Köszönjük, hogy felkereste a Nature.com weboldalt. Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik. A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy egy frissített böngészőt használjon (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Időközben a folyamatos támogatás biztosítása érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
A kontrollálatlan vérzés a halálozás egyik vezető oka. A gyors vérzéscsillapítás elérése biztosítja az alany túlélését elsősegélyként harcok, közlekedési balesetek és halálesetek csökkentése érdekében végzett műveletek során. A nanoporózus szálerősítésű kompozit állványzat (NFRCS), amely egy egyszerű vérzéscsillapító filmképző összetételből (HFFC) származik, mint folytonos fázis, beindíthatja és fokozhatja a vérzést. Az NFRCS kifejlesztése a szitakötő szárnyának kialakításán alapul. A szitakötő szárnyszerkezete keresztirányú és hosszanti szárnyakból áll, és a szárnymembránok egymáshoz vannak csatlakoztatva a mikroszerkezet integritásának megőrzése érdekében. A HFFC egyenletesen bevonja a szál felületét egy nanométer vastagságú filmmel, és a véletlenszerűen elosztott pamutvastagságot (Ct) (diszpergált fázis) összekapcsolja egy nanoporózus szerkezet kialakításával. A folytonos és diszpergált fázisok kombinációja tízszeresére csökkenti a termék költségét a kereskedelmi forgalomban kapható termékekhez képest. A módosított NFRCS-ek (tamponok vagy csuklópántok) számos biomedicinális alkalmazásban alkalmazhatók. In vivo vizsgálatok arra a következtetésre jutottak, hogy a kifejlesztett Cp NFRCS beindítja és fokozza a koagulációs folyamatot az alkalmazás helyén. Az NFRCS modulálhatja a mikro-környezetet és nanoporózus szerkezetének köszönhetően sejtszinten is hathat, ami jobb sebgyógyulást eredményez a kimetszéses sebmodellben.
A harci, intraoperatív és vészhelyzeti helyzetekben fellépő csillapíthatatlan vérzés komoly veszélyt jelenthet a sebesültek életére1. Ezek az állapotok továbbá a perifériás érrendszeri ellenállás általános növekedéséhez vezetnek, ami vérzéses sokkhoz vezet. A műtét alatti és utáni vérzés csillapítására irányuló megfelelő intézkedések potenciálisan életveszélyesnek tekinthetők2,3. A nagy erek sérülése tömeges vérveszteséghez vezet, ami harci helyzetben ≤ 50%-os, műtét során pedig 31%-os halálozási arányt eredményez1. A tömeges vérveszteség a testtérfogat csökkenéséhez vezet, ami csökkenti a perctérfogatot. A teljes perifériás érrendszeri ellenállás növekedése és a mikrokeringés progresszív károsodása hipoxiához vezet az életfenntartó szervekben. Vérzéses sokk léphet fel, ha az állapot hatékony beavatkozás nélkül folytatódik1,4,5. Egyéb szövődmények közé tartozik a hipotermia és a metabolikus acidózis progressziója, valamint a véralvadási zavar, amely akadályozza a véralvadási folyamatot. A súlyos vérzéses sokk a halálozás magasabb kockázatával jár6,7,8. III. fokozatú (progresszív) sokk esetén a vérátömlesztés elengedhetetlen a beteg túléléséhez a műtét alatti és posztoperatív morbiditás és mortalitás során. A fenti életveszélyes helyzetek leküzdésére kifejlesztettünk egy nanoporózus szálerősítésű kompozit állványzatot (NFRCS), amely minimális polimerkoncentrációt (0,5%) használ vízben oldódó hemosztatikus polimerek kombinációjával.
A szálerősítés használatával költséghatékony termékek fejleszthetők. A véletlenszerűen elrendezett szálak egy szitakötő szárnyának szerkezetére hasonlítanak, amit a szárnyakon található vízszintes és függőleges csíkok egyensúlyoznak ki. A szárny keresztirányú és hosszanti erezete kommunikál a szárnymembránnal (1. ábra). Az NFRCS megerősített Ct-ből áll, mint állványrendszer, jobb fizikai és mechanikai szilárdsággal (1. ábra). A megfizethetőség és a szakértelem miatt a sebészek a műtétek és kötözések során előszeretettel használnak pamutfonalat (Ct). Ezért, figyelembe véve számos előnyét, beleértve a > 90%-os kristályos cellulózt (amely hozzájárul a hemosztatikus aktivitás fokozásához), a Ct-t NFRCS9,10 vázrendszerként alkalmazták. Ezért, figyelembe véve számos előnyét, beleértve a > 90%-os kristályos cellulózt (amely hozzájárul a hemosztatikus aktivitás fokozásához), a Ct-t NFRCS9,10 vázrendszerként alkalmazták. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристаллической целлютнитеской целлютнилозы гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Ezért számos előnye miatt, beleértve a >90%-os kristályos cellulózt (amely részt vesz a fokozott hemosztatikus aktivitásban), a Ct-t alkalmazták NFRCS vázrendszerként9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止觀滞强止觀洠被用作NFRCS9,10 的骨架系统.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Ezért számos előnye miatt, beleértve a több mint 90%-os kristályos cellulózt (ami fokozza a hemosztatikus aktivitást), a Ct-t az NFRCS9,10 vázaként használták.A Ct-t felületileg bevonták (nanovastagságú filmképződést figyeltek meg), és egy hemosztatikus filmképző vegyülettel (HFFC) kötötték össze. A HFFC egy matrigélhez hasonlóan tartja össze a véletlenszerűen elhelyezett Ct-t. A kifejlesztett kialakítás a diszpergált fázison belül (erősítő szálak) vezeti át a feszültséget. Nehéz jó mechanikai szilárdságú nanoporózus szerkezeteket előállítani minimális polimerkoncentrációk alkalmazásával. Ezenkívül nem könnyű a különböző formákat testre szabni a különböző biomedicinális alkalmazásokhoz.
