Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com oldalt.Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik.A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben).Addig is a folyamatos támogatás érdekében a webhelyet stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg.
A madarak termékenysége attól függ, hogy képesek-e hosszabb ideig elegendő életképes spermát tárolni a spermiumtároló tubulusokban (SST).Továbbra is ellentmondásos a pontos mechanizmus, amellyel a spermiumok belépnek, ott tartózkodnak és elhagyják az SST-t.A sharkasi tyúkok spermája nagy agglutinációs hajlamot mutatott, sok sejtet tartalmazó, mozgékony fonalas kötegeket képezve.A spermiumok motilitásának és viselkedésének átlátszatlan petevezetékben történő megfigyelésének nehézségei miatt a spermiumok agglutinációjának és motilitásának vizsgálatára a spermiumokhoz hasonló mikrocsatornás keresztmetszetű mikrofluidikus eszközt alkalmaztunk.Ez a tanulmány azt tárgyalja, hogyan alakulnak ki a spermiumkötegek, hogyan mozognak, és milyen szerepet játszanak a spermiumok SST-ben való tartózkodásának meghosszabbításában.Vizsgáltuk a spermiumok sebességét és reológiai viselkedését, amikor a folyadékáramlás mikrofluidikus csatornán belül hidrosztatikus nyomás hatására keletkezett (áramlási sebesség = 33 µm/s).A spermiumok hajlamosak az árammal szemben úszni (pozitív reológia), és a spermiumköteg sebessége jelentősen lecsökken az egyedi spermiumokhoz képest.Megfigyelték, hogy a spermiumkötegek spirálisan mozognak, és megnövekednek a hosszúságuk és vastagságuk, ahogy egyre több egyedi spermium képződik. Megfigyelték, hogy a spermiumkötegek a mikrofluidikus csatornák oldalfalához közelednek és azokhoz tapadtak, hogy elkerüljék a 33 µm/s-nál nagyobb folyadékáramlási sebességgel való seperést. Megfigyelték, hogy a spermiumkötegek a mikrofluidikus csatornák oldalfalához közelednek és azokhoz tapadtak, hogy elkerüljék a 33 µm/s-nál nagyobb folyadékáramlási sebességgel való seperést. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюикачх, икрофлюикачены сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Megfigyelték, hogy a spermiumkötegek megközelítik és hozzátapadnak a mikrofluidikus csatornák oldalfalához, hogy elkerüljék a 33 µm/s-nál nagyobb folyadékáramlási sebességnél történő elsöpörését.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 流体流速> 33 悉µm/s> 3333 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного, тания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Megfigyelték, hogy a spermiumkötegek megközelítik és hozzátapadnak a mikrofluidikus csatorna oldalfalaihoz, hogy elkerüljék, hogy a >33 µm/s-nál nagyobb folyadékáramlás elsodorja őket.A pásztázó és transzmissziós elektronmikroszkópos vizsgálat kimutatta, hogy a spermiumkötegeket bőséges sűrű anyag támasztotta alá.A kapott adatok bizonyítják a Sharkazi csirke spermiumok egyedülálló mobilitását, valamint a spermiumok azon képességét, hogy agglutinálódjanak és mobil kötegeket képezzenek, ami hozzájárul a spermiumok SMT-ben való hosszú távú tárolásának jobb megértéséhez.
Az emberek és a legtöbb állat megtermékenyítése érdekében a spermiumoknak és a petesejteknek a megfelelő időben kell megérkezniük a megtermékenyítés helyére.Ezért a párzásnak az ovuláció előtt vagy annak idején kell megtörténnie.Másrészt egyes emlősök, például kutyák, valamint nem emlős fajok, például rovarok, halak, hüllők és madarak, hosszabb ideig tárolják a spermiumokat szaporítószerveikben, amíg tojásaik készen állnak a megtermékenyítésre (aszinkron megtermékenyítés 1 ).A madarak 2-10 hétig képesek fenntartani a peték megtermékenyítésére képes spermiumok életképességét2.
Ez egy egyedülálló tulajdonság, amely megkülönbözteti a madarakat a többi állattól, mivel egyetlen megtermékenyítés után több hétig nagy valószínűséggel megtermékenyít, anélkül, hogy egyidejű párzás és ovuláció történik.A fő spermiumtároló szerv, az úgynevezett spermiumtároló tubulus (SST), a belső nyálkahártya ráncaiban található az uterovaginális csomópontnál.A mai napig nem teljesen ismertek azok a mechanizmusok, amelyek révén a spermiumok belépnek, ott tartózkodnak és kilépnek a spermabankból.Korábbi tanulmányok alapján sok hipotézist állítottak fel, de egyik sem igazolódott be.
Forman4 feltételezte, hogy a spermiumok az SST hámsejteken elhelyezkedő fehérjecsatornákon keresztül a folyadékáramlás irányával szembeni folyamatos oszcillációs mozgás révén tartják fenn tartózkodási helyüket az SST üregben (reológia).Az ATP kimerül az állandó flagelláris aktivitás miatt, amely ahhoz szükséges, hogy a spermium az SST lumenében maradjon, és a motilitás végül csökken, amíg a spermiumok folyadékáramlással ki nem kerülnek a spermiumbankból, és új utat kezdenek a felszálló petevezetéken, hogy megtermékenyítsék a spermát.Tojás (Forman4).A spermiumtárolásnak ezt a modelljét támogatja az SST epiteliális sejtekben jelenlévő 2., 3. és 9. akvaporinok immuncitokémiai kimutatása.A mai napig hiányoznak a csirke sperma reológiájáról és az SST tárolásában, a hüvelyi spermiumok szelekciójában és a spermiumok versengésében betöltött szerepéről szóló tanulmányok.A csirkéknél a spermiumok természetes párzás után jutnak be a hüvelybe, de a spermiumok több mint 80%-a röviddel a párzás után kilökődik a hüvelyből.Ez arra utal, hogy a hüvely a madarak spermaválasztásának elsődleges helye.Ezenkívül arról számoltak be, hogy a hüvelyben megtermékenyített spermiumok kevesebb mint 1%-a kerül SST-be2.A hüvelyben lévő csibék mesterséges megtermékenyítésénél az SST-t elérő spermiumok száma a megtermékenyítés után 24 órával általában nő.A spermiumok szelekciójának mechanizmusa e folyamat során egyelőre nem tisztázott, és a spermiumok mozgékonysága fontos szerepet játszhat az SST spermiumfelvételében.A petevezetékek vastag és átlátszatlan falai miatt a madarak petevezetékében nehéz közvetlenül ellenőrizni a spermiumok mozgékonyságát.Ezért hiányoznak az alapvető ismereteink arról, hogy a spermiumok hogyan alakulnak át SST-be a megtermékenyítés után.
