Köszönjük, hogy felkereste a Nature.com weboldalt. Ön korlátozott CSS-támogatású böngészőverziót használ. A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy frissítse böngészőjét (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Ezenkívül a folyamatos támogatás biztosítása érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
Nemrégiben kifejlesztettek egy mesterséges víz nanostruktúrákat (EWNS) használó, nanotechnológián alapuló, vegyszermentes antimikrobiális platformot. Az EWNS-ek nagy felületi töltéssel rendelkeznek, és gazdagok reaktív oxigénfajtákban (ROS), amelyek számos mikroorganizmussal, köztük az élelmiszer eredetű kórokozókkal kölcsönhatásba léphetnek és inaktiválhatják azokat. Itt bemutatjuk, hogy tulajdonságaik a szintézis során finomhangolhatók és optimalizálhatók antibakteriális potenciáljuk további fokozása érdekében. Az EWNS laboratóriumi platformját az EWNS tulajdonságainak finomhangolására tervezték a szintézisparaméterek változtatásával. Az EWNS tulajdonságainak (töltés, méret és ROS-tartalom) jellemzését modern analitikai módszerekkel végezték. Ezenkívül élelmiszer-mikroorganizmusokat, például Escherichia colit, Salmonella entericát, Listeria innocuát, Mycobacterium para fortitum-ot és Saccharomyces cerevisiae-t oltottak be bio szőlőparadicsom felületére, hogy kiértékeljék mikrobiális inaktivációs potenciáljukat. Az itt bemutatott eredmények azt mutatják, hogy az EWNS tulajdonságai finomhangolhatók a szintézis során, ami az inaktivációs hatékonyság exponenciális növekedését eredményezi. Különösen a felületi töltés négyszeresére nőtt, és a ROS-tartalom is megnőtt. A mikrobiális eltávolítási sebesség mikrobiálisan függött, és 40 000 #/cm3 EWNS aeroszoldózis 45 perces expozíciója után 1,0 és 3,8 log között mozgott.
A kórokozók vagy azok toxinjainak lenyelése által okozott élelmiszer eredetű betegségek fő oka a mikrobiális szennyezés. Az élelmiszer eredetű betegségek évente körülbelül 76 millió megbetegedést, 325 000 kórházi kezelést és 5000 halálesetet okoznak csak az Egyesült Államokban1. Ezenkívül az Egyesült Államok Mezőgazdasági Minisztériuma (USDA) becslései szerint a friss termékek fokozott fogyasztása felelős az Egyesült Államokban jelentett összes élelmiszer eredetű betegség 48 százalékáért2. Az élelmiszer eredetű kórokozók okozta betegségek és halálesetek költsége az Egyesült Államokban nagyon magas, a Betegségellenőrzési és Megelőzési Központok (CDC) becslése szerint több mint 15,6 milliárd USD évente3.
Jelenleg az élelmiszer-biztonság garantálását célzó kémiai4, sugárzásos5 és termikus6 antimikrobiális beavatkozásokat főként a termelési lánc korlátozott kritikus ellenőrzési pontjain (CCP-ken) alkalmazzák (általában betakarítás után és/vagy a csomagolás során), ahelyett, hogy folyamatosan alkalmaznák őket oly módon, hogy a friss termékek keresztszennyeződésnek legyenek kitéve7. Az antimikrobiális beavatkozásokra szükség van az élelmiszer eredetű betegségek és az élelmiszer-romlás jobb ellenőrzéséhez, és lehetőség van arra, hogy a gazdaságtól az asztalig tartó folyamatban alkalmazhatók legyenek. Kisebb hatás és költség.
Nemrégiben kifejlesztettek egy nanotechnológián alapuló, vegyszermentes antimikrobiális platformot a felületeken és a levegőben lévő baktériumok inaktiválására mesterséges víz nanostruktúrák (EWNS) segítségével. Az EVNS szintéziséhez két párhuzamos eljárást alkalmaztak: elektroporlasztást és vízionizációt (1a. ábra). Az EWNS-ekről korábban kimutatták, hogy egyedi fizikai és biológiai tulajdonságokkal rendelkeznek8,9,10. Az EWNS átlagosan 10 elektronnal rendelkezik szerkezetenként, és átlagos nanométeres mérete 25 nm (1b.,c. ábra)8,9,10. Ezenkívül az elektronspin-rezonancia (ESR) kimutatta, hogy az EWNS nagy mennyiségű reaktív oxigénfajtát (ROS) tartalmaz, főként hidroxil- (OH•) és szuperoxid (O2-) gyököket (1c. ábra)8. Az EWNS hosszú ideig a levegőben maradt, és ütközhetett a levegőben lebegő és a felületeken jelen lévő mikrobákkal, leadva ROS-hasznosanyagukat és mikrobiális inaktivációt okozva (1d. ábra). Ezek a korábbi tanulmányok azt is kimutatták, hogy az EWNS kölcsönhatásba léphet és inaktiválhatja a közegészségügyi szempontból fontos különféle Gram-negatív és Gram-pozitív baktériumokat, beleértve a mikobaktériumokat is, felületeken és a levegőben8,9. A transzmissziós elektronmikroszkópia kimutatta, hogy az inaktivációt a sejtmembrán károsodása okozta. Ezenkívül az akut inhalációs vizsgálatok kimutatták, hogy az EWNS nagy dózisai nem okoznak tüdőkárosodást vagy gyulladást8.
(a) Az elektrosztatikus porlasztás akkor történik, amikor nagyfeszültséget alkalmaznak egy folyadékot tartalmazó kapilláris és egy ellenelektróda között. (b) A nagyfeszültség alkalmazása két különböző jelenséget eredményez: (i) a víz elektrosztatikus porlasztását és (ii) reaktív oxigénfajták (ionok) keletkezését, amelyek az EWNS-ben csapdába esnek. (c) Az EWNS-ek egyedi szerkezete. (d) Az EWNS-ek nanoskálájú jellegük miatt rendkívül mozgékonyak, és kölcsönhatásba léphetnek a levegőben lévő kórokozókkal.
Az EWNS antimikrobiális platform azon képességét, hogy inaktiválja az élelmiszerekben élő mikroorganizmusokat a friss élelmiszerek felületén, a közelmúltban szintén kimutatták. Azt is kimutatták, hogy az EWNS felületi töltése elektromos mezővel kombinálva célzott célba juttatható. Ennél is fontosabb, hogy az EWNS körülbelül 50 000#/cm311 koncentrációjú EWNS-nek való kitettség 90 percén belül ígéretes kezdeti eredményként körülbelül 1,4 log-os csökkenést mutatott a szerves paradicsom aktivitásában a különböző élelmiszer-mikroorganizmusok, például az E. coli és a Listeria ellen. Ezenkívül az előzetes érzékszervi értékelési tesztek nem mutattak érzékszervi hatást a kontroll paradicsomhoz képest. Bár ezek a kezdeti inaktivációs eredmények még nagyon alacsony, 50 000#/cc EWNS-dózisok mellett is élelmiszerbiztonságot ígérnek, egyértelmű, hogy a magasabb inaktivációs potenciál előnyösebb lenne a fertőzés és a romlás kockázatának további csökkentése érdekében.
Kutatásunkat itt egy EWNS generációs platform fejlesztésére fogjuk összpontosítani, hogy finomhangoljuk a szintézis paramétereit és optimalizáljuk az EWNS fizikai-kémiai tulajdonságait antibakteriális potenciáljuk fokozása érdekében. Az optimalizálás különösen a felületi töltésűek (a célzott célba jutás javítása) és a ROS-tartalom (az inaktivációs hatékonyság javítása) növelésére összpontosított. Az optimalizált fizikai-kémiai tulajdonságok (méret, töltés és ROS-tartalom) jellemzésére modern analitikai módszerek és gyakori élelmiszer-mikroorganizmusok, például E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae és M. parafortuitum felhasználásával kerül sor.
Az EVNS-t nagy tisztaságú víz (18 MΩ cm–1) egyidejű elektroporlasztásával és ionizációjával szintetizálták. Az elektromos porlasztót 12 jellemzően folyadékok, valamint szabályozott méretű szintetikus polimer és kerámia részecskék 13 és szálak 14 porlasztására használják.
Amint azt a korábbi publikációkban (8, 9, 10, 11) részletesen ismertettük, egy tipikus kísérletben nagyfeszültséget kapcsolnak egy fémkapilláris és egy földelt ellenelektróda közé. E folyamat során két különböző jelenség játszódik le: 1) elektrosztatikus porlasztás és 2) a víz ionizációja. A két elektróda közötti erős elektromos mező negatív töltések felhalmozódását okozza a kondenzált víz felületén, ami Taylor-kúpok kialakulásához vezet. Ennek eredményeként erősen töltött vízcseppek keletkeznek, amelyek a Rayleigh-elmélet16 szerint tovább esnek szét kisebb részecskékre. Ugyanakkor az erős elektromos mező a vízmolekulák egy részét felhasítja és elektronokat veszít (ionizáció), ezáltal nagy mennyiségű reaktív oxigénfajt (ROS)17 generálva. Az egyidejűleg generált ROS18 csomagokat EWNS-be kapszulázták (1c. ábra).
A 2a. ábra az ebben a vizsgálatban kifejlesztett és az EWNS szintézisben használt EWNS generáló rendszert mutatja. Egy zárt palackban tárolt tisztított vizet egy teflon csövön (2 mm belső átmérőjű) keresztül egy 30G-os rozsdamentes acél tűbe (fém kapilláris) vezettek. Amint a 2b. ábrán látható, a víz áramlását a palackban lévő légnyomás szabályozza. A tű egy teflon konzolhoz van rögzítve, amely manuálisan beállítható bizonyos távolságra az ellenelektródától. Az ellenelektróda egy polírozott alumínium korong, amelynek közepén egy lyuk van a mintavételhez. Az ellenelektróda alatt egy alumínium mintavevő tölcsér található, amely egy mintavételi nyíláson keresztül csatlakozik a kísérleti berendezés többi részéhez (2b. ábra). Minden mintavevő alkatrész elektromosan földelt, hogy elkerülje a töltés felhalmozódását, amely ronthatná a részecskemintavételt.
(a) Mesterséges Víz Nanoszerkezet Generáló Rendszer (EWNS). (b) A mintavevő és az elektroszóró egység keresztmetszete, amelyen a legfontosabb paraméterek láthatók. (c) Kísérleti beállítás baktériumok inaktiválására.
A fent leírt EWNS generáló rendszer képes a kulcsfontosságú működési paraméterek megváltoztatására az EWNS tulajdonságainak finomhangolásának megkönnyítése érdekében. Az alkalmazott feszültség (V), a tű és az ellenelektróda közötti távolság (L), valamint a kapillárison átfolyó víz áramlási sebességének (φ) beállításával finomhangolhatók az EWNS jellemzői. A [V (kV), L (cm)] szimbólumok a különböző kombinációk jelölésére szolgálnak. A víz áramlási sebességét úgy kell beállítani, hogy egy bizonyos [V, L] halmazú stabil Taylor-kúpot kapjunk. A vizsgálat céljából az ellenelektróda (D) nyílását 0,5 hüvelykre (1,29 cm) állították be.
A korlátozott geometria és aszimmetria miatt az elektromos térerősség nem számítható ki az elsődleges elvek alapján. Ehelyett a QuickField™ szoftvert (Svendborg, Dánia)19 használtuk az elektromos tér kiszámításához. Az elektromos tér nem egyenletes, ezért a kapilláris csúcsán lévő elektromos tér értékét használtuk referenciaértékként a különböző konfigurációkhoz.
A vizsgálat során a feszültség és a tű, valamint az ellenelektróda közötti távolság számos kombinációját értékelték a Taylor-kúp kialakulása, a Taylor-kúp stabilitása, az EWNS-termelés stabilitása és a reprodukálhatóság szempontjából. A különböző kombinációkat az S1. kiegészítő táblázat mutatja.
Az EWNS generáló rendszer kimenetét közvetlenül egy Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS, 3936-os modell, TSI, Shoreview, Minnesota) készülékhez csatlakoztattuk a részecskeszám-koncentráció mérésére, és egy Faraday aeroszol elektrométerrel (TSI, 3068B-es modell, Shoreview, USA) együtt használtuk az aeroszol áramlásának mérésére, a korábbi publikációnkban9 leírtak szerint. Mind az SMPS, mind az aeroszol elektrométer 0,5 l/perc áramlási sebességgel vett mintát (teljes mintaáramlás 1 l/perc). A részecskekoncentrációkat és az aeroszol fluxusokat 120 másodpercig mértük. A mérést 30-szor ismételjük meg. A teljes aeroszol töltetet az árammérésekből számítjuk ki, az átlagos EWNS töltetet pedig a mintában vett EWNS-részecskék teljes számából becsüljük meg. Az EWNS átlagos költsége az (1) egyenlettel számítható ki:
ahol IEl a mért áramerősség, NSMPS az SMPS-sel mért számkoncentráció, φEl pedig az elektrométerhez áramló áramlási sebesség.
Mivel a relatív páratartalom (RH) befolyásolja a felületi töltést, a kísérlet során a hőmérsékletet és a (RH) értéket állandó értéken tartottuk 21°C-on, illetve 45%-on.
Az EWNS méretének és élettartamának mérésére atomerő-mikroszkópiát (AFM), Asylum MFP-3D-t (Asylum Research, Santa Barbara, Kalifornia) és AC260T szondát (Olympus, Tokió, Japán) használtak. Az AFM pásztázási frekvencia 1 Hz, a pásztázási terület 5 µm × 5 µm, 256 pásztázási vonallal. Minden képet elsőrendű képillesztésnek vetettek alá az Asylum szoftver segítségével (maszk 100 nm-es tartományban és 100 pm küszöbértékkel).
Távolítsa el a mintavevő tölcsért, és helyezze a csillámfelületet 2,0 cm távolságra az ellenelektródától átlagosan 120 másodpercig, hogy elkerülje a részecskék koaleszcenciáját és a szabálytalan cseppek képződését a csillámfelületen. Az EWNS-t közvetlenül frissen vágott csillámfelületekre vitte fel (Ted Pella, Redding, CA). A porlasztás után azonnal a csillámfelületet AFM-mel vizualizálta. A frissen vágott, módosítatlan csillám felületi érintkezési szöge közel 0°, így az EWNS kupola alakban terjed a csillámfelületen20. A diffundáló cseppek átmérőjét (a) és magasságát (h) közvetlenül az AFM topográfiából mérte, és a korábban validált módszerünkkel8 kiszámította az EWNS kupola alakú diffúziós térfogatát. Feltételezve, hogy a fedélzeti EVNS térfogata megegyezik, az ekvivalens átmérő a (2) egyenletből számítható ki:
A korábban kidolgozott módszerünkkel összhangban elektronspin-rezonancia (ESR) spincsapdát alkalmaztunk a rövid élettartamú gyökös intermedierek jelenlétének kimutatására az EWNS-ben. Az aeroszolokat 235 mM DEPMPO (5-(dietoxi-foszforil)-5-metil-1-pirrolin-N-oxid) (Oxis International Inc., Portland, Oregon) oldaton vezettük át. Minden EPR mérést Bruker EMX spektrométerrel (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) és síkcellás elrendezésekkel végeztünk. Az adatok gyűjtésére és elemzésére az Acquisit szoftvert (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) használtuk. A ROS jellemzését csak egy sor üzemi körülmény mellett [-6,5 kV, 4,0 cm] végeztük. Az EWNS koncentrációkat SMPS-sel mértük, figyelembe véve az EWNS veszteségét az impaktorban.
Az ózonszintet egy 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Colorado) készülékkel monitorozták8,9,10.
Minden EWNS tulajdonság esetében a mérési érték a mérések átlaga, a mérési hiba pedig a szórás. T-próbát végeztünk az optimalizált EWNS attribútum értékének az alap EWNS megfelelő értékével való összehasonlítására.
A 2c. ábra egy korábban kifejlesztett és jellemzett elektrosztatikus csapadékáteresztő rendszert (EPES) mutat be, amely az EWNS11 felületekre történő célzására használható. Az EPES egy EWNS töltést és egy erős elektromos mezőt használ, hogy közvetlenül a célpont felületére „irányítson”. Az EPES rendszer részleteit Pyrgiotakis és munkatársai11 nemrégiben publikálták. Az EPES tehát egy 3D nyomtatott PVC kamrából áll, amelynek kúpos végei két párhuzamos rozsdamentes acél (304 rozsdamentes acél, tükörpolírozott) fémlapot tartalmaznak, amelyek középen 15,24 cm távolságra vannak egymástól. A lapokat egy külső nagyfeszültségű forráshoz (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY) csatlakoztatták, az alsó lap mindig pozitív, a felső lap pedig mindig földelt (lebegő) volt. A kamra falait alumíniumfóliával borították, amely elektromosan földelt a részecskeveszteség megakadályozása érdekében. A kamra egy lezárt elülső betöltőajtóval rendelkezik, amely lehetővé teszi a tesztfelületek műanyag állványokra helyezését, felemelve azokat az alsó fémlemezről, hogy elkerüljék a nagyfeszültségű interferenciát.
Az EWNS lerakódási hatékonyságát az EPES-ben egy korábban kidolgozott, az S111. kiegészítő ábrán részletezett protokoll szerint számítottuk ki.
Vezérlőkamraként a hengeres kamrán áthaladó második áramlás sorba van kötve az EPES rendszerrel egy közbenső HEPA szűrő segítségével az EWNS eltávolítására. Amint a 2c. ábrán látható, az EWNS aeroszolt két sorba kapcsolt kamrán keresztül pumpálták. A vezérlőhelyiség és az EPES közötti szűrő eltávolítja a maradék EWNS-t, ami azonos hőmérsékletet (T), relatív páratartalmat (RH) és ózonszintet eredményez.
Fontos, élelmiszer eredetű mikroorganizmusokról találtak friss termékeket szennyező anyagokat, mint például az Escherichia coli (ATCC #27325), egy széklet indikátor, a Salmonella enterica (ATCC #53647), egy élelmiszer eredetű kórokozó, és a Listeria innocua (ATCC #33090), a patogén Listeria monocytogenes alternatívája. A romlást okozó élesztő alternatívájaként használt Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), valamint a rezisztensebb élő baktériumként ismert Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) az ATCC-től (Manassas, Virginia) vásárolták.
Véletlenszerűen vásárolj bio koktélparadicsomokat a helyi piacon, és felhasználásig (legfeljebb 3 napig) tedd hűtőbe 4°C-ra. Válassz ki egy méretű, körülbelül 1,5 cm átmérőjű paradicsomokat a kísérletezéshez.
Az inkubáció, beoltás, expozíció és telepszámlálás protokolljait korábbi publikációinkban részletesen ismertettük, és a 11. kiegészítő adatokban részletesen ismertettük. Az EWNS teljesítményét úgy értékeltük, hogy a beoltott paradicsomokat 40 000 #/cm3 koncentrációnak tették ki 45 percig. Röviden, a t = 0 perc időpontban három paradicsomot használtunk a túlélő mikroorganizmusok értékelésére. Három paradicsomot EPES-be helyeztünk, és 40 000 #/cm3 koncentrációjú EWNS-nek tették ki őket (EWNS-nek kitett paradicsomok), a másik hármat pedig a kontrollkamrába helyeztük (kontroll paradicsomok). Egyik paradicsomcsoportot sem tettük ki további feldolgozásnak. Az EWNS-nek kitett paradicsomokat és a kontrollokat 45 perc elteltével eltávolítottuk az EWNS hatásának értékelése céljából.
Minden kísérletet háromszor végeztünk. Az adatelemzést a Kiegészítő Adatokban leírt protokoll szerint végeztük.
Az EWNS-nek (45 perc, EWNS aeroszol koncentráció 40 000 #/cm3) kitett és nem kezelt E. coli, Enterobacter és L. innocua baktérium mintákat pelletáltuk az inaktivációs mechanizmusok vizsgálata érdekében. A csapadékot 2 órán át szobahőmérsékleten fixáltuk 0,1 M nátrium-kakodilát oldatban (pH 7,4), 2,5% glutaraldehid, 1,25% paraformaldehid és 0,03% pikrinsav fixálószerrel. Mosás után 1% ozmium-tetroxid (OsO4)/1,5% kálium-ferrocianid (KFeCN6) oldattal fixáltuk 2 órán át, háromszor mostuk vízzel, és 1 órán át 1% uranil-acetátban inkubáltuk, majd kétszer mostuk vízzel. Ezt követően 10 percig dehidratáltuk 50%, 70%, 90% és 100% alkoholban. A mintákat ezután 1 órára propilén-oxidba helyeztük, majd propilén-oxid és TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA) 1:1 arányú keverékével impregnáltuk. A mintákat TAAB Eponba ágyaztuk, és 60°C-on 48 órán át polimerizáltuk. A kikeményedett granuláris gyantát TEM-mel vágtuk fel és vizualizáltuk egy JEOL 1200EX (JEOL, Tokió, Japán) készülékkel, amely egy hagyományos transzmissziós elektronmikroszkóp, és AMT 2k CCD kamerával (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, USA) volt felszerelve.
Minden kísérletet háromszor végeztünk. Minden időponthoz háromszor szélesztettük a baktériummosó oldatokat, így pontonként összesen kilenc adatpontot kaptunk, amelyek átlagát használtuk az adott organizmus baktériumkoncentrációjaként. A szórást használtuk mérési hibaként. Minden pont számít.
A baktériumok koncentrációjának t = 0 perchez viszonyított csökkenésének logaritmusát a következő képlettel számítottuk ki:
ahol C0 a kontrollminta baktériumkoncentrációja a 0. időpontban (azaz miután a felület megszáradt, de még a kamrába helyezése előtt), Cn pedig a baktériumok koncentrációja a felületen n perc expozíció után.
A baktériumok természetes lebomlásának figyelembevételével a 45 perces expozíciós időszak alatt a log-csökkenést a kontrollhoz képest 45 perc elteltével is kiszámították az alábbiak szerint:
Ahol Cn a kontrollmintában lévő baktériumok koncentrációja n időpontban, a Cn-Control pedig a kontrollbaktériumok koncentrációja n időpontban. Az adatokat a kontrollhoz (EWNS-expozíció nélkül) képest logaritmikus csökkenésként adjuk meg.
A vizsgálat során a tű és az ellenelektróda közötti feszültség és távolság számos kombinációját értékelték a Taylor-kúp kialakulása, a Taylor-kúp stabilitása, az EWNS-termelés stabilitása és a reprodukálhatóság szempontjából. A különböző kombinációkat az S1. kiegészítő táblázat mutatja be. Két esetet választottak ki egy teljes vizsgálathoz, amelyek stabil és reprodukálható tulajdonságokat mutattak (Taylor-kúp, EWNS-termelés és stabilitás az idő múlásával). A 3. ábra két eset ROS-töltésére, méretére és tartalmára vonatkozó eredményeket mutat. Az eredményeket az 1. táblázat is összefoglalja. Referenciaként a 3. ábra és az 1. táblázat tartalmazza a korábban szintetizált, nem optimalizált EWNS8, 9, 10, 11 (alap-EWNS) tulajdonságait. A kétoldalú t-próbával végzett statisztikai szignifikancia-számításokat az S2. kiegészítő táblázatban közöljük újra. Ezenkívül további adatok is tartalmaznak az ellenelektróda mintavételi furatátmérőjének (D) és a földelektróda és a tű hegye közötti távolságnak (L) a hatását vizsgáló tanulmányokat (S2. és S3. kiegészítő ábrák).
