Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com oldalt.Olyan böngészőverziót használ, amely korlátozott CSS-támogatással rendelkezik.A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben).Ezenkívül a folyamatos támogatás érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
Egyszerre három diából álló körhinta jeleníti meg.Az Előző és a Következő gombokkal egyszerre három dián lépkedhet, vagy a végén lévő csúszkagombokkal egyszerre három dián.
A vér-agy gát és a vér-agy gát megakadályozza, hogy a bioterápiás szerek elérjék céljukat a központi idegrendszerben, ezáltal akadályozzák a neurológiai betegségek hatékony kezelését.Az új agyi transzporterek in vivo felfedezése érdekében bevezettünk egy T7 fág peptid könyvtárat, és sorozatosan gyűjtöttük a vért és a cerebrospinális folyadékot (CSF) kanülbe helyezett, tudatos patkányok nagy medencemodellje segítségével.A specifikus fágklónok nagymértékben feldúsultak a CSF-ben négy szelekciós kör után.Az egyes jelölt peptidek tesztelése több mint 1000-szeres feldúsulást mutatott ki a CSF-ben.A peptid által közvetített agyba jutás bioaktivitását a cerebrospinális folyadékban az amiloid-β szintjének 40%-os csökkenése igazolta, az azonosított új tranzitpeptidhez kapcsolt BACE1 peptid inhibitor alkalmazásával.Ezek az eredmények azt sugallják, hogy az in vivo fágszelekciós módszerekkel azonosított peptidek hasznos hordozók lehetnek makromolekulák szisztémás bejuttatására az agyba, terápiás hatással.
A központi idegrendszerre (CNS) irányuló célzott terápiás kutatások nagyrészt az optimalizált gyógyszerek és szerek azonosítására összpontosítottak, amelyek központi idegrendszert célzó tulajdonságokat mutatnak, kevesebb erőfeszítéssel azon mechanizmusok felfedezésére, amelyek az aktív gyógyszeradagolást irányítják az agyba.Ez most kezd megváltozni, mivel a gyógyszerszállítás, különösen a nagy molekulák, a modern idegtudományi gyógyszerfejlesztés szerves részét képezik.A központi idegrendszer környezetét jól védi a vér-agy gátból (BBB) ​​és a vér-agy gátból (BCBB)1 álló cerebrovaszkuláris gátrendszer, amely kihívást jelent a gyógyszerek agyba juttatása1,2.Becslések szerint szinte az összes nagy molekulájú gyógyszer és a kis molekulájú gyógyszerek több mint 98%-a kiürül az agyból3.Éppen ezért nagyon fontos olyan új agyi transzportrendszerek azonosítása, amelyek hatékony és specifikus terápiás gyógyszerek eljuttatását biztosítják a központi idegrendszerbe 4,5.A BBB és a BCSFB azonban kiváló lehetőséget kínál a gyógyszerek bejuttatására is, mivel kiterjedt érrendszerén keresztül behatolnak és bejutnak az agy minden struktúrájába.Így az agyba történő bejuttatás nem invazív módszereinek alkalmazására irányuló jelenlegi erőfeszítések nagyrészt a receptor-mediált transzport (PMT) mechanizmusán alapulnak az endogén BBB6 receptor segítségével.A transzferrin receptor útvonalat használó közelmúltbeli kulcsfontosságú előrelépések ellenére7,8 új, jobb tulajdonságokkal rendelkező szállítórendszerek továbbfejlesztésére van szükség.Ennek érdekében a CSF transzport közvetítésére képes peptidek azonosítása volt a célunk, mivel ezek elvileg makromolekulák központi idegrendszerbe juttatására vagy új receptor utak megnyitására használhatók.Különösen a cerebrovaszkuláris rendszer specifikus receptorai és transzporterei (BBB és BSCFB) szolgálhatnak potenciális célpontok a bioterápiás gyógyszerek aktív és specifikus szállításához.A cerebrospinális folyadék (CSF) a choroid plexus (CS) szekréciós terméke, és a szubarachnoidális téren és a kamrai téren keresztül közvetlenül érintkezik az agy intersticiális folyadékával4.A közelmúltban kimutatták, hogy a subarachnoidális cerebrospinális folyadék túlzottan bediffundál az agy interstitiumába9.Reméljük, hogy ezen a subarachnoidális beáramlási csatornán keresztül vagy közvetlenül a BBB-n keresztül érhetjük el a parenchymalis teret.Ennek elérése érdekében robusztus in vivo fágszelekciós stratégiát alkalmaztunk, amely ideálisan azonosítja a két különböző útvonal bármelyikén szállított peptideket.
Most egy szekvenciális in vivo fágmegjelenítési szűrési módszert írunk le CSF-mintavétellel, amely nagy áteresztőképességű szekvenciával (HTS) párosul a kezdeti szelekciós körök legnagyobb könyvtári diverzitással történő monitorozására.A szűrést éber patkányokon végeztük tartósan beültetett nagy ciszterna (CM) kanüllel, hogy elkerüljük a vérszennyeződést.Fontos, hogy ez a megközelítés kiválasztja mind az agy-célzást, mind a cerebrovaszkuláris gáton áthaladó transzportaktivitású peptideket.Kis méretük (~60 nm)10 miatt T7 fágokat használtunk, és azt javasoltuk, hogy alkalmasak legyenek az endothel és/vagy hám-medulla gát transzcelluláris átjutását lehetővé tevő vezikulák szállítására.Négy pásztázási kör után fágpopulációkat izoláltunk, amelyek erős in vivo CSF-dúsulást és agyi mikroerek asszociációt mutattak.Fontos, hogy megerősítettük eredményeinket annak bizonyításával, hogy az előnyben részesített és kémiailag szintetizált legjobb peptidjelöltek képesek fehérje rakományt a cerebrospinális folyadékba szállítani.Először is, a központi idegrendszer farmakodinámiás hatásait úgy határoztuk meg, hogy egy vezető tranzitpeptidet kombináltunk a BACE1 peptid inhibitorával.Amellett, hogy bebizonyítjuk, hogy az in vivo funkcionális szűrési stratégiák képesek azonosítani az új agyi transzport peptideket, mint hatékony fehérje rakományhordozókat, arra számítunk, hogy a hasonló funkcionális szelekciós megközelítések fontosak lesznek az új agyi transzport utak azonosításában is.
A plakkképző egységek (PFU) alapján a fágcsomagolási lépést követően véletlenszerűen kiválasztott 12 tagú lineáris T7 fágpeptidek könyvtárát tervezték meg és hozták létre, körülbelül 109 diverzitással (lásd Anyagok és módszerek).Fontos megjegyezni, hogy gondosan elemeztük ezt a könyvtárat az in vivo pásztázás előtt.A fágkönyvtárminták PCR-amplifikációja módosított primerekkel olyan amplikonokat generált, amelyek közvetlenül alkalmazhatók a HTS-re (1a. Kiegészítő ábra).A) HTS11 szekvenálási hibák, b) a primerek (NNK)1-12 minőségére gyakorolt ​​hatás és c) a vad típusú (wt) fág (vázinszertek) jelenléte miatt a készenléti könyvtárban szekvenciaszűrő eljárást hajtottak végre, amely csak ellenőrzött szekvenciainformációkat nyer ki (1b. kiegészítő ábra).Ezek a szűrési lépések az összes HTS szekvenáló könyvtárra vonatkoznak.A standard könyvtár esetében összesen 233 868 leolvasást sikerült elérni, amelyek 39%-a megfelelt a szűrőkritériumoknak, és a könyvtár elemzésére és a következő körök kiválasztására használták (kiegészítő 1c-e ábra).A leolvasások túlnyomórészt 3 bázispár hosszúságú többszörösei voltak, csúcsuk 36 nukleotidnál volt (kiegészítő 1c. ábra), ami megerősíti a könyvtártervezést (NNK) 1-12.Figyelemre méltó, hogy a könyvtár tagjainak körülbelül 11%-a tartalmazott 12 dimenziós vad típusú (wt) PAGISRELVDKL-inszertet, és a szekvenciák csaknem fele (49%) tartalmazott inszerciót vagy deléciót.A könyvtári könyvtár HTS-e megerősítette a peptidek nagy diverzitását a könyvtárban: a peptidszekvenciák több mint 81%-át csak egyszer találták meg, és csak 1,5%-a fordult elő ≥4 kópiában (kiegészítő 2a. ábra).Az aminosavak (aa) gyakorisága a repertoár mind a 12 pozíciójában jól korrelált a degenerált NKK repertoár által generált kodonok számának várható gyakoriságával (2b. kiegészítő ábra).Az inszertek által kódolt aa-maradékok megfigyelt gyakorisága jól korrelált a számított frekvenciával (r = 0,893) (2c. kiegészítő ábra).A fágkönyvtárak injekcióhoz való előkészítése magában foglalja az amplifikáció és az endotoxin eltávolításának lépéseit.Ez korábban kimutatták, hogy potenciálisan csökkenti a fágkönyvtárak sokféleségét12,13.Ezért szekvenáltunk egy lemezen amplifikált fágkönyvtárat, amelyből endotoxin eltávolítást végeztek, és összehasonlítottuk az eredeti könyvtárral, hogy megbecsüljük az AA gyakoriságát.Erős korrelációt (r = 0,995) figyeltek meg az eredeti pool és az amplifikált és tisztított pool között (kiegészítő 2d. ábra), ami azt jelzi, hogy a lemezeken T7 fággal amplifikált klónok közötti versengés nem okozott jelentős torzítást.Ez az összehasonlítás a tripeptid motívumok gyakoriságán alapul az egyes könyvtárakban, mivel a könyvtárak sokfélesége (~109) még HTS-sel sem rögzíthető teljes mértékben.Az egyes pozíciókban az aa gyakorisági elemzése kis pozíciófüggő torzítást mutatott ki a bevitt repertoár utolsó három pozíciójában (2e kiegészítő ábra).Összefoglalva arra a következtetésre jutottunk, hogy a könyvtár minősége és diverzitása elfogadható volt, és a diverzitásban csak kisebb változásokat figyeltünk meg a fágkönyvtárak amplifikációja és előkészítése több szelekciós kör között.