A reológiát a közelmúltban az emlős nemi szervekben a spermiumszállítást szabályozó fontos tényezőként ismerték fel.A mozgékony spermiumok ellenáramú vándorlási képessége alapján Zaferani és munkatársai8 corra mikrofluidikus rendszert használtak a mozgó spermiumok passzív izolálására az elhelyezett spermamintákból.Az ilyen típusú spermaválogatás elengedhetetlen az orvosi meddőségi kezeléshez és a klinikai kutatásokhoz, és előnyben részesítik a hagyományos módszerekkel szemben, amelyek idő- és munkaigényesek, és veszélyeztethetik a sperma morfológiáját és szerkezeti integritását.Mindeddig azonban nem végeztek vizsgálatokat a csirkék nemi szerveiből származó váladéknak a spermiumok mozgékonyságára gyakorolt ​​hatásáról.
Az SST-ben tárolt spermát fenntartó mechanizmustól függetlenül sok kutató megfigyelte, hogy a 9., 10. csirkék, 2. fürj és 11. pulykák SST-jében a rezidens spermiumok fej-fej mellett agglutinálódnak, és agglutinált spermiumkötegeket képeznek.A szerzők azt sugallják, hogy kapcsolat van ezen agglutináció és a spermiumok hosszú távú tárolása között az SST-ben.
Tingari és Lake12 erős összefüggésről számolt be a csirke spermiumátvevő mirigyében lévő spermiumok között, és megkérdőjelezte, hogy a madár spermiumai ugyanúgy agglutinálódnak-e, mint az emlős spermiumok.Úgy vélik, hogy a spermiumok közötti mély kapcsolatokat a vas deferensben az a stressz okozhatja, amelyet a nagy számú spermium kis helyen való jelenléte okoz.
A spermiumok viselkedésének értékelése során frissen függő üveglemezeken az agglutináció átmeneti jelei láthatók, különösen a spermacseppek szélein.Az agglutinációt azonban gyakran megzavarta a folyamatos mozgással járó forgási hatás, ami magyarázza a jelenség átmeneti jellegét.A kutatók azt is észrevették, hogy amikor a hígítószert a spermához adták, megnyúlt „szálszerű” sejtaggregátumok jelentek meg.
A spermium utánzására a korai kísérletek során egy vékony drótot távolítottak el egy függő cseppről, aminek eredményeként egy megnyúlt spermaszerű hólyag nyúlt ki a spermacseppből.A spermiumok azonnal párhuzamosan sorakoztak fel a hólyagban, de a 3D-korlátozás miatt az egész egység gyorsan eltűnt.Ezért a spermiumok agglutinációjának tanulmányozásához közvetlenül izolált spermiumtároló tubulusokban kell megfigyelni a spermiumok mozgékonyságát és viselkedését, ami nehezen elérhető.Ezért szükség van egy olyan műszer kifejlesztésére, amely utánozza a spermiumokat a spermiumok mozgékonyságának és agglutinációs viselkedésének vizsgálatához.Brillard és munkatársai13 arról számoltak be, hogy a felnőtt csirkékben a spermiumtároló tubulusok átlagos hossza 400–600 µm, de egyes SST-k akár 2000 µm hosszúak is lehetnek.Mero és Ogasawara14 az ondómirigyeket megnagyobbodott és nem megnagyobbodott spermiumtároló tubulusokra osztotta, amelyek hossza (~500 µm) és nyakszélessége (~38 µm) azonos volt, de a tubulusok átlagos lumenátmérője 56,6 és 56,6 µm volt.., illetve 11,2 μm.A jelenlegi vizsgálatban 200 µm × 20 µm (W × H) csatornaméretű mikrofluidikus eszközt használtunk, amelynek keresztmetszete valamelyest közel áll az amplifikált SST keresztmetszeteéhez.Emellett megvizsgáltuk a spermiumok motilitását és agglutinációs viselkedését áramló folyadékban, ami összhangban van Foreman hipotézisével, miszerint az SST hámsejtek által termelt folyadék ellenáramú (reológiai) irányban tartja a spermiumokat a lumenben.
A tanulmány célja az volt, hogy leküzdje a spermiumok petevezetékben történő motilitásának megfigyelésével kapcsolatos problémákat, és elkerülje a spermiumok reológiájának és viselkedésének dinamikus környezetben történő tanulmányozásának nehézségeit.Mikrofluidikus eszközt használtak, amely hidrosztatikus nyomást hoz létre, hogy szimulálja a spermiumok mozgékonyságát a csirke nemi szervében.
Amikor egy csepp hígított spermamintát (1:40) helyeztünk a mikrocsatornás eszközbe, kétféle spermiummotilitást lehetett azonosítani (izolált spermium és kötött spermium).Ezenkívül a spermiumok hajlamosak voltak az árammal szemben úszni (pozitív reológia; 1., 2. videó). Bár a spermiumkötegek sebessége kisebb volt, mint a magányos spermáké (p < 0,001), növelték a pozitív reotaxist mutató spermiumok százalékos arányát (p < 0,001; 2. táblázat). Bár a spermiumkötegek sebessége kisebb volt, mint a magányos spermáké (p < 0,001), növelték a pozitív reotaxist mutató spermiumok százalékos arányát (p < 0,001; 2. táblázat). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), валончу01 рматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Bár a spermiumkötegek sebessége kisebb volt, mint az egyes spermiumoké (p < 0,001), növelte a pozitív reotaxist mutató spermiumok százalékos arányát (p < 0,001; 2. táblázat).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了昁槵槺逳.分比(p < 0,001；表2）).尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001）分比 (p <0,001 ； 2。。。。。。)）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они уверматозоидов они уверматозоидов они уверматозоидов в с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Bár a spermiumkötegek sebessége kisebb volt, mint az egyes spermiumoké (p < 0,001), növelte a pozitív reológiájú spermiumok arányát (p < 0,001; 2. táblázat).Az egyes spermiumok és kötegek pozitív reológiáját körülbelül 53%-ra, illetve 85%-ra becsülik.
