Köszönjük, hogy felkereste a Nature.com weboldalt. Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik. A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy egy frissített böngészőt használjon (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Időközben a folyamatos támogatás biztosítása érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
Az Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) egy hüvelyes növény, amelyet élelmiszertermelésre és talajjavításra használnak. Az NLL globális terjeszkedése számos kórokozó gombát vonzott, beleértve a csillagfürt antraknózist, amely a pusztító antraknózis betegséget okozza. Két allélt, a Lanr1-et és az AnMan-t, amelyek fokozott rezisztenciát biztosítanak, alkalmaztak az NLL nemesítésében, de a mögöttes molekuláris mechanizmusok továbbra sem ismertek. Ebben a vizsgálatban a Lanr1 és az AnMan markereket használták az európai NLL minták szűrésére. A vakcina kontrollált környezetben történő tesztelése megerősítette mindkét rezisztens donor hatékonyságát. Differenciális génexpressziós profilalkotást végeztek reprezentatív rezisztens és fogékony vonalakon. Az antraknózis-rezisztencia a „GO:0006952 Védelmi Válasz”, a „GO:0055114 Redox Folyamat” és a „GO:0015979 Fotoszintézis” génontológiai kifejezések túlexpressziójával járt. Ezenkívül a Lanr1(83A:476) vonal a beoltást követően gyorsan jelentős transzkriptom-átprogramozást mutatott, míg a többi vonal körülbelül 42 órás késést mutatott ebben a válaszban. A védekező válaszok a TIR-NBS, CC-NBS-LRR és NBS-LRR génekhez, a patogenezisben részt vevő 10 fehérjéhez, a lipidtranszfer fehérjékhez, az endoglükán-1,3-β-glükozidázhoz, a glicinben gazdag sejtfalfehérjékhez és az oxigén reaktív útvonalából származó génekhez kapcsolódnak. A 83A:476-ra adott korai válaszok, beleértve a fotoszintézissel kapcsolatos gének gondos elnyomását, egybeestek a gombabiológia vegetatív növekedési fázisában a sikeres védelemmel, ami arra utal, hogy egy effektor váltja ki az immunitást. A Mandeloop-reakció lelassul, akárcsak az általános vízszintes ellenállás.
A keskenylevelű csillagfürt (NLL, Lupinus angustifolius L.) egy magas fehérjetartalmú gabonaféle, amely a Földközi-tenger nyugati régiójából származik1,2. Jelenleg állatok és emberek élelmiszernövényeként termesztik. A vetésforgó rendszerekben zöldtrágyának is tekintik a szimbiotikus nitrogénmegkötő baktériumok általi nitrogénmegkötés és a talajszerkezet általános javulása miatt. Az NLL az elmúlt században gyors háziasodási folyamaton ment keresztül, és még mindig nagy tenyésztési nyomás alatt áll3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Az NLL széles körű termesztésével a kórokozó gombák egymásutánisága új mezőgazdasági réseket hozott létre, és új, növényeket pusztító betegségeket okozott. A csillagfürt-termesztők és -tenyésztők számára a legfigyelemreméltóbb az antraknózis megjelenése volt, amelyet a Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 kórokozó gomba okozott. A csillagfürt-termesztők és -tenyésztők számára a legfigyelemreméltóbb az antraknózis megjelenése volt, amelyet a Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 kórokozó gomba okozott. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза антракноза, вызвангриотерих памермеров, вызванногорныrich памеров (Bondar) Nirenberg, Feiler és Hagedorn13. A csillagfürt-gazdálkodók és -tenyésztők számára leginkább a Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 kórokozó gomba által okozott antraknózis megjelenése volt figyelemre méltó.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病trichpine (Bondar) Nirenberg, Feiler és Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病trichpine (Bondar)嵵Hajas.1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызбонковатогогонынконеров Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler és Hagedorn13. A csillagfürt-gazdálkodók és -tenyésztők számára a legszembetűnőbb az antraknózis megjelenése, amelyet a Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 kórokozó gomba okoz.A betegségről szóló legkorábbi jelentések Brazíliából és az Egyesült Államokból érkeztek, a tipikus tünetek 1912-ben, illetve 1929-ben jelentkeztek. Körülbelül 30 év elteltével azonban a kórokozót Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz-ként jelölték meg. & Sacc., teleomorfa Glomerella cingulata (Kőember) Spauld. & Sacc., teleomorfa Glomerella cingulata (Kőember) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., a Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld teleomorfja. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (kőműves) Spauld célzott morfológiában. & H. Schrenk,. & H. Schrenk,.és H. Schrenk. & H.施伦克，. & H.施伦克，.és H. Schlenk,.A 20. század közepén végzett előzetes betegség-fenotípus-meghatározás némi rezisztenciát mutatott az NLL és a sárga csillagfürt (L. luteus L.) tételekben, de az összes vizsgált fehér csillagfürt (L. albus L.) tétel nagyon fogékony volt15,16. Tanulmányok kimutatták, hogy az antraknózis kialakulása összefügg a megnövekedett csapadékmennyiséggel (páratartalom) és hőmérséklettel (12-28°C között), ami a rezisztencia csökkenéséhez vezet magasabb hőmérsékleten17, 18. Valójában a konídiumok csírázásához és a betegség kialakulásához szükséges idő négyszer rövidebb volt 24°C-on (4 óra), mint 12°C-on (16 óra) magas páratartalmú körülmények között19. Így a folyamatos globális felmelegedés az antraknózis terjedéséhez vezetett. A betegséget azonban Franciaországban (1982) és Ukrajnában (1983) is megfigyelték a közelgő veszély előhírnökeként, de a csillagfürtágazat akkoriban látszólag figyelmen kívül hagyta20,21. Néhány évvel később ez a pusztító betegség világszerte elterjedt, és olyan jelentős csillagfürt-termelő országokat is érintett, mint Ausztrália, Lengyelország és Németország22,23,24. Az 1990-es évek közepén kitört antraknózis-járványt követően kiterjedt szűrés eredményeként számos rezisztens donort azonosítottak az NLL19 mintákban. Az NLL antraknózissal szembeni rezisztenciáját két különálló domináns allél szabályozza, amelyek különböző csíraplazma-forrásokban találhatók: a Lanr1 a Tanjil fajtában, valamint a Wonga és az AnMan a Mandalay fajtában25, 26. Ezek az allélok kiegészítik azokat a molekuláris markereket, amelyek támogatják a rezisztens csíraplazma szelekcióját a nemesítési programokban25,26,27,28,29,30. A Lanr1 allélt hordozó 83A:476 rezisztens nemesítési vonalat keresztezték a fogékony P27255 vad vonallal, hogy egy antraknóz-rezisztenciára szegregálódó RIL populációt kapjanak, ami lehetővé tette a Lanr1 lókusz NLL-11 kromoszómához való rendelését31, 32, 33. Az antraknózhoz tartozó szegélyező rezisztencia lókuszok kapcsoltsági térkép markereinek genomikai kerettel való illesztésével az NLL feltárta mindhárom allél helyét ugyanazon a kromoszómán (NLL-11), de különböző pozíciókban29,34,35. Azonban a RIL-ek kis száma és a markerek és a megfelelő allélek közötti nagy genetikai távolság miatt nem lehet megbízható következtetéseket levonni az alapul szolgáló génjeikről. Másrészt a reverz genetika alkalmazása csillagfürtökben nehézkes a nagyon alacsony regenerációs potenciáljuk miatt, ami megnehezíti a genetikai manipulációt37.
A kívánt allélt homozigóta állapotban hordozó háziasított csíraplazma, mint például a 83A:476 (Lanr1) és a Mandelup (AnMan), kifejlesztése megnyitotta az utat az antraknóz-rezisztencia tanulmányozása előtt a vad populációkban található ellentétes allélkombinációk jelenlétében. Molekuláris mechanizmusok lehetőségei. Hasonlítsa össze az egyes genotípusok által generált védekező válaszokat. Ez a tanulmány az NLL korai transzkriptomválaszát értékelte a C. lupini vakcinációra. Először egy 215 vonalat tartalmazó európai NLL csíraplazma panelt szűrtek a Lanr1 és AnMan allélokat jelölő molekuláris markerek segítségével. Ezután antraknóz-fenotípus-meghatározást végeztek 50, korábban molekuláris markerekre kiválasztott NLL vonalon kontrollált körülmények között. Ezen kísérletek alapján négy, antraknóz-rezisztenciában és Lanr1/AnMan allélösszetételben eltérő vonalat választottak ki a differenciális védekező génexpressziós profilalkotáshoz két kiegészítő megközelítéssel: nagy áteresztőképességű RNS-szekvenálás és valós idejű PCR-kvantifikáció.
