyezték. (BG-HDT verzió; BioGents, Regensburg, Németország). Tíz csapdát helyeztek el 50 m távolságra legelőn, 400 m-re a faluközösségtől (Silay, Etiópia, 5°53´24´´N, 37°29´24´´K), szarvasmarha nélkül, állandó szaporodóhelyeken és falvakban. Öt csapdát fűtöttek a gazda jelenlétének szimulálására, míg öt csapdát fűtetlenül hagytak. Minden kezelési helyet éjszakánként cserélnek, összesen öt éjszakán át. A különböző korú vizelettel csalétekkel kezelt csapdákban fogott szúnyogok számát béta-binomiális eloszlású logisztikus regresszióval hasonlították össze (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Egy malária-endémiás faluban, Maki városa közelében, Oromia régióban, Etiópiában (É. sz. 8° 11′ 08″, K. sz. 38° 81′ 70″; 6A. ábra). A vizsgálatot augusztus közepe és szeptember közepe között végezték, az éves beltéri maradványpermetezés előtt, egy hosszú esős évszakkal egybekötve. A vizsgálathoz öt házpárt (20–50 m távolságra), amelyek a falu szélén helyezkedtek el, választottak ki (6A. ábra). A házak kiválasztásához a következő kritériumok alapján került sor: állatok tartása tilos a házban, beltéri főzés (tűzifa vagy faszén használata) tilos (legalábbis a kísérleti időszakban), és legfeljebb két lakosú házak, amelyek rovarirtó szerekkel nem szennyezett helyiségekben alszanak. a kezelt szúnyogháló alatt. Az etikai jóváhagyást az Addisz-Abebai Egyetem Természettudományi Karának (CNS-IRB) Intézményi Kutatásetikai Felülvizsgálati Testülete (IRB/022/2016) adta meg, a Helsinki Orvosi Világszövetség (WHO) Helsinki Nyilatkozatában meghatározott irányelvekkel összhangban. Minden családfő beleegyezését az egészségügyi tanácsadó személyzet segítségével szerezték be. A teljes folyamatot a helyi közigazgatások hagyták jóvá kerületi és kerületi („kebele”) szinten. A kísérleti terv egy 2 × 2-es latin négyzet elrendezést követett, amelyben a szintetikus keverékeket és a kontrollokat az első éjszakán párosított házakhoz rendelték, majd a következő kísérleti éjszakán cserélték a házak között. Ezt a folyamatot tízszer megismételték. Ezenkívül a kiválasztott házakban a szúnyogok aktivitásának becsléséhez a CDC csapdákat úgy állították be, hogy öt egymást követő éjszakán, a terepi kísérlet elején, közepén és végén, ugyanabban a napszakban működjenek.
Egy hat bioaktív vegyületet tartalmazó szintetikus keveréket heptánban (97,0%-os oldószer GC minőségű, Sigma Aldrich) oldottak fel, és 140 ng h-1 sebességgel szabadították fel egy pamut kanócos adagolóval [20]. A kanócos adagoló lehetővé tette, hogy az összes vegyület állandó arányban szabaduljon fel a 12 órás kísérlet során. Kontrollként heptánt használtak. Az üvegcsét a Betegségellenőrzési és Megelőzési Központok (CDC) fénycsapdájának (John W. Hock Company, Gainesville, FL, USA; 6A. ábra) belépési pontja mellé függesztették. A csapdákat 0,8-1 m-rel a talaj felett, az ágy lábához közel akasztották fel, és egy önkéntes kezeletlen szúnyogháló alatt aludt, és 18:00 és 06:30 között működtette. A nem és fiziológiai állapot szerint (nem táplált, táplált, félig vemhes és vemhes [21]) befogott szúnyogokat ezt követően polimeráz láncreakcióval (PCR) szűrték, hogy azonosítsák a morfológiailag A. gambiae sl.-ként azonosított fajt. A komplex tagjai [23]. A terepi vizsgálatban a csapda A párosított házak csapdázását nominális logisztikus illeszkedési modellel elemeztük, ahol a vonzás volt a függő változó, a kezelés (szintetikus keverék vs. kontroll) pedig a fix hatás (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Itt a likelihood ratio tesztből származó χ2 és p-értékeket közöljük.