Az ábra a szitakötő szárnyszerkezetén alapuló NFRCS-terv diagramját mutatja (A). Ez a kép egy szitakötő szárnyszerkezetének összehasonlító analógiáját mutatja (a szárny metsző és hosszanti erei összefüggenek), valamint a Cp NFRCS keresztmetszeti mikrográfiáját (B). Az NFRCS sematikus ábrázolása.
Az NFRC-ket HFFC, mint folytonos fázis alkalmazásával fejlesztették ki a fenti korlátozások kiküszöbölésére. A HFFC különféle filmképző hemosztatikus polimerekből áll, beleértve a kitint (mint a fő hemosztatikus polimert) metilcellulózzal (MC), hidroxipropil-metilcellulózzal (HPMC 50 cp) és polivinil-alkohollal (PVA) (125 kDa) mint hordozópolimerrel, amely elősegíti a trombusképződést. A polivinil-pirrolidin K30 (PVP K30) hozzáadása javította az NFRCS nedvszívó képességét. A kötött polimer keverékekben a polimer térhálósodásának javítása érdekében polietilén-glikolt 400-at (PEG 400) adtak hozzá. Három különböző HFFC hemosztatikus összetételt (Cm HFFC, Ch HFFC és Cp HFFC), nevezetesen kitint MC-vel (Cm), kitint HPMC-vel (Ch) és kitint PVA-val (Cp) alkalmaztak a Ct-re. Különböző in vitro és in vivo jellemzési vizsgálatok megerősítették az NFRCS hemosztatikus és sebgyógyító aktivitását. Az NFRCS által kínált kompozit anyagok felhasználhatók a különféle állványzatok testreszabására az igények kielégítésére.
Ezenkívül az NFRCS kötszerként vagy tekercsként módosítható, hogy lefedje az alsó végtagok és a test más részeinek teljes sérülési területét. Kifejezetten harci végtagsérülések esetén a tervezett NFRCS kialakítás fél karra vagy teljes lábra módosítható (S11. kiegészítő ábra). Az NFRCS szövetragasztóval csuklópánttá alakítható, amely a súlyos öngyilkossági kísérletből eredő csuklósérülések vérzésének elállítására használható. Fő célunk egy olyan NFRCS kifejlesztése, amely a lehető legkevesebb polimert tartalmazza, és amely nagyszámú populációhoz (a szegénységi küszöb alatt) szállítható, és amely elsősegélycsomagban is elhelyezhető. Az egyszerű, hatékony és gazdaságos kialakítású NFRCS a helyi közösségek javát szolgálja, és globális hatással is bírhat.
A kitin (molekulatömeg 80 kDa) és az amaránt a Merck-től (India) származott. A hidroxipropil-metilcellulóz 50 Cp-t, a polietilénglikolt 400-at és a metilcellulózt a Loba Chemie Pvt. LLC-től (Mumbai) szereztük be. A polivinil-alkoholt (molekulatömeg 125 kDa) (87-90%-ban hidrolizált) a National Chemicals-től (Gujarat) szereztük be. A polivinil-pirrolidin K30-at a Molychem-től (Mumbai) szereztük be, a steril tamponokat pedig a Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd.-től (Tamil Nadu) szereztük be, vivőanyagként Milli Q vizet (Direct-Q3 víztisztító rendszer, Merck, India) használva.
Az NFRCS-t liofilizációs módszerrel fejlesztették ki11,12. Az összes HFFC-összetételt (1. táblázat) mechanikus keverővel állították elő. Készítsenek 0,5%-os kitinoldatot 1%-os ecetsavval vízben, folyamatos keveréssel 800 fordulat/perc sebességgel mechanikus keverőn. A betöltött polimer pontos tömegét, amelyet az 1. táblázatban jeleznek, a kitinoldathoz adták, és addig keverték, amíg tiszta polimeroldatot nem kaptak. A kapott keverékhez PVP K30-at és PEG 400-at adtak az 1. táblázatban feltüntetett mennyiségekben, és a keverést addig folytatták, amíg tiszta, viszkózus polimeroldatot nem kaptak. A kapott polimeroldat-fürdőt 60 percig ultrahanggal kezelték, hogy eltávolítsák a csapdába esett légbuborékokat a polimerkeverékből. Amint az S1(b) kiegészítő ábrán látható, a Ct egyenletesen oszlott el egy 6-lyukú lemez (öntőforma) minden egyes lyukában, 5 ml HFFC-vel kiegészítve.
A hatlyukú lemezt 60 percig ultrahanggal kezelték, hogy a HFFC egyenletesen nedvesedjen és eloszlásban legyen a Ct hálózatban. Ezután a hatlyukú lemezt -20°C-on 8-12 órán át fagyasztották. A fagyasztólemezeket 48 órán át liofilizálták, hogy különböző NFRCS-készítményeket kapjanak. Ugyanezt az eljárást alkalmazzák különböző formák és szerkezetek, például tamponok vagy hengeres tamponok, vagy bármilyen más alak előállítására különböző alkalmazásokhoz.
A pontosan lemért kitin (80 kDa) (3%) mennyiséget mágneses keverővel 1%-os ecetsavban oldjuk. A kapott kitinoldathoz 1%-os PEG 400-at adunk, és 30 percig keverjük. A kapott oldatot négyzet vagy téglalap alakú edénybe öntjük, és -80°C-on 12 órán át fagyasztjuk. A fagyasztott mintákat 48 órán át liofilizáljuk, így porózus Cs13-at kapunk.
A kifejlesztett NFRCS-t Fourier-transzformációs infravörös spektroszkópiával (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokió, Japán) végzett kísérleteknek vetették alá, hogy megerősítsék a kitin kémiai kompatibilitását más polimerekkel14,15. Az összes vizsgált minta FTIR spektrumát (a spektrális tartomány szélessége 400 és 4000 cm-1 között) 32 szkenneléssel kapták meg.