Egy NLL csíraplazma készlet (N = 215) Lanr1 (Anseq3 és Anseq4), valamint AnMan (Anseq4) és AnMan (AnManM1) markerekkel történő szűrése kimutatta, hogy csak egy vonal (95726, Salamanca-b közelében) amplifikálja az összes marker „rezisztencia” allélját, míg az „érzékeny” allélok jelenléte” 158 (~73,5%) vonalban találta az összes marker arányát. Tizenhárom vonal két „rezisztens” allélt termelt a Lanr1 markerre, és 8 vonal a Lanr1 „rezisztens” allélját. Az AnMan marker „rezisztencia” allélja (S1. kiegészítő táblázat). Két vonal heterozigóta volt az Anseq3 markerre, és egy heterozigóta az AnManM1 markerre. 42 vonal (19,5%) hordozta az Anseq3 és Anseq4 allélok ellentétes fázisait, ami a két lókusz közötti rekombináció magas gyakoriságát jelzi. A kontrollált körülmények között vizsgált antracnóz fenotípusok (S2. kiegészítő táblázat) változékonyságot mutattak a tesztelt genotípusok rezisztenciájában, ami az antracnózis súlyosságában is tükröződött. Az átlagpontszámok különbségei 1,8 (mérsékelten rezisztens) és 6,9 (fogékony) között, a növények tömege pedig 0,62 (fogékony) és 4,45 g (rezisztens) között mozgott. Szignifikáns korreláció volt megfigyelhető a kísérlet két ismétlésében megfigyelt értékek között (0,51 a betegség súlyossági pontszámokra, P = 0,00017 és 0,61 a növénytömegre, P < 0,0001), valamint e két paraméter között (−0,59 és −0,77, P < 0,0001). Szignifikáns korreláció volt megfigyelhető a kísérlet két ismétlésében megfigyelt értékek között (0,51 a betegség súlyossági pontszámaira, P = 0,00017 és 0,61 a növénytömegre, P < 0,0001), valamint e két paraméter között (-0,59 és -0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 твавялдолдя) болезни, P = 0,00017 és 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,577, Ри) 0,0001) 0,0001). Szignifikáns korrelációt találtunk a kísérlet két ismétlésében megfigyelt értékek között (0,51 a betegség súlyossági pontszámaira, P = 0,00017 és 0,61 a növénytömegre, P < 0,0001), valamint e két paraméter között (-0,59 és -0,77, P < 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评P.51︺ 0,00017, 植物重量为 0,61, P < 0,0001在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 相关性分为 0,51, p = 0,00017, 植物 为 为 0,61, p <0,0001） 0,59 和 – 0,59 和 – 0,59 和 - 0,77, P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях, повторностях, повторностях, повторностях, повторностях, оценка тяА = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 és -0,0001) 0,77, P <0,0001 Szignifikáns korreláció volt megfigyelhető a duplikátumban megfigyelt értékek (betegség súlyossági pontszám 0,51, P = 0,00017 és növénytömeg 0,61, P < 0,0001) és e két paraméter között (-0,59 és -0,0001) 0,77, P<0,0001. ).Az érzékeny növényeknél megfigyelhető tipikus tünetek közé tartozik a szár meggörbülése és csavarodása, amely „pásztoríjra” emlékeztet, majd ovális elváltozások narancssárga/rózsaszín sporozoitákkal (1. kiegészítő ábra). Az ausztrál Lanr1 (83A:476 és Tanjil) és AnMan (Mandelup) géneket hordozó törzsek mérsékelten rezisztensek, 0,0331 és 0,0036). Néhány, „rezisztens” Lanr1 és/vagy AnMan allélokat is hordozó vonal a betegség tüneteit mutatja.
Érdekes módon néhány, „rezisztens” marker allélt nem tartalmazó NLL vonal magas szintű antraknóz-rezisztenciát mutatott (összehasonlítható vagy magasabb, mint a Lanr1 vagy AnMan genotípusok esetében), mint például a Boregine (P-érték < 0,0001 mindkét paraméter esetében), a Bojar (P-érték < 0,0001 a pontszámra és 0,001 a növény tömegére) és a B-549/79b populáció (P-érték < 0,0001 a pontszámra és nem szignifikáns a tömegre). Érdekes módon néhány, „rezisztens” marker allélt nem tartalmazó NLL vonal magas szintű antraknóz-rezisztenciát mutatott (összehasonlítható vagy magasabb, mint a Lanr1 vagy AnMan genotípusok esetében), mint például a Boregine (P-érték < 0,0001 mindkét paraméter esetében), a Bojar (P-érték < 0,0001 a pontszámra és 0,001 a növény tömegére) és a B-549/79b populáció (P-érték < 0,0001 a pontszámra és nem szignifikáns a tömegre). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяции B-549/79ниднизначел0е1начел0е1 оценки и незначимо для массы). Érdekes módon számos, „rezisztens” marker allélt nem tartalmazó NLL vonal magas szintű rezisztenciát mutatott az antraknózzal szemben (összehasonlítható vagy magasabb a Lanr1 vagy AnMan genotípusoknál), mint például a Boregine (P-érték < 0,0001 mindkét paraméter esetében), a Bojar (P-érték < 0,0001 az értékelésre és 0,001 a növénytömegre) és a B-549/79b populáció (P-érték < 0,0001 az értékelésre és nem szignifikáns a tömegre).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的位基因的位基因的位基因的.或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值睂扩才量丏不重龇 Érdekes, hogy néhány olyan NLL rendszer, amely nem rendelkezik „antigén” markerekkel, magas horizontális rezisztenciát mutat (egyenértékű a Lanr1 vagy AnMan génekkel vagy magasabb), mint például a Boregine (mindkét paraméter P < 0,0001), a Bojar (P-érték < 0,0001, növénytömeg 0,001) és a B-549/79b törzs (P-érték < 0,0001, tömeg nem szignifikáns). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высок к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих парамет00в1), (значение P <0,0001, масса растения 0,001) és популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначитначи). Érdekes módon néhány, „rezisztencia” marker allélektől mentes NLL vonal magas szintű antraknóz-rezisztenciát mutatott (a Lanr1 vagy AnMan genotípusokhoz hasonló vagy annál magasabb értéket), mint például a Boregine (mindkét paraméter P-értéke <0,0001), a Bojar (P-érték < 0,0001, növénytömeg 0,001) és a B-549/79b populáció (P-érték < 0,0001, tömeg nem szignifikáns).Ez a jelenség egy új genetikai rezisztenciaforrás lehetőségét sugallja, ami megmagyarázza a marker genotípusok és a betegség fenotípusok közötti megfigyelt korreláció hiányát (P-értékek ~0,42 és ~0,98 között). Így a Kolmogorov-Smirnov teszt kimutatta, hogy az antraknóz rezisztenciára vonatkozó adatok megközelítőleg normális eloszlást mutattak a pontszámok (P-értékek 0,25 és 0,11) és a növényi tömeg (P-értékek 0,47 és 0,55) tekintetében, ami arra utal, hogy feltételezem, hogy a Lanr1-en és az AnMan-on kívül több allél is érintett.
Az antracnóz rezisztencia szűrés eredményei alapján 4 vonalat választottak ki transzkriptom elemzéshez: 83A:476, Boregine, Mandelup és a 22660 populáció. Ezeket a vonalakat ismételten tesztelték lépfene rezisztenciára inokulációs kísérletekben RNS szekvenálással, feltéve, hogy megegyeztek az előző tesztben szereplőkkel. A pontszámok a következők voltak: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) és a 22660 populáció (6,11 ± 1,29).
Az Illumina NovaSeq 6000 protokoll átlagosan 40,5 M leolvasási párt ért el mintánként (29,7–54,4 M leolvasás) (S3. kiegészítő táblázat). A referencia szekvenciában az illesztési pontszámok 75,5% és 88,6% között mozogtak. A biológiai replikátumok kísérleti variánsai közötti leolvasási számláló adatok átlagos korrelációja 0,812 és 0,997 között mozgott (átlag 0,959). A 35 170 elemzett gén közül 2917 nem mutatott expressziót, a többi 4785 gén pedig elhanyagolható szinten expresszálódott (alapátlag < 5). A 35 170 elemzett gén közül 2917 nem mutatott expressziót, a többi 4785 gén pedig elhanyagolható szinten expresszálódott (alapátlag < 5). A (базовое среднее <5). A 35 170 elemzett génből 2917 nem mutatott expressziót, a fennmaradó 4785 gén pedig elhanyagolható szinten expresszálódott (alapátlag <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）.35 170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительсюпо среднее значение <5). A 35 170 elemzett génből 2917 nem expresszálódott, a fennmaradó 4785 gén expressziója pedig elhanyagolható volt (alapátlag <5).Így a kísérlet során expresszáltnak tekintett gének száma (bázis átlag ≥ 5) 27 468 volt (78, 1%) (S4. kiegészítő táblázat).
