Köszönjük, hogy felkereste a Nature.com weboldalt. Ön korlátozott CSS-támogatású böngészőverziót használ. A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy frissítse böngészőjét (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Ezenkívül a folyamatos támogatás biztosítása érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
Három diából álló forgószalagot jelenít meg egyszerre. Az Előző és Következő gombokkal egyszerre három dián, vagy a végén található csúszkagombokkal egyszerre három dián lapozhat.
Az önszerveződő neurális organellumok ígéretes in vitro platformot jelentenek az emberi fejlődés és betegségek modellezésére. Az organoidokból azonban hiányzik az in vivo meglévő összekapcsolódás, ami korlátozza az érést és megakadályozza az integrációt más, viselkedést szabályozó áramkörökkel. Ebben a tanulmányban bemutatjuk, hogy az újszülött meztelen patkányok szomatoszenzoros kérgébe átültetett emberi őssejtekből származó kérgi organoidok érett sejttípusokat fejlesztenek ki, amelyek integrálódnak az érzékszervi és motivációval kapcsolatos áramkörökbe. Az MRI transzplantáció utáni organoid növekedést mutatott ki számos őssejtvonalban és állatban, míg az egymagos analízis a kortikogenezis progresszióját és egy aktivitásfüggő transzkripciós program megjelenését tárta fel. Valójában az átültetett kérgi neuronok összetettebb morfológiai, szinaptikus és belső membrán tulajdonságokat mutatnak, mint in vitro megfelelőik, lehetővé téve az idegi defektusok kimutatását Timothy-szindrómában szenvedő betegeknél. Az anatómiai és funkcionális nyomon követés kimutatta, hogy az átültetett organellumok talamokortikális és kortikokortikális bemeneteket kapnak, és az idegi aktivitás in vivo felvételei arra utalnak, hogy ezek a bemenetek érzékszervi válaszokat generálhatnak az emberi sejtekben. Végül, a kérgi organoidok axonokat terjesztenek ki a patkány agyában, és optogenetikus aktivációjuk jutalomkereső viselkedéshez vezet. Így az átültetett emberi agykéreg neuronjai érnek, és részt vesznek a gazdaszervezet viselkedést szabályozó áramköreiben. Arra számítunk, hogy ez a megközelítés elősegíti a szálszintű fenotípusok kimutatását a betegből származó sejtekben, amelyeket más módszerekkel nem lehet kimutatni.
A fejlődő emberi agy egy figyelemre méltó önszerveződő folyamat, amelyben a sejtek szaporodnak, differenciálódnak, vándorolnak és összekapcsolódnak, funkcionális neuronális áramköröket alkotva, amelyeket az érzékszervi tapasztalatok tovább finomítanak. Az emberi agy fejlődésének megértésében, különösen a betegségek kontextusában, kulcsfontosságú probléma az agyszövethez való hozzáférés hiánya. Az önszerveződő organellumok, beleértve az emberi kéreg organoidjait (hCO; más néven az emberi kéreggömb), képesek 2,3,4,5,6-ot generálni. Számos korlátozás azonban korlátozza szélesebb körű alkalmazásukat az idegi áramkörök fejlődésének és működésének megértésére. Különösen nem világos, hogy a hCO érését korlátozza-e bizonyos mikro-környezeti és érzékszervi bemenetek hiánya in vivo. Ezenkívül, mivel a hCO-k nincsenek integrálva olyan áramkörökbe, amelyek viselkedési eredményeket generálhatnak, a genetikailag komplex és viselkedési neuropszichiátriai rendellenességek modellezésében való hasznosságuk jelenleg korlátozott.
A hCO ép élő agyba történő átültetése leküzdheti ezeket a korlátokat. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a rágcsálókéregbe átültetett emberi neuronok képesek túlélni, jeleket kivetíteni és kommunikálni a rágcsálósejtekkel7,8,9,10,11,12. Ezeket a kísérleteket azonban általában felnőtt állatokon végzik, ami korlátozhatja a szinaptikus és axonális integrációt. Itt egy olyan transzplantációs paradigmát írunk le, amelyben hiPS-sejtekből származó 3D hCO-t ültettünk át immunhiányos patkányok primer szomatoszenzoros kérgébe (S1) a plasztikus fejlődés korai szakaszában. Az átültetett hCO (t-hCO) neuronok jelentős érésen mennek keresztül, talamokortikális és kortikális-kortikális bemeneteket kapnak, amelyek érzékszervi válaszokat váltanak ki, és axonális projekciókat kiterjesztenek a patkány agyába, hogy jutalomkereső viselkedést váltsanak ki. A t-hCO kiterjesztett érése neuronális defektusokat tárt fel Timothy-szindrómában (TS) szenvedő betegeknél, amely egy súlyos genetikai rendellenesség, amelyet a feszültségérzékeny L-típusú CaV1.2 kalciumcsatorna (a CACNA1C által kódolt) mutációi okoznak.
Az emberi agykérgi neuronok idegköri in vivo vizsgálatához sztereotaxiásan intakt 3D hCO₂-t transzplantáltunk korai posztnatális atímiás patkányok S1-ébe (posztnatális 3-7. nap) (1a. ábra és az 1a-c. ábra bővített adatai). Ezen a ponton a talamokortikális és kortikokortikális axonális nyúlványok még nem fejezték be az S1 beidegzését (13. hivatkozás). Így ez a megközelítés a t-hCO₂ integrációjának maximalizálására szolgál, miközben minimalizálja az endogén áramkörökre gyakorolt ​​hatást. Az élő állatokban a t-hCO₂ helyének vizualizálásához T2 súlyozott MRI agyrekonstrukciókat végeztünk patkányokon a transzplantáció után 2-3 hónappal (1b. ábra és a bővített adatok, 1d. ábra). A t-hCO2 könnyen megfigyelhető volt, és a t-hCO2 térfogatmérése hasonló volt a fix szeletekből számított értékekhez (kiterjesztett adatok, 1d. és e. ábra; P > 0,05). A t-hCO2 könnyen megfigyelhető volt, és a t-hCO2 térfogatmérése hasonló volt a fix szeletekből számított értékekhez (kiterjesztett adatok, 1d. és e. ábra; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксировансрешох данные, рис 1d, P> 0,05). A t-hCO2 könnyen megfigyelhető volt, és a volumetrikus t-hCO2 mérések hasonlóak voltak a fix szakaszokra kiszámított értékekhez (kiterjesztett adatok, 1d., e. ábra; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0,05＀很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированшыревых данные, рис 1d, P> 0,05). A t-hCO2 könnyen megfigyelhető volt, és a volumetrikus t-hCO2 mérések hasonlóak voltak a fix szakaszokra számított értékekhez (kiterjesztett adatok, 1d., e. ábra; P > 0,05).A transzplantált állatok 81%-ánál körülbelül 2 hónappal a transzplantáció után meghatároztuk a t-hCO₂-t (n = 72 állat; hCO₂ 10 hiPS sejtvonalból; hiPS sejtvonalak az 1. kiegészítő táblázatban). Ezek közül 87% az agykéregben helyezkedett el (1c. ábra). Ugyanazon transzplantált patkány több időpontban végzett sorozatos MRI-vizsgálataival a t-hCO₂ térfogat kilencszeres növekedését tapasztaltuk 3 hónapon belül (1d. ábra és bővített adatok, 1f. ábra). A transzplantált állatok magas túlélési arányt (74%) mutattak a transzplantáció utáni 12. hónapban (bővített adatok, 1g. ábra és 2. kiegészítő táblázat), és nem találtunk nyilvánvaló motoros vagy memóriazavarokat, gliózist vagy elektroencefalogramot (EEG). Adatok: 1g. ábra és 2. kiegészítő táblázat. 1h–m és 3e).
a, Kísérleti terv vázlata. A hiPS-sejtekből származó hCO₂-t újszülött csupasz patkányok S1 agyába transzplantáltuk a differenciálódás 30-60. napján. b, T2 súlyozott koronális és horizontális MRI-képek, amelyek a t-hCO₂-t mutatják az S1-ben 2 hónappal a transzplantáció után. Lépték: 2 mm. c, A beágyazódás sikerességi arányának számszerűsítése minden hiPS-sejtvonalra vonatkozóan (n = 108, az oszlopokon belüli számok a t-hCO₂ mennyiségét jelzik hIPS-sejtvonalanként) és a kérgi vagy szubkortikális elhelyezkedésre vonatkozóan (n = 88). d, Koszorúér MRI-képe (balra; lépték: 3 mm) és a hozzá tartozó 3D-s volumetrikus rekonstrukció (lépték: 3 mm), amely a t-hCO₂ növekedését mutatja 3 hónap alatt. e, A t-hCO₂ mintázatainak áttekintése patkány agykéregben. Lépték: 1 mm. f, A t-hCO reprezentatív immuncitokémiai képei balról jobbra fentről (differenciálódás közben): PPP1R17 (4 hónapos), NeuN (8 hónapos), SOX9 és GFAP (8 hónapos), PDGFRα; (8 hónapos), MAP2 (8 hónapos) és IBA1 (8 hónapos). Lépték, 20 µm. A HNA koexpressziója emberi eredetű sejteket jelöl. g, snRNS-szekvencia: Az összes kiváló minőségű t-hCO sejtmag egyesített sokasága és projekciója (UMAP) dimenzionalitáscsökkentő képalkotása a Seurat integráció után (n=3 t-hCO minta, n=2 hiPS sejtvonal). Asztrociták, az asztrocita sejtvonal sejtjei; cyc prog, keringő progenitorok; GluN DL, mély glutamáterg neuronok; GluN DL/SP, mély és szublamelláris glutamáterg neuronok; GluN UL, felső réteg glutamáterg neuronjai; oligodendrociták, oligodendrociták; OPC, oligodendrocita progenitor sejtek; RELN, reelin neuronok. h, A t-hCO glutamáterg neuronokban szignifikánsan felregulált (2-szeresére korrigált, a sejtmagok legalább 10%-ában expresszálódó) gének gén ontológiai (GO) kifejezés-dúsulási elemzése a hCO glutamáterg neuronokhoz képest. h, A t-hCO glutamáterg neuronokban szignifikánsan felregulált (2-szeresére korrigált, a sejtmagok legalább 10%-ában expresszálódó) gének gén ontológiai (GO) kifejezés-dúsulási elemzése a hCO glutamáterg neuronokhoz képest. h, Анализ обогащения терминов Génontológia (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, ниязменсть, кратност экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматерских nejronámi hCO. h, Gén ontológia (GO) kifejezés-dúsulási analízis jelentős aktivációjú génekre (korrigált P<0,05, szoros változás>2, expresszió legalább 10%-os sejtmagokban) t-hCO glutamáterg neuronokban a hCO glutamáterg neuronokhoz képest. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整P 0,05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富雠 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上谎 弐 5 p， 弎 弎 弎 弎 弎 ，变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 核中 表达） 基因 基因 基因的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析. h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайне по крайне) глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический () термина обогащения. h, a gének szignifikánsan felregulálódtak (korrigált P < 0,05, szoros változás > 2, a sejtmagok legalább 10%-ában expresszálódva) a t-hCO glutamáterg neuronokban a hCO glutamáterg neuronokhoz képest. A dúsulási kifejezés ontológiai (GO) elemzése.A szaggatott vonal 0,05 aq értéket jelöl. i, GluN sejttípusok UMAP képalkotása t-hCO3-ban, referencia 22 snRNS-szekvenálású felnőtt motoros kéreg adatkészletből származó jelölésátvitellel. CT — kortikotalamusz sejtek, ET — extracerebrális sejtek, IT — belső telencephalikus sejtek, NP — közeli projekció.