Megfigyelték, hogy a sharkasi csirkék spermiumai közvetlenül az ejakuláció után lineáris kötegeket alkotnak, amelyek több tucat egyedből állnak.Ezek a csomók az idő múlásával növekszik a hossza és a vastagsága, és in vitro több órán keresztül is megmaradhatnak, mielőtt szétoszlanak (3. videó).Ezek a fonalas kötegek olyan formájúak, mint az echidna spermiumok, amelyek a mellékhere végén képződnek.A Sharkashi tyúk spermájáról azt találták, hogy a begyűjtés után kevesebb mint egy percen belül hajlamos agglutinálódni, és hálószerű köteget képezni.Ezek a gerendák dinamikusak, és bármely közeli falhoz vagy statikus objektumhoz tapadnak.Bár a spermiumkötegek csökkentik a hímivarsejtek sebességét, egyértelmű, hogy makroszkóposan növelik linearitásukat.A kötegek hossza a kötegekben összegyűjtött spermiumok számától függően változik.A köteg két részét izoláltuk: a kezdeti részt, amely magában foglalja az agglutinált spermium szabad fejét, és a terminális részt, amely magában foglalja a spermium farkát és teljes disztális végét.Nagysebességű (950 fps) kamera segítségével a köteg kezdeti részében agglutinált spermiumok szabad fejeit figyeltük meg, amelyek rezgőmozgásuk miatt felelősek a köteg mozgásáért, a maradékokat csavarvonalas mozdulattal a kötegbe húzva (4. videó).A hosszú kötegeknél azonban megfigyelték, hogy néhány szabad spermafej a testhez tapadt, és a köteg terminális része lapátként működik, segítve a köteg meghajtását.
Lassú folyadékáramlás közben a spermiumkötegek egymással párhuzamosan mozognak, azonban elkezdenek átfedni, és minden mozdulatlanhoz tapadnak, hogy az áramlási sebesség növekedésével ne mossa el őket az áramáramlás.A kötegek akkor jönnek létre, amikor egy maroknyi hímivarsejt közeledik egymáshoz, szinkronban kezdenek mozogni, és egymás köré tekerednek, majd ragadós anyaghoz tapadnak.Az 1. és 2. ábra azt mutatja, hogy a spermiumok hogyan közelednek egymáshoz, és egy csomópontot képeznek, amikor a farok körbefonódik.
A kutatók hidrosztatikus nyomást alkalmaztak, hogy folyadékáramlást hozzanak létre egy mikrocsatornában, hogy tanulmányozzák a spermiumok reológiáját.200 µm × 20 µm (Sz × Ma) méretű és 3,6 µm hosszúságú mikrocsatornát használtunk.Használjon mikrocsatornákat a tartályok között, a végükön fecskendőkkel.A csatornák láthatóbbá tételére ételfestéket használtak.
Rögzítse az összekötő kábeleket és a tartozékokat a falhoz.A videó fáziskontraszt mikroszkóppal készült.Minden egyes képnél fáziskontraszt mikroszkópos és térképészeti képeket mutatnak be.(A) A két patak közötti kapcsolat ellenáll a spirális mozgás miatti áramlásnak (piros nyíl).(B) A csőköteg és a csatornafal kapcsolata (piros nyilak), egyúttal két másik köteggel is össze vannak kötve (sárga nyilak).(C) A mikrofluidikus csatornában lévő spermiumkötegek elkezdenek kapcsolódni egymással (piros nyilak), spermiumkötegekből álló hálót alkotva.(D) A spermiumkötegek hálózatának kialakulása.
Amikor egy csepp hígított spermát betöltöttünk a mikrofluidikus eszközbe, és áramlást hoztunk létre, megfigyeltük, hogy a spermiumnyaláb az áramlás irányával ellentétesen mozog.A kötegek szorosan illeszkednek a mikrocsatornák falához, és a kötegek kezdeti részében lévő szabad fejek szorosan illeszkednek hozzájuk (5. videó).Ragaszkodnak az útjukba kerülő álló részecskékhez, például a törmelékhez is, hogy ellenálljanak az áram által elsodortnak.Idővel ezek a csomók hosszú szálakká válnak, amelyek befogják a többi egyedi spermiumot, és rövidebb csomókat (6. videó).Ahogy az áramlás lassulni kezd, a spermiumok hosszú vonalai spermiumvonalak hálózatát kezdik kialakítani (7. videó; 2. ábra).
Nagy áramlási sebességnél (V > 33 µm/s) a szálak spirális mozgása megnövekszik, hogy megkíséreljenek sok egyedi spermiumköteget megfogni, hogy jobban ellenálljanak az áramlás sodródó erejének. Nagy áramlási sebességnél (V > 33 µm/s) a szálak spirális mozgása megnövekszik, hogy megkíséreljenek sok egyedi spermiumköteget megfogni, hogy jobban ellenálljanak az áramlás sodródó erejének. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытанются х сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. Nagy áramlási sebességeknél (V > 33 µm/s) a szálak spirális mozgása megnövekszik, mivel sok egyedi spermiumot próbálnak megfogni, és olyan kötegeket képeznek, amelyek jobban ellenállnak az áramlás sodródó erejének.在高流速(V > 33 µm/s) 时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉以许多形成束的多形成束的好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 训 弚 形成 束 束更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。. При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватеть попытке захетенить зоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Nagy áramlási sebességeknél (V > 33 µm/s) a filamentumok spirális mozgása megnövekszik, hogy megkíséreljen befogni sok egyedi spermiumot, amelyek kötegeket képeznek, hogy jobban ellenálljanak az áramlás elsodródó erőinek.Az oldalfalakra mikrocsatornákat is próbáltak rögzíteni.
Fénymikroszkóppal (LM) a spermiumkötegeket spermiumfejek és hullámos farok csoportjaiként azonosították.A különféle aggregátumokat tartalmazó spermiumkötegeket csavart fejként és flagelláris aggregátumként, többszörös összeolvadt spermafarokként, farokhoz kapcsolódó spermiumfejként és hajlított maggal rendelkező spermiumfejként is azonosították, mint több összeolvadt magot.transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM).A pásztázó elektronmikroszkópos vizsgálat (SEM) azt mutatta, hogy a spermiumkötegek a spermiumfejek burkolt aggregátumai voltak, a spermium-aggregátumok pedig beburkolt farok hálózatát mutatták.
