Egyes LC hibaelhárítási témakörök soha nem elavultak, mivel az LC gyakorlatban vannak problémák, még akkor is, ha a műszertechnológia idővel javul. Számos módja van annak, hogy az LC-rendszerben problémák merüljenek fel, és a csúcsok rossz alakjába kerüljenek. Ha a csúcs alakjával kapcsolatos problémák merülnek fel, az eredmények lehetséges okainak rövid listája leegyszerűsíti a hibaelhárítási tapasztalatainkat.
Jó móka volt ezt az „LC Troubleshooting” rovatot megírni, és minden hónapban átgondolni a témákat, mert egyes témák sosem mennek ki a divatból. Míg a kromatográfiás kutatás területén bizonyos témák vagy ötletek elavulnak, mivel felváltják őket újabb és jobb ötletek, addig a hibaelhárítás terén, amióta ebben a folyóiratban megjelent az első hibaelhárítási cikk (az LC Journal néhány évében,19 még mindig)3. A folyadékkromatográfiát (LC) érintő kortárs trendekre fókuszáltam több LC-hibaelhárítási részt (például a nyomás visszatartásra gyakorolt ​​hatásának relatív összehasonlítása [2] Új fejlesztések) Az LC-eredmények értelmezése és a modern LC-műszerekkel való hibaelhárítás. LC hibaelhárítás — olyan elemek, amelyek minden hibaelhárítóhoz kiválóan alkalmasak, elengedhetetlenek, függetlenül az általunk használt rendszer korától.A sorozat fő témája nagyon releváns az LCGC híres „LC Troubleshooting Guide” falitáblázata (4) szempontjából, amely számos laboratóriumban lóg. A sorozat harmadik részében úgy döntöttem, hogy azokra a problémákra összpontosítok, amelyek a csúcsformák, a falak lehetséges okainak listája4. Ezeket a kérdéseket nem tudjuk egy cikkben részletesen megvizsgálni, ezért a témának ebben az első részében a leggyakrabban látottak közül néhányra összpontosítok. Remélem, hogy a fiatal és idős LC-felhasználók hasznos tippeket és emlékeztetőket találnak ebben a fontos témában.
Azon kapom magam, hogy egyre gyakrabban válaszolok a hibaelhárítási kérdésekre úgy, hogy „bármi lehetséges”. Ez a válasz könnyűnek tűnhet, ha nehezen értelmezhető megfigyeléseket veszünk figyelembe, de gyakran helyénvalónak tartom. A rossz csúcsformák sok lehetséges oka miatt fontos, hogy nyitottak legyünk annak mérlegelésekor, hogy mi lehet a probléma, és a lehetséges okok fontossági sorrendbe állítása a legfontosabb hibaelhárítási erőfeszítéseink megkezdéséhez.
Bármilyen hibaelhárítási gyakorlat kulcsfontosságú lépése – de szerintem alulértékelt – annak felismerése, hogy van egy probléma, amelyet meg kell oldani. A probléma felismerése gyakran azt jelenti, hogy felismerjük, hogy ami az eszközzel történik, az eltér elvárásainktól, amelyeket az elmélet, az empirikus tudás és a tapasztalat alakít (5). él, farok stb.), hanem a szélességre is. A tényleges csúcsformára vonatkozó elvárásaink egyszerűek. A (6) elmélet jól alátámasztja azt a tankönyvi elvárást, hogy a legtöbb esetben a kromatográfiás csúcsoknak szimmetrikusaknak kell lenniük, és meg kell felelniük a Gauss-eloszlás alakjának, amint az 1a. ábrán látható. A megfigyelt csúcsok szélességétől való elvárás egy összetettebb kérdés, a másik témában az ábra egy másik lehetőség, amelyről a jövőben szó lesz. – más szóval, néhány mód, ahogyan a dolgok rosszul sülhetnek el. A rész hátralévő részében arra fordítunk időt, hogy megvitassunk néhány konkrét példát olyan helyzetekre, amelyek ezekhez az alakzatokhoz vezethetnek.
Néha a csúcsok egyáltalán nem jelennek meg a kromatogramon, ahol várhatóan eluálódnak. A fenti fali diagram azt jelzi, hogy a csúcs hiánya (feltételezve, hogy a minta valóban olyan koncentrációban tartalmazza a megcélzott analitot, amely elegendő ahhoz, hogy a detektor válasza elegendő legyen ahhoz, hogy a zaj felett lássa) általában valamilyen műszerhibával vagy helytelen mozgófázis-körülményekkel van összefüggésben (ha egyáltalán megfigyelhető).csúcsok, általában túl „gyenge”). Az ebbe a kategóriába tartozó lehetséges problémák és megoldások rövid listája az I. táblázatban található.
Mint fentebb említettük, az a kérdés, hogy mekkora csúcsszélesedést kell tolerálni, mielőtt odafigyelnénk és megpróbálnánk megoldani, összetett téma, amelyet egy következő cikkben tárgyalok majd. Tapasztalatom szerint a jelentős csúcsszélesedés gyakran a csúcsok alakjának jelentős változásával jár együtt, és a csúcsok farokká válása gyakrabban fordul elő, mint a csúcs előtti vagy hasadás.
Ezeket a problémákat részletesen tárgyaltuk a Troubleshooting LC korábbi számaiban, és az e témák iránt érdeklődő olvasók ezekben a korábbi cikkekben tájékozódhatnak a problémák kiváltó okairól és lehetséges megoldásairól.További részletek.
A csúcsok elcsúszását, a csúcsok eloszlását és szétválását mind kémiai vagy fizikai jelenségek okozhatják, és az ezekre a problémákra kínált lehetséges megoldások listája nagyon eltérő lehet, attól függően, hogy kémiai vagy fizikai problémáról van szó. Gyakran előfordul, hogy a kromatogram különböző csúcsainak összehasonlításával fontos támpontokat találhat arra vonatkozóan, hogy melyik a tettes. csúcsok érintettek, de a többi jól néz ki, az ok valószínűleg kémiai.
A csúcsok farokképződésének kémiai okai túl bonyolultak ahhoz, hogy itt röviden megvitassuk. Az érdeklődő olvasót az „LC Troubleshooting” legutóbbi számában találja meg egy alaposabb megbeszélés érdekében (10). Könnyű azonban megpróbálni csökkenteni a befecskendezett analit tömegét, és megnézni, hogy javul-e a csúcs alakja. Ha igen, akkor ez egy jó nyom, hogy „kis mértékben túlterheljük a problémát”. es, vagy a kromatográfiás körülményeket úgy kell változtatni, hogy nagyobb tömegek injektálása esetén is jó csúcsformákat lehessen elérni.
Számos lehetséges fizikai oka is lehet a csúcs-maradékképződésnek. A lehetőségek részletes megbeszélése iránt érdeklődő olvasókat az „LC Troubleshooting” (11) egy másik közelmúltbeli számában találja. A csúcskiütés egyik leggyakoribb fizikai oka az injektor és a detektor közötti rossz kapcsolat (12). Egy szélsőséges példa látható az 1d. ábrán, amelyet a laboratóriumomban szereztem be, néhány héttel ezelőtt egy új befecskendezési rendszerrel telepítettük. p érvéghüvellyel, amelyet egy rozsdamentes acél kapillárisra öntöttek. Néhány kezdeti hibaelhárítási kísérlet után rájöttünk, hogy a befecskendezőszelep állórészének nyílásmélysége sokkal mélyebb volt, mint korábban megszokhattuk, ami nagy holttérfogatot eredményez a nyílás alján. Ez a probléma könnyen megoldható, ha az injektáló hurkot egy másik csőre cseréljük, és a nyíláson a megfelelő térfogatot tudjuk beállítani.
Az 1e. ábrán látható csúcsfrontokat fizikai vagy kémiai problémák is okozhatják. Az elülső él gyakori fizikai oka az, hogy az oszlop részecskeágya nincs jól megtömve, vagy a részecskék idővel újraszerveződtek. Ahogyan az e fizikai jelenség okozta csúcsmaradékok esetében is, a legjobb megoldás az oszlop cseréje és továbblépés. (lineáris) körülmények között az állófázis által visszatartott analit mennyisége (tehát a retenciós tényező) lineárisan összefügg az analit oszlopban lévő koncentrációjával. Kromatográfiásan ez azt jelenti, hogy az oszlopba injektált analit tömegének növekedésével a csúcs magasabb lesz, de nem tágabb. Ez a kapcsolat megszakad, ha a retenciós viselkedés magasabb, de nem csak szélesebb a tömeg, de nem csak szélesebb a retenciós viselkedés. emellett a nemlineáris alakzatok határozzák meg a kromatográfiás csúcsok alakját, ami bevezető vagy lefutó éleket eredményez. A csúcs farokképződését okozó tömegtúlterheléshez hasonlóan (10), a nemlineáris retenció okozta csúcseltolódás is diagnosztizálható a befecskendezett analit tömegének csökkentésével. Ha a csúcs alakja javul, a módszert módosítani kell, hogy ne haladja meg a kromatográfiás körülményeket, vagy módosítani kell az elülső élt okozó viselkedést.
Néha megfigyeljük azt, ami „hasadt” csúcsnak tűnik, amint azt az 1f. ábra mutatja. A probléma megoldásának első lépése annak meghatározása, hogy a csúcs alakja a részleges koelúciónak köszönhető-e (azaz két különálló, de szorosan eluálódó vegyület jelenléte). Ha valójában két különböző analit eluálódik egymáshoz közel, akkor ezeknek a felbontóképességének javításáról van szó (például a látszólagos csúcsok megvilágításával, a szelektivitással kapcsolatos lemezek újraszámlálásával). a formációnak semmi köze magához az oszlophoz. Gyakran a legfontosabb támpont ehhez a döntéshez az, hogy a kromatogram összes csúcsa hasított-e, vagy csak egy vagy kettő. Ha csak egy vagy kettő, akkor valószínűleg társelúciós probléma;ha minden csúcs fel van osztva, akkor valószínűleg fizikai probléma, valószínűleg magával az oszloppal kapcsolatos.
Az oszlop fizikai tulajdonságaival kapcsolatos megosztott csúcsok általában a részlegesen blokkolt bemeneti vagy kimeneti fritteknek, vagy az oszlopban lévő részecskék átrendeződésének tulajdoníthatók, ami lehetővé teszi a mozgófázis gyorsabb áramlását, mint a mozgófázis az oszlopcsatorna-képződés bizonyos területein .más régiókban (11). A részlegesen eltömődött fritt néha az oszlopon keresztüli áramlás megfordításával eltávolítható;azonban tapasztalataim szerint ez általában rövid távú, nem pedig hosszú távú megoldás. Ez gyakran végzetes lehet a modern oszlopoknál, ha a részecskék az oszlopon belül rekombinálódnak. Ezen a ponton a legjobb, ha kicseréljük az oszlopot, és folytatjuk.
Az 1g. ábrán látható csúcs, amely szintén egy nemrégiben a saját laboromból származik, általában azt jelzi, hogy a jel olyan magas, hogy elérte a választartomány felső határát. Optikai abszorbancia detektorok (ebben az esetben UV-vis) esetén, amikor az analit koncentrációja nagyon magas, az analit elnyeli a detektor áramlási celláján áthaladó fény nagy részét, így nagyon kevés fényt hagy az elektromos jel által érzékelni. , mint a szórt fény és a „sötét áram”, így a jel nagyon „homályos” megjelenésű és független az analit koncentrációjától.Ha ez megtörténik, a probléma gyakran könnyen megoldható az analit injektált térfogatának csökkentésével – az injekció térfogatának csökkentésével, a minta hígításával vagy mindkettővel.
A kromatográfiás iskolában a detektor jelét (azaz a kromatogram y tengelyét) használjuk a minta analitkoncentrációjának indikátoraként. Így hát furcsának tűnik nulla alatti jelű kromatogramot látni, mivel az egyszerű értelmezés szerint ez negatív analitkoncentrációt jelez – ami persze fizikailag nem lehetséges. Tapasztalataim szerint leggyakrabban negatív detektorok észlelik az optikai detektorokat.
Ebben az esetben a negatív csúcs egyszerűen azt jelenti, hogy az oszlopról eluálódó molekulák kevesebb fényt nyelnek el, mint maga a mozgófázis közvetlenül a csúcs előtt és után. Ez például akkor fordulhat elő, ha viszonylag alacsony detektálási hullámhosszokat (<230 nm) használnak, és olyan mobilfázisú adalékanyagokat használnak, amelyek a legtöbb fényt ezeken a hullámhosszakon nyelték el. Ilyen adalékok lehetnek például a mobilfázis-oldó- vagy acetát-komponensek. negatív csúcsokat a kalibrációs görbe elkészítéséhez és a pontos kvantitatív információk megszerzéséhez, ezért önmagában nincs alapvető ok elkerülni őket (ezt a módszert néha „közvetett UV-detektálásnak” is nevezik) (13). Ha azonban valóban el akarjuk kerülni a negatív csúcsokat, akkor abszorbancia-detektálás esetén a legjobb megoldás az, hogy más detektálási hullámhosszt használunk, mint a mozgófázis összetétele, így a mozgó fázis összetétele kevésbé változtatja meg a fényelnyelést, mint az analógiát. lytes.
Negatív csúcsok törésmutató (RI) detektáláskor is megjelenhetnek, ha a mintában lévő analittól eltérő komponensek, például az oldószer mátrix törésmutatója eltér a mozgófázis törésmutatójától. Ez történik UV-vis detektálással is, de ez a hatás az RI-detektáláshoz képest gyengül. Mindkét esetben a negatív minta összetételének összetétele a mobilfázis összetételének megfelelőbb minimalizálásával minimalizálható.
Az LC hibaelhárítás alaptémájával foglalkozó harmadik részben olyan helyzeteket taglaltam, amelyekben a megfigyelt csúcs alakja eltér a várt vagy normál csúcsformától. Az ilyen problémák hatékony hibaelhárítása a várható csúcsformák ismeretével kezdődik (az elmélet vagy a meglévő módszerek korábbi tapasztalatai alapján), így az ettől az elvárásoktól való eltérés nyilvánvaló. .E részletek ismerete jó kiindulópont a hibaelhárítás megkezdéséhez, de nem ragad meg minden lehetőséget. Az okok és megoldások részletesebb felsorolása iránt érdeklődő olvasók az LCGC „LC hibaelhárítási útmutató” fali táblázatát találhatják meg.
(4) LCGC „LC Troubleshooting Guide” fali táblázat. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Signal Processing in Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF és Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.