Ezután felmértük a t-hCO citoarchitektúráját és teljes sejtösszetételét. A patkány endotélsejtjeinek antitestfestése t-hCO vaszkularizációt mutatott ki, míg az IBA1 festés patkány mikroglia jelenlétét mutatta ki a graftban (1f. ábra és bővített adatok, 3c., d. ábra). Az immunfestés humán nukleáris antigén (HNA) pozitív sejteket mutatott ki, amelyek PPP1R17-et (kortikális progenitorok), NeuN-t (neuronok), SOX9-et és GFAP-t (glia eredetű sejtek) vagy PDGFRα-t (oligodendrocita progenitorok) koexpresszáltak (1f. ábra). A t-hCO sejtösszetételének egysejt-felbontású vizsgálatához körülbelül 8 hónapos differenciálódás után egymagos RNS-szekvenálást (snRNA-seq) végeztünk. A patkánymagok tömeges szűrése és eltávolítása 21 500 kiváló minőségű humán mononukleáris térképet eredményezett (1g. ábra és bővített adatok, 4a., b. ábra). A tipikus sejttípus-markerek expressziós mintázatai a főbb kérgi sejtosztályok klasztereit azonosították, beleértve a mély és felületes glutamáterg neuronokat, a keringő progenitorokat, az oligodendrocitákat és az asztrocita vonalat (1g. ábra, bővített adatok, 4c. ábra és 3. kiegészítő táblázat). A SATB2 és CTIP2 immunfestése azt mutatta, hogy a kérgi altípusok jelenléte ellenére a t-hCO nem mutatott egyértelmű anatómiai rétegződést (bővített adatok, 3a. ábra). A stádium-illesztéses snRNS-szekvenálású hCO nagyjából hasonló sejtosztályokat eredményezett, néhány kivételtől eltekintve, beleértve az oligodendrociták hiányát és a GABAergikus neuronok jelenlétét, ami tükrözheti a korábban jelentett kedvező in vitro körülményeket a laterális progenitor sejtek számára15 (bővített adatok, 4f-i. ábra és 4. kiegészítő táblázat). A differenciális génexpressziós analízis jelentős különbségeket tárt fel a glutamáterg neuronokban a t-hCO és a hCO között (5. kiegészítő táblázat), beleértve a neuronális éréssel kapcsolatos génkészletek aktiválódását, mint például a szinaptikus jelátvitel, a dendritikus lokalizáció és a feszültségfüggő csatornaaktivitás (1h. ábra és 5. kiegészítő táblázat). Ennek megfelelően a kérgi glutamáterg t-hCO neuronok felgyorsult transzkripciós érést mutattak.
Annak tisztázása érdekében, hogy ezek a t-hCO-ban bekövetkező transzkripciós változások összefüggésben állnak-e a hCO in vitro és a t-hCO in vivo közötti morfológiai különbségekkel, 7-8 hónapos differenciálódás után stádium-illesztett, biocitinnel töltött hCO és hCO rekonstruáltunk akut metszetekben. hCO neuronok (2a. ábra). A t-hCO neuronok szignifikánsan nagyobbak voltak, másfélszeres szóma átmérővel, kétszer annyi dendrittel és összességében hatszoros növekedéssel rendelkeztek a teljes dendritikus hosszukban az in vitro hCO-hoz képest (2b. ábra). Ezenkívül szignifikánsan nagyobb dendrittüske-sűrűséget figyeltünk meg a t-hCO neuronokban, mint a hCO neuronokban (2c. ábra). Ez arra utal, hogy a t-hCO neuronok kiterjedt dendritikus megnyúláson és elágazáson mennek keresztül, ami a folyamatos sejtszaporodással kombinálva hozzájárulhat a t-hCO intenzív növekedéséhez a transzplantáció után (1d. ábra és kibővített adatok 1f. ábra). Ez arra késztetett minket, hogy megvizsgáljuk az elektrofiziológiai tulajdonságokat. A membránkapacitás nyolcszor nagyobb volt (kibővített adatok, 8d. ábra), a nyugalmi állapotú membránpotenciál hiperpolarizáltabb volt (körülbelül 20 mV), és az árambefecskendezés magasabb maximális gerjesztési sebességet indukált a t-hCO neuronokban, mint a hCO neuronokban. in vitro (2d. és e. ábra), ami összhangban van a t-hCO nagyobb és összetettebb morfológiai jellemzőivel. Ezenkívül a spontán serkentő posztszinaptikus áram események (EPSC) gyakorisága szignifikánsan magasabb volt a t-hCO neuronokban (2f. ábra), ami arra utal, hogy a t-hCO neuronokban megfigyelt dendritikus tüskék megnövekedett sűrűsége összefüggésben állt a funkcionális ingerlékenységgel. A hCO neuronok éretlen jellegét in vitro megerősítettük jelölt glutamáterg neuronok rögzítésével (kibővített adatok, 6a-c. ábra).
a, A biocitinnel töltött hCO3 és t-hCO3 neuronok 3D rekonstrukciója 8 hónapos differenciálódás után. b, Morfológiai jellemzők mennyiségi meghatározása (n = 8 hCO neuron, n = 6 t-hCO neuron; **P = 0,0084, *P = 0,0179 és ***P < 0,0001). b, Morfológiai jellemzők mennyiségi meghatározása (n = 8 hCO neuron, n = 6 t-hCO neuron; **P = 0,0084, *P = 0,0179 és ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, 0,0,0 P = 9,0084,0 P = 9,0 b, morfológiai jellemzők számszerűsítése ( n = 8 hCO neuron, n = 6 t-hCO neuron; **P = 0,0084, *P = 0,0179 és ***P < 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 90 和*P = 90 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 90 和*P = 90 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, 0,0,0 P = 9,0084,0 P = 9,0 b, morfológiai jellemzők számszerűsítése ( n = 8 hCO neuron, n = 6 t-hCO neuron; **P = 0,0084, *P = 0,0179 és ***P < 0,0001).c, A hCO és t-hCO dendritikus ágak 3D rekonstrukciója 8 hónapos differenciálódás után. A piros csillagok a feltételezett dendritikus tüskéket jelzik. Dendritikus tüskék sűrűségének meghatározása (n = 8 hCO neuron, n = 6 t-hCO neuron; **P = 0,0092). d, A nyugalmi membránpotenciál mennyiségi meghatározása (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; ***P < 0,0001). d, A nyugalmi membránpotenciál mennyiségi meghatározása (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, nyugalmi membránpotenciál kvantifikációja (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; ***P < 0, 0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, nyugalmi membránpotenciál kvantifikációja (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; ***P < 0, 0001). e, Növekvő áraminjekciókkal kiváltott ismétlődő akciós potenciál tüzelés hCO3-ban és t-hCO3-ban, és a maximális tüzelési ráta számszerűsítése (n = 25 hCO3 neuron, n = 16 t-hCO3 neuron; ***P < 0,0001). e, Növekvő áraminjekciókkal kiváltott ismétlődő akciós potenciál tüzelés hCO3-ban és t-hCO3-ban, és a maximális tüzelési ráta számszerűsítése (n = 25 hCO3 neuron, n = 16 t-hCO3 neuron; ***P < 0,0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественная скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, az áramnövekedés által kiváltott akciós potenciál újratüzelése hCO3-ban és t-hCO3-ban, valamint a maximális tüzelési sebesség számszerűsítése (n = 25 hCO3 neuron, n = 16 t-hCO3 neuron; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电 最大放电.个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 最 大 的 2个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经； *** p <0,0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и ковцинчи тока максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, a hCO3 és t-hCO3 akciós potenciálok ismétlődő tüzelése, amelyet megnövekedett áramellátás és a maximális tüzelési sebesség mennyiségi meghatározása indukál (n = 25 hCO3 neuron, n = 16 t-hCO3 neuron; *** P < 0,0001). f, Spontán EPSC-k (sEPSC-k) a hCO és t-hCO neuronokban a differenciálódás 8. hónapjában, és a szinaptikus események gyakoriságának számszerűsítése (n = 25 hCO neuron, n = 17 t-hCO neuron; ***P < 0,0001). f, Spontán EPSC-k (sEPSC-k) a hCO és t-hCO neuronokban a differenciálódás 8. hónapjában, és a szinaptikus események gyakoriságának számszerűsítése (n = 25 hCO neuron, n = 17 t-hCO neuron; ***P < 0,0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, Spontán EPSC-k (sEPSC-k) hCO és t-hCO neuronokban 8 hónapos differenciálódás és a szinaptikus események arányának számszerűsítése után ( n = 25 hCO neuron, n = 17 t-hCO neuron; ***P<0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的2＇件频率的神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的2Ｆ事件频率的神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, Spontán EPSC-k (sEPSC-k) hCO és t-hCO neuronokban a differenciálódás 8. hónapjában és a szinaptikus események arányának számszerűsítése (n = 25 hCO neuron, n = 17 t-hCO neuron; *** P<0,0001).A 1208-2-es sorban található bf esetében a hCO3-at és a t-hCO3-at ugyanabból a differenciálási tételből vettük, amelyet párhuzamosan tartottunk fenn. g, Génkészlet-dúsulási analízis (egyoldalas Fisher-féle egzakt teszt) a t-hCO glutamáterg neuronokban szignifikánsan felregulálódott (korrigált P < 0,05, szoros változás > 2, a sejtmagok legalább 10%-ában expresszálva) gének esetében, összehasonlítva a korai válasz (ERG) és a késői válasz (LRG) aktivitásfüggő gének génkészleteivel rendelkező hCO glutamáterg neuronokkal egy in vivo egérvizsgálatból16, valamint az in vitro neuronokból származó humán-specifikus LRG-kből17. g, Génkészlet-dúsulási analízis (egyoldalas Fisher-féle egzakt teszt) a t-hCO glutamáterg neuronokban szignifikánsan felregulálódott (korrigált P < 0,05, szoros változás > 2, a sejtmagok legalább 10%-ában expresszálva) gének esetében, összehasonlítva a korai válasz (ERG) és a késői válasz (LRG) aktivitásfüggő gének génkészleteivel rendelkező hCO glutamáterg neuronokkal egy in vivo egérvizsgálatból16, valamint az in vitro neuronokból származó humán-specifikus LRG-kből17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией (скорва0,5 кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, истовихв, зав идентифицированных в исследовании на мышах in vivo16, и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, a génkészlet-dúsulás elemzése (egyoldalú Fisher-féle egzakt teszt) a jelentős aktivációjú (korrigált P<0,05, szoros változás >2, expresszió a sejtmagok legalább 10%-ában) gének esetében t-hCO glutamáterg neuronokban, összehasonlítva a korai (ERG) és késői (LRG) aktivitásfüggő gének hCO glutamáterg neuronkészleteivel, amelyeket in vivo egerekben16 és in vitro neuronokból származó humán-specifikus LRG-kben azonosítottak17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特LRG异 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 尃 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco <0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 䧈单 侈单体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基 基因 的 基 因 的 基 因神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическими глутаматергическим (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% раннего ответа (ERG) и позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные in исысле vivo16 és нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. g, a t-hCO glutamáterg neuronok szignifikánsan fel voltak szabályozva a hCO glutamáterg neuronokhoz képest (korrigált P<0,05, változás >2, legalább 10%). Korai válasz (ERG) és késői válasz géndúsulási analízis (egyoldalú Fisher-féle egzakt teszt) in vivo egerekben16 és in vitro neuronokban17 azonosított válaszaktivitástól függő gének (LRG-k). Humán specifikus LRG-k.A szaggatott vonal a Bonferroni-korrigált 0,05-ös P-értéket jelzi. h, A GluN gén expressziója (pszeudo-csomag és az egyes gének skálázása) szignifikánsan felemelkedett az LRG gének snRNS-szekvenálási replikáiban t-hCO glutamáterg neuronokban. i, Az immunfestés az SCG2 expresszióját mutatja t-hCO (felső) és hCO (alsó) neuronokban. A fehér nyilak az SCG2+ sejtekre mutatnak. Skála, 25 µm. Az adatokat átlag ± szórásként fejezzük ki.
Az ex vivo szeletekben megfigyelt fokozott t-hCO aktivitás alapján az snRNS-szekvenálás a géntranszkriptumok aktivitásfüggő felregulációját mutatta ki a t-hCO-ban a hCO-hoz képest in vitro. A glutamáterg t-hCO neuronok magasabb szinten expresszálták a késői válaszaktivitást szabályozó géneket (2g, h. ábra), amelyeket korábbi egér és emberi neuronokon végzett vizsgálatokban is megfigyeltek16,17. Például a BDNF18, az SCG2 és az OSTN, egy főemlős-specifikus aktivitásszabályozó gén, fokozott expressziót mutatott a t-hCO neuronokban a hCO neuronokhoz képest (2g-i. ábra). Így a t-hCO neuronok transzkripciós, morfológiai és funkcionális elemzések alapján fokozott érési jellemzőket mutattak a hCO neuronokhoz képest.