Sorozatos cerebrospinális folyadék mintavétel végezhető úgy, hogy egy kanült sebészeti úton ültetünk be éber patkányok CM-ébe, hogy megkönnyítsük a BBB-n és/vagy BCSFB-n keresztül intravénásan (iv) injektált T7-fág azonosítását (1a-b. ábra).Két független szelekciós kart (A és B kar) használtunk az in vivo szelekció első három fordulójában (1c. ábra).Fokozatosan növeltük a szelekció szigorúságát az első három szelekciós körben bevitt fág teljes mennyiségének csökkentésével.A pásztázás negyedik köréhez az A és B ágból származó mintákat kombináltuk, és további három független szelekciót végeztünk.A T7 fágrészecskék in vivo tulajdonságainak tanulmányozására ebben a modellben vad típusú fágot (PAGISRELVDKL master betét) injektáltunk patkányokba a farokvénán keresztül.A fágok agy-gerincvelői folyadékból és vérből való kinyerése különböző időpontokban azt mutatta, hogy a viszonylag kisméretű T7 ikozaéderes fágok kezdeti gyors kiürülési fázisban voltak a vérkamrából (3. kiegészítő ábra).A beadott titerek és a patkányok vértérfogata alapján kiszámítottuk, hogy csak körülbelül 1 tömeg%.A beadott dózisból származó fág 10 perccel az intravénás injekció után volt kimutatható a vérben.Ezt a kezdeti gyors csökkenést követően lassabb elsődleges clearance-t mértek 27,7 perces felezési idővel.Fontos, hogy csak nagyon kevés fág került ki a CSF-kompartmentből, ami azt jelzi, hogy a vad típusú fágok CSF-rekeszbe történő migrációja alacsony volt (3. kiegészítő ábra).Átlagosan csak körülbelül 1 x 10-3% titer T7 fág a vérben és 4 x 10-8% kezdetben infundált fág volt kimutatható az agy-gerincvelői folyadékban a teljes mintavételi időszak alatt (0-250 perc).Nevezetesen, a vad típusú fág felezési ideje (25,7 perc) a cerebrospinális folyadékban hasonló volt a vérben megfigyelthez.Ezek az adatok azt mutatják, hogy a CSF-kompartmentet a vértől elválasztó gát sértetlen CM-kanülbe helyezett patkányokban, lehetővé téve a fágkönyvtárak in vivo szelekcióját, hogy azonosítsák azokat a klónokat, amelyek könnyen szállíthatók a vérből a CSF-kompartmentbe.
(a) A cerebrospinális folyadék (CSF) újramintavételének módszerének felállítása egy nagy készletből.(b) A központi idegrendszeri (CNS) gát sejtes elhelyezkedését és a vér-agy gáton (BBB) ​​és a vér-agy gáton áthaladó peptidek azonosítására használt szelekciós stratégiát bemutató diagram.(c) In vivo fágmegjelenítési szűrési folyamatábra.Minden szelekciós körben fágokat (a nyilak belsejében található állatazonosítók) intravénásan injektáltunk.Két független alternatív ág (A, B) külön marad a 4. kiválasztási körig.A 3. és 4. szelekciós körben minden egyes CSF-ből extrahált fágklónt manuálisan szekvenáltunk.(d) A vérből (piros körök) és a cerebrospinális folyadékból (zöld háromszögek) izolált fág kinetikája a szelekció első körében két kanülbe helyezett patkányban a T7 peptidkönyvtár intravénás injekciója után (2 x 1012 fág/állat).A kék négyzetek a fág átlagos kezdeti koncentrációját jelzik a vérben, az injektált fág mennyiségéből számítva, figyelembe véve a teljes vértérfogatot.A fekete négyzetek a vér fágkoncentrációiból extrapolált y egyenes metszéspontját jelzik.(e,f) Mutassa be a peptidben található összes lehetséges átfedő tripeptid motívum relatív gyakoriságát és eloszlását.Megjelenik az 1000 leolvasás során talált motívumok száma.A szignifikánsan (p < 0,001) dúsított motívumokat piros pontok jelölik.(e) Korrelációs szórásdiagram, amely összehasonlítja az injektált könyvtár tripeptid motívumának relatív gyakoriságát az 1.1. és #1.2. számú állatok vérből származó fágjával.(f) Korrelációs szórásdiagram, amely összehasonlítja a vérben és az agy-gerincvelői folyadékban izolált #1.1 és #1.2 állati fág tripeptid motívumok relatív gyakoriságát.(g, h) A vérben dúsított fág (g) szekvencia-azonosító reprezentációja az injektált könyvtárakkal és a CSF-ben dúsított fágokkal (h) szemben a vérrel egy in vivo szelekció után mindkét állatban.Az egybetűs kód mérete jelzi, hogy az aminosav milyen gyakran fordul elő az adott pozícióban.Zöld = poláris, lila = semleges, kék = bázikus, piros = savas és fekete = hidrofób aminosavak.Az 1a, b ábrát Eduard Urich tervezte és készítette.
