Köszönjük, hogy felkereste a Nature.com weboldalt. Ön korlátozott CSS-támogatású böngészőverziót használ. A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy frissítse böngészőjét (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Ezenkívül a folyamatos támogatás biztosítása érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
Három diából álló forgószalagot jelenít meg egyszerre. Az Előző és Következő gombokkal egyszerre három dián, vagy a végén található csúszkagombokkal egyszerre három dián lapozhat.
A vér-agy gát és a vér-agy gát megakadályozza, hogy a bioterápiás szerek elérjék célpontjaikat a központi idegrendszerben, ezáltal akadályozva a neurológiai betegségek hatékony kezelését. Új agyi transzporterek in vivo felfedezése érdekében bevezettünk egy T7 fágpeptid-könyvtárat, és sorozatban gyűjtöttünk vért és agy-gerincvelői folyadékot (CSF) kanülált, éber, nagyméretű patkánymodell segítségével. A specifikus fágklónok négy szelekciós kör után nagymértékben feldúsultak a CSF-ben. Az egyes jelöltpeptidek tesztelése több mint 1000-szeres dúsulást mutatott a CSF-ben. Az agyba történő peptid-közvetített célba juttatás bioaktivitását az agy-gerincvelői folyadékban az amiloid-β szintjének 40%-os csökkenése igazolta az azonosított új tranzitpeptidhez kapcsolt BACE1 peptidgátló alkalmazásával. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az in vivo fágszelekciós módszerekkel azonosított peptidek hasznos hordozók lehetnek makromolekulák agyba történő szisztémás célba juttatásához terápiás hatással.
A központi idegrendszerre (KIR) irányuló célzott terápiás kutatások nagyrészt az optimalizált, központi idegrendszert célzó tulajdonságokkal rendelkező gyógyszerek és ágensek azonosítására összpontosítottak, kevesebb erőfeszítéssel az agyba történő aktív gyógyszeradagolást elősegítő mechanizmusok felfedezésére. Ez most kezd megváltozni, mivel a gyógyszeradagolás, különösen a nagy molekulájúak esetében, a modern idegtudományi gyógyszerfejlesztés szerves részét képezi. A központi idegrendszer környezetét jól védi a cerebrovaszkuláris barrierrendszer, amely a vér-agy gátból (BBB) ​​​​és a vér-agy gátból (BCBB)1 áll, ami megnehezíti a gyógyszerek agyba juttatását1,2. Becslések szerint szinte az összes nagy molekulájú gyógyszer és a kis molekulájú gyógyszerek több mint 98%-a kiürül az agyból3. Ezért nagyon fontos olyan új agyi transzportrendszerek azonosítása, amelyek hatékony és specifikus gyógyszeradagolást biztosítanak a központi idegrendszerbe4,5. A BBB és a BCSFB azonban kiváló lehetőséget kínál a gyógyszeradagolásra is, mivel behatolnak az agy minden struktúrájába a kiterjedt érrendszerén keresztül. Így a jelenlegi, nem invazív agyi hatóanyag-beviteli módszerek alkalmazására irányuló erőfeszítések nagyrészt a receptor-közvetített transzport (PMT) mechanizmusán alapulnak, amely az endogén BBB6 receptort használja. A transzferrin receptor útvonal használatával kapcsolatos legújabb kulcsfontosságú előrelépések ellenére7,8 további, továbbfejlesztett tulajdonságokkal rendelkező új szállítórendszerek fejlesztésére van szükség. Ennek érdekében célunk a cerebrospinális folyadék (CSF) transzportját közvetítő peptidek azonosítása volt, mivel elvileg ezek felhasználhatók makromolekulák központi idegrendszerbe juttatására vagy új receptor útvonalak megnyitására. Különösen az agyi érrendszer specifikus receptorai és transzporterei (BBB és BSCFB) szolgálhatnak potenciális célpontként a bioterápiás gyógyszerek aktív és specifikus célpontjaiként. Az agy-gerincvelői folyadék (CSF) a plexus choroidea (CS) szekréciós terméke, és közvetlen kapcsolatban áll az agy intersticiális folyadékával a subarachnoidális téren és a kamrai téren keresztül4. Nemrégiben kimutatták, hogy a subarachnoidális cerebrospinális folyadék túlzott mértékben diffundál az agy intersticiumába9. Reményeink szerint a parenchymális térbe ezen a szubarachnoidális beáramlási útvonalon vagy közvetlenül a vér-agy gáton keresztül tudunk bejutni. Ennek eléréséhez egy robusztus in vivo fágszelekciós stratégiát alkalmaztunk, amely ideális esetben azonosítja a két különböző útvonal valamelyikén szállított peptideket.
Most egy szekvenciális in vivo fágbemutató szűrési módszert írunk le, amely CSF mintavételezést és nagy áteresztőképességű szekvenálást (HTS) kombinál a kezdeti szelekciós körök monitorozására a legnagyobb könyvtári diverzitás mellett. A szűrést éber patkányokon végeztük, akikbe állandóan beültetett nagy ciszterna (CM) kanült helyeztünk a vérszennyeződés elkerülése érdekében. Fontos, hogy ez a megközelítés mind az agyat célzó, mind az agyi érrendszeren átívelő transzportaktivitással rendelkező peptideket szelektálja. Kis méretük (~60 nm)10 miatt T7 fágokat használtunk, és azt feltételeztük, hogy alkalmasak olyan vezikulák szállítására, amelyek lehetővé teszik az endoteliális és/vagy epiteliális-velő gát transzcelluláris átjutását. Négy pásztázási kör után olyan fágpopulációkat izoláltunk, amelyek erős in vivo CSF ​​dúsulást és agyi mikroér asszociációt mutattak. Fontos, hogy eredményeinket megerősíthettük azzal, hogy kimutattuk, hogy az előnyben részesített és kémiailag szintetizált legjobb jelölt peptidek képesek fehérjerakományt szállítani az agy-gerincvelői folyadékba. Először a központi idegrendszer farmakodinámiás hatásait állapítottuk meg egy vezető tranzitpeptid és a BACE1 peptid inhibitorának kombinálásával. Amellett, hogy kimutatjuk, hogy az in vivo funkcionális szűrési stratégiák képesek azonosítani az új agyi transzportpeptideket, mint hatékony fehérje-rakomány hordozókat, arra számítunk, hogy a hasonló funkcionális szelekciós megközelítések fontossá válnak az új agyi transzportútvonalak azonosításában is.
A plakkképző egységek (PFU) alapján, a fágcsomagolási lépés után, egy körülbelül 109 diverzitású, véletlenszerű 12-mer lineáris T7 fágpeptidekből álló könyvtárat terveztünk és hoztunk létre (lásd Anyagok és módszerek). Fontos megjegyezni, hogy ezt a könyvtárat gondosan elemeztük az in vivo pásztázás előtt. A fágkönyvtár minták PCR-amplifikációja módosított primerek alkalmazásával olyan amplikonokat generált, amelyek közvetlenül alkalmazhatók voltak a HTS-re (1a. kiegészítő ábra). A) a HTS11 szekvenálási hibák, b) a primerek (NNK)1-12 minőségére gyakorolt ​​hatás, és c) a vad típusú (wt) fág (vázbetétek) jelenléte a készenléti könyvtárban miatt szekvenciaszűrő eljárást alkalmaztunk, hogy csak az ellenőrzött szekvenciainformációkat kinyerjük (1b. kiegészítő ábra). Ezek a szűrési lépések minden HTS szekvenálási könyvtárra vonatkoznak. A standard könyvtár esetében összesen 233 868 leolvasást kaptunk, amelyek közül 39% megfelelt a szűrőkritériumoknak, és a könyvtárelemzéshez és a következő körökhöz való kiválasztáshoz használtuk fel (1c–e. kiegészítő ábra). A leolvasások túlnyomórészt 3 bázispár hosszúságú többszörösei voltak, 36 nukleotidnál egy csúccsal (1c. kiegészítő ábra), ami megerősíti a könyvtár tervét (NNK) 1-12. Figyelemre méltó, hogy a könyvtár tagjainak körülbelül 11%-a tartalmazott egy 12 dimenziós vad típusú (wt) gerincű PAGISRELVDKL inszertet, és a szekvenciák közel fele (49%) tartalmazott inszerciókat vagy deléciókat. A könyvtárkönyvtár HTS-e megerősítette a peptidek nagyfokú diverzitását a könyvtárban: a peptidszekvenciák több mint 81%-át csak egyszer találták meg, és csak 1,5%-uk fordult elő ≥4 példányban (2a. kiegészítő ábra). Az aminosavak (as) gyakorisága a repertoár mind a 12 pozíciójában jól korrelált a degenerált NKK repertoár által generált kodonok számára várt gyakoriságokkal (2b. kiegészítő ábra). Az ezen inszertek által kódolt aminosavmaradékok megfigyelt gyakorisága jól korrelált a számított gyakorisággal (r = 0,893) (2c. kiegészítő ábra). A fágkönyvtárak injekcióra való előkészítése magában foglalja az amplifikáció és az endotoxin eltávolításának lépéseit. Korábban kimutatták, hogy ez potenciálisan csökkenti a fágkönyvtárak diverzitását12,13. Ezért szekvenáltunk egy lemezen amplifikált, endotoxin eltávolításon átesett fágkönyvtárat, és összehasonlítottuk az eredeti könyvtárral az aminosavak gyakoriságának becsléséhez. Erős korrelációt (r = 0,995) figyeltünk meg az eredeti készlet és az amplifikált és tisztított készlet között (2d. kiegészítő ábra), ami azt jelzi, hogy a T7 fággal lemezeken amplifikált klónok közötti versengés nem okozott jelentős torzítást. Ez az összehasonlítás az egyes könyvtárakban található tripeptid motívumok gyakoriságán alapul, mivel a könyvtárak diverzitását (~109) még HTS-sel sem lehet teljes mértékben visszaadni. Az aminosavak gyakorisági elemzése minden pozícióban kis, pozíciófüggő torzítást mutatott a bevitt repertoár utolsó három pozíciójában (2e. kiegészítő ábra). Összefoglalva arra a következtetésre jutottunk, hogy a könyvtár minősége és diverzitása elfogadható volt, és a fágkönyvtárak amplifikációja és előkészítése miatt csak kisebb változásokat figyeltünk meg a diverzitásban a szelekciós körök között.
