Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com oldalt.Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik.A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben).Addig is a folyamatos támogatás érdekében a webhelyet stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg.
A folyékony biopszia (LB) egy olyan fogalom, amely gyorsan egyre népszerűbb az orvosbiológiai területen.A koncepció főként a keringő extracelluláris DNS (ccfDNS) fragmenseinek kimutatásán alapul, amelyek főleg kis fragmentumokként szabadulnak fel a sejthalál után különböző szövetekben.E töredékek kis része idegen (idegen) szövetekből vagy organizmusokból származik.A jelenlegi munkában ezt a koncepciót a kagylókra alkalmaztuk, amely egy őrszemfaj, amely magas tengervízszűrő képességéről ismert.Használjuk a kagylók azon képességét, hogy természetes szűrőként működjenek a környezeti DNS-fragmentumok különféle forrásokból történő befogására, hogy információt nyújtsunk a tengeri part menti ökoszisztémák biológiai sokféleségéről.Eredményeink azt mutatják, hogy a kagyló hemolimfája nagymértékben eltérő méretű DNS-fragmenseket tartalmaz, 1 és 5 kb között.A shotgun szekvenálás kimutatta, hogy nagyszámú DNS-fragmens idegen mikrobiális eredetű.Ezek között találtunk baktériumokból, archaeákból és vírusokból származó DNS-fragmenseket, köztük olyan vírusokat, amelyekről ismert, hogy megfertőzik a part menti tengeri ökoszisztémákban gyakran előforduló gazdaszervezeteket.Összefoglalva, tanulmányunk azt mutatja, hogy a kagylókra alkalmazott LB koncepció gazdag, de még feltáratlan tudásforrást jelent a tengeri part menti ökoszisztémák mikrobiális sokféleségével kapcsolatban.
A klímaváltozás (CC) hatása a tengeri ökoszisztémák biológiai sokféleségére a kutatások gyorsan növekvő területe.A globális felmelegedés nemcsak jelentős fiziológiai terheléseket okoz, hanem a tengeri élőlények termikus stabilitásának evolúciós határait is kitolja, számos faj élőhelyére hatással van, és arra készteti őket, hogy kedvezőbb feltételek után keressenek [1, 2].Amellett, hogy befolyásolja a metazoák biológiai sokféleségét, a CC megzavarja a gazda-mikrobiális kölcsönhatások kényes egyensúlyát.Ez a mikrobiális diszbakteriózis komoly veszélyt jelent a tengeri ökoszisztémákra, mivel fogékonyabbá teszi a tengeri élőlényeket a fertőző kórokozókkal szemben [3, 4].Úgy gondolják, hogy az SS fontos szerepet játszik a tömeges halálesetekben, ami komoly problémát jelent a globális tengeri ökoszisztémák kezelésében [5, 6].Ez fontos kérdés számos tengeri faj gazdasági, ökológiai és táplálkozási hatásai miatt.Ez különösen igaz a sarki régiókban élő kagylókra, ahol a CK hatásai közvetlenebbek és súlyosabbak [6, 7].Valójában a kagylók, például a Mytilus spp.széles körben használják a CC tengeri ökoszisztémákra gyakorolt ​​hatásának nyomon követésére.Nem meglepő, hogy viszonylag sok biomarkert fejlesztettek ki egészségi állapotuk monitorozására, gyakran kétszintű megközelítést alkalmazva, amely funkcionális biomarkereket foglal magában enzimatikus aktivitáson vagy sejtfunkciókon, például a sejt életképességén és fagocita aktivitásán [8].Ezek a módszerek magukban foglalják a nagy mennyiségű tengervíz felszívódását követően a lágyszövetekben felhalmozódó specifikus nyomásindikátorok koncentrációjának mérését is.A kagylók nagy szűrési kapacitása és félig nyitott keringési rendszere azonban lehetőséget ad új hemolimfa biomarkerek kifejlesztésére a folyékony biopszia (LB) koncepciójával, amely egy egyszerű és minimálisan invazív megközelítés a betegkezelésben.vérminták [9, 10].Bár többféle keringő molekula megtalálható a humán LB-ben, ez a koncepció elsősorban a plazmában keringő extracelluláris DNS (ccfDNS) fragmensek DNS-szekvenálási analízisén alapul.Valójában a 20. század közepe óta ismert a keringő DNS jelenléte az emberi plazmában [11], de a nagy áteresztőképességű szekvenálási módszerek megjelenése csak az utóbbi években vezetett a ccfDNS-en alapuló klinikai diagnózishoz.Ezeknek a keringő DNS-fragmenseknek a jelenléte részben a genomiális DNS (nukleáris és mitokondriális) sejthalál utáni passzív felszabadulásának köszönhető. Egészséges egyénekben a ccfDNS koncentrációja általában alacsony (<10 ng/mL), de 5-10-szeresére nőhet különböző patológiákban szenvedő vagy stressznek kitett betegekben, ami szövetkárosodást eredményez. Egészséges egyénekben a ccfDNS koncentrációja általában alacsony (<10 ng/mL), de 5-10-szeresére nőhet különböző patológiákban szenvedő vagy stressznek kitett betegekben, ami szövetkárosodást eredményez. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатьлуся в 5–10 разный разнычы огией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Egészséges emberekben a cccDNS koncentrációja általában alacsony (<10 ng/mL), de 5-10-szeresére nőhet különböző patológiás vagy szövetkárosodást okozó stressz alatt álló betegeknél.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理有各种病理或承傁加5-10 倍，从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 各 种 病理 或可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 似 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 прациныныто патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. A ccfDNS koncentrációja általában alacsony (<10 ng/ml) egészséges egyénekben, de 5-10-szeresére növelhető különböző patológiás vagy stresszes betegeknél, ami szövetkárosodást eredményez.A ccfDNS-fragmensek mérete széles skálán változik, de általában 150 és 200 bp között mozog.[12].A saját eredetű ccfDNS, azaz a normál vagy transzformált gazdasejtekből származó ccfDNS elemzése felhasználható a nukleáris és/vagy mitokondriális genomban jelen lévő genetikai és epigenetikai változások kimutatására, ezáltal segítve a klinikusokat a specifikus molekuláris célzott terápiák kiválasztásában [13].A ccfDNS azonban beszerezhető idegen forrásokból, például magzati sejtekből a terhesség alatt vagy átültetett szervekből származó ccfDNS-ből [14,15,16,17].A ccfDNS fontos információforrás egy fertőző ágens (idegen) nukleinsavai jelenlétének kimutatásához is, amely lehetővé teszi a vértenyészetekkel nem azonosított, széles körben elterjedt fertőzések non-invazív kimutatását, elkerülve a fertőzött szövet invazív biopsziáját [18].A legújabb tanulmányok valóban kimutatták, hogy az emberi vér gazdag információforrást tartalmaz, amely felhasználható vírusos és bakteriális kórokozók azonosítására, és hogy az emberi plazmában található ccfDNS körülbelül 1%-a idegen eredetű [19].Ezek a vizsgálatok azt mutatják, hogy egy szervezet keringő mikrobiomjának biológiai sokfélesége ccfDNS-analízissel értékelhető.Ezt a fogalmat azonban egészen a közelmúltig kizárólag az emberek, és kisebb mértékben más gerincesek is használták [20, 21].