Fágpeptid-könyvtárat injektáltunk két CM műszerpatkányba (A és B kládok), és fágot izoláltunk a cerebrospinális folyadékból és a vérből (1d. ábra).A könyvtár kezdeti gyors kiürülése kevésbé volt kifejezett a vad típusú fághoz képest.Az injektált könyvtár átlagos felezési ideje mindkét állatban 24,8 perc volt a vérben, hasonlóan a vad típusú fághoz, és 38,5 perc a CSF-ben.Minden egyes állatból származó vér- és cerebrospinális folyadék fágmintákat vetettünk alá HTS-nek, és az összes azonosított peptidet megvizsgáltuk egy rövid tripeptid motívum jelenlétére.A tripeptid motívumokat azért választottuk, mert minimális alapot adnak a szerkezet kialakításához és a peptid-fehérje kölcsönhatásokhoz14,15.Jó korrelációt találtunk a motívumok eloszlásában az injektált fágkönyvtár és mindkét állat véréből kinyert klónok között (1e. ábra).Az adatok azt mutatják, hogy a könyvtár összetétele csak kismértékben gazdagodott a vértérben.Az aminosav-frekvenciákat és a konszenzusszekvenciákat minden pozícióban tovább elemeztük a Weblogo16 szoftver adaptációjával.Érdekes módon erős dúsulást találtunk a vér glicin-maradványaiban (1g. ábra).Amikor a vért CSF-ből kiválasztott klónokkal hasonlítottuk össze, erős szelekciót és a motívumok bizonyos deszelekcióját figyeltük meg (1f. ábra), és bizonyos aminosavak előnyösen voltak jelen a 12 tagú előre meghatározott pozíciókban (1h. ábra).Nevezetesen, az egyes állatok szignifikánsan különböztek az agy-gerincvelői folyadékban, míg a vér glicin-dúsulása mindkét állatban megfigyelhető volt (4a–j kiegészítő ábra).A szekvenciaadatok szigorú szűrését követően az 1.1. és #1.2. számú állatok agy-gerincvelői folyadékában összesen 964 és 420 egyedi 12 tagú peptidet kaptunk (1d–e kiegészítő ábra).Az izolált fágklónokat amplifikáltuk, és egy második in vivo szelekciós körnek vetettük alá.A második szelekciós körből kivont fágokat mindegyik állatban HTS-nek vetettük alá, és az összes azonosított peptidet felhasználtuk egy motívumfelismerő program inputjaként a tripeptid motívumok előfordulásának elemzésére (2a, b, ef ábra).A CSF-ből kinyert fág első ciklusához képest az A és B ágakban számos motívum további szelekcióját és deszelekcióját figyeltük meg a CSF-ben (2. ábra).Hálózatazonosító algoritmust alkalmaztunk annak meghatározására, hogy a konzisztens sorozat különböző mintáit képviselik-e.Egyértelmű hasonlóságot figyeltünk meg a CSF által visszanyert 12 dimenziós szekvenciák között az alternatív A-kládban (2c. ábra, d) és a B-kládban (2g. ábra, h ábra).Az egyesített analízis az egyes ágakban eltérő szelekciós profilokat mutatott ki a 12 tagú peptidekre (kiegészítő 5c, d ábra), és a CSF/vértiter arány időbeli növekedését mutatta ki az egyesített klónok esetében a második szelekciós kör után az első szelekciós körhöz képest (kiegészítő 5e. ábra).).
Motívumok és peptidek dúsítása a cerebrospinális folyadékban két egymást követő in vivo funkcionális fágmegjelenítési szelekcióval.
Az egyes állatok első köréből kinyert összes cerebrospinális folyadék fágot (#1.1 és #1.2 állatok) összegyűjtöttük, amplifikáltuk, HT-szekvenáltuk, és újra együtt injektáltuk (2 x 1010 fág/állat) 2 SM kanülált patkányba (#1.1 → #).2.1 és 2.2, 1.2 → 2.3 és 2.4).(a,b,e,f) Korrelációs szórásdiagramok, amelyek összehasonlítják az összes CSF-eredetű fág tripeptid motívumainak relatív gyakoriságát az első és a második szelekciós körben.A peptidekben található összes lehetséges átfedő tripeptidet reprezentáló motívumok relatív gyakorisága és eloszlása ​​mindkét orientációban.Megjelenik az 1000 leolvasás során talált motívumok száma.A szignifikánsan (p < 0,001) kiválasztott vagy kizárt motívumok valamelyik összehasonlított könyvtárban piros pontokkal vannak kiemelve.(c, d, g, h) Az összes CSF-ben gazdag, 12 aminosavból álló szekvencia szekvencialogója az in vivo szelekció 2. és 1. köre alapján.Az egybetűs kód mérete jelzi, hogy az aminosav milyen gyakran fordul elő az adott pozícióban.A logó ábrázolásához összehasonlítják az egyes állatokból két kiválasztási kör között kinyert CSF-szekvenciák gyakoriságát, és a második körben feldúsított szekvenciákat mutatják be: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 és (h) #1.2–#2.4.A leginkább dúsított aminosavak egy adott pozícióban (c, d) állatokban sz.2.1 és nem.2.2 vagy (g, h) állatoknál sz.2.3 és nem.A 2.4 színesen látható.Zöld = poláris, lila = semleges, kék = bázikus, piros = savas és fekete = hidrofób aminosavak.
A harmadik szelekciós kör után 124 egyedi peptidszekvenciát (#3.1 és #3.2) azonosítottunk 332, két állatból izolált, CSF-vel helyreállított fágklónból (kiegészítő 6a. ábra).Az LGSVS szekvencia (18,7%) volt a legmagasabb relatív arányban, ezt követték a vad típusú PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) és SARGSWREIVSLS (2,2%) inszertek.Az utolsó negyedik körben három különálló állat két, egymástól függetlenül kiválasztott ágát egyesítettük (1c. ábra).A CSF-ből kinyert 925 szekvenált fágklón közül a negyedik körben 64 egyedi peptidszekvenciát találtunk (kiegészítő 6b. ábra), amelyek között a vad típusú fágok relatív aránya 0,8%-ra csökkent.A negyedik körben a leggyakoribb CSF-klónok a LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) és RLSSVDSDLSGC (3,6%) voltak.%)).A kiválasztott peptidek hosszúsági tartománya a nukleotid inszercióknak/delécióknak vagy a könyvtári primerekben lévő korai stopkodonoknak köszönhető, ha degenerált kodonokat használunk az NNK könyvtár tervezésére.A korai stopkodonok rövidebb peptideket generálnak, és azért kerülnek kiválasztásra, mert tartalmazzák a kedvező aa motívumot.Hosszabb peptidek származhatnak a szintetikus könyvtárak primereinek inszercióiból/delécióiból.Ez a tervezett stopkodont a kereten kívülre helyezi, és addig olvassa, amíg egy új stopkodon meg nem jelenik az áramlásirányban.Általánosságban elmondható, hogy a dúsítási tényezőket mind a négy kiválasztási körre úgy számítottuk ki, hogy összehasonlítottuk a bemeneti adatokat a minta kimeneti adatokkal.A szűrés első körében vad típusú fágtitereket használtunk nem specifikus háttérreferenciaként.Érdekes módon a negatív fágszelekció nagyon erős volt az első CSF-ciklusban, de nem a vérben (3a. ábra), ami annak tudható be, hogy a peptidkönyvtár legtöbb tagja passzív diffúziója alacsony valószínűséggel történik a CSF-kompartmentben, vagy a relatív fágok általában hatékonyabban maradnak meg vagy távolíthatók el a véráramból, mint a bakteriofágok.Azonban a második körben a CSF-ben a fágok erős szelekcióját figyelték meg mindkét kládban, ami arra utal, hogy az előző kör olyan fágokban gazdagodott, amelyek a CSF-felvételt elősegítő peptideket mutattak (3a. ábra).Ismét jelentős vérdúsítás nélkül.A harmadik és negyedik körben is a fágklónok jelentősen feldúsultak CSF-ben.Összehasonlítva az egyes egyedi peptidszekvenciák relatív gyakoriságát a szelekció utolsó két köre között, azt találtuk, hogy a szekvenciák még jobban gazdagodtak a szelekció negyedik körében (3b. ábra).Összesen 931 tripeptid motívumot vontunk ki mind a 64 egyedi peptid szekvenciából mindkét peptid orientáció használatával.A negyedik körben leginkább dúsított motívumok dúsítási profiljukat alaposabban megvizsgálták az összes körben, összehasonlítva az injektált könyvtárral (vágási határ: 10%-os dúsítás) (kiegészítő 6c. ábra).A szelekció általános mintái azt mutatták, hogy a vizsgált motívumok többsége mindkét szelekciós ág minden korábbi fordulójában gazdagodott.Egyes motívumok (pl. SGL, VSG, LGS GSV) azonban túlnyomórészt az alternatív A kládból származtak, míg mások (pl. FGW, RTN, WGF, NTR) az alternatív B kládban gazdagodtak.
A CSF-ben dúsított fágban megjelenített peptidek és a sztreptavidin hasznos terhekhez konjugált biotinilált vezető peptidek CSF-transzportjának validálása.