Sorozatos cerebrospinális folyadékmintavétel végezhető egy kanül sebészeti beültetésével éber patkányok agy-gerincvelői folyadékterébe (CM), hogy megkönnyítse a BBB-n és/vagy BCSFB-n keresztül intravénásan (iv) injektált T7 fág azonosítását (1a-b. ábra). Az in vivo szelekció első három körében két független szelekciós kart (A és B kar) használtunk (1c. ábra). Fokozatosan növeltük a szelekció szigorúságát az első három szelekciós körben bevitt fág teljes mennyiségének csökkentésével. A negyedik pásztázási körben az A és B ágakból származó mintákat kombináltuk, és további három független szelekciót végeztünk. A T7 fágrészecskék in vivo tulajdonságainak vizsgálatához ebben a modellben vad típusú fágot (PAGISRELVDKL master insert) injektáltunk patkányokba a farokvénán keresztül. A fágok agy-gerincvelői folyadékból és vérből történő kinyerése különböző időpontokban azt mutatta, hogy a viszonylag kis T7 ikozaéderes fágok gyors kezdeti kiürülési fázist mutattak a vérrekeszből (3. kiegészítő ábra). A beadott titerek és a patkányok vértérfogata alapján kiszámítottuk, hogy a beadott dózisnak csak körülbelül 1%-a volt kimutatható a vérben az intravénás injekció beadása után 10 perccel. Ezt a kezdeti gyors csökkenést követően lassabb elsődleges clearance-t mértünk, 27,7 perces felezési idővel. Fontos megjegyezni, hogy a cerebrospinális folyadékból (CSF) csak nagyon kevés fágot nyertünk ki, ami a vad típusú fágok CSF-rekeszbe történő migrációjának alacsony hátterét jelzi (3. kiegészítő ábra). Átlagosan a vérben a T7 fágnak csak körülbelül 1 x 10-3%-a, az eredetileg beadott fágoknak pedig 4 x 10-8%-a volt kimutatható az agy-gerincvelői folyadékban a teljes mintavételi időszak (0-250 perc) alatt. Figyelemre méltó, hogy a vad típusú fág felezési ideje (25,7 perc) az agy-gerincvelői folyadékban hasonló volt a vérben megfigyelthez. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a CSF-rekesz és a vér közötti elválasztó gát ép a CM-kanülált patkányokban, lehetővé téve a fágkönyvtárak in vivo szelekcióját, hogy azonosítsák azokat a klónokat, amelyek könnyen transzportálhatók a vérből a CSF-rekeszbe.
(a) Módszer létrehozása agy-gerincvelői folyadék (CSF) újbóli mintavételére egy nagyméretű mintából. (b) Ábra, amely a központi idegrendszeri (CNS) gát sejtes elhelyezkedését és a vér-agy gáton (BBB) ​​és a vér-agy gáton átjutó peptidek azonosítására használt szelekciós stratégiát mutatja. (c) In vivo fágbemutató szűrő folyamatábra. Minden szelekciós körben fágokat (a nyilakon belüli állatazonosítók) injektáltak intravénásan. Két független alternatív ágat (A, B) külön tartottak a 4. szelekciós körig. A 3. és 4. szelekciós körben a CSF-ből kivont egyes fágklónokat manuálisan szekvenálták. (d) A vérből (piros körök) és agy-gerincvelői folyadékból (zöld háromszögek) izolált fág kinetikája az első szelekciós körben két kanülált patkányban a T7 peptidkönyvtár intravénás injekciója után (2 x 1012 fág/állat). A kék négyzetek a fág átlagos kezdeti koncentrációját jelzik a vérben, az injektált fág mennyiségéből számítva, figyelembe véve a teljes vértérfogatot. A fekete négyzetek a vér fágkoncentrációiból extrapolált y vonal metszéspontját jelzik. (e, f) Mutassa be a peptidben található összes lehetséges átfedő tripeptid motívum relatív gyakoriságát és eloszlását. Az 1000 leolvasás során talált motívumok száma látható. A szignifikánsan (p < 0,001) dúsult motívumokat piros pontok jelölik. (e) Korrelációs szóródási diagram, amely az injektált könyvtár tripeptid motívumának relatív gyakoriságát hasonlítja össze az 1.1. és 1.2. számú állatok vérből származó fágjaival. (f) Korrelációs szóródási diagram, amely az 1.1. és 1.2. számú állati fág tripeptid motívumainak relatív gyakoriságát hasonlítja össze vérben és agy-gerincvelői folyadékban izolált 1.1. és 1.2. számú állati fág tripeptid motívumok relatív gyakoriságát hasonlítja össze. (g, h) A vérben dúsított fág (g) szekvencia-azonosító ábrázolása az injektált könyvtárakkal szemben, valamint a cerebrospinális folyadékban (h) dúsított fág (h) szekvencia-azonosítója a vérrel szemben mindkét állatban végzett in vivo szelekciós kör után. Az egybetűs kód mérete azt jelzi, hogy az aminosav milyen gyakran fordul elő az adott pozícióban. Zöld = poláris, lila = semleges, kék = bázikus, piros = savas és fekete = hidrofób aminosavak. Az 1a. és 1b. ábrát Eduard Urich tervezte és készítette.