Ebben a cikkben az LB potenciált használjuk az Aulacomya atra ccfDNS-ének elemzésére, amely egy déli faj, amely általában a szubantarktikus Kerguelen-szigeteken található, egy szigetcsoport egy nagy fennsíkon, amely 35 millió évvel ezelőtt alakult ki.vulkánkitörés.Egy in vitro kísérleti rendszer segítségével azt találtuk, hogy a tengervízben lévő DNS-fragmenseket a kagylók gyorsan felveszik, és bejutnak a hemolimfa-rekeszbe.A sörétes szekvenálás kimutatta, hogy a kagyló hemolimfa ccfDNS-e saját és nem saját eredetű DNS-fragmenseket tartalmaz, köztük szimbiotikus baktériumokat és a hideg vulkáni tengerparti ökoszisztémákra jellemző biomák DNS-fragmenseit.A hemolimfa ccfDNS különböző gazdasejttartományú vírusokból származó vírusszekvenciákat is tartalmaz.Többsejtű állatokból, például csontos halakból, tengeri kökörcsinekből, algákból és rovarokból származó DNS-fragmenseket is találtunk.Összefoglalva, tanulmányunk azt mutatja, hogy az LB-koncepció sikeresen alkalmazható tengeri gerincteleneknél, hogy gazdag genomi repertoárt generáljon a tengeri ökoszisztémákban.
Kifejlett (55-70 mm hosszú) Mytilus platensis (M. platensis) és Aulacomya atra (A. atra) Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 K.) sziklás partjairól gyűjtöttük.Kerguelen-szigetek 2018 decemberében. Más kifejlett kékkagylókat (Mytilus spp.) egy kereskedelmi beszállítótól (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) szereztünk be, és egy szabályozott hőmérsékletű (4°C) levegőztetett tartályba helyezték, amely 10–20 liter 32‰-es mesterséges sóoldatot tartalmazott.(mesterséges tengeri só Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA).Minden kísérletnél megmértük az egyes héjak hosszát és súlyát.
A program ingyenes nyílt hozzáférésű protokollja elérhető online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Röviden, az LB hemolimfát az abduktor izmokból gyűjtöttük össze [22].A hemolimfát centrifugálással tisztítottuk 1200×g-vel 3 percig, a felülúszót felhasználásig lefagyasztottuk (-20°C).A cfDNS izolálásához és tisztításához a mintákat (1,5-2,0 ml) felolvasztjuk, és a NucleoSnap cfDNS kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) segítségével feldolgozzuk a gyártó utasításai szerint.A ccfDNS-t -80 °C-on tároltuk a további elemzésig.Egyes kísérletekben ccfDNS-t izoláltak és tisztítottak a QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada) segítségével.Az izolált ccfDNS fragmensek eloszlását kapilláris elektroforézissel elemeztük, Agilent 2100 bioanalizátort (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) használva egy High Sensitivity DNA Kit segítségével.
A hemolimfa ccfDNS-fragmenseinek szekvenálásához a Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) shotgun-könyvtárakat készített az Illumina MiSeq PE75 kit Illumina DNA Mix készletével.Szabványos adaptert (BioO) használtunk.A nyers adatfájlok az NCBI Sequence Read Archive-ból (SRR8924808 és SRR8924809) érhetők el.Az alapvető olvasási minőséget FastQC [23] segítségével értékeltük.A Trimmomatic [24]-et adapterek levágásához és rossz minőségű leolvasásokhoz használták.A páros végű sörétes leolvasásokat FLASH-val egyesítették hosszabb egyedi leolvasásokká, legalább 20 bp átfedéssel az eltérések elkerülése érdekében [25]. Az egyesített leolvasásokat BLASTN-nel annotáltuk egy kéthéjú NCBI Taxonomy adatbázis segítségével (e-érték < 1e-3 és 90%-os homológia), az alacsony komplexitású szekvenciák maszkolását pedig DUST segítségével [26]. Az egyesített leolvasásokat BLASTN-nel annotáltuk egy kéthéjú NCBI Taxonomy adatbázis segítségével (e-érték < 1e-3 és 90%-os homológia), az alacsony komplexitású szekvenciák maszkolását pedig DUST segítségével [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двусты таксономии двусты чение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с испологии с использо Az összevont leolvasásokat BLASTN-nel annotáltuk az NCBI kéthéjú taxonómiai adatbázis segítségével (e-érték < 1e-3 és 90%-os homológia), az alacsony komplexitású szekvenciamaszkolást pedig DUST segítségével [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释吼并的读数]低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 6复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данческой базы данскотлорхдчаных BI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использо. Az összevont leolvasásokat BLASTN-nel annotáltuk az NCBI kéthéjú taxonómiai adatbázis segítségével (e-érték <1e-3 és 90%-os homológia), az alacsony komplexitású szekvenciamaszkolást pedig DUST segítségével [26].Az olvasásokat két csoportra osztották: a kéthéjú szekvenciákkal kapcsolatos (itt önolvasásnak) és a nem kapcsolódó (nem önolvasási) csoportra.Két csoportot külön-külön állítottunk össze MEGAHIT segítségével a kontigok létrehozásához [27].Eközben az idegen mikrobiómák taxonómiai eloszlását a Kraken2 [28] segítségével osztályozták, és grafikusan ábrázolták egy Krona kördiagrammal a Galaxyn [29, 30].Előkísérleteink alapján az optimális kmers-t kmers-59-ben határoztuk meg. Az önkontigeket ezután a BLASTN-nel (kéthéjú NCBI-adatbázis, e-érték < 1e-10 és 60%-os homológia) való illesztéssel azonosítottuk a végső megjegyzéshez. Az önkontigeket ezután a BLASTN-nel (kéthéjú NCBI-adatbázis, e-érték < 1e-10 és 60%-os homológia) való illesztéssel azonosítottuk a végső megjegyzéshez. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Az önkontigeket ezután a BLASTN (NCBI kéthéjú adatbázis, e-érték <1e-10 és 60%-os homológia) összehasonlításával azonosítottuk a végső megjegyzéshez.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来迤衫衫最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Ezután az önkontigeket azonosítottuk a végső annotációhoz a BLASTN (NCBI kéthéjú adatbázis, e-érték <1e-10 és 60%-os homológia) összehasonlításával. Ezzel párhuzamosan a nem saját csoportkontigeket BLASTN-nel (nt NCBI adatbázis, e érték < 1e−10 és 60%-os homológia) annotáltuk. Ezzel párhuzamosan a nem saját csoportkontigeket BLASTN-nel (nt NCBI adatbázis, e érték < 1e−10 és 60%-os homológia) annotáltuk. Паралелно черодные груоы контиги ыи аи анноtt оаны с о о щ blastn (баз даных nt ncbi, з 100 л о о о о о о о о о о о о о о о о о о о о fi. Ezzel párhuzamosan az idegen csoport kontigjait BLASTN-nel (NT NCBI adatbázis, e érték <1e-10 és 60% homológia) annotáltuk. Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база даннч1,-иe1 гомология 60%). Ezzel párhuzamosan a nem saját csoport kontigeket annotáltuk BLASTN-nel (nt NCBI adatbázis, e érték <1e-10 és 60%-os homológia). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (знаeч10e) %). 还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧 源 傌源 傌源 傌 60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧 源 傌源 傌源 傌 60% BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%).