(a) Mind a négy körben (R1-R4) számított dúsítási arányok az injektált (input = I) fág (PFU) titerek és a meghatározott CSF fágtiterek (output = O) alapján.Az utolsó három kör (R2-R4) dúsítási tényezőit az előző körhöz és az első fordulóhoz (R1) képest súlyadatokkal hasonlították össze.A nyitott sávok a cerebrospinális folyadékot, az árnyékolt sávok a plazmát jelentik.(***p<0,001, Student-féle t-próba alapján).(b) A legnagyobb mennyiségben előforduló fágpeptidek listája a szelekció 4. fordulója után a CSF-ben gyűjtött összes fághoz viszonyított arányuk szerint rangsorolva.A hat leggyakoribb fág klónt a 3. és 4. szelekciós kör között kiemeljük, számozzuk és gazdagodási faktoraikkal.(c, d) A hat leginkább dúsított fág klónt, az üres fág és a szülői fág peptid könyvtárat a 4. körből egyenként elemeztük CSF mintavételi modellben.A CSF-et és a vérmintákat a megadott időpontokban vettük.(c) Egyenlő mennyiségben 6 jelölt fág klón (2 x 1010 fág/állat), üres fág (#1779) (2 x 1010 fág/állat) és törzsfág peptidkönyvtár (2 x 1012 fág/állat). Injektáljon be legalább 3 CM-et a külön beadott vénába.Az egyes injektált fágklónok és fágpeptid-könyvtárak CSF-farmakokinetikáját az idő függvényében mutatjuk be.(d) az összes visszanyert fág/ml átlagos CSF/vér arányát mutatja a mintavételi idő alatt.(e) Négy szintetikus vezető peptidet és egy kódolt kontrollt biotinnal kapcsoltunk streptavidinhez az N-terminálisukon keresztül (tetramer megjelenítés), majd injekciót (farokvénába iv, 10 mg sztreptavidin/kg).Legalább három intubált patkány (N = 3).).A CSF-mintákat a jelzett időpontokban gyűjtöttük, és a sztreptavidin-koncentrációkat CSF anti-sztreptavidin ELISA-val mértük (nd = nem detektáltuk).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ANOVA teszt alapján).(f) A leginkább dúsított #2002 fág peptid klón (lila) aminosavszekvenciájának összehasonlítása a 4. szelekciós körből kiválasztott többi fágpeptid klónnal.Az azonos és hasonló aminosav-fragmensek színkóddal vannak ellátva.
A negyedik körben (3b. ábra) az összes dúsított fág közül hat jelölt klónt választottunk ki további egyedi elemzésre a CSF mintavételi modellben.Hat fágjelölt, üres fág (nincs inszert) és profág peptidkönyvtárak azonos mennyiségét injektáltuk három kanülbe helyezett CM állatba, és a farmakokinetikát CSF-ben (3c. ábra) és vérben (7. kiegészítő ábra) határoztuk meg.Az összes tesztelt fágklón a CSF-kompartmentet 10-1000-szer magasabb szinten célozta meg, mint az üres kontrollfág (#1779).Például a #2020 és #2077 klónok körülbelül 1000-szer magasabb CSF-titerrel rendelkeztek, mint a kontrollfág.Az egyes kiválasztott peptidek farmakokinetikai profilja eltérő, de mindegyikük magas CSF-homing képességgel rendelkezik.Az 1903-as és a 2011-es klónok esetében állandó csökkenést figyeltünk meg az idő múlásával, míg a 2077-es, a 2002-es és a 2009-es klónoknál az első 10 percben bekövetkezett növekedés jelezheti az aktív transzportot, de ezt ellenőrizni kell.A 2020-as, 2002-es és 2077-es klónok magas szinten stabilizálódtak, míg a 2009-es klón CSF-koncentrációja lassan csökkent a kezdeti növekedés után.Ezután összehasonlítottuk az egyes CSF-jelöltek relatív gyakoriságát a vérkoncentrációjukkal (3d. ábra).Az egyes CSF jelöltek átlagos titerének és a vértiterüknek az összes mintavételi időpontban való korrelációja azt mutatta, hogy a hat jelölt közül három szignifikánsan feldúsult a vér CSF-ben.Érdekes módon a 2077-es klón magasabb vérstabilitást mutatott (7. kiegészítő ábra).Annak megerősítésére, hogy maguk a peptidek képesek a fágrészecskéktől eltérő rakományt is aktívan szállítani a CSF-rekeszbe, négy, biotinnal derivatizált vezető peptidet szintetizáltunk az N-terminálison, ahol a peptidek a fágrészecskéhez kapcsolódnak.Biotinilezett peptideket (2002, 2009, 2020 és 2077) streptavidinnel (SA) konjugáltak, hogy a fággeometriát némileg utánzó multimer formákat kapjanak.Ez a formátum azt is lehetővé tette számunkra, hogy mérjük az SA expozíciót a vérben és a cerebrospinális folyadékban, mint rakományszállító fehérjepeptideket.Fontos, hogy a fágadatok gyakran reprodukálhatók voltak, ha szintetikus peptideket ebben az SA-konjugált formátumban adtunk be (3e. ábra).Az összekevert peptidek kezdeti expozíciója kisebb, a CSF-kiürülésük pedig gyorsabb volt, 48 órán belül nem volt kimutatható.Annak érdekében, hogy betekintést nyerjünk ezeknek a peptidfág klónoknak a CSF-térbe történő bejuttatási útvonalaiba, elemeztük az egyes fágpeptidek lokalizációját immunhisztokémia (IHC) segítségével a fágrészecskék közvetlen kimutatására 1 órával az intravénás injekció után in vivo.Nevezetesen, a 2002-es, a 2077-es és a 2009-es klónok az agyi hajszálerek erős festődésével kimutathatók, míg a kontroll fág (#1779) és a 2020-as klón nem volt kimutatható (8. kiegészítő ábra).Ez arra utal, hogy ezek a peptidek pontosan a BBB-n való kereszteződés révén járulnak hozzá az agyra gyakorolt ​​hatáshoz.A hipotézis teszteléséhez további részletes elemzésre van szükség, mivel a BSCFB útvonal is érintett lehet.A leginkább dúsított klón (#2002) aminosavszekvenciáját más kiválasztott peptidekkel összehasonlítva megállapították, hogy némelyikük hasonló aminosav-kiterjesztésekkel rendelkezik, ami hasonló transzportmechanizmusra utalhat (3f. ábra).
Egyedülálló plazmaprofilja és a CSF jelentős növekedése miatt az idő múlásával a 2077-es fágmegjelenítő klónt egy hosszabb, 48 órás perióduson keresztül tovább kutatták, és képes volt reprodukálni a CSF-ben a tartós SA-szintekkel összefüggésben megfigyelt gyors növekedést (4a. ábra).Más azonosított fágklónok tekintetében a #2077 erősen festődött az agyi kapillárisokra, és jelentős kolokalizációt mutatott a kapilláris marker lektinnel, ha nagyobb felbontásban néztük, és esetleg némi festődést a parenchimális térben (4b. ábra).Annak vizsgálatára, hogy peptid-mediált farmakológiai hatások érhetők-e el a központi idegrendszerben, egy kísérletet végeztünk, amelyben i) a #2077 tranzit peptid és ii) a BACE1 inhibitor peptid biotinilált változatait két különböző arányban kevertük SA-val.Az egyik kombinációhoz csak a BACE1 peptid inhibitort, a másikhoz pedig a BACE1 peptid inhibitort a #2077 peptidhez viszonyítva 1:3 arányban alkalmaztuk.Mindkét mintát intravénásan adtuk be, és idővel mértük a béta-amiloid peptid 40 (Abeta40) szintjét a vérben és a cerebrospinális folyadékban.Az Abeta40-et CSF-ben mérték, mivel az tükrözi a BACE1 gátlását az agy parenchymában.Ahogy az várható volt, mindkét komplex jelentősen csökkentette az Abeta40 vérszintjét (4c., d. ábra).Azonban csak a sz. peptid keverékét tartalmazó minták.2077 és az SA-hoz konjugált BACE1 peptid inhibitora az Abeta40 szignifikáns csökkenését okozta a cerebrospinális folyadékban (4c. ábra).Az adatok azt mutatják, hogy a sz.A 2077 képes a 60 kDa-os SA fehérjét a központi idegrendszerbe szállítani, és farmakológiai hatásokat is kivált a BACE1 peptid SA-konjugált inhibitoraival.