A t-hCO érés és az emberi agy fejlődésével való összefüggésének további vizsgálata érdekében transzkriptomikai összehasonlításokat végeztünk magzati és felnőtt agykérgi sejttípusok19,20 és felnőtt21,22 között, valamint kiterjedt adatokat vizsgáltunk a kérgi génexpresszióról23 a fejlődés során (kibővített adatok, 5. ábra). Korábbi munkákkal24 összhangban a hCO és a t-hCO transzkriptom globális érési állapota a differenciálódás 7-8. hónapjában nagyjából összhangban van az in vivo fejlődési idővel, és leginkább a késői magzati élettel egyenértékű (kibővített adatok, 5a. ábra). Figyelemre méltó, hogy a t-hCO-ban a korcsoportnak megfelelő hCO-hoz képest fokozott transzkriptom érettséget figyeltünk meg, valamint a szinaptogenezissel, az asztrogenezissel és a mielinizációval összefüggő transzkriptom aktivációt (kibővített adatok, 5b-d. ábra). Sejtszinten a t-hCO-ban vékonyabb agykéreg altípusra utaló bizonyítékokat találtunk, a glutamáterg neuronok klaszterei átfedésben vannak a felnőtt L2/3, L5 és L6 neuron altípusokkal (1i. ábra). Ezzel szemben a glutamáterg t-hCO neuronok és a magzati kérgi neuronok közötti klaszterátfedés korlátozottabb volt a terhesség közepén (kibővített adatok, 5e-j. ábra). Annak meghatározása érdekében, hogy a t-hCO neuronok funkcionálisan hasonlóak-e az emberi posztnatális neokortikális neuronokhoz, elektrofiziológiai felvételeket és anatómiai rekonstrukciókat végeztünk az emberi L2/3 piramissejtjein az emberi posztnatális kéreg éles metszeteiben (kibővített adatok, 7a. ábra). Az L2/3 piramisneuronok elektrofiziológiai tulajdonságai hasonlóak voltak a t-hCO piramisneuronokéhoz (kibővített adatok, 7e. ábra). Morfológiailag a posztnatális emberi mintákból származó L2/3 neuronok jobban hasonlítottak a t-hCO-hoz, mint a hCO-hoz, bár az L2/3 sejtek hosszabbak voltak, összességében több ágat tartalmaztak, és nagyobb volt a tüskesűrűségük (3g. ábra és kibővített adatok, 7b-G. ábra).
a, Kontroll és TS hiPS sejtvonalak által termelt hCO₃ transzplantációja újszülött patkányokba. b, Biocitinnel töltött t-hCO₃ neuronok 3D rekonstrukciója 8 hónapos differenciálódás után. c, Az átlagos dendritikus hossz számszerűsítése (n = 19 kontroll neuron, n = 21 TS neuron; **P = 0,0041). d, 3D-ben rekonstruált dendritikus ágak kontroll és TS t-hCO3 neuronokból a differenciálódás 8. hónapjában, és a dendritikus tüskék sűrűségének mennyiségi meghatározása (n = 16 kontroll neuron, n = 21 TS neuron, ***P < 0,0001). d, 3D-ben rekonstruált dendritikus ágak kontroll és TS t-hCO3 neuronokból a differenciálódás 8. hónapjában, és a dendritikus tüskék sűrűségének mennyiségi meghatározása (n = 16 kontroll neuron, n = 21 TS neuron, ***P < 0,0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и колинчеостевки и колинчеост плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, a kontroll és a t-hCO TS dendritikus ágainak 3D rekonstrukciója a differenciálódás 8. hónapjában, valamint a dendritikus tüskék sűrűségének meghatározása ( n = 16 kontroll neuron, n = 21 TS neuron, ***P<0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量n化16个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）. d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分 支 以及 树突棘 密度 重 棘 密度神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）. d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и колиндритных ветвей контроля и колинячев дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, a kontroll dendritikus ágak és a TS t-hCO 3D rekonstrukciója a differenciálódás 8. hónapjában, valamint a dendritikus tüskék sűrűségének meghatározása ( n = 16 kontroll neuron, n = 21 TS neuron, ***P<0,0001).A piros csillagok feltételezett dendrites tüskéket jelölnek. e, spontán EPSC-k kontroll és TS t-hCO neuronokban 8 hónapos differenciálódás után. f, kumulatív frekvenciadiagram és a szinaptikus események gyakoriságának és amplitúdójának számszerűsítése (n = 32 kontroll neuron, n = 26 TS neuron; **P=0,0076 és P=0,8102). g, TS és kontroll neuronok Scholl-analízise hCO-ban és t-hCO-ban. A szaggatott vonalak az összehasonlítás céljából az emberi L2/3 posztnatális piramissejteket mutatják (n = 24 kontroll t-hCO neuron, n = 21 TS t-hCO neuron, n = 8 kontroll hCO neuron és n = 7 TS hCO neuron). Az adatokat átlag ± szórásként fejezzük ki.
A t-hCO azon képessége, hogy magas szinten képes replikálni az emberi kéreg neuronjainak morfológiai és funkcionális jellemzőit, arra késztetett minket, hogy megvizsgáljuk, vajon a t-hCO felhasználható-e betegségek fenotípusainak kimutatására. Vizsgálatunk a TS-re, egy súlyos neurofejlődési rendellenességre összpontosított, amelyet a CaV1.2-t kódoló génben bekövetkező funkciónyerési mutációk okoznak, amely az aktivitásfüggő géntranszkripciót indítja el a neuronokban. Három, a leggyakoribb szubsztitúciót (p.G406R) hordozó TS-betegtől és három kontrolltól nyertünk hCO-t (3a. ábra). Transzplantáció után azt tapasztaltuk, hogy a dendritikus morfológia megváltozott a TS neuronokban a kontrollokhoz képest (3b. ábra és bővített adatok, 8a,b. ábra), a primer dendritek számának kétszeres növekedésével, valamint a dendritek átlagos és összesített hosszának növekedésével és csökkenésével (3c. ábra és bővített adatok, 8c. ábra). Ez a tüskék sűrűségének növekedésével és a spontán EPSC-k gyakoriságának növekedésével járt együtt a TS-ben a kontrollneuronokhoz képest (3d–f. ábra és bővített adatok, 8g. ábra). További elemzések során a kontrollokhoz képest a t-hCO TS-ben abnormális dendritikus elágazás mintázatait tártuk fel, de in vitro TS hCO-ban a differenciálódás hasonló szakaszában nem (3g. ábra). Ez összhangban van a TS-ben az aktivitásfüggő dendritikus zsugorodásról szóló korábbi jelentéseinkkel, és kiemeli ezen transzplantációs platform azon képességét, hogy in vivo is kimutathassa a betegség fenotípusait.
Ezután azt vizsgáltuk, hogy a t-hCO sejtek milyen mértékben integrálódtak funkcionálisan a patkány S1-be. A rágcsálókban az S1 erős szinaptikus bemeneteket kap az ipsilaterális ventrális bazális és posterior talamikus magokból, valamint az ipsilaterális motoros és szekunder szomatoszenzoros kéregből, és az ellenoldali S1-ből (4a. ábra). Az beidegzési minta helyreállításához a hCO-t veszettség vírus-dG-GFP/AAV-G-vel fertőztük meg, és 3 nappal később hCO-t transzplantáltunk S1 patkányba. Sűrű GFP expressziót figyeltünk meg az ipsilaterális S1 és a ventrális bazális ganglionok neuronjaiban a transzplantáció után 7-14 nappal (4b., c. ábra). Ezenkívül a netrin G1 talamikus marker antitestfestése kimutatta a talamikus végződések jelenlétét a t-hCO-ban (4d., e. ábra). Annak kiértékelésére, hogy ezek az afferens projekciók kiválthatnak-e szinaptikus válaszokat a t-hCO sejtekben, teljes sejtes elvezetéseket végeztünk emberi sejtekből a talamikus kéreg rétegének éles metszeteiben. A patkány S1, a belső tok, a fehérállomány és a t-hCO közelében lévő rostok elektromos stimulációja, illetve a t-hCO-ban lévő opszint expresszáló talamikus végződések optogenetikus aktiválása rövid latenciaidejű EPSC-ket indukált a t-hCO neuronokban, amelyeket az AMPA receptor antagonista NBQX-nek tettek ki. (4f. és g. ábra, valamint bővített adatok, 9a–g. ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a t-hCO anatómiailag integrálódott a patkány agyába, és képes aktiválódni a patkány gazdaszövete által.
a, Veszettségkövető kísérlet sematikus rajza. b, GFP és emberspecifikus STEM121 expresszió a t-hCO és a patkány agykéreg között (felső panel). Látható még a GFP expressziója a patkány ipsilaterális ventrális bazális magjában (VB) (bal alsó sarok) és az ipsilaterális S1-ben (jobb alsó sarok). Léptéksáv, 50 µm. A piros négyzetek az agy azon területeit jelölik, ahol a képeket készítették. c, GFP-t expresszáló sejtek mennyiségi meghatározása (n = 4 patkány). d, e — Netrin G1+ talamikus terminálisok a t-hCO-ban. d, a t-hCO és a VB magokat tartalmazó koronális metszet. Léptéksáv, 2 mm. e, a Netrin G1 és a STEM121 expresszióját mutatja a t-hCO (bal) és a VB (jobb) neuronokban. Léptéksáv, 50 µm. A narancssárga szaggatott vonal a t-hCO határát jelzi. f, g, A t-hCO neuronok áramgörbéi elektromos stimuláció után S1 patkányban (f) vagy belső tokban (g), NBQX-szel (lila) vagy anélkül (fekete) (balra). EPSC amplitúdók NBQX-szel és anélkül (n = 6 S1 neuron, *P = 0,0119; és n = 6 belső tok neuron, **P = 0,0022) (középen). Az EPSC-t mutató t-hCO neuronok százalékos aránya az S1 patkány (f) vagy belső tok (g) elektromos stimulációjára adott válaszként (jobbra). aCSF, mesterséges agy-gerincvelői folyadék. h, a 2P képalkotó kísérlet vázlatos rajza (balra). GCaMP6-ok expressziója t-hCO-ban (középen). Skála, 100 µm. A GCaMP6-ok fluoreszcencia időzített ábrázolása (jobbra). i, A spontán aktivitás fluoreszcenciájának Z-pontszáma. j, a bajusz stimuláció vázlatos ábrázolása. k, z-pontszámmal értékelt 2P fluoreszcencia trajektóriák egy kísérletben, a példa szerinti sejtekben a whisker-eltéréshez igazítva (szaggatott vonal). l, az összes sejt populációátlagolt z-pontszám válaszai, a nulla időpontbeli whisker-eltéréshez igazítva (szaggatott vonal) (piros) vagy véletlenszerűen generált időbélyegekhez (szürke). m. Az optikai jelöléssel végzett kísérlet sematikus rajza. n, Nyers feszültséggörbék egy példa szerinti t-hCO cellából kék lézer stimuláció vagy whisker-eltérés során. A piros nyilak a fény által okozott első tüskéket (felül) vagy a whisker-eltérés által okozott első tüskéket jelzik (alul). A szürke árnyékolás a whisker-eltérés periódusait jelzi. o, Csúcsfény hullámformák és whisker-eltérés válaszok. p, egyetlen kísérlet tüskéi, a példa szerinti sejtekben a whisker-eltéréshez igazítva. A 0 a whisker-eltérést jelzi (szaggatott vonal). q, az összes fényérzékeny sejt populációátlagolt z-pontszám tüzelési sebessége, a nulla időpontbeli whisker-eltéréshez igazítva (szaggatott vonal) (piros) vagy véletlenszerűen generált időbélyegekhez (szürke). r, A bajuszeltérés által szignifikánsan modulált fényérzékeny egységek aránya (n = 3 patkány) (balra). Csúcs z-pontszám latencia (n = 3 patkány; n = 5 (világoszöld), n = 4 (sötétzöld) és n = 4 (cián) bajuszeltérés-modulációs egység patkányonként) (jobbra). Az adatokat átlag ± szórásként fejezzük ki.