A PCR-hez használt primereket az S1 táblázat tartalmazza.A következő reakciókörülményeket alkalmaztuk: denaturálás 95 °C-on 3 percig, 95 °C-on 1 percig, beállított lágyítási hőmérséklet 1 percig, megnyújtás 72 °C-on 1 percig, 35 ciklus, végül 72 °C 10 percen belül..A PCR-termékeket elektroforézissel választottuk el SYBRTM Safe DNA Gel Stain-t (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) tartalmazó agaróz gélekben (1,5%) 95 V-on.
A humán galectin-7 cDNS-szekvenciát kódoló inszertet (NCBI letéti szám: L07769) tartalmazó plazmid DNS-t adtunk az ampullához 190 μg/μl végső koncentrációban.A harmadik kontrolltartály DNS-t tartalmazott kagyló nélkül.A tengervízben lévő DNS minőségének ellenőrzésére minden tartályból tengervízmintákat (20 μl; három ismétlés) vettünk a jelzett időpontban.A plazmid DNS nyomon követhetősége érdekében az LB kagylókat a jelzett időpontokban gyűjtöttük be, és qPCR-rel és ddPCR-rel analizáltuk.A tengervíz magas sótartalma miatt az alikvot részeket PCR minőségű vízzel (1:10) hígítottuk minden PCR vizsgálat előtt.
A digitális csepp-PCR-t (ddPCR) BioRad QX200 protokollal (Mississauga, Ontario, Kanada) végeztük.A cseppeket QX200 cseppgenerátorral (BioRad) hoztuk létre.A ddPCR-t a következőképpen végeztük: 95 °C 5 percig, 50 ciklus 95 °C-on 30 másodpercig és adott hőkezelési hőmérséklet 1 percig és 72 °C 30 másodpercig, 4 °C 5 percig és 90 °C 5 percen belül.A cseppek számát és a pozitív reakciókat (másolatszám/µl) QX200 cseppleolvasóval (BioRad) mértük.A 10 000-nél kevesebb cseppet tartalmazó mintákat elutasították.A minta-ellenőrzést nem végezték el minden alkalommal, amikor a ddPCR-t futtatták.
A qPCR-t Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Ausztrália) és LGALS7 specifikus primerekkel végeztük.Minden kvantitatív PCR-t 20 µl-ben végeztünk a QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) segítségével.A qPCR-t 15 perces 95 °C-os inkubációval kezdtük, majd 40 ciklust 95 °C-on 10 másodpercig és 60 °C-on 60 másodpercig, egy adatgyűjtéssel.Az olvadásgörbéket 95 °C-on 5 másodpercig, 65 °C-on 60 másodpercig, és 97 °C-on a qPCR végén egymást követő mérésekkel állítottuk elő.Minden qPCR-t három párhuzamosban végeztünk, kivéve a kontroll mintákat.
Mivel a kagylók magas szűrési sebességükről ismertek, először azt vizsgáltuk, hogy képesek-e kiszűrni és megtartani a tengervízben lévő DNS-fragmenseket.Arra is kíváncsiak voltunk, hogy ezek a töredékek felhalmozódnak-e a félig nyitott nyirokrendszerükben.Ezt a problémát kísérleti úton oldottuk meg úgy, hogy nyomon követtük a kékkagyló-tartályokhoz hozzáadott oldható DNS-fragmensek sorsát.A DNS-fragmensek nyomon követésének megkönnyítésére a humán galectin-7 gént tartalmazó idegen (nem saját) plazmid DNS-t használtuk.A ddPCR nyomon követi a plazmid DNS-fragmenseket tengervízben és kagylókban.Eredményeink azt mutatják, hogy ha a tengervízben a DNS-fragmensek mennyisége viszonylag állandó maradt az idő múlásával (legfeljebb 7 napig) kagyló hiányában, akkor kagyló jelenlétében ez a szint 8 órán belül szinte teljesen eltűnt (1a,b. ábra).Az exogén DNS-töredékek 15 percen belül könnyen kimutathatók voltak az intravalvuláris folyadékban és a hemolimfában (1c. ábra).Ezek a töredékek még 4 órával az expozíció után is kimutathatók voltak.Ez a szűrőaktivitás a DNS-fragmensek tekintetében összemérhető a baktériumok és algák szűrőaktivitásával [31].Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a kagylók képesek kiszűrni és felhalmozni az idegen DNS-t a folyadékrekeszekben.