(a–c) AFM méreteloszlás. (d–f) Felületi töltés karakterisztikája. (g) ROS és ESR jellemzése.
Fontos megjegyezni azt is, hogy a fenti körülmények mindegyike mellett a mért ionizációs áramok 2-6 µA tartományban, a feszültségek pedig -3,8 és -6,5 kV között voltak, aminek eredményeként az egyterminális EWNS generációs modul energiafogyasztása kevesebb, mint 50 mW volt. Bár az EWNS-t nagy nyomás alatt szintetizálták, az ózonszint nagyon alacsony volt, soha nem haladta meg a 60 ppb-t.
Az S4. kiegészítő ábra a [-6,5 kV, 4,0 cm] és [-3,8 kV, 0,5 cm] forgatókönyvek szimulált elektromos mezőit mutatja. A [-6,5 kV, 4,0 cm] és [-3,8 kV, 0,5 cm] forgatókönyvek szerinti mezőket 2 × 10⁶ V/m, illetve 4,7 × 10⁶ V/m-nek számítottuk. Ez várható is, mivel a feszültség és a távolság aránya a második esetben sokkal nagyobb.
A 3a, 3b ábra az AFM8-cal mért EWNS átmérőt mutatja. A [-6,5 kV, 4,0 cm] és [-3,8 kV, 0,5 cm] forgatókönyvek átlagos EWNS átmérőit rendre 27 nm-nek, illetve 19 nm-nek számították. A [-6,5 kV, 4,0 cm] és [-3,8 kV, 0,5 cm] esetek eloszlásának geometriai szórása 1,41, illetve 1,45, ami szűk méreteloszlásra utal. Mind az átlagos méret, mind a geometriai szórás nagyon közel van az alap EWNS-hez, 25 nm, illetve 1,41. A 3c ábra az alap EWNS ugyanazon módszerrel és azonos körülmények között mért méreteloszlását mutatja.
A 3d,e ábrán a töltésjellemzés eredményei láthatók. Az adatok 30 egyidejű koncentrációmérés (#/cm3) és áramerősség (I) átlagértékei. Az elemzés azt mutatja, hogy az EWNS átlagos töltése 22 ± 6 e- és 44 ± 6 e- [-6,5 kV, 4,0 cm], illetve [-3,8 kV, 0,5 cm] esetén. Az alap-EWNS-hez (10 ± 2 e-) képest a felületi töltésük jelentősen magasabb, kétszerese a [-6,5 kV, 4,0 cm] forgatókönyvnek és négyszerese a [-3,8 kV, 0,5 cm]-nek. A 3f ábra az EWNS alapvető fizetési adatait mutatja.
Az EWNS részecskeszám-koncentrációs térképeiből (S5. és S6. kiegészítő ábrák) látható, hogy a [-6,5 kV, 4,0 cm] jelenetben szignifikánsan több részecske van, mint a [-3,8 kV, 0,5 cm] jelenetben. Azt is meg kell jegyezni, hogy az EWNS részecskeszám-koncentrációit akár 4 órán át is monitorozták (S5. és S6. kiegészítő ábrák), ahol az EWNS generálási stabilitása mindkét esetben azonos részecskeszám-koncentrációs szinteket mutatott.