Az első időponttól kezdve az összes NLL vonal reagált a C. lupini (Col-08 törzs) beoltására a transzkriptom átprogramozásával (1. táblázat), azonban a vonalak között jelentős különbségeket figyeltek meg. Így a 83A:476 rezisztenciavonal (amely a Lanr1 gént hordozza) jelentős transzkriptom átprogramozást mutatott az első időpontban (6 hpi), az izolált up- és down-gének számában 31-69-szeres növekedést tapasztalva a többi időponthoz képest ebben az időpontban. Ráadásul ez a csúcs rövid életű volt, mivel a második időpontban (12 hpi) csak néhány gén expressziója maradt szignifikánsan megváltozva. Érdekes módon a Boregine, amely szintén magas szintű rezisztenciát mutatott az oltványtesztben, a kísérlet során nem esett át ilyen masszív transzkripciós átprogramozáson. A differenciálisan expresszált gének (DEG) száma azonban azonos volt a Boregine és a 83A:476 esetében a 12 hpi-nél. Mind a Mandelup, mind a 22660-as populáció DEG csúcsokat mutatott az utolsó időpontban (48 l/s), ami a védekező válaszok relatív késleltetését jelzi.
Mivel a 83A:476 a C. lupini fertőzésre adott válaszként a 6. HPI-nél az összes többi vonalhoz képest jelentős transzkriptom-átprogramozáson ment keresztül, az ebben az időpontban megfigyelt differenciált gének (DEG) ~91%-a volt leszármazási vonal-specifikus (1. ábra). A vizsgálati vonalak korai válaszaiban azonban némi átfedés mutatkozott, mivel a Boregine, Mandelup és a 22660 populációban a DEG 68,5%, 50,9% és 52,6%-a átfedésben volt a 83A:476-ban bizonyos időpontokban talált értékekkel. Ezek a DEG-ek azonban a 83A:476 segítségével jelenleg detektált összes DEG-nek csak kis részét (0,97–1,70%) tették ki. Ezenkívül az összes vonalból 11 DEG volt koherens ebben az időpontban (S4-S6. kiegészítő táblázatok), beleértve a növényi védekező válaszok közös komponenseit: lipidtranszfer fehérje (TanjilG_32225), endoglükán-1,3-β-glükozid enzim (TanjilG_23384), két stresszindukálható fehérje, mint például a SAM22 (TanjilG_31528 és TanjilG_31531), bázikus latex fehérje (TanjilG_32352), és két glicinben gazdag szerkezeti sejtfalfehérje (TanjilG_19701 és TanjilG_19702). Viszonylag nagy átfedés volt megfigyelhető a transzkriptom válaszokban a 83A:476 és a Boregine között 24 HPI-nél (összesen 16-38% DEG), valamint a Mandelup és a 22660 populáció között 48 HPI-nél (összesen 14-20% DEG).
A Venn-diagram a Colletotrichum lupinivel (Col-08 törzs, Wierzhenice, Lengyelország, 1999 csillagfürtföldjeiről) beoltott keskenylevelű csillagfürt (NLL) vonalakban a differenciálisan expresszált gének (DEG) számát mutatja. Az elemzett NLL vonalak a következők voltak: 83A:476 (rezisztens, Lanr1 allélt hordoz), Boregine (rezisztens, genetikai háttér ismeretlen), Mandelup (mérsékelten rezisztens, AnMan allélt hordoz) és 22660 populáció (nagyon fogékony). A hpi rövidítés a vakcináció utáni órákat jelenti. A grafikon egyszerűsítése érdekében a nulla értékeket eltávolítottuk.
A 6 hpi-nél túlexpresszált gének halmazát kanonikus R géndomének jelenlétére elemezték (S7. kiegészítő táblázat). Ez a tanulmány klasszikus betegségrezisztencia-gének transzkriptom indukcióját mutatta ki, amelyek csak NBS-LRR doméneket tartalmaztak a 83A:476 pozícióban. Ez a halmaz egy TIR-NBS-LRR gént (tanjilg_05042), öt CC-NBS-LRR gént (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 és tanjilg_16162), valamint négy NBS-LR (Tanjilg_16162) és négy NBS-LRRE (tanjilg_16162), továbbá négy NBS-Lrr (tanjilg_16162) és négy NBS-LRR (TANJILG_16162) gént tartalmazott. Mindezen gének kanonikus doméneket tartalmaznak konzervált szekvenciákba rendeződve. Az NBS-LRR doméngéneken kívül számos RLL kináz aktiválódott 6 hpi-nél, nevezetesen egy Boregine-ben (TanjilG_19877), kettő Mandelupban (TanjilG_07141 és TanjilG_19877) és a 22660-as populációban (TanjilG_09014 és TanjilG_10361), valamint kettő a 83A 27:476-ban.
A C. lupini-vel (Col-08 törzs) történő beoltásra adott válaszként szignifikánsan megváltozott expressziójú géneket gén ontológia (GO) dúsítási analízisnek vetettük alá (S8. kiegészítő táblázat). A leggyakrabban túlreprezentált biológiai folyamatkifejezés a „GO:0006952 védekező válasz” volt, amely 16 (idő × vonal) kombinációból 6-ban jelent meg nagy szignifikanciával (P-érték < 0,001) (2. ábra). A leggyakrabban túlreprezentált biológiai folyamatkifejezés a „GO:0006952 védekező válasz” volt, amely 16 (idő × vonal) kombinációból 6-ban jelent meg nagy szignifikanciával (P-érték < 0,001) (2. ábra). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный», откортоный» появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (2. pont). A leggyakrabban túlreprezentált biológiai folyamatkifejezés a „GO:0006952 védekező válasz” volt, amely a 16 (idő × leszármazási vonal) kombinációból 6-ban jelent meg nagy szignifikanciával (P-érték < 0,001) (2. ábra).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）. A biológiai folyamatra vonatkozó legreprezentatívabb kifejezés a „GO:0006952 védekező válasz”, amely a 16 (时间×线) kombinációból 6-ban jelenik meg, magas szignifikanciával (P-érték < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», копяры 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). A leggyakrabban túlreprezentált biológiai folyamatkifejezés a „GO:0006952 Védelmi Válasz” volt, amely 16 kombinációból 6-ban (idő × vonal) jelent meg nagy szignifikanciával (P-érték < 0,001) (2. ábra).Ez a kifejezés két időpontban is túlreprezentált volt a 83A populációban: a 476-ban és a Boregine-ben (6 és 24 hpi), valamint egy időpontban a Mandelupban és a 22660 populációban (12 és 6 hpi). Ez egy várható eredmény, amely rávilágít a rezisztens vonalak gombaellenes válaszára. Ezenkívül a 83A:476 a C. lupinire úgy reagált, hogy gyorsan indukálta a „GO:0055114 redox folyamat” kifejezés által képviselt oxidatív kitöréshez kapcsolódó géneket, ami egy specifikus védekező válaszra utal, míg a Boregine specifikus védekező válaszokat mutatott ki, amelyek a „GO” kifejezéshez kapcsolódtak. :0006950 Stresszválasz”. A 22660-as populáció aktiválta a másodlagos metabolitokat magában foglaló horizontális rezisztenciaválaszt, kiemelve a „GO:0016104 Triterpén bioszintézis folyamata” és a „GO:0006722 Triterpén anyagcsere folyamata” kifejezések túlzott számát (mindkét kifejezés ugyanahhoz a génkészlethez tartozik). A GO kifejezések dúsulási elemzésének eredményeit figyelembe véve a Mandelup reakció stabilitása a Boregine és a 22660-as populáció között volt. Ezenkívül a korai 83A:476 reakció (6 hpi) és a késleltetett Mandelup és a 22660-as populáció reakciói magukban foglalják a GO:0015979 „fotoszintézis” kifejezést és más kapcsolódó biológiai folyamatokat.
Az anthrax csillagfürttel (Col-08 törzs, melyet 1999-ben Wierzhenice-i (Lengyelország) csillagfürtföldekről nyertek) beoltott keskenylevelű csillagfürt (NLL) transzkriptomválaszai során eltérően expresszált gének annotációjában kiválasztott biofolyamat gén ontológiai kifejezések erősen eltúlzottak. Az elemzett NLL vonalak a következők voltak: 83A:476 (rezisztens, homozigóta Lanr1 allélt hordoz), Boregine (rezisztens, ismeretlen genetikai háttér), Mandelup (mérsékelten rezisztens, homozigóta AnMan allélt hordoz) és 22660 populáció (fogékony).
Mivel ez a tanulmány az antraknóz-rezisztenciához hozzájáruló gének azonosítását célozta, a GO „GO: 0006952 Védekező válaszok” és a „GO: 0055114 Redox folyamatok” kifejezésekhez rendelt géneket olyan határértékekkel elemezték, amelyek alapátlaga ≥ 30 volt, legalább egy vonallal × időpont, amely a log2 (szoros változás) statisztikailag szignifikáns értékeit kombinálta. A kritériumoknak megfelelő gének száma 65 volt a GO:0006952 és 524 a GO:0055114 esetében.