A plazmid DNS relatív koncentrációja a tengervízben kagylók jelenlétében (A) vagy távollétében (B), ddPCR-rel mérve.Az A-ban az eredményeket százalékban fejezzük ki, a négyzetek szegélye pedig a 75. és 25. percentilist jelöli.Az illesztett logaritmikus görbe piros színnel látható, a szürkével árnyékolt terület pedig a 95%-os konfidencia intervallumot jelenti.A B-ben a piros vonal az átlagot, a kék vonal pedig a koncentráció 95%-os konfidencia intervallumát jelöli.C A plazmid DNS felhalmozódása a kagylók hemolimfájában és billentyűnedvében különböző időpontokban a plazmid DNS hozzáadása után.Az eredmények abszolút kimutatott másolatok/ml-ben (±SE) vannak megadva.
Ezt követően a ccfDNS eredetét vizsgáltuk a Kerguelen-szigeteken, a korlátozott antropogén befolyással rendelkező távoli szigetcsoporton, a kagylóágyakból gyűjtött kagylókban.Azt találtuk, hogy a kagylók átlagos hemolimfa ccfDNS-koncentrációja az alacsony mikrogramm/ml hemolimfa tartományba esik (lásd az S2 táblázatot, Kiegészítő információk).Ez a koncentrációtartomány jóval nagyobb, mint az egészséges emberekben (alacsony nanogramm/milliliter), de ritka esetekben, rákos betegekben a ccfDNS szintje elérheti a több mikrogrammot milliliterenként [34, 35].A hemolimfa ccfDNS méretbeli eloszlásának elemzése azt mutatta, hogy ezek a fragmentumok nagymértékben különböznek egymástól, 1000 bp és 1000 bp között.5000 bp-ig (2. ábra).Hasonló eredményeket kaptunk a szilícium-dioxid alapú QIAamp Investigator Kit segítségével, amely a törvényszéki tudományban általánosan használt módszer a genomi DNS gyors izolálására és tisztítására alacsony koncentrációjú DNS-mintákból, beleértve a ccfDNS-t is [36].
A kagyló hemolimfa reprezentatív ccfDNS elektroforegramja.A NucleoSnap Plasma Kit (fent) és a QIAamp DNA Investigator Kit segítségével extraháljuk.B Hegedűdiagram, amely a hemolimfa ccfDNS-koncentrációinak (±SE) eloszlását mutatja kagylóban.A fekete és piros vonal a mediánt, illetve az első és a harmadik kvartilist jelenti.
Tekintettel a kagylók félig nyitott keringési rendszerére, a mikrobiálisan gazdag tengervízre és a kagyló ccfDNS méretbeli eloszlására, azt feltételeztük, hogy a kagyló hemolimfa ccfDNS gazdag és változatos mikrobiális DNS-készletet tartalmazhat.Ennek a hipotézisnek a teszteléséhez hemolimfa ccfDNS-t szekvenáltunk a Kerguelen-szigetekről gyűjtött Aulacomya atra mintákból, több mint 10 millió leolvasást eredményezve, amelyek 97,6%-a átment a minőségellenőrzésen.A leolvasásokat ezután a saját és nem saját források szerint osztályozták a BLASTN és az NCBI kéthéjú adatbázisok segítségével (S1 ábra, kiegészítő információk).
Emberben nukleáris és mitokondriális DNS is felszabadulhat a véráramba [38].Jelen tanulmányban azonban nem lehetett részletesen leírni a kagylók nukleáris genomiális DNS-ét, mivel az A. atra genomját nem szekvenálták és nem írták le.Azonban sikerült azonosítanunk számos saját eredetű ccfDNS-fragmentumot a kéthéjú könyvtár segítségével (S2 ábra, kiegészítő információk).A saját eredetű DNS-fragmensek jelenlétét a szekvenált A. atra gének irányított PCR-amplifikációjával is igazoltuk (3. ábra).Hasonlóképpen, tekintettel arra, hogy az A. atra mitokondriális genomja nyilvános adatbázisokban elérhető, bizonyítékot találhatunk a mitokondriális ccfDNS-fragmensek jelenlétére az A. atra hemolimfájában.A mitokondriális DNS-fragmensek jelenlétét PCR-amplifikációval igazoltuk (3. ábra).
Az A. atra (piros pöttyök – készletszám: SRX5705969) és a M. platensis (kék pöttyök – készletszám: SRX5705968) hemolimfájában különböző mitokondriális gének voltak jelen PCR-rel amplifikálva.Ábra adaptált: Breton és munkatársai, 2011 B Az A. atra hemolimfa felülúszójának amplifikációja FTA papíron tárolva.3 mm-es lyukasztó segítségével közvetlenül a PCR-keveréket tartalmazó PCR-csőhöz adja hozzá.
Tekintettel a tengervíz bőséges mikrobiális tartalmára, kezdetben a hemolimfában található mikrobiális DNS-szekvenciák jellemzésére összpontosítottunk.Ehhez két különböző stratégiát alkalmazunk.Az első stratégia a Kraken2-t, egy algoritmus alapú szekvenciaosztályozó programot használt, amely a BLAST-hoz és más eszközökhöz hasonló pontossággal képes azonosítani a mikrobiális szekvenciákat [28].Több mint 6719 leolvasást állapítottak meg bakteriális eredetűnek, 124 és 64 pedig archaeából és vírusokból (4. ábra).A leggyakrabban előforduló bakteriális DNS-fragmensek a Firmicutes (46%), a Proteobaktériumok (27%) és a Bacteroidetes (17%) voltak (4a. ábra).Ez az eloszlás összhangban van a tengeri kékkagyló mikrobiomával kapcsolatos korábbi tanulmányokkal [39, 40].A gammaproteobaktériumok képezték a Proteobaktériumok fő osztályát (44%), köztük sok Vibrionales-t (4b. ábra).A ddPCR módszer megerősítette a Vibrio DNS fragmentumok jelenlétét az A. atra hemolymph ccfDNS-ében (4c. ábra) [41].A ccfDNS bakteriális eredetével kapcsolatos további információk megszerzéséhez egy további megközelítést alkalmaztak (S2 ábra, kiegészítő információk). Ebben az esetben az átfedő leolvasásokat páros végű leolvasásokként állítottuk össze, és saját (kéthéjúak) vagy nem öneredetűekként osztályozták a BLASTN használatával, valamint 1e-3 e-értékkel és 90% feletti homológiát mutató határértékkel. Ebben az esetben az átfedő leolvasásokat páros végű leolvasásokként állítottuk össze, és saját (kéthéjúak) vagy nem öneredetűekként osztályozták a BLASTN használatával, valamint 1e-3 e-értékkel és 90% feletti homológiát mutató határértékkel. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классировафиц орчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечемия олгиомолсгео%. Ebben az esetben az átfedő leolvasásokat páros végű leolvasásokként gyűjtöttük össze, és natív (kéthéjú) vagy nem eredetinek minősítették a BLASTN használatával, valamint 1e-3 e-értékkel és >90%-os homológiával határértékkel.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 梌和愚暄 暐 倀 值值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使 用 使用 使用 使用 使 用 使用和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。. a тые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гом>9 и порога гом>9%. Ebben az esetben az átfedő leolvasásokat páros végű leolvasásokként gyűjtöttük össze, és saját (kéthéjúak) vagy nem eredetinek minősítették e BLASTN és 1e-3 értékek és 90% feletti homológia küszöb alapján.Mivel az A. atra genomját még nem szekvenálták, a MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) összeszerelő de novo összeállítási stratégiáját alkalmaztuk.Összesen 147 188 kontigot azonosítottak függőként (kéthéjúként).Ezeket a kontigokat ezután 1e-10 e-értékekkel robbantották fel a BLASTN és a BLASTX segítségével.Ez a stratégia lehetővé tette számunkra, hogy 482 nem kéthéjú fragmentumot azonosítsunk az A. atra ccfDNS-ben.Ezen DNS-fragmensek több mint fele (57%) baktériumokból származik, főként kopoltyú szimbiontákból, köztük szulfotróf szimbiontákból, valamint Solemya velum kopoltyúszimbiontákból (5. ábra).