Két CM műszeres patkányba (A és B klád) injektáltunk egy fágpeptid-könyvtárat, majd agy-gerincvelői folyadékból és vérből izoláltunk fágot (1d. ábra). A könyvtár kezdeti gyors kiürülése kevésbé volt kifejezett a vad típusú fághoz képest. Az injektált könyvtár átlagos felezési ideje mindkét állatban 24,8 perc volt vérben, hasonlóan a vad típusú fághoz, és 38,5 perc CSF-ben. Mindkét állat vér- és agy-gerincvelői folyadékfágmintáit HTS-nek vetettük alá, és az összes azonosított peptidet elemeztük egy rövid tripeptid motívum jelenlétére. A tripeptid motívumokat azért választottuk, mert minimális alapot biztosítanak a szerkezetképződéshez és a peptid-fehérje kölcsönhatásokhoz14,15. Jó korrelációt találtunk a motívumok eloszlásában az injektált fágkönyvtár és a két állat véréből kivont klónok között (1e. ábra). Az adatok azt mutatják, hogy a könyvtár összetétele csak marginálisan dúsult a vérrekeszben. Az aminosav-frekvenciákat és a konszenzus szekvenciákat minden pozícióban tovább elemeztük a Weblogo16 szoftver adaptációjával. Érdekes módon erős glicin-maradék dúsulást tapasztaltunk a vérben (1g. ábra). Amikor a vért összehasonlítottuk a cerebrospinális folyadékból (CSF) szelektált klónokkal, erős szelekciót és a motívumok bizonyos mértékű deszelekcióját figyeltük meg (1f. ábra), és bizonyos aminosavak preferenciálisan voltak jelen a 12-tagú szerkezet előre meghatározott pozícióiban (1h. ábra). Figyelemre méltó, hogy az egyes állatok agy-gerincvelői folyadékában szignifikánsan különböztek, míg mindkét állatban megfigyelhető volt a vér glicin-dúsulása (4a–j. kiegészítő ábra). Az 1.1. és 1.2. állatok agy-gerincvelői folyadékában található szekvenciaadatok szigorú szűrése után összesen 964, illetve 420 egyedi 12-mer peptidet kaptunk (1d–e. kiegészítő ábra). Az izolált fágklónokat amplifikáltuk, és egy második in vivo szelekciós körnek vetettük alá. A második szelekciós körből kivont fágokat minden állatban HTS-nek vetettük alá, és az összes azonosított peptidet egy motívumfelismerő program bemeneteként használtuk fel a tripeptid motívumok előfordulásának elemzésére (2a., b., ef. ábra). A CSF-ből kinyerett fág első ciklusához képest a CSF-ben az A és B ágakban számos motívum további szelekcióját és szelekciómentesedését figyeltük meg (2. ábra). Hálózati azonosító algoritmust alkalmaztunk annak meghatározására, hogy azok a konzisztens szekvencia különböző mintázatait képviselik-e. Egyértelmű hasonlóságot figyeltünk meg a CSF által az alternatív A kládban (2c., d. ábra) és a B kládban (2g., h. ábra) kinyert 12 dimenziós szekvenciák között. Az egyes ágak összesített elemzése eltérő szelekciós profilokat mutatott a 12-mer peptidek esetében (5c., d. kiegészítő ábra), valamint a CSF/vér titer arány időbeli növekedését mutatta ki a második szelekciós kör után az első szelekciós körhöz képest (5e. kiegészítő ábra).
Motívumok és peptidek dúsítása agy-gerincvelői folyadékban két egymást követő in vivo funkcionális fágmegjelenítési szelekciós fordulóval.
Az egyes állatok (1.1. és 1.2. számú állatok) első köréből kinyert összes cerebrospinális folyadékfágot összegyűjtötték, amplifikálták, HT-szekvenálták, majd együtt injektálták újra (2 x 1010 fág/állat) 2 SM kanülált patkányba (1.1. → #). 2.1 és 2.2, 1.2 → 2.3 és 2.4). (a, b, e, f) Korrelációs szóródási diagramok, amelyek az összes CSF-ből származó fág tripeptid motívumainak relatív gyakoriságát hasonlítják össze az első és a második szelekciós körben. Az összes lehetséges átfedő tripeptidet képviselő motívumok relatív gyakorisága és eloszlása, amelyek mindkét orientációban megtalálhatók a peptidekben. Az 1000 leolvasás során talált motívumok számát mutatjuk be. Az összehasonlított könyvtárak egyikében szignifikánsan (p < 0,001) kiválasztott vagy kizárt motívumokat piros pontokkal jelöltük. (c, d, g, h) Az összes CSF-ben gazdag, 12 aminosav hosszúságú szekvencia szekvencialogójának ábrázolása az in vivo szelekció 2. és 1. fordulója alapján. Az egybetűs kód mérete azt jelzi, hogy az aminosav milyen gyakran fordul elő az adott pozícióban. A logó ábrázolásához összehasonlítják az egyes állatokból két szelekciós forduló között kivont CSF-szekvenciák gyakoriságát, és a második fordulóban feldúsult szekvenciákat mutatják: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 és (h) #1.2–#2.4. A (c, d) 2.1. és 2.2. számú állatokban, illetve (g, h) 2.3. és 2.4. számú állatokban egy adott pozícióban leginkább feldúsult aminosavakat színessel jelölték. Zöld = poláris, lila = semleges, kék = bázikus, piros = savas és fekete = hidrofób aminosavak.
A harmadik szelekciós kör után 124 egyedi peptidszekvenciát (#3.1 és #3.2) azonosítottunk két állatból izolált 332 CSF-ben rekonstruált fágklónból (6a. kiegészítő ábra). Az LGSVS szekvencia (18,7%) rendelkezett a legnagyobb relatív arányban, ezt követték a vad típusú inszertek: PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) és SARGSWREIVSLS (2,2%). Az utolsó negyedik körben két, egymástól függetlenül kiválasztott ágat gyűjtöttünk össze három különálló állatból (1c. ábra). A CSF-ből kinyert 925 szekvenált fágklón közül a negyedik körben 64 egyedi peptidszekvenciát találtunk (6b. kiegészítő ábra), amelyek között a vad típusú fág relatív aránya 0,8%-ra csökkent. A negyedik körben a leggyakoribb CSF klónok a következők voltak: LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) és RLSSVDSDLSGC (3,2%). A kiválasztott peptidek hossztartománya a könyvtár primereiben található nukleotid inszercióknak/delécióknak vagy korai stop kodonoknak köszönhető, amikor degenerált kodonokat használnak az NNK könyvtártervezéshez. A korai stop kodonok rövidebb peptideket generálnak, és azért szelektálódnak, mert a kedvező aminosav motívumot tartalmazzák. Hosszabb peptidek a szintetikus könyvtárak primereiben található inszerciókból/deléciókból származhatnak. Ez a tervezett stop kodont a kereten kívülre helyezi, és addig olvassa, amíg egy új stop kodon meg nem jelenik a downstream oldalon. Általánosságban elmondható, hogy mind a négy szelekciós kör dúsulási tényezőit a bemeneti adatok és a minta kimeneti adatainak összehasonlításával számítottuk ki. Az első szűrési körben vad típusú fág titereket használtunk nem specifikus háttér referenciaként. Érdekes módon a negatív fágszelekció nagyon erős volt az első CSF-ciklusban, de nem a vérben (3a. ábra), ami a peptidkönyvtár legtöbb tagjának a CSF-rekeszbe történő passzív diffúziójának alacsony valószínűségével magyarázható, vagy a relatív fágok hajlamosabbak hatékonyabban visszatartani vagy eltávolítani a véráramból, mint a bakteriofágok. A második pásztázási körben azonban mindkét kládban erős fágszelekciót figyeltek meg a CSF-ben, ami arra utal, hogy az előző kör a CSF-felvételt elősegítő peptideket mutató fágokban gazdagodott (3a. ábra). Ismét jelentős vérdúsulás nélkül. A harmadik és negyedik körben is jelentősen gazdagodtak a fágklónok a CSF-ben. Az egyes egyedi peptidszekvenciák relatív gyakoriságát összehasonlítva az utolsó két szelekciós kör között azt tapasztaltuk, hogy a szekvenciák még inkább gazdagodtak a negyedik szelekciós körben (3b. ábra). Összesen 931 tripeptidmotívumot vontunk ki mind a 64 egyedi peptidszekvenciából, mindkét peptidorientációt alkalmazva. A negyedik körben leggazdagabb motívumokat alaposabban megvizsgáltuk dúsulási profiljaik szempontjából az összes körben az injektált könyvtárhoz képest (határérték: 10%-os dúsulás) (6c. kiegészítő ábra). Az általános szelekciós mintázatok azt mutatták, hogy a vizsgált motívumok többsége mindkét szelekciós ág összes korábbi körében dúsult. Egyes motívumok (pl. SGL, VSG, LGS GSV) azonban túlnyomórészt az alternatív A kládból származtak, míg mások (pl. FGW, RTN, WGF, NTR) az alternatív B kládban dúsultak fel.
A CSF-ben dúsított fággal megjelenített peptidek és a sztreptavidin hasznos terheléshez konjugált biotinilezett vezető peptidek CSF-transzportjának validálása.