(a) A 2077. számú CSF peptid (RLSSVDSDLSGC) és a nem injektált kontrollfág (#1779) hosszú távú farmakokinetikai profilját mutató T7 fág (2 × 10 fág/állat) klonális injekciója legalább három CM-intubált patkányban.(b) Konfokális mikroszkópos kép a reprezentatív kérgi mikroerekről fággal injektált patkányokban (2 × 1010 fág/állat), amely a #2077 peptid és az erek (lektin) ellenfestését mutatja.Ezeket a fágklónokat 3 patkánynak adtuk be, és 1 órán át keringettük őket perfúzió előtt.Az agyakat metszettek, és a T7 fág kapszid elleni poliklonális FITC-jelölt antitestekkel megfestették.Tíz perccel a perfúzió és az azt követő rögzítés előtt DyLight594-gyel jelölt lektint adtunk be intravénásan.Fluoreszcens képek, amelyek a mikroerek és fágok (zöld) luminális oldalán lektin festődést (piros) mutatnak a kapillárisok és a perivaszkuláris agyszövet lumenében.A skála 10 µm-nek felel meg.(c, d) A biotinilezett BACE1-gátló peptidet önmagában vagy a #2077 számú biotinilezett tranzitpeptiddel kombinálva sztreptavidinhez kapcsoltuk, majd legalább három kanülbe helyezett CM-patkány intravénás injekciójával (10 mg sztreptavidin/kg).A BACE1 peptid inhibitor által közvetített Aβ40 csökkenését Aβ1-40 ELISA-val mértük vérben (piros) és liquorban (narancssárga) a jelzett időpontokban.A jobb áttekinthetőség érdekében a grafikonon 100%-os léptékben szaggatott vonal rajzolódik ki.(c) Az Aβ40 százalékos csökkenése a vérben (piros háromszögek) és az agy-gerincvelői folyadékban (narancssárga háromszögek) patkányokban, amelyeket a #2077 számú tranzitpeptidhez és BACE1-gátló peptidhez konjugált streptavidinnel kezeltek 3:1 arányban.(d) A vér Aβ40 (piros körök) és az agy-gerincvelői folyadék (narancssárga körök) százalékos csökkenése a csak BACE1-gátló peptidhez kapcsolt streptavidinnel kezelt patkányokban.Az Aβ koncentráció a kontrollban 420 pg/ml volt (szórás = 101 pg/ml).
A fágmegjelenítést az orvosbiológiai kutatások számos területén sikeresen alkalmazták17.Ezt a módszert in vivo vaszkuláris diverzitás-vizsgálatokhoz18,19, valamint agyi ereket célzó vizsgálatokhoz20,21,22,23,24,25,26 használták.Ebben a tanulmányban ennek a szelekciós módszernek az alkalmazását nem csak az agyi ereket megcélzó peptidek közvetlen azonosítására terjesztettük ki, hanem a vér-agy gáton való átjutáshoz aktív transzport tulajdonságokkal rendelkező jelöltek felfedezésére is.Most leírjuk egy in vivo szelekciós eljárás kifejlesztését CM-intubált patkányokban, és bemutatjuk annak lehetőségét a CSF-homing tulajdonságokkal rendelkező peptidek azonosítására.A 12 tagú random peptidekből álló könyvtárat megjelenítő T7 fág segítségével be tudtuk mutatni, hogy a T7 fág elég kicsi (körülbelül 60 nm átmérőjű)10 ahhoz, hogy alkalmazkodni lehessen a vér-agy gáton, ezáltal közvetlenül áthaladjon a vér-agy gáton vagy a choroid plexuson.Megfigyeltük, hogy a kanülbe helyezett CM patkányokból a CSF begyűjtése jól kontrollált in vivo funkcionális szűrési módszer volt, és hogy a kivont fág nemcsak az érrendszerhez kötődött, hanem transzporterként is funkcionált a vér-agy gáton.Ezenkívül a vér egyidejű gyűjtése és a HTS CSF-re és vérből származó fágokra történő alkalmazása megerősítette, hogy a CSF-választásunkat nem befolyásolta a vér dúsítása vagy a szelekciós körök közötti bővítésre való alkalmasság.A vérkamra azonban a szelekciós eljárás része, mivel a CSF-kompartmentet elérni képes fágoknak elég hosszú ideig túl kell élniük és keringniük kell a véráramban ahhoz, hogy az agyban gazdagodjanak.Annak érdekében, hogy megbízható szekvencia-információkat nyersünk ki a nyers HTS-adatokból, a platform-specifikus szekvenálási hibákhoz igazított szűrőket implementáltunk az elemzési munkafolyamatban.A kinetikai paraméterek beépítésével a szűrési módszerbe megerősítettük a vad típusú T7 fágok gyors farmakokinetikáját (t½ ~ 28 perc) a vérben24, 27, 28, valamint meghatároztuk felezési idejüket a cerebrospinális folyadékban (t½ ~ 26 perc) percenként).Annak ellenére, hogy a vérben és a CSF-ben a farmakokinetikai profilok hasonlóak, a fág vérkoncentrációjának csak 0,001%-a volt kimutatható a CSF-ben, ami arra utal, hogy a vad típusú T7 fág háttérben alacsony a vér-agy gáton való mobilitása.Ez a munka rávilágít a szelekció első körének fontosságára in vivo panning stratégiák alkalmazásakor, különösen a keringésből gyorsan kiürülő fágrendszerek esetében, mivel kevés klón képes elérni a központi idegrendszeri kompartmentet.Így első körben a könyvtári diverzitás csökkenése nagyon nagy volt, mivel végül csak korlátozott számú klónt gyűjtöttek össze ebben a nagyon szigorú CSF-modellben.Ez az in vivo pásztázási stratégia számos szelekciós lépést tartalmazott, mint például az aktív felhalmozódást a CSF-kompartmentben, a klónok túlélését a vérrekeszben, és a T7 fágklónok gyors eltávolítását a vérből az első 10 percben (1d. ábra és 4M. kiegészítő ábra).).Így az első kör után különböző fágklónokat azonosítottak a CSF-ben, bár ugyanazt a kezdeti készletet használták az egyes állatokhoz.Ez arra utal, hogy a nagyszámú könyvtártagot tartalmazó forráskönyvtárak többszörös szigorú kiválasztási lépései a diverzitás jelentős csökkenését eredményezik.Ezért a véletlenszerű események a kezdeti kiválasztási folyamat szerves részévé válnak, és nagyban befolyásolják az eredményt.Valószínű, hogy az eredeti könyvtárban lévő klónok közül sok nagyon hasonló CSF-dúsítási hajlamot mutatott.Azonban még azonos kísérleti körülmények között is a szelekciós eredmények eltérhetnek az egyes klónok kis száma miatt a kezdeti készletben.
A CSF-ben dúsított motívumok különböznek a vérben lévőktől.Érdekes módon megfigyeltük az első elmozdulást a glicinben gazdag peptidek felé az egyes állatok vérében.(1g. ábra, 4e, 4f kiegészítő ábra).A glicin peptideket tartalmazó fágok stabilabbak lehetnek, és kevésbé valószínű, hogy kivonják a keringésből.Ezeket a glicinben gazdag peptideket azonban nem mutatták ki az agy-gerincvelői folyadékmintákban, ami arra utal, hogy a kiválasztott könyvtárak két különböző szelekciós lépésen mentek keresztül: az egyik a vérben, a másik pedig hagyta felhalmozódni a cerebrospinális folyadékban.A negyedik szelekciós körből származó, CSF-ben dúsított klónokat alaposan tesztelték.Szinte minden egyedileg tesztelt klónról bebizonyosodott, hogy CSF-ben dúsított a vak kontrollfághoz képest.Egy peptid találatot (#2077) részletesebben megvizsgáltunk.Hosszabb plazma felezési időt mutatott más találatokhoz képest (3d. ábra és 7. kiegészítő ábra), és érdekes módon ez a peptid ciszteint tartalmazott a C-terminálison.Nemrég kimutatták, hogy cisztein hozzáadása a peptidekhez javíthatja azok farmakokinetikai tulajdonságait az albumin 29-hez való kötődésével.Ez a #2077-es peptid esetében jelenleg ismeretlen, és további tanulmányozást igényel.Egyes peptidek vegyértékfüggőséget mutattak a CSF feldúsításában (az adatokat nem mutatjuk be), ami összefüggésben lehet a T7 kapszid megjelenített felületi geometriájával.Az általunk használt T7 rendszer fágrészecskénként minden peptidből 5-15 kópiát mutatott.Az IHC-t patkányok agykéregébe intravénásan injektált jelölt ólomfág klónokon végeztük (8. kiegészítő ábra).Az adatok azt mutatták, hogy legalább három klón (No. 2002, No. 2009 és No. 2077) kölcsönhatásba lép a BBB-vel.Meg kell határozni, hogy ez a BBB-kölcsönhatás a CSF felhalmozódását vagy ezeknek a klónoknak közvetlenül a BCSFB-be való mozgását eredményezi-e.Fontos, hogy megmutatjuk, hogy a kiválasztott peptidek megőrzik CSF transzport kapacitásukat, amikor szintetizálódnak és a fehérje rakományhoz kötődnek.Az N-terminális biotinilezett peptidek SA-hoz való kötődése lényegében megismétli a megfelelő fágklónokkal kapott eredményeket a vérben és a cerebrospinális folyadékban (3e. ábra).Végül megmutatjuk, hogy a #2077 ólompeptid képes elősegíteni az SA-hoz konjugált BACE1 biotinilezett peptid inhibitorának agyi hatását, kifejezett farmakodinámiás hatásokat okozva a központi idegrendszerben azáltal, hogy jelentősen csökkenti a cerebrospinalis folyadékban az Abeta40 szintjét (4. ábra).Nem tudtunk homológokat azonosítani az adatbázisban az összes találat peptidszekvencia-homológia keresésével.Fontos megjegyezni, hogy a T7 könyvtár mérete megközelítőleg 109, míg a 12 tagúak elméleti mérete 4 x 1015. Ezért a 12 tagú peptidkönyvtár diverzitásterének csak egy kis töredékét választottuk ki, ami azt jelentheti, hogy az azonosított szomszédos találati szekvenciaterek kiértékelésével optimalizáltabb peptidek azonosíthatók.Hipotetikusan az egyik ok, amiért nem találtunk természetes homológokat ezeknek a peptideknek, az lehet, hogy az evolúció során deszelekciót hajtottak végre, hogy megakadályozzák bizonyos peptidmotívumok ellenőrizetlen bejutását az agyba.