Az összes készítmény vérfelvételi sebességét (BAR) Chen és munkatársai által leírt módszerrel értékelték, kisebb módosításokkal. Az összes összetételű kifejlesztett NFRK-t vákuumkemencében 105°C-on szárították egy éjszakán át a maradék oldószer eltávolítása érdekében. 30 mg NFRCS-t (kezdeti minta tömege – W0) és 30 mg Ct-t (pozitív kontroll) külön edényekbe helyeztek, amelyek 3,8%-os nátrium-citrát előkeveréket tartalmaztak. Előre meghatározott időközönként, azaz 5, 10, 20, 30, 40 és 60 másodpercenként az NFRCS-eket eltávolították, és felületüket a fel nem szívódott vértől megtisztították a minták 30 másodperces Ct-re helyezésével. Az NFRCS 16 által elnyelt vér végső tömegét (W1) minden időpontban figyelembe vették. A BAR százalékos arányát a következő képlettel számítsák ki:
A véralvadási időt (BCT) Wang és munkatársai által leírtak szerint határoztuk meg. A teljes vér (patkányvér, 3,8%-os nátrium-citráttal előkeverve) NFRCS jelenlétében történő alvadásához szükséges időt a tesztminta BCT-jeként számítottuk ki. A különböző NFRCS-komponenseket (30 mg) 10 ml-es csavaros tetejű fiolákba helyeztük, és 37°C-on inkubáltuk. Vért (0,5 ml) adtunk a fiolához, és 0,3 ml 0,2 M CaCl2-t adtunk hozzá a véralvadás aktiválása érdekében. Végül 15 másodpercenként fordítsuk fejjel lefelé a fiolát (legfeljebb 180°-ig), amíg szilárd alvadék nem képződik. A minta BCT-jét a flip-ek száma alapján becsültük meg17,18. A BCT alapján két optimális összetételű NFRCS-t választottunk ki a további jellemzési vizsgálatokhoz: Cm, Ch és Cp.
A Ch NFRCS és Cp NFRCS összetételek véralvadási érzékenységét (BCT) Li és munkatársai által leírt módszerrel határoztuk meg. 19 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS és Cs (pozitív kontroll) mintákat helyeztünk külön Petri-csészékbe (37 °C). A véralvadási folyamat megindításához 3,8% nátrium-citrátot tartalmazó vért 0,2 M CaCl2-vel kevertünk 10:1 térfogatarányban. 20 µl 0,2 M CaCl2 patkányvér-keveréket vittünk fel a minta felületére, és egy üres Petri-csészébe helyeztük. Kontrollként Ct nélküli, üres Petri-csészékbe öntött vért használtunk. 0, 3 és 5 perces fix időközönként az alvadást 10 ml ioncserélt (DI) víz hozzáadásával állítottuk meg a mintát tartalmazó csészében anélkül, hogy az alvadékot megzavartuk volna. A nem koagulált eritrociták (eritrociták) ioncserélt víz jelenlétében hemolízisen mennek keresztül, és hemoglobint szabadítanak fel. A hemoglobint különböző időpontokban (HA(t)) 540 nm-en (λmax hemoglobin) mértük UV-Vis spektrofotométerrel. Referencia standardként a hemoglobin abszolút abszorpcióját (AH(0)) vettük 20 µl vér 10 ml ioncserélt vízben történő 0 perc alatt. A koagulált vér relatív hemoglobinfelvételét (RHA) a HA(t)/HA(0) arányból számítottuk ki, ugyanazon vérminta felhasználásával.
Egy textúra-analizátor (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA) segítségével meghatározták az NFRK sérült szövethez való tapadási tulajdonságait. Nyomtak egy nyitott aljú hengeres tálat a sertésbőr belsejéhez (a zsírréteg nélkül). A mintákat (Ch NFRCS és Cp NFRCS) kanülön keresztül hengeres formákba vitték fel, hogy tapadást hozzanak létre a sertés bőréhez. Szobahőmérsékleten (RT) (25°C) végzett 3 perces inkubálás után az NFRCS tapadási szilárdságát 0,5 mm/s állandó sebességgel rögzítették.
A sebészeti tömítőanyagok fő jellemzője a véralvadás fokozása a vérveszteség csökkentése mellett. Az NFRCS-ben a veszteségmentes koagulációt egy korábban publikált módszerrel, enyhe módosításokkal értékelték19. Készíts egy mikrocentrifuga csövet (2 ml) (belső átmérő 10 mm) egy 8 × 5 mm2-es lyukkal a centrifuga cső egyik oldalán (ami egy nyílt sebet ábrázol). Az NFRCS-t a nyílás lezárására, a külső szélek lezárására pedig ragasztószalagot használj. Adj 20 µl 0,2 M CaCl2-t a 3,8%-os nátrium-citrát premixet tartalmazó mikrocentrifuga csőbe. 10 perc elteltével a mikrocentrifuga csöveket kivettük a csészékből, és meghatároztuk a csészék tömegének növekedését az NFRK-ból kiáramló vér alapján (n = 3). A Ch NFRCS és a Cp NFRCS vérveszteségét összehasonlítottuk a Cs-sel.
Az NFRCS nedves integritását Mishra és Chaudhary21 által leírt módszer alapján határoztuk meg, kisebb módosításokkal. Helyezzük az NFRCS-t egy 100 ml-es Erlenmeyer-lombikba 50 ml vízzel, és 60 másodpercig keverjük anélkül, hogy teteje képződne. A minták vizuális ellenőrzése és rangsorolása fizikai integritás szempontjából a gyűjtés alapján.
A HFFC Ct-hez való kötődési erősségét korábban publikált módszerekkel vizsgálták, kisebb módosításokkal. A felületi bevonat integritását úgy értékelték, hogy az NFRK-t akusztikus hullámoknak (külső inger) tették ki milliQ víz (Ct) jelenlétében. A kifejlesztett NFRCS Ch NFRCS-t és Cp NFRCS-t vízzel töltött főzőpohárba helyezték, és ultrahanggal kezelték 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 és 30 percig. Szárítás után az NFRCS kezdeti és végső tömege közötti százalékos különbséget használták az anyagveszteség százalékos értékének (HFFC) kiszámításához. Az in vitro BCT tovább alátámasztotta a kötési erősséget vagy a felületi anyagok elvesztését. A HFFC Ct-hez való kötődésének hatékonysága véralvadást és rugalmas bevonatot biztosít a Ct22 felületén.