(a) A dúsulási arányok mind a négy körben (R1-R4) kiszámítása a befecskendezett (bemenet = I) fág (PFU) titerek és a meghatározott CSF fág titerek (kimenet = O) alapján. Az utolsó három kör (R2-R4) dúsulási faktorait az előző körrel és az első körrel (R1) való összehasonlítással, súlyozási adatokkal számítottuk ki. Az üres oszlopok az agy-gerincvelői folyadékot, az árnyékolt oszlopok a plazmát jelölik. (***p<0,001, Student-féle t-próbán alapulva). (b) A leggyakoribb fágpeptidek listája, a 4. szelekciós kör után a CSF-ben gyűjtött összes fághoz viszonyított arányuk szerint rangsorolva. A hat leggyakoribb fágklónt színnel és számmal jelöltük, és a 3. és 4. szelekciós kör közötti dúsulási faktorokat (betétek) tüntettük fel. (c, d) A 4. körből származó hat legdúsabb fágklónt, az üres fág- és a szülői fágpeptid-könyvtárakat egyenként elemeztük CSF mintavételi modellben. A megadott időpontokban CSF- és vérmintákat gyűjtöttünk. (c) 6 jelölt fágklón (2 x 1010 fág/állat), üres fágok (#1779) (2 x 1010 fág/állat) és törzs fágpeptidkönyvtárak (2 x 1012 fág/állat) egyenlő mennyisége. A kanülált állatnak legalább 3 CM-et kell injektálni külön-külön a farokvénán keresztül. Az egyes injektált fágklónok és fágpeptidkönyvtárak CSF farmakokinetikáját az idő függvényében mutatjuk be. (d) az összes kinyert fág/ml átlagos CSF/vér arányát mutatja a mintavételi idő alatt. (e) Négy szintetikus vezető peptidet és egy kevert kontrollt biotinnal kapcsoltunk sztreptavidinhez az N-terminálisukon keresztül (tetramer megjelenítés), majd injekciót adtunk be (farokvénába intravénásan, 10 mg sztreptavidin/kg). Legalább három intubált patkány (N = 3). A megadott időpontokban CSF mintákat gyűjtöttünk, és a sztreptavidin koncentrációkat CSF anti-sztreptavidin ELISA-val mértük (nd = nem detektálható). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ANOVA teszt alapján). (f) A leggazdagabb fágpeptid klón (#2002, lila) aminosav-szekvenciájának összehasonlítása a 4. szelekciós körből származó többi szelektált fágpeptid klónnal. Az azonos és hasonló aminosav-fragmenseket színkódoltuk.
A negyedik körben feldúsított összes fágból (3b. ábra) hat jelölt klónt választottak ki további egyedi elemzésre a CSF mintavételi modellben. Hat jelölt fág, üres fág (inszert nélkül) és profág peptidkönyvtár egyenlő mennyiségét injektálták három kanülált CM állatba, és a farmakokinetikát CSF (3c. ábra) és vér (7. kiegészítő ábra) vizsgálatokban határozták meg. Az összes tesztelt fágklón a CSF rekeszrekeszét 10-1000-szer magasabb szinten célozta meg, mint az üres kontroll fág (#1779). Például a #2020 és #2077 klónok körülbelül 1000-szer magasabb CSF titerrel rendelkeztek, mint a kontroll fág. Az egyes kiválasztott peptidek farmakokinetikai profilja eltérő, de mindegyikük magas CSF homing képességgel rendelkezik. A #1903 és #2011 klónok esetében az idő múlásával állandó csökkenést figyeltünk meg, míg a #2077, #2002 és #2009 klónok esetében az első 10 percben bekövetkező növekedés aktív transzportra utalhat, de ezt ellenőrizni kell. A #2020, #2002 és #2077 klónok magas szinten stabilizálódtak, míg a #2009 klón cerebrospinális folyadék (CSF) koncentrációja a kezdeti emelkedés után lassan csökkent. Ezután összehasonlítottuk az egyes CSF-jelöltek relatív gyakoriságát a vérkoncentrációjukkal (3d. ábra). Az egyes CSF-jelöltek átlagos titerének és a vértiterüknek a korrelációja az összes mintavételi időpontban azt mutatta, hogy a hat jelölt közül három szignifikánsan dúsult a vér CSF-ben. Érdekes módon a #2077 klón nagyobb vérstabilitást mutatott (7. kiegészítő ábra). Annak megerősítésére, hogy maguk a peptidek képesek a fágrészecskéken kívül más rakomány aktív szállítására a CSF-rekeszbe, négy vezető peptidet szintetizáltunk, amelyeket biotinnal derivatizáltunk az N-terminálison, ahol a peptidek a fágrészecskéhez kapcsolódnak. A biotinilezett peptideket (2002, 2009, 2020 és 2077 számú) sztreptavidinnel (SA) konjugáltuk, hogy a fággeometriát némileg utánzó multimer formákat kapjunk. Ez a formátum lehetővé tette számunkra, hogy megmérjük az SA-expozíciót a vérben és az agy-gerincvelői folyadékban, mint rakományt szállító fehérjepeptideket. Fontos, hogy a fágadatok gyakran reprodukálhatók voltak, amikor a szintetikus peptideket ebben az SA-konjugált formátumban adtuk be (3e. ábra). A kevert peptidek kezdeti expozíciója kisebb volt, és gyorsabb volt a cerebrospinális folyadékból való kiürülésük, 48 órán belül kimutathatatlan szintekkel. Annak érdekében, hogy betekintést nyerjünk ezen peptidfágklónok CSF-térbe jutási útjaiba, immunhisztokémiával (IHC) elemeztük az egyes fágpeptid-találatok lokalizációját, hogy közvetlenül kimutassuk a fágrészecskéket az intravénás injekció után 1 órával in vivo. Figyelemre méltó, hogy a #2002, #2077 és #2009 klónok erős festődéssel detektálhatók voltak az agyi kapillárisokban, míg a kontroll fágot (#1779) és a #2020 klónt nem detektáltuk (8. kiegészítő ábra). Ez arra utal, hogy ezek a peptidek pontosan a BBB-n való átjutással járulnak hozzá az agyra gyakorolt ​​hatáshoz. További részletes elemzésre van szükség a hipotézis teszteléséhez, mivel a BSCFB útvonal is szerepet játszhat. A legdúsabb klón (#2002) aminosav-szekvenciájának más kiválasztott peptidekkel való összehasonlításakor megfigyelték, hogy némelyikük hasonló aminosav-kiterjesztéssel rendelkezik, ami hasonló transzportmechanizmusra utalhat (3f. ábra).
Egyedi plazmaprofilja és a cerebrospinális folyadékban (CSF) az idő múlásával tapasztalt jelentős növekedése miatt a #2077 fágmegjelenítő klónt egy hosszabb, 48 órás időszakon keresztül tovább vizsgálták, és képes volt reprodukálni a tartós SA-szinttel összefüggésben megfigyelt gyors CSF-növekedést (4a. ábra). Más azonosított fágklónokat tekintve a #2077 erősen festődött az agyi kapillárisokra, és nagyobb felbontásban jelentős kolokalizációt mutatott a kapilláris marker lektinnel, valamint esetleg némi festődést a parenchymális térben (4b. ábra). Annak vizsgálatára, hogy elérhetők-e peptidközvetített farmakológiai hatások a központi idegrendszerben, egy kísérletet végeztünk, amelyben i) a #2077 tranzitpeptid és ii) a BACE1 inhibitor peptid biotinilezett változatait két különböző arányban kevertük SA-val. Az egyik kombinációhoz csak a BACE1 peptid inhibitort, a másikhoz pedig a BACE1 peptid inhibitor és a #2077 peptid 1:3 arányú arányát használtuk. Mindkét mintát intravénásan adtuk be, és a béta-amiloid peptid 40 (Abeta40) vér- és agy-gerincvelői folyadékszintjét idővel mértük. Az Abeta40 szintjét a cerebrospinális folyadékban (CSF) mérték, mivel az az agy parenchymában a BACE1 gátlását tükrözi. A várakozásoknak megfelelően mindkét komplex jelentősen csökkentette az Abeta40 vérszintjét (4c., d. ábra). Azonban csak a 2077-es peptid és a BACE1 peptid egy SA-hoz konjugált inhibitorának keverékét tartalmazó minták okozták az Abeta40 szignifikáns csökkenését az agy-gerincvelői folyadékban (4c. ábra). Az adatok azt mutatják, hogy a 2077-es peptid képes a 60 kDa-os SA fehérjét a központi idegrendszerbe szállítani, és farmakológiai hatásokat is kivált a BACE1 peptid SA-val konjugált inhibitoraival együtt.