A spermiumok morfológiáját és ultrastruktúráját, a spermiumköteg kialakulását fénymikroszkóppal (félmetszet), pásztázó elektronmikroszkóppal (SEM) és transzmissziós elektronmikroszkóppal (TEM), a spermiumkeneteket akridinnarancssárgával megfestettük és epifluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk.
A spermiumkenet akridinnarancssárgával történő festése (3B. ábra) azt mutatta, hogy a spermiumfejek összetapadtak, és szekréciós anyaggal borították be, ami nagy csomók kialakulásához vezetett (3D. ábra).A spermiumkötegek spermium-aggregátumokból álltak, és egymáshoz kapcsolódó farokhálózattal (4A-C. ábra).A spermiumkötegeket sok, egymáshoz tapadt spermium farka alkotja (4D. ábra).A titkok (4E, F ábra) a spermiumkötegek fejét fedték.
A spermiumköteg kialakulása Fáziskontraszt mikroszkóppal és akridinnarancsgal festett spermiumkenetekkel kimutattuk, hogy a spermiumok fejei összetapadnak.(A) A korai spermiumcsomó képződése egy spermiummal (fehér kör) és három spermiummal (sárga kör) kezdődik, a spirál a faroknál kezdődik és a fejnél ér véget.(B) Az akridinnarancssárgával festett spermiumkenet mikrofényképe, amelyen megtapadó spermafejek (nyilak) láthatók.A váladék lefedi a fej(ke)t.Nagyítás × 1000. (C) Egy mikrofluidikus csatornában áramlás által továbbított nagy nyaláb kialakítása (nagy sebességű, 950 képkocka/mp sebességű kamera segítségével).(D) Mikrográf akridinnarancssárgával megfestett spermiumkenetről, amely nagy csomókat (nyilak) mutat.Nagyítás: × 200.
Pásztázó elektronmikroszkópos felvétel egy spermiumnyalábról és egy akridinnarancssárgával festett spermiumkenetről.(A, B, D, E) a spermiumok digitális színes pásztázó elektronmikroszkópos felvételei, a C és F pedig akridinnarancssárgával festett spermiumkenetek mikroképei, amelyek a farokszövetet beburkoló több spermium tapadását mutatják.(AC) A spermium-aggregátumok a hozzákapcsolt farok (nyilak) hálózataként jelennek meg.(D) Több spermium (ragasztóanyaggal, rózsaszín körvonallal, nyíllal) adhéziója a farok körül.(E és F) Spermafej-aggregátumok (mutatók), amelyeket ragasztóanyaggal (mutatók) borítanak.A spermiumok számos örvényszerű szerkezettel rendelkező kötegeket alkottak (F).(C) × 400 és (F) × 200 nagyítás.
Transzmissziós elektronmikroszkóppal azt találtuk, hogy a spermiumkötegekhez farok (6A., C. ábra), farokhoz kapcsolódó fej (6B. ábra) vagy farokhoz (6D. ábra) kapcsolódott fej.A kötegben lévő spermiumok feje ívelt, metszetben két magrégiót mutat be (6D. ábra).A bemetszéskötegben a spermiumok feje csavarodott, két magrégióval és több flagelláris régióval (5A. ábra).
Digitális színes elektronmikroszkópos felvétel, amelyen a spermiumkötegben lévő összekötő farok és a spermiumfejeket összekötő agglutináló anyag látható.(A) Nagyszámú spermium hozzátartozó farka.Figyelje meg, hogyan néz ki a farok álló (nyíl) és fekvő (nyíl) vetítésben is.(B) A spermium feje (nyíl) kapcsolódik a farokhoz (nyíl).(C) Számos spermiumfarok (nyilak) van rögzítve.(D) Az agglutinációs anyag (AS, kék) négy spermiumfejet köt össze (lila).
Pásztázó elektronmikroszkóppal kimutatták a spermiumfejeket a váladékkal vagy membránnal borított spermiumkötegekben (6B. ábra), ami azt jelzi, hogy a spermiumkötegeket extracelluláris anyag rögzítette.Az agglutinált anyagot a spermiumfejben koncentráltuk (medúzafej-szerű összeállítás; 5B. ábra), és disztálisan kitágult, és akridinnarancssárgával megfestve fluoreszcens mikroszkóp alatt ragyogó sárga megjelenést kapott (6C. ábra).Ez az anyag jól látható pásztázó mikroszkóp alatt, és kötőanyagnak számít.A félvékony metszetek (5C. ábra) és akridinnarancssárgával festett spermiumkenetek sűrűn tömött fejeket és felgöndörödött farkat tartalmazó spermiumkötegeket mutattak (5D. ábra).
Különféle mikrofényképek, amelyek különböző módszerekkel mutatják be a spermiumfejek és az összehajtott farok aggregációját.(A) Keresztmetszeti digitális színtranszmissziós elektronmikroszkópos felvétel egy spermiumkötegről, amely egy feltekert spermiumfejet mutat, kétrészes maggal (kék) és több flagelláris résszel (zöld).(B) Digitális színes pásztázó elektronmikroszkópos felvétel, amely medúzaszerű spermiumfejek (nyilak) csoportját mutatja, amelyek fedni látszanak.(C) Félvékony metszet, amely aggregált spermiumfejeket (nyilak) és felgöndörödött farkokat (nyilak) mutat.(D) Mikrográf akridinnarancssárgával megfestett spermiumkenetről, amelyen a spermiumfejek aggregátumai (nyilak) és a felgöndörödött összetapadó farok (nyilak) láthatók.Vegye figyelembe, hogy egy ragacsos anyag (S) borítja a spermium fejét.(D) × 1000-es nagyítás.
Transzmissziós elektronmikroszkóppal (7A. ábra) azt is megfigyelték, hogy a spermiumfejek csavarodtak, és a sejtmagok spirál alakúak voltak, amint azt az akridinnarancssárgával megfestett spermiumkenetek és fluoreszcens mikroszkóppal vizsgálták (7B. ábra).
(A) Digitális színtranszmissziós elektronmikroszkópos felvétel és (B) Akridinnarancssárgával festett spermiumkenet, amely a feltekeredett fejeket és a spermiumfejek és -farok rögzítését mutatja (nyilak).(B) × 1000-es nagyítás.
Érdekes felfedezés, hogy Sharkazi spermája mozgékony fonalas kötegeket képezve aggregálódik.Ezeknek a kötegeknek a tulajdonságai lehetővé teszik számunkra, hogy megértsük lehetséges szerepüket a spermiumok SST-ben történő felszívódásában és tárolásában.