A kifejlesztett NFRCS homogenitását a véletlenszerűen kiválasztott NFRCS általános helyeiről vett minták (30 mg) véráramlás-átalakításával (BCT) határoztuk meg. Az NFRCS megfelelőségének meghatározásához a korábban említett BCT eljárást kövessük. Az öt minta közelsége biztosítja az egyenletes felületi lefedettséget és a HFFC lerakódást a Ct hálóban.
A névleges vérkontaktus-területet (NBCA) a korábban leírtak szerint, némi módosítással határoztuk meg. A vér koagulálásához 20 µl vért szorítottunk a Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS és Cs két felülete közé. 1 óra elteltével a stent két részét szétválasztottuk, és manuálisan megmértük az alvadék területét. A három ismétlés átlagértékét tekintettük NBCA NFRCS19-nek.
A dinamikus gőzszorpciós (DVS) analízist alkalmazták az NFRCS hatékonyságának értékelésére a külső környezetből vagy a koaguláció megindításáért felelős sérülés helyéről történő vízelnyelésében. A DVS egy ultraérzékeny, ±0,1 µg tömegfelbontású mérleg segítségével gravimetrikusan értékeli vagy rögzíti a minta gőzfelvételét és -veszteségét. A parciális gőznyomást (relatív páratartalmat) egy elektronikus tömegáram-szabályozó hozza létre a minta körül telített és száraz vivőgázok keverésével. Az Európai Gyógyszerkönyv irányelvei szerint a minták nedvességfelvételének százalékos aránya alapján a mintákat 4 kategóriába sorolták (0–0,012% t/t − nem higroszkópos, 0,2–2% t/t enyhén higroszkópos, 2–15% közepesen higroszkópos és > 15% nagyon higroszkópos)23. Az Európai Gyógyszerkönyv irányelvei szerint a minták nedvességfelvételének százalékos aránya alapján a mintákat 4 kategóriába sorolták (0–0,012% t/t − nem higroszkópos, 0,2–2% t/t enyhén higroszkópos, 2–15% közepesen higroszkópos és > 15% nagyon higroszkópos)23.Az Európai Gyógyszerkönyv ajánlásainak megfelelően a minták nedvességfelvételének százalékos arányától függően a mintákat 4 kategóriába sorolták (0–0,012% t/t – nem higroszkópos, 0,2–2% t/t enyhén higroszkópos, 2–15%).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. (% közepesen higroszkópos és > 15% nagyon higroszkópos)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012% w/w-0,012非吸湿性、0,2-2% w/w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23.根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 分为 分为-0% .为 分为 . W/w- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2% W/w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）Az Európai Gyógyszerkönyv ajánlásainak megfelelően a mintákat 4 osztályba sorolják a minta által elnyelt nedvesség százalékos aránya alapján (0-0,012 tömeg% – nem higroszkópos, 0,2-2 tömeg% – enyhén higroszkópos, 2-15 tömeg%).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. (% közepesen higroszkópos, > 15% nagyon higroszkópos) 23.Az NFCS X NFCS és a TsN NFCS higroszkópos hatékonyságát DVS TA TGA Q5000 SA analizátoron határoztuk meg. A folyamat során meghatároztuk a futási időt, a relatív páratartalmat (RH) és a valós idejű minta tömegét 25°C-on24. A nedvességtartalmat pontos NFRCS tömeganalízissel számítjuk ki a következő egyenlet segítségével:
Az MC az NFRCS páratartalma. m1 – az NSAID-ok száraz tömege. m2 az NFRCS valós idejű tömege adott relatív páratartalom mellett.
A teljes felületet folyékony nitrogénnel végzett nitrogénadszorpciós kísérlettel becsülték meg, miután a mintákat 25 °C-on 10 órán át (< 7 × 10–3 Torr) ürítették ki. A teljes felületet folyékony nitrogénnel végzett nitrogénadszorpciós kísérlettel becsülték meg, miután a mintákat 25 °C-on 10 órán át (< 7 × 10–3 Torr) ürítették ki. Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азорота жидким опосломе образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). A teljes felületet folyékony nitrogénnel végzett nitrogénadszorpciós kísérlettel becsülték meg, miután a mintákat 25 °C-on 10 órán át (< 7 × 10–3 Torr) ürítették.在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表验估计总表在 25°C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидкиним посолтомя пазолтов образцов в течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 торр). A teljes felületet folyékony nitrogénnel végzett nitrogénadszorpciós kísérletekkel becsülték meg, miután a mintákat 10 órán át 25°C-on (< 7 x 10-3 torr) ürítették.A teljes felületet, a pórustérfogatot és az NFRCS pórusméretét egy NOVA 1000e (Ausztria) Quantachrome készülékkel, RS 232 szoftverrel határoztuk meg.
Készítsen 5%-os vörösvérsejt-mintákat (sóoldat hígítószerként) teljes vérből. Ezután vigyen át egy alikvot HFFC-t (0,25 ml) egy 96 lyukú lemezre, és adjon hozzá 5%-os vörösvérsejt-tömeget (0,1 ml). Inkubálja az elegyet 37°C-on 40 percig. Pozitív kontrollként vörösvértestek és szérum keverékét, negatív kontrollként pedig sóoldat és vörösvértestek keverékét tekintette. A hemagglutinációt a Stajitzky-skála szerint határozta meg. A javasolt skálák a következők: + + + + sűrű szemcsés aggregátumok; + + + sima aljú párnák ívelt szélekkel; + + sima aljú párnák szakadt szélekkel; + keskeny piros gyűrűk a sima párnák szélei körül; – (negatív) különálló piros 12-es gomb az alsó kút közepén.
