Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com webhelyet. Az Ön által használt böngészőverzió korlátozottan támogatja a CSS-t. A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy kapcsolja ki a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Addig is a folyamatos támogatás érdekében a webhelyet stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg.
Porózus szilícium-dioxid részecskéket szol-gél módszerrel állítottunk elő, némi módosítással makropórusos részecskék előállításához. Ezeket a részecskéket reverzibilis addíciós fragmentációs lánctranszfer (RAFT) polimerizációval származtattuk N-fenil-maleimid-metil-vinil-izocianáttal (PMI) és sztirollal, így N-fenilmaleimid-oszlopos stacionárius fázisú (PMP polisztirolbórmentes interkalációt) állítottunk elő. 00 × 1,8 mm id) szuszpenzióval töltöttük. Öt peptidből álló peptidkeverék (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin-kromatográfiás HA szérum-enkephalin optimális emésztési viszonyok) és leucin-kromatográfiás HA optimális teljesítménye) PMP oszlopos szétválasztása. , a peptidkeverék elméleti lemezszáma akár 280 000 lemez/m². A kifejlesztett oszlop elválasztási teljesítményét a kereskedelmi Ascentis Express RP-Amide oszloppal összehasonlítva megfigyelhető, hogy a PMP oszlop elválasztási teljesítménye jobb volt, mint a kereskedelmi oszlopé az elválasztás hatékonysága és felbontása tekintetében.
Az elmúlt években a biogyógyszeripar egyre bővülő globális piactá vált, jelentős piaci részesedésnövekedéssel. A biogyógyszeripar robbanásszerű növekedésével1,2,3 nagyon kívánatos a peptidek és fehérjék analízise. A peptidszintézis során a célpeptiden kívül számos szennyeződés is keletkezik a peptidszintézis során, így szükséges a fehérje kromatográfiás kromatográfiás kromatográfiás tisztítása és tisztítása. A szövetek és sejtek rendkívül nagy kihívást jelentenek az egyetlen mintában potenciálisan kimutatható fajok nagy száma miatt. Bár a tömegspektrometria hatékony eszköz a peptid- és fehérjeszekvenáláshoz, ha ilyen mintákat egy menetben injektálnak a tömegspektrométerbe, az elválasztás nem lesz ideális. Ez a probléma enyhíthető a folyadékkromatográfiás (MS) beviteli analízis végrehajtásával, amely a tömegmérést megelőzően csökkenti a tömegspektrométert. adott idő4,5,6.Ezenkívül a folyadékfázisú elválasztás során az analitokat szűk tartományokba lehet fókuszálni, ezáltal ezek az analitok koncentrálódnak, és javul az MS kimutatási érzékenysége.A folyadékkromatográfia (LC) jelentősen fejlődött az elmúlt évtizedben, és népszerű technikává vált a proteomikai analízisben7,8,9,10.
A fordított fázisú folyadékkromatográfiát (RP-LC) széles körben alkalmazzák peptidkeverékek tisztítására és elválasztására, állófázisként oktadecil-módosított szilícium-dioxidot (ODS) használva11,12,13. Az RP állófázisok azonban nem biztosítják a peptidek és fehérjék kielégítő elválasztását a speciális stacioner fázisú5, amphiphilic szerkezetük miatt. szükséges a poláros és nem poláros részekkel rendelkező peptidek és fehérjék elemzése, hogy kölcsönhatásba léphessenek ezekkel az analitokkal és megtartsák azokat.16. A multimodális kölcsönhatásokat biztosító vegyes módú kromatográfia az RP-LC alternatívája lehet a peptidek, fehérjék és egyéb komplex keverékek elválasztásában. Számos kevert módú állófázisú fehérje elválasztásra került sor. ,20,21.A vegyes módú állófázisok (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, poláris interkaláció/RPLC) poláris és nem poláris csoportok jelenléte miatt alkalmasak peptidek és fehérjék szétválasztására. -poláris analitok, mivel az elválasztás az analit és az állófázis közötti kölcsönhatástól függ.Multimodális interakciók 29, 30, 31, 32. A közelmúltban Zhang et al.30 dodecil-végződésű poliamin állófázis készült, és sikeresen szeparált szénhidrogéneket, antidepresszánsokat, flavonoidokat, nukleozidokat, ösztrogéneket és számos más analitot. A poláris interkalátor poláros és nem poláris csoportokat is tartalmaz, így felhasználható olyan peptidek és fehérjék elválasztására, amelyek hidrofób és hidrofil oszlopos részeket egyaránt tartalmaznak. Ascentis Express RP-Amide oszlopok kereskedelmi néven kaphatók, de ezeket az oszlopokat csak a 33-as amin elemzésére használják.
Jelen vizsgálatunkban egy poláris beágyazott állófázis (N-fenil-maleimidbe ágyazott polisztirol) készült és értékeltük a HSA peptidek és tripszin emésztések elválasztását. Az állófázis a következő stratégiával készült. Porózus szilícium-dioxid részecskéket az előző publikációnkban megadott eljárás szerint állítottunk elő, néhány módosítással a készítményhez viszonyított polietilén P,PolietilénP,Polietilén P,A készítmény aránya EG. Az ecetsavat úgy állítottuk be, hogy nagy pórusméretű szilícium-dioxid részecskéket állítsunk elő. Másodszor, egy új ligandumot, a fenil-maleimid-metil-vinil-izocianátot szintetizálták, és szilícium-dioxid részecskék derivatizálására használták poláris, beágyazott állófázis előállításához. A kapott állófázis egy rozsdamentes acél oszlopba lett csomagolva. homogén ágy képződik az oszlopon belül. Értékelje az öt peptidből álló peptidkeverékek töltött oszlopos elválasztását;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin Enkephalin) és a humán szérumalbumin (HAS) tripszin emésztése. A peptidkeverék és a HSA tripszin emésztése jó felbontással és hatékonysággal vált szét. és a fehérjék jól feloldódnak és hatékonyak a PMP oszlopon, amely hatékonyabb volt, mint az Ascentis Express RP-Amide oszlop.
PEG (polietilénglikol), karbamid, ecetsav, trimetoxi-ortoszilikát (TMOS), trimetil-klór-szilán (TMCS), tripszin, humán szérumalbumin (HSA), ammónium-klorid, karbamid, hexán-metil-diszilazán (HMDS), metakriloil-szilazazán (HMDS), metakriloil-szilil-klorid (MCTEHPOM), benzoil-4, ), HPLC minőségű acetonitrilt (ACN), metanolt, 2-propanolt és acetont a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA) vásároltunk.
Karbamid (8 g), polietilénglikol (8 g) és 8 ml 0,01 N ecetsav keverékét 10 percig keverjük, majd 24 ml TMOS-t adunk hozzá jéghideg körülmények között. A reakcióelegyet 40 °C-on 6 órán át öntjük, majd 120 °C-on öntjük, és az acélból készült anyagot 8 órán át vízmentesen lehűtjük. 12 órán át 70 °C-on szárítottuk. A megszárított lágy masszát kemencében simára őröltük, és 550 °C-on 12 órán át kalcináltuk. Három tételt készítettünk és jellemeztük, hogy megvizsgáljuk a reprodukálhatóságot részecskeméretben, pórusméretben és felületben.
Szilícium-dioxid részecskék felületi módosításával előszintetizált ligandum fenil-maleimid-metil-vinilizocianáttal (PCMP), majd sztirol radiális polimerizációval poláros csoportot tartalmazó vegyületet állítottunk elő.Állófázis aggregátumokhoz és polisztirol láncokhoz. Az előállítási folyamatot az alábbiakban ismertetjük.
N-fenil-maleimidet (200 mg) és metil-vinil-izocianátot (100 mg) feloldottunk száraz toluolban, és 0,1 ml 2,2'-azoizobutironitrilt (AIBN) adtunk a reakciólombikhoz, így fenil-maleimid-metil-vinil-izocianátot szárítottunk, majd a keveréket 30 °C-on, 6 °C-on CP-n szűrtük. 40°C-os sütőben 3 órán keresztül.
2 g szárított szilícium-dioxid részecskéket 100 ml vízmentes toluolban diszpergáltunk, kevertük, és egy 500 ml-es gömblombikban 10 percig ultrahanggal kezeltük. PMCP-t (10 mg) feloldottunk toluolban, és cseppenként hozzáadtuk a reakcióedénybe. Ezután PMCP-kötött szilícium-dioxid részecskéket (100 g) feloldunk 200 ml toluolban, és 100 µl dibutilón-dilaurát jelenlétében katalizátorként 4-hidroxi-TEMPO-t (2 ml) adunk hozzá. Az elegyet 50 °C-on 8 órán át keverjük, majd 50 °C-on szárítjuk.
Sztirol (1 ml), benzoil-peroxid BPO (0,5 ml) és TEMPO-PMCP-vel kapcsolt szilícium-dioxid részecskéket (1,5 g) toluolban diszpergáltunk, és nitrogénnel átöblítettük. A sztirol polimerizációját 100 °C-on 12 órán át szárítottuk. A kapott terméket egy éjszakán át metanollal 60 °C-on mostuk.
A mintákat 393 K-en 1 órán át gáztalanítottuk, hogy 10-3 Torr-nál kisebb maradék nyomást kapjunk.A P/P0 = 0,99 relatív nyomáson adszorbeált N2 mennyiségét használjuk a teljes pórustérfogat meghatározásához.A csupasz és ligandumkötésű szilícium-dioxid részecskék morfológiáját vizsgáltuk meg High scanningotechopylogias, TooDinkykyrita (Japánpásztázóelektronologia, TooDinkykyrita) segítségével. (csupasz szilícium-dioxid és ligandumkötésű szilícium-dioxid részecskék) alumínium oszlopra helyeztük ragasztós szénszalag segítségével.A mintákra Q150T porlasztó bevonattal aranyat vontunk be, és a mintákra 5 nm-es Au réteg került.Ez javítja a folyamat hatékonyságát alacsony feszültségek használatával és finomszemcsés, hideg analízist biztosít. Az elemanalízishez r-t használtunk. A részecskeméret-eloszlás meghatározásához Malvern (Worcestershire, Egyesült Királyság) Mastersizer 2000 típusú részecskeméret-analizátort használtunk. A csupasz szilícium-dioxid részecskéket és ligandumkötésű szilícium-dioxid részecskéket (mindegyik 5 mg) 5 ml izopropanolban diszpergáltuk, 10 percig ultrahanggal kezeltük, majd 10 percen keresztül a Mastersizer-re helyeztük. A ravimetriás analízist percenként 5 °C sebességgel végeztük 30-800 °C hőmérséklet-tartományban.
Üvegbevonatú, rozsdamentes acél keskeny furatú oszlopokat (100 × 1,8 mm belső átmérőjű) zagyos csomagolási módszerrel töltöttünk, ugyanazt az eljárást alkalmazva, mint a Ref.31. Egy rozsdamentes acél oszlopot (üvegbevonatú, 100 × 1,8 mm belső átmérőjű) 1 µm-es frittel ellátott kimeneti csatlakozóval egy iszapcsomagolóhoz (Alltech Deerfield, IL, USA) csatlakoztattunk. Készítsünk állófázisú szuszpenziót 150 mg 150 mg 2 ml állófázis szuszpendálásával. a szuszpenzió oldószereként, valamint a hajtó oldószerként. Töltse fel az oszlopot egymás után 100 MP nyomás alkalmazásával 10 percig, 80 MP 15 percig és 60 MP nyomással 30 percig. A csomagolás során mechanikai vibrációt alkalmaztunk két GC oszloprázóval (Alltech, Deerfield, IL, USA) az oszlop egyenletes nyomásának biztosítására. elkerülje az oszlopon belüli sérüléseket. Válassza le az oszlopot a zagycsomagoló egységről, és csatlakoztasson egy másik szerelvényt a bemenethez és az LC rendszerhez, hogy ellenőrizze a teljesítményét.
LC-szivattyút (10AD Shimadzu, Japán), injektort (Valco (USA) C14 W.05) 50 nL-es befecskendező hurokkal, membrán gáztalanítót (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapilláris ablakot építettek. Speciális µLC készülék detektor (UV-2075) és üvegbélésű oszlop nagyon szűkíti a sávot és minimalizálja a mikrooszlopokat. Csomagolás után kapillárisok (50 μm id 365 és redukáló egyesülési kapillárisok (50 μm) kerültek beépítésre a redukáló egység 1/16″-os kimenetére. Az adatgyűjtés és a kromatográfiás feldolgozás Multichro 2000 szoftverrel történt. Monitoring 254 nm-en (MANormatografálták).
Albumin humán szérumból, liofilizált por, ≥ 96% (agaróz gél elektroforézis) 3 mg tripszinnel (1,5 mg), 4,0 M karbamiddal (1 ml) és 0,2 M ammónium-hidrogén-karbonáttal (1 ml) keverve. Az oldatot 10 percig keverjük, majd 10 percen keresztül 10 °C-on 1 órán át vízfürdőben állni hagyjuk. % TFA. Az oldatot szűrjük és 4 °C alatt tároljuk.
A peptidkeverékek és a HSA tripszin emésztések elválasztását külön értékeltük PMP oszlopokon. Ellenőrizze a peptidkeverék és a HSA tripszin emésztésének elválasztását a PMP oszlopon, és hasonlítsa össze az eredményeket az Ascentis Express RP-Amide oszloppal. Az elméleti lemezszám kiszámítása a következőképpen történik:
A csupasz szilícium-dioxid részecskék és a ligandumhoz kötött szilícium-dioxid részecskék SEM-képei a 1. ábrán láthatók.2. A csupasz szilícium-dioxid részecskék (A, B) SEM felvételei azt mutatják, hogy korábbi vizsgálatainkkal ellentétben ezek a részecskék gömb alakúak, amelyekben a részecskék megnyúltak, vagy szabálytalan szimmetriájúak. A ligandumkötésű szilícium-dioxid részecskék felülete (C, D) simább, mint a csupasz szilícium-dioxid részecskéké, ami a poliészter felület kocsolatosságának köszönhető.
Pásztázó elektronmikroszkópos felvételek csupasz szilícium-dioxid részecskékről (A, B) és ligandumkötésű szilícium-dioxid részecskékről (C, D).
A csupasz szilícium-dioxid részecskék és a ligandumkötésű szilícium-dioxid részecskék szemcseméret-eloszlását a 3(A) ábra mutatja. A térfogat alapú részecskeméret-eloszlási görbék azt mutatták, hogy a szilícium-dioxid részecskék mérete a kémiai módosítást követően megnőtt (3A. ábra). A jelenlegi és az előző vizsgálatból származó szilícium-dioxid részecskék szemcseméret-eloszlási adatait a P.3,-1(AMP alapú részecskeméret) táblázatban hasonlítjuk össze.5,-1(AMP). 0,36 μm, szemben a korábbi, 3,05 μm-es ad(0,5) értékű vizsgálatunkkal (polisztirolhoz kötött szilícium-dioxid részecskék)34. Ennek a tételnek a részecskeméret-eloszlása ​​szűkebb volt az előző vizsgálatunkhoz képest a korábban változó PEG, karbamid, TMOS és ecetsav aránya miatt a reakcióelegyben, mint a polisztirolfázis részecskemérete, mint a PMP részecskemérete. Ez azt jelenti, hogy a szilícium-dioxid részecskék felületi funkcionalizálása sztirollal csak egy polisztirol réteget (0,97 µm) rakott le a szilícium-dioxid felületére, míg a PMP fázisban a rétegvastagság 1,38 µm volt.
A csupasz szilícium-dioxid részecskék és ligandumhoz kötött szilícium-dioxid részecskék szemcseméret-eloszlása ​​(A) és pórusméret-eloszlása ​​(B).
A jelen vizsgálatban szereplő szilícium-dioxid részecskék pórusméretét, pórustérfogatát és felületét az 1(B) táblázat tartalmazza. A csupasz szilícium-dioxid részecskék és a ligandumkötésű szilícium-dioxid részecskék PSD profilja a 3(B) ábrán látható. Az eredmények összehasonlíthatók korábbi vizsgálatunkkal. A csupasz és ligandumhoz kötött szilícium-dioxid részecskék pórusmérete310, illetve a mennyiségükkel csökken. 69 kémiai módosítás után, ahogy az 1(B) táblázatban látható, a görbe változása pedig a 3(B) ábrán látható. Hasonlóan a szilícium-dioxid részecskék pórustérfogata 0,67-ről 0,58 cm3/g-ra csökkent a kémiai módosítást követően. A jelenleg vizsgált szilícium-dioxid részecskék fajlagos felülete 116 m2/g, ami a mi vizsgálatunkban 116 m2/g,246 m2. Az 1(B) táblázatban a szilícium-dioxid részecskék felülete (m2/g) szintén 116 m2/g-ról 105 m2/g-ra csökkent kémiai módosítás után.
Az állófázis elemanalízisének eredményeit a 2. táblázat mutatja. A jelenlegi állófázis szénterhelése 6,35%, ami alacsonyabb, mint az előző vizsgálatunk szénterhelése (polisztirolkötésű szilícium-dioxid részecskék 7,93%35 és 10,21%) fenil-maleimid-metil-vinilizocianátot (PCMP) és 4-hidroxi-TEMPO-t használtak. A jelenlegi állófázis nitrogén tömegszázaléka 2,21%, szemben a korábbi vizsgálatok 0,1735, illetve 0,85 tömeg%-ával. Ez azt jelenti, hogy a jelenlegi stacionárius fázisban a nitrogén-immizáló fázis nagyobb tömegszázaléka. A (4) és (5) termékek 2,7%, illetve 2,9%-a, míg a (6) végtermék szénterhelése 6,35%, a 2. táblázat szerint. A súlycsökkenést PMP stacionárius fázissal ellenőriztük, a TGA görbe pedig a 4. ábrán látható. A TGA görbe 8,6%-os súlyveszteséget mutat. és H.
A fenil-maleimid-metil-vinil-izocianát ligandumot a szilícium-dioxid részecskék felületének módosítására választottuk, mert poláris fenil-maleimid-csoportokat és vinilizocianát-csoportokat tartalmaz. A vinil-izocianát-csoportok élő gyökös polimerizációval tovább reagálhatnak a sztirollal. A második ok az, hogy egy olyan csoportot helyezzenek be, amely mérsékelten kölcsönhatásba lép az erős analitikai fázissal és az erős analitikai fázissal, valamint az erős analitikai fázissal. Ide molekularésznek nincs virtuális töltése normál pH-n. Az állófázis polaritása szabályozható az optimális sztirolmennyiséggel és a szabad gyökös polimerizáció reakcióidejével. A reakció utolsó lépése (szabadgyökös polimerizáció) kritikus, és megváltoztathatja az állófázis polaritását. Ezen állófázisok szénterhelésének ellenőrzésére elemanalízist végeztünk. Megfigyelték, hogy a reakcióidő megnövekedett stacionerfázis-mennyisége és vice-fázis terhelése folyamatosan növekszik. .A különböző koncentrációjú sztirollal készített SP-k szénterhelése eltérő. Ismét töltse be ezeket az állófázisokat rozsdamentes acél oszlopokba, és ellenőrizze kromatográfiás teljesítményüket (szelektivitás, felbontás, N-érték stb.).Ezen kísérletek alapján egy optimalizált készítményt választottak ki a PMP állófázis elkészítéséhez a szabályozott polaritás és a jó analit visszatartás biztosítása érdekében.
Öt peptidkeveréket (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin-enkefalin) szintén PMP-oszlopon, mozgófázis alkalmazásával értékeltünk;60/40 (v/v) acetonitril/víz (0,1% TFA) 80 μl/perc áramlási sebesség mellett. Optimális elúciós körülmények között az elméleti lemezszám (N) oszloponként (100 × 1,8 mm belső átmérő) 20 000 ± 100 (200/000 N 200 000 N-t ad a három chrome lemeznél). A grammok az 5A. ábrán láthatók. Gyors elemzés PMP oszlopon nagy áramlási sebesség mellett (700 μL/perc), öt peptid eluálódott egy percen belül, az N értékek nagyon jók voltak, 13 500 ± 330 oszloponként (oszloponként 1,8 mm id), 135,00 Tre 135,00 tre 1 identres lemezméretnek felel meg. 00 × 1,8 mm id) három különböző tétel PMP állófázissal voltak megtöltve a reprodukálhatóság ellenőrzése érdekében. Az egyes oszlopok analitkoncentrációját az optimális elúciós körülmények és az elméleti lemezek számának (N) és a retenciós időnek megfelelően rögzítettük, hogy ugyanazt a tesztkeveréket minden oszlopon elválasszák. 3. táblázat.
A peptidkeverék szétválasztása PMP oszlopon (B) és Ascentis Express RP-Amide oszlopon (A);mozgófázis 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP oszlop méretei (100 × 1,8 mm id);analitikai A vegyületek elúciós sorrendje: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) és 5 (leucin) sav enkefalin)).
Egy PMP oszlopot (100 × 1,8 mm id) értékeltünk a humán szérumalbumin triptikus emésztésének elválasztására nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával. A 6. ábrán látható kromatogram azt mutatja, hogy a minta jól elkülönült, és a felbontás nagyon jó. A HSA-emésztéseket 100 µl/perc áramlási sebességgel elemeztük, a mobil fázist 70 µl/perc, a mobil fázist acetonitril/0% FAatonitril/0% vízben. grammban (6. ábra), a HSA emésztést 17 csúcsra bontották, amelyek 17 peptidnek felelnek meg. A HSA emésztés egyes csúcsainak elválasztási hatékonyságát kiszámítottuk, és az értékeket az 5. táblázat tartalmazza.
A HSA triptikus emésztését (100 × 1,8 mm átmérőjű) PMP oszlopon választottuk el;áramlási sebesség (100 µl/perc), mozgófázis 60/40 acetonitril/víz 0,1% TFA-val.
ahol L az oszlop hossza, η a mozgófázis viszkozitása, ΔP az oszlop ellennyomása, u pedig a mozgófázis lineáris sebessége. A PMP oszlop permeabilitása 2,5 × 10-14 m2 volt, az áramlási sebesség 25 μL/perc, és 60/40 v/v az ACN perme. hasonló volt az előző tanulmányunkhoz Ref.34.A felületesen porózus részecskékkel megtöltött oszlop permeabilitása: 1,7 × 10-15 az 1,3 μm-es részecskék esetében, 3,1 × 10-15 az 1,7 μm-es részecskék esetében, 5,2 × 10-15 és 210-2 μm-es részecskék esetében 5,2 × 10-15 és 21-2-5 μs. μm-es részecskék 43.Ezért a PMP fázis permeabilitása hasonló az 5 μm-es mag-héj részecskékéhez.
ahol Wx a kloroformmal töltött oszlop tömege, Wy a metanollal töltött oszlop tömege, ρ pedig az oldószer sűrűsége. A metanol (ρ = 0,7866) és a kloroform (ρ = 1,484) sűrűsége. A szilícium-dioxid-részecskék teljes porozitása Az általunk korábban vizsgált 31. karbamidoszlopok 0,63 és 0,55 voltak. Ez azt jelenti, hogy a karbamid ligandumok jelenléte csökkenti az állófázis permeabilitását. Másrészt a PMP oszlop teljes porozitása (100 × 1,8 mm belső átmérő) 0,60. típusú állófázisok esetén a C18 ligandumok lineáris láncokként kapcsolódnak a szilícium-dioxid részecskékhez, míg a polisztirol típusú állófázisokban egy viszonylag vastag polimer réteg alakul ki körülötte. Egy tipikus kísérletben az oszlop porozitását a következőképpen számítják ki:
A 7A, B ábra a PMP oszlopot (100 × 1,8 mm belső átmérőjű) és az Ascentis Express RP-Amide oszlopot (100 × 1,8 mm belső átmérőjű) mutatja azonos elúciós körülmények között (azaz 60/40 ACN/H2O és 0,1% TFA).) van Deemter telek.A kiválasztott peptidkeverékeket (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin Enkephalin) 20 µL/mindkét oszlopban állítottuk elő. A minimális áramlási sebesség mindkét oszlop esetében 800 µL/perc. A minimális HETP-értékek a 8 MP áramlási sebességnél (8 µL/perc) centis Express RP-Amide oszlop 2,6 µm, illetve 3,9 µm volt. A HETP értékek azt mutatják, hogy a PMP oszlop (100 × 1,8 mm id) elválasztási hatékonysága sokkal jobb, mint a kereskedelemben kapható Ascentis Express N RP-Amide oszlopé (100 × 1,8 mm id áramlási diagrammal, a csökkenés a vanig Deemter id 7-ben). nem szignifikáns korábbi vizsgálatunkhoz képest.A PMP oszlop (100 × 1,8 mm id) nagyobb elválasztási hatékonysága az Ascentis Express RP-Amide oszlophoz képest a részecskék alakjának, méretének és a jelenlegi munkában alkalmazott összetett oszlopcsomagolási eljárásoknak a javulásain alapul34.
(A) van Deemter diagram (HETP versus mozgófázis lineáris sebesség), amelyet PMP oszlop (100 × 1,8 mm átmérőjű) alkalmazásával kaptunk, 60/40 ACN/H2O-ban, 0,1% TFA-val.(B) van Deemter diagram (HETP versus mozgófázis lineáris sebesség) Ascentis Express Ascentis Express A RP-Amide oszloppal (10/0 mm/0H2) (10/0 mm2H2) kapott. 0,1% TFA-val.
Poláros beágyazott polisztirol állófázis készült és értékelhető a szintetikus peptidkeverékek és a humán szérumalbumin (HAS) tripszin emésztésének elválasztására nagy teljesítményű folyadékkromatográfiában. A peptidkeverékekhez készült PMP oszlopok kromatográfiás teljesítménye kiváló elválasztási hatékonyság és felbontás tekintetében. sis az állófázis, és az összetett oszloppakolás. A nagy elválasztási hatékonyság mellett az alacsony oszlop-ellennyomás nagy áramlási sebesség mellett további előnye ennek az állófázisnak. A PMP oszlopok jó reprodukálhatóságot mutatnak, felhasználhatók peptidkeverékek elemzésére és különféle fehérjék tripszin emésztésére. Ezt az oszlopot kívánjuk felhasználni a jövőben a P-oszlop kromográfiában a gyógynövények, gyógynövények és gyógynövények folyékony kivonataként is. értékelték a fehérjék és a monoklonális antitestek elválasztására.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Research on Peptide Separation Systems by Reversed Phase Chromatography I. rész: Oszlopjellemző protokoll fejlesztése.J.Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al.A fertőző betegségek kezelésére tervezett továbbfejlesztett aktív peptidek.Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Szintetikus terápiás peptidek: tudomány és piac.drog felfedezés.15 (1-2) ma, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD és Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. A fejlett folyadékkromatográfiás tömegspektrometria lehetővé teszi a széles körben célzott metabolomika és proteomika beépítését.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Az UHPLC szerepe a gyógyszerfejlesztésben.J.Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Az ultranagynyomású folyadékkromatográfia alapvető és gyakorlati szempontjai gyors elválasztáshoz.J.Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Ultra-high performance liquid chromatography in drug development.J.Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. és munkatársai: Olaj a vízben magas belső fázisú emulziókból előállított monolitikus makropórusos hidrogélek enterovírusok hatékony tisztítására.Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA The role of liquid chromatography in proteomics.J.Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. Emerging trends in revered-phase liquid chromatography separations of therapy peptides and proteins: theory and applications.J.Gyógyszerészet.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Peptidek kétdimenziós elválasztása RP-RP-HPLC rendszerrel, különböző pH-értékek alkalmazásával az első és második elválasztási dimenzióban.J.Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al.A C18 sub-2 μm teljesen és felületesen porózus részecskékkel töltött nagy hatékonyságú kromatográfiás oszlopok tömegátviteli jellemzőit és kinetikai teljesítményét vizsgálták.J.Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al.A legújabb trendek és analitikai kihívások a növényi bioaktív peptidek izolálásával, azonosításával és validálásával kapcsolatban.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-028-08.
Mueller, JB et al.The proteomic landscape of the Kingdom of life. Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. és munkatársai: Terápiás peptidek downstream feldolgozása preparatív folyadékkromatográfiával. Molecule (Basel, Svájc) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Mixed-mode kromatográfia és alkalmazása biopolimerekre.J.Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ligands for mix-mode protein chromatography: elv, jellemzés és tervezés.J.Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).