A párosodás után a spermiumok bejutnak a hüvelybe, és intenzív szelekciós folyamaton mennek keresztül, aminek eredményeként csak korlátozott számú spermium kerül az SST15-be,16.A mai napig nem tisztázott a spermiumok SST-be való belépésének és kilépésének mechanizmusa.Baromfi esetében a spermiumokat fajtól függően hosszabb ideig, 2-10 hétig tárolják az SST-ben6.Továbbra is vita van a sperma állapotáról az SST-ben való tárolás során.Mozgásban vannak vagy nyugalomban vannak?Más szóval, hogyan tartják meg a spermiumsejtek pozíciójukat az SST-ben ilyen sokáig?
Forman4 azt javasolta, hogy az SST tartózkodása és kilökődése a spermiumok mozgékonyságával magyarázható.A szerzők feltételezik, hogy a spermiumok úgy tartják meg pozíciójukat, hogy az SST hám által létrehozott folyadékáramlással szemben úsznak, és a spermiumok kilökődnek az SST-ből, amikor sebességük az energiahiány miatt visszafelé haladni kezd.A Zaniboni5 megerősítette a 2-es, 3-as és 9-es akvaporinok jelenlétét az SST hámsejtek apikális részében, amelyek közvetve támogathatják Foreman spermatárolási modelljét.A jelenlegi tanulmányban azt találtuk, hogy Sharkashi spermiumainak csaknem fele pozitív reológiát mutat az áramló folyadékban, és az agglutinált spermiumkötegek növelik a pozitív reológiát mutató spermiumok számát, bár az agglutináció lelassítja őket.Nem teljesen ismert, hogy a spermiumsejtek hogyan jutnak fel a madár petevezetékén a megtermékenyítés helyére.Emlősökben a follikuláris folyadék kemovonzza a spermiumokat.Azonban úgy gondolják, hogy a kemoattraktánsok nagy távolságra irányítják a spermiumokat7.Ezért más mechanizmusok felelősek a spermiumszállításért.A spermiumok azon képessége, hogy a párzás után felszabaduló petevezeték-folyadékkal szemben orientálódjanak és áramoljanak, az egyik fő tényező a spermiumok megcélzásában egerekben.Parker 17 azt javasolta, hogy a spermiumok madarakban és hüllőkben a ciliáris árammal szemben úszva keljenek át a petevezetéken.Bár madarakon kísérletileg nem igazolták, az Adolphi18 volt az első, aki megállapította, hogy a madársperma pozitív eredményeket ad, ha egy szűrőpapírcsíkkal vékony folyadékréteget hoznak létre a fedőlemez és a tárgylemez között.Reológia.Hino és Yanagimachi [19] egér petefészek-tubalus-uterin komplexet helyeztek egy perfúziós gyűrűbe, és 1 µl tintát fecskendeztek az isthmusba, hogy láthatóvá tegyék a folyadékáramlást a petevezetékekben.Nagyon aktív összehúzódási és relaxációs mozgást észleltek a petevezetékben, amelyben az összes tintagolyó folyamatosan a petevezeték ampullája felé haladt.A szerzők hangsúlyozzák a petevezető folyadék áramlásának fontosságát az alsó petevezetékből a felső felé a spermiumok felszaporodásához és a megtermékenyítéshez.Brillard20 arról számolt be, hogy csirkékben és pulykákban a spermiumok aktív mozgással vándorolnak a hüvelybejárattól, ahol tárolják őket, a méh-hüvely csomópontig, ahol tárolják őket.Ez a mozgás azonban nem szükséges az uterovaginális csomópont és az infundibulum között, mivel a spermiumok passzív elmozdulással szállítódnak.Ezen korábbi ajánlások és a jelen vizsgálat során kapott eredmények ismeretében feltételezhető, hogy a spermiumok felfelé irányuló mozgási képessége (reológia) az egyik olyan tulajdonság, amelyen a szelekciós folyamat alapul.Ez határozza meg a spermiumok hüvelyen keresztüli áthaladását és tárolás céljából a CCT-be való bejutását.Amint azt Forman4 javasolta, ez azt a folyamatot is megkönnyítheti, hogy a spermiumok bizonyos ideig belépnek az SST-be és annak élőhelyére, majd kilépnek, amikor sebességük lassul.
Másrészt Matsuzaki és Sasanami 21 azt javasolta, hogy a madár spermiumai motilitási változásokon mennek keresztül a nyugalmi állapotból a motilitásba a hím és nőstény szaporodási traktusában.A spermiumok SST-ben a rezidens spermiumok mozgékonyságának gátlásával magyarázzák a spermiumok hosszú tárolási idejét, majd az SST elhagyása utáni megfiatalodást.Hipoxiás körülmények között Matsuzaki et al.1 magas laktáttermelésről és felszabadulásról számolt be az SST-ben, ami a spermiumok mobilitásának gátlásához vezethet.Ebben az esetben a spermiumok reológiájának jelentősége a spermiumok kiválasztásában és felszívódásában tükröződik, nem pedig a tárolásukban.
A spermiumok agglutinációs mintázata elfogadható magyarázatnak tekinthető a spermiumok hosszú tárolási idejére az SST-ben, mivel ez a baromfi sperma-visszatartásának gyakori mintája2,22,23.Bakst et al.2 megfigyelte, hogy a legtöbb spermium egymáshoz tapadt, fascicularis aggregátumokat képezve, és a fürj CCM-ben ritkán találtak egyetlen spermiumot.Másrészt Wen et al.24 több szórt spermiumot és kevesebb spermiumcsomót figyeltek meg csirkékben az SST lumenében.Ezen megfigyelések alapján feltételezhető, hogy a spermiumok agglutinációra való hajlama eltérő a madarak és az azonos ejakulátumban lévő spermiumok között.Ezenkívül Van Krey et al.9 azt sugallta, hogy az agglutinált spermiumok véletlenszerű disszociációja felelős a spermiumok fokozatos behatolásáért a petevezeték lumenébe.E hipotézis szerint az alacsonyabb agglutinációs képességű spermiumokat először ki kell üríteni az SST-ből.Ebben az összefüggésben a spermiumok agglutinációs képessége olyan tényező lehet, amely befolyásolja a piszkos madarak spermiumversenyének kimenetelét.Ezenkívül minél tovább disszociál az agglutinált spermium, annál tovább tart a termékenység.