Ezután azt vizsgáltuk, hogy a t-hCO aktiválható-e érzékszervi ingerekkel in vivo. S1 patkányokba transzplantáltunk olyan hCO-t, amely a genetikailag kódolt GCaMP6 kalcium indikátorokat expresszálja. 150 nap elteltével szálas fotometriát vagy kétfotonos kalcium képalkotást végeztünk (4h. ábra és bővített adatok, 10a. ábra). Azt tapasztaltuk, hogy a t-hCO sejtek szinkronizált ritmikus aktivitást mutattak (4i. ábra, bővített adatok, 10b. ábra és 1. kiegészítő videó). A t-hCO aktivitás csúcsértékének jellemzésére extracelluláris elektrofiziológiai felvételeket végeztünk altatott transzplantált patkányokban (bővített adatok, 10c-f. ábra). MRI képekből sztereotaxiális koordinátákat generáltunk; így ezek a rögzített egységek feltételezett emberi neuronokat képviselnek, bár az elektrofiziológia önmagában nem teszi lehetővé a származási faj meghatározását. Szinkronizált aktivitáskitöréseket figyeltünk meg (bővített adatok, 10d. ábra). A kitörések körülbelül 460 ms-ig tartottak, és körülbelül 2 másodperces csendperiódusok választották el őket (bővített adatok, 10d., e. ábra). Az egyes egységek átlagosan körülbelül három lövést adtak le sorozatonként, ami a sorozatonként regisztrált egységek körülbelül 73%-a. Az egyes egységek aktivitása szorosan korrelált, és ezek a korrelációk magasabbak voltak, mint a beoltatlan állatokban azonosított, azonos körülmények között rögzített egységeké (kibővített adatok, 10f. ábra). Az azonosított emberi eredetű neuronok tüskeválaszainak további jellemzése érdekében fényjelöléses kísérleteket végeztünk altatott patkányokon, amelyekbe a fényérzékeny rodopszin 2 (hChR2) kationcsatornát expresszáló HCO3-at transzplantáltunk, amelyen keresztül a t-hCO neuronok rövid latenciaidejű felismerést (kevesebb, mint 10 ms) végeznek a kék fény ingerekre adott válaszul (4m–o. ábra). A t-hCO neuronok spontán aktivitáskitöréseket mutattak a kalcium képalkotás során megfigyelt frekvenciákon, valamint a t-hCO3-ban fényjelölés hiányában végzett elektrofiziológiai felvételeken (kibővített adatok, 10c-g. ábra). Az in vitro rögzített HCO3 megfelelő szakaszaiban nem figyeltünk meg spontán aktivitást. Annak felmérésére, hogy a t-hCO aktiválható-e érzékszervi ingerekkel, rövid időre eltérítettük a patkány bajuszát a t-hCO3-tól (4j, m ábra és bővített adatok, 10h, k ábra). Korábbi tanulmányok8,10 szerint a t-hCO3 sejtek egy részhalmaza fokozott aktivitást mutatott a bajusz eltérítésére adott válaszként, amit nem figyeltünk meg, amikor az adatokat véletlenszerű időbélyegekkel hasonlítottuk össze (4k–q ábra és bővített adatok, 10h–q ábra). Valójában az optoelektronnal jelölt egyedi egységek körülbelül 54%-a mutatott szignifikánsan megnövekedett ébredési sebességet a bajuszstimuláció után, amely körülbelül 650 ms-nál tetőzött (4r ábra). Összefoglalva, ezek az adatok arra utalnak, hogy a t-hCO3 megfelelő funkcionális bemeneteket kap, és környezeti ingerekre aktiválható.
Ezután azt vizsgáltuk, hogy a t-hCO képes-e aktiválni a patkányokban az idegpályákat a viselkedés szabályozása érdekében. Először azt vizsgáltuk, hogy a t-hCO neuronok axonjai kivetülnek-e a patkány környező szöveteibe. A hCO-t egy hChR2-t kódoló lentivírussal fertőztük meg, amely EYFP-hez volt fuzionálva (hChR2-EYFP). 110 nap elteltével az EYFP expresszióját figyeltük meg az ipszilaterális kéreg régióiban, beleértve az auditív, motoros és szomatoszenzoros kérget, valamint a kéreg alatti régiókban, beleértve a striatumot, a hippocampust és a talamuszt (5a. ábra). Annak felmérésére, hogy ezek az efferens projekciók kiválthatnak-e szinaptikus válaszokat patkánysejtekben, optikailag aktiváltuk a hChR2-EYFP-t expresszáló t-hCO sejteket úgy, hogy patkány agykéreg sejteket rögzítettünk éles agymetszetekben. A t-hCO axonok kék fénnyel történő aktiválása rövid latenciajú EPSC-ket indukált a patkány piramiskéreg neuronjaiban, amelyeket NBQX blokkolt (5b-g. ábra). Ezenkívül ezeket a válaszokat a tetrodotoxin (TTX) blokkolhatja, és a 4-aminopiridin (4-AP) helyreállíthatja, ami arra utal, hogy monoszinaptikus kapcsolatok okozták őket (5e. ábra).
a, Az axonkövetés sematikus rajza (balra). t-hCO EYFP expresszió (jobbra). Lépték, 100 µm. A1, hallókéreg, ACC, anterior cinguláris kéreg, d. striatum, dorzális striatum, HPC, hippocampus; Rekeszizom, laterális septum, mPFC, mediális prefrontális kéreg, piriform kéreg, v. striatum, ventrális striatum, VPM, a talamusz ventroposztomediális magja, VTA, ventrális tegmentális régió. A piros négyzetek az agy azon területeit jelölik, ahol a képeket készítették. b, A stimulációs kísérlet sematikus rajza. c, d, Példák a kék fény által indukált fotoáram (fent) és feszültség (alul) válaszára emberi (c) EYFP+ t-hCO vagy patkány (d) EYFP- sejtekben. e, f, Patkány neuronok áramgörbéi t-hCO axonok kék fénnyel történő stimulálása után TTX-szel és 4-AR-ral (zöld), TTX-szel (szürke) vagy aCSF-fel (fekete) (e), NBQX-szel (ibolya) vagy anélkül (fekete) (e). g, Kék fénnyel kiváltott válaszok latenciája patkánysejtekben (n = 16 sejt); a vízszintes sávok az átlagos latenciát jelzik (7,13 ms) (balra). NBQX-szel vagy anélkül rögzített fény által kiváltott EPSC-k amplitúdója (n = 7 sejt; ***P < 0,0001) (középen). NBQX-szel vagy anélkül rögzített fény által kiváltott EPSC-k amplitúdója (n = 7 sejt; ***P < 0,0001) (középen). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). A fényindukált EPSC-k amplitúdója NBQX-szel vagy anélkül rögzítve (n = 7 sejt; ***P < 0,0001) (középen).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中） Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). A fényindukált EPSC-k amplitúdója NBQX-szel vagy anélkül rögzítve (n = 7 sejt; ***P < 0,0001) (középen).Az EPSC-ket mutató patkánysejtek százalékos aránya, amelyek kék fényre reagálnak (jobbra). h, Viselkedési feladat vázlatos rajza. d0, 0. nap. i. Példaértékű állatok teljesítménye a képzés 1. napján (balra) vagy 15. napján (jobbra). Az 1. napon (balra) vagy a 15. napon (jobbra középen) elvégzett nyalogatások átlagos száma (n = 150 kék fénypróba, n = 150 piros fénypróba; ***P < 0,0001). Az 1. napon (balra) vagy a 15. napon (jobbra középen) elvégzett nyalogatások átlagos száma (n = 150 kék fénypróba, n = 150 piros fénypróba; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа, в центре справа, = n = 150 испыта) 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Az 1. napon (balra) vagy a 15. napon (jobbra középen) elvégzett nyalogatások átlagos száma (n = 150 kék fénypróba, n = 150 vörös fénypróba; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验150，n次红光试验；***P < 0,0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验150，n次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа, в центре справа, = n = 150 испыта) 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Az 1. napon (balra) vagy a 15. napon (jobbra középen) elvégzett nyalogatások átlagos száma (n = 150 kék fénypróba, n = 150 vörös fénypróba; ***P < 0,0001).Kumulatív nyalási értékek a vörös és kék fény próbák során az 1. napon (balra középen) vagy a 15. napon (jobbra). NS, nem szignifikáns. j, k, Az összes olyan állat viselkedési jellemzői, amelyekbe hChR2-EYFP-t (j) vagy kontroll fluorofort (k) expresszáló t-hCO3-t transzplantáltak az 1. vagy 15. napon (hChR2-EYFP: n = 9 patkány, ** P = 0,0049; kontroll: n = 9, P = 0,1497). l, A preferencia pontszám alakulása (n = 9 hChR2, n = 9 kontroll; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, A preferencia pontszám alakulása (n = 9 hChR2, n = 9 kontroll; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, A preferencia pontszám alakulása (n = 9 hChR2, n = 9 kontroll; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）. l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）. l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, A preferencia pontszámok alakulása (n = 9 hChR2, n = 9 kontroll; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, FOS expresszió a t-hCO3 optogenetikus aktiválására adott válaszként S1-ben. Az FOS expressziójának képei (balra) és a kvantifikáció (n = 3 csoportonként; *P < 0,05, **P < 0,01 és ***P < 0,001) (jobbra) láthatók. Az FOS expressziójának képei (balra) és a kvantifikáció (n = 3 csoportonként; *P < 0,05, **P < 0,01 és ***P < 0,001) (jobbra) láthatók. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,05, ** P <0,0пра1, 0,01). Az FOS expressziójának (balra) és a kvantifikációnak (n = 3 csoportonként; *P<0,05, **P<0,01 és ***P<0,001) képei láthatók (jobbra).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P。 0,001）叚叀）（右（显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P。 0,001）叚叀）（右（ Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,05, ** P <0,0пра1, 0,01). Az FOS expressziójának (balra) és a kvantifikációnak (n = 3 csoportonként; *P<0,05, **P<0,01 és ***P<0,001) képei láthatók (jobbra).Skála, 100 µm. Az adatokat átlag ± standard hibaként fejezzük ki a BLA, a bazolaterális mandula, az MDT, a dorsomediális talamikus mag, a PAG és a periaqueductalis szürkeállomány tekintetében.
Végül azt vizsgáltuk, hogy a t-hCO képes-e modulálni a patkányok viselkedését. Ennek tesztelésére hChR2-EYFP-t expresszáló hCO-t transzplantáltunk az S1-be, majd 90 nappal később optikai szálakat ültettünk be a t-hCO-ba fényadás céljából. Ezután a patkányokat egy módosított operáns kondicionálási paradigmával képeztük ki (5h. ábra). Az állatokat egy viselkedési tesztkamrába helyeztük, és véletlenszerűen 5 másodperces kék (473 nm) és vörös (635 nm) lézeringereket alkalmaztunk. Az állatok vízjutalomban részesültek, ha a kék fény stimuláció alatt nyalogattak, de a vörös fény stimuláció alatt nem. A tréning első napján az állatok nem mutattak különbséget a nyalogatásban kék vagy vörös fény stimuláció esetén. A 15. napon azonban a hChR2-EYFP-t expresszáló hCO-val transzplantált állatok aktívabb nyalogatást mutattak kék fény stimuláció esetén, mint a vörös fény stimuláció esetén. Ezeket a nyalogatási viselkedésbeli változásokat nem figyelték meg a kontroll fluorofort expresszáló hCO-val transzplantált kontrollállatoknál (tanulási sikerarány: hChR2 89%, EYFP 0%, 5i-1. ábra és 2. kiegészítő videó). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a t-hCO sejtek aktiválhatják a patkány neuronjait a jutalomkereső viselkedés stimulálása érdekében. Annak kiderítése érdekében, hogy mely patkány t-hCO idegi áramkörök lehetnek érintettek ezekben a viselkedési változásokban, optogenetikusan aktiváltuk a t-hCO-t idomított állatokban, majd 90 perccel később szövetmintákat gyűjtöttünk. Az immunhisztokémia az aktivitásfüggő FOS fehérje expresszióját mutatta ki számos, a motivált viselkedésben részt vevő agyi régióban, beleértve a mediális prefrontális kérget, a mediális talamuszt és a periaqueductális szürkeállományt, amely vagy a stimulálatlan kontrollállatokban, vagy az állatokban expresszálódott. (rizs. 5m). Összefoglalva, ezek az adatok arra utalnak, hogy a t-hCO modulálhatja a patkány neuronális aktivitását a viselkedés stimulálása érdekében.