Relatív bőség típus szinten.B Két fő törzs (Firmicutes és Proteobacteria) mikrobiális diverzitása.A ddPCR reprezentatív amplifikációja C Vibrio spp.A. A 16S rRNS gén töredékei (kék) három atra hemolimfában.
Összesen 482 összegyűjtött kontigot elemeztek.A metagenomikus kontig annotációk (prokarióták és eukarióták) taxonómiai eloszlásának általános profilja.B A BLASTN és BLASTX által azonosított bakteriális DNS-fragmensek részletes eloszlása.
A Kraken2-elemzés azt is kimutatta, hogy a kagyló ccfDNS-e archeális DNS-fragmenseket tartalmazott, beleértve az Euryarchaeota (65%), a Crenarchaeota (24%) és a Thaurmarcheota (11%) DNS-fragmenseit (6a. ábra).Az Euryarchaeota és Crenarchaeota eredetű DNS-fragmensek jelenléte, amelyeket korábban a kaliforniai kagylók mikrobiális közösségében találtak, nem lehet meglepő [42].Bár az Euryarchaeotát gyakran extrém körülményekkel társítják, ma már felismerték, hogy mind az Euryarchaeota, mind a Crenarcheota a tengeri kriogén környezetben a leggyakoribb prokarióták közé tartozik [43, 44].A metanogén mikroorganizmusok jelenléte a kagylókban nem meglepő, tekintve a Kerguelen-fennsíkon [45] kiterjedt metánszivárgásról szóló jelentéseket, valamint a Kerguelen-szigetek partjainál megfigyelt lehetséges mikrobiális metántermelést [46].
Figyelmünk ezután a DNS-vírusok leolvasására terelődött.Legjobb tudomásunk szerint ez az első nem célzott vizsgálat a kagylók vírustartalmáról.Ahogy az várható volt, bakteriofágok (Caudovirales) DNS-fragmenseit találtuk (6b. ábra).A leggyakoribb vírus-DNS azonban a nukleocitovírusok törzséből származik, más néven nukleáris citoplazmatikus nagy DNS-vírus (NCLDV), amely a vírusok közül a legnagyobb genommal rendelkezik.Ezen a törzsön belül a legtöbb DNS-szekvencia a Mimimidoviridae (58%) és Poxviridae (21%) családba tartozik, amelyek természetes gazdái gerincesek és ízeltlábúak, míg ezeknek a DNS-szekvenciáknak egy kis része ismert virológiai algákhoz tartozik.Megfertőzi a tengeri eukarióta algákat.A szekvenciákat a Pandora vírusból is nyerték, amely az ismert vírusnemzetségek közül a legnagyobb genomméretű óriásvírus.Érdekes módon a vírussal fertőzött gazdaszervezetek köre, amelyet a hemolimfa ccfDNS szekvenálása határoz meg, viszonylag nagy volt (S3 ábra, kiegészítő információ).Ide tartoznak a rovarokat megfertőző vírusok, például a Baculoviridae és az Iridoviridae, valamint az amőbákat, algákat és gerinceseket fertőző vírusok.Találtunk a Pithovirus sibericum genomjának megfelelő szekvenciákat is.A pitovírusokat (más néven zombivírusokat) először 30 000 éves örökfagyból izolálták Szibériában [47].Eredményeink tehát összhangban vannak a korábbi jelentésekkel, amelyek azt mutatják, hogy ezeknek a vírusoknak nem minden modern faja halt ki [48], és ezek a vírusok jelen lehetnek távoli szubarktikus tengeri ökoszisztémákban.
Végül azt teszteltük, hogy találunk-e más többsejtű állatok DNS-fragmenseit.A BLASTN és a BLASTX összesen 482 idegen kontigot azonosított nt, nr és RefSeq könyvtárakkal (genomiális és fehérje).Eredményeink azt mutatják, hogy a többsejtű állatok ccfDNS-ének idegen fragmentumai között a csontos csontok DNS-e dominál (5. ábra).A rovarokból és más fajokból származó DNS-fragmenseket is találtak.A DNS-fragmensek viszonylag nagy részét nem sikerült azonosítani, valószínűleg azért, mert a genomi adatbázisokban nagyszámú tengeri faj alulreprezentált a szárazföldi fajokhoz képest [49].
Ebben a cikkben az LB-koncepciót alkalmazzuk a kagylókra, azzal érvelve, hogy a hemolimfa ccfDNS-sel végzett szekvenálása betekintést nyújthat a tengeri part menti ökoszisztémák összetételébe.Különösen azt találtuk, hogy 1) a kagyló hemolimfa viszonylag nagy koncentrációban (mikrogramm szinten) tartalmaz viszonylag nagy (~1-5 kb) keringő DNS-fragmenseket;2) ezek a DNS-fragmensek függetlenek és nem függetlenek. 3) Ezen DNS-fragmensek idegen forrásai között találtunk bakteriális, régészeti és vírus DNS-t, valamint más többsejtű állatok DNS-ét;4) Ezek az idegen ccfDNS-fragmensek a hemolimfában gyorsan felhalmozódnak, és hozzájárulnak a kagylók belső szűrőaktivitásához.Összefoglalva, tanulmányunk azt bizonyítja, hogy az LB eddig főként a biomedicina területén alkalmazott fogalma egy gazdag, de feltáratlan tudásforrást kódol, amely felhasználható az őrszemfajok és környezetük kölcsönhatásának jobb megértésére.
A főemlősökön kívül a ccfDNS izolálásáról számoltak be emlősökben, köztük egerekben, kutyákban, macskákban és lovakban [50, 51, 52].Tudomásunk szerint azonban tanulmányunk az első, amely a nyílt keringésű rendszerrel rendelkező tengeri fajok ccfDNS-ének kimutatásáról és szekvenálásáról számol be.A kagylók ezen anatómiai jellemzői és szűrőképessége legalább részben megmagyarázhatja a keringő DNS-fragmensek más fajokhoz képest eltérő méretbeli jellemzőit.Emberben a legtöbb vérben keringő DNS-fragmens 150-200 bp méretű kis fragmentum.167 bp maximális csúccsal [34, 53].A DNS-fragmensek kicsi, de jelentős része 300 és 500 bp közötti, és körülbelül 5%-a hosszabb 900 bp-nál.[54].Ennek a méreteloszlásnak az az oka, hogy a plazmában a ccfDNS fő forrása sejthalál eredményeként következik be, akár sejthalál, akár egészséges egyénekben keringő hematopoietikus sejtek elhalása, vagy rákos betegekben a tumorsejtek apoptózisa miatt (keringő tumor DNS-ként ismert)., ctDNS).A kagylókban talált hemolimfa ccfDNS méretbeli eloszlása ​​1000 és 5000 bp között változott, ami arra utal, hogy a kagyló ccfDNS-e eltérő eredetű.Ez egy logikus hipotézis, mivel a kagylók félig nyitott érrendszerrel rendelkeznek, és olyan tengeri vízi környezetben élnek, amely nagy koncentrációban tartalmaz mikrobiális genomi DNS-t.Valójában az exogén DNS-t használó laboratóriumi kísérleteink azt mutatták, hogy a kagylók DNS-fragmenseket halmoznak fel a tengervízben, legalább néhány óra elteltével a sejtes felvétel után lebomlanak és/vagy felszabadulnak és/vagy különféle szervezetekben tárolódnak.Tekintettel a sejtek (prokarióta és eukarióta) ritkaságára, az intravalvuláris kompartmentek használata csökkenti a saját forrásokból származó ccfDNS mennyiségét, valamint az idegen forrásokból származó ccfDNS mennyiségét.Figyelembe véve a kéthéjú veleszületett immunitás fontosságát és a keringő fagociták nagy számát, azt feltételeztük, hogy még az idegen ccfDNS is feldúsul a keringő fagocitákban, amelyek mikroorganizmusok és/vagy sejttörmelékek lenyelése során felhalmozódnak idegen DNS-t.Összességében eredményeink azt mutatják, hogy a kéthéjú hemolimfa ccfDNS a molekuláris információk egyedülálló tárháza, és megerősíti őrfajkénti státuszukat.
Adataink azt mutatják, hogy a bakteriális eredetű hemolimfa ccfDNS-fragmenseinek szekvenálása és elemzése kulcsfontosságú információkat szolgáltathat a gazdabakteriális flóráról és a környező tengeri ökoszisztémában jelenlévő baktériumokról.A shot szekvenálási technikák feltárták az A. atra kopoltyú kommenzális baktérium szekvenciáit, amelyek kimaradtak volna, ha hagyományos 16S rRNS azonosítási módszereket alkalmaztak volna, részben a referenciakönyvtár torzítása miatt.Valójában a mi felhasználásunk LB adatok gyűjtött M. platensis ugyanabban a kagyló réteg Kerguelen azt mutatta, hogy az összetétele kopoltyú-asszociált bakteriális szimbionták azonos volt mindkét kagylófaj (ábra. S4, Kiegészítő információk).A két genetikailag különböző kagyló hasonlósága a kergueleni hideg, kénes és vulkáni lerakódások bakteriális közösségeinek összetételét tükrözheti [55, 56, 57, 58].A kéncsökkentő mikroorganizmusok magasabb szintjét jól leírták bioturbált tengerparti területekről [59], például Port-au-France partjairól származó kagylók begyűjtése során.Egy másik lehetőség, hogy a kommenzális kagylóflórát befolyásolhatja a horizontális átvitel [60, 61].További kutatásokra van szükség a tengeri környezet, a tengerfenék felszíne és a kagylók szimbiotikus baktériumainak összetétele közötti összefüggés meghatározásához.Ezek a vizsgálatok jelenleg is folynak.
A hemolimfa ccfDNS hossza és koncentrációja, könnyű tisztíthatósága és kiváló minősége, amely lehetővé teszi a gyors sörétes szekvenálást, néhány előnye annak, hogy a kagyló ccfDNS-t használjuk a tengeri part menti ökoszisztémák biológiai sokféleségének felmérésére.Ez a megközelítés különösen hatékony a vírusközösségek (virómák) jellemzésére egy adott ökoszisztémában [62, 63].A baktériumoktól, archaeáktól és eukariótáktól eltérően a vírusgenomok nem tartalmaznak filogenetikailag konzervált géneket, például 16S szekvenciákat.Eredményeink azt mutatják, hogy az indikátorfajokból, például a kagylókból származó folyékony biopsziák segítségével viszonylag nagyszámú ccfDNS-vírus-fragmens azonosítható, amelyekről ismert, hogy megfertőzik a tipikusan part menti tengeri ökoszisztémákban élő gazdaszervezeteket.Ide tartoznak azok a vírusok, amelyekről ismert, hogy megfertőzik a protozoákat, ízeltlábúakat, rovarokat, növényeket és bakteriális vírusokat (pl. bakteriofágokat).Hasonló eloszlást találtunk, amikor megvizsgáltuk a kékkagylók (M. platensis) hemolimfa ccfDNS viromját, amelyet ugyanabban a kagylórétegben gyűjtöttünk össze Kerguelenben (S2 táblázat, kiegészítő információk).A ccfDNS sörétes szekvenálása valóban új megközelítés, amely egyre nagyobb lendületet kap az emberek vagy más fajok viromjának vizsgálatában [21, 37, 64].Ez a megközelítés különösen hasznos a kétszálú DNS-vírusok tanulmányozására, mivel egyetlen gén sem konzervált az összes kétszálú DNS-vírus között, amelyek Baltimore-ban a legváltozatosabb és legszélesebb vírusosztályt képviselik [65].Bár ezeknek a vírusoknak a többsége besorolatlan marad, és a vírusvilág teljesen ismeretlen részéből származó vírusokat is tartalmazhatnak [66], azt találtuk, hogy az A. atra és M. platensis kagylók viromjai és gazdakörzete a két faj közé esik.hasonlóan (lásd az S3 ábrát, további információk).Ez a hasonlóság nem meglepő, mivel a környezetben jelen lévő DNS felvételének szelektivitásának hiányát tükrözheti.A tisztított RNS-t használó jövőbeli vizsgálatok jelenleg szükségesek az RNS-virom jellemzéséhez.
Tanulmányunkban egy nagyon szigorú csővezetéket használtunk, amelyet Kowarski és munkatársai [37] munkáiból adaptáltak, akik a natív ccfDNS összeállítása előtt és után az összevont leolvasások és kontigek kétlépcsős törlését alkalmazták, ami nagy arányban eredményezte a leképezetlen leolvasásokat.Ezért nem zárhatjuk ki, hogy ezeknek a feltérképezetlen leolvasásoknak még mindig megvan a saját eredete, elsősorban azért, mert nincs referenciagenomunk ehhez a kagylófajhoz.Azért is használtuk ezt a folyamatot, mert aggódtunk a saját és nem saját olvasások közötti kimérák és az Illumina MiSeq PE75 által generált olvasási hosszok miatt.A feltáratlan leolvasások többségének másik oka az, hogy a tengeri mikrobák nagy részét, különösen a távoli területeken, például Kerguelenben, nem jegyezték fel.Illumina MiSeq PE75-öt használtunk, feltételezve, hogy a ccfDNS fragmentum hossza hasonló a humán ccfDNS-hez.A jövőbeni vizsgálatokhoz, tekintettel arra, hogy eredményeink szerint a hemolimfa ccfDNS hosszabb olvasási képességgel rendelkezik, mint az emberek és/vagy emlősök esetében, javasoljuk, hogy olyan szekvenálási platformot használjanak, amely alkalmasabb a hosszabb ccfDNS-fragmensekre.Ez a gyakorlat sokkal könnyebbé teszi további jelzések azonosítását a mélyebb elemzéshez.A jelenleg nem elérhető teljes A. atra nukleáris genom szekvencia beszerzése szintén nagyban megkönnyítené a saját és nem saját forrásokból származó ccfDNS megkülönböztetését.Tekintettel arra, hogy kutatásunk a folyékony biopszia koncepciójának kagylókra való alkalmazásának lehetőségére összpontosított, reméljük, hogy mivel ezt a koncepciót a jövőbeni kutatások során alkalmazzák, új eszközöket és csővezetékeket fognak kifejleszteni, amelyek növelik ennek a módszernek a lehetőségeit a kagylók mikrobiális diverzitásának vizsgálatára.tengeri ökoszisztéma.
Nem invazív klinikai biomarkerként a ccfDNS emelkedett humán plazmaszintje különféle betegségekhez, szöveti károsodásokhoz és stresszhelyzetekhez kapcsolódik [67, 68, 69].Ez a növekedés a saját eredetű DNS-fragmensek szövetkárosodás utáni felszabadulásával függ össze.Ezt a problémát akut hőstressz alkalmazásával kezeltük, amelyben a kagylókat rövid ideig 30 °C-os hőmérsékletnek tették ki.Ezt az elemzést három különböző típusú kagylón végeztük el három független kísérletben.A ccfDNS-szintekben azonban nem találtunk változást akut hőstressz után (lásd az S5 ábrát, további információk).Ez a felfedezés – legalábbis részben – megmagyarázhatja azt a tényt, hogy a kagylók keringési rendszere félig nyitott, és nagy mennyiségű idegen DNS-t halmoznak fel magas szűrőaktivitásuk miatt.Másrészt a kagylók, mint sok gerinctelen, jobban ellenállnak a stressz okozta szövetkárosodásnak, ezáltal korlátozva a ccfDNS felszabadulását a hemolimfájukban [70, 71].