Bár számos tanulmányban megfigyelték a spermiumok aggregációját és kötegekké történő aggregációját2, 22, 24, ezeket nem írták le részletesen az SST-n belüli kinematikai megfigyelésük összetettsége miatt.Számos kísérlet történt a spermium-agglutináció in vitro tanulmányozására.Kiterjedt, de átmeneti aggregáció volt megfigyelhető, amikor a vékony drótot eltávolították a lelógó magcseppről.Ez ahhoz a tényhez vezet, hogy a cseppből egy hosszúkás buborék nyúlik ki, imitálva a szemmirigyet.A 3D korlátok és a rövid csepegtető szárítási idők miatt az egész blokk gyorsan tönkrement9.A jelenlegi tanulmányban Sharkashi csirkék és mikrofluidikus chipek felhasználásával le tudtuk írni, hogyan alakulnak ki és hogyan mozognak ezek a csomók.A spermakötegek közvetlenül a spermagyűjtés után alakultak ki, és spirálisan mozogtak, és pozitív reológiát mutattak, ha jelen vannak az áramlásban.Ezen túlmenően, ha makroszkóposan nézzük, a spermiumkötegek növelik a mozgékonyság linearitását az izolált spermiumokhoz képest.Ez arra utal, hogy a spermiumok agglutinációja előfordulhat az SST behatolása előtt, és a spermiumtermelés nem korlátozódik egy kis területre a stressz miatt, ahogyan azt korábban javasolták (Tingari és Lake12).A csomóképződés során a spermiumok szinkronban úsznak, amíg csomópontot nem alkotnak, majd farkuk egymás köré fonódik, és a spermium feje szabad marad, de a spermium farka és disztális része ragadós anyaggal összetapad.Ezért a szalag szabad feje felelős a mozgásért, húzza a szalag többi részét.A spermiumkötegek pásztázó elektronmikroszkópos vizsgálata azt mutatta, hogy a rájuk tapadt spermiumfejek sok ragadós anyaggal borítottak, ami arra utal, hogy a spermiumfejek nyugvó kötegekben csatlakoztak, ami a tárolóhely (SST) elérése után következhetett be.
Ha a spermiumkenetet akridinnarancssárgával megfestik, a spermiumok körül fluoreszcens mikroszkóp alatt extracelluláris tapadóanyag látható.Ez az anyag lehetővé teszi a spermiumkötegek számára, hogy a környező felületekhez vagy részecskékhez tapadjanak, és hozzátapadjanak, így azok nem sodródnak a környező áramlással.Így megfigyeléseink a spermiumok adhézió szerepét mutatják mobil köteg formájában.Az a képességük, hogy az árammal szemben úsznak és a közeli felületekhez tapadnak, lehetővé teszi, hogy a spermiumok hosszabb ideig maradjanak az SST-ben.
A Rothschild25 hemocitometriás kamerát használt a szarvasmarhasperma lebegő eloszlásának tanulmányozására egy csepp szuszpenzióban, és mikrofényképeket készített a mikroszkóp függőleges és vízszintes optikai tengelyével rendelkező kamerán keresztül.Az eredmények azt mutatták, hogy a spermiumok vonzódtak a kamra felületéhez.A szerzők azt sugallják, hogy hidrodinamikai kölcsönhatások léphetnek fel a spermium és a felszín között.Figyelembe véve ezt, valamint a Sharkashi csirke spermájának azon képességét, hogy ragadós csomókat képezzenek, növelheti annak valószínűségét, hogy a sperma az SST falához tapad, és hosszú ideig tárolódik.
Bccetti és Afzeliu26 arról számoltak be, hogy a spermium glikokalix szükséges az ivarsejtek felismeréséhez és agglutinációjához.Forman10 megfigyelte, hogy a glikoprotein-glikolipid bevonatok α-glikozidos kötéseinek hidrolízise a madársperma neuraminidázzal történő kezelésével csökkent fertilitást eredményezett anélkül, hogy befolyásolta volna a spermiumok mozgékonyságát.A szerzők azt sugallják, hogy a neuraminidáz glikokalixre gyakorolt ​​hatása rontja a spermiumok megkötését a méh-hüvely találkozásánál, ezáltal csökkentve a termékenységet.Megfigyeléseik nem hagyhatják figyelmen kívül azt a lehetőséget, hogy a neuraminidáz kezelés csökkentheti a spermiumok és a petesejtek felismerését.Forman és Engel10 azt találta, hogy a termékenység csökkent, amikor a tyúkokat intravaginálisan termékenyítették neuraminidázzal kezelt spermával.A neuraminidázzal kezelt spermával végzett IVF azonban nem befolyásolta a termékenységet a kontroll csirkékhez képest.A szerzők arra a következtetésre jutottak, hogy a spermium membrán körüli glikoprotein-glikolipid bevonat változásai csökkentették a spermiumok megtermékenyítő képességét azáltal, hogy rontották a spermiumok megkötését a méh-hüvely találkozásánál, ami viszont növelte a spermiumveszteséget a méh-hüvely találkozási sebessége miatt, de nem befolyásolja a spermiumok és a tojás felismerését.
Pulykáknál Bakst és Bauchan 11 kis hólyagokat és membránfragmenseket talált az SST lumenében, és megfigyelte, hogy ezek közül néhány granulátum összeolvadt a spermiummembránnal.A szerzők azt sugallják, hogy ezek a kapcsolatok hozzájárulhatnak a spermiumok hosszú távú tárolásához az SST-ben.A kutatók azonban nem határozták meg ezeknek a részecskéknek a forrását, akár CCT-hámsejtek, akár a hím reproduktív rendszer által termelt és szekretált, vagy maga a spermium.Ezenkívül ezek a részecskék felelősek az agglutinációért.Grützner és munkatársai27 arról számoltak be, hogy az epididimális hámsejtek olyan specifikus fehérjét termelnek és választanak ki, amely az egypórusos ondópályák kialakulásához szükséges.A szerzők arról is beszámolnak, hogy ezeknek a kötegeknek a diszperziója függ az epididimális fehérjék kölcsönhatásától.Nixon és munkatársai28 azt találták, hogy az adnexa fehérjét, a savas ciszteinben gazdag oszteonektint választ ki;A SPARC részt vesz a rövidcsőrű echidnák és kacsacsőrű echidnák spermiumcsomóinak kialakításában.Ezeknek a nyaláboknak a szétszóródása e fehérje elvesztésével jár.