Eredményeink összességében alapot adnak az agyi érrendszeri gát transzportrendszereinek in vivo részletesebb azonosítására és jellemzésére irányuló jövőbeni munkához.Ennek a módszernek az alapvető felépítése egy funkcionális szelekciós stratégián alapul, amely nemcsak az agyi vaszkuláris kötődési tulajdonságokkal rendelkező klónokat azonosítja, hanem magában foglal egy kritikus lépést is, amelyben a sikeres klónok intrinsic aktivitással rendelkeznek a biológiai gátak in vivo átjutására a központi idegrendszeri kompartmentbe.célja, hogy tisztázza e peptidek transzportjának mechanizmusát és az agyi régióra specifikus mikrovaszkulatúrához való kötődésük preferenciáját.Ez a BBB és a receptorok transzportjának új utak felfedezéséhez vezethet.Arra számítunk, hogy az azonosított peptidek közvetlenül tudnak kötődni a cerebrovaszkuláris receptorokhoz vagy a keringő ligandumokhoz, amelyek a BBB-n vagy a BCSFB-n keresztül szállítódnak.Az ebben a munkában felfedezett CSF transzportaktivitással rendelkező peptid vektorokat tovább vizsgáljuk.Jelenleg e peptidek agyi specifitását vizsgáljuk a BBB-n és/vagy BCSFB-n való átjutást illetően.Ezek az új peptidek rendkívül értékes eszközök lesznek új receptorok vagy utak potenciális felfedezésében, valamint új, rendkívül hatékony platformok kifejlesztésében a makromolekulák, például a biológiai anyagok agyba juttatására.
Kanülálja be a nagy ciszternát (CM) a korábban leírt módszer módosításával.Altatott Wistar patkányokat (200-350 g) sztereotaxiás készülékre helyeztünk, és a borotvált és aszeptikusan előkészített fejbőrön középső bemetszést végeztünk, hogy feltárjuk a koponyát.Fúrjon két lyukat a felső szárny területére, és rögzítse a rögzítőcsavarokat a lyukakba.Egy további lyukat fúrtak az oldalsó nyakszirtben, hogy egy rozsdamentes acél kanül sztereotaktikus módon a CM-be kerüljön.Vigyen fel fogászati ​​cementet a kanül köré, és rögzítse csavarokkal.Fénykezelés és cementkötés után a bőrsebet 4/0 szupramid varrattal lezártuk.A kanül megfelelő elhelyezését a cerebrospinális folyadék (CSF) spontán szivárgása igazolja.Távolítsa el a patkányt a sztereotaxiás készülékből, részesüljön megfelelő posztoperatív ellátásban és fájdalomcsillapításban, és hagyja legalább egy hétig felépülni, amíg a vér jeleit nem észlelik a cerebrospinális folyadékban.A Wistar patkányokat (Crl:WI/Han) a Charles River-től (Franciaország) szereztük be.Valamennyi patkányt specifikus patogénmentes körülmények között tartottunk.Valamennyi állatkísérletet a svájci Basel város Állategészségügyi Hivatala hagyott jóvá, és a 2474-es számú állatengedély (Assessment of Active Brain Transport Levels of Therapeutic Candidates in the Cerebrospinal Fluid and Brain of Rat) szerint végezték.
Óvatosan tartsa eszméleténél a patkányt a CM kanüllel a kezében.Vegye ki a Daturát a kanülből, és gyűjtsön össze 10 µl spontán áramló agy-gerincvelői folyadékot.Mivel a kanül átjárhatósága végül megsérült, ebbe a vizsgálatba csak tiszta agy-gerincvelői folyadék mintákat vontunk be, amelyekben nem volt vérszennyeződés vagy elszíneződés.Ezzel párhuzamosan körülbelül 10-20 μl vért vettünk a farok hegyén lévő kis bemetszésből heparinnal (Sigma-Aldrich) tartalmazó csövekbe.A CSF-et és a vért különböző időpontokban gyűjtöttük össze a T7 fág intravénás injekciója után.Körülbelül 5–10 μl folyadékot öntöttünk ki minden egyes CSF-minta gyűjtése előtt, ami megfelel a katéter holt térfogatának.
A könyvtárakat a T7Select 10-3b vektor használatával állítottuk elő, a T7Select rendszer kézikönyvében leírtak szerint (Novagen, Rosenberg és munkatársai, InNovations 6, 1-6, 1996).Röviden, egy véletlenszerű 12 tagú DNS-inszertet szintetizáltak a következő formátumban:
Az NNK kodont a kettős stopkodonok és az aminosav-túlexpresszió elkerülésére használtuk az inszertben.N az egyes nukleotidok manuálisan kevert ekvimoláris aránya, K pedig az adenin és citozin nukleotidok manuálisan kevert ekvimoláris aránya.Az egyszálú régiókat kétszálú DNS-vé alakítottuk át dNTP-vel (Novagen) és Klenow enzimmel (New England Biolabs) Klenow pufferben (New England Biolabs) 3 órán át 37 °C-on.A reakció után a kettős szálú DNS-t etanolos kicsapással nyertük ki.A kapott DNS-t EcoRI és HindIII restrikciós enzimekkel emésztettük (mindkettő a Roche cégtől).A hasított és tisztított (QIAquick, Qiagen) inszertet (T4 ligáz, New England Biolabs) ezután egy előhasított T7 vektorba ligáljuk a 10B kapszid gén 348. aminosava után.A ligációs reakciókat 16 °C-on 18 órán át inkubáltuk az in vitro csomagolás előtt.A fág in vitro csomagolását a T7Select 10-3b klónozókészlethez (Novagen) mellékelt utasítások szerint végeztük, és a csomagolóoldatot egyszer amplifikáltuk, hogy Escherichia coli (BLT5615, Novagen) segítségével lízist végezzünk.A lizátumokat centrifugáltuk, titráltuk és -80 °C-on glicerin törzsoldatként lefagyasztottuk.
