Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com oldalt.Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik.A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben).Addig is a folyamatos támogatás érdekében a webhelyet stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg.
Az Angustifolius csillagfürt (NLL, Lupinus angustifolius L.) élelmiszertermelésre és talajjavításra használt hüvelyes növény.Az NLL mint növénykultúra globális elterjedése számos patogén gombát vonzott, köztük a csillagfürt antracnózt, amely a pusztító antracnózis betegséget okozza.Két allélt, a Lanr1-et és az AnMan-t, amelyek fokozott rezisztenciát biztosítanak, használtak az NLL-tenyésztésben, de a mögöttes molekuláris mechanizmusok ismeretlenek.Ebben a vizsgálatban a Lanr1 és AnMan markereket használtuk az európai NLL minták szűrésére.A vakcina ellenőrzött környezetben végzett tesztelése megerősítette mindkét rezisztens donor hatékonyságát.A differenciális génexpressziós profilt reprezentatív rezisztens és fogékony vonalakon végeztük.Az antracnóz rezisztenciát a „GO:0006952 Defense Response”, „GO:0055114 Redox Process” és „GO:0015979 Photosynthesis” génontológiai kifejezések túlzott expressziójával hozták összefüggésbe.Ezenkívül a Lanr1(83A:476) vonal jelentős transzkriptum-átprogramozást mutatott gyorsan az oltás után, míg a többi vonal körülbelül 42 órás késést mutatott ebben a válaszban.A védekezési válaszok a TIR-NBS, CC-NBS-LRR és NBS-LRR génekhez, a patogenezisben részt vevő 10 fehérjéhez, lipidtranszfer fehérjékhez, endoglükán-1,3-β-glükozidázhoz, glicinben gazdag sejtfalfehérjékhez és az oxigén reaktív útjából származó génekhez kapcsolódnak.A 83A:476-ra adott korai válaszok, beleértve a fotoszintézissel kapcsolatos gének gondos elnyomását, egybeestek a gombabiológia vegetatív növekedési szakaszában a sikeres védekezéssel, ami arra utal, hogy az effektor immunitást vált ki.A Mandeloop reakció lelassul, csakúgy, mint az általános vízszintes ellenállás.
A keskenylevelű csillagfürt (NLL, Lupinus angustifolius L.) a Földközi-tenger nyugati vidékéről származó magas fehérjetartalmú gabona1,2.Jelenleg állatok és emberek élelmiszernövényeként termesztik.A vetésforgó rendszerekben is zöldtrágyának számít a szimbiotikus nitrogénmegkötő baktériumok általi nitrogénmegkötés és a talajszerkezet általános javítása miatt.Az NLL a múlt században gyors háziasítási folyamaton ment keresztül, és még mindig nagy tenyésztési nyomás alatt áll3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Az NLL széles körben elterjedt termesztésével a kórokozó gombák egymásutánja új mezőgazdasági fülkéket alakított ki, és új terméspusztító betegségeket okozott. A csillagfürttenyésztők és -tenyésztők számára a legfigyelemreméltóbb az antracnózis megjelenése volt, amelyet a Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler és Hagedorn13 kórokozó gomba okozott. A csillagfürttenyésztők és -tenyésztők számára a legfigyelemreméltóbb az antracnózis megjelenése volt, amelyet a Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler és Hagedorn13 kórokozó gomba okozott. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, появление антракноза, вызванного rich памеров Nirenberg, Feiler és Hagedorn13. A csillagfürttenyésztők és -tenyésztők számára a legfigyelemreméltóbb az antracnózis megjelenése volt, amelyet a Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler és Hagedorn13 kórokozó gomba okozott.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病tondarum) enberg, Feiler és Hagedorn13 引起的.A嵵Hajas.1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракмрительным для фермеров Bondar) Nirenberg, Feiler és Hagedorn13. A csillagfürttenyésztők és -tenyésztők számára a legszembetűnőbb az antracnózis megjelenése, amelyet a Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler és Hagedorn13 kórokozó gomba okoz.A betegségről a legkorábbi jelentések Brazíliából és az Egyesült Államokból érkeztek, tipikus tünetekkel 1912-ben, illetve 1929-ben jelentkeztek.Körülbelül 30 év elteltével azonban a kórokozót Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz néven nevezték el. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., a Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld teleomorfja. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Targeted Morphology. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .és H. Schrenk. & H.施伦克，. & H.施伦克，.és H. Schlenk, .A 20. század közepén végzett előzetes betegségfenotipizálás némi rezisztenciát mutatott az NLL és a sárga csillagfürt (L. luteus L.) fertőzésekben, de az összes vizsgált fehér csillagfürt (L. albus L.) fertőzés nagyon fogékony volt15,16.Tanulmányok kimutatták, hogy az antracnóz kialakulása a megnövekedett csapadékmennyiséggel (levegő páratartalmával) és hőmérséklettel (12-28°C) társul, ami magasabb hőmérsékleten az ellenállás megsértéséhez vezet17, 18. Valójában a konídiumok csírázásához és a betegség kialakulásához szükséges idő négyszer rövidebb volt 24°C-on magas páratartalom mellett (6 óra 12 óra)9.Így a folyamatban lévő globális felmelegedés az antracnózis terjedéséhez vezetett.A betegséget azonban Franciaországban (1982) és Ukrajnában (1983) a közelgő fenyegetés előhírnökeként figyelték meg, de a csillagfürtipar akkoriban nyilvánvalóan figyelmen kívül hagyta20,21.Néhány évvel később ez a pusztító betegség az egész világon elterjedt, és olyan jelentős csillagfürt-termelő országokat is érintett, mint Ausztrália, Lengyelország és Németország22,23,24.Az 1990-es évek közepén egy antracnózis kitörést követően kiterjedt szűrés eredményeként számos rezisztens donort azonosítottak az NLL19 mintákban.Az antracnózzal szembeni NLL-rezisztenciát két különálló domináns allél szabályozza, amelyek különböző csíraplazma-forrásokban találhatók: a Lanr1 a Tanjil és a Wonga fajtákban, valamint az AnMan a fajtában.Mandalay 25, 26. Ezek az allélek kiegészítik azokat a molekuláris markereket, amelyek támogatják a rezisztens csíraplazma szelekcióját a nemesítési programokban25,26,27,28,29,30.A Lanr1 allélt hordozó 83A:476 rezisztens tenyésztési vonalat keresztezték a fogékony P27255 vad vonallal, hogy antraknózrezisztenciára szegregáló RIL populációt kapjanak, ami lehetővé tette a Lanr1 lókusz hozzárendelését az NLL-1131, 32, 33 kromoszómához. feltárta mindhárom allél elhelyezkedését ugyanazon a kromoszómán (NLL-11), de különböző pozíciókban29,34,35.A RIL-ek kis száma, valamint a markerek és a megfelelő allélek közötti nagy genetikai távolság miatt azonban nem lehet megbízható következtetéseket levonni a mögöttes génjeikről.Másrészt a fordított genetika alkalmazása csillagfürteknél nehézkes a nagyon alacsony regenerációs potenciáljuk miatt, ami nehézkessé teszi a genetikai manipulációt37.
A kívánt allélt homozigóta állapotban hordozó háziasított csíraplazma, mint például a 83A:476 (Lanr1) és a Mandelup (AnMan), megnyitotta az ajtót az antracnózrezisztencia tanulmányozása előtt a vadon élő populációkban ellentétes allélkombinációk jelenlétével szemben.Molekuláris mechanizmusok lehetőségei.Hasonlítsa össze a specifikus genotípusok által generált védekezési válaszokat.Ez a tanulmány értékelte az NLL korai transzkripciós válaszát a C. lupini vakcinációra.Először egy 215 vonalat tartalmazó európai NLL csíraplazma panelt szűrtünk a Lanr1 és AnMan allélokat jelölő molekuláris markerek segítségével.Az antracnóz fenotipizálást ezután 50 NLL vonalon végezték el, amelyeket korábban molekuláris markerek számára kiválasztottak, ellenőrzött körülmények között.E kísérletek alapján négy, antracnóz rezisztenciában és Lanr1/AnMan allél összetételben eltérő vonalat választottunk ki a differenciális védekező génexpressziós profilozáshoz, két egymást kiegészítő megközelítést alkalmazva: nagy áteresztőképességű RNS szekvenálás és valós idejű PCR kvantifikáció.