Értékelje, hogy biztonságos-e. Az arabiensis képes volt vizelethez jutni, fő nitrogénforrásához, a karbamidhoz, közvetlen etetés útján, a beadást követő 48 órán belül, 4 napon keresztül a gazdakereső és a vérrel etetett nőstények etetési kísérleteiben (1A. ábra). Mind a gazdakereső, mind a vérszívó nőstények szignifikánsan több szacharózt szívtak fel, mint bármely más étrend vagy víz (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 és F(5,299) = 56,00, p < 0,0001; 1B. és C. ábra). Továbbá a gazdakereső nőstények kevesebb vizeletet ettek 72 óra elteltével, mint 168 óra elteltével (1B. ábra). Amikor karbamidot tartalmazó étrendet kaptak, a gazdakereső nőstények szignifikánsan nagyobb mennyiségű karbamidot szívtak fel 2,69 mM-on, mint az összes többi koncentrációjú és víz, míg megkülönböztethetetlen a 10%-os szacharóztól (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; 1D. ábra). Ez ellentétben állt a vérrel etetett nőstények válaszával, akik jellemzően szignifikánsan több karbamidtartalmú étrendet szívtak fel, mint vizet, bár szignifikánsan kevesebbet, mint 10% szacharózt (F(10 557) = 78,35, p < 0,0001; 1E. ábra). Továbbá, a két fiziológiai állapot összehasonlításakor a flebotomizált nőstények a legalacsonyabb koncentrációknál több karbamidot szívtak fel, mint a gazdaszervezetet kereső nőstények, és ezek a nőstények hasonló mennyiségű karbamidot szívtak fel magasabb koncentrációknál (F(1 953) = 78,82, p < 0,0001; 1F., G. ábra). Míg a karbamidtartalmú étrendből származó bevitel optimális értékekkel rendelkezett (1D., E. ábra), a nőstények mindkét fiziológiai állapotban loglineáris módon képesek voltak modulálni a felszívódott karbamid mennyiségét a teljes karbamidkoncentráció-tartományban (1F., G. ábra). ).Hasonlóképpen úgy tűnik, hogy a szúnyogok a felszívott vizelet mennyiségének szabályozásával szabályozzák a nitrogénfelvételüket, mivel a vizeletben lévő nitrogén mennyisége tükröződik a felszívott mennyiségben (1B, C és B ábra beillesztések).
A vizelet és a karbamid gazdaállat-kereső és vérszívó szúnyogok túlélésére gyakorolt ​​hatásának felméréséhez a nőstényeket mind a négy korosztály vizeletével etették (friss, 24 órával, 72 órával és 168 órával a lerakódás után), és kontrollként különböző karbamidkoncentrációkat, valamint desztillált vizet és 10%-os szacharózt használtak (2A. ábra). Ez a túlélési elemzés kimutatta, hogy az étrend szignifikáns hatással volt a teljes túlélésre a gazdaállat-kereső nőstények (vizelet: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; karbamid: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; 2B. és C. ábra) és a vérrel etetett nőstények (vizelet: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; karbamid: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; 2D. és E. ábra) esetében. Minden kísérletben a vizelettel, karbamiddal és vízzel etetett nőstények túlélési aránya szignifikánsan alacsonyabb volt a szacharózos diétával etetett nőstényekhez képest (2B-E. ábra). A friss és állott vizelettel etetett gazdakereső nőstények eltérő túlélési arányokat mutattak, a 72 órás állott vizelettel etetettek (p = 0,016) rendelkeztek a legalacsonyabb túlélési valószínűséggel (2B. ábra). Továbbá a 135 mM karbamiddal etetett gazdakereső nőstények tovább éltek, mint a vízzel etetett kontrollcsoport tagjai (p < 0,04) (2C. ábra). A vízzel etetett nőkhöz képest a friss vizelettel és a 24 órás vizelettel etetett nők tovább éltek (p = 0,001, illetve p = 0,012; 2D. ábra), míg a 72 órás vizelettel etetett nők tovább éltek, mint a rövid friss vizelettel és a 24 órás érlelt vizelettel etetett nők (p < 0,0001, illetve p = 0,013; 2D. ábra). 135 mM karbamiddal etetett nők a vérrel etetett nők tovább éltek, mint minden más karbamid- és vízkoncentrációjú csoport. (p < 0,013; 2E. ábra).