Levesben vagy lemezben amplifikált fág variábilis régiók közvetlen PCR-amplifikációja szabadalmaztatott 454/Roche-amplikon fúziós primerek használatával.A forward fúziós primer a variábilis régiót (NNK) 12 (templát-specifikus), a GS FLX Titanium Adapter A-t és egy négybázisú könyvtári kulcsszekvenciát (TCAG) szegélyező szekvenciákat tartalmaz (1a. kiegészítő ábra):
A reverz fúziós primer biotint is tartalmaz befogó gyöngyökhöz és a GS FLX Titanium Adapter B-t, amely az emulziós PCR során a klonális amplifikációhoz szükséges:
Az amplikonokat ezután 454/Roche piroszekvenálásnak vetettük alá a 454 GS-FLX Titanium protokoll szerint.A kézi Sanger szekvenáláshoz (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNS Analyzer) a T7 fág DNS-t PCR-rel amplifikáltuk, és a következő primerpárokkal szekvenáltuk:
Az egyes plakkokból származó inszerteket PCR-amplifikációnak vetettük alá a Roche Fast Start DNA Polymerase Kit segítségével (a gyártó utasításai szerint).Végezzen melegindítást (10 perc 95 °C-on) és 35 boost ciklust (50 s 95 °C-on, 1 perc 50 °C-on és 1 perc 72 °C-on).
A könyvtárakból származó fágokat, a vad típusú fágokat, a CSF-ből és a vérből mentett fágokat vagy az egyes klónokat Escherichia coli BL5615-ben amplifikáltuk TB táptalajban (Sigma Aldrich) vagy 500 cm2-es edényekben (Thermo Scientific) 4 órán át 37 °C-on.A fágokat a lemezekről Tris-EDTA pufferrel (Fluka Analytical) történő öblítéssel vagy a plakkok steril pipettahegyekkel történő összegyűjtésével extraháltuk.A fágokat a tenyészet felülúszójából vagy extrakciós pufferből izoláltuk egy körben polietilénglikol (PEG 8000) precipitációval (Promega), és újraszuszpendáltuk Tris-EDTA pufferben.
Az amplifikált fágot 2-3 kör endotoxin eltávolításnak vetettük alá endotoxin eltávolító gyöngyökkel (Miltenyi Biotec) az intravénás (IV) injekció beadása előtt (500 μl/állat).Első körben 2×1012 fág került bevezetésre;a másodikban 2×1010 fág;a harmadik és negyedik szelekciós körben állatonként 2×109 fág.A CSF-ben és a jelzett időpontokban gyűjtött vérminták fágtartalmát plakkszámlálással határoztuk meg a gyártó utasításai szerint (T7Select rendszer kézikönyv).A fágszelekciót tisztított könyvtárak farokvénába történő intravénás injekciójával vagy az előző szelekciós körből származó CSF-ből kinyert fág újrainjekciójával végeztük, majd az ezt követő begyűjtést 10 perc, 30 perc, 60 perc, 90 perc, 120 perc, 180 perc és 240 perccel végeztük, a CSF és a vérminták után.Összesen négy in vivo pásztázási kört hajtottak végre, amelyekben a két kiválasztott ágat külön tárolták és elemezték az első három szelekciós körben.A CSF-ből az első két szelekciós körből kivont összes fág inszertet 454/Roche piroszekvenálásnak vetettük alá, míg a CSF-ből az utolsó két szelekciós körből kivont összes klónt manuálisan szekvenáltuk.Az első szelekciós körből származó összes vérfágot 454/Roche piroszekvenálásnak is alávetettük.Fág klónok injektálásához a kiválasztott fágokat E. coliban (BL5615) amplifikáltuk 500 cm2-es lemezeken 37 °C-on 4 órán át.Az egyénileg kiválasztott és manuálisan szekvenált klónokat TB tápközegben szaporítottuk.Fág extrakció, tisztítás és endotoxin eltávolítása után (a fent leírtak szerint) 2×1010 fág/állat 300 μl-ben intravénásan injektáltunk egy farokvénába.
Sorozatadatok előfeldolgozása és minőségi szűrése.A nyers 454/Roche adatokat egy bináris szabványos adatfolyam-térkép formátumból (sff) egy Pearson ember által olvasható formátumba (fasta) alakították át a gyártó szoftverével.A nukleotidszekvencia további feldolgozását szabadalmaztatott C programok és szkriptek (kiadatlan szoftvercsomag) segítségével végeztük az alábbiakban leírtak szerint.Az elsődleges adatok elemzése szigorú, többlépcsős szűrési eljárásokat foglal magában.Az érvényes 12 tagú inszert DNS-szekvenciát nem tartalmazó leolvasások kiszűrése érdekében a leolvasott értékeket szekvenciálisan a startcímke (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), a stopcímke (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) és a háttérinszert (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC-Wunsch Needleman) segítségével illesztjük.igazítás, amely igazításonként legfeljebb 2 inkonzisztenciát tesz lehetővé31.Ezért a start- és stopcímkék nélküli, valamint a háttérbeillesztést, azaz a megengedett eltérések számát meghaladó igazításokat tartalmazó olvasásokat eltávolítottuk a könyvtárból.Ami a többi leolvasást illeti, az N-mer DNS-szekvenciát, amely a kezdőjeltől kezdve és a stopjel előtt végződik, kivágtuk az eredeti leolvasási szekvenciából, és tovább dolgoztuk (a továbbiakban: „beszúrás”).Az inszert transzlációja után a primer 5' végén lévő első stopkodon utáni részt eltávolítjuk az inszertből.Ezenkívül a primer 3' végén hiányos kodonokhoz vezető nukleotidokat is eltávolítottuk.A csak háttérszekvenciákat tartalmazó inszertek kizárása érdekében a „PAG” aminosavmintával kezdődő lefordított inszerteket is eltávolítottuk.A 3 aminosavnál rövidebb poszttranszlációs hosszúságú peptideket eltávolítottuk a könyvtárból.Végül távolítsa el a redundanciát a betétkészletből, és határozza meg az egyes egyedi betétek gyakoriságát.Ennek az elemzésnek az eredményei tartalmazták a nukleotidszekvenciák (inszertek) és azok (olvasási) gyakoriságának listáját (1c. és 2. kiegészítő ábra).
Az N-mer DNS-inszertek csoportosítása szekvencia-hasonlóság alapján: A 454/Roche-specifikus szekvenálási hibák (például a homopolimer-kiterjesztések szekvenálási problémái) és a kevésbé fontos redundanciák eltávolítása érdekében a korábban szűrt N-mer DNS-szekvencia-inszerteket (inszerteket) hasonlóság szerint rendezzük.beszúrások (legfeljebb 2 nem egyező bázis megengedett) a következőképpen meghatározott iteratív algoritmussal: a beszúrások először gyakoriságuk szerint (legmagasabbtól a legalacsonyabbig), és ha megegyeznek, akkor másodlagos rendezésük szerint hosszuk szerint (leghosszabbtól a legrövidebbig) ).Így a leggyakoribb és leghosszabb beillesztések határozzák meg az első „csoportot”.A csoport frekvenciája a kulcsfrekvenciára van állítva.Ezután a rendezett listában maradt minden egyes beszúrást megpróbáltunk páronként Needleman-Wunsch igazítással hozzáadni a csoporthoz.Ha egy igazításban az eltérések, beillesztések vagy törlések száma nem haladja meg a 2-es küszöbértéket, a rendszer hozzáad egy beillesztést a csoporthoz, és a csoport általános gyakorisága a beillesztés hozzáadásának gyakoriságával nő.A csoporthoz hozzáadott beszúrások használtként vannak megjelölve, és ki vannak zárva a további feldolgozásból.Ha a beillesztési szekvencia nem adható hozzá egy már létező csoporthoz, akkor a beillesztési szekvencia segítségével új csoport jön létre a megfelelő beillesztési gyakorisággal, és használtként jelöli meg.Az iteráció akkor ér véget, amikor az egyes beillesztési szekvenciákat egy új csoport létrehozására használták fel, vagy egy már meglévő csoportba beépíthető.Végül is a nukleotidokból álló csoportosított inszertek végül peptidszekvenciákká (peptidkönyvtárakká) transzlálódnak.Ennek az elemzésnek az eredménye egy sor beillesztés és a hozzájuk tartozó frekvenciák, amelyek az egymást követő leolvasások számát alkotják (2. kiegészítő ábra).