Az NFRCS hemokompatibilitását a Nemzetközi Szabványügyi Szervezet (ISO) módszere (ISO10993-4, 1999)26,27 szerint vizsgálták. A Singh és munkatársai által leírt gravimetriás módszert alkalmazták. Kisebb módosításokat végeztek a trombusképződés NFRCS jelenlétében vagy felületén történő vizsgálatára. 500 mg Cs, Ch NFRCS és Cp NFRCS-t foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) inkubáltak 24 órán át 37°C-on. 24 óra elteltével a PBS-t eltávolították, és az NFRCS-t 2 ml 3,8% nátrium-citrátot tartalmazó vérrel kezelték. Az NFRCS felületén 0,04 ml 0,1 M CaCl2-t adtak az inkubált mintákhoz. 45 perc elteltével 5 ml desztillált vizet adtak hozzá a koaguláció leállítása érdekében. Az NFRK felületén alvadt vért 36-38%-os formaldehid-oldattal kezelték. A formaldehiddel fixált alvadékokat szárították és lemérték. A trombózis százalékos arányát a vér és a minta nélküli pohár (negatív kontroll), valamint a vérrel töltött pohár (pozitív kontroll) súlyának kiszámításával becsülték meg.
Kezdeti megerősítésként a mintákat optikai mikroszkóp alatt vizualizáltuk, hogy megértsük a HFFC felületi bevonat, az összekapcsolódó Ct és a Ct hálózat pórusképző képességét. Az NFRCS-ből származó Ch és Cp vékony metszeteit szikével levágtuk. A kapott metszetet üveg tárgylemezre helyeztük, fedőlemezzel fedtük le, és a széleket ragasztóval rögzítettük. Az előkészített tárgylemezeket optikai mikroszkóp alatt vizsgáltuk, és különböző nagyításokban fényképeket készítettünk róluk.
A polimer lerakódását Ct hálózatokban fluoreszcens mikroszkóppal vizualizáltuk a Rice és munkatársai által leírt módszer alapján.29 A készítményhez használt HFFC-összetételt fluoreszcens festékkel (amarant) keverték össze, és az NFRCS-t (Ch és Cp) a korábban említett módszerrel állították elő. A készítményhez használt HFFC-összetételt fluoreszcens festékkel (amarant) keverték össze, és az NFRCS-t (Ch és Cp) a korábban említett módszerrel állították elő.A formulázáshoz használt HFFC-összetételt fluoreszcens festékkel (amarant) keverték, és az NFRCS-t (Ch és Cp) a korábban említett módszer szerint kapták.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的FR斤懅Ch刈到的FR斤Cp).将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的FR斤懅Ch刈到的FR斤Cp).A készítményben használt HFFC-összetételt fluoreszcens festékkel (amarant) keverték, és a korábban említettek szerint NFRCS-t (Ch és Cp) adtak hozzá.A kapott mintákból vékony NFRK metszeteket vágtak, üveglemezekre helyezték, és fedőlemezekkel fedték le. A preparált tárgylemezeket fluoreszcens mikroszkóp alatt, zöld szűrő (310-380 nm) segítségével vizsgálták. A képeket 4-szeres nagyítással készítették, hogy megértsék a Ct-összefüggéseket és a Ct-hálózatban a túlzott polimerlerakódást.
Az NFRCS Ch és Cp felületi topográfiáját atomerő-mikroszkóppal (AFM) határoztuk meg, ultra-éles TESP konzollal, menetfúró módban: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Tajvan. A felületi érdességet négyzetes középértékkel (RMS) határoztuk meg szoftver (Scanning Probe Image Processor) segítségével. Különböző NFRCS helyeket jelenítettünk meg 3D képeken a felület egyenletességének ellenőrzése érdekében. Egy adott területre vonatkozó pontszám szórását felületi érdességnek nevezzük. Az RMS egyenletet használtuk az NFRCS31 felületi érdességének számszerűsítésére.
A FESEM-alapú vizsgálatokat FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokió műszerrel végezték a Ch NFRCS és a Cp NFRCS felületi morfológiájának megértése érdekében, amelyek jobb BCT-t mutattak, mint a Cm NFRCS. A FESEM vizsgálatot Zhao és munkatársai által leírt módszer szerint végezték, kisebb módosításokkal. 20-30 mg Ch NFRCS és Cp NFRCS NFRCS-t előkevertek 20 µl 3,8%-os nátrium-citráttal, amelyet előre összekevertek patkányvérrel. A vérrel kezelt mintákhoz 20 μl 0,2 M CaCl2-t adtak a koaguláció megindításához, majd a mintákat szobahőmérsékleten 10 percig inkubálták. Ezenkívül a felesleges eritrocitákat sóoldatos öblítéssel eltávolították az NFRCS felületéről.
A későbbi mintákat 0,1%-os glutaraldehiddel kezeltük, majd forró levegős kemencében 37°C-on szárítottuk a nedvesség eltávolítása érdekében. A szárított mintákat bevontuk és elemeztük32. Az elemzés során kapott egyéb képek közé tartozott az alvadékképződés az egyes pamutszálak felületén, a polimer lerakódása a Ct között, az eritrocita morfológia (alak), az alvadék integritása és az eritrocita morfológia NFRCS jelenlétében. A kezeletlen NFRCS területeket, valamint a vérrel inkubált Ch és Cp kezelt NFRCS területeket elemi ionokra (nátrium, kálium, nitrogén, kalcium, magnézium, cink, réz és szelén) vizsgáltuk33. Hasonlítsuk össze az elemi ionok százalékos arányát a kezelt és a kezeletlen minták között, hogy megértsük az elemi ionok felhalmozódását az alvadékképződés során, valamint az alvadék homogenitását.
A Ct felületen lévő Cp HFFC felületi bevonat vastagságát FESEM-mel határoztuk meg. A Cp NFRCS keresztmetszeteit kivágtuk a vázszerkezetből, és porlasztott bevonattal láttuk el. A kapott porlasztott bevonatú mintákat FESEM-mel vizsgáltuk, és megmértük a felületi bevonat vastagságát 34, 35, 36.