(a) T7 fág klonális injekciója (2 × 10 fág/állat), amely a CSF 2077-es peptid (RLSSVDSDLSGC) és az injektálatlan kontroll fág (#1779) hosszú távú farmakokinetikai profiljait mutatja legalább három CM-intubált patkányban. (b) Fággal injektált patkányok reprezentatív kérgi mikrovérsejtjeinek konfokális mikroszkópos képe (2 × 1010 fág/állat), amely a 2077-es peptid és az erek (lektin) kontrasztfestését mutatja. Ezeket a fágklónokat 3 patkánynak adtuk be, és a perfúzió előtt 1 órán át keringtek. Az agyakat metszetekre vágtuk, és a T7 fág kapszid elleni poliklonális FITC-vel jelölt antitestekkel festettük. A perfúzió és az azt követő fixálás előtt tíz perccel DyLight594-jelölt lektint adtunk be intravénásan. Fluoreszcens képek, amelyek a mikrovérsejtek luminális oldalának lektin festését (piros) és a fágok (zöld) festését mutatják a kapillárisok és a perivaszkuláris agyszövet lumenében. A lépték 10 µm-nek felel meg. (c, d) Biotinilált BACE1 gátló peptidet önmagában vagy biotinilált 2077-es tranzitpeptiddel kombinálva sztreptavidinhez kapcsoltak, majd legalább három kanülált CM patkánynak intravénásan injektálták (10 mg sztreptavidin/kg). A BACE1 peptid inhibitor által közvetített Aβ40-csökkenést Aβ1-40 ELISA-val mérték vérben (piros) és agy-gerincvelői folyadékban (narancssárga) a megadott időpontokban. A jobb áttekinthetőség kedvéért a grafikonon 100%-os skálán szaggatott vonal látható. (c) Az Aβ40 százalékos csökkenése a vérben (piros háromszögek) és az agy-gerincvelői folyadékban (narancssárga háromszögek) a 2077-es tranzitpeptidhez konjugált sztreptavidinnel és BACE1 gátló peptiddel 3:1 arányban kezelt patkányokban. (d) A vér Aβ40 (piros körök) és az agy-gerincvelői folyadékban (narancssárga körök) százalékos csökkenése a csak BACE1 gátló peptidhez kapcsolt sztreptavidinnel kezelt patkányokban. A kontrollban az Aβ koncentráció 420 pg/ml volt (szórás = 101 pg/ml).
A fágmegjelenítést sikeresen alkalmazták a biomedicinális kutatások számos területén17. Ezt a módszert in vivo vaszkuláris diverzitási vizsgálatokban18,19, valamint agyi ereket célzó vizsgálatokban20,21,22,23,24,25,26 használták. Ebben a tanulmányban kiterjesztettük a szelekciós módszer alkalmazását nemcsak az agyi ereket célzó peptidek közvetlen azonosítására, hanem a vér-agy gáton átjutni képes aktív transzporttulajdonságokkal rendelkező jelöltek felfedezésére is. Most leírjuk egy in vivo szelekciós eljárás kifejlesztését CM intubált patkányokban, és bemutatjuk annak lehetőségét a CSF homing tulajdonságokkal rendelkező peptidek azonosítására. A 12-mer véletlenszerű peptidek könyvtárát megjelenítő T7 fág segítségével kimutathattuk, hogy a T7 fág elég kicsi (körülbelül 60 nm átmérőjű)10 ahhoz, hogy alkalmazkodjon a vér-agy gáthoz, ezáltal közvetlenül átjutva a vér-agy gáton vagy a choroidea plexuson. Megfigyeltük, hogy a kanülált CM patkányokból történő cerebrospinális folyadék (CSF) kinyerése egy jól kontrollált in vivo funkcionális szűrővizsgálati módszer, és hogy a kivont fág nemcsak az érrendszerhez kötődik, hanem transzporterként is működik a vér-agy gáton keresztül. Továbbá, a vér egyidejű gyűjtésével és a HTS CSF-re, valamint a vérből származó fágokra történő alkalmazásával megerősítettük, hogy a CSF-választásunkat nem befolyásolta a vér dúsulása vagy a szelekciós körök közötti tágulásra való alkalmasság. A vérrekesz azonban a szelekciós eljárás része, mivel a CSF-rekeszbe jutni képes fágoknak elég sokáig kell túlélniük és keringeniük a véráramban ahhoz, hogy feldúsuljanak az agyban. Annak érdekében, hogy megbízható szekvenciainformációkat kinyerjünk a nyers HTS-adatokból, platformspecifikus szekvenálási hibákhoz igazított szűrőket implementáltunk az elemzési munkafolyamatban. A kinetikai paraméterek beépítésével a szűrővizsgálati módszerbe megerősítettük a vad típusú T7 fágok gyors farmakokinetikáját (t½ ~ 28 perc) a vérben (24, 27, 28), és meghatároztuk a felezési idejüket az agy-gerincvelői folyadékban (t½ ~ 26 perc) percenként. A vérben és a cerebrospinális folyadékban (CSF) megfigyelhető hasonló farmakokinetikai profilok ellenére a fág vérkoncentrációjának mindössze 0,001%-a volt kimutatható a CSF-ben, ami a vad típusú T7 fág alacsony háttérmobilitását jelzi a vér-agy gáton keresztül. Ez a munka kiemeli az első szelekciós kör fontosságát az in vivo pásztázási stratégiák alkalmazásakor, különösen a keringésből gyorsan kiürülő fágrendszerek esetében, mivel kevés klón képes elérni a központi idegrendszeri rekeszeket. Így az első körben a könyvtár diverzitásának csökkenése nagyon nagy volt, mivel ebben a nagyon szigorú CSF modellben végül csak korlátozott számú klónt gyűjtöttek össze. Ez az in vivo pásztázási stratégia több szelekciós lépést is magában foglalt, mint például az aktív felhalmozódás a CSF-rekeszben, a klónok túlélése a vérrekeszben és a T7 fág klónok gyors eltávolítása a vérből az első 10 percen belül (1d. ábra és kiegészítő 4M. ábra). Így az első kör után különböző fág klónokat azonosítottak a CSF-ben, bár ugyanazt a kezdeti készletet használták az egyes állatokhoz. Ez arra utal, hogy a nagyszámú könyvtártagot tartalmazó forráskönyvtárak több szigorú szelekciós lépése a diverzitás jelentős csökkenését eredményezi. Ezért a véletlenszerű események a kezdeti szelekciós folyamat szerves részévé válnak, nagyban befolyásolva az eredményt. Valószínű, hogy az eredeti könyvtárban található számos klón nagyon hasonló CSF-dúsulási hajlammal rendelkezett. Azonban még azonos kísérleti körülmények között is eltérhetnek a szelekciós eredmények az egyes klónok kis száma miatt a kezdeti készletben.
A cerebrospinális folyadékban (CSF) dúsuló motívumok eltérnek a vérben találhatóaktól. Érdekes módon az egyes állatok vérében figyeltük meg az első eltolódást a glicinben gazdag peptidek felé. (1g. ábra, 4e., 4f. kiegészítő ábrák). A glicinben gazdag peptideket tartalmazó fágok stabilabbak lehetnek, és kisebb valószínűséggel kerülnek ki a keringésből. Ezeket a glicinben gazdag peptideket azonban nem mutatták ki az agy-gerincvelői folyadék mintákban, ami arra utal, hogy a kurált könyvtárak két különböző szelekciós lépésen mentek keresztül: az egyik a vérben, a másik pedig az agy-gerincvelői folyadékban halmozódott fel. A negyedik szelekciós körből származó, CSF-ben dúsított klónokat széles körben tesztelték. Az egyedileg tesztelt klónok szinte mindegyikéről megerősítést nyert, hogy CSF-ben dúsult a vak kontroll fághoz képest. Egy peptidtalálatot (#2077) részletesebben vizsgáltunk meg. Hosszabb plazma felezési időt mutatott a többi találathoz képest (3d. ábra és 7. kiegészítő ábra), és érdekes módon ez a peptid cisztein aminosavat tartalmazott a C-terminálison. Nemrégiben kimutatták, hogy a cisztein hozzáadása a peptidekhez javíthatja farmakokinetikai tulajdonságaikat az albuminhoz való kötődés révén. Ez jelenleg a 2077-es peptid esetében ismeretlen, és további vizsgálatokat igényel. Egyes peptidek vegyértékfüggőséget mutattak a CSF dúsulásban (az adatokat nem mutatjuk be), ami összefüggésben lehet a T7 kapszid megjelenített felületi geometriájával. Az általunk használt T7 rendszer 5-15 példányban mutatott ki minden peptidet fágrészecskénként. IHC-t végeztünk a patkányok agykéregébe intravénásan injektált jelölt vezető fágklónokon (8. kiegészítő ábra). Az adatok azt mutatták, hogy legalább három klón (2002., 2009. és 2077. számú) kölcsönhatásba lépett a vér-agy gáttal (BBB). Még meg kell állapítani, hogy ez a BBB kölcsönhatás a CSF felhalmozódását vagy ezen klónok közvetlen mozgását eredményezi-e a BCSFB-be. Fontos, hogy megmutatjuk, hogy a kiválasztott peptidek megtartják CSF transzportkapacitásukat, amikor szintetizálódnak és a fehérjerakományhoz kötődnek. Az N-terminális biotinilezett peptidek SA-hoz való kötődése lényegében megismétli a megfelelő fágklónokkal vérben és agy-gerincvelői folyadékban kapott eredményeket (3e. ábra). Végül bemutatjuk, hogy a 2077-es számú vezető peptid képes elősegíteni egy SA-hoz konjugált BACE1 biotinilezett peptidgátló agyi hatását, kifejezett farmakodinámiás hatásokat okozva a központi idegrendszerben azáltal, hogy jelentősen csökkenti az Abeta40 szintet a cerebrospinális folyadékban (4. ábra). Nem tudtunk homológokat azonosítani az adatbázisban az összes találat peptidszekvencia-homológia keresésével. Fontos megjegyezni, hogy a T7 könyvtár mérete körülbelül 109, míg a 12-merek elméleti könyvtármérete 4 x 1015. Ezért a 12-mer peptidkönyvtár diverzitási terének csak egy kis részét választottuk ki, ami azt jelentheti, hogy optimalizáltabb peptidek azonosíthatók ezen azonosított találatok szomszédos szekvenciaterének kiértékelésével. Elméletileg az egyik oka annak, hogy nem találtuk meg ezen peptidek természetes homológjait, az evolúció során végrehajtott deszelekció lehet, amelynek célja bizonyos peptidmotívumok ellenőrizetlen bejutásának megakadályozása az agyba.