Az NLL csíraplazma (N = 215) szűrése Lanr1 (Anseq3 és Anseq4) és AnMan (Anseq4) és AnMan (AnManM1) markerekkel azt mutatta, hogy csak egy vonal (95726, Salamanca-b közelében) erősíti fel a „rezisztencia” allélt az allélek arányában az all5 pres8 allélek összes markerére. (~73,5%) sorok.Tizenhárom vonal termelte a Lanr1 marker két „rezisztens” allélját, és 8 vonal a Lanr1 „rezisztens” allélját.jelző.Az AnMan marker „rezisztencia” allélja (S1 kiegészítő táblázat).Két vonal heterozigóta volt az Anseq3 markerre és egy heterozigóta az AnManM1 markerre.42 vonal (19,5%) az Anseq3 és Anseq4 allélok ellentétes fázisait hordozta, ami azt jelzi, hogy e két lókusz között magas a rekombináció gyakorisága.Az antracnóz fenotípusai ellenőrzött körülmények között (S2 kiegészítő táblázat) a vizsgált genotípusok rezisztenciájának változékonyságát mutatták ki, ami az antracnóz súlyosságában is megmutatkozott.Az átlagpontszámok különbségei 1,8 (közepesen rezisztens) és 6,9 (érzékeny) között, a növénytömeg különbségek pedig 0,62 (érzékeny) és 4,45 g (rezisztens) között változtak. Szignifikáns korreláció volt a kísérlet két ismétlésénél megfigyelt értékek között (0,51 a betegség súlyossági pontszámaira, P = 0,00017 és 0,61 a növény tömegére, P < 0,0001), valamint e két paraméter között (-0,59 és -0,77, P < 0,0001). Szignifikáns korreláció volt a kísérlet két ismétlésénél megfigyelt értékek között (0,51 a betegség súlyossági pontszámaira, P = 0,00017 és 0,61 a növény tömegére, P < 0,0001), valamint e két paraméter között (-0,59 és -0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 твизбялдолеяя) , P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,10,0,0,0 Р0,10,0). Szignifikáns korrelációt találtunk a kísérlet két ismétlésénél megfigyelt értékek között (0,51 a betegség súlyossági pontszámaira, P = 0,00017 és 0,61 a növény tömegére, P < 0,0001), valamint e két paraméter között (-0,59 és -0,77, P < 0,00001)1).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重复实验中观察度评夆1︌.物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和-0,77，P < 0,0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严 庺 程 円 误. 1, p = 0,00017, 植物 为 为 0,61, p <0,0001和 – 0,59 和 - 0,77, P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях, 0,0,0,0,0,0,0,0 0017 и масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 és -0,0001) 0,77, P <0,0001. Szignifikáns korreláció volt a két párhuzamosban megfigyelt értékek között (a betegség súlyossági pontszáma 0,51, P = 0,00017 és a növény tömege 0,61, P < 0,0001), valamint a két paraméter között (-0,59 és -0 ,0001) 0,77, P<0,0001. ).A fogékony növényeknél megfigyelhető tipikus tünetek közé tartozik a szár meghajlása és csavarodása, amely „pásztor íj” szerkezetére emlékeztet, majd ovális elváltozások narancssárga/rózsaszín sporozoitákkal (kiegészítő 1. ábra).A Lanr1 (83A:476 és Tanjil) és AnMan (Mandelup) géneket hordozó ausztrál törzsek közepesen ellenállóak, 0,0331 és 0,0036.Egyes vonalak, amelyek „rezisztens” Lanr1 és/vagy AnMan allélokat is hordoznak, a betegség tüneteit mutatják.
Érdekes módon néhány „rezisztens” marker allélt nem tartalmazó NLL-vonal magas szintű antracnóz-rezisztenciát mutatott ki (hasonlóan vagy magasabban, mint a Lanr1 vagy AnMan genotípusoknál), ilyenek például a Boregine (P-érték < 0,0001 mindkét paraméter esetében), a Bojar (P-érték < 0,0001 a pontszámnál és a 0,001 a P900/0,001 a növénytömegnél) 1 a pontszám és nem szignifikáns a súly tekintetében). Érdekes módon néhány „rezisztens” marker allélt nem tartalmazó NLL-vonal magas szintű antracnóz-rezisztenciát mutatott ki (hasonlóan vagy magasabban, mint a Lanr1 vagy AnMan genotípusoknál), ilyenek például a Boregine (P-érték < 0,0001 mindkét paraméter esetében), a Bojar (P-érték < 0,0001 a pontszámnál és a 0,001 a P900/0,001 a növénytömegnél) 1 a pontszám és nem szignifikáns a súly tekintetében). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высовейхчостали высокий кнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 длахерона) е P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для дизначимоценен). Érdekes módon több „rezisztens” marker allélt nem tartalmazó NLL-vonal magas szintű antracnóz-rezisztenciát mutatott (a Lanr1 vagy AnMan genotípusokhoz hasonló vagy magasabb), mint például a Boregine (P-érték < 0,0001 mindkét paraméter esetében), Bojar (P-érték < 0,0001 az értékeléshez és a B-érték <0,0001 a növénytömeghez és a B-0,0-71-érték a növény tömegéhez) 01 az értékeléshez, és nem szignifikáns a súly szempontjából).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高気平示出高気平的発高気平的炭疁基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分00縍01＇0 .001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）. Érdekes, hogy egyes NLL-rendszerek, amelyek nem rendelkeznek „antigén” markerekkel, magas vízszintes rezisztenciát mutatnak (egyenértékű a Lanr1 vagy AnMan génekkel vagy magasabb), mint például a Boregine (mindkét paraméter P < 0,0001), a Bojar (P érték < 0,0001, a növény tömege 0,001) és a B-549/0,001 törzs nem szignifikáns (P0 érték <0,19b). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высочвистунтуйй ракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,00,00езна, 0,000 (параметров) са растения 0,001) и популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Érdekes módon néhány „rezisztencia” marker allélt nem tartalmazó NLL-vonal magas antracnóz-rezisztenciát mutatott (a Lanr1 vagy AnMan genotípusokhoz hasonló vagy magasabb), mint például a Boregine (P-érték mindkét paraméternél <0,0001), Bojar (P-érték <0,0001, növénytömeg <0,0001, növénytömeg: 0,0-90b01) és P70b014. 01, súlya nem jelentős).Ez a jelenség egy új genetikai rezisztenciaforrás lehetőségére utal, megmagyarázva a marker genotípusok és a betegség fenotípusai közötti összefüggés megfigyelt hiányát (P-értékek ~0,42 és ~0,98 között).Így a Kolmogorov-Smirnov teszt azt mutatta, hogy az antracnózrezisztenciára vonatkozó adatok megközelítőleg normálisan oszlanak meg a pontszámok (P-értékek 0,25 és 0,11) és a növény tömege (P-értékek 0,47 és 0,55), ami azt sugallja, hogy több allél érintett, mint a Lanr1 és az AnMan.
Az antracnóz rezisztencia szűrés eredményei alapján 4 vonalat választottunk ki a transzkriptom elemzéshez: 83A:476, Boregine, Mandelup és Population 22660. Ezeket a vonalakat RNS szekvenálással oltási kísérletekben újra teszteltük antrax rezisztencia szempontjából, feltéve, hogy megegyeznek az előző tesztben leírtakkal.A pontértékek a következők voltak: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) és népesség 22660 (6,11 ± 1,29).
Az Illumina NovaSeq 6000 protokoll átlagosan 40,5 Mread-párt ért el mintánként (29,7-54,4 Mread) (S3 kiegészítő táblázat).Az illesztési pontszámok a referencia szekvenciában 75,5% és 88,6% között változtak.Az olvasási adatok átlagos korrelációja a kísérleti változatok között a biológiai ismétlések között 0,812 és 0,997 között volt (átlag 0,959). A 35 170 elemzett gén közül 2917 nem mutatott expressziót, a többi 4785 gén pedig elhanyagolható szinten expresszálódott (bázisátlag < 5). A 35 170 elemzett gén közül 2917 nem mutatott expressziót, a többi 4785 gén pedig elhanyagolható szinten expresszálódott (bázisátlag < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались генов ое среднее <5). A 35 170 elemzett gén közül 2917 nem mutatott expressziót, a fennmaradó 4785 gén pedig elhanyagolható szinten expresszálódott (alapátlag <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忟值< 5).35,170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительсюпо е значение <5). A 35 170 elemzett gén közül 2917 nem expresszálódott, a fennmaradó 4785 gén expressziója pedig elhanyagolható volt (alapátlag <5).Így a kísérlet során kifejezettnek tekintett gének száma (alapátlag ≥ 5) 27 468 (78, 1%) volt (S4 kiegészítő táblázat).