A tehénvizeleten és karbamidon táplálkozó gazda- és vérszívó nőstény Anopheles arabinis túlélése. A biológiai vizsgálatban (A) a nőstény szúnyogok friss és érlelt tehénvizeletből, különböző koncentrációjú karbamidból, szacharózból (10%) és desztillált vízből (H2O) álló étrendet kaptak. A gazdakereső (B, C) és a vérszívó (D, E) szúnyogok túlélését 12 óránként rögzítették, amíg az összes vizelettel (B, D) és karbamiddal (C, E) etetett nőstény, a kontrollcsoport (szacharóz és víz) pedig elpusztult.
A 24 órás repülési malomtesztben meghatározott teljes távolság és körök száma különbözött a gazdaállat-kereső és a vérszívó szúnyogok között, amelyek összességében kevesebb repülési aktivitást mutattak (3. ábra). A friss és érlelt vizelettel vagy szacharózzal és vízzel táplált gazdaállat-kereső szúnyogok eltérő repülési mintázatot mutattak (3. ábra), a friss vizelettel táplálkozó nőstények hajnalban voltak aktívabbak, míg a 24 és 168 órás korú szúnyogokkal táplált szúnyogok eltérő repülési mintázatot mutattak, és elsősorban nappali repülési mintázatot mutattak. A szacharózt vagy 72 órás vizeletet biztosító nőstény szúnyogok a 24 órás időszak alatt aktivitást mutattak, míg a vizet biztosító nőstények a középső időszakban voltak aktívabbak. A szacharózzal etetett szúnyogok késő este és kora reggel mutatták a legnagyobb aktivitást, míg azok, amelyek 72 órás korú vizeletet fogyasztottak, 24 óra alatt folyamatosan csökkentek aktivitásukban (3. ábra).
Vadászkutyaként vérszívó nőstény Anopheles arabinis repülési teljesítménye tehénvizeleten és karbamidon táplálkozva. A repülési malom tesztben friss és érlelt tehénvizeleten, különböző koncentrációjú karbamidon, szacharózon (10%) és desztillált vízen (H2O) etetett nőstény szúnyogokat rögzítettek vízszintes, szabadon forgó karokhoz (fent). A gazdakutyaként kereső (balra) és a vérszívó (jobbra) nőstények esetében rögzítették az egyes étrendek teljes távolságát és óránkénti repüléseinek számát egy 24 órás időszak alatt (sötét: szürke; világos: fehér). Az átlagos távolságot és a repülések átlagos számát a cirkadián aktivitási grafikon jobb oldalán mutatjuk be. A hibasávok az átlag standard hibáját jelentik. A statisztikai elemzést lásd a szövegben.
Általánosságban elmondható, hogy a gazdakereső nőstények repülési aktivitása hasonló mintázatot követett, mint a repülési távolság 24 órás időszak alatt. Az átlagos repülési távolságot szignifikánsan befolyásolta a bevitt táplálék (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), és a 72 órán át vizelettel elfogyasztott gazdakereső nőstények szignifikánsan hosszabb távolságokat repültek az összes többi étrendhez képest (p < 0,0001), és a szacharózzal etetett szúnyogok hosszabb ideig repültek, mint a friss (p = 0,022) és a 24 órán át érlelt vizelettel (p = 0,022) etetett szúnyogok. A vizelettel etetett étrend által leírt repülési aktivitási mintázattal ellentétben a karbamiddal etetett gazdakereső nőstények 24 órán keresztül tartós repülési aktivitást mutattak, amely a sötét fázis második felében tetőzött (3. ábra). Bár az aktivitási mintázatok hasonlóak voltak, a karbamiddal etetett gazdakereső nőstények szignifikánsan növelték az átlagos repülési távolságot az elnyelt koncentrációtól függően (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). A gazdakereső nőstények, amelyeket bármilyen koncentrációjú karbamiddal ettek, tovább repültek, mint a vízzel vagy szacharózzal etetett nőstények (p < 0,03).
A vérszívó szúnyogok repülési aktivitása összességében stabil volt és 24 órán át fennmaradt minden étrend esetében, a sötét időszak második felében fokozott vizeletaktivitással a vízzel etetett nőstényeknél, valamint a frissen és 24 órás korban etetett nőstényeknél (3. kép). Míg a vizelettel etetett étrend szignifikánsan befolyásolta az átlagos repülési távolságot a vérrel etetett nőstényeknél (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), a karbamiddal etetett étrend nem befolyásolta ezt a hatást (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) más vizelettel és kontroll étrenddel (friss, p = 0,0091; 72 óra, p = 0,0022; 168 óra, p = 0,001; szacharóz, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
A vizelettel és karbamiddal etetett egyedek reprodukciós paramétereire gyakorolt ​​hatását peterakási biovizsgálatokkal értékelték (4A. ábra), és az egyes nőstények által lerakott peték száma, a peték mérete és az újonnan kikelt első stádiumú lárvák alapján vizsgálták. A lerakott peték száma... A vizelettel etetett arab nőstények a táplálkozás szerint változtak (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; 4B. ábra). A 24 órás vizelettel és vérliszttel etetett nőstények szignifikánsan több petét raktak, mint a más vizelettel etetett nőstények, és hasonlóak voltak a szacharózzal etetettekhez (4B. ábra). Hasonlóképpen, a vizelettel etetett nőstények által lerakott peték mérete a táplálkozás szerint változott (F(5,209) = 12,85, p < 0,0001), a 24 órás vizelettel és szacharózzal etetett nőstények szignifikánsan nagyobb petéket raktak, mint a vízzel etetett nőstények, míg a 168 órás vizelettel etetett nőstények petéke szignifikánsan kisebb volt (4C. ábra). Ezenkívül a vizelettel etetett étrend szignifikánsan befolyásolta a lárvák méretét (F(5,209) = 12,85, p < 0,0001). 187) = 7,86, p < 0,0001), a 24 és 72 órás, vizelettel táplált nőstények által lerakott petékből szignifikánsan nagyobb lárvák kelnek ki, mint a vízzel táplált és 168 órás, vizelettel táplált nőstények által lerakott petékből (4D. ábra).
A tehénvizelettel és karbamiddal táplálkozó nőstény Anopheles arabinis szaporodási teljesítménye. Vérrel etetett nőstény szúnyogokat 48 órán át friss és érlelt tehénvizeletből, különböző koncentrációjú karbamidból, szacharózból (10%) és desztillált vízből (H2O) álló étrenddel etettek, mielőtt biotesztekbe helyezték volna őket, és 48 órán át peterakó szubsztrátokat gyűjtöttek volna (A). A peteszámot (B, E), a peteméretet (C, F) és a lárvák méretét (D, G) szignifikánsan befolyásolta a biztosított takarmány (tehénvizelet: BD; karbamid: EG). Az egyes paraméterek különböző betűnevekkel mért átlagai szignifikánsan eltértek egymástól (egyutas ANOVA Tukey-féle post hoc analízissel; p < 0,05). A hibasávok az átlag standard hibáját jelölik.
A vizelet fő nitrogéntartalmú összetevőjeként a karbamid, amikor vérrel táplált nőstényeknek takarmányként adták, minden vizsgálatban jelentősen befolyásolta a reprodukciós paramétereket. A karbamiddal etetett nőstények által vérliszt elfogyasztása után lerakott peték száma a karbamidkoncentrációtól függően (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), a 134 µM és 1,34 mM közötti karbamidkoncentrációval etetett nőstények több petét raktak (4E. ábra). A 134 µM vagy annál nagyobb karbamidkoncentrációval etetett nőstények nagyobb petéket raktak, mint a vízzel etetett nőstények (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; 4F. ábra), és a lárvaméret, bár az anyák hasonló karbamidkoncentrációi befolyásolták (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001), változékonyabb volt (4G. ábra).