Összefoglalva, eredményeink alapot nyújtanak a jövőbeli munkához, amelynek célja az agyi érrendszeri gát transzportrendszereinek részletesebb azonosítása és jellemzése in vivo. A módszer alapvető felépítése egy funkcionális szelekciós stratégián alapul, amely nemcsak az agyi érrendszerhez kötődő tulajdonságokkal rendelkező klónokat azonosítja, hanem egy kritikus lépést is tartalmaz, amelyben a sikeres klónok belső aktivitással rendelkeznek a biológiai gátak in vivo átjutására a központi idegrendszeri rekeszbe. Célja ezen peptidek transzportmechanizmusának és az agyi régióra jellemző mikroérrendszerhez való kötődésük preferenciájának tisztázása. Ez új útvonalak felfedezéséhez vezethet a vér-agy gát (BBB) ​​és a receptorok transzportjához. Várhatóan az azonosított peptidek közvetlenül kötődhetnek az agyi érrendszeri receptorokhoz vagy a BBB-n vagy a BCSFB-n keresztül szállított keringő ligandumokhoz. Az ebben a munkában felfedezett, CSF transzportaktivitással rendelkező peptidvektorokat tovább vizsgáljuk. Jelenleg vizsgáljuk ezen peptidek agyspecificitását a BBB-n és/vagy a BCSFB-n való átjutási képességük szempontjából. Ezek az új peptidek rendkívül értékes eszközök lesznek új receptorok vagy útvonalak potenciális felfedezéséhez, valamint új, nagy hatékonyságú platformok fejlesztéséhez a makromolekulák, például biológiai készítmények agyba juttatásához.
A korábban leírt módszer módosításával kanüláljuk a nagy ciszternát (CM). Altatott Wistar patkányokat (200-350 g) szereltünk egy sztereotaxiás készülékre, és a leborotvált és aszeptikusan előkészített fejbőrön középső bemetszést ejtettünk, hogy a koponya láthatóvá váljon. Fúrtunk két lyukat a felső szár területén, és rögzítettük a rögzítőcsavarokat a lyukakba. Egy további lyukat fúrtunk az oldalsó nyakszirtcsont taréján a rozsdamentes acél kanül CM-be történő sztereotaxiás vezetéséhez. Vigyünk fel fogászati ​​cementet a kanül köré, és rögzítsük csavarokkal. A fotokeményítés és a cement megszilárdulása után a bőrsebet 4/0-s supramid varrattal zártuk. A kanül megfelelő elhelyezését az agy-gerincvelői folyadék (CSF) spontán szivárgása igazolja. A patkányt eltávolítottuk a sztereotaxiás készülékből, megfelelő posztoperatív ellátásban és fájdalomcsillapításban részesítettük, és legalább egy hétig hagytuk felépülni, amíg vér jelei nem figyelhetők meg az agy-gerincvelői folyadékban. A Wistar patkányokat (Crl:WI/Han) a Charles Rivertől (Franciaország) szereztük be. Minden patkányt meghatározott, kórokozómentes körülmények között tartottak. Minden állatkísérletet a svájci Bázel Város Állatorvosi Hivatala hagyott jóvá, és a 2474-es számú állatengedélynek (Az aktív agyi transzport felmérése a terápiás jelöltek szintjének mérésével a patkány cerebrospinális folyadékában és agyában) megfelelően végeztek.
Óvatosan tartsuk éber állapotban a patkányt a CM-kanüllel a kezében. Távolítsuk el a Datura-t a kanülből, és gyűjtsünk 10 µl spontán áramló agy-gerincvelői folyadékot. Mivel a kanül átjárhatósága végül veszélybe került, csak tiszta, vérszennyeződésre vagy elszíneződésre utaló jeleket nem mutató agy-gerincvelői folyadékmintákat vontunk be ebbe a vizsgálatba. Ezzel párhuzamosan körülbelül 10–20 μl vért vettünk a farokvégen lévő kis bemetszésből heparint (Sigma-Aldrich) tartalmazó csövekbe. A cerebrospinális folyadékot és a vért a T7 fág intravénás injekciója után különböző időpontokban gyűjtöttük. Minden egyes cerebrospinális folyadékminta gyűjtése előtt körülbelül 5–10 μl folyadékot távolítottunk el, ami megfelel a katéter holt térfogatának.
A könyvtárakat a T7Select 10-3b vektorral hoztuk létre, a T7Select rendszer kézikönyvében leírtak szerint (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Röviden, egy véletlenszerű 12-mer DNS-inszertet szintetizáltunk a következő formátumban:
Az NNK kodont a kettős stop kodonok és az aminosav-túltermelés elkerülése érdekében használtuk az inszertben. N az egyes nukleotidok manuálisan kevert ekvimoláris aránya, K pedig az adenin és citozin nukleotidok manuálisan kevert ekvimoláris aránya. Az egyszálú régiókat kétszálú DNS-sé alakítottuk át további dNTP-vel (Novagen) és Klenow enzimmel (New England Biolabs) történő inkubálással Klenow pufferben (New England Biolabs) 3 órán át 37°C-on. A reakció után a kétszálú DNS-t EtOH-s kicsapással kinyertük. A kapott DNS-t EcoRI és HindIII restrikciós enzimekkel emésztettük (mindkettő a Roche-tól). A hasított és tisztított (QIAquick, Qiagen) inszertet (T4 ligáz, New England Biolabs) ezután keretben ligáltuk egy előre hasított T7 vektorba a 10B kapszid gén 348. aminosava után. A ligációs reakciókat 16°C-on inkubáltuk 18 órán át az in vitro csomagolás előtt. Az in vitro fágcsomagolást a T7Select 10-3b klónozókészlethez (Novagen) mellékelt utasítások szerint végeztük, és a csomagolóoldatot egyszer amplifikáltuk lízisig Escherichia coli (BLT5615, Novagen) segítségével. A lizátumokat centrifugáltuk, titráltuk, majd -80°C-on lefagyasztottuk glicerin törzsoldatként.