A jelenlegi tanulmányban az elektronmikroszkópos ultrastrukturális elemzés kimutatta, hogy a spermiumok nagy mennyiségű sűrű anyaghoz tapadtak.Úgy gondolják, hogy ezek az anyagok felelősek az agglutinációért, amely a tapadó fejek között és körül kondenzálódik, de alacsonyabb koncentrációban a farok régiójában.Feltételezzük, hogy ez az agglutináló anyag a hím reproduktív rendszerből (epididymis vagy vas deferens) a spermával együtt ürül ki, mivel gyakran megfigyeljük, hogy az ejakuláció során a sperma elválik a nyirok- és ondóplazmától.Beszámoltak arról, hogy amint a madár spermiumai áthaladnak a mellékherén és a vas deferensen, az éréssel összefüggő változásokon mennek keresztül, amelyek támogatják a fehérjékhez való kötőképességüket és a plazma lemmához kapcsolódó glikoproteinek megszerzését.Ezeknek a fehérjéknek a perzisztenciája az SST rezidens spermiummembránjain arra utal, hogy ezek a fehérjék befolyásolhatják a spermiummembrán stabilitásának megszerzését 30 és meghatározhatják termékenységüket 31 .Ahammad és munkatársai32 arról számoltak be, hogy a hím reproduktív rendszer különböző részeiről (a heréktől a disztális vas deferensekig) nyert spermiumok életképessége fokozatosan nőtt folyékony tárolási körülmények között, függetlenül a tárolási hőmérséklettől, és csirkék életképessége a mesterséges megtermékenyítést követően a petevezetékben is nő.
A Sharkashi csirke spermiumkötegei eltérő tulajdonságokkal és funkciókkal rendelkeznek, mint más fajok, például echidnák, kacsacsőrűek, erdei egerek, szarvas patkányok és tengerimalacok.A sharkasi csirkékben a spermiumkötegek kialakulása csökkentette az úszás sebességét az egyedi spermiumokhoz képest.Ezek a kötegek azonban növelték a reológiailag pozitív spermiumok százalékos arányát, és növelték a spermiumok azon képességét, hogy stabilizálódjanak egy dinamikus környezetben.Eredményeink tehát megerősítik azt a korábbi feltételezést, hogy az SST-ben a spermium-agglutináció a hosszú távú spermiumtárolással jár.Azt is feltételezzük, hogy a spermiumok kötegképződésére való hajlama szabályozhatja a spermiumveszteség mértékét SST-ben, ami megváltoztathatja a spermiumok versengésének kimenetelét.E feltevés szerint az alacsony agglutinációs kapacitású spermiumok bocsátják ki először az SST-t, míg a nagy agglutinációs kapacitású spermiumok az utódok nagy részét.Az egypórusos spermiumkötegek kialakulása előnyös, és befolyásolja a szülő-gyermek arányt, de más mechanizmust alkalmaz.Az echidnákban és a kacsacsőrűekben a spermiumok egymással párhuzamosan helyezkednek el, hogy növeljék a sugár előrehaladási sebességét.Az echidnák kötegei körülbelül háromszor gyorsabban mozognak, mint az egyes spermiumok.Úgy gondolják, hogy az ilyen spermiumcsomók kialakulása echidnákban evolúciós alkalmazkodás a dominancia fenntartásához, mivel a nőstények szerények, és általában több hímmel párosodnak.Ezért a különböző ejakulátumokból származó spermiumok hevesen versengenek a tojás megtermékenyítéséért.
A sharkasi csirkék agglutinált spermiumai könnyen láthatóvá válnak fáziskontraszt mikroszkóppal, amelyet azért tartanak előnyösnek, mert lehetővé teszi a spermiumok viselkedésének in vitro könnyű tanulmányozását.Az a mechanizmus, amellyel a hímivarsejtcsomók kialakulása elősegíti a szaporodást a cápasi csirkékben, szintén eltér attól, amelyet néhány méhlepényes emlősnél tapasztaltak, amelyek kooperatív spermium viselkedést képviselnek, például az erdei egereknél, ahol egyes spermiumok elérik a petéket, segítve más rokon egyedeknek, hogy elérjék és károsítsák tojásaikat.hogy bizonyítsd magad.altruista viselkedés.Önmegtermékenyítés 34. A spermiumok kooperatív viselkedésének másik példáját szarvas egereknél találtuk, ahol a spermiumok képesek voltak azonosítani és kombinálni a genetikailag leginkább rokon spermiumokat, és együttműködő csoportokat alkotni, hogy növeljék sebességüket a nem rokon spermiumokhoz képest35.
A tanulmányban kapott eredmények nem mondanak ellent Foman elméletének a spermiumok hosszú távú tárolásáról SWS-ben.A kutatók arról számoltak be, hogy a hímivarsejtek hosszabb ideig mozognak az SST-t bélelő hámsejtek áramlásában, majd egy bizonyos idő elteltével a hímivarsejtek energiaraktárai kimerülnek, ami a sebesség csökkenését eredményezi, ami lehetővé teszi a kis molekulatömegű anyagok kilökődését.spermiumok energiája a folyadékáramlással az SST lumenéből A petevezeték ürege.A jelenlegi tanulmányban azt figyeltük meg, hogy az egyetlen spermium fele képes úszni az áramló folyadékokkal szemben, és a kötegben való tapadásuk növelte a pozitív reológiát mutató képességüket.Ezenkívül adataink összhangban vannak Matsuzaki és munkatársai adataival.1, akik arról számoltak be, hogy az SST-ben megnövekedett laktátszekréció gátolhatja a rezidens spermiumok mozgékonyságát.Eredményeink azonban leírják a spermiumok mozgékony szalagjainak kialakulását és reológiai viselkedését egy mikrocsatornán belüli dinamikus környezet jelenlétében, hogy megkíséreljék tisztázni viselkedésüket SST-ben.A jövőbeli kutatások az agglutináló szer kémiai összetételének és eredetének meghatározására összpontosíthatnak, ami kétségtelenül segíti a kutatókat abban, hogy új módszereket dolgozzanak ki a folyékony sperma tárolására és a termékenység időtartamának növelésére.