A 83A:476 két DEG csúcsot mutatott, amelyeket a GO:0006952 kifejezéssel jelöltek, az első 6 gén/hüvelyknél (64 gén, fel és le szabályozás), a második pedig 24 gén/hüvelyknél (15 gén, csak fel szabályozás). Boregine azt is kimutatta, hogy a GO:0006952 ugyanabban az időpontban tetőzött, de kevesebb DEG-gel (11 és 8) és preferenciális aktivációval. Mandeloop két GO:0006952 csúcsot mutatott 12 és 48 HPI-nél, mindkettő 12 gént hordozott (az első aktiváló génekkel, a második pedig csak szuppresszív génekkel), míg a 22660-as populációban 6 HPI-nél (13 gén) a növekedési csúcs dominanciája volt nagyobb. Meg kell jegyezni, hogy a GO:0006952 DEG-ek 96,4%-a ezekben a csúcsokban azonos típusú választ mutatott (fel vagy le), ami a védekező válaszok jelentős átfedését jelzi az érintett gének számának különbségei ellenére. A GO:0006952 kifejezéshez kapcsolódó szekvenciák legnagyobb csoportja a 22-es éhezési stresszhez kapcsolódó üzenetfehérjét (SAM22-szerű) kódolja, amely a 10-es osztályú patogenezishez kapcsolódó fehérje (PR-10) fehérjekládba és a latex magfehérjébe tartozik. A hasonló (MLP-szerű) fehérje) fehérje (3. ábra). A két csoport az expresszió jellegében és a válasz irányában különbözött. A SAM22-szerű fehérjéket kódoló gének konzisztens és szignifikáns indukciót mutattak a korai időpontokban (6 vagy 12 hpi), és általában nem reagáltak a kísérlet végén (48 hpi), míg az MLP-szerű fehérjék koordinációt mutattak 6 hpi-nél. A 83A:476 és a Mandelup esetében 48 hpi/in, szinte az összes többi adatpont nem reagált. Ezenkívül a SAM22-szerű fehérje gének expressziós profiljainak különbségei az antraknóz-rezisztencia megfigyelt változékonyságát követték, mivel a rezisztensebb vonalak több időpontban indukálták jelentősen ezeket a géneket, mint a fogékonyabb gének. Egy másik LlR18A/B-szerű PR-10 gén nagyon hasonló expressziós mintázatot mutatott, mint a SAM22-szerű fehérje génje.
Azonosították a „GO:0006952 Védelmi Válasz” biológiai folyamatkifejezés főbb összetevőit, valamint a Lanr1 és AnMan allélok jelöltgénjeinek expressziós mintázatait. A Log2 skála a beoltott (Colletotrichum lupini, Col-08 törzs, csillagfürtületekből, Wizhenica, Lengyelország, 1999) és a kontroll (álinokulált) növények közötti log2 értékeket (változás-szoros) jelenti ugyanabban az időpontban. A következő keskenylevelű csillagfürt vonalakat elemezték: 83A:476 (rezisztens, homozigóta Lanr1 allélt hordoz), Boregine (rezisztens, genetikai háttér ismeretlen), Mandelup (mérsékelten rezisztens, homozigóta AnMan allélt hordoz), és 22660 populáció (fogékony).
Ezenkívül a Lanr1 (TanjilG_05042) és az AnMan (TanjilG_12861) RNS-szekvenálási jelöltgének expressziós profiljait is kiértékelték (3. ábra). A TanjilG_05042 gén csak az első időpontban (6 hpi) mutatott szignifikáns választ (aktivációt) a 83A:476-nál, míg a TanjilG_12861 Mandeloopban csak két időpontban volt szignifikáns: 6 hpi (lefelé történő szabályozás) és 24 hpi (6 hpi). (Valójában.). állítható) ).
A GO:0055114 „redox folyamat” kifejezésben a leginkább túltermelt gének a citokróm P450 fehérjéket és a peroxidázt kódoló gének voltak (4. ábra). A 83A:476-ból 6 HPI-nél izolált minták esetében általában maximális vagy minimális log2 (fold change) értékeket figyeltek meg (a gének 86,6%-ánál) a beoltott és a kontroll növények között, ami kiemeli e genotípus magas válaszát az inokuláló ivarra. A 83A:476 mutatta a legjelentősebb GO:0055114 DEG-et 6 hpi-nél (503 gén), míg a többi vonal 48 hpi-nél (Boregine, 31 gén; Mandelup, 85 gén; és 22660-as populáció, 78 gén). A GO:0055114 család legtöbb génjében kétféle választ figyeltek meg a vakcinációra (aktiválás és gátlás). Érdekes módon a Mandelupe-ban 48 lóerős korban a GO:0055114 kifejezésre azonosított differenciálódott gének akár 97,6%-a is. Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a jelentősen kisebb lépték (azaz a mutált redox gének száma 85 vs. 503) ellenére a mandeloup antraknózra adott késleltetett transzkriptomválaszának mintázata hasonló a 83A:476 korai válaszához. A Boregine-ben és a 22660-as populációban ez a konvergencia alacsonyabb, 51,6%, illetve 75,6%.
A „GO:0055114 Redox folyamat” biológiai folyamat fő komponenseinek expressziós mintázatait vizsgálták. A Log2 skála a beoltott (Colletotrichum lupini, Col-08 törzs, csillagfürtületekből, Wizhenica, Lengyelország, 1999) és a kontroll (álinokulált) növények közötti log2 értékeket (változás-szorosát) jelenti ugyanabban az időpontban. A következő keskenylevelű csillagfürt vonalakat elemezték: 83A:476 (rezisztens, homozigóta Lanr1 allélt hordoz), Boregine (rezisztens, genetikai háttér ismeretlen), Mandelup (mérsékelten rezisztens, homozigóta AnMan allélt hordoz), és a 22660-as populáció (fogékony).
83A:476 A C. lupini (Col-08 törzs) inokulációra adott transzkriptomikai válaszok magukban foglalták a GO:0015979 „fotoszintézis” kifejezéshez és más kapcsolódó biológiai folyamatokhoz kapcsolódó gének koordinált elcsendesítését is (5. ÁBRA). Ez a GO:0015979 DEG készlet 105 gént tartalmazott, amelyek szignifikánsan represszálódtak 6 hpi-nél a 83A:476-nál. Ebben a részhalmazban 37 gén is leszabályozódott 48 hpi-nél Mandelupban, és 35 gén ugyanebben az időpontban a 22660-as populációban, beleértve 19 DEG-et, amelyek mindkét genotípusra közösek. A GO:0015979 kifejezéshez kapcsolódó DEG-ek egyike sem aktiválódott szignifikánsan semmilyen kombinációban (vonal x idő).
A „GO:0015979 Fotoszintézis” biológiai folyamat fő komponenseinek expressziós mintázatait vizsgálták. A Log2 skála a beoltott (Colletotrichum lupini, Col-08 törzs, csillagfürtületekből, Wizhenica, Lengyelország, 1999) és a kontroll (álinokulált) növények közötti log2 értékeket (változás-szorosát) jelenti ugyanabban az időpontban. A következő keskenylevelű csillagfürt vonalakat elemezték: 83A:476 (rezisztens, homozigóta Lanr1 allélt hordoz), Boregine (rezisztens, genetikai háttér ismeretlen), Mandelup (mérsékelten rezisztens, homozigóta AnMan allélt hordoz), és 22660 populáció (fogékony).
A differenciális expressziós analízis eredményei alapján, és feltehetően a patogén gombák elleni védekező válaszokban részt vevőként, ezt a hét génből álló készletet választottuk ki az expressziós profilok valós idejű PCR-rel történő kvantifikálására (S9. kiegészítő táblázat).