A röntgen mikro-CT nagy felbontású 3D roncsolásmentes képalkotást biztosít, és lehetővé teszi az NFRK belső szerkezeti elrendezésének tanulmányozását. A mikro-CT egy a mintán áthaladó röntgensugárnyalábot használ a mintában lévő röntgensugarak lokális lineáris csillapítási együtthatójának rögzítésére, ami segít morfológiai információk megszerzésében. A Ct belső elhelyezkedését a Cp NFRCS-ben és a vérrel kezelt Cp NFRCS-ben mikro-CT-vel vizsgálták, hogy megértsék az abszorpciós hatékonyságot és a véralvadást NFRCS jelenlétében37,38,39. A vérrel kezelt és kezeletlen Cp NFRCS minták 3D szerkezetét mikro-CT-vel (V|tome|x S240, Phoenix, Németország) rekonstruálták. A VG STUDIO-MAX szoftver 2.2-es verziójával több röntgenképet készítettek különböző szögekből (ideális esetben 360°-os lefedettség) az NFRCS 3D képeinek létrehozásához. A gyűjtött vetítési adatokat a megfelelő egyszerű 3D ScanIP Academic szoftverrel 3D volumetrikus képekké rekonstruálták.
Ezenkívül a vérrög eloszlásának megértése érdekében 20 µl előkevert citrátos vért és 20 µl 0,2 M CaCl2-t adtak az NFRCS-hez a véralvadás megindítása érdekében. Az előkészített mintákat hagyták megkeményedni. Az NFRK felületét 0,5%-os glutaraldehiddel kezelték, és forró levegős kemencében 30–40°C-on 30 percig szárították. Az NFRCS-en képződött vérrögöt szkennelték, rekonstruálták, és a vérrög 3D-s képét vizualizálták.
Az antibakteriális vizsgálatokat Cp NFRCS-en (legjobb összehasonlítani a Ch NFRCS-sel) végeztük a korábban leírt módszerrel, kisebb módosításokkal. A Cp NFRCS és a Cp HFFC antibakteriális aktivitását három különböző tesztmikroorganizmussal [S. aureus (Gram-pozitív baktériumok), E. coli (Gram-negatív baktériumok) és fehér Candida (C. albicans)] határoztuk meg, melyeket agar táptalajban, Petri-csészékben, inkubátorban növesztettünk. Egyenletesen oltsunk be 50 ml hígított baktériumtenyésztő szuszpenziót 105-106 CFU ml-1 koncentrációban az agar táptalajra. Öntsük a táptalajt Petri-csészébe, és hagyjuk megszilárdulni. Az agarlemez felületén lyukakat készítettünk a HFFC-vel való feltöltéshez (3 lyuk a HFFC-hez és 1 a negatív kontrollhoz). Adjunk 200 µl HFFC-t 3 lyukba és 200 µl pH 7,4 PBS-t a 4. lyukba. A Petri-csészébe helyezzünk egy 12 mm-es Cp NFRCS korongot a megszilárdult agarra, és nedvesítsük meg PBS-sel (pH 7,4). A ciprofloxacin, ampicillin és flukonazol tablettákat referencia standardoknak tekintjük a Staphylococcus aureus, az Escherichia coli és a Candida albicans esetében. Mérjük meg manuálisan a gátlási zónát, és készítsünk digitális képet a gátlási zónáról.
Az intézményi etikai jóváhagyást követően a vizsgálatot a Kasturba Orvosi Főiskolán végezték a Manipalban (Karnataka, Dél-India). Az in vitro TEG kísérleti protokollt a Kasturba Orvosi Főiskola Intézményi Etikai Bizottsága felülvizsgálta és jóváhagyta a Manipalban (Karnataka) található Kasturba Orvosi Főiskola Intézményi Etikai Bizottsága (IEC: 674/2020). A vizsgálati alanyokat önkéntes véradókból (18 és 55 év közöttiek) toborozták a kórházi vérbankból. Ezenkívül az önkéntesektől tájékoztatáson alapuló beleegyező nyilatkozatot is beszereztek a vérvételhez. Natív TEG-et (N-TEG) ​​​​használtak a Cp HFFC készítmény nátrium-citráttal előkevert teljes vérre gyakorolt ​​​​hatásának vizsgálatára. Az N-TEG széles körben elismert a betegellátás helyén végzett újraélesztésben betöltött szerepéről, ami problémákat okoz a klinikusoknak az eredmények klinikailag jelentős késése miatt (rutinszerű véralvadási tesztek). Az N-TEG analízist teljes vérrel végezték. Minden résztvevőtől tájékoztatáson alapuló beleegyezést és részletes kórtörténetet szereztek be. A vizsgálatban nem vettek részt olyan résztvevők, akiknél vérzéses vagy trombotikus szövődmények, például terhesség/szülés utáni időszak vagy májbetegség állt fenn. A véralvadási kaszkádot befolyásoló gyógyszereket szedő alanyokat szintén kizárták a vizsgálatból. Az összes résztvevőn alapvető laboratóriumi vizsgálatokat (hemoglobin, protrombin idő, aktivált tromboplasztin és vérlemezkeszám) végeztek a standard eljárások szerint. Az N-TEG meghatározza a vérrög viszkoelaszticitását, a kezdeti vérrög szerkezetét, a részecskék kölcsönhatását, a vérrög megerősödését és a vérrög lízisét. Az N-TEG analízis grafikus és numerikus adatokat szolgáltat számos sejtes elem és a plazma kollektív hatásairól. Az N-TEG analízist két különböző térfogatú Cp HFFC-n (10 µl és 50 µl) végezték. Ennek eredményeként 1 ml citromsavat tartalmazó teljes vért adtak 10 μl Cp HFFC-hez. Adjanak 1 ml (Cp HFFC + citrátos vér), 340 µl kevert vért 20 µl 0,2 M CaCl2-t tartalmazó TEG-csészéhez. Ezt követően a TEG-csészéket TEG® 5000, US készülékbe töltöttük, hogy Cp HFFC41 jelenlétében megmérjük az R, K, alfa-szög, MA, G, CI, TPI, EPL és LY értékeket a vérminták 30%-ában.