Tizenöt 30 hetes csupasznyakú hím cápát (homozigóta domináns; Na Na) választottak spermadonornak a vizsgálatba.A madarakat az egyiptomi Ashit kormányzóság Ashit Egyetem Mezőgazdasági Karának Kutató baromfitelepén nevelték fel.A madarakat külön ketrecekben (30 x 40 x 40 cm) helyezték el, fényprogramnak vetették alá (16 óra fény és 8 óra sötétség), és 160 g nyersfehérjét, 2800 kcal metabolizálható energiát és 35 g kalciumot tartalmazó takarmányt kaptak.5 gramm elérhető foszfor kilogrammonként diéta.
A 36, 37-es adatok szerint hímektől hasmasszázzsal gyűjtötték be a spermát.Összesen 45 spermamintát gyűjtöttek 15 férfitól 3 napon keresztül.A spermát (n = 15/nap) azonnal 1:1 (v:v) arányban hígítottuk Belsville Poultry Semen Diluent-tel, amely kálium-difoszfátot (1,27 g), mononátrium-glutamát-monohidrátot (0,867 g), fruktózt (0,5 d) vízmentes nátriumot tartalmaz.acetát (0,43 g), trisz(hidroxi-metil)-amino-metán (0,195 g), kálium-citrát-monohidrát (0,064 g), kálium-monofoszfát (0,065 g), magnézium-klorid (0,034 g) és H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolarity 3 33-330 mm.A hígított spermamintákat először fénymikroszkóp alatt megvizsgáltuk, hogy biztosítsuk a sperma jó minőségét (nedvesség), majd 37°C-os vízfürdőben tároltuk a gyűjtést követő fél órán belüli felhasználásig.
A spermiumok kinematikáját és reológiáját mikrofluidikus eszközök rendszerével írják le.A spermamintákat tovább hígítottuk 1:40 arányban Beltsville Avian Semen Diluentben, mikrofluidikus eszközbe töltöttük (lásd alább), és a kinetikai paramétereket a mikrofluidika jellemzésére korábban kifejlesztett Computerized Semen Analysis (CASA) rendszer segítségével határoztuk meg.a spermiumok mobilitásáról folyékony tápközegben (Gépészmérnöki Tanszék, Műszaki Kar, Assiut Egyetem, Egyiptom).A beépülő modul letölthető a következő címről: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.A görbesebességet (VCL, μm/s), a lineáris sebességet (VSL, μm/s) és az átlagos pályasebességet (VAP, μm/s) mértük.A spermiumokról készült videókat fordított Optika XDS-3 fáziskontraszt mikroszkóppal (40x objektívvel) Tucson ISH1000 kamerához csatlakoztatva 30 képkocka/mp sebességgel, 3 másodpercig készítettük.Használja a CASA szoftvert legalább három terület és 500 spermatrajektória vizsgálatához mintánként.A rögzített videó feldolgozása házi készítésű CASA segítségével történt.A motilitás meghatározása a CASA beépülő modulban a spermium úszási sebességén alapul az áramlási sebességhez képest, és nem tartalmaz más paramétereket, például az oldalirányú mozgást, mivel ezt megbízhatóbbnak találták a folyadékáramlásban.A reológiai mozgást úgy írják le, mint a hímivarsejtek mozgását a folyadékáramlás irányával szemben.A reológiai tulajdonságokkal rendelkező spermiumokat elosztottuk a mozgékony spermiumok számával;a nyugalomban lévő és konvektíven mozgó spermiumokat kizártuk a számlálásból.
Minden felhasznált vegyszert az Elgomhoria Pharmaceuticals-tól (Kairó, Egyiptom) szereztünk be, hacsak másként nem jelezzük.Az eszközt az El-sherry és munkatársai által leírtak szerint gyártották.40 némi módosítással.A mikrocsatornák gyártásához üveglemezeket (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negatív reziszt (MicroChem, Newton, CA), diaceton-alkoholt (Sigma Aldrich, Steinheim, Németország) és poliacetont használtak.-184, Dow Corning, Midland, Michigan).A mikrocsatornákat lágy litográfia segítségével állítják elő.Először egy átlátszó védőmaszkot nyomtattak a kívánt mikrocsatornás kialakítással egy nagy felbontású nyomtatóra (Prismatic, Kairó, Egyiptom és Pacific Arts and Design, Markham, ON).A mesterek üveglapok felhasználásával készültek hordozóként.A lemezeket acetonban, izopropanolban és ionmentesített vízben tisztítottuk, majd centrifugálással (3000 ford./perc, 1 perc) 20 µm-es SU8-25 réteggel vontuk be.Az SU-8 rétegeket ezután óvatosan szárítottuk (65 °C, 2 perc és 95 °C, 10 perc), és 50 másodpercig UV-sugárzásnak tették ki.Az expozíció után sütjük 65 °C-on és 95 °C-on 1 percig és 4 percig, hogy a szabaddá vált SU-8 rétegek térhálósodjanak, majd előhívás diaceton-alkoholban 6,5 percig.A gofrit keményre sütjük (200°C-on 15 percig), hogy tovább szilárduljon az SU-8 réteg.
A PDMS-t úgy állítottuk elő, hogy a monomert és a keményítőt 10:1 tömegarányban összekevertük, majd vákuum-exszikkátorban gáztalanítottuk és az SU-8 főkeretére öntöttük.A PDMS-t kemencében (120 °C, 30 perc) kikeményítettük, majd a csatornákat kivágtuk, elválasztottuk a mestertől, és perforáltuk, hogy lehetővé tegyük a csövek csatlakoztatását a mikrocsatorna be- és kimenetéhez.Végül a PDMS mikrocsatornákat tartósan a mikroszkóp tárgylemezeire erősítették egy hordozható koronaprocesszor (Electro-Technic Products, Chicago, IL) segítségével, amint azt máshol leírtuk.A vizsgálatban használt mikrocsatorna mérete 200 µm × 20 µm (Sz × Ma) és 3,6 cm hosszú.
A mikrocsatornán belüli hidrosztatikus nyomás által kiváltott folyadékáramlást úgy érjük el, hogy a folyadékszintet a bemeneti tartályban a kimeneti tartály Δh39 magasságkülönbsége felett tartjuk (1. ábra).
ahol f a súrlódási együttható, f = C/Re a téglalap alakú csatorna lamináris áramlására, ahol C a csatorna oldalarányától függő állandó, L a mikrocsatorna hossza, Vav a mikrocsatornán belüli átlagos sebesség, Dh a csatorna hidraulikus átmérője, g – a gravitációs gyorsulás.Ezzel az egyenlettel az átlagos csatornasebesség kiszámítható a következő egyenlettel: