Néhány LC hibaelhárítási téma sosem avul el, mivel az LC gyakorlatában mindig vannak problémák, még akkor is, ha a műszertechnológia idővel fejlődik. Sokféleképpen merülhetnek fel problémák egy LC rendszerben, és rossz csúcsalakhoz vezethetnek. Amikor a csúcsalakkal kapcsolatos problémák merülnek fel, az eredmények lehetséges okainak rövid listája segít leegyszerűsíteni a hibaelhárítási folyamatot.
Jó móka volt ezt az „LC hibaelhárítás” rovatot írni és minden hónapban témákon gondolkodni, mert vannak olyan témák, amik sosem mennek ki a divatból. Míg a kromatográfiás kutatás területén bizonyos témák vagy ötletek elavulnak, mivel újabb és jobb ötletek váltják fel őket, a hibaelhárítás területén az első hibaelhárítási cikk 1983-ban jelent meg ebben a folyóiratban (akkoriban az LC Journalban) (mivel egyes témák még mindig relevánsak)(1). Az elmúlt években számos LC hibaelhárítási részt a folyadékkromatográfiát (LC) befolyásoló kortárs trendekre összpontosítottam (például a nyomás retencióra gyakorolt ​​hatásának megértésének relatív összehasonlítása [2] Új előrelépések), az LC eredmények értelmezésére és a modern LC eszközökkel történő hibaelhárításra. Ebben a hónapban folytatom a 2021 decemberében indított sorozatomat (3), amely az LC hibaelhárítás néhány „élet-halál” témájára összpontosított – azok az elemek, amelyek nagyszerűek minden hibaelhárító számára, elengedhetetlenek, függetlenül a használt rendszer korától. A sorozat fő témája nagyban kapcsolódik az LCGC híres „LC hibaelhárítási útmutatója” faliújságjához (4), amely a falon lóg. sok laboratóriumban. A sorozat harmadik részében a csúcs alakjával vagy a csúcsjellemzőivel kapcsolatos problémákra összpontosítottam. Hihetetlen módon a fali diagram a rossz csúcs alakjának 44 különböző lehetséges okát sorolja fel! Nem tudjuk mindezeket a problémákat részletesen megvizsgálni egyetlen cikkben, ezért a téma első részében azokra fogok összpontosítani, amelyekkel a leggyakrabban találkozom. Remélem, hogy a fiatal és az idős LC-felhasználók hasznos tippeket és emlékeztetőket találnak majd ebben a fontos témában.
Egyre gyakrabban találom magam olyan válaszokkal a hibaelhárítási kérdésekre, hogy „bármi lehetséges”. Ez a válasz egyszerűnek tűnhet, ha a nehezen értelmezhető megfigyeléseket vesszük figyelembe, de én gyakran találom helyénvalónak. Mivel a gyenge csúcsformának számos lehetséges oka lehet, fontos, hogy nyitottak legyünk a probléma mérlegelésekor, és rangsoroljuk a lehetséges okokat a hibaelhárítási erőfeszítések megkezdéséhez, a leggyakoribb lehetőségekre összpontosítva. Ez a pont nagyon fontos.
Bármely hibaelhárítási gyakorlat egyik kulcsfontosságú lépése – de egy véleményem szerint alulértékelt lépés – annak felismerése, hogy van egy probléma, amelyet meg kell oldani. A probléma felismerése gyakran azt jelenti, hogy felismerjük, hogy az eszközzel történtek eltérnek az elvárásainktól, amelyeket az elmélet, az empirikus ismeretek és a tapasztalat alakít (5). Az itt említett „csúcsalak” valójában nemcsak a csúcs alakjára utal (szimmetrikus, aszimmetrikus, sima, bolyhos, belépőél, farok stb.), hanem a szélességére is. A tényleges csúcsalakra vonatkozó elvárásaink egyszerűek. Az elmélet (6) jól alátámasztja a tankönyvi elvárást, miszerint a legtöbb esetben a kromatográfiás csúcsoknak szimmetrikusnak kell lenniük, és meg kell felelniük a Gauss-eloszlás alakjának, ahogy az az 1a. ábrán látható. Amit a csúcsszélességektől várunk, az egy összetettebb kérdés, és ezt a témát egy későbbi cikkben tárgyaljuk. Az 1. ábrán látható többi csúcsalak néhány további megfigyelhető lehetőséget mutat be – más szóval, néhány módot, ahogyan a dolgok rosszul sülhetnek el. A cikk további részében időt szánunk arra, hogy megvitassunk néhány konkrét példát azokra a helyzetekre, amelyek ezekhez az alakzatokhoz vezethetnek. típusok.
Előfordul, hogy a csúcsok egyáltalán nem figyelhetők meg a kromatogramon ott, ahol várhatóan eluálódnak. A fenti fali diagram azt jelzi, hogy a csúcs hiánya (feltételezve, hogy a minta valóban tartalmazza a célanalitot olyan koncentrációban, amely elegendővé teszi a detektor válaszát ahhoz, hogy a zaj felett látható legyen) általában valamilyen műszerhibával vagy helytelen mozgófázis-feltételekkel függ össze (ha egyáltalán megfigyelhetők). A csúcsok általában túl „gyengék”. Az ebben a kategóriában lehetséges problémák és megoldások rövid listája az I. táblázatban található.
Amint azt fentebb említettük, az a kérdés, hogy milyen mértékű csúcskiszélesedést kell tolerálni, mielőtt odafigyelnénk rá és megpróbálnánk kijavítani, egy összetett téma, amelyet egy későbbi cikkben fogok tárgyalni. Tapasztalataim szerint a jelentős csúcskiszélesedést gyakran a csúcs alakjának jelentős változása kíséri, és a csúcsok elágazása gyakoribb, mint a csúcs előtti vagy a csúcsfelhasadás. A nominálisan szimmetrikus csúcsok azonban szintén kiszélesednek, aminek több különböző oka is lehet:
Ezeket a problémákat részletesen tárgyaltuk a Troubleshooting LC korábbi számaiban, és az ezek iránt érdeklődő olvasók a korábbi cikkekben tájékozódhatnak a problémák kiváltó okairól és lehetséges megoldásairól. További részletek.
A csúcsok farokképződését, a csúcsok elejének kialakulását és a felhasadást mind kémiai vagy fizikai jelenségek okozhatják, és ezeknek a problémáknak a lehetséges megoldásai széles skálán mozognak attól függően, hogy kémiai vagy fizikai problémáról van szó. Gyakran a kromatogram különböző csúcsainak összehasonlításával fontos nyomokat találhatunk arról, hogy melyik a felelős. Ha a kromatogram összes csúcsa hasonló alakú, az ok valószínűleg nem fizikai. Ha csak egy vagy néhány csúcs érintett, de a többi rendben van, az ok valószínűleg kémiai.
A csúcsok farokképződésének kémiai okai túl összetettek ahhoz, hogy itt röviden tárgyaljuk őket. Az érdeklődő olvasót a részletesebb tárgyalásért az „LC Troubleshooting” című folyóirat legutóbbi számában ajánljuk (10). Azonban egy egyszerű próbálkozás, hogy csökkentjük a befecskendezett analit tömegét, és megnézzük, javul-e a csúcs alakja. Ha igen, akkor ez jó jel arra, hogy a probléma a „tömeg túlterhelés”. Ebben az esetben a módszert kis analittömegek befecskendezésére kell korlátozni, vagy a kromatográfiás körülményeket úgy kell megváltoztatni, hogy nagyobb tömegek befecskendezése esetén is jó csúcsalakok érhetők el.
A csúcsos farokképződésnek számos fizikai oka is lehet. Azoknak az olvasóknak, akiket érdekel a lehetőségek részletes tárgyalása, ajánljuk az „LC Troubleshooting” (11) című folyóirat egy másik, nemrégiben megjelent számát. A csúcsos farokképződés egyik leggyakoribb fizikai oka a rossz csatlakozás az injektor és a detektor között (12). Egy szélsőséges példa látható az 1d. ábrán, amelyet néhány héttel ezelőtt készítettem a laboratóriumomban. Ebben az esetben egy új, korábban nem használt befecskendező szeleppel ellátott rendszert építettünk, és egy kis térfogatú befecskendező hurkot szereltünk be egy rozsdamentes acél kapillárisra öntött hüvelylel. Néhány kezdeti hibaelhárítási kísérlet után rájöttünk, hogy a befecskendező szelep állórészében a nyílás mélysége sokkal nagyobb, mint amihez hozzászoktunk, ami nagy holt térfogatot eredményezett a nyílás alján. Ez a probléma könnyen megoldható a befecskendező hurok egy másik csővel való cseréjével, a hüvelyt a megfelelő helyzetbe állíthatjuk, hogy megszüntessük a holt térfogatot a nyílás alján.
Az 1e. ábrán látható csúcsfrontokat fizikai vagy kémiai problémák is okozhatják. A felhajtóél gyakori fizikai oka, hogy az oszlop részecskeágya nincs jól becsomagolva, vagy hogy a részecskék idővel átszerveződtek. Ahogyan a fizikai jelenség okozta csúcsfarokképződésnél is, a probléma megoldásának legjobb módja az oszlop cseréje és a folyamat folytatása. Alapvetően a kémiai eredetű felhajtóél csúcsformák gyakran az úgynevezett „nemlineáris” retenciós körülményekből adódnak. Ideális (lineáris) körülmények között az állófázis által visszatartott analit mennyisége (ezért a retenciós tényező) lineárisan összefügg az analit koncentrációjával az oszlopban. Kromatográfiailag ez azt jelenti, hogy az oszlopba injektált analit tömegének növekedésével a csúcs magasabb lesz, de nem szélesebb. Ez a kapcsolat megszakad, ha a retenciós viselkedés nemlineáris, és a csúcsok nemcsak magasabbak, hanem szélesebbek is lesznek, ahogy egyre több tömeget injektálunk. Ezenkívül a nemlineáris alakok határozzák meg a kromatográfiás csúcsok alakját, ami felhajtó vagy lehajtó éleket eredményez. Ahogy a tömeg túlterhelése esetén, amely csúcsfarokképződést okoz (10), a nemlineáris retenció okozta csúcselvezetés is... a befecskendezett analit tömegének csökkentésével is diagnosztizálható. Ha a csúcs alakja javul, a módszert módosítani kell, hogy ne lépje túl a felhajtóélt okozó befecskendezési minőséget, vagy a kromatográfiás körülményeket kell megváltoztatni ennek a viselkedésnek a minimalizálása érdekében.
Néha megfigyelhetünk egy látszólagos „hasadó” csúcsot, ahogy az az 1f. ábrán látható. A probléma megoldásának első lépése annak meghatározása, hogy a csúcs alakja részleges koelúciónak (azaz két különálló, de közel eluálódó vegyület jelenlétének) köszönhető-e. Ha valójában két különböző analit eluálódik közel egymáshoz, akkor a felbontásuk javításáról van szó (például a szelektivitás, a retenció vagy a lemezszám növelésével), és a látszólagos „hasadó” csúcsok fizikai tulajdonságokkal kapcsolatosak. A teljesítménynek semmi köze magához az oszlophoz. Gyakran a legfontosabb támpont ehhez a döntéshez az, hogy a kromatogram összes csúcsa mutat-e hasadó alakot, vagy csak egy vagy kettő. Ha csak egy vagy kettő, akkor valószínűleg koelúciós probléma; ha minden csúcs hasadó, akkor valószínűleg fizikai probléma, valószínűleg magával az oszloppal kapcsolatos.
Az oszlop fizikai tulajdonságaival kapcsolatos megosztott csúcsok általában a részben elzáródott bemeneti vagy kimeneti frittek, vagy az oszlopban lévő részecskék átrendeződésének tudhatók be, ami lehetővé teszi, hogy a mozgófázis az oszlopcsatorna-képződés bizonyos területein, más régiókban gyorsabban áramoljon, mint a mozgófázis (11). A részben eltömődött fritt néha eltávolítható az oszlopon keresztüli áramlás megfordításával; tapasztalatom szerint azonban ez általában rövid, nem pedig hosszú távú megoldás. Ez a modern oszlopoknál gyakran végzetes, ha a részecskék újra egyesülnek az oszlopon belül. Ezen a ponton a legjobb kicserélni az oszlopot és folytatni a munkát.