Az idegi organoidok ígéretes rendszert jelentenek az emberi fejlődés és betegségek in vitro vizsgálatára, de korlátozottak az in vivo létező áramkörök közötti kapcsolatok hiánya miatt. Kifejlesztettünk egy új platformot, amelyben hCO-t ültettünk át immunhiányos korai posztnatális patkányok S1 sejtjébe, hogy in vivo tanulmányozzuk az emberi sejtek fejlődését és működését. Kimutattuk, hogy a t-hCO olyan érett sejttípusokat fejleszt, amelyeket in vitro nem figyeltek meg28, és hogy a t-hCO anatómiailag és funkcionálisan integrálódott a rágcsáló agyába. A t-hCO integrációja a rágcsáló idegi áramköreibe lehetővé tette számunkra, hogy kapcsolatot teremtsünk az emberi sejtek aktivitása és a vizsgált állatok viselkedése között, kimutatva, hogy a t-hCO neuronok képesek modulálni a patkány neuronális aktivitását a viselkedési válaszok kiváltása érdekében.
Az általunk leírt platform számos előnnyel rendelkezik a korábbi, rágcsáló agyba történő emberi sejtek átültetésével kapcsolatos kutatásokkal szemben. Először is, hCO₂-t ültettünk át korai posztnatális patkányok fejlődő agykéregébe, ami elősegítheti az anatómiai és funkcionális integrációt. Másodszor, a t-hCO₂ MRI monitorozás lehetővé tette számunkra, hogy élő állatokban vizsgáljuk a graft pozícióját és növekedését, ami lehetővé tette számunkra, hogy hosszú távú, több állaton végzett vizsgálatokat végezzünk, és megállapítsuk több hiPS sejtvonal megbízhatóságát. Végül intakt organoidokat ültettünk át izolált, egysejt-szuszpenziók helyett, amelyek kevésbé romboló hatással vannak az emberi sejtekre, és elősegíthetik az emberi agykéreg neuronjainak integrációját és keletkezését patkányagyakban.
Elismerjük, hogy a platform fejlődése ellenére az időbeli, térbeli és fajok közötti korlátok megakadályozzák az emberi idegi áramkörök nagy pontosságú kialakulását, még a fejlődés korai szakaszában történő transzplantáció után is. Például nem világos, hogy a t-hCO-ban megfigyelt spontán aktivitás a kérgi fejlődés során megfigyelt ritmikus aktivitáshoz hasonló fejlődési fenotípust képvisel, vagy a t-hCO-ban jelen lévő szupresszív sejttípusok hiányának köszönhető. Hasonlóképpen nem világos, hogy a t-hCO-ban a lamináció hiánya milyen mértékben befolyásolja a láncok összekapcsolódását30. A jövőbeli munka más sejttípusok, például emberi mikroglia, emberi endotélsejtek és a GABAerg interneuronok változó arányainak integrálására összpontosít, amint azt az in vitro 6-os összeállításban kimutatták, valamint annak megértésére, hogy az idegi integráció és feldolgozás hogyan történhet a megváltozott t-hCO transzkripciós, szinaptikus és viselkedési szinteken betegektől származó sejtekben.
Összességében ez az in vivo platform egy hatékony erőforrást képvisel, amely kiegészítheti az in vitro emberi agyfejlődési és betegségkutatási programokat. Arra számítunk, hogy ez a platform lehetővé teszi számunkra, hogy új, szálszintű fenotípusokat fedezzünk fel egyébként nehezen megtalálható, betegektől származó sejtekben, és új terápiás stratégiákat teszteljünk.
A korábban leírtak szerint hCO2.5-öt állítottunk elő HiPS sejtekből. A táplálórétegeken tenyésztett hiPS sejtekből a hCO2-termelés megindításához az ép hiPS sejtkolóniákat diszpáz (0,35 mg/ml) segítségével eltávolítottuk a tenyésztő edényekből, és ultra-alacsony tapadású műanyag tenyészeteket tartalmazó edényekbe helyeztük, amelyek hiPS sejtkultúra-közeget (Corning) tartalmaztak, amelyet két SMAD inhibitorral, dorsomorfinnal (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) és SB-431542-vel (10 μM; 1614, Tocris) és ROCK inhibitor Y-27632-vel (10 μM; S1049, Selleckchem) egészítettünk ki. Az első 5 napban a hiPS sejtkultúrát naponta cseréltük, és dorsomorfint és SB-431542-t adtunk hozzá. A szuszpenzióban lévő hatodik napon a neurális szferoidokat neurobasal-A-t (10888, Life Technologies), A-vitamin nélküli B-27-kiegészítőt (12587, Life Technologies), GlutaMax-ot (1:100, Life Technologies), penicillint és sztreptomicint (1:100, Life Technologies) tartalmazó neurális táptalajra vittük át, amelyet epidermális növekedési faktorral (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) és fibroblaszt növekedési faktor 2-vel (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) egészítettünk ki a 24. napig. A 25. naptól a 42. napig a táptalajt agyi eredetű neurotróf faktorral (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) és neurotrofin 3-mal (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) egészítettük ki, a táptalajt kétnaponta cserélve. A szuszpenzióban lévő hatodik napon a neurális szferoidokat neurobasal-A-t (10888, Life Technologies), A-vitamin nélküli B-27-kiegészítőt (12587, Life Technologies), GlutaMax-ot (1:100, Life Technologies), penicillint és sztreptomicint (1:100, Life Technologies) tartalmazó neurális táptalajra vittük át, amelyet epidermális növekedési faktorral (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) és fibroblaszt növekedési faktor 2-vel (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) egészítettünk ki a 24. napig. A 25. naptól a 42. napig a táptalajt agyi eredetű neurotróf faktorral (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) és neurotrofin 3-mal (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) egészítettük ki, a táptalajt kétnaponta cserélve.A szuszpenzióban töltött hatodik napon a neurális szferoidokat Neurobasal-A-t (10888, Life Technologies), A-vitamin nélküli B-27-kiegészítőt (12587, Life Technologies), GlutaMax-ot (1:100, Life Technologies) és penicillint tartalmazó neurális táptalajra vittük át.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) и фактомицром ро2Fро22 20 нг/мл; K+F rendszerek) до 24-го дня. és sztreptomicinnel (1:100, Life Technologies), majd epidermális növekedési faktorral (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) és fibroblaszt növekedési faktor 2-vel (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) egészítettük ki a 24. napig.A 25. és 42. nap között agyi eredetű neurotróf faktort (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) és neurotrofin 3-at (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) adtunk a táptalajhoz, a táptalajt kétnaponta cserélve.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含焴A2生、不含焴A2生补充剂 (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) Technológiák）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（202ng mlD（ Rendszerek）直至第24 天.在 悬浮 的 第 第 6 将 神 经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 绌 焠 ， Life Technologies０ 丟 丟b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 培养 基 中 韹养 基 中 韹养 基 中 1） 01 ， Life Technologies） 表皮 生长 因子 （（(20 ng ml-1 ； K+F rendszerek） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml-1；R&D Rendszerek）直至第24天. На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technобавава) без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; K+F rendszerek) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; A 6. napon a neuroszféra szuszpenziókat neurobasal-A-t (10888, Life Technologies), A-vitamin nélküli B-27-vitamin-kiegészítőt (12587, Life Technologies), GlutaMax-ot (1:100, Life Technologies), penicillinnel semlegesített sztreptomicint (1:100, Life Technologies) és epidermális növekedési faktort (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) és fibroblaszt növekedési faktor 2-t (FGF2; 20 ng ml-1) tartalmazó kiegészítőre váltottuk. K+F rendszerek) до 24-го дня. K+F rendszerek) a 24. napig.A 25. naptól a 42. napig minden második nap agyi eredetű neurotróf faktort (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) és neurotróf faktor 3-at (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) adtunk a táptalajhoz. A táptalajt egyszer cseréltük.A 43. naptól kezdődően a hCO₂-t kiegészítés nélküli neurobasal-A táptalajban (NM; 1088022, Thermo Fisher) tartottuk fenn, a táptalajt 4-6 naponta cserélve. A hCO₂ kinyeréséhez táplálék nélküli körülmények között tenyésztett hiPS-sejtekből a hiPS-sejteket Accutase-zal (AT-104, Innovate Cell Technologies) inkubáltuk 37°C-on 7 percig, majd egyedi sejtekre disszociáltuk, és AggreWell 800 lemezekre (34815, STEMCELL Technologies) szélesztettük 3 × 106 egyedi sejt/lyuk sűrűséggel Essential 8 táptalajban, amelyet ROCK inhibitor Y-27632-vel (10 μM; S1049, Selleckchem) egészítettünk ki. 24 óra elteltével a kutakban lévő táptalajt Essential 6 táptalajba (A1516401, Life Technologies) pipettáztuk, amely dorsomorfint (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) és SB-431542-t (10 μM; 1614) tartalmazott. , Tocrida). A 2. és 6. nap között az Essential 6 táptalajt naponta dorsomorfinra és SB-431542 kiegészítőre cseréltük. A hatodik naptól kezdve a neuroszféra szuszpenziókat neurobasális táptalajba helyeztük át, és a fent leírtak szerint tartottuk fenn.
Minden állatkísérletet a Stanford Egyetem Laboratóriumi Állatgondozási Adminisztratív Bizottsága (APLAC) által jóváhagyott állatgondozási irányelveknek megfelelően végeztünk. Vemhes eutímiás RNU (rnu/+) patkányokat vásároltunk (Charles River Laboratories) vagy helyeztünk el. Az állatokat 12 órás világos-sötét cikluson tartottuk, élelmet és vizet szabadon engedve. A három-hét napos csupasz (FOXN1–/–) patkánykölyköket a selejtezés előtt az éretlen bajusz növekedése alapján azonosítottuk. A kölyköket (hím és nőstény) 2-3%-os izofluránnal altattuk, és sztereotaxiás keretre helyeztük. A koponyán trepanációt végeztünk, amelynek átmérője körülbelül 2-3 mm-rel meghaladta az S1-et, miközben megőriztük a dura mater épségét. Ezután egy 30 G-s tűvel (körülbelül 0,3 mm) átszúrtuk a dura mater-t a kraniotomia közvetlen közelében. Ezután HCO3-at vittünk fel egy vékony, 3×3 cm-es parafilmre, és eltávolítottuk a felesleges táptalajt. Egy 23 G-s, 45°-os tűhöz csatlakoztatott Hamilton fecskendővel óvatosan szívjunk fel hCO₂-t a tű legtávolabbi végébe. Ezután helyezzük a fecskendőt a sztereotaxiás eszközhöz csatlakoztatott fecskendőpumpára. Ezután helyezzük a tű hegyét a dura materbe korábban készített 0,3 mm széles szúrás fölé (z = 0 mm), és szűkítsük a fecskendőt 1-2 mm-rel (z = körülbelül -1,5 mm), amíg a tű a dura mater A közé nem kerül. Sűrű zárás képződik. Ezután emeljük a fecskendőt a kéreg felszínének közepére z = -0,5 mm-nél, és percenként 1-2 µl sebességgel injektáljuk a hCO₂-t. A hCO₂ injekció beadása után a tűt percenként 0,2-0,5 mm sebességgel visszahúzzuk, a bőrt összevarrjuk, és a kölyökkutyát azonnal meleg melegítőpárnára helyezzük a teljes felépülésig. Néhány állatot kétoldali átültetésben részesítettünk.
Minden állatkísérletet a Stanford Egyetem APLAC által jóváhagyott állatgondozási irányelveinek megfelelően végeztek. A patkányokat (a transzplantáció után 60 napnál idősebbeket) 5%-os izofluránnal érzéstelenítették, majd a képalkotás során 1-3%-os izofluránnal altatták. A vizualizációhoz egy 7 Teslás, aktívan árnyékolt, vízszintes fúrólyuk-szkennert (Bruker Corp.) használtak, amely egy International Electric Company (IECO) gradiensmeghajtóval, egy 120 mm belső átmérőjű árnyékolt gradiensbetéttel (600 mT/m, 1000 T/m/s) volt felszerelve, AVANCE. III készülékkel, nyolccsatornás, többtekercses RF és többmagos képességekkel, valamint a hozzá tartozó Paravision 6.0.1 platformmal. A felvételt egy 86 mm belső átmérőjű, aktívan leválasztott volumetrikus RF tekercssel és egy négycsatornás, kriohűtéses RF tekercssel végezték, kizárólag vételre. Axial 2D Turbo-RARE (ismétlési idő = 2500 ms, visszhangidő = 33 ms, 2 átlagolás) 16 szeletfelvétellel, 0,6–0,8 mm szeletvastagsággal, 256 × 256 mintát tartalmazva. A jeleket egy 2 cm belső átmérőjű kvadratúra adó-vevő volumetrikus RF tekerccsel (Rapid MR International, LLC) vettük. Végül a beépített Imaris (BitPlane) felületbecslő függvényeket használtuk a 3D rendereléshez és a térfogatelemzéshez. Sikeres transzplantációnak azt tekintettük, amely során folyamatos T2 súlyozott MRI-jelű területek alakultak ki az átültetett féltekében. A graft kilökődésének azt a graftot tekintettük, amely nem eredményezett folyamatos T2 súlyozott MRI-jelű területeket az átültetett féltekében. A szubkortikális t-hCO-t kizártuk a későbbi elemzésből.