A 3g. ábra az optimalizált EWNS kontroll (háttér) kivonása utáni EPR spektrumát mutatja [-6,5 kV, 4,0 cm]. A ROS spektrumot egy korábban publikált cikkben szereplő EWNS alapvonallal is összehasonlították. A spincsapdával reagáló EWNS számított száma 7,5 × 104 EWNS/s, ami hasonló a korábban publikált Baseline-EWNS8-hoz. Az EPR spektrumok egyértelműen kétféle ROS jelenlétét mutatták, ahol az O2- dominált, míg az OH• kisebb mennyiségben volt jelen. Ezenkívül a csúcsintenzitások közvetlen összehasonlítása azt mutatta, hogy az optimalizált EWNS szignifikánsan magasabb ROS-tartalommal rendelkezett az alap EWNS-hez képest.
A 4. ábra az EWNS leválasztási hatékonyságát mutatja EPES-ben. Az adatokat az I. táblázatban összegeztük és összehasonlítottuk az eredeti EWNS adatokkal. Mindkét EUNS esetben a leválasztás közel 100%-os volt még 3,0 kV-os alacsony feszültségen is. Általában 3,0 kV elegendő a 100%-os leválasztás eléréséhez, függetlenül a felületi töltésváltozástól. Ugyanezen körülmények között az alap-EWNS leválasztási hatékonysága mindössze 56% volt az alacsonyabb töltés (átlagosan 10 elektron EWNS-enként) miatt.
Az 5. ábra és a 2. táblázat összefoglalja a paradicsom felületére beoltott mikroorganizmusok inaktivációjának mértékét körülbelül 40 000 #/cm3 EWNS-nek 45 percig történő kitettség után, optimális forgatókönyv [-6,5 kV, 4,0 cm] mellett. A beoltott E. coli és L. innocua szignifikáns, 3,8 logaritmikus csökkenést mutatott 45 perc expozíció után. Ugyanezen körülmények között az S. enterica alacsonyabb, 2,2 logaritmikus logaritmikus csökkenést mutatott, míg az S. cerevisiae és az M. parafortuitum 1,0 logaritmikus csökkenést mutatott.
Elektronmikroszkópos felvételek (6. ábra), amelyek az EWNS által E. coli, Salmonella enterica és L. innocua sejtekben kiváltott, inaktivációhoz vezető fizikai változásokat ábrázolják. A kontrollbaktériumok ép sejtmembránokat mutattak, míg a kitett baktériumok külső membránjai sérültek voltak.
A kontroll és az exponált baktériumok elektronmikroszkópos képalkotása membránkárosodást mutatott.
Az optimalizált EWNS fizikai-kémiai tulajdonságaira vonatkozó adatok együttesen azt mutatják, hogy az EWNS tulajdonságai (felületi töltés és ROS-tartalom) jelentősen javultak a korábban publikált EWNS alapadatokhoz képest8,9,10,11. Másrészt a méretük nanométeres tartományban maradt, ami nagyon hasonlít a korábban publikált eredményekhez, lehetővé téve számukra, hogy hosszú ideig a levegőben maradjanak. A megfigyelt polidiszperzitás a felületi töltés változásaival magyarázható, amelyek meghatározzák a Rayleigh-effektus nagyságát, a véletlenszerűséget és az EWNS-ek potenciális összeolvadását. Azonban, ahogy Nielsen és munkatársai22 részletezik, a nagy felületi töltés csökkenti a párolgást azáltal, hogy hatékonyan növeli a vízcsepp felületi energiáját/feszültségét. Ezt az elméletet mikrocseppek22 és EWNS esetében kísérletileg is megerősítettük korábbi publikációnkban8. Az időveszteség szintén befolyásolhatja a méretet, és hozzájárulhat a megfigyelt méreteloszláshoz.
Ezenkívül a szerkezetenkénti töltés körülbelül 22–44 e-, a körülményektől függően, ami jelentősen magasabb az alap EWNS-hez képest, amelynek átlagos töltése szerkezetenként 10 ± 2 elektron. Meg kell azonban jegyezni, hogy ez az EWNS átlagos töltése. Seto és munkatársai kimutatták, hogy a töltés nem egyenletes, és log-normális eloszlást követ21. Korábbi munkánkhoz képest a felületi töltés megduplázása az EPES rendszerben a lerakódási hatékonyságot majdnem 100%-ra növeli11.