Eddig a vízi ökoszisztémák biológiai sokféleségének DNS-elemzése főként a környezeti DNS (eDNS) metabarkódolására összpontosított.Ez a módszer azonban általában korlátozott a biológiai sokféleség elemzésében, amikor primereket használnak.A shotgun szekvenálás használata megkerüli a PCR korlátait és a primer készletek torzított kiválasztását.Így bizonyos értelemben módszerünk közelebb áll a közelmúltban alkalmazott nagy áteresztőképességű eDNS Shotgun szekvenálási módszerhez, amely képes a fragmentált DNS közvetlen szekvenálására és szinte minden élőlény elemzésére [72, 73].Azonban számos alapvető probléma különbözteti meg az LB-t a szabványos eDNA-módszerektől.Természetesen a fő különbség az eDNS és az LB között a természetes szűrőgazdaszervezetek használata.Beszámoltak tengeri fajok, például szivacsok és kagylók (Dresseina spp.) természetes szűrőként történő felhasználásáról az eDNS tanulmányozására [74, 75].Dreissena tanulmánya azonban szövetbiopsziákat használt, amelyekből DNS-t vontak ki.Az LB-ből származó ccfDNS elemzése nem igényel szövetbiopsziát, speciális és néha drága berendezéseket és az eDNS-hez vagy szövetbiopsziához kapcsolódó logisztikát.Valójában nemrégiben számoltunk be arról, hogy az LB-ből származó ccfDNS tárolható és elemezhető FTA-támogatással hideglánc fenntartása nélkül, ami nagy kihívást jelent a távoli területeken végzett kutatás számára [76].A ccfDNS folyékony biopsziákból történő kinyerése szintén egyszerű, és kiváló minőségű DNS-t biztosít a sörétes szekvenáláshoz és a PCR elemzéshez.Ez nagy előny, tekintettel az eDNS-elemzéssel kapcsolatos néhány technikai korlátra [77].A mintavételi módszer egyszerűsége és alacsony költsége különösen alkalmas hosszú távú monitoring programokra.A kagylók másik jól ismert tulajdonsága a nagy szűrőképesség mellett a nyálka kémiai mukopoliszacharid összetétele, amely elősegíti a vírusok felszívódását [78, 79].Ez teszi a kagylókat ideális természetes szűrővé a biológiai sokféleség és az éghajlatváltozás hatásainak jellemzésére egy adott vízi ökoszisztémában.Bár a gazdaeredetű DNS-fragmensek jelenléte a módszer korlátjának tekinthető az eDNS-hez képest, az ilyen natív ccfDNS-sel járó költségek az eDNS-hez képest ugyanakkor érthetőek az egészségügyi vizsgálatokhoz rendelkezésre álló hatalmas mennyiségű információ alapján.offset host.Ez magában foglalja a gazdaszervezet genomjába integrált vírusszekvenciák jelenlétét.Ez különösen fontos a kagylók esetében, tekintettel a vízszintesen terjedő leukémiás retrovírusok jelenlétére a kagylókban [80, 81].Az LB másik előnye az eDNS-sel szemben, hogy kihasználja a hemolimfában keringő vérsejtek fagocitáló aktivitását, amely elnyeli a mikroorganizmusokat (és azok genomjait).A fagocitózis a kagylók vérsejtek fő funkciója [82].Végül a módszer kihasználja a kagylók nagy szűrőképességét (átlagosan 1,5 l/h tengervíz) és a kétnapos keringést, amelyek fokozzák a tengervíz különböző rétegeinek keveredését, lehetővé téve a heterológ eDNS befogását.[83, 84].Így a kagyló ccfDNS-elemzése érdekes út, tekintettel a kagylók táplálkozási, gazdasági és környezeti hatásaira.Hasonlóan az embertől gyűjtött LB elemzéséhez, ez a módszer is lehetőséget teremt a gazda DNS-ében az exogén anyagok hatására bekövetkező genetikai és epigenetikai változások mérésére.Például harmadik generációs szekvenálási technológiák elképzelhetők a natív ccfDNS genomszintű metilációs elemzésének elvégzésére nanopórusos szekvenálás segítségével.Ezt a folyamatot elősegítheti az a tény, hogy a kagyló ccfDNS-fragmenseinek hossza ideálisan kompatibilis a régóta olvasott szekvenáló platformokkal, amelyek lehetővé teszik a genomszintű DNS-metiláció elemzését egyetlen szekvenálási futtatásból anélkül, hogy kémiai transzformációra lenne szükség.85,86] Ez egy érdekes lehetőség, mivel kimutatták, hogy a DNS-metilációs mintázatok számos környezeti stresszre adott reakciót tükröznek.Ezért értékes betekintést nyújthat az éghajlatváltozásnak vagy szennyező anyagoknak való kitettség utáni válaszadás mögöttes mechanizmusokba [87].Az LB használata azonban nem korlátlan.Mondanunk sem kell, hogy ehhez indikátorfajok jelenléte szükséges az ökoszisztémában.Amint fentebb említettük, az LB használata egy adott ökoszisztéma biológiai sokféleségének felmérésére szigorú bioinformatikai csővezetéket is igényel, amely figyelembe veszi a forrásból származó DNS-fragmensek jelenlétét.Egy másik nagy probléma a tengeri fajok referenciagenomjainak elérhetősége.Remélhetőleg az olyan kezdeményezések, mint a Marine Mammal Genomes Project és a közelmúltban létrehozott Fish10k projekt [88] elősegítik az ilyen elemzést a jövőben.Az LB koncepció alkalmazása a tengeri szűrőt tápláló organizmusokra a szekvenálási technológia legújabb vívmányaival is kompatibilis, így kiválóan alkalmas többohmos biomarkerek fejlesztésére, amelyek fontos információkat szolgáltatnak a tengeri élőhelyek egészségéről a környezeti stressz hatására.
A genomszekvenálási adatokat az NCBI Sequence Read Archívumában (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808) helyeztük el a Bioprojects SRR8924808 cím alatt.
Brierley AS, Kingsford MJ Az éghajlatváltozás hatása a tengeri élővilágra és az ökoszisztémákra.Cole biológia.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S és mások.Vegye figyelembe az éghajlatváltozás és más helyi stresszorok együttes hatásait a tengeri környezetre.általános tudományos környezet.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P és mások.).Március elseje tudománya.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Csökkent hőtűrés ismétlődő hőstressz körülmények között magyarázza a kékkagylók magas nyári mortalitását.Tudományos jelentés 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER és mások.A közelmúltban bekövetkezett változások az állatok elhullásának gyakoriságában, okaiban és mértékében.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S és mások.Több, nem fajspecifikus kórokozó okozhatta a Pinna nobilis tömeges elhullását.Élet.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Az éghajlatváltozás lehetséges hatása a sarkvidéki zoonózisos betegségekre.Int J Circumpoláris egészség.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.A kékkagylók (Mytilus edulis spp.) mint jelzőszervezetek a part menti szennyezés monitorozásában: áttekintés.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Folyékony biopszia integrációja a rák kezelésében.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C és mások.Folyékony biopsziás érés: Lehetővé teszi a tumor DNS keringését.Nat Rev Rák.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleinsavak emberi plazmában.A Soc Biol leányvállalatok ülésének jegyzőkönyvei.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. A sejtmentes DNS új szerepe, mint molekuláris marker a rák kezelésére.A biomoláris analízis mennyiségi meghatározása.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS A folyékony biopszia belép a klinikára – megvalósítási kérdések és jövőbeli kihívások.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW és mások.A magzati DNS jelen van az anyai plazmában és szérumban.Gerely.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR A terhesség lefolyásának és szövődményeinek vizsgálata a nők vérében keringő extracelluláris RNS felhasználásával a terhesség alatt.Dopediátria.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J és munkatársai.Folyékony biopszia: donor sejtmentes DNS-t használnak az allogén elváltozások kimutatására vesegraftban.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovations in prenatális diagnosztika: anyai plazma genom szekvenálás.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D és mások.Gyors kórokozó-detektálás a fertőzött testnedvek következő generációs metagenomikus szekvenálásával.Nat Medicine.2021;27:115-24.