Az első időponttól kezdve minden NLL vonal reagált a C. lupini (Col-08 törzs) beoltására a transzkriptom átprogramozásával (1. táblázat), azonban jelentős különbségek voltak megfigyelhetők a vonalak között.Így a 83A:476 rezisztenciavonal (amely a Lanr1 gént hordozza) az első időpontban (6 hpi) jelentős transzkriptomátprogramozást mutatott, az izolált felfelé és lefelé irányuló gének számában 31-69-szeres növekedést mutatott a többi időponthoz képest ebben az időpontban.Ráadásul ez a csúcs rövid életű volt, mivel csak néhány gén expressziója maradt szignifikánsan megváltozott a második időpontban (12 hpi).Érdekes módon a Boregine, amely szintén magas szintű ellenállást mutatott a graft tesztben, nem esett át ilyen masszív transzkripciós átprogramozáson a kísérlet során.A differenciálisan expresszált gének (DEG) száma azonban azonos volt a Boregine és a 83A:476 esetében 12 HPI-nél.Mind a Mandelup, mind a 22660 populáció DEG csúcsokat mutatott az utolsó időpontban (48 l/s), ami a védekezési reakciók viszonylagos késését jelzi.
Mivel a 83A:476 masszív transzkriptum-átprogramozáson ment keresztül a C. lupini hatására 6 HPI-nél az összes többi vonalhoz képest, az ezen időpontban megfigyelt DEG-ek ~91%-a volt vonal-specifikus (1. ábra).A korai válaszok között azonban volt némi átfedés a vizsgálati vonalak között, mivel a Boregine-ben, Mandelupban 68,5%, 50,9% és 52,6% DEG-ben, illetve a 22660-as populációban, bizonyos időpontokban átfedés volt a 83A:476-ban találtakkal.Ezek a DEG-ek azonban csak egy kis részét (0,97–1,70%) tették ki a 83A:476 segítségével jelenleg kimutatott összes DEG-nek.Ezenkívül az összes vonalból 11 DEG volt koherens ebben az időben (S4-S6 kiegészítő táblázatok), beleértve a növényvédelmi válaszok közös összetevőit: lipidtranszfer fehérjét (TanjilG_32225), endoglükán-1,3-β-glükozid enzimet (TanjilG_23384), két stressz-indukálható fehérjét (TanjilG_23384), és két stressz-indukálható fehérjét (S35AMl2) 31), bázikus latexfehérje (TanjilG_32352) és két glicinben gazdag szerkezeti sejtfalfehérje (TanjilG_19701 és TanjilG_19702).Viszonylag nagy átfedés volt a transzkripciós válaszokban a 83A:476 és a Boregine között 24 HPI-nél (összesen 16-38% DEG), valamint a Mandelup és a 22660 populáció között 48 HPI-nél (összesen 14-20% DEG).
Venn-diagram, amely a Colletotrichum lupinivel beoltott keskenylevelű csillagfürt (NLL) vonalakban lévő differenciálisan expresszált gének (DEG) számát mutatja (a Col-08 törzset Wierzhenice-ben, Lengyelországban, 1999.Az elemzett NLL-vonalak a következők voltak: 83A:476 (rezisztens, Lanr1 allélt hordozó), Boregine (rezisztens, genetikai háttér ismeretlen), Mandelup (mérsékelten rezisztens, AnMan allélt hordoz) és 22660 populáció (nagyon érzékeny).A hpi rövidítés az oltás utáni órákat jelenti.A nulla értékeket eltávolítottuk a grafikon egyszerűsítése érdekében.
A 6 hpi-nél túlexpresszált gének készletét kanonikus R géndomének jelenlétére elemeztük (S7 kiegészítő táblázat).Ez a tanulmány csak a 83A:476-nál tárta fel a klasszikus betegségrezisztencia gének transzkriptom indukcióját NBS-LRR doménekkel.Ez a készlet egy TIR-NBS-LRR gént (tanjilg_05042), öt CC-NBS-LRR gént (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 és tanjilg_16162), valamint négy NBS_LR-1 és Tanilgjilg6 (Tanjilg2LR) (tanjilg2LR) (tanjilg6,1) tartalmazott. 162), valamint Four NBS-Lrr (tanjilg_16162) és Four NBS-LRR (TANJILG_16162).Ezeknek a géneknek mindegyike rendelkezik kanonikus doménekkel, amelyek konzervált szekvenciákba rendeződnek.Az NBS-LRR domén gének mellett számos RLL kináz aktiválódott 6 hpi-vel, nevezetesen egy Boregine-ben (TanjilG_19877), kettő Mandelupban (TanjilG_07141 és TanjilG_19877), valamint a 22660-as populációban (TanjilG_0ji) kettő in3901_4A és TanjilG_02 :476.
A C. lupini-vel (Col-08 törzs) való beoltás hatására jelentősen megváltozott expressziójú géneket génontológiai (GO) dúsítási elemzésnek vetettük alá (S8 kiegészítő táblázat). A leggyakrabban felülreprezentált biológiai folyamat kifejezés a „GO:0006952 védekezési válasz” volt, amely 16 (idő × vonal) kombinációból 6-ban jelent meg nagy szignifikanciával (P-érték < 0,001) (2. ábra). A leggyakrabban felülreprezentált biológiai folyamat kifejezés a „GO:0006952 védekezési válasz” volt, amely 16 (idő × vonal) kombinációból 6-ban jelent meg nagy szignifikanciával (P-érték < 0,001) (2. ábra). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защиятный», отвскоятый» 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). A biológiai folyamatok leggyakrabban felülreprezentált kifejezése a „GO:0006952 védekezési válasz” volt, amely 16 (idő × leszármazási) kombináció közül 6-ban jelent meg nagy szignifikanciával (P-érték < 0,001) (2. ábra).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 七出现在16 丶（旈丄个中，具有高显着性(P 值< 0,001）（图2）). A biológiai folyamat legreprezentatívabb kifejezése a „GO:0006952 védekezési válasz”, amely a 16 (时间×线) kombináció közül 6-ban jelenik meg, nagy szignifikanciával (P-érték < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 баки 61 Копяры» инаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). A biológiai folyamatok leggyakrabban felülreprezentált kifejezése a 'GO:0006952 Defense Response' volt, amely 16 kombinációból 6-ban jelent meg (idő × vonal) nagy szignifikanciával (P-érték < 0,001) (2. ábra).Ez a kifejezés két időpontban felülreprezentált volt a 83A-ban: 476 és Boregine (6 és 24 hpi), valamint egy időpontban a Mandelupban és a 22660-as populációban (12 és 6 LE).Ez egy várt eredmény, kiemelve a rezisztens vonalak gombaellenes reakcióját.Ezenkívül a 83A:476 reagált a C. lupini-re a „GO:0055114 redox folyamat” kifejezéssel jellemezhető oxidatív robbanáshoz kapcsolódó gének gyors indukálásával, jelezve a specifikus védekezési választ, míg a Boregine a „GO” kifejezéssel kapcsolatos specifikus védekezési reakciókat mutatott ki.:0006950 Stresszreakció”.A 22660-as populáció aktiválta a másodlagos metabolitokat érintő horizontális rezisztencia választ, kiemelve a „GO:0016104 Triterpén bioszintézis folyamata” és a „GO:0006722 Triterpén-metabolizmus folyamata” kifejezések túlzott számát (mindkét kifejezés ugyanahhoz a génkészlethez tartozik), figyelembe véve a GO:2 és a populegén-dúsulási reakció stabilitásának2 és a mandelgén dúsítási stabilitásának analízisének eredményeit26. 60. Ezenkívül a 83A:476 (6 hpi) korai reakció és a Mandelup és Population 22660 késleltetett reakció magában foglalja a GO:0015979 „fotoszintézis” kifejezést és más kapcsolódó biológiai folyamatokat.
Az antrax csillagfürttel beoltott keskenylevelű csillagfürt (NLL) (1999-ben a lengyelországi wierzhenicei csillagfürtföldekről nyert Col-08 törzs) transzkripciós válaszai során a differenciálisan expresszált gének annotációjában kiválasztott biofolyamat-gén-ontológiai kifejezések erősen eltúlzottak.Az elemzett NLL vonalak a következők voltak: 83A:476 (rezisztens, homozigóta Lanr1 allélt hordozó), Boregine (rezisztens, ismeretlen genetikai háttér), Mandelup (mérsékelten rezisztens, homozigóta AnMan allélt hordoz) és 22660 populáció (érzékeny).
Mivel ennek a vizsgálatnak az volt a célja, hogy azonosítsa azokat a géneket, amelyek hozzájárulnak az antracnózis-rezisztenciához, a GO „GO: 0006952 Defensive responses” és „GO: 0055114 Redox process” kifejezésekhez rendelt géneket küszöbértékekkel elemeztük, mivel az alapérték ≥ 30 legalább egy vonallal.× időpont a log2 statisztikailag szignifikáns értékeinek kombinálásával (szeres változás).Az ezeknek a kritériumoknak megfelelő gének száma 65 a GO:0006952 és 524 a GO:0055114 esetében.
A 83A:476 két DEG-csúcsot mutatott ki a GO:0006952 kifejezéssel, az első 6 gén hüvelykenként (64 gén, felfelé és lefelé szabályozás), a második pedig 24 gén hüvelykenként (15 gén, csak felfelé szabályozás).Boregine azt is kimutatta, hogy a GO:0006952 ugyanabban az időpontban érte el a csúcsot, de kevesebb DEG-vel (11 és 8) és preferenciális aktiválással.A Mandeloop a GO:0006952 két csúcsát mutatta 12 és 48 HPI-nél, mindkettő 12 gént hordozott (az első aktiváló génekkel, a második pedig csak szuppresszív génekkel), míg a 22660 populáció 6 HPI-nél (13 gén) nagyobb mértékben dominált a növekedési csúcsnál.szabályozás.Meg kell jegyezni, hogy ezekben a csúcsokban a GO:0006952 DEG 96,4%-a azonos típusú választ adott (felfelé vagy lefelé), ami a védekezési válaszok jelentős átfedését jelzi, az érintett gének számában mutatkozó különbségek ellenére.A GO:0006952 kifejezéshez kapcsolódó szekvenciák legnagyobb csoportja a 22-es éhezési stresszhez kapcsolódó üzenetfehérjét (SAM22-like) kódolja, amely a 10. osztályba tartozó patogenezis-asszociált fehérje (PR-10) fehérje kládjához és a core protein latexhez tartozik.hasonló (MLP-szerű) fehérje) fehérje (3. ábra).A két csoport a kifejezés jellegében és a válasz irányában különbözött.A SAM22-szerű fehérjéket kódoló gének konzisztens és jelentős indukciót mutattak a korai időpontokban (6 vagy 12 hpi), és általában nem reagáltak a kísérlet végén (48 hpi), míg az MLP-szerű fehérjék 6 hpi-nél mutattak koordinációt.hpi.A 83A:476 és a Mandelup 48 LE/in, szinte az összes többi adatpont nem reagált.Ezenkívül a SAM22-szerű fehérje gének expressziós profiljában mutatkozó különbségek az antracnóz rezisztencia megfigyelt variabilitását követték, mivel a rezisztensebb vonalakban több időpont volt szignifikánsan indukálva ezeket a géneket, mint az érzékenyebb gének.Egy másik LlR18A/B-szerű PR-10 gén a SAM22-szerű fehérjegénhez nagyon hasonló expressziós mintázatot mutatott.
Azonosították a „GO:0006952 Defense Response” biológiai folyamatkifejezés fő összetevőit, valamint a Lanr1 és AnMan allél jelölt génjeinek expressziós mintázatait.A Log2 skála a log2 értékeket (szeres változás) mutatja az oltott (Colletotrichum lupini, Col-08 törzs, csillagfürtföldekről, Wizhenica, Lengyelország, 1999) és a kontroll (álinokulált) növények között ugyanabban az időpontban.A következő keskenylevelű csillagfürt vonalakat elemeztük: 83A:476 (rezisztens, homozigóta Lanr1 allélt hordozó), Boregine (rezisztens, genetikai háttér ismeretlen), Mandelup (mérsékelten rezisztens, homozigóta AnMan allélt hordoz) és 22660 populáció (érzékeny).
Ezenkívül értékeltük a Lanr1 (TanjilG_05042) és az AnMan (TanjilG_12861) RNS-seq jelölt gének expressziós profilját (3. ábra).A TanjilG_05042 gén 83A:476-nál csak az első időpontban (6 hpi) mutatott szignifikáns választ (aktivációt), míg a TanjilG_12861 csak két időpontban volt szignifikáns a Mandeloopban: 6 hpi (lefelé szabályozás) és 24 hpi (6 hpi).Val vel.).állítható) ).
A GO:0055114 „redox folyamat” kifejezésben a leginkább túlzottan kifejezett gének a citokróm P450 fehérjéket és a peroxidázt kódoló gének voltak (4. ábra).A 83A:476-ból 6 HPI-vel izolált minták esetében általában a maximális vagy minimális log2 (szeres változás) értékeket figyelték meg (a gének 86,6%-ánál) az oltott és a kontroll növények között, ami rávilágít ennek a genotípusnak az oltási nemre adott magas válaszreakciójára.83A:476 mutatta a legjelentősebb GO: 0055114 DEG 6 hpi-nél (503 gén), míg a többi vonal 48 hpi-nél (Boregine, 31 gén; Mandelup, 85 gén; és Population 22660, 78 gén)).A GO:0055114 család legtöbb génjében a vakcinázásra adott kétféle választ (aktiválást és gátlást) figyeltek meg.Érdekes módon a GO: 0055114 kifejezésre azonosított DEG-ek akár 97,6%-a Mandelupe-ban 48 LE-n Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a lényegesen kisebb lépték ellenére (azaz a mutált redoxgének száma 85 versus 503) a 6 korai mandelózra 6 korai mandelózra reagáló késleltetett transzkripciós válasz mintázata hasonló.Boregine-ben és a 22660-as lakosságszámban ez a konvergencia alacsonyabb, 51,6%, illetve 75,6%.
Feltárásra kerültek a „GO:0055114 Redox folyamat” biológiai folyamat terminusának főbb komponenseinek kifejeződési mintái.A Log2 skála a log2 értékeket (szeres változás) mutatja az oltott (Colletotrichum lupini, Col-08 törzs, csillagfürtföldekről, Wizhenica, Lengyelország, 1999) és a kontroll (álinokulált) növények között ugyanabban az időpontban.A következő keskenylevelű csillagfürt vonalakat elemeztük: 83A:476 (rezisztens, homozigóta Lanr1 allélt hordozó), Boregine (rezisztens, genetikai háttér ismeretlen), Mandelup (mérsékelten rezisztens, homozigóta AnMan allélt hordoz) és 22660 populáció (érzékeny).
83A:476 A C. lupini (Col-08 törzs) beoltására adott transzkriptomikus válaszok a GO:0015979 „fotoszintézis” kifejezésnek tulajdonított gének koordinált elnémítását és más kapcsolódó biológiai folyamatokat is magukban foglalták (5. ábra).Ez a GO:0015979 DEG készlet 105 gént tartalmazott, amelyek szignifikánsan elnyomtak 6 hpi-nél 83A:476-nál.Ebben az alcsoportban 37 gén is le lett szabályozva a Mandelupban 48 HPI-nél és 35 gén ugyanabban az időpontban a 22660 populációban, beleértve a 19 DEG-et, amely mindkét genotípusra jellemző.A GO: 0015979 kifejezéshez kapcsolódó DEG-ek egyik kombinációban sem aktiválódtak szignifikánsan (sor x idő).
Feltárásra kerültek a „GO:0015979 Fotoszintézis” biológiai folyamat kifejezés fő összetevőinek kifejeződési mintái.A Log2 skála a log2 értékeket (szeres változás) mutatja az oltott (Colletotrichum lupini, Col-08 törzs, csillagfürtföldekről, Wizhenica, Lengyelország, 1999) és a kontroll (álinokulált) növények között ugyanabban az időpontban.A következő keskenylevelű csillagfürt vonalakat elemeztük: 83A:476 (rezisztens, homozigóta Lanr1 allélt hordozó), Boregine (rezisztens, genetikai háttér ismeretlen), Mandelup (mérsékelten rezisztens, homozigóta AnMan allélt hordoz) és 22660 populáció (érzékeny).
A differenciális expressziós elemzés eredményei alapján, és feltehetően részt vesz a patogén gombák elleni védekezési válaszokban, ezt a hét génből álló készletet választották ki az expressziós profilok valós idejű PCR-rel történő kvantifikálására (S9 kiegészítő táblázat).
A TanjilG_10657 feltételezett fehérjegén szignifikánsan indukálódott minden vizsgált vonalban és időpontban a kontroll (utánzó) növényekhez képest (S10, S11 kiegészítő táblázatok).Ezenkívül a TanjilG_10657 expressziós profilja növekvő tendenciát mutatott a kísérlet során az összes vonal esetében.A 22660-as populáció mutatta a TanjilG_10657 legnagyobb érzékenységét az oltásra 114-szeres aktiválással és a legmagasabb relatív expressziós szintet (4,4 ± 0,4) 24 HPI-n (6a. ábra).A PR10 LlR18A fehérjegén, a TanjilG_27015 szintén aktiválást mutatott az összes vonalon és időpontban, statisztikai szignifikanciával a legtöbb adatponton (6b. ábra).A TanjilG_10657-hez hasonlóan a TanjilG_27015 legmagasabb relatív expressziós szintjét a 22660 beoltott populációban figyelték meg 24 HPI-nél (19,5 ± 2,4).A TanjilG_04706 savas endokitináz gén szignifikánsan felszabályozott minden vonalban és minden időpontban, kivéve a Boregine 6 hpi-t (6c. ábra).Erősen indukált az első időpontban (6 HPI) a 83A:476-nál (10,5-szeresére), és mérsékelten emelkedett a többi vonalban (6,6-7,5-szeresére).A kísérlet során a TanjilG_04706 expressziója hasonló szinten maradt a 83A:476-ban és a Boregine-ben, míg a Mandelup-ban és a 22660-as populációban szignifikánsan nőtt, és viszonylag magas értékeket ért el (5,9 ± 1,5 és 6,2 ± 1,5).A TanjilG_23384 endoglükán-1,3-β-glükozidáz-szerű gén az első két időpontban (6 és 12 hpi) magas aktivációt mutatott a 22660-as populáció kivételével minden vonalban (6d. ábra).A TanjilG_23384 legmagasabb relatív expressziós szintjét a második időpontban (12 hpi) figyelték meg Mandelupban (2,7 ± 0,3) és 83A:476-ban (1,5 ± 0,1).24 HPI-nél a TanjilG_23384 expressziója viszonylag alacsony volt az összes vizsgált vonalban (0,04 ± 0,009 és 0,44 ± 0,12 között).
A kiválasztott gének (ag) expressziós profilja kvantitatív PCR-rel feltárva.A 6, 12 és 24 számok az oltás utáni órákat jelzik.A LanDExH7 és LanTUB6 géneket a normalizáláshoz, a LanTUB6 géneket pedig a sorozatok közötti kalibráláshoz használtuk.A hibasávok a három biológiai ismétlésen alapuló szórást jelentik, amelyek mindegyike három technikai ismétlés átlaga. Az oltott (Colletotrichum lupini, Col-08 törzs, 1999-ben a wierzenicai csillagfürt tábláról, Lengyelország) és a kontroll (áloltott) növények expressziós szintjei közötti különbségek statisztikai szignifikanciája az adatpontok felett van jelölve (*P érték < 0,05, **P érték ≤ 01, 0,1 0). Az oltott (Colletotrichum lupini, Col-08 törzs, 1999-ben a wierzenicai csillagfürt tábláról, Lengyelország) és a kontroll (áloltott) növények expressziós szintjei közötti különbségek statisztikai szignifikanciája az adatpontok felett van jelölve (*P érték < 0,05, **P érték ≤ 01, 0,1 0). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штаменпо Col-08, л 99 Col-09 я люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точнихе, 0,5,5 ение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Statisztikailag szignifikáns különbségek vannak az oltott (Colletotrichum lupini, Col-08 törzs, 1999-ben egy csillagfürtföldről Wierzhenice-ben, Lengyelországban) és a kontroll (áloltott) növények expressziós szintjében az adatpontok felett (*P-érték < 0,05, **P-érték ≤ 0,01-0,0).接种(Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模槍，水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,01, ***P 值0.0.0)接种 (colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对玤）平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001) Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штаменныч-08, лилич-08, на в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены отмечены отмечены над точкам. ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Statisztikailag szignifikáns különbségek vannak az oltott (Colletotrichum lupini, Col-08 törzs, csillagfürtföldekről Verzhenice-ben, Lengyelországban, 1999-ben) és a kontroll (áloltott) növények expressziós szintjében az adatpontok felett (*P-érték < 0,05 , **P-érték ≤ 0,01, 0,01, 0,0 0.01).Az elemzett NLL-vonalak a következők voltak: 83A:476 (rezisztens, homozigóta Lanr1 allélt hordozó), Mandelup (mérsékelten rezisztens, homozigóta AnMan allélt hordoz), Boregine (rezisztens, ismeretlen genetikai háttér) és 22660 populáció (érzékeny).
A Lanr1 lókuszban található TanjilG_05042 jelölt gén markánsan eltérő expressziós mintázatot mutatott az RNS-seq vizsgálatokból nyert profiloktól (6e. ábra).Ennek a génnek a jelentős aktiválódását figyelték meg Mandelupban és a 22660 populációban (akár 39,7-szeres, illetve 11,7-szeresére), ami viszonylag magas expressziós szintet eredményezett (1,4 ± 0,14 és 7,2 ± 1,3-ig).A 83A:476 a TanjilG_05042 gén bizonyos mértékû felszabályozását is feltárta (akár 3,8-szorosra), azonban az elért relatív expressziós szintek (0,044 ± 0,002) több mint 30-szor alacsonyabbak voltak, mint a Mandelupban és a 22660 populációban megfigyeltek.A qPCR-rel elemezve szignifikáns különbségeket mutattak ki a genotípusok közötti expressziós szintek között az álvakcinált (kontroll) variánsokban, elérve az 58-szoros különbséget a 22660 és 83A:476 populációk, valamint a 22660 és 22660 populációk között. Kétszeres különbséget értek el Boregine és Mandalup között.
Az AnMan lókusz jelölt génje, a TanjilG_12861, a 83A:476-ban és a Mandelupban végzett vakcináció hatására aktiválódott, a 22660-as populációban semleges volt, Boregine-ben pedig leszabályozott (6f. ábra).A TanjilG_12861 gén relatív expressziója a beoltott 83A: 476-ban volt a legmagasabb (0,14±0,01).A 17,4 kDa-os I. osztályú hősokk-fehérje gén, a TanjilG_05080 HSP17.4 alacsonyabb relatív expressziós szintet mutatott minden vizsgált törzsben és időpontban (6g. ábra).A legmagasabb értéket 24 HPI-nél figyelték meg a 22660 fős populációban (0,14 ± 0,02, nyolcszoros növekedés a vakcinázásra adott válaszban).
A génexpressziós profilok összehasonlítása (7. ábra) magas korrelációt mutatott ki a TanjilG_10657 és négy másik gén között: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) és 4 TanjilG_05042 (r = 0,80 (r) 07) és 4 másik gén között.Az ilyen eredmények arra utalhatnak, hogy ezeknek a géneknek a koregulációja zajlik a védekezési válaszok során.A TanjilG_12861 és TanjilG_23384 gének eltérő expressziós profilokat mutattak alacsonyabb Pearson korrelációs koefficiens értékekkel (0,08-0,43 és -0,19-0,28) más génekhez képest.
A génexpressziós profilok közötti összefüggéseket kvantitatív PCR-rel detektáltuk.A következő keskenylevelű csillagfürt vonalakat elemeztük: 83A:476 (rezisztens, homozigóta Lanr1 allélt hordoz), Mandelup (mérsékelten rezisztens, homozigóta AnMan allélt hordoz), Boregine (rezisztens, genetikai háttér ismeretlen) és 22660 populáció (érzékeny).Három időpontot számítottunk ki (6, 12 és 24 órával az oltás után), beleértve a beoltott (Colletotrichum lupini, Col-08 törzs, Wierzhenice, Lengyelország csillagfürtföldekről 1999-ben nyert) és a kontroll (áloltott) növényeket.A skála a Pearson-féle korrelációs együttható értékét mutatja.
A 6 lóerő per hüvelyk sebességgel kapott adatok alapján a WGCNA-t 9981°-on hajtották végre, amelyet az oltott és a kontroll növények összehasonlításával azonosítottak, hogy a korai védekezési válaszokra összpontosítsanak (S12 kiegészítő táblázat).Huszonkét génmodult (klasztert) találtunk korrelált (pozitív vagy negatív) expressziós profillal a genotípusok és a kísérleti változatok között. Átlagosan a génexpressziós szintek csökkenő sorrendben 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (mindkét változatban azonban ez a tendencia erősebb volt a kontroll növényekben). Átlagosan a génexpressziós szintek csökkenő sorrendben 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (mindkét változatban azonban ez a tendencia erősebb volt a kontroll növényekben). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > 22660 lakos сильнее у контрольных растений). A génexpressziós szintek átlagosan a 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 sorrendben csökkentek (mindkét változatban azonban ez a tendencia erősebb volt a kontroll növényekben).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 的顺序下降（然而，作两势在对照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> népessége 22660 的 顺序 伋 降 （Ｇ 在 在在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。. В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Népesség: 22660 е у контрольных растений). Átlagosan a génexpressziós szintek csökkentek a 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 sorozatban (azonban mindkét változatban ez a tendencia erősebb volt a kontroll növényekben).Az oltás a génexpresszió fokozódását eredményezte, különösen a 18., 19., 14., 6. és 1. modulban (hatás csökkenő sorrendben), negatív szabályozást (pl. 9. és 20. modul) vagy semleges hatásokat (pl. 11., 22., 8. és 13. modul).A GO kifejezés dúsítási analízise (S13 kiegészítő táblázat) „GO: 0006952 védőreakciókat” mutatott ki az oltott modulra (18) maximális aktiválással, beleértve a qPCR-rel elemzett géneket (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_015G), Tanjil_G_015G, valamint a legtöbb TanjilG_015G, valamint a legtöbb TanjilG_0156G. préselt fotoszintézis modulok (9).A 18. modul koncentrátorát (8. ábra) a PR-10-szerű LlR18B fehérjét kódoló TanjilG_26536 génként, a 9. modul koncentrátorát pedig a Photosystem II PsbQ fehérjét kódoló TanjilG_28955 génként azonosítottuk.A Lanr1 antracnózrezisztencia-gén jelöltet, a TanjilG_05042-t a 22. modulban találták meg (9. ábra), amely a „GO:0044260 Cellular makromolekuláris metabolikus folyamatok” és a „GO:0006355 Transzkripciós szabályozás, DNS-templálás” kifejezésekhez kapcsolódik, és a TanjilG hub_0121212-t hordozza.a gén az A-4a hőstressz transzkripciós faktort (HSFA4a) kódolja.
Modulok gén-koexpressziójának súlyozott hálózati elemzése felülreprezentált biológiai folyamatkifejezésekkel: „GO: 0006952 Defense responses”.A ligálást leegyszerűsítettük, hogy kiemeljük a qPCR-rel elemzett négy gént (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 és TanjilG_27015).
A „GO: 0006355: Transzkripciós szabályozás, DNS-templálás” túlreprezentált biológiai folyamatkifejezéssel és a Lanr1 TanjilG_05042 antracnózrezisztencia-gén jelöltet hordozó modul gén-koexpressziójának súlyozott hálózati elemzése.A ligálást leegyszerűsítettük a TanjilG_05042 gén és a központi TanjilG_01212 gén izolálására.
Az Ausztráliában gyűjtött antracnóz rezisztencia szűrés azt mutatta, hogy a korai kibocsátású fajták többsége fogékony volt;A Kalya, a Coromup és a Mandelup közepesen ellenállónak, míg a Wonga, a Tanjil és a 83A:476 nagyon ellenállónak26,27,31.ugyanazzal a rezisztencia alléllal rendelkezett, Lanr1-nek, a Coromupnak és a Mandelupnak pedig egy másik allélje volt, nevezetesen AnMan10, 26, 39, míg Kalya más allélt adott át., Lanr2.Az antracnóz rezisztencia szűrése Németországban egy rezisztens Bo7212 vonal azonosítását eredményezte, amely a Lanr1-től eltérő jelölt allélt tartalmaz, amelyet LanrBo36-nak neveztek.
Vizsgálatunk a Lanr1 allél nagyon alacsony gyakoriságát (körülbelül 6%) mutatta ki a vizsgált csíraplazmában.Ez a megfigyelés összhangban van az Anseq3 és Anseq4 markerekkel végzett kelet-európai csíraplazma szűrés eredményeivel, amelyek azt mutatták, hogy a Lanr1 allél csak két fehérorosz vonalban van jelen.Ez arra utal, hogy a Lanr1 allélt még nem használják széles körben a helyi tenyésztési programok, ellentétben Ausztráliával, ahol ez az egyik kulcsfontosságú allél a marker-asszisztált tenyésztésben.Ennek oka lehet, hogy a Lanr1 allél alacsonyabb rezisztenciaszintet biztosít európai terepi körülmények között az ausztrál jelentéshez képest.Ezenkívül Ausztrália magas csapadékos területein végzett antracnóz-vizsgálatok kimutatták, hogy a Lanr1 allél által közvetített rezisztenciaválaszok nem biztos, hogy hatékonyak olyan időjárási körülmények között, amelyek kedveznek a kórokozó növekedésének és gyors fejlődésének19,42.Valójában a jelen tanulmányban az antracnóz bizonyos tüneteit a Lanr1 allélt hordozó genotípusokban is megfigyelték, ami arra utal, hogy a rezisztencia eltűnhet a C. lupini fejlődésének optimális körülményei között.Ezenkívül lehetséges az Anseq3 és Anseq4 markerek jelenlétének hamis pozitív értelmezése, amelyek körülbelül 1 cM-re vannak a Lanr1 lókusztól 28, 30, 43 .
Vizsgálatunk kimutatta, hogy a Lanr1 allélt hordozó 83A:476 a C. lupini oltásra az első elemzett időpontban (6 hpi) nagy léptékű transzkriptomátprogramozással reagált, míg az AnMan allélt hordozó Mandelupban sokkal később figyeltek meg transzkriptomikus válaszokat.(24-től 48 LE-ig).A védekezési válaszok ezen időbeli eltérései a betegség tüneteinek különbségeivel járnak együtt, rávilágítva a korai kórokozó felismerés fontosságára a rezisztenciára adott sikeres válasz szempontjából.A növényi szövetek megfertőzéséhez a lépfene spóráknak több fejlődési szakaszon kell keresztülmenniük a gazdafelületen, beleértve a csírázást, a sejtosztódást és az appresszórium kialakulását.A függelék egy fertőző szerkezet, amely a gazdaszervezet felületéhez kapcsolódik, és megkönnyíti a gazdaszövetekbe való behatolást.Így a C. gloeosporioides spórái a borsókivonatban 75-90 perces inkubáció után a sejtmag első osztódását, 90-120 perces csíracső kialakulását, 4 óra elteltével elnyomást mutattak 45 .A Mango C. gloeosporioides több mint 40%-os konidiális csírázást mutatott 3 órás inkubáció után, és kb. 20%-ban appresszorok képződését 4 óra múlva.A C. gloeosporioides virulenciával összefüggő CAP20 génje transzkripciós aktivitást mutatott epifitaképző konídiumokban 3,5 órás avokádó felületi viaszban magas CAP20 fehérje koncentrációjú inkubáció után 4 óra 46 perc után.Hasonlóképpen, a melanin bioszintézis gének aktivitása C. trifolii-ban indukált egy 2 órás inkubációt, amelyet 1 óra elteltével appresszórium képződés követett.A levélszöveteken végzett vizsgálatok kimutatták, hogy a C. acutatum-mal beoltott szamóca első elnyomása 8 hpi-nél jelentkezik, míg a C. coccode-okkal beoltott paradicsom 4 hpi-nél 48,49.nagyrészt összhangban van a Colletotrichum spp.fertőző folyamat.A 83A:476-ra adott gyors védekezési válaszok a növényi rezisztencia és az effektor által kiváltott immunitás (ETI) gének részvételére utalnak ebben a vonalban, míg Mandelup késleltetett válaszai a mikro-asszociált molekuláris mintázat által kiváltott immunitás (MTI) 50. hipotézisét támasztják alá. Korai válaszok 83A: 476-ra és Mandelupra.A felfelé vagy lefelé szabályozott gének részleges átfedése a késleltetett válaszreakcióban szintén ezt az elképzelést támasztja alá, mivel az ETI-t gyakran egy felgyorsult és fokozott MTI-válasznak tekintik, amely a fertőzés helyén programozott sejthalálban csúcsosodik ki, amelyet anafilaxiás sokknak neveznek51,52.
A túlreprezentált Gene Ontology GO:0006952 „Defense Response” kifejezésnek tulajdonított gének többsége a stressz által kiváltott éhgyomri üzenet 22 fehérje (hasonlóan a SAM22-hez) és a hét fő latexfehérje-szerű (MLP) 11 homológja.A 31-es, 34-es, 43-as és 423-as fehérjék szekvencia hasonlóságot mutattak.A SAM22-szerű gének szignifikáns aktivációt mutattak, amely hosszabb ideig tartott, megnövekedett antracnóz rezisztenciát mutatva (83A:476 és Boregine).Az MLP-szerű gének azonban csak a jelölt rezisztencia allélt hordozó vonalakban voltak leszabályozva (83A:476/Lanr1 6 hpi-nél és Mandelup/AnMan 24 hpi-nél).Meg kell jegyezni, hogy az összes azonosított SAM22-szerű homológ egy körülbelül 105 kb-os génklaszterből származik, míg az MLP-szerű gének a genom különböző régióiból származnak.Az ilyen SAM22-szerű gének összehangolt aktiválódását a Diaporthetoxica oltással szembeni NLL-rezisztenciát vizsgáló korábbi vizsgálatunkban is megállapítottuk, ami arra utal, hogy részt vesznek a védekezési válasz horizontális összetevőiben.Ezt a következtetést a SAM22-szerű gének pozitív reakciójáról szóló jelentések is alátámasztják sérülésekre vagy szalicilsavval, gombainduktorokkal vagy hidrogén-peroxiddal végzett kezelésre.
Kimutatták, hogy az MLP-szerű gének különféle abiotikus és biotikus stresszekre reagálnak, beleértve számos növényfaj bakteriális, vírusos és patogén gombás fertőzéseit55.A növények és a kórokozók közötti bizonyos kölcsönhatásokra adott válaszirányok az erősen növekvőtől (vagyis a gyapot Verticillium dahliae fertőzésekor) a szignifikánsan csökkenőig (az almafa Alternaria spp. fertőzése után)56,57.Az MLP-szerű 423 gén jelentős downregulációját figyelték meg az avokádó F. niger fertőzéssel szembeni védekezése során és az almafa Botryosphaeria berengeriana f. fertőzése során.cn.A piricola és az Alternaria alternata az alma patotípusai58,59.Ezenkívül az MLP-szerű 423 gént túltermelő alma kalluszokban alacsonyabb volt a rezisztenciával kapcsolatos gének expressziója, és érzékenyebbek voltak a gombás fertőzésekre59.A Fusarium oxysporum f után az MLP-szerű 423 gén is elnyomott a rezisztens közönséges babcsíraplazmában.cn.Babfertőzés 60.
A PR-10 család további tagjai, amelyeket az RNS-seq vizsgálatunkban azonosítottunk, az LlR18A és LlR18B gének voltak a felszabályozásra válaszul, valamint a DIR1 lipidtranszfer fehérje upregulált (1 gén) vagy downregulált (3 gén) génje..Ezen túlmenően, a WGCNA kiemeli az LlR18B gént, mint egy csomópontot ebben a modulban, amely nagyon érzékeny a vakcinázásra, és számos védőreakció gént hordoz.Az LlR18A és LlR18B gének a sárga csillagfürt levelekben indukálódtak patogén baktériumok hatására, valamint NLL szárban D. toxica oltás után, míg ezen gének rizs homológját, az RSOsPR10-et gyorsan indukálta egy gombás fertőzés, amely feltehetően részt vesz a D6ensonic sav gént kódoló 1IR,563 nem jázmonic génben. specifikus lipid transzport fehérjék, amelyek szükségesek a szisztémás szerzett rezisztencia (SAR) kialakulásához.A védőreakciók kialakulásával a DIR1 fehérje a fertőzés fókuszából a floémon keresztül transzportálódik, hogy SAR-t indukáljon a távoli szervekben.Érdekes módon a TanjilG_02313 DIR1 gén az első időpontban szignifikánsan indukálódott a 84A:476 vonalban és a 22660 populációban, de az antracnóz rezisztencia csak a 84A:476 vonalban fejlődött ki sikeresen.Ez a DIR1 gén bizonyos szubfunkcionalizálására utalhat NLL-ben, mivel a fennmaradó három homológ csak a 83A:476 vonalban reagált az oltásra 6 hpi-nél, és ez a válasz lefelé irányult.
Vizsgálatunkban a „GO:0055114 Redox folyamat” nevű biológiai folyamatnak megfelelő komponensek a citokróm P450 fehérje, a peroxidáz, a linolsav-9S-/13S-lipoxigenáz és az 1-aminociklopropán-1-karbonsav-oxidáz voltak a leggyakoribbak.Ezenkívül WGCNA-nk a HSFA4a homológot modulokat hordozó hubként határozza meg, mint például a Lanr1 rezisztenciagén jelölt TanjilG_05042.A HSFA4a a növényekben a nukleáris transzkripció redox-függő szabályozásának egyik összetevője.
A citokróm P450 fehérjék olyan oxidoreduktázok, amelyek NADPH és/vagy O2-függő hidroxilációs reakciókat katalizálnak az elsődleges és másodlagos metabolizmusban, beleértve a xenobiotikumok, valamint a hormonok, zsírsavak, szterolok, sejtfalkomponensek, biopolimerek metabolizmusát, valamint a védővegyületek bioszintézisét. 0,6 log2 (szeres változás) 5,7-re a megváltozott homológok nagy száma (37) és a specifikus gének válaszmintázatai közötti különbségek miatt, ami felfelé irányuló felülvizsgálatot tükröz..Csak az RNS-seq adatok felhasználása az NLL gének feltételezett biológiai funkciójának tisztázására egy ilyen nagy fehérje szupercsaládban nagyon spekulatív lenne.Érdemes azonban megjegyezni, hogy egyes citokróm P450 gének a patogén gombákkal vagy baktériumokkal szembeni fokozott rezisztenciával járnak, beleértve az allergiás reakciókhoz való hozzájárulást69, 70, 71.
A III. osztályú peroxidázok multifunkcionális növényi enzimek, amelyek a növény növekedése és fejlődése során az anyagcsere-folyamatok széles skálájában vesznek részt, valamint válaszul olyan környezeti stresszekre, mint a sótartalom, a szárazság, a nagy fényintenzitás és a kórokozók támadása72.A peroxidázok számos növényfaj és Anthracis kölcsönhatásban vesznek részt, köztük a Stylosanthes humilis és a C. gloeosporioides, a Lens culinaris és a C. truncatum, a Phaseolus vulgaris és a C. lindemuthianum, a Cucumis sativus és a C. lagenarium73, 74, 75, 76.A válasz nagyon gyors, néha 4 HPI-nél is, mielőtt a gomba behatolna a növényi szövetbe73.A peroxidáz gén a D. toxica NLL oltásra is reagált.Az oxidatív robbanás szabályozására vagy az oxidatív stressz kiküszöbölésére szolgáló tipikus funkcióik mellett a peroxidázok megzavarhatják a kórokozók növekedését azáltal, hogy fizikai akadályokat hoznak létre a sejtfal megerősítésén alapuló lignifikáció, alegység vagy specifikus vegyületek keresztkötése során.Ez a funkció in silico tulajdonítható a TanjilG_03329 génnek, amely egy feltételezett ligninképző anion-peroxidázt kódol, amely vizsgálatunk során a 83A:476 rezisztens vonalban 6 HPI-nél szignifikánsan felszabályozott, de más törzsekben és időpontokban, amelyek nem reagáltak, nem.
A linolsav 9S-/13S-lipoxigenáza a lipid bioszintézis oxidatív folyamatának első lépése78.Ennek az útvonalnak a termékei többféle funkciót töltenek be a növényvédelemben, beleértve a sejtfal erősítését a kallóz és pektin lerakódások képződésén keresztül, valamint az oxidatív stressz szabályozását reaktív oxigénfajták előállításán keresztül79, 80, 81, 82, 83.Jelen vizsgálatunkban a linolsav 9S-/13S-lipoxigenáz expressziója minden törzsben megváltozott, de a fogékony 22660-as populációban különböző időpontokban az upreguláció érvényesült, míg a rezisztens Lanr1-et és AnMan allélt hordozó törzsekben az oxilipin-reakció diverzifikációját hangsúlyozza ezen anthrax-reakciók között ezen anthrax-rétegek között.
Az 1-amino-ciklopropán-1-karboxilát-oxidáz (ACO) homológ szignifikánsan felszabályozott (9 gén) vagy leszabályozott (2 gén), amikor csillagfürttel oltották be.Két kivételtől eltekintve ezek a reakciók 6 lóerőnél jelentkeztek.83A:476.Az ACO fehérjék által közvetített enzimatikus reakció az etiléntermelés sebességkorlátozó lépése, ezért erősen szabályozott84.Az etilén egy növényi hormon, amely számos szerepet játszik a növények fejlődésének szabályozásában, valamint az abiotikus és biotikus stresszviszonyokra adott válaszok szabályozásában.Az ACO transzkripció indukciója és az etilén jelátviteli útvonal aktiválása részt vesz a rizs rezisztenciájának növelésében az oryzae oryzae hemibiotróf gombával szemben a reaktív oxigénfajták és fitoalexinek termelésének szabályozásával.A M. oryzae és a C. lupini88,89 között talált nagyon hasonló levélfertőzési folyamat, az ACO homológok jelentős felszabályozásának hátterében a 83A:476 vonalban, amelyről ebben a tanulmányban beszámoltunk, áthelyezi annak lehetőségét, hogy az NLL antracnóz etilénnel szembeni rezisztenciát a molekuláris útvonalak központi jelzési lépésévé váljon.
A jelen tanulmányban számos, a fotoszintézissel kapcsolatos gén nagyarányú elnyomását figyelték meg 6 hpi-nél a 83A:476-ban és 48 hpi-nél Mandeloopban és a 22660 populációban.E változások mértéke és előrehaladása arányos a szinttel.Ebben a kísérletben antracnóz rezisztenciát figyeltek meg.A közelmúltban a fotoszintézissel kapcsolatos transzkriptumok erős és korai elnyomásáról számoltak be a növény-patogén kölcsönhatások számos modelljében, beleértve a patogén baktériumokat és gombákat.A kapkodás (egyes interakciókban 2 HPI-től) és a fotoszintézishez kapcsolódó gének globális elnyomása a fertőzésre adott válaszként kiválthatja a növényi immunitást a reaktív oxigénfajták betelepülésén és a szalicilsav-útvonallal való kölcsönhatásán alapuló allergiás reakciók közvetítése révén 90,94.
Összefoglalva, a legrezisztensebb vonalra (83A:476) javasolt védekezési válaszmechanizmusok közé tartozik a gyors kórokozó felismerés az R gén által (feltehetően TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) és az allergiás válasz által közvetített szalicilsav és etilén jelátvitel, majd a hosszú távú SAR létrehozása.hatását a DIR-1 fehérje támogatja.Meg kell jegyezni, hogy a C. lupini fertőzés biotróf periódusa nagyon rövid (körülbelül 2 nap), ezt követi a nekrotikus növekedés95.Az e szakaszok közötti átmenet összefüggésbe hozható az etilénnel indukálható fehérjék nekrózisával és expressziójával, amelyek túlérzékenységi reakciókat váltanak ki a gazdanövényekben.Ezért nagyon szűk az időablak a C. lupini sikeres befogására a biotróf stádiumban.A 83A:476-ban 6 hpi-nél megfigyelt redox- és fotoszintézissel kapcsolatos gének átprogramozása összhangban van a gombás hifák előrehaladásával, és sikeres védekező válasz kialakulását hirdeti a biotróf szakaszban.A Mandelup és a 22660 populáció transzkriptomikus válaszai túlságosan késleltethetik a gombát a nekrotikus növekedésre való átállás előtt, azonban a Mandelup hatékonyabb lehet, mint a 22660 populáció, mivel a PR-10 fehérje viszonylag gyors szabályozása elősegíti a horizontális rezisztenciát.
Az ETI, amelyet a kanonikus R gén vezérel, az antracnózzal szembeni babrezisztencia általános mechanizmusának tűnik.Így a Medicago truncatula modell hüvelyesben az antracnózzal szembeni rezisztenciát az RCT1 gén biztosítja, amely a TIR-NBS-LRR97 növényi R génosztály tagja.Ez a gén széles spektrumú antracnóz rezisztenciát is biztosít a lucernában, ha érzékeny növényekre kerül át.A közönséges babban (P. vulgaris) eddig több mint két tucat antracnóz rezisztencia gént azonosítottak.Ezen gének némelyike ​​olyan régiókban található, amelyekben nincs kanonikus R gén, mások azonban az NBS-LRR génklasztert hordozó kromoszómák szélein találhatók, beleértve a TIR-NBS-LRRs99-et is.A genomra kiterjedő SSR vizsgálat is megerősítette az NBS-LRR gén és a közönséges bab antracnóz rezisztenciájával való összefüggését.A kanonikus R gént a fehér csillagfürt 101 fő antracnóz rezisztencia lókuszát hordozó genomi régióban is megtalálták.
Munkánk azt mutatja, hogy a növényfertőzés korai szakaszában (lehetőleg legkésőbb 12 hpi-nél) aktiválódó azonnali rezisztenciareakció hatékonyan védi a keskenylevelű csillagfürtet a Collelotrichum lupini kórokozó gomba által okozott antracnózistól.Nagy áteresztőképességű szekvenálás segítségével kimutattuk az antracnóz rezisztencia gének eltérő expressziós profilját NLL növényekben a Lanr1 és AnMan rezisztencia gének közvetítésével.A sikeres védekezés magában foglalja a redox-, fotoszintézis- és patogenezisben részt vevő fehérjék génjeinek gondos megtervezését a növény kórokozóval való első érintkezését követő órákon belül.A hasonló, de időben késleltetett védekezési reakciók sokkal kevésbé hatékonyak a növények betegségekkel szembeni védelmében.A Lanr1 gén által közvetített lépfene-rezisztencia hasonlít az R gén tipikus gyors válaszára (effektor által kiváltott immunitás), míg az AnMan gén nagy valószínűséggel horizontális választ ad (mikrobához kapcsolódó molekuláris mintázat által kiváltott immunitás), mérsékelt szintű fenntarthatóságot biztosítva.
Az antracnózis-markerek szűrésére használt 215 NLL-vonal 74 fajtából, 60 keresztezéssel vagy nemesítéssel nyert vonalból, 5 mutánsból és 76 vad vagy eredeti csíraplazmából állt.A vonalak 17 országból érkeztek, elsősorban Lengyelországból (58), Spanyolországból (47), Németországból (27), Ausztráliából (26), Oroszországból (19), Fehéroroszországból (7), Olaszországból (5) és más vonalakból.10 országból.A készlet referencia-rezisztens vonalakat is tartalmaz: 83A:476, Tanjil, Wonga, amely a Lanr1 allélt hordozza, és Mandelup, amely az AnMan allélt hordozza.A vonalakat a Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Lengyelország által fenntartott európai csillagfürt genetikai erőforrás adatbázisból szereztük be (S1 kiegészítő táblázat).
A növényeket ellenőrzött körülmények között neveltük (fényperiódus 16 óra, hőmérséklet 25°C nappal és 18°C ​​éjszaka).Két biológiai ismétlést elemeztünk.A DNS-t három hetes levelekből izoláltuk a DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Németország) segítségével a protokoll szerint.Az izolált DNS minőségét és koncentrációját spektrofotometriás módszerekkel (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) határoztuk meg.Az antracnóz rezisztencia gént jelölő AnMan (a Mandelup cv.-ből származó) AnManM1 markert és a Lanr1 gént szegélyező Anseq3 és Anseq4 markert (Cv. Tanjil) elemeztük 11,26,28.A rezisztens allél homozigótáit „1”, a fogékonyakat „0”-ra, a heterozigótákat pedig 0,5-re értékeltük.
Az AnManM1, AnSeq3 és AnSeq4 markerek szűrésének eredményei és a végső követési kísérletekhez rendelkezésre álló magok alapján 50 NLL vonalat választottunk ki az antracnóz rezisztencia fenotipizálására.Az analízist két párhuzamosban végeztük számítógép által vezérelt üvegházban, 14 órás fotoperiódussal, nappal 22°C és éjszaka 19°C hőmérséklet-tartományban.A magvakat a vetés előtt megkarcolják (éles pengével levágják a magházat az embrió másik oldalán), hogy megakadályozzák a magvak túl keménysége miatti nyugalmi állapotát, és biztosítsák az egyenletes csírázást.A növényeket steril talajon (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsó, Lengyelország) cserépben (11 × 11 × 21 cm) neveltük.A beoltást a Colletotrichum lupini Col-08 törzzsel végezték, amelyet 1999-ben termesztettek keskeny levelű csillagfürt növények száraiból, amelyeket Verzhenitsa (Nagy-Lengyelország) (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E) szántóföldön termesztettek.Szerezz egy területet.Az izolátumokat SNA tápközegben tenyésztettük 20 °C-on, fekete fényben 21 napig, hogy a spórákat indukáljuk.Négy héttel a vetés után, amikor a növények elérték a 4-6 leveles állapotot, a beoltást 0,5 x 106 konídium/ml koncentrációjú konídiumszuszpenzióval permeteztük.A beoltás után a növényeket 24 órán át sötétben tartottuk, körülbelül 98%-os páratartalom mellett 25 °C hőmérsékleten, hogy elősegítsék a konídiumok csírázását és a fertőzési folyamatot.A növényeket ezután 14 órás fényperiódus alatt neveltük 22 °C nappali/19 °C éjszakai hőmérsékleten és 70% páratartalom mellett.A betegség pontszámát 22 nappal az oltás után határozták meg, és 0 (immun) és 9 (nagyon érzékeny) között változott, attól függően, hogy a száron és a leveleken vannak-e nekrotikus elváltozások.Ezen kívül pontozás után megmértük a növények súlyát is.A marker genotípusok és a betegség fenotípusok közötti kapcsolatokat pont kétszekvenciás korrelációként számítottuk ki (heterozigóta markerek hiánya az antracnóz rezisztencia fenotípus elemzésére szolgáló vonalkészletben).