A feltételezett TanjilG_10657 fehérjegén szignifikánsan indukálódott az összes vizsgált vonalban és időpontban a kontroll (utánzó) növényekhez képest (S10., S11. kiegészítő táblázatok). Ezenkívül a TanjilG_10657 expressziós profilja növekvő tendenciát mutatott a kísérlet során minden vonal esetében. A 22660-as populáció mutatta a TanjilG_10657 legnagyobb érzékenységét az inokulációra, 114-szeres aktiválással és a legmagasabb relatív expressziós szinttel (4,4 ± 0,4) a 24 HPI-nél (6a. ábra). A PR10 LlR18A fehérjegén, a TanjilG_27015 szintén aktivációt mutatott az összes vonalban és időpontban, a legtöbb adatpontban statisztikailag szignifikánsan (6b. ábra). A TanjilG_10657-hez hasonlóan a TanjilG_27015 legmagasabb relatív expressziós szintjét a 22660-as beoltott populációban figyelték meg a 24 HPI-nél (19,5 ± 2,4). A TanjilG_04706 savas endokitináz gén expressziója szignifikánsan megnövekedett minden vonalban és minden időpontban, kivéve a Boregine 6 hpi-t (6c. ábra). Az első időpontban (6 HPI) a 83A:476-nál erősen indukálódott (10,5-szeresére), és a többi vonalakban mérsékelten megnőtt (6,6-7,5-szeresére). A kísérlet során a TanjilG_04706 expressziója hasonló szinten maradt a 83A:476-ban és a Boregine-ben, míg a Mandelupban és a 22660-as populációban szignifikánsan megnőtt, viszonylag magas értékeket elérve (5,9 ± 1,5, illetve 6,2 ± 1,5). Az endoglükán-1,3-β-glükozidáz-szerű TanjilG_23384 gén magas aktivációt mutatott az első két időpontban (6 és 12 hpi) minden vonalban, kivéve a 22660-as populációt (6d. ábra). A TanjilG_23384 legmagasabb relatív expressziós szintjét a második időpontban (12 hpi) figyeltük meg Mandelupban (2,7 ± 0,3) és a 83A:476-ban (1,5 ± 0,1). A 24. HPI-nél a TanjilG_23384 expressziója viszonylag alacsony volt az összes vizsgált vonalban (0,04 ± 0,009 és 0,44 ± 0,12 között).
A kiválasztott gének (ag) expressziós profiljait kvantitatív PCR-rel vizsgáltuk. A 6-os, 12-es és 24-es számok a vakcináció utáni órákat jelölik. A LanDExH7 és LanTUB6 géneket normalizálásra, a LanTUB6 gént pedig sorozatok közötti kalibrációra használtuk. A hibasávok a három biológiai replikátum alapján számított standard deviációt jelölik, amelyek mindegyike három technikai replikátum átlaga. A beoltott (Colletotrichum lupini, Col-08 törzs, 1999-ben a lengyelországi Wierzenica csillagfürtföldjéről származtatva) és a kontroll (kontroll-inokulált) növények expressziós szintjei közötti különbségek statisztikai szignifikanciáját a fenti adatpontok jelölik (*P-érték < 0,05, **P-érték ≤ 0,01, ***P-érték ≤ 0,001). A beoltott (Colletotrichum lupini, Col-08 törzs, 1999-ben a lengyelországi Wierzenica csillagfürtföldjéről származtatva) és a kontroll (kontroll-inokulált) növények expressziós szintjei közötti különbségek statisztikai szignifikanciáját a fenti adatpontok jelölik (*P-érték < 0,05, **P-érték ≤ 0,01, ***P-érték ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штаменпо Col-08, 199 Col-08. с поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). A beoltott (Colletotrichum lupini, Col-08 törzs, 1999-ben egy wierzhenicei (Lengyelország) csillagfürtföldről származó) és a kontroll (álbeoltott) növények expressziós szintjei közötti statisztikailag szignifikáns különbségeket az adatpontok felett tüntettük fel (*P-érték < 0,05, **P-érték ≤ 0,01, ***P-érték ≤ 0,001).接种 (Colletotrichum Lupini, Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性伈标记在数) 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对煤 ）之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, **P ≤ 0,01,)***P.01 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штаменыный 08, Col-08 люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены намхи отмечены над значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). A beoltott (Colletotrichum lupini, Col-08 törzs, 1999-ben Verzhenice-i (Lengyelország) csillagfürtföldekről származó) és a kontroll (álbeoltott) növények expressziós szintjei közötti statisztikailag szignifikáns különbségeket az adatpontok felett tüntettük fel (*P-érték < 0,05, **P-érték ≤ 0,01, ***P-érték ≤ 0,001).Az elemzett NLL vonalak a következők voltak: 83A:476 (rezisztens, homozigóta Lanr1 allélt hordoz), Mandelup (mérsékelten rezisztens, homozigóta AnMan allélt hordoz), Boregine (rezisztens, ismeretlen genetikai háttér) és a 22660-as populáció (érzékeny).
A Lanr1 lókuszon található TanjilG_05042 jelöltgén jelentősen eltérő expressziós mintázatot mutatott az RNS-szekvenálási vizsgálatokból kapott profilokhoz képest (6e. ábra). A gén jelentős aktivációját figyelték meg Mandelupban és a 22660-as populációban (akár 39,7-szeres, illetve 11,7-szeres), ami viszonylag magas expressziós szinteket eredményezett (akár 1,4 ± 0,14-szeres, illetve 7,2 ± 1,3-szoros). A 83A:476 jelű tanulmány a TanjilG_05042 gén bizonyos mértékű felregulációját is kimutatta (akár 3,8-szoros), azonban az elért relatív expressziós szintek (0,044 ± 0,002) több mint 30-szor alacsonyabbak voltak, mint a Mandelupban és a 22660-as populációban megfigyeltek. A qPCR-rel elemzett eredmények szignifikáns különbségeket mutattak az expressziós szintek között a kontroll-vakcinázott (kontroll) variánsok genotípusai között, 58-szoros különbséget elérve a 22660 és 83A:476 populációk, valamint a 22660 és 22660 populációk között. Kétszeres különbséget értek el a Boregine és a Mandalup között.
Az AnMan lókuszon található TanjilG_12861 jelöltgén a 83A:476 és a Mandelup törzsekben vakcinációra adott válaszként aktiválódott, a 22660-as populációban semleges volt, a Boregine-ben pedig leszabályozottnak bizonyult (6f. ábra). A TanjilG_12861 gén relatív expressziója a beoltott 83A:476 törzsben volt a legmagasabb (0,14±0,01). A 17,4 kDa molekulatömegű I. osztályú hősokkfehérje gén, a TanjilG_05080 HSP17.4 alacsonyabb relatív expressziós szintet mutatott az összes vizsgált törzsben és időpontban (6g. ábra). A legmagasabb értéket a 22660-as populációban a 24. HPI-nél figyelték meg (0,14 ± 0,02, ami nyolcszoros növekedést jelent a vakcinációra adott válaszban).
A génexpressziós profilok összehasonlítása (7. ábra) magas korrelációt mutatott a TanjilG_10657 és négy másik gén között: a TanjilG_27015 (r = 0,89), a TanjilG_05080 (r = 0,85), a TanjilG_05042 (r = 0,80) és a TanjilG_04706 (r = 0,79). Az ilyen eredmények e gének koregulációjára utalhatnak a védekező válaszok során. A TanjilG_12861 és a TanjilG_23384 gének eltérő expressziós profilokat mutattak, alacsonyabb Pearson-korrelációs együttható értékekkel (0,08 és 0,43, illetve -0,19 és 0,28 között) a többi génhez képest.
A génexpressziós profilok közötti korrelációkat kvantitatív PCR-rel vizsgáltuk. A következő keskenylevelű csillagfürt vonalakat elemeztük: 83A:476 (rezisztens, homozigóta Lanr1 allélt hordoz), Mandelup (mérsékelten rezisztens, homozigóta AnMan allélt hordoz), Boregine (rezisztens, genetikai háttér ismeretlen), és 22660 populáció (fogékony). Három időpontot számítottunk ki (6, 12 és 24 órával a beoltás után), beleértve a beoltott (Colletotrichum lupini, Col-08 törzs, 1999-ben Wierzhenice-i (Lengyelország) csillagfürtföldekről nyerve) és a kontroll (álbeoltott) növényeket. A skála a Pearson-féle korrelációs együttható értékét mutatja.
A 6 lóerő/hüvelyk mellett kapott adatok alapján WGCNA-t végeztek a 9981 DEG törzsön, melyet a beoltott és a kontroll növények összehasonlításával azonosítottak, a korai védekező válaszokra összpontosítva (S12. kiegészítő táblázat). Huszonkét génmodult (klasztert) találtak, amelyek korreláltak (pozitív vagy negatív) expressziós profillal a genotípusok és a kísérleti variánsok között. A génexpressziós szintek átlagosan csökkenő sorrendben alakultak 83A:476 > Mandelup > Boregine > 22660 populáció szerint (mindkét változatban ez a tendencia erősebb volt a kontroll növényekben). A génexpressziós szintek átlagosan csökkenő sorrendben alakultak 83A:476 > Mandelup > Boregine > 22660 populáció szerint (mindkét változatban ez a tendencia erősebb volt a kontroll növényekben). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > 22660 lakos была сильнее у контрольных растений). A génexpressziós szintek átlagosan a 83A:476 > Mandelup > Boregine > 22660 populáció sorrendben csökkentek (mindkét változatban azonban ez a tendencia erősebb volt a kontroll növényekben).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Népesség 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> népessége 22660 的 顺序 下降 （Ｇ 在在 在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。. В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Népesség: 22660 сильнее у контрольных растений). Átlagosan a génexpressziós szintek csökkentek a 83A:476 > Mandelup > Boregine > 22660 populációban (azonban mindkét változatban ez a tendencia erősebb volt a kontroll növényekben).A vakcináció a génexpresszió felregulációját eredményezte, különösen a 18., 19., 14., 6. és 1. modulokban (csökkenő hatás sorrendben), negatív szabályozással (pl. 9. és 20. modul) vagy semleges hatásokkal (pl. 11., 22., 8. és 13. modul). A GO kifejezések dúsulási elemzése (S13. kiegészítő táblázat) a beoltott modul (18) esetében a „GO: 0006952 védőválaszokat” mutatta ki maximális aktivációval, beleértve a qPCR-rel elemzett géneket (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 és TanjilG_27015), valamint számos, a leginkább elnyomott fotoszintézis modult (9). A 18-as modul koncentrátorát (8. ábra) a PR-10-szerű LlR18B fehérjét kódoló TanjilG_26536 génként, a 9-es modul koncentrátorát pedig a fotoszisztéma II PsbQ fehérjét kódoló TanjilG_28955 génként azonosították. Az antracnóz rezisztencia Lanr1 génjelöltjét, a TanjilG_05042-t a 22-es modulban találták (9. ábra), amely a „GO:0044260 Cellular macromolecular metabolic processes” és a „GO:0006355 Transcriptional regulation, DNS templating” kifejezésekhez kapcsolódik, és a TanjilG_01212 hubot hordozza. A gén a hőstressz transzkripciós faktor A-4a-t (HSFA4a) kódolja.
Súlyozott hálózati elemzés a „GO: 0006952 Védelmi válaszok” biológiai folyamatkifejezéseket tartalmazó modulok génkoexpressziójáról. A ligálást egyszerűsítettük, hogy kiemeljük a qPCR által elemzett négy gént (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 és TanjilG_27015).
Súlyozott hálózati analízis egy túlreprezentált biológiai folyamatkifejezést tartalmazó „GO: 0006355: Transzkripciós szabályozás, DNS-templát” tartalmazó modul gén-koexpressziójáról, amely egy Lanr1 TanjilG_05042 antraknóz rezisztencia gén jelöltjét hordozza. A ligációt egyszerűsítettük a TanjilG_05042 gén és a központi TanjilG_01212 gén izolálásához.
Az Ausztráliában végzett antraknóz-rezisztencia-szűrés kimutatta, hogy a korán kibocsátott fajták többsége fogékony volt; a Kalya, Coromup és Mandelup fajtákat mérsékelten rezisztensnek, míg a Wonga, Tanjil és 83A:476 fajtákat erősen rezisztensnek26,27,31 írták le. ugyanazzal a rezisztencia-alléllal, amelyet Lanr1-nek neveztek el, a Coromup és Mandelup pedig egy másik alléllal, az AnMan10,26,39-cel rendelkezett, míg a Kalya egy másik allélt, a Lanr2-t örökítette tovább. Az antraknóz-rezisztencia Németországban végzett szűrése eredményeként azonosították a Bo7212 rezisztens vonalat, amelynek a Lanr1-től eltérő jelölt allélja volt, amelyet LanrBo36-nak neveztek el.
Tanulmányunk a Lanr1 allél nagyon alacsony gyakoriságát (kb. 6%) mutatta ki a vizsgált csíraplazmában. Ez a megfigyelés összhangban van a kelet-európai csíraplazma Anseq3 és Anseq4 markerekkel végzett szűrésének eredményeivel, amelyek azt mutatták, hogy a Lanr1 allél csak két fehérorosz vonalban van jelen. Ez arra utal, hogy a Lanr1 allélt még nem használják széles körben a helyi nemesítési programok, ellentétben Ausztráliával, ahol ez az egyik kulcsfontosságú allél a marker-asszisztált nemesítésben. Ez annak tudható be, hogy a Lanr1 allél alacsonyabb rezisztenciaszintet biztosít európai terepi körülmények között az ausztrál jelentéshez képest. Ezenkívül az antraknózisról Ausztráliában a magas csapadékmennyiségű területeken végzett vizsgálatok kimutatták, hogy a Lanr1 allél által közvetített rezisztenciaválaszok nem biztos, hogy hatékonyak olyan időjárási körülmények között, amelyek kedveznek a kórokozó növekedésének és gyors fejlődésének19,42. Valójában a jelen vizsgálatban az antraknózis egyes tüneteit a Lanr1 allélt hordozó genotípusokban is megfigyelték, ami arra utal, hogy a rezisztencia eltűnhet a C. lupini fejlődéséhez optimális körülmények között. Ezenkívül az Anseq3 és Anseq4 markerek jelenlétének álpozitív értelmezése is lehetséges, amelyek körülbelül 1 cM-ra vannak a Lanr1 lókusztól [28,30,43].
Tanulmányunk kimutatta, hogy a Lanr1 allélt hordozó 83A:476 törzs nagymértékű transzkriptom-átprogramozással reagált a C. lupini oltásra az első elemzett időpontban (6 hpi), míg az AnMan allélt hordozó Mandelupban a transzkriptomikus válaszokat sokkal később (24-48 hpi) figyelték meg. Ezek az időbeli eltérések a védekező válaszokban összefüggésben állnak a betegség tünetei közötti különbségekkel, kiemelve a korai kórokozó-felismerés fontosságát a rezisztenciára adott sikeres válasz szempontjából. A növényi szövetek megfertőzéséhez a lépfene spóráknak több fejlődési szakaszon kell keresztülmenniük a gazdaszervezet felszínén, beleértve a csírázást, a sejtosztódást és az appresszórium kialakulását. A függelék egy fertőző struktúra, amely a gazdaszervezet felszínéhez tapad, és elősegíti a behatolást a gazdaszervezet szöveteibe. Így a borsókivonatban található C. gloeosporioides spórák a sejtmag első osztódását 75-90 perc inkubáció után, a csíratömlő kialakulását 90-120 perc után, a szuppressziót pedig 4 óra elteltével mutatták. A mangó C. gloeosporioides több mint 40%-os konídiumcsírázást mutatott 3 óra inkubáció után, és körülbelül 20%-os appresszorképződést 4 óra után. A C. gloeosporioides virulenciához kapcsolódó CAP20 génje transzkripciós aktivitást mutatott az epifitonképző konídiumokban 3,5 órás inkubáció után avokádó felszíni viaszban, magas CAP20 fehérjekoncentráció mellett, 4 óra 46 perc elteltével. Hasonlóképpen, a melanin bioszintézis gének aktivitása a C. trifolii-ban 2 órás inkubáció alatt indukálódott, majd 1 óra elteltével appresszórium alakult ki. A levélszövetek vizsgálata kimutatták, hogy a C. acutatummal beoltott szamóca 8 óra múlva, míg a C. coccodes-szal beoltott paradicsom 4 óra múlva mutatja az első szupressziót48,49. Ez nagyrészt összhangban van a Colletotrichum spp. fertőző folyamatának időskálájával. A 83A:476-ra adott gyors védekező válaszok a növényi rezisztencia és az effektor által kiváltott immunitás (ETI) gének szerepére utalnak ebben a sejtvonalban, míg Mandelup késleltetett válaszai a mikro-asszociált molekuláris mintázat által kiváltott immunitás (MTI) hipotézist támasztják alá 50. Korai válaszok a 83A:476-ra és Mandelupra. A késleltetett válaszban a fel- vagy leszabályozott gének részleges átfedése is ezt a koncepciót támasztja alá, mivel az ETI-t gyakran egy gyorsított és fokozott MTI-válasznak tekintik, amely a fertőzés helyén programozott sejthalálhoz vezet, amit anafilaxiás sokknak neveznek 51,52.
A túlreprezentált Gene Ontology GO:0006952 „Védelmi válasz” kifejezéshez rendelt gének többsége a stressz által kiváltott böjtölés üzenet 22 fehérje (hasonló a SAM22-höz) 11 homológja és a hét fő latexfehérje-szerű (MLP) gén. A SAM22-szerű fehérjék, a 31, 34, 43 és 423, szekvencia-hasonlóságot mutattak. A SAM22-szerű gének jelentős, hosszabb ideig tartó aktivációt mutattak, ami az antraknóz-rezisztencia fokozott szintjét mutatta (83A:476 és Boregine). Az MLP-szerű gének azonban csak a jelölt rezisztencia allélt hordozó vonalakban voltak leszabályozva (83A:476/Lanr1 6 hpi-nél és Mandelup/AnMan 24 hpi-nél). Meg kell jegyezni, hogy az összes azonosított SAM22-szerű homológ egy körülbelül 105 kb-os génklaszterből származik, míg az MLP-szerű gének a genom különálló régióiból származnak. Az ilyen SAM22-szerű gének koordinált aktivációját egy korábbi, Diaporthetoxica oltással szembeni NLL-rezisztenciát vizsgáló tanulmányunkban is megfigyeltük, ami arra utal, hogy ezek a gének a védekező válasz horizontális komponenseiben vesznek részt. Ezt a következtetést alátámasztják azok a beszámolók is, amelyek szerint a SAM22-szerű gének pozitívan reagálnak sérülésre vagy szalicilsavval, gombainerekkel vagy hidrogén-peroxiddal történő kezelésre.