A GCaMP6-ok stabil expressziója hCO-ban a kétfotonos kalcium képalkotáshoz a hiPS sejteket pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro vírussal fertőzte meg, majd antibiotikumokat szelektáltak. Röviden, a sejteket EDTA-val disszociálták, és 1 ml Essential 8 táptalajban szuszpendálták körülbelül 300 000 sejt sűrűséggel polibrén (5 μg/ml) és 15 μl vírus jelenlétében. A sejteket ezután 60 percig szuszpenzióban inkubálták, majd 50 000 sejt/lyuk sűrűséggel beoltották. A konfluencia után a sejteket 5-10 μg ml-1 puromicinnel kezelték 5-10 napig, vagy amíg stabil telepek megjelentek. Az akut hCO fertőzést a korábban leírtak szerint végezték5, néhány módosítással. Röviden, a 30-45. napon a hCO-t 100 µl idegtáptalajt tartalmazó 1,5 ml-es Eppendorf mikrocentrifuga csövekbe helyezték. Ezután körülbelül 90 µl táptalajt veszünk ki, 3-6 µl magas titerű lentivírust (0,5 x 108-tól 1,2 x 109-ig) adunk a csőbe, és a hCO3-at 30 percre átvisszük az inkubátorba. Ezután adjunk 90–100 µl táptalajt minden csőhöz, és tegyük vissza a csöveket az inkubátorba egy éjszakára. Másnap a hCO3-at friss idegtáptalajra tesszük át alacsony tapadású lemezeken. 7 nap elteltével a hCO3-at 24-lyukú üvegaljú lemezekre vittük át a fertőzés minőségének vizualizálása és értékelése céljából. A pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE és a pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE plazmidokat a VectorBuilder segítségével generáltuk. A lentivírust a legtöbb kísérletben azért használják, mert integrálódik a gazdaszervezet genomjába, lehetővé téve a riportergén expresszióját a fertőzött sejtvonalakban. A veszettség utánkövetése érdekében a 30-45. napon a hCO-t veszettség-ΔG-eGFP-vel és AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA-val (plazmid #67528, Addgene) fertőzték meg, 3 napig alaposan mosták, majd S1 patkányokba transzplantálták és 7-14 napig in vivo tartották.
Az immuncitokémiához az állatokat elaltattuk, majd transzkardiálisan perfundáltuk PBS-sel, majd 4%-os paraformaldehiddel (PFA PBS-ben; Electron Microscopy Sciences). Az agyakat 4%-os PFA-ban fixáltuk 2 órán át, vagy egy éjszakán át 4°C-on, majd 30%-os szacharózos PBS-ben kriokonzerváltuk 48-72 órán át, és 1:1 arányú, 30%-os szacharóz:OCT elegybe (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) ágyaztuk, és 30 µm vastagságú koronális metszeteket készítettünk kriosztát (Leica) segítségével. A vastag metszetek immunhisztokémiájához az állatokat PBS-sel perfundáltuk, az agyat boncoltuk és koronálisan metszettük 300-400 µm vastagságban vibratómmal (Leica), és a metszeteket 4%-os PFA-val fixáltuk 30 percig. Ezután a kriometszeteket vagy vastag metszeteket PBS-sel mostuk, 1 órán át szobahőmérsékleten blokkoltuk (10% normál szamárszérum (NDS) és 0,3% Triton X-100 PBS-ben hígítva), majd 4°C-on blokkoló oldattal blokkoltuk. – Inkubáció A kriometszeteket egy éjszakán át, a vastag metszeteket pedig 5 napig inkubáltuk. Az alkalmazott elsődleges antitestek a következők voltak: anti-NeuN (egér, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (patkány, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (nyúl, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (csirke, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (egér, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (nyúl, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (nyúl, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (nyúl, 1:200; HPA047819, Atlas antitestek), anti-RECA-1 (egér, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (nyúl, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kecske, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (kecske, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (egér, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (egér, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (nyúl, 1:400; ABN904, Millipore) és anti-IBA1 (kecske, 1:100; ab5076, abcam). Az alkalmazott elsődleges antitestek a következők voltak: anti-NeuN (egér, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (patkány, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (nyúl, 1:1000; Z0334, Dako), anti-D-GFP (csirke, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (egér, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (nyúl, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (nyúl, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (nyúl, 1:200; HPA047819, Atlas antitestek), anti-RECA-1 (egér, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (nyúl, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kecske, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (kecske, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (egér, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (egér, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (nyúl, 1:400; ABN904, Millipore) és anti-IBA1 (kecske, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти,-CTIP2: ны0; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти-GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мы1,1910,8; abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas antitestek), ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a,;,1:1AF10D Rendszerek), анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABABN900)-IBAiант904, (коза, 1 :100; аб5076, абкам). Az alkalmazott elsődleges antitestek a következők voltak: anti-NeuN (egér, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (patkány, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (nyúl, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (csirke, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (egér, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (nyúl, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (nyúl, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (nyúl, 1:200; HPA047819, Atlas antitestek), anti-RECA-1 (egér, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (nyúl, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kecske, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (kecske, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (egér, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (egér, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (nyúl, 1:400; ABN904, Millipore) és anti-IBA1 (kecske, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100，山羊，1:100， Systems）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (egér, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (nyúl, 1:400; ABN904, Millipore) és anti-IBA1 (kecske, 1:100; ab5076, abcam).Az alkalmazott elsődleges antitestek a következők voltak: anti-NeuN (egér, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (patkány, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (nyúl, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (csirke, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (egér, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (nyúl, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (nyúl, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (nyúl, 1:200; HPA047819, Atlas antitest), anti-RECA-1 (egér, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (nyúl), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM120,, мы:ш201, (1:04) Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) és анти-IBA1 (коза, 6мба70; 1,1500; 1,1500); 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kecske, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (kecske, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (egér, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (egér, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (nyúl, 1:400; ABN904, Millipore) és anti-IBA1 (kecske, 1:100; ab5076, abkam).A metszeteket ezután PBS-sel mostuk, majd másodlagos antitesttel inkubáltuk 1 órán át szobahőmérsékleten (fagyasztott metszetek) vagy egy éjszakán át 4°C-on (vastag metszetek). Alexa Fluor másodlagos antitestet (Life Technologies) használtunk, amelyet 1:1000 arányban hígítottunk blokkoló oldatban. PBS-sel történő mosás után a sejtmagokat Hoechst 33258 (Life Technologies) készülékkel vizualizáltuk. Végül a tárgylemezeket fedőlemezes mikroszkópra (Fisher Scientific) helyeztük Aquamount (Polysciences) segítségével, és Keyence fluoreszcens mikroszkópon (BZ-X analizátor) vagy Leica TCS SP8 konfokális mikroszkópon (Las-X) elemeztük a képen. A képeket az ImageJ programmal (Fidzsi-szigetek) dolgoztuk fel. Az emberi neuronok arányának meghatározásához a t-hCO-ban és a patkánykéregben 387,5 μm széles téglalap alakú képeket készítettünk a t-hCO középpontjában, a patkánykéreg szélén vagy annak közelében. A graft széleit a szöveti átlátszóság, a HNA+ sejtmagok és/vagy a szöveti autofluoreszcencia jelenlétének változásainak felmérésével határoztuk meg. Minden képen a NeuN+ és HNA+ sejtek teljes számát elosztották az ugyanazon a területen található NeuN+ sejtek teljes számával. Annak érdekében, hogy csak a képsíkban lévő sejtmaggal rendelkező sejteket számoljuk, csak a Hoechst+ sejteket is beleszámítjuk a számításba. A legalább 1 mm távolságra lévő két képet átlagoltuk a statisztikai hiba csökkentése érdekében.
Egy héttel a mintavétel előtt helyezzük a hCO₂ transzplantált állatokat (körülbelül 8 hónapos differenciálódási időszak) egy sötét szobába, a bajuszukat levágva az érzékszervi stimuláció minimalizálása érdekében. A sejtmagok izolálását a korábban leírtak szerint végezzük, némi módosítással. Röviden, a t-hCO₂-t és a hCO₂-t detergens-mechanikus sejtlízissel és 2 ml-es üvegszövet-darálóval (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE) bontottuk el. A nyers sejtmagokat ezután 40 µm-es szűrőn leszűrtük, és 320 g-vel 10 percig 4 °C-on centrifugáltuk, mielőtt szacharóz sűrűséggradiens elválasztás következett volna. A centrifugálási lépés (320 g 20 percig 4 °C-on) után a mintákat 0,04% BSA/PBS-ben reszuszpendáltuk 0,2 egység µl-1 RNáz inhibitor (40 u µl-1, AM2682, Ambion) hozzáadásával, és 40 µm-es áramlási szűrőn átengedtük. A disszociált sejtmagokat ezután 0,02% BSA-t tartalmazó PBS-ben reszuszpendáltuk, és egy Chromium Single Cell 3′ chipre vittük fel (becsült kinyerés 8000 sejt sávonként). Az snRNS-seq könyvtárakat a Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) segítségével készítettük el. Az snRNS-seq könyvtárakat a Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) segítségével készítettük el. Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Az snRNS-seq könyvtárakat Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) felhasználásával állítottuk elő. snRNA-seq 文库是使用Chromium Single Cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的. snRNA-seq 文库是使用Chromium Single Cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的. Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Az snRNA-seq könyvtárat Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) felhasználásával állítottuk elő.A különböző mintákból származó könyvtárakat az Admera Health NovaSeq S4 (Illumina) készülékkel összevonta és szekvenálta.
Az egyes feltételezett nukleáris vonalkódok génexpressziós szintjét a 10x Genomics CellRanger elemző szoftvercsomaggal (6.1.2-es verzió) számszerűsítettük. Konkrétan, a leolvasásokat az mkref paranccsal létrehozott humán (GRCh38, Ensemble, 98-as verzió) és patkány (Rnor_6.0, Ensemble, 100-as verzió) referencia genomok kombinációjával hasonlítottuk össze, amelyeket az „mkref” paranccsal hoztak létre, és a „count” függvénnyel, az „–include-introns=TRUE” paranccsal kvantifikálták az intron régiókhoz rendelt include leolvasásokat. A t-hCO minták esetében az emberi sejtmagokat azon konzervatív követelmény alapján azonosítottuk, hogy az összes leképezett leolvasás legalább 95%-a egyezzen az emberi genommal. Minden további elemzést a CellRanger által szűrt vonalkód-tömb kimenetén végeztünk az R csomag (4.1.2-es verzió) és a Seurat (4.1.1-es verzió)32 segítségével.
Annak érdekében, hogy csak a kiváló minőségű sejtmagok kerüljenek be a későbbi elemzésbe, minden mintához iteratív szűrési folyamatot alkalmaztunk. Először azonosítottuk és eltávolítottuk azokat az alacsony minőségű sejtmagokat, amelyekben kevesebb mint 1000 egyedi gén található, és a teljes mitokondrium több mint 20%-a található. Ezt követően a nyers génszám-mátrixot regularizált negatív binomiális regresszióval normalizáltuk az sctransform(vst.flavor=”v2″) függvény segítségével, amely a 3000 legvariabilisabb gént is azonosította alapértelmezett paraméterek használatával. A felső variábilis géneken dimenziócsökkentést végeztünk főkomponens-analízissel (PCA) alapértelmezett paraméterekkel, 30-as adathalmaz-dimenzió használatával (a dims = 30-at a térdízületek vizuális vizsgálata alapján választottuk, és az összes mintához és együttes elemzéshez használtuk). Ezután több iteratív klaszterezési kört hajtottunk végre (felbontás = 1), hogy a géneket az abnormálisan alacsony génszám (medián 10. percentilis alatt), az abnormálisan magas mitokondriális génszám (medián 95. percentilis felett) alapján osztályozzuk, hogy azonosítsuk és eltávolítsuk a feltételezett alacsony minőségű sejteket, klasztereket és/vagy a DoubletFinder33 csomaggal azonosított feltételezett ikrek magas arányát (átlagos DoubletFinder pontszám a 95. percentilis felett). A t-hCO mintákat (n=3) és a hCO mintákat (n=3) külön integráltuk az IntegrateData függvénnyel a fenti paraméterekkel. Ezután... Az integrált adathalmaz kvalitatív szűrésének egy újabb fordulóját a fent leírtak szerint végeztük el.