A fág variábilis régióinak közvetlen PCR amplifikációja táplevesben vagy lemezen, saját fejlesztésű 454/Roche-amplikon fúziós primerekkel. Az előre irányuló fúziós primer a variábilis régiót (NNK) 12 (templátspecifikus), a GS FLX Titanium Adapter A-t és egy négybázisú könyvtári kulcsszekvenciát (TCAG) szegélyező szekvenciákat tartalmazza (1a. kiegészítő ábra):
A reverz fúziós primer biotint is tartalmaz, amely a befogógyöngyökhöz van kötve, valamint a GS FLX Titanium Adapter B-t, amely az emulziós PCR során a klonális amplifikációhoz szükséges:
Az amplikonokat ezután 454/Roche piroszekvenálással vizsgáltuk a 454 GS-FLX Titanium protokoll szerint. A manuális Sanger-szekvenáláshoz (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) a T7 fág DNS-t PCR-rel amplifikáltuk, és a következő primerpárokkal szekvenáltuk:
Az egyes plakkokból származó inszerteket PCR amplifikációnak vetettük alá a Roche Fast Start DNS polimeráz készlet segítségével (a gyártó utasításai szerint). Végeztünk el egy hot startot (10 perc 95 °C-on) és 35 boost ciklust (50 másodperc 95 °C-on, 1 perc 50 °C-on és 1 perc 72 °C-on).
A könyvtárakból származó fágokat, a vad típusú fágokat, a cerebrospinális folyadékból és vérből mentett fágokat, vagy az egyes klónokat Escherichia coli BL5615 baktériumban amplifikáltuk TB táptalajban (Sigma Aldrich) vagy 500 cm2-es csészékben (Thermo Scientific) 4 órán át 37°C-on. A fágokat a lemezekről Tris-EDTA pufferrel (Fluka Analytical) történő öblítéssel vagy a plakkok steril pipettahegyekkel történő összegyűjtésével extraháltuk. A fágokat a tenyészet felülúszójából vagy az extrakciós pufferből polietilén-glikollal (PEG 8000) kicsapással (Promega) izoláltuk, majd Tris-EDTA pufferben reszuszpendáltuk.
Az amplifikált fágot 2-3 endotoxin eltávolítási ciklusnak vetettük alá endotoxin eltávolító gyöngyök (Miltenyi Biotec) segítségével az intravénás (IV) injekció (500 μl/állat) előtt. Az első körben 2×1012 fágot, a másodikban 2×1010 fágot, a harmadik és negyedik szelekciós körben pedig 2×109 fágot juttattunk be állatonként. A jelzett időpontokban gyűjtött cerebrospinális folyadék (CSF) és vérminták fágtartalmát plakkszámlálással határoztuk meg a gyártó utasításai szerint (T7Select rendszer kézikönyve). A fágszelekciót tisztított könyvtárak intravénás injekciójával végeztük a farokvénába, vagy az előző szelekciós körből a CSF-ből kivont fágok újbóli injekciózásával, majd a további begyűjtéseket a CSF- és vérminták 10., 30., 60., 90., 120., 180. és 240. percében végeztük. Összesen négy in vivo pásztázási kört végeztek, amelyek során a két kiválasztott ágat külön tárolták és elemezték az első három szelekciós körben. Az első két szelekciós körben a CSF-ből kivont összes fágbetétet 454/Roche piroszekvenálással hajtották végre, míg az utolsó két szelekciós körben a CSF-ből kivont összes klónt manuálisan szekvenálták. Az első szelekciós körben használt összes vérfágot szintén 454/Roche piroszekvenálással hajtották végre. A fágklónok injektálásához a kiválasztott fágokat E. coliban (BL5615) amplifikálták 500 cm2-es lemezeken 37°C-on 4 órán át. Az egyenként kiválasztott és manuálisan szekvenált klónokat TB-táptalajban szaporították. A fágextrakció, tisztítás és az endotoxin eltávolítása (a fent leírtak szerint) után 2×1010 fágot/állatot 300 μl-ben intravénásan injektáltak az egyik farokvénába.
Szekvenciaadatok előfeldolgozása és kvalitatív szűrése. A nyers 454/Roche adatokat bináris standard stream map formátumból (sff) Pearson ember által olvasható formátumba (fasta) konvertáltuk egy gyártói szoftver segítségével. A nukleotidszekvencia további feldolgozását saját C programok és szkriptek (kiadatlan szoftvercsomag) segítségével végeztük az alábbiakban leírtak szerint. Az elsődleges adatok elemzése szigorú, többlépcsős szűrési eljárásokat foglal magában. Az érvényes 12-mer inszert DNS-szekvenciát nem tartalmazó leolvasások kiszűrése érdekében a leolvasásokat szekvenciálisan illesztettük a start címkéhez (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), a stop címkéhez (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) és a háttér inszerthez (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) a globális Needleman-Wunsch teszt segítségével. Az illesztés legfeljebb 2 inkonzisztenciát engedett meg illesztésenként31. Ezért a start és stop címkék nélküli leolvasásokat, valamint a háttér inszerteket tartalmazó leolvasásokat, azaz a megengedett eltérések számát meghaladó illesztéseket eltávolítottuk a könyvtárból. Ami a fennmaradó leolvasásokat illeti, az N-mer DNS-szekvenciát, amely a startjeltől a stopjel előtt ér véget, kivágták az eredeti leolvasási szekvenciából, és tovább feldolgozták (a továbbiakban: „inszert”). Az inszert transzlációja után az első stop kodon utáni részt a primer 5’ végén eltávolították az inszertből. Ezenkívül a primer 3’ végén található hiányos kodonokhoz vezető nukleotidokat is eltávolították. A csak háttérszekvenciákat tartalmazó inszerteket kizárva a „PAG” aminosav-mintázattal kezdődő transzlált inszerteket is eltávolították. A 3 aminosavnál rövidebb poszttranszlációs hosszúságú peptideket eltávolították a könyvtárból. Végül eltávolították a redundanciát az inszertkészletben, és meghatározták az egyes inszertek gyakoriságát. Az elemzés eredményei között szerepelt a nukleotidszekvenciák (inszertek) listája és azok (olvasási) gyakorisága (1c. és 2. kiegészítő ábra).
N-mer DNS-beillesztések csoportosítása szekvencia-hasonlóság szerint: A 454/Roche-specifikus szekvenálási hibák (például a szekvenálási homopolimer kiterjesztésekkel kapcsolatos problémák) kiküszöbölése és a kevésbé fontos redundanciák eltávolítása érdekében a korábban szűrt N-mer DNS-szekvencia-beillesztéseket (beillesztéseket) hasonlóság szerint rendezzük. A beillesztéseket (legfeljebb 2 nem egyező bázis megengedett) egy iteratív algoritmus segítségével, amely a következőképpen van definiálva: a beillesztéseket először a gyakoriságuk (a legmagasabbtól a legalacsonyabbig) szerint rendezzük, és ha azonosak, akkor a hosszuk szerinti másodlagos rendezésük (a leghosszabbtól a legrövidebbig) szerint. Így a leggyakoribb és leghosszabb beillesztések határozzák meg az első „csoportot”. A csoport gyakoriságát a kulcsgyakoriságra állítjuk be. Ezután a rendezett listában maradt minden beillesztést megpróbáltunk hozzáadni a csoporthoz páros Needleman-Wunsch igazítással. Ha az eltérések, beillesztések vagy deléciók száma egy igazításban nem haladja meg a 2-es küszöbértéket, akkor egy beillesztést adunk a csoporthoz, és a teljes csoportgyakoriságot a beillesztések hozzáadásának gyakoriságával növeljük. A csoporthoz hozzáadott beillesztéseket használtként jelöljük meg, és kizárjuk a további feldolgozásból. Ha az inszertált szekvencia nem adható hozzá egy már létező csoporthoz, akkor az inszertált szekvenciát egy új csoport létrehozására használják fel a megfelelő inszertálási gyakorisággal, és felhasználtként jelölik meg. Az iteráció akkor ér véget, amikor minden inszertált szekvenciát vagy felhasználtak egy új csoport létrehozására, vagy beilleszthetők egy már létező csoportba. Végül is a nukleotidokból álló csoportosított inszertek végül peptidszekvenciákká (peptidkönyvtárakká) fordítódnak le. Ennek az elemzésnek az eredménye az inszerciók és a hozzájuk tartozó gyakoriságok halmaza, amelyek az egymást követő leolvasások számát alkotják (2. kiegészítő ábra).