Kimutatták, hogy az MLP-szerű gének reagálnak különféle abiotikus és biotikus stresszekre, beleértve a bakteriális, vírusos és patogén gombafertőzéseket számos növényfajban55. A növények és kórokozók közötti bizonyos kölcsönhatásokra adott válaszok iránya az erős emelkedéstől (pl. a gyapot Verticillium dahliae fertőzése során) a jelentős csökkenésig (pl. az almafa Alternaria spp. fertőzése után)56,57 terjedt. Az MLP-szerű 423 gén jelentős csökkenését figyelték meg az avokádó F. niger fertőzéssel szembeni védekezése során, valamint az almafa fertőzése során. A Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola és az Alternaria alternata almapatotípusok58,59. Ezenkívül az MLP-szerű 423 gént túltermelő almakalluszok alacsonyabb expressziót mutattak a rezisztenciával kapcsolatos gének esetében, és fogékonyabbak voltak a gombás fertőzésekre59. A Fusarium oxysporum f után az MLP-szerű 423 gén szintén elnyomódott a rezisztens közönséges bab csíraplazmájában. cn. Babfertőzés 60.
Az RNS-szekvenálási tanulmányunkban azonosított PR-10 család további tagjai az LlR18A és LlR18B gének voltak a felszabályozásra adott válaszként, valamint a DIR1 lipidtranszferfehérje felszabályozott (1 gén) vagy leszabályozott (3 gén) génje. Ezenkívül a WGCNA kiemeli az LlR18B gént, mint a modul központi elemét, amely nagyon fogékony a vakcinázásra, és számos védőválasz gént hordoz. Az LlR18A és LlR18B géneket sárga csillagfürt levelekben indukálták patogén baktériumokra adott válaszként, valamint NLL szárakban D. toxica beoltás után, míg ezen gének rizs homológját, az RSOsPR10-et, gyorsan indukálta egy gombás fertőzés, amely feltehetően a jázmonsav jelátviteli útvonalban vesz részt53,61, 62. A DIR1 gén nem specifikus lipidtranszportfehérjéket kódol, amelyek szükségesek a szisztémás szerzett rezisztencia (SAR) kialakulásához. A védőreakciók kialakulásával a DIR1 fehérje a fertőzés gócpontjából a háncson keresztül transzportálódik, hogy SAR-t indukáljon távoli szervekben. Érdekes módon a TanjilG_02313 DIR1 gén az első időpontban szignifikánsan indukálódott a 84A:476 vonalakban és a 22660 populációban, de az antraknóz-rezisztencia csak a 84A:476 vonalban fejlődött ki sikeresen. Ez a DIR1 gén bizonyos mértékű szubfunkcionalizálódására utalhat az NLL-ben, mivel a fennmaradó három homológ csak a 83A:476 vonalban reagált az oltásra 6 órakor, és ez a válasz lefelé irányult.
Tanulmányunkban a „GO:0055114 Redox folyamat” elnevezésű biológiai folyamatnak megfelelő leggyakoribb komponensek a citokróm P450 fehérje, a peroxidáz, a linolsav 9S-/13S-lipoxigenáz és az 1-aminociklopropán-1-karbonsav-oxidáz voltak. Ezenkívül a WGCNA-nk a HSFA4a homológot egy olyan modulokat hordozó központként definiálja, mint például a Lanr1 rezisztencia génjelöltje, a TanjilG_05042. A HSFA4a a növények nukleáris transzkripciójának redox-függő szabályozásának komponense.
A citokróm P450 fehérjék oxidoreduktázok, amelyek katalizálják a NADPH és/vagy O2-függő hidroxilációs reakciókat az elsődleges és másodlagos anyagcserében, beleértve a xenobiotikumok, valamint a hormonok, zsírsavak, szterinek, sejtfalkomponensek, biopolimerek és a védő vegyületek bioszintézisének anyagcseréjét 69. Egy tanulmányunkban a növényi citokróm P450 funkció variabilitása -10,6 log2-ről (szoros változás) 5,7-re csökkent a nagyszámú megváltozott homológ (37) és az egyes gének közötti válaszminták közötti különbségek miatt, ami felfelé irányuló revíziót tükröz. Kizárólag RNS-szekvenálási adatok felhasználása az NLL gének feltételezett biológiai funkciójának tisztázására egy ilyen nagy fehérje szupercsaládban erősen spekulatív lenne. Érdemes azonban megjegyezni, hogy egyes citokróm P450 gén a kórokozó gombákkal vagy baktériumokkal szembeni fokozott rezisztenciával jár, beleértve az allergiás reakciókhoz való hozzájárulást is 69,70,71.
A III. osztályú peroxidázok multifunkcionális növényi enzimek, amelyek a növények növekedése és fejlődése során számos anyagcsere-folyamatban részt vesznek, valamint válaszul olyan környezeti stresszekre, mint a sótartalom, a szárazság, a magas fényintenzitás és a kórokozók támadására72. A peroxidázok számos növényfaj és az Anthracis kölcsönhatásában vesznek részt, beleértve a Stylosanthes humilis és a C. gloeosporioides, a Lens culinaris és a C. truncatum, a Phaseolus vulgaris és a C. lindemuthianum, a Cucumis sativus és a C. lagenarium73,74,75,76 növényeket. A válasz nagyon gyors, néha akár 4 HPI-nél is, mielőtt a gomba behatolna a növényi szövetbe73. A peroxidáz gén a D. toxica NLL beoltására is reagált. Az oxidatív robbanás szabályozására vagy az oxidatív stressz kiküszöbölésére szolgáló tipikus funkcióik mellett a peroxidázok fizikai akadályokat hozhatnak létre a sejtfal megerősítése alapján a lignifikáció, az alegységek vagy a specifikus vegyületek térhálósodása során. Ez a funkció in silico a feltételezett ligninképző anion-peroxidázt kódoló TanjilG_03329 génnek tulajdonítható, amelynek expressziója szignifikánsan megnövekedett a mi vizsgálatunkban a 83A:476 rezisztens vonalban 6 HPI-nél, de más törzsekben és időpontokban nem, amelyek nem reagáltak.
A linolsav 9S-/13S-lipoxigenáza az első lépés a lipidbioszintézis oxidatív útvonalán78. Ennek az útvonalnak a termékei több funkciót is betöltenek a növényvédelemben, beleértve a sejtfal erősítését kallóz- és pektinlerakódások képződésén keresztül, valamint az oxidatív stressz szabályozását reaktív oxigénfajták termelésén keresztül79,80,81,82,83. Jelen vizsgálatban a linolsav 9S-/13S-lipoxigenáz expressziója minden törzsben megváltozott, de a fogékony 22660 populációban a felülszabályozás érvényesült különböző időpontokban, míg a rezisztens Lanr1-et és az AnMan allélt hordozó törzsekben az oxilipin réteg diverzifikációját hangsúlyozza a védő lépfene-reakciókban ezen genotípusok között.
Az 1-aminociklopropán-1-karboxilát-oxidáz (ACO) homológ expressziója szignifikánsan felerősödött (9 gén) vagy lecsökkent (2 gén) csillagfürttel történő beoltás esetén. Két kivételtől eltekintve mindezek a válaszreakciók 6 lóerős korban, 83A:476-nál jelentkeztek. Az ACO fehérjék által közvetített enzimatikus reakció a sebességmeghatározó lépés az etiléntermelésben, ezért erősen szabályozott84. Az etilén egy növényi hormon, amely számos szerepet játszik a növények fejlődésének szabályozásában és az abiotikus és biotikus stressz körülményekre adott válaszában. Az ACO transzkripció indukciója és az etilén jelátviteli útvonal aktiválása szerepet játszik a rizs hemibiotróf oryzae gombával szembeni rezisztenciájának növelésében a reaktív oxigénfajták és fitoalexinek termelésének szabályozásával. Egy nagyon hasonló levélfertőzéses folyamat, amelyet az M. oryzae és a C. lupini között találtak88,89, a 83A:476 vonalban az ACO homológok jelentős felregulációja mellett, amiről ebben a tanulmányban számoltak be, megváltoztatja az NLL antracnóz etilénnel szembeni rezisztencia átadásának lehetőségét, ami a molekuláris útvonalak központi jelátviteli lépése.