Az alacsony minőségű kernelek eltávolítása után az integrált adathalmazt csoportosítottuk (felbontás = 0,5) és beágyaztuk UMAP34 vizualizációs célokra. Az egyes klaszterek markergénjeit a FindMarkers függvénnyel határoztuk meg, a normalizált génexpressziós adatokból számított alapértelmezett paraméterekkel. A főbb sejtosztályokat a magzati és felnőttkori kérgi referencia adathalmazok markergén-expresszióval (19,20,21,35) és annotációval történő kombinálásával azonosítjuk és osztályozzuk. Különösen a keringő prekurzorokat az MKI67 és a TOP2A expressziója alapján azonosítottuk. A progenitor klasztereket a mitotikus transzkriptumok hiánya, a késői metafázisos magzati kéregben leírt multipotens gliális progenitor klaszterekkel való nagy átfedés, valamint az EGFR és az OLIG1 expressziója határozta meg. Az asztrocita kifejezést az asztrocita differenciálódás számos állapotának magába foglalására használjuk, a késői radiális gliától az asztrociták éréséig. Az asztrocita klaszterek magas szintű SLC1A3 és AQP4 expressziót mutatnak, és kimutatták, hogy a magzati radiális glia és/vagy a felnőtt asztrociták altípusaival térképezhetők fel. Az OPC-k PDGFRA-t és SOX10-et expresszálnak, míg az oligodendrociták mielinizációs markereket (MOG és MYRF) expresszálnak. A glutamáterg neuronokat neuronális transzkriptumok (SYT1 és SNAP25) jelenléte, GABAerg markerek hiánya (GAD2), valamint NEUROD6, SLC17A7, BCL11B vagy SATB2 expressziója alapján azonosították. A GluN neuronokat tovább osztották felső (SATB2 expresszió és BCL11B hiánya) és mély (BCL11B expresszió) alosztályokra. A feltételezett allemez (SP) neuronok a mély GluN markerek mellett ismert SP18 markereket is expresszálnak, mint például az ST18 és a SORCS1. A choroidea plexus-szerű sejteket TTR expresszió alapján azonosították, a meningea-szerű sejtek pedig fibroblaszt-asszociált géneket expresszáltak, és a referencia adatkészlet pial/vaszkuláris sejtjeit térképezték fel.
A t-hCO₃ és a hCO₃ alosztályok közötti génexpresszió differenciálanalízisét egy újonnan kifejlesztett pszeudo-batch módszerrel végeztük, amelyet a Libra R csomag (1.0.0 verzió) segítségével implementált mintákban reprodukáltunk. Konkrétan edgeR log-likelihood teszteket (3.36.0 verzió, R csomag) végeztünk csoportokra az adott sejtosztály sejtjeiben lévő gének számának összegzésével minden egyes minta replikációnál. A hőtérkép megjelenítéséhez a normalizált per millió (CPM) értékeket az edgeR (cpm() függvény) segítségével számítottuk ki, és skáláztuk (átlag = 0, szórás = 1 eléréséhez). A szignifikánsan felregulált t-hCO₃ GluN gének gén ontológiai (GO) dúsulási analízisét végeztük el (Benjamini-Hochberg korrigált P-érték kisebb, mint 0,05, a t-hCO₃ GluN sejtek legalább 10%-ában expresszálódott, és a változás legalább kétszerese volt), a ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 segítségével. A ToppFun alkalmazást alapértelmezett paraméterekkel használjuk, és a GO-annotált hipergeometrikus tesztekből számított Benjamini-Hochberg-korrigált P-értékeket közöljük.
Ahhoz, hogy az snRNS-szekvenálási klasztereinket összehasonlítsuk az elsődleges egysejtes RNS-szekvenálás vagy felnőttkori snRNS-szekvenálás referenciavizsgálataiból származó annotált sejtklaszterekkel19,20,21,22, párosított adatkészlet-integrációs megközelítést alkalmaztunk. A Seurat SCTransform (v2) normalizálási munkafolyamatát használtuk az adatkészletek közötti klaszterátfedések integrálásához és összehasonlításához (ugyanazokat a paramétereket használva, mint fent). Az egyes adatkészleteket véletlenszerűen osztottuk fel legfeljebb 500 sejtre vagy magra eredeti klaszterenként a számítási hatékonyság érdekében. A korábban leírtakhoz hasonló megközelítést alkalmazva, a klaszterátfedést úgy definiáltuk, mint az egyesített klaszterekben lévő sejtek vagy sejtmagok azon arányát, amelyek átfedésben voltak a referenciaklaszter címkéjével. A GluN-ek további osztályozásához a Seurat TransferData munkafolyamatát használtuk GluN részhalmazadatokhoz, hogy referencia adatkészlet-címkéket rendeljünk a GluN sejtjeinkhez.
A t-hCO és hCO minták globális transzkriptomjának érési állapotának felméréséhez összehasonlítottuk pszeudo-bulk mintáinkat a BrainSpan/psychENCODE23-mal, amely egy nagyméretű RNS-szekvenciából áll, amely az emberi agy fejlődését átfogja. PCA-t végeztünk egy kombinált, mintázat-normalizált génexpressziós mátrixon kérgi mintákból a fogantatás után 10 héttel, majd később 5567 génen (a mi adatainkkal együtt), amelyeket korábban aktívnak azonosítottak a BrainSpan kérgi mintákban (a köbös modell segítségével az életkorral magyarázott fejlődési variancia több mint 50%-át definiálva)38. Ezenkívül a korábban leírtak szerint nemnegatív mátrixfaktorizációval származtattuk a neurofejlődés fő transzkriptom-szignatúráival kapcsolatos géneket. A nemnegatív mátrixfaktorizációs eljárással számított mintasúlyokat az 5b. ábrán ábrázoljuk, Zhu és munkatársai által leírt öt szignatúra mindegyikére kibővített adatokkal.38 Az aktivitásfüggő transzkripciós markerek ismét korábban publikált tanulmányokból származtak. Különösen az ERG és az LRG expressziója volt szignifikánsan felregulálva a glutamáterg neuronokban, melyeket az egér látókéreg snRNS-szekvenálási gyűjteménye azonosított vizuális stimuláció után (3. kiegészítő táblázat, Hrvatin és munkatársai16). Emberben dúsított LRG-ket nyertek KCl-aktivált emberi magzati agykultúrákból, és a stimuláció után 6 órával gyűjtöttek be, a szűrt gének pedig szignifikánsan felregulálódtak emberekben, de nem rágcsálókban (4. kiegészítő táblázat). A génkészlet-dúsulás elemzését ezen génkészletek alkalmazásával egyutas Fisher-féle egzakt teszttel végezték.
A patkányokat izofluránnal altatjuk, agyvelőt távolítunk el, és hideg (kb. 4°C-os), oxigénnel dúsított (95% O2 és 5% CO2) szacharózoldatba helyezzük a következő összetételű metszetekhez: 234 mM szacharóz, 11 mM glükóz, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 és 0,5 mM CaCl2 (kb. 310 mOsm). A patkány agyának koronális metszeteit (300–400 µm), amelyek t-hCO3-at tartalmaztak, Leica VT1200 vibratómmal készítettük a korábban leírtak szerint39. A metszeteket ezután egy folyamatos szobahőmérsékletű oxigénellátású metszőkamrába helyeztük, amely 10 mM glükóz, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 és 126 mM NaCl (298 mOsm) összetételű aCSF-et tartalmazott. legalább 45 perccel a felvétel előtt. A metszeteket egy bemerített kamrában rögzítettük, ahol folyamatosan perfundáltuk aCSF-fel (95% O2 és 5% CO2 ampulla). Minden adatot szobahőmérsékleten rögzítettünk. A t-hCO neuronokat egy boroszilikát üveg pipettával termináltuk, amely 127 mM kálium-glükonátot, 8 mM NaCl-t, 4 mM magnézium-ATP-t, 0,3 mM nátrium-GTP-t, 10 mM HEPES-t és 0,6 mM EGTA-t tartalmazó oldattal volt feltöltve, pH 7,2, belső oldat KOH-val beállítva (290 mOsm). A kinyeréshez biocitint (0,2%) adtunk a regisztráló oldathoz.
Az adatokat MultiClamp 700B erősítővel (Molecular Devices) és Digidata 1550B digitalizálóval (Molecular Devices) gyűjtöttük, 2 kHz-en aluláteresztő szűréssel szűrtük, 20 kHz-en digitalizáltuk, és Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro) (2021b, OriginLab) és egyedi MATLAB függvényekkel (Mathworks) elemeztük. Az átmeneti potenciált JPCalc segítségével számítottuk ki, és a bejegyzéseket a -14 mV számított értékre igazítottuk. A IV. művelet 10-25 pA-es lépésekben mért áramlépésekből áll, -250 és 750 pA között.
A talamuszt, a fehérállományt és az S1 afferenseket elektromosan stimulálták talamokortikális szeletekben a hCO neuronok patch-clamp rögzítése során, a korábban leírtak szerint. Röviden, az agyat egy 10°-os szögben döntött 3D nyomtatóasztalra helyezték, és az agy elejét 35°-os szögben elvágták. Az agyat ezután a vágott felülethez ragasztották és metszeteket készítettek, megőrizve a talamokortikális kiálló axonokat. Bipoláris volfrámelektródákat (0,5 MΩ) szereltek egy második mikromanipulátorra, és stratégiailag elhelyezték őket úgy, hogy sejtenként négy régiót (belső tok, fehérállomány, S1 és hCO) stimuláljanak. Szinaptikus válaszokat rögzítettek 300 µA fázisos stimuláció után 0,03–0,1 Hz-en.
A hChR2-t expresszáló hCO neuronokat 480 nm-en aktiváltuk, és egy LED (Prizmatix) által generált fényimpulzusokat alkalmaztunk egy ×40 objektíven (0.9 NA; Olympus) keresztül, hogy rögzítsük a hChR2 expresszióját a sejtek közelében. A megvilágított mező átmérője körülbelül 0,5 mm, a teljes teljesítmény pedig 10-20 mW. Az impulzusszélességet 10 ms-ra állítottuk be, ami megfelel a viselkedési tanulási kísérlet során adott impulzusnak. Különböző stimulációs frekvenciákat alkalmaztunk, 1-től 20 Hz-ig, de a sorozat első impulzusát használtuk a kvantifikációhoz. A sorozatok közötti intervallumok általában hosszabbak, mint 30 másodperc, hogy minimalizáljuk a szinaptikus gátló vagy facilitáló útvonalakra gyakorolt ​​hatást. Annak tesztelésére, hogy a hChR2 válasz monoszinaptikus-e, TTX-et (1 μM) adtunk a fürdőhöz, amíg az EPSC reakció eltűnt, majd 4-aminopiridint (4-AP; 100 μM) adtunk hozzá. A válasz jellemzően néhány percen belül visszatér, a LED bekapcsolása és az EPSC generálása között valamivel hosszabb késleltetéssel. Az NBQX-et (10 μM) használtuk annak tesztelésére, hogy a választ AMPA receptorok vezérlik-e.
Az éles hCO3 metszeteket a korábban leírtak szerint készítettük. Röviden, a hCO3 metszeteket 4%-os agarózba ágyaztuk, majd 126 mM NaCl-t, 2,5 mM KCl-t, 1,25 mM NaH2PO4-et, 1 mM MgSO4-et, 2 mM CaCl2-t, 26 mM NaHCO3-at és 10 mM d-(+)-glükózt tartalmazó sejtekbe vittük át. A metszeteket 200–300 µm vastagságban vágtuk ki szobahőmérsékleten Leica VT1200 vibrátorral, majd szobahőmérsékleten ASF-ben tároltuk. Ezután a hCO3 metszeteken teljes sejtek patch-camp elkövetését végeztük direkt SliceScope mikroszkóp (Scientifica) alatt. A metszeteket aCSF-fel (95% O2 és 5% CO2) perfundáltuk, és a sejtjeleket szobahőmérsékleten rögzítettük. A hCO neuronokat boroszilikát üvegpipettával vittük fel, amely 127 mM kálium-glükonátot, 8 mM NaCl-t, 4 mM magnézium-ATP-t, 0,3 mM nátrium-GTP-t, 10 mM HEPES-t és 0,6 mM EGTA-t tartalmazó oldattal volt feltöltve. A belső pH 7, 2 volt, és KOH-val volt beállítva (ozmolaritás 290). A kinyeréshez 0,2% biocitint adtunk a belső oldathoz.