Az 1g ábrán látható csúcs, amely szintén egy nemrégiben a saját laboromban történt esetből származik, általában azt jelzi, hogy a jel olyan magas, hogy elérte a választartomány felső határát. Optikai abszorbancia detektorok (jelen esetben UV-Vis) esetén, amikor az analit koncentrációja nagyon magas, az analit elnyeli a detektor áramlási celláján áthaladó fény nagy részét, így nagyon kevés fény marad detektálható. Ilyen körülmények között a fotodetektor elektromos jelét erősen befolyásolják a zaj különböző forrásai, például a kóválygó fény és a „sötétáram”, ami miatt a jel nagyon „homályos” megjelenésű és független az analit koncentrációjától. Amikor ez megtörténik, a probléma gyakran könnyen megoldható az analit befecskendezési térfogatának csökkentésével – a befecskendezési térfogat csökkentésével, a minta hígításával, vagy mindkettővel.
A kromatográfiás iskolában a detektorjelet (azaz a kromatogram y tengelyét) használjuk a minta analitkoncentrációjának indikátoraként. Ezért furcsának tűnik egy kromatogramot nulla alatti jellel látni, mivel az egyszerű értelmezés az, hogy ez negatív analitkoncentrációt jelez – ami természetesen fizikailag nem lehetséges. Tapasztalataim szerint a negatív csúcsokat leggyakrabban optikai abszorbanciadetektorok (pl. UV-Vis) használatakor figyeljük meg.
Ebben az esetben a negatív csúcs egyszerűen azt jelenti, hogy az oszlopból eluálódó molekulák kevesebb fényt nyelnek el, mint maga a mozgófázis közvetlenül a csúcs előtt és után. Ez például akkor fordulhat elő, ha viszonylag alacsony detektálási hullámhosszakat (<230 nm) és olyan mozgófázis-adalékokat használunk, amelyek a fény nagy részét elnyelik ezeken a hullámhosszakon. Ilyen adalékanyagok lehetnek a mozgófázis oldószerkomponensei, például a metanol, vagy pufferkomponensek, például az acetát vagy a formiát. A negatív csúcsok valójában felhasználhatók kalibrációs görbe elkészítéséhez és pontos kvantitatív információk megszerzéséhez, így nincs alapvető ok arra, hogy elkerüljük őket (ezt a módszert néha „közvetett UV-detektálásnak” is nevezik) (13). Ha azonban valóban teljesen el akarjuk kerülni a negatív csúcsokat, az abszorbancia-detektálás esetében a legjobb megoldás egy eltérő detektálási hullámhossz használata, hogy az analit többet abszorbeáljon, mint a mozgófázis, vagy a mozgófázis összetételének megváltoztatása úgy, hogy kevesebb fényt nyeljenek el, mint az analitok.
Negatív csúcsok is megjelenhetnek törésmutató (RI) detektálás esetén, ha a mintában lévő analittól eltérő komponensek, például az oldószer mátrix törésmutatója eltér a mozgófázis törésmutatójától. Ez UV-Vis detektálásnál is előfordul, de ez a hatás általában csökken az RI detektáláshoz képest. Mindkét esetben a negatív csúcsok minimalizálhatók, ha a minta mátrixának összetételét jobban összehangoljuk a mozgófázis összetételével.
A harmadik részben, amely az LC hibaelhárításának alapvető témájával foglalkozik, azokat a helyzeteket tárgyaltam, amelyekben a megfigyelt csúcs alakja eltér a várt vagy normál csúcs alakjától. Az ilyen problémák hatékony hibaelhárítása a várt csúcs alakjának ismeretével kezdődik (elméleti vagy a meglévő módszerekkel kapcsolatos korábbi tapasztalatok alapján), így az eltérések ezektől az elvárásoktól nyilvánvalóak. A csúcs alakjának problémáinak számos különböző lehetséges oka lehet (túl széles, farok, belépőél stb.). Ebben a részben részletesen tárgyalok néhányat a leggyakrabban látott okok közül. Ezen részletek ismerete jó kiindulópontot biztosít a hibaelhárításhoz, de nem öleli fel az összes lehetőséget. Azok az olvasók, akiket érdekel az okok és megoldások részletesebb listája, az LCGC „LC hibaelhárítási útmutatója” fali táblázatában találhatnak információkat.
(4) LCGC „LC hibaelhárítási útmutató” fali diagram. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Adatelemzés és jelfeldolgozás kromatográfiában (Elsevier, New York, NY, 1998), 43–96. o.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF és Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.