Az in vivo vizsgálati protokollt a Manipal Felsőoktatási Intézet Kasturba Orvostudományi Karának Intézményi Állatietikai Bizottsága (IAEC) felülvizsgálta és jóváhagyta (IAEC/KMC/69/2020). Minden állatkísérletet az Állatkísérletezés Ellenőrzési és Felügyeleti Bizottsága (CPCSEA) ajánlásainak megfelelően végeztek. Minden in vivo NFRCS vizsgálatot (2 × 2 cm2) nőstény Wistar patkányokon (200-250 g súlyú) végeztek. Minden állatot 24-26°C hőmérsékleten akklimatizáltak, az állatok szabadon hozzáférhettek a standard táplálékhoz és vízhez ad libitum. Minden állatot véletlenszerűen különböző csoportokba osztottak, minden csoport három állatból állt. Minden vizsgálatot az Állatkísérletek: In Vivo Kísérleti Jelentés 43 szerint végeztek. A vizsgálat előtt az állatokat intraperitoneálisan (ip) altatták 20-50 mg ketamin (testtömeg-kg-onként) és 2-10 mg xilazin (testtömeg-kg-onként) keverékének beadásával. A vizsgálat után a vérzés mennyiségét a minták kezdeti és végső súlya közötti különbség kiértékelésével számították ki, a három vizsgálatból kapott átlagértéket vették a minta vérzés mennyiségének.
A patkányfarok-amputációs modellt azért alkalmazták, hogy megértsék az NFRCS (nehézlégzőrendszeri amputációs technikával végzett műtét) vérzést befolyásoló potenciálját traumák, harcok vagy közlekedési balesetek esetén (sérülésmodell). A farok 50%-át vágták le egy szikével, és 15 másodpercre levegőre helyezték a normális vérzés biztosítása érdekében. Ezenkívül a tesztmintákat nyomás alkalmazásával a patkány farkára helyezték (Ct, Cs, Ch NFRCS és Cp NFRCS). A tesztminták esetében vérzést és PCT-t jelentettek (n = 3)17,45.
Az NFRCS nyomásszabályozásának hatékonyságát harcban a felületes combartéria modelljén vizsgálták. A combartériát szabaddá tették, 24G-s trokárral megszúrták, és 15 másodpercen belül véreztették. Miután kontrollálhatatlan vérzést észleltek, a vizsgálati mintát a szúrás helyére helyezték, és nyomást alkalmaztak rá. A vizsgálati minta felvitele után azonnal feljegyezték az alvadási időt, és a következő 5 percben megfigyelték a hemosztatikus hatékonyságot. Ugyanezt az eljárást megismételték Cs és Ct46 esetében.
Dowling és munkatársai47 egy májkárosodási modellt javasoltak a hemosztatikus anyagok hemosztatikus potenciáljának felmérésére intraoperatív vérzés összefüggésében. A véráramlási érzékenységet (BCT) rögzítették Ct minták (negatív kontroll), Cs váz (pozitív kontroll), Ch NFRCS minták és Cp NFRCS minták esetében. A patkány szuprahepatikus vena caváját medián laparotomiával tárták fel. Ezt követően a bal lebeny disztális részét ollóval kivágták. Szike segítségével bemetszést ejtettek a májon, és hagyták néhány másodpercig vérezni. A pontosan lemért Ch NFRCS és Cp NFRCS tesztmintákat pozitív nyomás nélkül a sérült felületre helyezték, és felvették a BCT-t. A kontrollcsoport (Ct) ezután nyomást, majd 30 másodperces Cs-lecsengést alkalmaztak a sérülés megszakítása nélkül.
In vivo sebgyógyulási vizsgálatokat végeztek egy kimetszett sebmodell segítségével a kifejlesztett polimer alapú NFRCS-ek sebgyógyulási tulajdonságainak értékelésére. A kimetszett sebek modelljeit a korábban publikált módszerek szerint választották ki és végezték el, kisebb módosításokkal19,32,48. Minden állatot a korábban leírtak szerint érzéstelenítettek. Biopsziás lyukasztóval (12 mm) kör alakú, mély bemetszést ejtettek a hát bőrén. Az előkészített sebhelyeket Cs-sel (pozitív kontroll), Ct-vel (figyelembe véve, hogy a vattakorongok zavarják a gyógyulást), Ch NFRCS-sel és Cp NFRCS-sel (kísérleti csoport), valamint egy negatív kontrollal, kezelés nélkül kötözték be. A vizsgálat minden napján minden patkánynál megmérték a seb területét. Digitális kamerával készítettek képet a seb területéről, és új kötést helyeztek fel. A sebzáródás százalékos arányát a következő képlettel mérték:
A vizsgálat 12. napján a sebzáródás százalékos aránya alapján a legjobb csoport patkánybőrét kimetszettük ((Cp NFRCS) és a kontrollcsoportét), és H&E festéssel, valamint Masson-féle trikróm festéssel vizsgáltuk. A vizsgálat 12. napján a sebzáródás százalékos aránya alapján a legjobb csoport patkánybőrét kimetszettük ((Cp NFRCS) és a kontrollcsoportét), és H&E festéssel, valamint Masson-féle trikróm festéssel vizsgáltuk.A vizsgálat 12. napján a sebzáródás százalékos aránya alapján a legjobb csoport ((Cp NFRCS) és a kontrollcsoport) patkányainak bőrét kimetszettük, és hematoxilin-eozinnal, valamint Masson-trikrómmal festettük.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和Masson三色染色研究.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组）A legjobb csoportba ((Cp NFRCS) és a kontrollcsoport) tartozó patkányokat a vizsgálat 12. napján kimetszették hematoxilin-eozin festésre és Masson-trikróm festésre a sebzáródás százalékos aránya alapján.A festési eljárást a korábban leírt módszerek49,50 szerint végeztük. Röviden, 10%-os formalinban történő fixálás után a mintákat fokozatos alkoholok sorozatával dehidratáltuk. Mikrotómmal vékony (5 µm vastag) metszeteket készítettünk a kimetszett szövetből. A kontrollok és a Cp NFRCS vékony sorozatmetszeteit hematoxilinnel és eozinnal kezeltük a hisztopatológiai változások vizsgálata céljából. Masson-féle trikróm festéket használtunk a kollagénfibrillumok képződésének kimutatására. A kapott eredményeket patológusok vakon vizsgálták.