A gazdaszervezetet kereső szarvasmarha vizelet fejtérbeli illékony kivonatai iránti általános vonzerő. Az üvegcsöves olfaktométerben (5A. ábra) mért arabiensis szúnyogokat szignifikánsan befolyásolta a vizelet kora (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; 5B. ábra). A post hoc elemzés kimutatta, hogy a 24 óra elteltével érzékeny vizeletszag szignifikánsan magasabb vonzerőt okozott az összes többi kezeléshez képest (72 óra: p = 0,0060, 168 óra: p = 0,012, pentán: p = 0,00070), kivéve a friss vizelet illatát (p = 0,13; 5B. ábra). Bár a vérszívó szúnyogok vizeletszag iránti általános vonzereje nem különbözött szignifikánsan (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; 5C. ábra), ezek a nőstények szignifikánsan vonzóbbnak bizonyultak a fejtérbeli illékony kivonatokhoz a 72 órás érlelésű vizelethez képest a kontrollcsoporthoz képest (p = 0,0032). 0,0066; 5C. ábra).
Viselkedési válaszok természetes és szintetikus tehénvizelet-szagokra gazda- és vérrel táplált Anopheles arabianus szúnyogok keresése során. Az üvegcsöves olfaktométer vázlata (A). Friss és érlelt tehénvizeletből származó illékony kivonatok vonzása a gazda- (B) és a vérszívó (C) szúnyogokhoz. Határozza meg a Lord An csápreakcióját. Friss (D), 24 órás (E), 72 órás (F) és 168 órás (G) érlelt tehénvizeletből izolált kivonatok a fejtérben. Az elektronantenna-detektálási (EAD) görbék a gázkromatográfból eluált és lángionizációs detektorral (FID) detektált fejtérben lévő bioaktív vegyületekre adott feszültségváltozásokat mutatják. A skála a válasz amplitúdóját (mV) a retenciós idő (s) függvényében jelöli. A biológiailag aktív vegyületek tulajdonságai és felszabadulási sebességei (µg h-1) láthatók. Egy csillag (*) következetesen alacsony amplitúdójú választ jelöl. A dupla csillag (**) reprodukálhatatlan válaszokat jelöl. Keresse meg a gazda- (H) és a vérszívó (I) szúnyogot. Az An.arabiensis másképp vonzza a friss és érlelt tehénvizelet illatának szintetikus keverékeit. A különböző betűnevekhez vonzódó szúnyogok átlagos aránya szignifikánsan eltért egymástól (egyutas ANOVA Tukey post hoc analízisével; p < 0,05). A hibasávok a skála standard hibáját jelölik.
Az Ann.arabiensis nőstények ívása során, 72 és 120 órával a vérliszt után, nem mutattak előnyt a friss és érlelt tehénvizeletből származó, fejtérben oldódó illékony kivonatok iránt a pentános kontrollokhoz képest (χ2 = 3,07, p > 0,05; 1. kiegészítő fájl: S1. ábra).
A nőstény Ann.arabiensis esetében a GC-EAD és GC-MS elemzések nyolc, hat, három és három bioaktív vegyületet azonosítottak (5D-G. ábra). Bár az elektrofiziológiai válaszokat kiváltó vegyületek számában eltéréseket figyeltek meg, ezek a vegyületek mind jelen voltak a friss és érlelt vizeletből gyűjtött, a headspace-ben lévő illékony kivonatokban. Ezért minden kivonat esetében csak azokat a vegyületeket vonták be a további elemzésekbe, amelyek a küszöbérték feletti fiziológiai választ váltottak ki a nőstény csápokból.
A bioaktív vegyületek teljes illékony felszabadulási sebessége a headspace-gyűjteményben 29 µg h-1-ről (friss vizelet) 242 µg h-1-re (168 órás érlelésű vizelet) nőtt, főként a p-krezol és az m-formaldehid miatt. A fenol és a fenol mennyiségének növekedése miatt. Ezzel szemben más vegyületek, például a 2-ciklohexén-1-on és a dekanal felszabadulási sebessége a vizelet korának növekedésével csökkent, ami korrelált a kromatogramon megfigyelt jelintenzitás (abundancia) csökkenésével (5D. ábra - G. bal panel) és az ezekre a vegyületekre adott fiziológiai válaszokkal (5D. ábra - G. jobb panel).
Összességében a szintetikus keverék hasonló természetes arányban tartalmazott bioaktív vegyületeket a friss és az érlelt vizelet fejtér illékony kivonataiban (5D–G. ábra), és nem tűnt jelentős vonzerőnek a gazda (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; 5H. ábra) vagy a vérszívó szúnyogok (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; 5I. ábra) keresésében. A kezelések közötti utólagos páros összehasonlítások azonban azt mutatták, hogy a gazdakereső szúnyogok szignifikánsan vonzóbbak voltak a 24 órás érlelt vizelet szintetikus keveréke számára a pentán kontrollokhoz képest (p = 0,0086; 5H. ábra).
A 24 órás érlelésű vizelet szintetikus keverékeiben az egyes komponensek szerepének felméréséhez hat szubtraktív keveréket értékeltek teljes keverékekkel szemben Y-cső vizsgálatban, amelyben az egyes vegyületeket eltávolították. A gazdaszervezetet kereső szúnyogok esetében az egyes vegyületek kivonása a teljes keverékből szignifikáns hatással volt a viselkedési válaszokra (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; 1. kiegészítő fájl: S2A. ábra), minden szubtraktív keverék vonzóbb volt, mint a kisebb, mint a teljesen összekevert. Ezzel szemben az egyes vegyületek eltávolítása a teljesen szintetikus keverékből nem befolyásolta a vérszívó szúnyogok viselkedési válaszait (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), a dekanal kivételével, amely alacsonyabb vonzási szinteket eredményezett a teljes keverékhez képest (p = 0,022; 1. kiegészítő fájl: S2B. ábra).
Egy maláriafertőzött etiópiai faluban tíz éjszakán keresztül értékelték a 24 órás tehénvizelet szintetikus keverékének szúnyogok vonzására való hatékonyságát terepi körülmények között (6A. ábra). Összesen 4861 szúnyogot fogtak be és azonosítottak, amelyek 45,7%-a Anthropus.gambiae sl, 18,9%-a Anopheles pharoensis és 35,4%-a Culex spp. volt. (1. kiegészítő fájl: S1. táblázat). Az Anopheles arabinis az egyetlen olyan tagja az An.Gambian fajkomplexumnak, amelyet PCR-analízissel azonosítottak. Átlagosan éjszakánként 320 szúnyogot fogtak be, ez idő alatt a szintetikus keverékcsalételekkel ellátott csapdák több szúnyogot fogtak, mint a keverék nélküli páros csapdák (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Csali nélküli csapdákat helyeztek el mind az öt kontrolléjszakán, a kísérlet elején, közepén és végén. Minden csapdapárban hasonló számú szúnyogot fogtak be. ami nem jelez torzítást a házak között (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05), és a vizsgálati időszak alatt nem volt populációcsökkenés. A kontrollcsapdákkal összehasonlítva a szintetikus keveréket tartalmazó csapdákban fogott szúnyogok száma szignifikánsan megnőtt: gazdaállat keresése (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), vérvétel a közelmúltban (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) és vemhesség (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; 1. kiegészítő fájl: S1. táblázat). Ez tükröződik a fogott szúnyogok teljes számában is: gazdaállat keresése > vérszívó > vemhes > félig vemhes > hím.