Jelen tanulmányban a fotoszintézissel kapcsolatos számos gén nagymértékű elnyomását figyelték meg 6 hpi-nél a 83A:476 populációban, valamint 48 hpi-nél a Mandeloop és a 22660 populációban. Ezen változások mértéke és progressziója arányos a szinttel. Ebben a kísérletben antracnóz-rezisztenciát figyeltek meg. Nemrégiben a fotoszintézissel kapcsolatos transzkriptumok erős és korai repressziójáról számoltak be számos növény-kórokozó interakciós modellben, beleértve a patogén baktériumokat és gombákat is. A fotoszintézissel kapcsolatos gének fertőzésre adott válaszként történő gyors (egyes interakciókban 2 HPI-től kezdődő) és globális elnyomása kiválthatja a növényi immunitást a reaktív oxigénfajták telepítése és a szalicilsav-útvonallal való kölcsönhatásuk alapján, allergiás reakciók közvetítése érdekében [90,94].
Összefoglalva, a legrezisztensebb leszármazási vonal (83A:476) esetében javasolt védekező válaszmechanizmusok közé tartozik a gyors kórokozó-felismerés az R gén által (feltehetően TIR-NBS-LRR TanjilG_05042), valamint az allergiás válasz által közvetített szalicilsav és etilén jelátvitel, amelyet a hosszú hatótávolságú SAR kialakulása követ. A hatást a DIR-1 fehérje támogatja. Meg kell jegyezni, hogy a C. lupini fertőzés biotróf periódusa nagyon rövid (körülbelül 2 nap), amelyet nekrotikus növekedés követ95. Ezen szakaszok közötti átmenet összefüggésben lehet a nekrózissal és az etilén által indukálható fehérjék expressziójával, amelyek a gazdanövényekben túlérzékenységi reakciókat váltanak ki. Ezért a C. lupini biotróf stádiumban történő sikeres befogásának időablaka nagyon szűk. A redoxszal és fotoszintézissel kapcsolatos gének átprogramozása, amelyet a 83A:476-ban 6 hpi-nál megfigyeltek, összhangban van a gombahifák progressziójával, és a biotróf stádiumban kialakuló sikeres védőválasz kialakulását jelzi. A Mandelup és a 22660-as populáció transzkriptomikai válaszai túl későiek lehetnek ahhoz, hogy a gombát a nekrotikus növekedés felé való átállás előtt befogják, azonban a Mandelup hatékonyabb lehet, mint a 22660-as populáció, mivel a PR-10 fehérje viszonylag gyors szabályozása horizontális rezisztenciát elősegít.
A kanonikus R gén által vezérelt ETI egy gyakori mechanizmusnak tűnik a bab antraknóz-rezisztenciájában. Így a Medicago truncatula modellnövényben az antraknóz-rezisztenciát az RCT1 gén biztosítja, amely a TIR-NBS-LRR97 növényi R génosztály tagja. Ez a gén széles spektrumú antraknóz-rezisztenciát biztosít a lucernában is, ha érzékeny növényekbe viszik át. A közönséges babban (P. vulgaris) a mai napig több mint két tucat antraknóz-rezisztencia gént azonosítottak. Ezen gének némelyike ​​olyan régiókban található, ahol nincsenek kanonikus R génjei, azonban sok más gén az NBS-LRR génklasztert hordozó kromoszómák szélein található, beleértve a TIR-NBS-LRR99-et is. A genomszintű SSR-vizsgálat megerősítette az NBS-LRR gén és az antraknóz-rezisztencia közötti összefüggést a közönséges babban. A kanonikus R gént a fehér csillagfürt 101 fő antraknóz-rezisztencia lókuszát hordozó genomiális régióban is megtalálták.
Munkánk azt mutatja, hogy a növényfertőzés korai szakaszában (lehetőleg legkésőbb 12 hpi-n) aktiválódó azonnali rezisztenciareakció hatékonyan védi a keskenylevelű csillagfürtöt a kórokozó Colletrichum lupini gomba által okozott antraknózistól. Nagy áteresztőképességű szekvenálás segítségével kimutattuk az antraknózis-rezisztenciagének eltérő expressziós profiljait az NLL növényekben, amelyeket a Lanr1 és AnMan rezisztenciagének közvetítenek. A sikeres védekezés magában foglalja a redoxban, fotoszintézisben és patogenezisben részt vevő fehérjék génjeinek gondos megtervezését a növény kórokozóval való első érintkezését követő órákon belül. Hasonló védőreakciók, de időben késleltetve, sokkal kevésbé hatékonyak a növények betegségek elleni védelmében. A Lanr1 gén által közvetített lépfene-rezisztencia hasonlít az R gén tipikus gyors válaszára (effektor által kiváltott immunitás), míg az AnMan gén valószínűleg horizontális választ biztosít (mikroba-asszociált molekuláris minta által kiváltott immunitás), mérsékelt fenntarthatósági szintet biztosítva.
Az antraknóz markerek szűrésére használt 215 NLL vonal 74 fajtából, 60 keresztezéssel vagy nemesítéssel kapott vonalból, 5 mutánsból és 76 vad vagy eredeti csíraplazmából állt. A vonalak 17 országból származtak, főként Lengyelországból (58), Spanyolországból (47), Németországból (27), Ausztráliából (26), Oroszországból (19), Fehéroroszországból (7), Olaszországból (5) és további 10 országból származó vonalakból. A készlet referenciaként rezisztens vonalakat is tartalmaz: 83A:476, Tanjil, a Lanr1 allélt hordozó Wonga és az AnMan allélt hordozó Mandelup. A vonalakat a Poznań Plant Breeding Ltd. (Wiatrowo, Lengyelország) által fenntartott Európai Csillagfürt Genetikai Erőforrás Adatbázisból szereztük be (S1. kiegészítő táblázat).
A növényeket kontrollált körülmények között nevelték (16 órás fotoperiódus, 25°C nappali és 18°C ​​éjszakai hőmérséklet). Két biológiai replikátumot elemeztek. A DNS-t háromhetes levelekből izolálták a DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Németország) segítségével a protokoll szerint. Az izolált DNS minőségét és koncentrációját spektrofotometriás módszerekkel (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) értékelték. Az antraknóz rezisztencia gént, az AnMan-t (a Mandelup fajta eredetű) jelző AnManM1 markert, valamint a Lanr1 gént (a Tanjil fajta eredetű) szegélyező Anseq3 és Anseq4 markereket elemezték 11,26,28. A rezisztens allélre homozigótákat „1”, a fogékonyakat „0”, a heterozigótákat pedig 0,5 ponttal értékelték.
Az AnManM1, AnSeq3 és AnSeq4 markerek szűrésének eredményei, valamint a végső nyomon követési kísérletekhez szükséges magvak elérhetősége alapján 50 NLL vonalat választottak ki antraknóz rezisztencia fenotípus-meghatározáshoz. Az elemzést duplikáltan végezték számítógéppel vezérelt üvegházban, 14 órás fotoperiódussal, 22°C nappal és 19°C éjszakai hőmérséklet-tartományban. A magokat vetés előtt megkarcolják (egy éles pengével levágják a maghéjat az embrió másik oldalán), hogy megakadályozzák a magok túl kemény maghéj miatti nyugalmi állapotát, és biztosítsák az egyenletes csírázást. A növényeket cserepekben (11 × 11 × 21 cm) nevelték steril talajban (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsó, Lengyelország). A beoltást a Colletotrichum lupini Col-08 törzzsel végeztük, amelyet 1999-ben termesztettek keskenylevelű csillagfürt növények szárából a Nagy-Lengyelországban, Verzhenitsa (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E) egyik szántóföldjén. Vegyük ki a területet. Az izolátumokat SNA táptalajon tenyésztettük 20°C-on, fekete fény alatt 21 napig a sporuláció kiváltása érdekében. Négy héttel a vetés után, amikor a növények elérték a 4-6 leveles állapotot, a beoltást 0,5 x 106 konídium/ml koncentrációjú konídium-szuszpenzióval történő permetezéssel végeztük. A beoltás után a növényeket 24 órán át sötétben tartottuk, körülbelül 98%-os páratartalom mellett és 25°C-on, a konídiumok csírázásának és a fertőzési folyamatnak a elősegítése érdekében. A növényeket ezután 14 órás fotoperiódus alatt, 22°C nappal/19°C éjszaka és 70%-os páratartalom mellett neveltük. A betegség pontszámát a beoltás után 22 nappal határoztuk meg, és 0-tól (immunis) 9-ig (nagyon fogékony) terjedt, a szárakon és leveleken található nekrotikus léziók jelenlététől vagy hiányától függően. Ezenkívül a pontozás után megmértük a növények súlyát. A marker genotípusok és a betegség fenotípusok közötti összefüggéseket pont-két szekvencia korrelációként számítottuk ki (heterozigóta markerek hiánya az antraknóz rezisztencia fenotípus elemzéséhez használt vonalakban).