Motívumgenerálás: Az egyedi peptidek listája alapján egy könyvtárat hoztak létre, amely az összes lehetséges aminosavmintázatot (aa) tartalmazza, az alábbiak szerint.Minden lehetséges 3-as hosszúságú mintát kivontunk a peptidből, és annak inverz mintáját adtuk hozzá az összes mintát (tripeptideket) tartalmazó közös motívumkönyvtárhoz.Az erősen ismétlődő motívumok könyvtárait szekvenálták, és eltávolították a redundanciát.Ezután a motívumkönyvtárban lévő minden egyes tripeptid esetében számítógépes eszközökkel ellenőriztük, hogy jelen van-e a könyvtárban.Ebben az esetben a talált motívum-tripeptidet tartalmazó peptid gyakoriságát hozzáadjuk és hozzárendeljük a motívumkönyvtárban lévő motívumhoz („motívumok száma”).A motívumgenerálás eredménye egy kétdimenziós tömb, amely tartalmazza a tripeptidek (motívumok) összes előfordulását és a hozzájuk tartozó értékeket, amelyek a szekvenálási leolvasások száma, amelyek a megfelelő motívumot eredményezik az olvasmányok szűrése, csoportosítása és fordítása során.A fent részletesen leírt mutatók.
A motívumok számának normalizálása és a megfelelő szórásdiagramok: Az egyes minták motívumainak számát normalizáltuk
ahol ni az i témát tartalmazó olvasások száma.Így a vi az i motívumot tartalmazó leolvasások (vagy peptidek) százalékos gyakoriságát jelenti a mintában.A nem normalizált motívumok számának P-értékeit Fisher-féle egzakt teszttel számítottuk ki.A motívumok számának korrelogramjait illetően a Spearman-féle korrelációkat az R-vel normalizált motívumszám felhasználásával számítottuk ki.
A peptidkönyvtár egyes pozícióiban lévő aminosav-tartalom megjelenítésére a 32., 33. weblogogramokat (http://weblogo.threeplusone.com) hoztuk létre.Először is, a 12-tagú peptid minden pozíciójában lévő aminosav-tartalmat egy 20×12-es mátrixban tároljuk.Ezután egy 1000 peptidből álló, minden pozícióban azonos relatív aminosav-tartalmat tartalmazó készletet generálunk fasta-szekvencia formátumban, és bemenetként biztosítjuk a 3. weblogóhoz, amely grafikusan ábrázolja az egyes pozíciók relatív aminosavtartalmát.egy adott peptidkönyvtárhoz.A többdimenziós adatkészletek megjelenítéséhez hőtérképeket készítettek egy belső fejlesztésű R-eszközzel (biosHeatmap, egy még kiadandó R-csomag).A hőtérképeken bemutatott dendrogramokat Ward hierarchikus klaszterezési módszerével, az euklideszi távolságmetrikával számítottuk ki.A motívumpontozási adatok statisztikai elemzéséhez a nem normalizált pontozás P-értékeit Fisher-féle egzakt teszttel számítottuk ki.A többi adatkészlet P-értékeit R-ben számoltuk ki Student-féle t-teszt vagy ANOVA segítségével.
A kiválasztott fágklónokat és inszert nélküli fágokat intravénásan injektáltuk a farokvénán keresztül (2×1010 fág/állat 300 μl PBS-ben).Tíz perccel a perfúzió és az azt követő rögzítés előtt ugyanazokat az állatokat intravénásan injektáltuk 100 μl DyLight594-gyel jelölt lektint (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 perccel a fáginjekció után a patkányokat szívükön keresztül perfundáltuk 50 ml PBS-sel, majd 50 ml 4%-os PFA/PBS-sel.Az agymintákat egy éjszakán át fixáltuk 4% PFA/PBS-ben, és 30% szacharózban áztattuk egy éjszakán át 4 °C-on.A mintákat gyorsfagyasztjuk az OCT keverékben.A fagyasztott minták immunhisztokémiai analízisét szobahőmérsékleten, 1% BSA-val blokkolt 30 µm-es kriometszeteken végeztük, és T7 fág (Novus NB 600-376A) elleni poliklonális FITC-vel jelölt antitestekkel inkubáltuk 4 °C-on.Inkubáljuk egy éjszakán át.Végül a metszeteket háromszor mostuk PBS-sel, és konfokális lézermikroszkóppal (Leica TCS SP5) vizsgáltuk.
Minden 98%-os minimális tisztaságú peptidet a GenScript USA szintetizált, biotinilált és liofilizált.A biotin egy további hármas glicin távtartón keresztül kötődik az N-terminálishoz.Ellenőrizze az összes peptidet tömegspektrometriával.
A sztreptavidint (Sigma S0677) ötszörös ekvimoláris feleslegben kevertük össze biotinilált peptiddel, biotinilált BACE1 gátló peptiddel vagy biotinilált BACE1 gátló peptid és BACE1 gátló peptid kombinációjával (3:1 arányban) 5-10% DMSO/inkubált PBS-ben.1 órával szobahőmérsékleten az injekció beadása előtt.Streptavidin-konjugált peptideket intravénásan injektáltunk 10 mg/kg dózisban agyüreggel rendelkező patkányok egyik farokvénájába.
A sztreptavidin-peptid komplexek koncentrációját ELISA-val határoztuk meg.Nunc Maxisorp mikrotiter lemezeket (Sigma) vontunk be egy éjszakán át 4 °C-on 1,5 μg/ml egér anti-sztreptavidin antitesttel (Thermo, MA1-20011).A blokkolás után (blokkoló puffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% zselatin, 1% BSA) szobahőmérsékleten 2 órán át mossuk a lemezt 0,05% Tween-20/PBS-sel (mosópuffer) 3 percig. 000, CSF 1:115).A lemezt ezután egy éjszakán át 4 °C-on detektáló antitesttel (1 μg/ml, anti-sztreptavidin-HRP, Novus NB120-7239) inkubáltuk.Három mosási lépés után a sztreptavidint TMB szubsztrát oldatban (Roche) 20 percig tartó inkubálással detektáltuk.Miután leállította a színfejlődést 1 M H2SO4-gyel, mérje meg az abszorbanciát 450 nm-en.
A sztreptavidin-peptid-BACE1 inhibitor komplex funkcióját Aβ(1-40) ELISA-val értékeltük a gyártó protokollja szerint (Wako, 294-64701).Röviden, a CSF-mintákat standard hígítóval (1:23) hígítottuk, és egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk BNT77 befogó antitesttel bevont 96 lyukú lemezeken.Öt mosási lépés után HRP-konjugált BA27 antitestet adtunk hozzá, és 2 órán át 4 °C-on inkubáltuk, majd öt mosási lépést követett.Az Aβ(1–40)-t szobahőmérsékleten 30 percig TMB-oldatban végzett inkubálással detektáltuk.Miután a színfejlődést stopoldattal leállítottuk, mérjük meg az abszorbanciát 450 nm-en.A plazmamintákat szilárd fázisú extrakciónak vetettük alá az Aβ(1-40) ELISA előtt.A plazmát 0,2%-os DEA-hoz (Sigma) adtuk 96 lyukú lemezeken, és szobahőmérsékleten 30 percig inkubáltuk.Az SPE lemezek (Oasis, 186000679) vízzel és 100%-os metanollal történő egymás utáni mosása után plazmamintákat adtunk az SPE lemezekre, és az összes folyadékot eltávolítottuk.A mintákat mostuk (először 5% metanollal, majd 30% metanollal), és 2% NH4OH/90% metanol eleggyel eluáltuk.Miután az eluátumot 55 °C-on 99 percig, állandó N2 áram mellett szárítottuk, a mintákat standard hígítókban redukáltuk, és az Aβ(1–40) értéket a fent leírtak szerint mértük.
Hogyan idézzük ezt a cikket: Urich, E. et al.Rakományszállítás az agyba in vivo azonosított tranzitpeptidek segítségével.a tudomány.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB és Moos T. Makromolekuláris gyógyszerek eljuttatása az agyba célzott terápia segítségével.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., és Martinez-Martinez, P. Peptid és fehérje gyógyszerek szállítása a vér-agy gáton keresztül.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM A vér-agy gát: szűk keresztmetszet az agy gyógyszerfejlesztésében.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG és Byrd, A. Kilátások a jobb gyógyszerszállításra és az agyba történő célzásra a choroid plexus-CSF útvonalon keresztül.Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Biogyógyszerek modernizálása molekuláris trójai falovakkal az agy szállítására.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptor által közvetített peptid transzport a vér-agy gáton keresztül.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Növelje az agyba való behatolást és a terápiás antitestek hatékonyságát monovalens molekuláris transzferek segítségével.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.A transzferrin receptor (TfR) transzport meghatározza a TfR antitestek affinitási változatainak agyi felvételét.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).