24 órás szintetikus tehénvizelet szagkeverék hatékonyságának terepi értékelése. Terepi kísérleteket végeztek Etiópia dél-középső részén (térkép), Maki városa közelében (beillesztés), egy Betegségellenőrzési és Járványvédelmi Központok (CDC) fénycsapdáját (jobbra) párosított házakban, latin négyzet alakú elrendezésben (légi felvétel) (A). A szintetikus szagcsalikkal ellátott CDC fotocsapdák más módon vonzzák és fogják be a nőstény Anopheles arabesques szúnyogokat (B), de nem az Anopheles farroes szúnyogokat (C), egy eltérő módon, ami fiziológiai állapotfüggő hatás. Ezenkívül ezek a csapdák jelentősen megnövekedett számú Culex gazdaszúnyogot fogtak be. (D) A kontrollhoz képest. A bal oldali oszlopok a szagcsalik (zöld) és a kontroll (nyitott) csapdapárokban fogott szúnyogok átlagos szelekciós indexét jelentik (N = 10), míg a jobb oldali oszlopok a kontrollcsapdapárokban (nyitott; N = 5) fogott szúnyogok átlagos szelekciós indexét jelentik. ). A csillagok a statisztikai szignifikancia szintet jelzik (*p = 0,01 és ***p < 0,0001).
A három fajt eltérő módon fogták be a szintetikus keverékeket tartalmazó csapdákban. Gazdanövény (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), vérvétel (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) és vemhesség (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) keresése során egy .arabiensis esett csapdába a szintetikus keveréket kibocsátó csapdában (6B. ábra), míg az An mennyisége nem különbözött. Különböző fiziológiai állapotú Pharoensis szúnyogokat találtak (6C. ábra). A Culex esetében a szintetikus keverékkel csalétkes csapdákban csak a gazdaállatot kereső szúnyogok számának szignifikáns növekedését tapasztalták (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; 6D. ábra) a kontrollcsapdákhoz képest.
Etiópiában a szaporodási helyek és a vidéki közösségek között, a potenciális gazdaszervezeteken kívül elhelyezett gazdacsapdákat használtak annak felmérésére, hogy a maláriaszúnyogok a tehénvizelet szagát használják-e a gazda élőhelyének jelzésére. Gazdajelek és hő hiányában, valamint tehénvizelet szag jelenlétében vagy anélkül nem fogtak be szúnyogokat (1. kiegészítő fájl: S3. ábra). Magas hőmérséklet és tehénvizelet szag jelenlétében azonban a nőstény maláriaszúnyogokat vonzották és fogták be, bár kis számban, függetlenül a vizelet korától (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; 1. kiegészítő fájl: S3. ábra). Ezzel szemben a vízgazdálkodási kontrollok nem fogták be a maláriaszúnyogokat magas hőmérsékleten (1. kiegészítő fájl: S3. ábra).
A maláriaszúnyogok nitrogéntartalmú vegyületeket szereznek be és osztanak szét a tehénvizelettel (azaz pocsolyákkal) való kompenzáló táplálkozás révén, hogy javítsák az életciklus jellemzőit, hasonlóan más rovarokhoz [2, 4, 24, 25, 26]. A tehénvizelet egy könnyen elérhető, megújuló erőforrás, amely szorosan kapcsolódik a maláriavektorok pihenőhelyeihez, például a tehénistállókhoz és a vidéki házakhoz és ívóhelyekhez közeli magas növényzethez. A nőstény szúnyogok szaglás útján keresik meg ezt az erőforrást, és képesek szabályozni a vizeletben lévő nitrogéntartalmú vegyületek felvételét, beleértve a karbamidot, a vizelet fő nitrogéntartalmú összetevőjét [15, 16]. A nőstény szúnyog fiziológiai állapotától függően a vizeletben lévő tápanyagok a gazdaszervezetet kereső nőstény szúnyogok repülési aktivitásának és túlélésének fokozására, valamint a vérrel táplált egyedek túlélési és szaporodási jellemzőinek javítására az első gonadotrop ciklus során. Ezért a vizeletkeverés fontos táplálkozási szerepet játszik a zárt maláriavektorok számára, mint például az alultáplált felnőttek [8], mivel lehetővé teszi a nőstény szúnyogok számára, hogy fontos nitrogéntartalmú vegyületekhez jussanak alacsony kockázatú táplálkozás révén. Ennek a megállapításnak jelentős epidemiológiai következményei vannak, mivel a nőstények növelik várható élettartamukat, aktivitásukat és szaporodási képességüket. kimenet, amelyek mindegyike befolyásolja a vektorkapacitást. Továbbá ez a viselkedés a jövőbeli vektorkezelési programok célpontja is lehet.