Az adatokat Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) szoftverrel rögzítettük, MultiClamp 700B erősítővel (Molecular Devices) és Digidata 1550B digitalizálóval (Molecular Devices), 2 kHz-en aluláteresztő szűréssel, 20 kHz-en digitalizáltuk, és Clampfit (10.6-os verzió) szoftverrel elemeztük (molecular devices) és egyedi MATLAB függvényekkel (MATLAB 2019b, Mathworks). Az átmeneti potenciált JPCalc segítségével számítottuk ki, és a bejegyzéseket a számított -14 mV-os átmeneti potenciálhoz igazítottuk. A IV. művelet 5-10 pA-es lépésekben, -50 és 250 pA között változó áramlépésekből áll.
A becsípődött neuronok morfológiai rekonstrukciójához 0,2%-os biocitint (Sigma-Aldrich) adtunk a belső oldathoz. A sejteket a feltörés után legalább 15 percig előkezeltük. A pipettát ezután lassan, 1-2 percig szívtuk be, amíg a regisztrált membrán teljesen lezárult. A metszetfiziológiai eljárást követően a metszeteket egy éjszakán át 4°C-on 4%-os PFA-ban fixáltuk, 3-szoros PBS-sel mostuk, majd 1:1000 arányban hígítottuk streptavidinnel konjugált DyLight 549 vagy DyLight 405 (Vector Labs) festékkel. A biocitinnel (2%; Sigma-Aldrich) töltött sejteket patch clamp rögzítés közben, szobahőmérsékleten, 2 órán át jelöltük. A metszeteket ezután mikroszkópos tárgylemezekre rögzítettük Aquamount (Thermo Scientific) segítségével, majd másnap Leica TCS SP8 konfokális mikroszkópon vizualizáltuk, olajimmerziós objektívvel, amelynek numerikus apertúrája ×40 1,3, nagyítása ×0,9–1,0, xy. A mintavételi sebesség körülbelül 7 pixel/mikron. 1 µm-es intervallumokban sorozatban Z-vermeket készítettek, majd z-verem mozaikokat és Leica-alapú automatikus varrást végeztek az egyes neuronok teljes dendritfájának lefedésére. A neuronokat ezután félig manuálisan követték nyomon a neuTube 40 interfész segítségével, és SWC fájlokat generáltak. A fájlokat ezután feltöltötték a SimpleNeuriteTracer41 Fiji pluginba (ImageJ, 2.1.0 verzió; NIH).
Az emberi kéregszövetet tájékozott beleegyezéssel nyerték, a Stanford Egyetem Intézményi Felülvizsgálati Testülete által jóváhagyott protokoll szerint. Két szülés utáni emberi szövetmintát (3 és 18 évesek) nyertek a frontális kéreg (középső frontális gyrus) reszekciójával, refrakter epilepszia műtétjének részeként. A reszekció után a szövetet jéghideg NMDG-aCSF-ben vették, amely a következőket tartalmazta: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glükóz, 2 mM tiourea, 5 mM nátrium-aszkorbát, 3 mM nátrium-piruvát, 0,5 mM CaCl2·4H2O és 10 mM MgSO4·7H2O. Tömény sósavval pH 7,3-7,4-re titrálták. A szöveteket 30 percen belül szállították a laboratóriumba, és a fent leírt eljárás szerint koronális metszeteket vettek.
Minden állatkísérletet a Stanford Egyetem APLAC által jóváhagyott állatgondozási irányelveinek megfelelően végeztünk. A patkányokat (a transzplantáció után 140 napnál idősebbeket) 5%-os izofluránnal altattuk, majd intraoperatívan 1-3%-os izofluránnal altattuk. Az állatokat sztereotaxiás keretbe (Kopf) helyeztük, és szubkután injekcióztuk be őket nyújtott felszívódású buprenorfinnal (SR). A koponyát feltártuk, megtisztítottuk, és 3-5 csontcsavart helyeztünk be. A t-hCO2 célzott eléréséhez sztereotaxiás koordinátákat generáltunk MRI-képekből. Egy furatot fúrtunk a vizsgált helyen, és a rostokat (400 µm átmérőjű, NA 0,48, Doric) 100 µm-rel a hCO2 felszíne alá süllyesztettük, majd UV-fényre keményedő fogászati ​​cementtel (Relyx) rögzítettük a koponyához.
A szálas fotometriai felvételeket a korábban leírtak szerint végeztük42. A spontán aktivitás rögzítéséhez a patkányokat tiszta ketrecbe helyeztük, és egy 400 µm átmérőjű száloptikai patchkábelt (Doric), amely egy száloptikai fotometriai adatgyűjtő rendszerhez volt csatlakoztatva, csatlakoztattunk a beültetett száloptikai kábelhez. A motoros aktivitás 10 perces rögzítése alatt az állatok szabadon felfedezhették a ketrecet. A kiváltott aktivitás rögzítéséhez a patkányokat (a transzplantáció után több mint 140 nappal) 5%-os izofluránnal altattuk indukció céljából, és 1-3%-os izofluránnal altattuk fenntartólag. Az állatot sztereotaktikus keretbe (Kopf) helyeztük, és a t-hCO2 másik oldalán lévő bajuszokat körülbelül 2 cm-re vágtuk, majd egy piezoelektromos aktuátorhoz (PI) csatlakoztatott hálón átvezettük. Egy 400 µm-es száloptikai patchkábelt (Doric) csatlakoztattunk a beültetett szálhoz, majd az adatgyűjtő rendszerhez. A t-hCO2 másik oldalán lévő bajuszszálakat ezután piezoelektromos meghajtóval 50-szer eltérítették (2 mm 20 Hz-en, 2 másodpercig megjelenítésenként) véletlenszerű időpontokban, 20 perces felvételi időszak alatt. Az eltérítési idő szabályozásához az Arduino MATLAB támogatási csomagot használták egyedi MATLAB kóddal. Az eseményeket tranzisztor-tranzisztor logikai (TTL) impulzusok segítségével szinkronizálták az adatgyűjtő szoftverrel.
A transzplantáció után 140 napnál idősebb patkányokat 5%-os izofluránnal érzéstelenítettük, majd intraoperatívan 1-3%-os izofluránnal altattuk. Az állatokat sztereotaxiás keretbe (Kopf) helyeztük, és buprenorfin SR-t és dexametazont injektáltunk szubkután. A koponyát feltártuk, megtisztítottuk, és 3-5 csontcsavart helyeztünk be. A t-hCO célzott eléréséhez MRI-képekből sztereotaxiás koordinátákat generáltunk. Kör alakú kraniotomiát (kb. 1 cm átmérőjű) végeztünk nagy sebességű fúróval közvetlenül az átültetett hCO felett. Miután a csont a lehető legvékonyabb lett, de még az egész csont átfúrása előtt, csipesszel eltávolítottuk a megmaradt ép medenceporckorongot, hogy felfedjük az alatta lévő t-hCO-t. A kraniotomiát steril sóoldattal töltöttük fel, és egy fedőlemezt és egy speciális fejtűt rögzítettünk a koponyához UV-származékkal kezelt fogászati ​​cementtel (Relyx).
A kétfoton képalkotást Bruker multifoton mikroszkóppal és Nikon LWD (×16, 0,8 NA) objektívvel végeztük. A GCaMP6 képalkotást 920 nm-en, 1,4x-es egyetlen z-síkú nagyítással és 8x-os átlagos 7,5 fps-sel végeztük. A patkányokat 5%-os izoflurán érzéstelenítéssel indukáltuk, majd 1-3%-os izofluránnal fenntartottuk. A patkányokat egy egyedi készítésű fejrögzítőbe helyeztük, és a lencse alá helyeztük. A motoros aktivitás 3 perces háttérfelvételét készítettük. A 20 perces felvétel során 50 puffanást (mindegyik 100 ms hosszú) juttattunk véletlenszerűen a t-hCO2-val szemben lévő bajuszpárnára egy picospricer segítségével. Az Arduino MATLAB Support Package segítségével szabályoztuk a burst időt egyedi MATLAB kóddal. Az eseményeket szinkronizáltuk az adatgyűjtő szoftverrel (PrairieView 5.5) TTL impulzusok segítségével. Az elemzéshez a képeket xy mozgásra korrigáltuk affin korrekcióval a Fidzsi-szigeteken indított MoCo programban. Fluoreszcens nyomok extrakciója egyes sejtekből CNMF-E43 segítségével. A fluoreszcenciát minden egyes érdekes régióra extraháltuk, dF/F görbékké alakítottuk, majd z-pontszámmá alakítottuk.
A transzplantáció után 140 napnál idősebb patkányokat 5%-os izofluránnal érzéstelenítettük, majd intraoperatívan 1-3%-os izofluránnal altattuk. Az állatokat sztereotaxiás keretbe (Kopf) helyeztük, és buprenorfin SR-t és dexametazont injektáltunk bőr alá. A t-hCO-val ellentétes oldalon lévő bajuszszálakat körülbelül 2 cm-esre vágtuk, és egy piezoelektromos aktuátorhoz csatlakoztatott hálón átfűztük. A koponyát feltártuk és megtisztítottuk. Egy rozsdamentes acél földelőcsavart rögzítettünk a koponyához. A t-hCO célzott eléréséhez sztereotaxiás koordinátákat generáltunk MRI-képekből. Kör alakú kraniotomiát végeztünk (körülbelül 1 cm átmérőjű) nagy sebességű fúróval, közvetlenül a t-hCO felett. Miután a csont a lehető legvékonyabb lett, de mielőtt a teljes csontot átfúrtuk volna, csipesszel eltávolítottuk a fennmaradó ép medenceporckorongot, hogy felfedjük az alatta lévő t-hCO-t. Az egyes sejteket 32 ​​vagy 64 csatornás, nagy sűrűségű szilícium szondákkal (Cambridge Neurotech) rögzítettük, amelyek földelőcsavarokhoz voltak földelve, és RHD erősítőkkel (Intan) előerősítettük. A manipulátor segítségével az elektródákat a célhelyre engedtük le a steril sóoldattal töltött kraniotomia segítségével. Az adatgyűjtést 30 kHz frekvencián végeztük az Open Ephys adatgyűjtő rendszer segítségével. A felvétel csak akkor folytatódott, amikor több mint 10 csatornában erősen korreláló ritmikus spontán aktivitást észleltünk, ami arra utalt, hogy az elektródák a graftban helyezkedtek el (a kétfotonos kalcium képalkotó adatok alapján). A motoros aktivitás 10 perces háttérfelvételét kaptuk. A t-hCO2 másik oldalán lévő bajuszokat ezután 50-szer (2 mm 20 Hz-en, 2 másodpercenként) eltérítettük véletlenszerű időpontokban egy piezoelektromos meghajtóval egy 20 perces felvételi időszak alatt. A MATLAB Support Package for Arduino (MATLAB 2019b) használatával az eltérítési időt egyedi MATLAB kóddal szabályoztuk. TTL impulzusokkal szinkronizáltuk az eseményeket az adatgyűjtő szoftverrel.
Optikai jelölési kísérletekhez egy 200 µm-es optikai patch kábelt (Doric), amely egy 473 nm-es lézerhez (Omicron) volt csatlakoztatva, egy 200 µm-es optikai szálhoz csatlakoztattak, amelyet a koponyanyílás fölé helyeztek. Közvetlenül ez előtt állították be az jumper teljesítményét 20 mW-ra. A manipulátor segítségével engedjék le az elektródákat a célhelyre a koponyanyíláson keresztül, amely steril sóoldattal volt feltöltve. A felvétel kezdetén tíz, 473 nm-es fényimpulzust (2 Hz frekvencia, 10 ms impulzus időtartama) bocsátottak ki. A fényérzékeny sejteket olyan sejtekként definiálták, amelyek a kísérletek 70%-ában vagy annál több esetben 10 ms-on belül tüskeválaszt mutattak.