A Cp NFRCS minták stabilitását szobahőmérsékleten (25°C ± 2°C/60% relatív páratartalom ± 5%) vizsgálták 12 hónapon keresztül51. A Cp NFRCS-t (felületi elszíneződés és mikrobiális növekedés) vizuálisan ellenőrizték, és a fenti, az Anyagok és módszerek részben ismertetett módszerek szerint tesztelték a hajtogatási kopásállóság és a törési kopásállóság szempontjából.
A Cp NFRCS skálázhatóságát és reprodukálhatóságát 15×15 cm2 méretű Cp NFRCS előállításával vizsgáltuk. Ezenkívül 30 mg-os mintákat (n = 5) vágtunk ki különböző Cp NFRCS frakciókból, és a vizsgált minták vérplazma-átlagát (BCT) a Módszerek részben korábban leírtak szerint értékeltük.
Különböző formákat és szerkezeteket próbáltunk kidolgozni Cp NFRCS kompozíciók felhasználásával különféle biomedicinális alkalmazásokhoz. Az ilyen formák vagy konfigurációk közé tartoznak a kúpos tamponok orrvérzés és fogászati ​​beavatkozások esetén, valamint a hengeres tamponok hüvelyi vérzés esetén.
Minden adatsort átlag ± szórásként fejeztünk ki, és ANOVA-val elemeztük Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, USA) szoftverrel, majd Bonferroni-féle többszörös összehasonlító teszttel (*p<0,05).
Az emberi vizsgálatokban végzett összes eljárás az Intézet és a Nemzeti Kutatási Tanács szabványaival, valamint az 1964. évi Helsinki Nyilatkozattal és annak későbbi módosításaival, vagy hasonló etikai normákkal összhangban történt. Minden résztvevőt tájékoztattak a vizsgálat jellemzőiről és önkéntes jellegéről. A résztvevők adatai a gyűjtést követően bizalmasak maradnak. Az in vitro TEG kísérleti protokollt a Kasturba Orvosi Egyetem Intézményi Etikai Bizottsága (Manipal, Karnataka) felülvizsgálta és jóváhagyta (IEC: 674/2020). Az önkéntesek tájékoztatáson alapuló beleegyezésüket írták alá a vérvételhez.
Az állatkísérletekben elvégzett összes eljárást a Manipal Felsőoktatási Intézet Kastuba Orvostudományi Karának (IAEC/KMC/69/2020) előírásaival összhangban végezték. Az összes tervezett állatkísérletet az Állatkísérletezés Ellenőrzési és Felügyeleti Bizottsága (CPCSEA) irányelveinek megfelelően végezték. Minden szerző az ARRIVE irányelveit követi.
Az összes NFRCS FTIR spektrumát elemezték és összehasonlították a 2A. ábrán látható kitin spektrumával. A kitin jellemző spektrális csúcsai (felvéve) 3437 cm⁻¹-nél (OH és NH nyújtás, átfedés), 2945 és 2897 cm⁻¹-nél (CH nyújtás), 1660 cm⁻¹-nél (NH2 feszültség), 1589 cm⁻¹-nél (N–H hajlítás), 1157 cm⁻¹-nél (híd nyújtás O–), 1067 cm⁻¹-nél (C–O nyújtás, szekunder hidroxil), 993 cm⁻¹-nél (CO nyújtás, Bo-OH) 52,53,54 cm⁻¹-nél láthatók. Az S1. kiegészítő táblázat a kitin (riporter), a tiszta kitin, a Cm, Ch és Cp FTIR NFRCS abszorpciós spektrum értékeit mutatja. Az összes NFRCS (Cm, Ch és Cp) FTIR spektrumai ugyanazokat a jellemző abszorpciós sávokat mutatták, mint a tiszta kitin, szignifikáns változások nélkül (2A. ábra). Az FTIR eredmények megerősítették a kémiai vagy fizikai kölcsönhatások hiányát az NFRCS kifejlesztéséhez használt polimerek között, ami arra utal, hogy a felhasznált polimerek inertek.
A Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS és Cs in vitro jellemzése. (A) a kitin és a Cm NFRCS, Ch NFRCS és Cp NFRCS összetételének kombinált FTIR spektrumát mutatja be kompresszió alatt. (B) a) Az NFRCS Cm, Ch, Cp és Cg teljes vérfelvételi sebessége (n = 3); A Ct minták magasabb BAR értéket mutattak, mivel a vattapálcika nagyobb abszorpciós hatékonysággal rendelkezik; b) Vér vérfelvétel után Az abszorbeált minta illusztrációja. A C tesztminta BCT-jének grafikus ábrázolása (a Cp NFRCS mutatta a legjobb BCT-t (15 s, n = 3)). A C, D, E és G ábrákon látható adatokat átlag ± SD formátumban tüntettük fel, a hibasávok pedig a SD-t jelentik, ***p < 0,0001. A C, D, E és G ábrákon látható adatokat átlag ± SD formátumban tüntettük fel, a hibasávok pedig a SD-t jelentik, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E és G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представлендниртно представлендают ***p <0,0001. A C, D, E és G ábrákon látható adatok átlag ± szórás formájában vannak megadva, a hibasávok pedig a szórást jelölik, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001. Данные в C, D, E és G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей представляю отклонение, ***p <0,0001. A C, D, E és G ábrákon látható adatok átlag ± szórás formájában láthatók, a hibasávok a szórást jelölik, ***p<0,0001.