Motívumgenerálás: Az egyedi peptidek listája alapján létrehoztunk egy könyvtárat, amely az összes lehetséges aminosav-mintázatot (aa) tartalmazza, az alábbiak szerint. Minden egyes 3 hosszúságú lehetséges mintázatot kivontunk a peptidből, és hozzáadtuk az inverz mintázatát egy közös motívumkönyvtárral együtt, amely az összes mintázatot (tripeptideket) tartalmazta. A sokszor ismétlődő motívumokat tartalmazó könyvtárakat szekvenáltuk, és eltávolítottuk a redundanciát. Ezután a motívumkönyvtárban található minden egyes tripeptid esetében számítógépes eszközök segítségével ellenőriztük a jelenlétét a könyvtárban. Ebben az esetben a talált motívum tripeptidet tartalmazó peptid gyakoriságát hozzáadtuk, és hozzárendeltük a motívumkönyvtárban lévő motívumhoz („motívumok száma”). A motívumgenerálás eredménye egy kétdimenziós tömb, amely tartalmazza a tripeptidek (motívumok) összes előfordulását és azok értékeit, amelyek a megfelelő motívumot eredményező szekvenálási leolvasások száma, amikor a leolvasásokat szűrtük, csoportosítottuk és lefordítottuk. A metrikák a fent részletesen leírtak szerint.
A motívumok számának és a megfelelő szóródási diagramok normalizálása: Az egyes minták motívumainak számát a következővel normalizáltuk:
ahol ni az i témát tartalmazó leolvasások száma. Így vi az i motívumot tartalmazó leolvasások (vagy peptidek) százalékos gyakoriságát jelenti a mintában. A nem normalizált motívumszám P-értékeit Fisher-féle egzakt teszttel számítottuk. A motívumok számának korrelogramjaival kapcsolatban Spearman-féle korrelációkat számítottunk ki a normalizált motívumszám és az R érték felhasználásával.
A peptidkönyvtár minden pozíciójában található aminosavak tartalmának vizualizálásához a 32. és 33. weblogogramokat (http://weblogo.threeplusone.com) hozták létre. Először a 12-mer peptid minden pozíciójában található aminosavak tartalmát egy 20×12-es mátrixban tárolták. Ezután 1000, azonos relatív aminosav-tartalmú peptidet generáltak fasta-szekvencia formátumban, és bemenetként szolgáltatták a web-logo 3-nak, amely grafikusan ábrázolja az adott peptidkönyvtár minden pozíciójában található relatív aminosav-tartalmat. A többdimenziós adatkészletek vizualizálásához hőtérképeket készítettek egy belsőleg fejlesztett R eszközzel (biosHeatmap, egy még kiadatlan R csomag). A hőtérképeken bemutatott dendrogramokat Ward hierarchikus klaszterezési módszerével és euklideszi távolságmetrikával számították ki. A motívumpontozási adatok statisztikai elemzéséhez a nem normalizált pontozás P-értékeit Fisher-féle egzakt teszttel számították ki. A többi adathalmaz P-értékeit R-ben Student-féle t-próbával vagy ANOVA-val számítottuk ki.
A kiválasztott fágklónokat és az inszert nélküli fágokat intravénásan injektáltuk a farokvénán keresztül (2×1010 fág/állat 300 μl PBS-ben). Tíz perccel a perfúzió és az azt követő fixálás előtt ugyanazon állatokba 100 μl DyLight594-gyel jelölt lektint (Vector Laboratories Inc., DL-1177) injektáltunk intravénásan. A fáginjekció után 60 perccel a patkányokat 50 ml PBS-sel, majd 50 ml 4%-os PFA/PBS-sel perfundáltuk a szíven keresztül. Az agymintákat ezenkívül egy éjszakán át fixáltuk 4%-os PFA/PBS-ben, majd egy éjszakán át 30%-os szacharózban áztattuk 4°C-on. A mintákat gyorsfagyasztottuk az OCT keverékben. A fagyasztott minták immunhisztokémiai elemzését szobahőmérsékleten végeztük 30 µm-es krioszekciókon, amelyeket 1%-os BSA-val blokkoltunk, és 4°C-on inkubáltunk T7 fág (Novus NB 600-376A) elleni poliklonális FITC-vel jelölt antitestekkel. Egy éjszakán át inkubáltuk. Végül a metszeteket háromszor mostuk PBS-sel, és konfokális lézermikroszkóppal (Leica TCS SP5) vizsgáltuk.
Minden legalább 98%-os tisztaságú peptidet a GenScript USA szintetizált, biotinnal kezelt és liofilizált. A biotin egy további tripla glicin spaceren keresztül kötődik az N-terminálishoz. Az összes peptidet tömegspektrometriával ellenőrizzük.
A sztreptavidint (Sigma S0677) ötszörös ekvimoláris feleslegben lévő biotinilált peptiddel, biotinilált BACE1 gátló peptiddel vagy biotinilált BACE1 gátló peptid és BACE1 gátló peptid kombinációjával (3:1 arány) keverték 5–10%-os DMSO-ban, majd PBS-ben inkubálták. Az injekció beadása előtt 1 órán át szobahőmérsékleten inkubálták. A sztreptavidinnal konjugált peptideket 10 mg/kg dózisban intravénásan injektálták agyüreggel rendelkező patkányok egyik farokvénájába.
A streptavidin-peptid komplexek koncentrációját ELISA-val határoztuk meg. Nunc Maxisorp mikrotiter lemezeket (Sigma) vontunk be 4°C-on egy éjszakán át 1,5 μg/ml egér anti-streptavidin antitesttel (Thermo, MA1-20011). A blokkolás (blokkoló puffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% zselatin, 1% BSA) után a lemezt 0,05% Tween-20/PBS-sel (mosó puffer) mostuk 3 másodpercig, majd a blokkoló pufferrel hígított kutakba (plazma 1:10 000, CSF 1:115) CSF és plazma mintákat adtunk. A lemezt ezután egy éjszakán át 4°C-on inkubáltuk a detektáló antitesttel (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Három mosási lépés után a sztreptavidint TMB szubsztrát oldatban (Roche) történő inkubációval detektáltuk, legfeljebb 20 percig. Miután a színfejlődést 1M H2SO4-dal leállítottuk, mérjük az abszorbanciát 450 nm-en.
A streptavidin-peptid-BACE1 inhibitor komplex funkcióját Aβ(1-40) ELISA-val értékeltük a gyártó protokollja szerint (Wako, 294-64701). Röviden, a CSF mintákat standard hígítószerben (1:23) hígítottuk, és egy éjszakán át 4°C-on inkubáltuk 96 lyukú lemezeken, amelyeket BNT77 befogó antitesttel vontunk be. Öt mosási lépés után HRP-konjugált BA27 antitestet adtunk hozzá, és 2 órán át 4°C-on inkubáltuk, majd öt mosási lépést végeztünk. Az Aβ(1-40)-et TMB oldatban, 30 percig, szobahőmérsékleten történő inkubálással detektáltuk. Miután a színfejlődést leállító oldattal leállítottuk, mérjük az abszorbanciát 450 nm-en. A plazma mintákat szilárd fázisú extrakciónak vetettük alá az Aβ(1-40) ELISA előtt. A plazmát 0,2%-os DEA-hoz (Sigma) adtuk 96 lyukú lemezeken, és szobahőmérsékleten 30 percig inkubáltuk. Miután az SPE lemezeket (Oasis, 186000679) egymás után vízzel és 100%-os metanollal mostuk, plazma mintákat adtunk az SPE lemezekhez, és az összes folyadékot eltávolítottuk. A mintákat mostuk (először 5%-os metanollal, majd 30%-os metanollal), és 2%-os NH4OH/90%-os metanol eleggyel eluáltuk. Miután az eluátumot 55°C-on 99 percig állandó N2 áram mellett szárítottuk, a mintákat standard hígítóoldatokban redukáltuk, és az Aβ(1–40) szintet a fent leírtak szerint mértük.
Hogyan idézzük ezt a cikket: Urich, E. et al. Áruszállítás az agyba in vivo azonosított tranzitpeptidek segítségével. The Science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB és Moos T. Makromolekuláris gyógyszerek agyba juttatása célzott terápiával. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. és Martinez-Martinez, P. Peptid és fehérje gyógyszerek bejuttatása a vér-agy gáton keresztül. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneumobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM A vér-agy gát: szűk keresztmetszet az agyi gyógyszerfejlesztésben. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, és Byrd, A. A choroidea plexus-CSF útvonalon keresztül az agyba történő jobb gyógyszeradagolás és célzott eljuttatás kilátásai. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM: Biofarmakonok modernizálása molekuláris trójai falókkal az agyba juttatáshoz. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptor által közvetített peptidtranszport a vér-agy gáton keresztül. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. és munkatársai: Terápiás antitestek agyi penetrációjának és hatékonyságának növelése monovalens molekuláris ingajáratok segítségével. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. és munkatársai. A transzferrin receptor (TfR) transzportja határozza meg a TfR antitestek affinitási variánsainak agyi felvételét. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).